CN107446984A - 一种抗氧化物质抗氧化活性的评价方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗氧化物质抗氧化活性的评价方法。该评价方法以酿酒酵母为模型，将酿酒酵母进行接种培养，再加入氧化剂氧化胁迫培养，得酿酒酵母氧化胁迫模型，为对照组；在接种的酿酒酵母中加入供试样品培养，再加入氧化剂氧化胁迫培养，得处理组；通过测定比较对照组与处理组中酿酒酵母生长与酿酒酵母中抗氧化指标来评价供试样品的抗氧化活性。本发明提供的评价方法接近于生物体的实际体系，且较为灵敏，以酿酒酵母为模型，克服了周期长、成本大且实验过程繁琐等不足。本发明以菌株ATCC9763为模型，建立一种抗氧化活性的评价，为探究抗氧化物质的体内抗氧化活性提供一种研究方法。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗氧化物质抗氧化活性的评价方法。
背景技术
目前，用于研究抗氧化能力的方法有很多。常见的体外抗氧化测定的方法主要有以下几种：DPPH(1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical)法、ABTS(2，2'-azinobis(3-ethbenzothiazoline-6-sulfonate)法，FRAP(ferric reducing antioxidant power)法、ORAC(oxygen radical absorbance capacity)氧自由基吸收能力、细胞抗氧化方法、P-carotene bleatene bleching method(P-胡萝卜素亚油酸体系)和low-densitylipoprotein(LDL)(低密度脂蛋白氧化反应)等。其中DPPH、ABTS、FRAP和ORAC属测定抗氧化剂清除自由基能力的方法，在果蔬抗氧化能力的评价上都已得到广泛用。抗氧化能力强弱的表达方式主要有AE(抗氧化效率)、TEAC(Trolox equivalentantioxidant capacity)、抑制率和IC50(半抑制浓度)等。
DPPH·清除法:DPPH·(1，1-二苯基-2-三稍基苯肼自由基)是一种很稳定的自由基，在517nm处有最大光吸收，易溶于有机溶剂，溶解于乙醇时溶液为深紫色。当自由基清除剂存在时，抗氧化剂给出的氢能与DPPH·电子配对，使体系颜色由紫色变为淡黄，光吸收值减少，此变化与其接受的电子数成定量关系。依据这一性质，可用分光光度法对其进行定量分析，从而判断抗氧化物自由基清除能力的大小。Maria等利用DPPH法测定了甜橙乙酸乙酯提取物的抗氧化活性，发现抗氧化活性与酌酸含量及类黄酮含量呈正相关。该方法具有操作简单、快速、灵敏、易重复，不需要复杂的仪器等优点，是目前世界上使用较为普遍的体外抗氧化能力评价方法。该方法的缺点是DPPH·的颜色易受被测样品颜色的干扰，且DPPH·的氧化势较低(E＝0.34V)，导致许多抗氧化物质不能被其氧化，从而表现不出抗氧化能力。
ABTS自由基抗氧化法：2，2'-氨基-二(3-乙基-苯并噻挫啉磺酸-6)铵盐(ABTS)自由基是一种较为稳定的化学性自由基引发剂，可溶解于乙醇中。经氢过氧化物(或活性氧)和过氧化物酶氧化后，ABTS会生成稳定的蓝绿色阳离子自由基ABTS·+；若被测物质中存在抗氧化成分，ABTS·+与抗氧化剂发生反应生成无色的ABTS而使体系褪色，之后在734nrn处测定体系的吸光度，吸光值越小，则表明样品抗氧化活性强。与Trolox(维E的水溶性类似物)标准对照体系比较即可换算出被测物质的总抗氧化能力(TEAC值)。因而该方法也被称为TEAC(Trolox equivalent antioxidant capacity)法。该方法简单快捷，pH使用范围广，适用于大量样品的检测分析。已被广泛用于测定样品的抗氧化活性。但ABTS·+并非生理自由基，缺乏生理相关性，只能用来定性评价样品的抗氧化能力。此外，有研究表明，该方法可能会出现假阳性结果，不具抗氧化活性的物质也可以贡献氢离子，而被误判具有抗氧化活性。
FRAP铁离子还原法：FRAP为Fe3+-三吡啶三吖嗪(tripyridyl-triazine，TPTZ)，在pH值3.6，37℃下，Fe3+-TPTZ可被样品中的抗氧化剂还原为Fe2+-TPTZ形式，而呈现出蓝色，并在593nm处具有最大光吸收，吸光值越大，表示其抗氧化活性越强。可根据吸光值的大小计算出抗氧化剂的抗氧化能力。该方法的主要优点是操作简单、重复性强，现主要应用于食品抗氧化能力的测定方面。但该方法实际测定的是待测样品将Fe3+还原成Fe2+的能力，因而缺乏抗氧化活性的生物学相关性。此外，不同物质发生氧化还原反应达到平衡的时间不同，因此不同反应时间终点选的择对结果也有很大影响。
