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CN108355167A - 一种缓释sdf-1的壳聚糖包被bcbb骨修复支架材料及其制备方法 - Google Patents

一种缓释sdf-1的壳聚糖包被bcbb骨修复支架材料及其制备方法 Download PDF

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CN108355167A
CN108355167A CN201810393340.3A CN201810393340A CN108355167A CN 108355167 A CN108355167 A CN 108355167A CN 201810393340 A CN201810393340 A CN 201810393340A CN 108355167 A CN108355167 A CN 108355167A
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sdf
bcbb
bone
weeks
chitosan
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李彦林
肖渝
韩睿
高寰宇
余洋
蔡国锋
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Original Assignee
First Affiliated Hospital of Kunming Medical University
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Abstract

本发明涉及一种缓释SDF‑1的壳聚糖包被BCBB骨修复支架材料及其制备方法，属于骨移植替代材料及骨组织工程技术领域。本发明是为了克服SDF‑1生物利用率低，防止SDF‑1因子过快释放失效，无法发挥其对MSCs细胞的趋化作用的问题，所提供的材料不仅能较好地解决SDF‑1在局部很快被稀释和被酶分解的缺点，还能保证在一段时间内持续缓慢释放SDF‑1因子，保障SDF‑1在骨缺损中一定时间内趋化MSCs参与缺损修复，同时调节局部组织BMP‑2表达升高，促进MSCs的分化增殖，促进新骨形成和血管生成，而且携载SDF‑1的BCBB支架在一定时间内会被降解吸收，并且被新生骨组织替代，从而更好地修复骨缺损。

Description

一种缓释SDF-1的壳聚糖包被BCBB骨修复支架材料及其制备 方法
技术领域
本发明属于骨移植替代材料及骨组织工程技术领域，具体涉及一种缓释SDF-1的壳聚糖包被BCBB骨修复支架材料及其制备方法。
背景技术
临床上常因创伤或骨肿瘤手术切除所致的骨缺损十分常见，而骨缺损部位常常局部缺乏充足的血液供应、修复组织爬附生长的三维结构、缺乏参与骨修复的成骨细胞，故缺损自身修复能力十分有限。骨缺损修复的金标准目前仍然是自体松质骨移植，但自体骨来源受限往往不能满足大范围骨缺损修复的需要。异体骨移植材料虽然目前临床应用较为常见，但费用高、传播潜在疾病和远期修复效果不佳等问题。人工合成生物修复材料具有良好的生物组织相容性、可降解性强及来源丰富等优点，但材料成分单一，其孔隙结构和成分不能模仿天然骨结构系统，骨修复能力有限，成本高，目前市场上的骨缺损修复生物材料无法完全修复大范围骨缺损。异种骨修复材料因其来源广泛、成本低、具有天然骨结构及生物学特性等方面的优势而受到广泛关注。目前已有不少关于源于动物骨或珊瑚的新型骨修复材料研究报道，部分异种骨修复材料如瑞士盖氏公司的BioOssTM骨已在临床上使用多年，且其具有一定的骨修复效果，但无法达到自体骨修复效果，更不能修复大范围骨缺损。良好的骨修复材料不仅能为修复组织提供三维空间支撑的问题，而且修复材料还应具有骨诱导及自身成骨的特点，即使满足这些条件仍无法解决大范围骨缺损时局部修复细胞缺乏、微环境改变和修复时间长等问题，所以单纯运用生物材料进行骨缺损修复时会出现骨缺损不完全修复或不修复问题。自上世纪80年代以来，组织工程技术不断发展，为人类解决受损骨组织修复或替代带来新希望，骨组织工程是将细胞生物学与材料工程技术结合，研发出可完全修复大范围骨缺损的材料。
