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CN109401986A - 一种提高酵母抗氧化能力的方法 - Google Patents

一种提高酵母抗氧化能力的方法 Download PDF

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CN109401986A
CN109401986A CN201811231503.4A CN201811231503A CN109401986A CN 109401986 A CN109401986 A CN 109401986A CN 201811231503 A CN201811231503 A CN 201811231503A CN 109401986 A CN109401986 A CN 109401986A
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yeast
oxidation resistance
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ros
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王金晶
李磊
段鸿绪
李崎
郑飞云
钮成拓
刘春凤
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Jiangnan University
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Jiangnan University
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    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Abstract

本发明公开了一种提高酵母抗氧化能力的方法，属于生物工程领域。本发明用适当浓度的H2O2刺激酵母细胞，以96孔板微型液体培养方法筛选生长速度快、活性高的菌株，得到的菌株较出发菌株胞内ROS积累水平减少30％左右，且除一株果酒酵母外，胞内ATP含量上升幅度均超过50％。本发明方法可以有效降低酵母胞内ROS累积量，增加胞内ATP含量，从而达到提高酵母菌株抗氧化能力的目的。

Description

一种提高酵母抗氧化能力的方法
技术领域
本发明涉及一种提高酵母抗氧化能力的方法，属于生物工程领域。
背景技术
酵母是一种重要的工业生产菌株，它具有发酵速度快、生长周期短、可进行大规模培养等优点。酵母在工业生产中会受到各种胁迫压力(如氧化胁迫、高渗透压胁迫、低pH值、高酒精度胁迫、冷或热刺激、饥饿、高浓度SO2等)的影响，这些胁迫对酵母的生存能力和发酵效力有很大的影响。其中，氧化胁迫是对酵母发酵过程影响最大的胁迫，它主要是由活性氧簇(ROS)的大量积累引起的。
ROS是细胞新陈代谢的主要副产物，它包括H2O2、单态氧、羟自由基和超氧化物阴离子等。由于ROS和ATP参与氧化磷酸化过程，这两者在细胞内的存在是必要的。但是，当ROS随时间增加在细胞内累积过多，细胞自身清除内源性ROS的机制已不能将过多的ROS抵消掉，ROS的大量积累损伤胞内大分子物质，使得细胞膜传输、细胞代谢等功能减弱，啤酒酵母的生物活性和发酵能力都会受到严重的影响。ROS诱发的损伤是复杂的并且通常情况下是不可逆转的。尤其是胞内ROS会直接损害线粒体功能，使得线粒体向着更易于产生ROS的方向变化。线粒体与ROS之间恶性循环更加快了细胞老化的速率。ROS的聚集和细胞氧化压力的增加被认定为细胞衰老的重要特征，因此，提高酵母的抗氧化能力有对提高酵母的发酵性能有重要的意义。
发明内容
本发明提供一种提高酵母抗氧化能力的方法，是在酵母生长周期的对数期，使用H2O2刺激酵母细胞1～2h，而后，将酵母细胞接种于含有新鲜YPD培养基的96孔板中静置培养，分离单菌落，得到抗氧化能力提高的酵母。
所述酵母包括啤酒酵母、酿酒酵母、果酒酵母、鲁氏酵母。
所述提高抗氧化能力是指减少胞内ROS累积量，增加胞内ATP含量。