ORAC抗氧化能力测定：ORAC(Oxygen radical absorbance capacity)是利用β-藻红蛋白(P-phycoerythrin，β-PE)在540nm光波激发下，可发射出565nm的荧光；AAPH[2，2-偶氮二(2-咪基丙院)二盐酸盐]提供过氧化自由基将β-PE氧化，从而使其荧光减弱甚至消失：相反，抗氧剂存在时，抑制β-PE的荧光减弱。藻红蛋白是大分子蛋白，暴露激发波长下会快速自发衰退；各种藻红蛋白荧光强度不同，且与自由基的反应性不同，加上分离得到PE纯度上的限制，不同结果之间的可比性难以保证。现已用荧光素(Fluorescein，FL)代替PE，FL与待测样品不发生相互作用，不会对样品的测定结果产生干扰。改进后的方法是目前国际上常用的一种抗氧化活性评价方法。美国、日本以及某些欧洲国家的食品、功能食品行业都普遍采用ORAC作为评价抗氧化能力的重要标准。该方法是一种新颖的抗氧化评价方法，其主要不足之处在于所需仪器较为昂贵，荧光物质对温度和PH值很敏感，使实验的操作难度增加。
CAA法：即细胞抗氧化法(cellular antioxidant activity，CAA)，通过以人体肝癌细胞HepG-2为模型，观察检测抗氧化物质在其中的作用情况，如观测抗氧化成分在胞内的吸收、代谢，生物利用率等指标。其原理为二氯荧光黄双乙酸盐(Dichloro-fiiorescin)进入细胞后，会被自由基ABAP氧化成荧光化合物DCF(dichlorofuorescein)，抗氧化剂能与DCF竞争结合自由基，导致荧光减弱。因此可通过荧光降低的程度该物质的评价抗氧化能力。CAA法在操作上具有诸多优点：与传统的化学方法相比，更具有生物相关性；与动物模型和临床研究相比，更经济快捷，简便、灵敏，并可高通量分析。因而CAA法被认为是抗氧化活性评价研究方法中的革命。
体内抗氧化活性评价方法主要包括动物实验、人体实验与细胞实验。①动物实验：在给动物喂食或注射抗氧化剂一定时间后，通过测定其血液中脂质过氧化产物丙二醛(MDA)的变化、以及肝脏匀浆中谷胱甘肽过氧化物酶GSH-PX和超氧化物歧化酶SOD的活力变化，来评价该物质抗氧化能力的强弱。②人体实验:主要通过测定尿液、血液中的丙二醛，以及血液中谷胱甘肽过氧化物酶GSH-PX和超氧化物歧化酶SOD的变化情况，来测定抗氧化剂对人体的作用，进而判定抗氧化物抗氧化活性的强弱。我国国家食品药品管理局已将利用动物实验和人体实验等体内实验作为抗氧化功能的主要评价方法来判定食品药品的抗氧化活性。③细胞实验：以细胞为模型，用抗氧化剂处理一段时间后，通过检测细胞内相关抗氧化指标(如丙二醛、谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶和过氧化物酶等)的变化，对该抗氧化剂的抗氧化能力进行评价。与体外抗氧化活性研究方法相比，体内评价方法接近于生物体的实际体系，且较为灵敏，但存在周期长、成本大且实验过程繁琐等不足。
酿酒酵母作为单细胞模式生物，与其他细胞模型相比，具有易于培养、繁殖周期短、成本相对较低等优点，在生物和生物医学研究中作为模式生物也已得到广泛的应用。
目前，并没有酿酒酵母作为模型来评价抗氧化活性的报道，因此，本发明选用酵母作为模式生物，建立酵母氧化胁迫模型，研究抗氧化物质对氧化胁迫条件下酿酒酵母的影响，为抗氧化物质抗氧化活性的评价提供一种新方法。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种抗氧化物质抗氧化活性的评价方法。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
抗氧化物质抗氧化活性的评价方法，所述评价方法以酿酒酵母为模型，包括以下步骤：
1)构建酿酒酵母氧化胁迫模型：将酿酒酵母进行接种培养，再加入氧化剂氧化胁迫培养，得酿酒酵母氧化胁迫模型，为对照组；
2)处理组：在接种的酿酒酵母中加入供试样品培养，再加入氧化剂氧化胁迫培养，得处理组；
3)通过测定比较对照组与处理组中酿酒酵母生长与酿酒酵母中抗氧化指标来评价供试样品的抗氧化活性。