修复材料和正常组织的相互整合是运用组织工程方法修复骨缺损的关键，这一过程与三种因素关系密切：①种子细胞，②支架材料，③生长因子。虽然目前自体胚胎干细胞是利用价值最高的全能干细胞，作为组织修复种子细胞的最佳选择，但需面对来源受限及复杂的伦理问题，难以在临床工作中推广运用。近年来从骨、软骨、滑膜、脂肪、心、脑、肝、肾等组织中分离得到的间充质多能干细胞，不仅来源广，可在体外扩增培养，而且能多次传代后依然保留其分化潜能，已成为组织工程种子细胞的新焦点，故种子细胞的存在与否是影响修复结果的一个关键因素。骨组织工程的支架材料主要分为无机合成材料，如：HA、β-TCP、BCP、半水合硫酸钙，钛合金等；有机合成材料，如：胶原、PLA、PGA、PLGA等；生物衍生材料，如：骨胶原、骨HA、珊瑚HA、海藻酸、壳聚糖等以及多种成分的混合材料。生物衍生支架不仅具有良好的生物相容性和良好的生物降解性，而且来源广，天然自带的生物活性基团对种子细胞粘附、增殖及分化发挥很好作用，与人工合成支架材料相比有着无可比拟的天然优势。损伤组织修复的过程是多种细胞因子同时产生和发挥作用的一个综合的复杂过程，目前研究尚未明确骨缺损修复中具体的分子生物学机制，但部分细胞因子如BMP-2、SDF-1、VEGF、bFGF等参与骨修复的过程已经被证实，随着骨缺损修复机制研究的不断深入，今后可根据骨缺损修复不同时期的需要调控各个因子的表达，以达到大范围骨缺损的完全修复。
双相陶瓷样生物骨(Biphasic ceramic biologic bone,BCBB)属于生物衍生支架材料范畴，其制作方法主要是将异种松质骨经高温煅烧、焦磷酸钠浸泡处理后让天然骨中的HA部分转变成β-TCP，使材料不仅具备一定的机械强度，同时还兼具易降解能力。该材料保留了天然松质骨的多孔结构，具有良好的骨传导作用，同时经过高温煅烧后的支架具有一定的机械强度，能为种子细胞增殖修复和组织长入提供三维支撑空间结构，同时材料为HA/β-TCP两种物相的混合，还具有一定的骨传导性能，该无机HA/β-TCP成分具有骨组织亲和性，可在骨组织界面形成骨-材料界面，有利于细胞的爬附、增殖和分化。我们前期BCBB支架修复兔桡骨缺损模型发现该支架能辅助修复桡骨缺损，进一步将携载细胞的BCBB用于兔骨节段性缺损修复研究发现，组织工程化的BCBB对骨缺损的修复较单一BCBB支架效果更佳。
本申请的发明人经研究后发现，单一BCBB支架较复合细胞因子或干细胞的BCBB支架在动物骨缺损修复研究中效果差。近年来有文献报道SDF-1作为趋化干细胞(mesenchyalstem cells,MSCs)的细胞因子备受关注，其具有趋化含CXCR4受体细胞尤其是趋化MSCs归巢作用，并有上调MSCs表面CXCR4受体表达的作用。有研究发现在骨缺损动物模型中，受损部位的SDF-1表达会增加，具有局部释放SDF-1能力的支架在组织损伤的修复效果上优于对照组(对照组是无释放SDF-1能力的支架)，搭载过表达CXCR4受体的MSCs的支架在组织损伤修复效果上也优于对照组。基于上述研究结果，大范围骨缺损原位修复的想法已变得可能，即利用体内自身MSCs的归巢、原位增殖和分化完成大范围骨缺损处骨组织的完全修复。目前国内外研究主要是利用人工合成材料如PLGA、PLA、人工合成HA、人工合成β-TCP、胶原多孔支架等与SDF-1结合来进行研究，尚无利用BCBB材料携载SDF-1进行骨缺损修复的研究。因此，本申请发明人在前期的研究基础上，将BCBB作为支架材料与SDF-1复合，使其携载有趋化MSCs归巢的细胞因子的骨组织修复材料，利用体内自身的MSCs到达骨缺损部位从而实现骨缺损的原位修复。迄今研究表明，SDF-1在骨缺损中会趋化MSCs参与骨缺损修复，同时调节局部组织BMP-2表达升高和促进血管生成，促进MSCs的分化增殖。但有报道指出，若支架直接搭载SDF-1，细胞因子会很快完全释放，被组织中的蛋白酶分解，SDF-1释放过程短暂而达不到趋化MSCs的目的，如若大剂量使用SDF-1，其成本将会非常高昂，并且本发明人前期的研究中发现，SDF-1对MSCs的趋化效果存在二重性作用，过高或过低的浓度均不能达到对MSCs有效的趋化归巢作用。故完善高效的SDF-1缓释系统，使细胞因子更有效地作用于MSCs，可增强组织工程化骨修复骨缺损的能力。