具体地，是在酵母生长周期的对数期，使用10mmol/L H2O2刺激酵母细胞1～2h，而后接种于含有新鲜YPD培养基的96孔板中，逐级稀释、分离单菌落，得到抗氧化能力提高的酵母。
具体地，将酵母在YPD培养基中培养至对数生长期，收集酵母菌体，用PBS缓冲液稀释至(1～2)×107cfu/mL，再加入H2O2，使H2O2的终浓度达到10mmol/L，于28℃、180r/min培养1h，取菌液接种于含有新鲜YPD培养基的96孔板中，在28℃静置培养，分离单菌落。
在本发明的一种实施方式中，以胞内ROS含量、胞内ATP含量为检测指标，筛选经过过氧化氢处理后的抗氧化能力提高的酵母。
本发明用不同浓度的H2O2刺激酵母细胞，在致死浓度条件下以96孔板微型液体培养方法筛选生长速度快、活性高的菌株，得到的菌株较出发菌株胞内ROS积累水平减少30％左右，且除一株果酒酵母外，胞内ATP含量上升幅度均超过50％。因此，本发明方法可以有效降低酵母胞内ROS累积量，增加胞内ATP含量，从而达到提高酵母菌株抗氧化能力的目的。
附图说明
图1处于生长对数期的啤酒酵母pilsner、酿酒酵母12、酿酒酵母14、果酒酵母JNB、果酒酵母D254、鲁氏酵母WLL186，经过10mmol/L H2O2处理前后，胞内ROS的含量。
图2处于生长对数期的啤酒酵母pilsner、酿酒酵母12、酿酒酵母14、果酒酵母JNB、果酒酵母D254、鲁氏酵母WLL186，经过10mmol/L H2O2处理前后，胞内ATP的含量。
图3 12株菌在含有H2O2的平板培养基中的生长情况；(A)H2O2浓度为4mmol/L，(B)H2O2浓度为6mmol/L。
具体实施方式
胞内ROS的测定方法：以1％接种量将酵母种子液接入YPD培养基中，28℃、180r/min培养24h，取1mL菌液，离心收集菌体，将菌体洗涤后，用磷酸盐缓冲液将菌体浓度调整至OD600＝0.8，取1mL OD600＝0.8的细胞悬液加入5μL 0.02mmol/L DCFH-DA溶液，180r/min，28℃培养30min，用酶标仪检测DCF荧光。λex＝485nm，λem＝530nm。
ATP活力的检测方法：以1％接种量将酵母种子液接入YPD培养基中，28℃、180r/min培养24h，取1mL菌液，离心收集菌体，将菌体细胞悬浮于磷酸盐缓冲液中，调整细胞浓度至OD600＝0.8，取1mL OD600＝0.8的菌液于含玻璃珠的细胞破壁管中，使用-24均质破碎仪破碎细胞5min(震荡1min，冰浴30s)，12000r/min离心5min，收集上清液。取100μLATP检测盒试剂于96孔板中，加入100μL细胞破碎液的上清液，混匀后用酶标仪检测其化学发光值。
实施例1
1.抗氧化酵母的筛选
(1)将实验室保存的啤酒酵母pilsner，酿酒酵母12、14，果酒酵母JNB、D254，鲁氏酵母WLL186，以1％接种量接种到新鲜YPD培养液中，28℃180r/min培养12h，取适量培养液，分别稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，分别取20μL各梯度的稀释液，加入含有180μLYPD液体培养基的96孔板的孔中，在28℃静置培养。28℃静置培养2～3天后，在稀释倍数足够大的情况下，96孔板的孔底会出现单菌落。
(2)取步骤(1)中的单菌落酵母，在YPD中培养生长至对数前期，4000r/min离心5min，收集菌体，将菌体混悬于PBS缓冲液使细胞浓度达到(1～2)×107cfu/mL，再加入H2O2，使H2O2的终浓度达到10mmol/L，28℃，180r/min培养1h，取20μL菌液接种于含有180μL新鲜YPD培养基的96孔板中，在28℃静置培养，分离单菌落并培养2～3天。挑取生长较快的单菌落接种于斜面保存。
(3)将获得的单菌落菌株进行胞内ROS、胞内ATP检测，并进行抗氧化平板验证。
(Ⅰ)将出发菌株啤酒酵母pilsner、酿酒酵母12、酿酒酵母14、果酒酵母JNB、果酒酵母D254、鲁氏酵母WLL186与步骤(2)收集的处理后的菌株啤酒酵母pilsner-1、酿酒酵母12-1、酿酒酵母14-1、果酒酵母JNB-1、果酒酵母D254-1、鲁氏酵母WLL186-1以1％接种量接种到YPD液体培养基中，28℃180r/min培养24h，并进行胞内ROS检测。