进一步，所述酿酒酵母为菌株ATCC9763。
在相同条件的氧化胁迫下，从生长曲线的稳定性和平滑度来说，菌株ATCC9763相比菌株S288c，更为稳定和平缓。菌株ATCC9763的抗逆性要强于菌株S288c。
进一步，步骤1)与步骤2)所述氧化剂为H2O2，所述H2O2的浓度为0.2mM～2.0mM。
作为一种优选，所述H2O2的浓度为1.0mM。
H2O2的处理浓度低于0.2mM时，对酵母ATCC9763的生长曲线没有影响，H2O2的处理浓度高于2.5mM时，酵母ATCC9763在24小时内停止生长，H2O2的处理浓度高于3.0mM时，酵母ATCC9763全部死亡。
进一步，步骤2)所述酿酒酵母培养培养时接种浓度为OD600＝1.0的酵母种，以培养液体积的1％为接种量，28℃培养至OD600＝0.1(约4h)时加入供试样品，供试样品预先与酿酒酵母培养0.3～7h后进行H2O2氧化胁迫；所述氧化胁迫培养的时间为18～25h。
作为一种优选，所述供试样品预先与酿酒酵母培养0.5h后进行H2O2氧化胁迫；所述氧化胁迫培养的时间为20h。
进一步，步骤3)所述抗氧化指标包括活性氧(ROS)含量、抗氧化相关蛋白酶的活性、抗氧化相关基因的表达的一种或多种。
进一步，所述抗氧化相关蛋白酶包括过氧化氢酶(CAT)、过氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)的一种或多种；所述酵母抗氧化相关基因包括CTT，SOD1，SOD2，GPX1，GPX2的一种或多种。
作为一种优选，所述酵母抗氧化相关基因为CTT、GPX2和SOD2。
抗氧化活性好的供试样品，预处理酿酒酵母后，其胞内活性氧(ROS)含量较对照组显著下降，胞内ROS含量存在显著差异，抗氧化相关蛋白酶的活性总体呈上升趋势；通过调整供试样品的处理浓度，通过分析抗氧化指标的变化，能得出最佳的供试样品的处理浓度。
进一步，步骤2)所述供试样品用0.1％DMSO稀释后再加入到接种培养的酿酒酵母中。0.1％的DMSO对酵母ATCC9763的生长无抑制也无促进作用。因此，在生长曲线测定中无需将其作为实验因素考虑。
进一步，步骤2)所述供试样品为抗氧化物质，包括类黄酮物质。所述抗氧化物质为水溶性物质或脂溶性物质。
进一步，所述类黄酮物质包括槲皮素。
槲皮素是黄酮类化合物黄酮醇的主要组成成分，也是黄酮醇中最为常见的几种物质之一，具有良好的抗氧化活性。柑橘类黄酮中，还有芦丁、新橙皮苷、橙皮素、橙皮苷、柚皮素和柚皮苷。
槲皮素抗氧化活性的评价方法，包括以下步骤：
1)构建酿酒酵母氧化胁迫模型：将酿酒酵母进行接种培养，再加入氧化剂氧化胁迫培养，得酿酒酵母氧化胁迫模型，为对照组；
2)在接种的酿酒酵母中加入不同浓度的槲皮素进行培养，再加入H2O2氧化胁迫培养，得槲皮素抗氧化活性评价体系；所述H2O2的浓度为0.8mM～2.0mM；所述酿酒酵母为菌株ATCC9763，得处理组；
3)通过测定比较对照组与处理组中酿酒酵母生长与酿酒酵母中抗氧化指标来评价槲皮素的抗氧化活性和合适添加量；所述抗氧化指标包括活性氧(ROS)含量、蛋白酶的活性、抗氧化相关基因的表达；所述蛋白酶包括过氧化氢酶(CAT)、过氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)的一种或多种；所述酵母抗氧化相关基因包括CTT，SOD1，SOD2，GPX1，GPX2，ACTIN的一种或多种。
本发明的目的之二在于提供一种所述的酿酒酵母氧化胁迫模型在研究胞内抗氧化机制中的应用。
本发明选用酵母作为模式生物，建立酵母氧化胁迫模型，研究抗氧化物质对氧化胁迫条件下酿酒酵母的影响，可以为探究抗氧化物质的体内抗氧化活性提供一种研究方法，也可以帮助我们探索、了解某些特定基因、蛋白在高等生物(包括人类)中的作用，建立抗氧化物质抗氧化活性的胞内研究方法，以期能为类黄酮体内抗氧化的相关研究提供参考，对于以酵母为模型研究体内抗氧化机制也有一定的借鉴意义。
本发明的有益效果在于：
1)本发明提供的抗氧化物质抗氧化活性的评价方法与体外抗氧化活性研究方法相比，体内评价方法接近于生物体的实际体系，且较为灵敏，以酿酒酵母为模型，克服了周期长、成本大且实验过程繁琐等不足。
2)酿酒酵母作为单细胞模式生物，与其他细胞模型相比，具有易于培养、繁殖周期短、成本相对较低等优点；选取的菌株ATCC9763在氧化胁迫下生长曲线稳定和平缓，抗逆性要强，本发明以该菌株为模型，建立一种抗氧化活性的评价，为探究抗氧化物质的体内抗氧化活性提供一种研究方法。