壳聚糖(Chitosan，CS)为一种天然多糖聚合物，自然环境中储备丰富，来源广泛，具有生物相容性好、可降解性强、无细胞毒性、一定的抗菌性，且带有正电荷，易吸引负电荷蛋白的特性，同时对带有正电荷性质的SDF-1无吸附作用，目前以CS为缓释载体制备的蛋白或药物缓释载体已被广泛应用各类药品和生物材料。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种缓释SDF-1的壳聚糖包被BCBB骨修复支架材料及其制备方法，以克服SDF-1生物利用率低，防止SDF-1因子过快释放失效，无法发挥其对MSCs细胞的趋化作用的问题。该材料不仅能较好地解决SDF-1在局部很快被稀释和被酶分解的缺点，还能保证在一段时间内持续缓慢释放SDF-1因子，保障SDF-1在骨缺损中一定时间内趋化MSCs参与缺损修复，同时调节局部组织骨形态形成蛋白2(bonemorphogenetic protein 2，BMP-2)表达升高，促进MSCs的分化增殖，促进新骨形成，并促进血管生成，而且携载SDF-1的BCBB支架在一定时间内会被降解吸收，并且被新生骨组织替代，从而更好地修复骨缺损。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种缓释SDF-1的壳聚糖包被BCBB骨修复支架材料的制备方法，包括如下步骤：
步骤(1)，将壳聚糖溶解于体积浓度为1％醋酸溶液中至壳聚糖浓度为20mg/ml，再向其中加入SDF-1至SDF-1浓度为400ng/ml，得到SDF-1/CS缓释液；
步骤(2)，将BCBB支架置于SDF-1/CS缓释液中，超声30min，取出干燥，得到缓释SDF-1的壳聚糖包被BCBB骨修复支架材料(SDF-1/CS/BCBB支架)。
进一步，优选的是，其特征在于，所述的壳聚糖粘度为50～800mpas，脱乙酰度为90～95％。
进一步，优选的是，将壳聚糖溶解于体积浓度为1％醋酸溶液中时，采用搅拌的方式使壳聚糖溶解；加入SDF-1后，搅拌至其混合均匀。
进一步，优选的是，搅拌时间均为2h。
进一步，优选的是，超声的频率为40kHz。
进一步，优选的是，所述的干燥方式为自然风干。
进一步，优选的是，BCBB支架的制备方法包括如下步骤：
采用市售新鲜猪骨的松质骨，于蒸馏水煮至少6h，干燥过夜，然后于马弗炉内以10℃/min的升温速度升至800℃后保持温度煅烧1h，之后置于浓度为0.04mol/ml的焦磷酸钠溶液中超声30min，取出，干燥过夜，再于马弗炉内以10℃/min的升温速度升至1150℃后保持温度煅烧1h，自然冷却后，120℃高温高压消毒，制得BCBB支架。
第一次煅烧意义：通过高温去除猪松质骨内有机物、抗原性、免疫性，保留原有的骨小梁、小梁间隙多孔结构。第二次煅烧意义：覆盖于表面的焦磷酸钠和骨内无机盐在高温下发生化学反应，生成β-TCP，增加BCBB支架的β-TCP含量。缓慢升温速度目的：第一次缓慢升温有助于有机物的除去，避免无机盐在急剧温度变化下发生变性。第二次缓慢升温有助于焦磷酸钠和无机盐反应彻底，增加β-TCP的生成量。
进一步，优选的是，水煮之前，需先将猪骨的松质骨制备成大小范围为0.5cm×0.5cm×0.5cm至1.0cm×1.0cm×1.0cm块状物或1.5cm×0.5cm×0.5cm至2.0cm×1.0cm×1.0cm条形物。
进一步，优选的是，超声的频率为40kHz。
本发明还提供上述制备方法制得的缓释SDF-1的壳聚糖包被BCBB骨修复支架材料的制备方法。