结果如图1所示，经过H2O2处理过后的菌株，胞内ROS水平降低明显。相比于出发菌株，经过H2O2处理过后的六株菌的胞内ROS含量分别降低42％、32％、24％、42％、12％、21％，降低幅度在30％左右，其变化幅度可能与菌株自身抗氧化体系相关。总之，该处理过程对于有效降低酵母胞内ROS累积，提高抗氧化能力具有较为显著的效果。
(Ⅱ)将上述12株菌(啤酒酵母pilsner、酿酒酵母12、酿酒酵母14、果酒酵母JNB、果酒酵母D254、鲁氏酵母WLL186、啤酒酵母pilsner-1、酿酒酵母12-1、酿酒酵母14-1、果酒酵母JNB-1、果酒酵母D254-1、鲁氏酵母WLL186-1)1％接种量接种到YPD液体培养基中，28℃180r/min培养12h，并进行胞内ATP检测。
ATP是体现细胞活力的重要指标。从图2中可以看出，相比于出发菌株，经过H2O2处理后的菌株胞内ATP含量分别提高了78％、110％、87％、52％、21％、78％。除一株果酒酵母外，其他五株菌上升幅度均超过50％，胞内ATP含量上升显著。此结果与胞内ROS含量变化趋势相符，ATP含量升高，有效降低了胞内ROS含量积累，从而促使酵母的抗氧化性能提升。
(Ⅲ)将上述12株菌(啤酒酵母pilsner、酿酒酵母12、酿酒酵母14、果酒酵母JNB、果酒酵母D254、鲁氏酵母WLL186、啤酒酵母pilsner-1、酿酒酵母12-1、酿酒酵母14-1、果酒酵母JNB-1、果酒酵母D254-1、鲁氏酵母WLL186-1)1％接种量接种到YPD液体培养基中，28℃180r/min培养12h，并进行H2O2平板点样验证(菌液浓度为105、104、103、102CFU/mL)。
如图3所示，从不同浓度的H2O2平板点样结果中可以发现，当H2O2浓度为4mmol/L时，6株菌并没有表现出明显差异；当H2O2浓度升高至6mmol/L时，经过该方法处理的菌株较原菌株，差异显著，表现出了更强的活性。其结果说明，4mmol/L的H2O2对于6株菌的胁迫较小，不能揭示出菌株间的抗氧化能力的差异；6mmol/L的H2O2浓度选择较为恰当，且处理后的菌株较原菌株，有更强的抗氧化能力，该处理过程，可以有效提高酵母菌株的抗氧化能力。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种提高酵母抗氧化能力的方法，其特征在于，是在酵母生长周期的对数期，使用H2O2刺激酵母细胞，而后，将酵母细胞接种于含有新鲜YPD培养基的96孔板中静置培养，分离单菌落，得到抗氧化能力提高的酵母。
2.根据权利要求1所述的一种提高酵母抗氧化能力的方法，其特征在于，所述酵母包括啤酒酵母、酿酒酵母、果酒酵母、鲁氏酵母。
3.根据权利要求1或2所述的一种提高酵母抗氧化能力的方法，其特征在于，所述提高抗氧化能力是指减少胞内ROS累积量，增加胞内ATP含量。
4.根据权利要求1～3任一所述的一种提高酵母抗氧化能力的方法，其特征在于，是在酵母生长周期的对数期，使用10～12mmol/L H2O2刺激酵母细胞1～2h，而后，将酵母细胞接种于含有新鲜YPD培养基的96孔板中静置培养，分离单菌落，得到抗氧化能力提高的酵母。
5.根据权利要求4所述的一种提高酵母抗氧化能力的方法，其特征在于，是在酵母生长周期的对数期，使用10mmol/L H2O2刺激酵母细胞1～2h，而后接种于含有新鲜YPD培养基的96孔板中静置培养，分离单菌落，得到抗氧化能力提高的酵母。
6.根据权利要求4或5所述的一种提高酵母抗氧化能力的方法，其特征在于，将酵母在YPD培养基中培养至对数生长期，收集酵母菌体，用PBS缓冲液稀释至(1～2)×107cfu/mL，再加入H2O2，使H2O2的终浓度达到10mmol/L，于28℃、180r/min培养1h，取菌液接种于含有新鲜YPD培养基的96孔板中，在28℃静置培养，分离单菌落。
7.根据权利要求1～5任一所述的一种提高酵母抗氧化能力的方法，其特征在于，以胞内ROS含量、胞内ATP含量为检测指标，筛选经过过氧化氢处理后的抗氧化能力提高的酵母。
8.根据权利要求1所述的一种提高酵母抗氧化能力的方法，其特征在于，以10mmol/LH2O2刺激酵母细胞。
9.根据权利要求1～9所述方法培养得到的抗氧化能力提高的酵母。
10.权利要求9所述酵母在酿造啤酒中的应用。
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