3)本发明提供的抗氧化物质抗氧化活性的评价方法，可以为探究抗氧化物质的体内抗氧化活性提供一种研究方法，也可以帮助我们探索、了解某些特定基因、蛋白在高等生物(包括人类)中的作用，对于以酵母为模型研究体内抗氧化机制也有一定的借鉴意义。
附图说明
图1为不同浓度H2O2处理不同接种比例的酵母(菌株：ATCC9763)。
图2为不同浓度H2O2处理不同接种比例的酵母(菌株：S288c)。
图3为酵母生长至OD600＝0.1后进行不同浓度H2O2处理(菌株：ATCC9763)。
图4为酵母生长至OD600＝0.1后进行不同浓度H2O2处理(菌株：S288c)。
图5为0.1％DMSO对酵母生长的作用(菌株：ATCC9763)。
图6为槲皮素和2.0mM H2O2共同处理不同接种浓度的酵母(菌株：ATCC9763)。
图7为槲皮素预处理对不同浓度H2O2胁迫下酵母生长的影响(菌株：ATCC9763)。
图8为不同浓度槲皮素处理后酵母胞内活性氧(ROS)含量(株系：ATCC9763)。
图9为不同浓度槲皮素预处理对酵母胞内ROS降低的比例。
图10为槲皮素和H2O2处理后酵母细胞内CAT酶活性的变化。
图11为槲皮素和H2O2处理后酵母细胞内SOD酶活性的变化。
图12为槲皮素和H2O2处理后酵母细胞内POD酶活性的变化。
图13为槲皮素处理后酵母细胞内氧化应激相关基因的表达变化。
图14为槲皮素和H2O2处理后酵母细胞内氧化应激相关基因的表达变化。
具体实施方式
以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
主要材料：酵母(菌株ATCC9763、S288c)菌种均购自于广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心(Microbial Culture Collection Center of Guangdong Institude ofMicrobiology，GIMCC)。
酵母保存与培养：本发明实施例中所涉及的酵母培养，均采用YPD培养基(固体/液体)。培养条件为28℃，180rpm/min。
实施例1酿酒酵母的氧化胁迫处理
挑取酵母单菌落，液体培养至菌液OD600＝1.0左右时作为菌种，分别按0.1％、0.5％、1.0％的比例，在装有20mL YPD液体培养基的100mL三角瓶进行接种。分组加入配制好H2O2，使之终浓度为0mM(对照)、0.2mM、1.0mM、2.0mM。
分别对ATCC9763和S288c菌液为母种做上述处理，观察不同浓度的H2O2处理对酵母不同菌株的抑制作用。
A组模式：酿酒酵母接种后立即进行H2O2氧化胁迫
以OD600＝1.0的酵母(ATCC9763和S288c)菌液为母种，按不同比例(0.1％、0.5％、1.0％)进行接种，并同时加入H2O2处理，观察不同浓度的H2O2处理对酵母不同菌株的抑制作用。结果如图1和图2所示：在相同的H2O2浓度处理下，菌种接种比例越高，从迟滞期进入指数期的时间越短，指数期的时间越短，单位体积培养液中菌体数目就越多；相同的接种比例下，随着H2O2浓度的增加，酵母正常生长受到的抑制程度逐渐加重，从迟滞期进入指数期需要的时间越长。
菌株ATCC9763：0.2mM H2O2对三种接种比例的酵母在指数期的生长速率有影响，而对于相同接种比例的酵母，该浓度下的H2O2对其从迟滞期进入指数期的时间与达到平台期(稳定期)的时间几乎没有影响。在1.0mM H2O2的胁迫下，1.0％接种浓度的酵母进入指数期的生长时间与对照组相比延缓了8h左右，胁迫效果明显。而2.0mM H2O2已使1.0％接种浓度的酵母恢复生长能力的时间延缓12h左右，对酵母的正常生长产生了严重的抑制，到第18h左右才开始进入指数期；而0.1％接种浓度的酵母在2.0mM H2O2的胁迫下，近24h才开始进入指数期，胁迫效果显著。
菌株S288c：在同浓度酵母液接种比例、0.2mM H2O2胁迫处理下，酵母菌株S288c受到的影响较小，其生长曲线几乎与同样接种比例的对照组重合；而在1.0mM、2.0mM H2O2处理下，相同条件处理下，菌株S288c的生长趋势均不如菌株ATCC9763，比较而言，前者在同等条件下受到的胁迫程度更重些。在2.0mM H2O2胁迫处理下，酵母菌株S288c三种接种比例下的均未进入指数生长期。