本发明的思路是：结合壳聚糖的特点，思考到若应用CS制备携载SDF-1细胞因子的缓释系统以期在骨缺损中持续缓慢释放基质细胞衍生因子-1(SDF-1)，可望很好地修复骨缺损。故本申请发明人将BCBB携载并缓释SDF-1来修复大段骨缺损研究发现该支架在成骨性能和生物相容性能上表现优异，并与自体骨相当，是一种理想的骨缺损修复材料。
本发明与现有技术相比，其有益效果为：
(1)本发明具有制备BCBB方法便捷，原材料来源丰富，可大量获取，经济廉价的特点；可按缺损的形状制成不同的形状和大小的修复材料，应用方便；既保留了猪松质骨中相互交通的天然网状空隙结构，空隙直径达(514±270)μm，孔隙率达(60.19±6.47)％，可为细胞提供宽大的内表面积附着空间和细胞增殖空间，利于种子细胞的黏附、增殖和分化，且材料具有良好的细胞相容性、生物相容性和降解性，是一种良好的骨组织工程支架材料。
(2)选用CS作为材料表面修饰物，因为其具有毒性小、相容性好、可降解性高的优点，同时，甲壳素作为CS的原料，在地球上储量巨大，来源丰富。CS的等电点为10.9，在体内条件下带有正电荷，这与同为带正电荷的SDF-1混合后，相同电荷性质可使SDF-1从溶胀的壳聚糖中释放而不会被CS和支架材料吸附，而且CS本身的化学结构使它具有一定的抗菌性。它的凝胶性提供了可粘附于生物材料上形成修饰薄膜，此外CS还具有药物缓释功能，SDF-1/CS缓释系统的有效缓释时间可达9d以上。
(3)本发明产品具有极低的免疫原性，经动物实验证实，SDF-1/CS/BBCB支架移植后免疫排斥反应低，无发生免疫排斥反应的记录，并且具有较强的诱导骨生成作用，在大段骨缺损动物模型中12w可见明显骨再生，24w完全修复骨缺损。同时该缓释支架还可以搭载其他细胞因子或特殊抗菌药物，满足其他特殊情况的需要。
附图说明
图1 SDF-1/CS/BCBB支架材料、CS/BCBB支架材料和BCBB大体观：肉眼观SDF-1/CS/BCBB支架材料外观呈棕红色海绵状，表面见多孔结构，表面孔隙与深层孔隙相连通，孔隙大小不等；CS/BCBB支架材料呈淡黄色，而BCBB呈亮白色；
图2 CS/BBCB支架扫描电镜形貌特征：SEM观察见支架内部布满大小不等的天然的网架孔隙结构，各孔隙相互交通未被CS堵塞，孔隙内壁表面放大观察可见多孔海绵样结构CS均匀包被；
图3 FITC标记的CS包被BCBB支架后荧光显像：可见支架呈绿色多孔结构，透过支架表面孔隙可见深部孔隙内壁包被的CS发出亮绿色荧光，说明超声包被法是有效便捷的CS包被方法；
图4细胞相容性研究中，与BMSCs共培养时CCK-8法检测细胞增殖情况；结果显示S/BCBB支架对BMSCs增殖无明显影响，细胞毒性小，细胞相容性好；
图5 CS/BCBB支架与BMSCs共培养8天倒置相差显微镜结果；结果显示CS/BCBB对细胞无明显毒性，细胞相容性好；
图6 CS/BCBB支架与细胞共培养培养8天的电镜扫描结果；结果显示细胞在材料表面粘附生长良好，细胞相容性好；
图7细胞色素C的吸光波长图和标准曲线图；其中，左图为吸光波长图，右图为标准曲线图；
图8缓释浓度曲线图；其中，左图是细胞色素C/CS/BCBB支架的缓释浓度曲线图；右图是SDF-1/CS/BCBB支架缓释浓度曲线图；横坐标表示时间(d)；纵坐标表示累计释放量(μg/mL)；
图9 Transwell小室法检测支架趋化BMSCs实验图；
图10 Transwell小室法检测支架趋化BMSCs穿膜细胞对比图；其中A为BCBB支架组，B为CS/BCBB支架组，C为SDF-1/CS/BCBB支架组；
图11三组支架组趋化BMSCs细胞计数直方图；横坐标为分组情况；纵坐标表示细胞数量；
图12 BCBB支架、CS/BCBB支架、SDF-1/CS/BCBB支架植入大鼠后腿肌袋时情况；左图为实验动物，右图为支架植入示意图；
图13 BCBB支架、CS/BCBB支架、SDF-1/CS/BCBB支架植入4周和8周时支架与周围肌肉组织大体观；
图14 BCBB支架、CS/BCBB支架、SDF-1/CS/BCBB支架4周和8周时取材后大体观；