B组模式：酿酒酵母生长至OD600＝0.1后进行H2O2氧化胁迫
基于A组胁迫模型的结果，B组母种菌液(ATCC9763和S288c)按1.0％比例接种从接种即开始计时，记为0h；待菌液生长至OD600＝0.1后再进行H2O2氧化胁迫处理，此后测定不同时间点的OD600，制作生长曲线图。曲线中0h到第一个测量点之间用虚线表示。实验结果如图3、图4所示。
酵母ATCC9763所受氧化胁迫状况与A组中不同浓度H2O2处理对酵母ATCC9763的抑制作用实验结果一致。结果表明：不论是接种后立即加入H2O2还是菌液生长至OD600＝0.1后再加入H2O2，0.2mM H2O2处理时，在指数期对酵母ATCC9763正常生长有轻微的影响，但不显著且不影响其进入平台期(稳定期)的时间，只对生长速度有轻微延迟作用；当H2O2浓度提高到1.0mM时，对酵母ATCC9763的生长已产生较为严重的抑制，不仅延迟其在指数期的生长速度，也推迟了酵母ATCC9763进入平台期(稳定期)的时间；在2.0mM H2O2胁迫处理下，酵母ATCC9763生长迟缓，受到极其严重的抑制，进入指数期的时间延后17h左右。
酵母S288c所受胁迫状况与A组中不同浓度H2O2处理对酵母S288c的抑制作用实验结果(图2b)有所不同。对比两生长曲线图可看出，两种实验条件下，浓度为0.2mM时，在指数期H2O2对酵母S288c正常生长仅有轻微的影响，但不影响其进入平台期(稳定期)的时间，且其生长曲线与对照组的几乎完全重合。在2.0mM H2O2胁迫处理下，酵母S288c生长迟缓，受到极其严重的抑制。从测定数据结果来看，各检测点测得的OD600值变化不大，其生长趋势几乎是一条直线，24h后仍处于迟滞期，未进入指数生长阶段。以上两种浓度下H2O2胁迫效果一致，实验条件的调整对其胁迫处理酵母S288c的作用没有产生影响。
但是，当H2O2浓度为1.0mM时，实验条件调整前后，胁迫效果差异很大：在图2b中可看出，1.0mM H2O2处理对酵母S288c的生长产生较为严重的抑制，延迟其在指数期的生长速度(与对照组相比，进入指数期的时间延后6h左右)，也推迟了其进入平台期(稳定期)的时间，在24h内有进入平台期(稳定期)的趋势；对比图2b与图4可看出，与A组相比，该实验条件下，同浓度(1.0mM)H2O2处理使酵母S288c的生长受到更严重的抑制，酵母S288c从迟滞期进入指数期的时间延后13h左右，24h时仍然停留在指数期的初期。
由此可见，两种酿酒酵母都可以建立H2O2氧化胁迫模型，但是同等条件下，无论是同时加入还是后加入H2O2，从生长曲线的稳定性和平滑度来说，菌株ATCC9763更为稳定和平缓。菌株ATCC9763的抗逆性要强于菌株S288c。所以本发明选取菌株ATCC9763来评价抗氧化物质的抗氧化活性，H2O2氧化胁迫处理的浓度应为1.0mM以上。
实施例2利用抗氧化物质抗氧化活性的评价方法评价槲皮素的抗氧化作用
1.助剂DMSO对酵母ATCC9763生长的影响
以0.1％DMSO处理1.0％接种比例的酵母作为处理组，研究助剂DMSO在体积分数为0.1％时对酵母ATCC9763生长的影响。由图5可以看出，处理组(0.1％DMSO)与对照组的生长曲线几乎完全重合。实验结果表明：0.1％的DMSO对酵母ATCC9763的生长无抑制也无促进作用。因此，在生长曲线测定中无需将其作为实验因素考虑。
2.槲皮素浓度梯度的筛选
槲皮素是一种黄色粉末状物质，含有不同浓度槲皮素的YPD液体培养基在600nm处也有吸光值，且槲皮素浓度越高，吸光值越大。测定结果显示，经24h培养后，含有槲皮素的YPD液体培养基OD值在24小时内的趋势均近似于一条直线，可以说明所购药品内不含细菌或酵母菌等杂菌或者药品中所含的杂菌数目极少而在24h内不会影响酵母的生长与OD600的测定，购买的槲皮素试剂在DMSO中溶解后可以直接用于本实验。
以ATCC9763为对象，槲皮素浓度低于100μM时，设置的两组处理25μM、50μM槲皮素处理(图6a、图6b)与只加入2.0mM H2O2氧化胁迫处理的酵母对照组相比，并没有起到对H2O2胁迫的缓解作用，相反其生长趋势反而不如对照组。在100μM槲皮素处理组(如图6c)中，1.0％接种浓度下，100μM的槲皮素处理2.0mM H2O2胁迫酵母的生长趋势与仅有H2O2胁迫处理组相似，且处于迟滞期的时间相同，但进入指数期之后100μM的槲皮素处理组生长明显快于仅有H2O2胁迫处理组。因此，100μM的槲皮素处理组对酵母受到H2O2胁迫有一定的保护作用。
槲皮素浓度高于100μM时，与未加试剂的菌液对照组相比，只加入槲皮素组酵母ATCC97693的生长得到了一定程度上的促进，且随浓度升达到平台期需要的时间缩短。观察比较图6c、图6d、图6e中各处理组的生长曲线，可以看出，300μM槲皮素、500μM槲皮素的处理效果均不如100μM槲皮素，其进入对数期的时间比H2O2胁迫处理组还要晚，生长速度也略慢。但效果好于25μM、50μM槲皮素处理(图6a、图6b)的效果。因此，在A组方法的处理下，100μM槲皮素的预处理，缓解2.0mM H2O2氧化胁迫效果最佳，浓度高是(300μM和500μM)反而会在一定程度上抑制酵母生长。
3.槲皮素对不同浓度H2O2胁迫下酵母生长的影响
由以上实验结果来看，浓度在100uM以下对处于H2O2胁迫状态下的酵母ATCC9763生长无促进的作用，对酵母受胁迫后生长力恢复的影响很小，甚至负作用。因此，调整槲皮素浓度时应将浓度选择范围缩小到较高浓度(100μM、300μM、500μM)。
为了避免酵母接种后立即加入高浓度槲皮素对酵母生长的影响，在探究槲皮素对不同浓度H2O2胁迫下酵母生长影响的试验中，选取了B组处理方法，即接种酵母(菌株为ATCC976)使其达到OD＝0.1后进行相应的试验，结果如图7。
0.2mM H2O2胁迫处理组的生长曲线可以看出，0.2mM H2O2造成的胁迫对生长有一定的影响，但影响较小。当分别加入100μM、300μM、500μM的槲皮素进行预处理的生长曲线结果表明：100μM、300μM、500μM均可使生长曲线恢复到正常状态，其中，300μM、500μM在比较时扣除相应的槲皮素产生的背景。
从1.0mM H2O2胁迫处理组的生长曲线可以看出，槲皮素的前处理对于酵母受到H2O2的胁迫有一定程度的抵抗或保护作用，可以恢复酵母的生长力，进而缩短H2O2胁迫处理下酵母从迟滞期进入指数期的时间，甚至能够缩短酵母进入平台期(稳定期)的时间。500μM槲皮素处理表现为进入对数期时间最早，100μM槲皮素处理次之，300μM槲皮素处理最后，但三种浓度处理均比1.0mM H2O2胁迫处理的酵母生长快。
2.0mM H2O2胁迫处理下，槲皮素达到500μM时，起到的缓解作用较为明显，100μM、300μM处理组与对照组2.0mM H2O2的生长趋势比较相似，100μM、300μM处理组的生长速度略快于2.0mM H2O2处理组。
从上述实验结果可反映菌株ATCC9763的抗逆性强，因而，我们对于酿酒的H2O2氧化胁迫模型的材料选取上，选择菌株ATCC9763，以下都是基于菌株ATCC9763以上试验基础做的测定。
4.抗氧化指标的测定
1)胞内活性氧(ROS)含量
通过前期处理后，加入荧光探针DCFH-DA，孵育后用酶标仪检测酵母细胞的荧光强度，以荧光强度的高低来评断酵母胞内活性氧含量的多少。从图8可看出，与对照组(CK)相比，活性氧阳性对照试剂(ROSup)、H2O2处理后的荧光强度均升高，且荧光强度随H2O2浓度增加升高趋势增强。表明在H2O2处理下，酵母胞内活性氧的含量增加，说明H2O2的处理对酵母的正常生长形成了氧化胁迫环境。
加入槲皮素预处理后，无论是阳性对照组、H2O2处理组还是菌液对照组(CK)样品的荧光强度都有不同程度的降低；与各对照组相比，加入槲皮素处理后，胞内ROS含量存在显著差异，作用效果明显图(如8和图9所示)。结果表明，经100μM、300μM、500μM槲皮素预处理后酵母细胞内活性氧水平被降低。在相同槲皮素浓度处理下，随H2O2浓度增加，其降低胞内活性氧的能力总体呈下降趋势。H2O2浓度越高，其导致荧光强度的增加、胞内活性氧水平的升高越是难以降低。由图9可以看出，三种浓度的槲皮素作用效果相近，都在50％左右，500μM的效果略好；其余处理组中，100μM降低活性氧水平的能力不如300μM、500μM。
从总体效果来看，除槲皮素处理对照组外，在其余处理组中300μM槲皮素的处理效果均比500μM槲皮素的好，其降低活性氧水平的比例要高于500μM槲皮素处理组。在各处理组中，与H2O2胁迫处理组相比，100μM槲皮素平均可以使胞内活性氧水平降低38.6％，300μM时可降低55.1％，500μM时可降低51.2％。各处理组之间的差异性如图9所示。
2)抗氧化相关蛋白酶的活性
槲皮素处理对不同浓度H2O2胁迫下酵母生长的具有缓解作用，同时，酵母体内的ROS也发生了变化，为此本研究检测了酵母胞内抗氧化相关酶的活性(如图10，图11，图12所示)。
过氧化氢酶(CAT)和过氧化物歧化酶(SOD)在槲皮素处理后的活性变化趋势是一致的。单加助剂DMSO的酵母中的CAT和SOD酶的活性比对照组相比均增加了约1倍左右，但不同浓度的槲皮素预处理却使CAT和SOD酶的活性有不同程度的下降(图10a，图11a)。当对酵母进行H2O2胁迫时，随着H2O2浓度的升高，CAT和SOD酶的活性随之升高(图10b，图11b)。然而，在对酵母进行了槲皮素预处理的H2O2胁迫的样品种，CAT和SOD酶的活性与对照组和单加H2O2胁迫组的样品相比，均发生了变化。
在低浓度(0.2mM)H2O2胁迫时，随着槲皮素预处理浓度的上升，CAT和SOD酶的活性逐步下降，趋势与未受H2O2胁迫的单加槲皮素组的趋势一致。其中，50μM槲皮素预处理的样品的酶活性与对照基本相同，而当浓度高于50μM时，CAT和SOD酶的活性逐步下降(图10b，图11b)。在中等浓度(1.0mM)H2O2胁迫时，CAT酶的活性与对照组和单加H2O2胁迫组的样品相比有所下降，300μM槲皮素预处理时达到最低，500μM槲皮素预处理时，有所回升，与单加H2O2胁迫组的样品相持平。SOD酶的活性与对照组和单加H2O2胁迫组的样品相比，差异不大，仅在300μM槲皮素预处理时SOD酶的活性有所下降(图10b，图11b)。当对酵母进行高浓度(2.0mM)H2O2胁迫时，CAT和SOD酶的活性与对照组和单加H2O2胁迫组的样品相比有所变化。50μM槲皮素预处理的样品的酶活性比仅2.0mM H2O2胁迫的样品有所下降，但到100μM和300μM槲皮素预处理时，CAT和SOD酶的活性与对照组和单加H2O2胁迫组的样品相比明显上升，且300μM槲皮素预处理时酶活性最高，而500μM槲皮素预处理时酶活性有所下降。
过氧化物酶(POD)与CAT和SOD酶的活性变化完全不同。当单加助剂DMSO的酵母中的POD酶的活性比对照组相比均增加了约1倍左右，但不同浓度的槲皮素预处理却使POD酶的活性有不同程度的变化(图12a)。当槲皮素浓度为50μM和100μM时，POD酶的活性与对照比有所升高，但是与助剂DMSO比有所下降。当槲皮素浓度为300μM和500μM时，POD酶的活性与对照比有所升高了4倍和8倍。
当对酵母进行H2O2胁迫时，随着H2O2浓度的升高，POD酶的活性随之逐步升高(图12b)。当在低浓度(0.2mM)H2O2胁迫时，POD酶的活性在50μM和100μM槲皮素预处理浓度时下降，而在300μM和500μM时POD酶的活性与单加H2O2胁迫组的样品相比逐步上升，趋势与未受H2O2胁迫的单加槲皮素组的趋势一致。在中等浓度(1.0mM)H2O2胁迫时，随着槲皮素预处理浓度的上升，POD酶的活性在50μM时下降，而100μM、300μM和500μM时，POD酶的活性与单加H2O2胁迫组的样品相比逐步上升。当对酵母进行高浓度(2.0mM)H2O2胁迫时，POD酶的活性在50μM和100μM槲皮素预处理浓度时下降，而在300μM和500μM时POD酶的活性与单加H2O2胁迫组的样品相比上升了6倍和4倍。期中300μM预处理后进行2.0mM H2O2胁迫时，POD酶的活性达到最高点。
因此，从上述结果可以看出不同浓度的槲皮素处理后，并没有直接试细胞内的CAT、SOD和POD酶的活性逐步上升，相反，CAT和SOD均有所下降，而POD是先下降再上升的过程。从槲皮素的作用浓度来说，50μM近乎于没有效应，这与生长曲线结果相吻合。
3)抗氧化相关基因的表达
对鉴于酵母体内抗氧化酶发生的变化，本研究中检测了CTT、SOD1、SOD2、GPX1和GPX2五个氧化应激因子基因的表达变化(如图13所示)。从实验结果来看，助剂DMSO几乎不影响基因的表达。在单加槲皮素处理的样品中，CTT基因和GPX1基因，在50μM和100μM槲皮素处理浓度时下降，而在300μM和500μM时表达上升；SOD1基因随着槲皮素浓度上升而表达增强，GPX2基因和SOD2基因受槲皮素影响较小。
当对酵母进行H2O2胁迫时，随着H2O2浓度的升高，基因表达也发生了相应的变化(图14)。当在低浓度(0.2mM)H2O2胁迫时，CTT、GPX2和SOD2基因无论单加槲皮素处理时的表达模式如何，均表现为下调表达；GPX1基因则表现为上调表达；SOD1基因表达变化无显著差异。在中等浓度(1.0mM)H2O2胁迫时，所以基因的表达均上调了2倍以上。GPX1、GPX2和SOD2的表达变为槲皮素预处理样品基因表达均高于无槲皮素预处理的H2O2胁迫样品和对照样品，且随着槲皮素浓度梯度的升高，表达趋势为先升高再下降过程，其中100μM槲皮素预处理时，基因表达最高。SOD1基因随着槲皮素浓度上升而表达增强，而H2O2处理后50μM和100μM槲皮素处理表达下降，300μM和500μM处理时表达恢复到仅H2O2处理的基因表达水平。然而，CTT基因则表现为随浓度梯度下降，300μM时最低，500μM时表达有所回升。当对酵母进行高浓度(2.0mM)H2O2胁迫时，CTT和GPX1的表达下降，GPX2和SOD1表达增强，SOD2表达变化不大。CTT基因在槲皮素预处理后比仅2.0mM H2O2胁迫时的表达量降低；而GPX1则在槲皮素预处理后表达无变化；GPX2基因在槲皮素预处理后与2.0mM H2O2胁迫时的表达量相比，表现为先上升再下降，其中50μM和100μM槲皮素处理表达升高，而300μM和500μM处理时则下降；SOD1则是表达均增强。
由上述结果可知，随着H2O2胁迫浓度的增加，CTT、SOD1、SOD2、GPX1和GPX2五个氧化应激因子基因有着不同的变化(表1)所示。槲皮素作为具有抗氧化活性的物质，对酵母细胞进行预处理之后，CTT、SOD1、SOD2、GPX1和GPX2五个氧化应激因子基因对槲皮素有着不同的响应，其原因是槲皮素可能会直接影响这些基因的变化，或者氧化应激反应间接的影响这些基因的变化。
表1不同浓度H2O2处理对氧化应激因子基因的影响汇总
槲皮素具有对人体有益的作用，是由于其具有的内在抗自由基性质，而不是由于其铁螯合功能或诱导内源性抗氧化防御机制的功能。本发明通过槲皮素预处理酿酒酵母ATCC9763和S288c后以H2O2胁迫处理。通过对其生长曲线的分析，并对其酵母胞内活性氧的水平、酶和基因的变化等进行了分析，结果表明酵母ATCC9763对H2O2胁迫的反应和稳定性要好于S288c。
本实施例结果得到，槲皮素处理菌株ATCC9763的最适浓度是300μM。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (10)
1.一种抗氧化物质抗氧化活性的评价方法，其特征在于，所述评价方法以酿酒酵母为模型，包括以下步骤：
1)构建酿酒酵母氧化胁迫模型：将酿酒酵母进行接种培养，再加入氧化剂氧化胁迫培养，得酿酒酵母氧化胁迫模型，为对照组；
2)处理组：在接种的酿酒酵母中加入供试样品培养，再加入氧化剂氧化胁迫培养，得处理组；
3)通过测定比较对照组与处理组中酿酒酵母生长与酿酒酵母中抗氧化指标来评价供试样品的抗氧化活性。
2.根据权利要求1所述的评价方法，其特征在于，所述酿酒酵母为菌株ATCC9763。
3.根据权利要求1所述的评价方法，其特征在于，步骤1)与步骤2)所述氧化剂为H2O2，所述H2O2的浓度为0.2mM～2.0mM。
4.根据权利要求1所述的评价方法，其特征在于，步骤2)所述酿酒酵母培养培养时接种浓度为OD600＝1.0的酵母种，以培养液体积的1％为接种量，28℃培养至OD600＝0.1(约4h)时加入供试样品，供试样品预先与酿酒酵母培养0.3～7h后进行H2O2氧化胁迫；所述氧化胁迫培养的时间为18～25h。
5.根据权利要求1所述的评价方法，其特征在于，步骤3)所述抗氧化指标包括活性氧(ROS)含量、抗氧化相关蛋白酶的活性、抗氧化相关基因的表达的一种或多种。
6.根据权利要求5所述的评价方法，其特征在于，所述抗氧化相关蛋白酶包括过氧化氢酶(CAT)、过氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)的一种或多种；所述酵母抗氧化相关基因包括CTT，SOD1，SOD2，GPX1，GPX2的一种或多种。
7.根据权利要求1所述的评价方法，其特征在于，步骤2)所述供试样品用0.1％DMSO稀释后再加入到接种培养的酿酒酵母中。
8.根据权利要求1所述的评价方法，其特征在于，步骤2)所述供试样品为抗氧化物质，包括类黄酮物质。
9.根据权利要求8所述的评价方法，其特征在于，所述类黄酮物质包括槲皮素。
10.权利要求1所述的酿酒酵母氧化胁迫模型在研究胞内抗氧化机制中的应用。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20171208 |
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