图15 BCBB支架、CS/BCBB支架、SDF-1/CS/BCBB支架植入肌袋4w时脱钙切片进行HE和Masson染色显微镜观察结果；
图16 BCBB支架、CS/BCBB支架、SDF-1/CS/BCBB支架植入肌袋8w时脱钙切片HE和Masson染色显微镜观察结果；
图17显微镜观察植入8w长入BCBB支架、CS/BCBB支架、SDF-1/BCBB支架内的组织血管情况；
图18显微镜观察BCBB支架植入4w后脱钙切片Ⅰ型胶原免疫组化染色结果；
图19显微镜观察SDF-1/CS/BCBB支架植入4w后脱钙切片Ⅰ型胶原免疫组化染色结果；
图20显微镜观察BCBB支架植入8w后脱钙切片Ⅰ型胶原免疫组化染色结果；
图21显微镜观察SDF-1/CS/BCBB支架植入8w后脱钙切片Ⅰ型胶原免疫组化染色结果；
图22显微镜观察BCBB支架植入8w后硬组织切片HE染色结果；S处表示支架；黑色箭头指示胶原组织；
图23显微镜观察SDF-1/CS/BCBB支架植入8w后硬组织切片HE染色结果；S处表示支架；黑色箭头指示胶原组织；白色箭头指示不成熟的软骨组织；黑底白箭头指示血管；
图24 Photoshop CS6软件计算各组支架组织长入直方图；横坐标表示分组情况；纵坐标表示组织长入率(％)；
图25异位成骨4w后硬组织切片HE染色结果；
图26异位成骨8w后硬组织切片HE染色结果；
图27异位成骨12w后硬组织切片HE染色结果；
图28异位成骨4w后硬组织切片VG染色结果；
图29异位成骨8w后硬组织切片VG染色结果；
图30异位成骨12w后硬组织切片VG染色结果；
图31异位成骨计量分析直方图；
图32制备兔桡骨1.5cm缺损模型图；
图33各组2周时大体标本肉眼观；
图34各组4周时大体标本肉眼观；
图35各组8周时大体标本肉眼观；
图36各组12周时大体标本肉眼观；
图37各组24周时大体标本肉眼观；
图38显微镜观察空白组4周时免疫组化结果，未见阳性细胞；
图39显微镜观察自体骨组4周时免疫组化结果，可见大量阳性细胞(白色箭头示)；
图40显微镜观察BCBB组4周时免疫组化结果，偶见阳性细胞沿材料-组织界面分布(白色箭头示)；
图41显微镜观察SDF-1/CS/BCBB支架组4周时免疫组化结果，可见许多阳性细胞沿材料-组织界面分布(白色箭头示)；
图42空白组2周、4周、8周、12周、24周X摄片结果，各组均可见骨缺损透亮区，随时间推移，骨折端逐渐吸收、硬化；
图43自体骨组2周、4周、8周、12周、24周X摄片结果，植入骨与断端对合好，8周时断端间隙还能分辨，12周和24周植入骨基本被吸收，形态与桡骨相似，髓腔基本再通；
图44 BCBB组2周、4周、8周、12周、24周X摄片结果，材料与宿主骨对合良好，4周后出现骨痂，8周材料部分吸收，12周部分位置出现新生骨，24周材料与宿主骨结合，两者之间分界存在；
图45 SDF-1/CS/BCBB组2周、4周、8周、12周、24周X摄片结果，材料与宿主骨对合良好，4周与宿主骨连接紧密，8周材料部分吸收，12周材料大部分被新生骨组织替代，24周时缺损完全修复，接近正常桡骨.；
图46各组X线评分直方图；
图47各组2周时硬组织切片HE染色结果；
图48各组4周时硬组织切片HE染色结果；
图49各组8周时硬组织切片HE染色结果；
图50各组12周时硬组织切片HE染色结果；
图51各组24周时硬组织切片HE染色结果；
图52各组4周时硬组织切片VG染色结果；
图53 C组、D组4周硬组织切片VG染色高倍镜观察结果；
图54各组8周时硬组织切片VG染色结果；
图55 C组、D组8周时硬组织切片VG染色高倍镜观察结果；
图56各组12周时硬组织切片VG染色结果；
图57各组24周时硬组织切片VG染色结果；
图58用Photoshop CS6软件直方图功能计算成骨量；
图59各组成骨量计算结果直方图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
本发明除非另有说明，否则百分数代表质量百分数。
实验例1：
1、BCBB支架的制备
(1)采用市售新鲜猪骨，取其松质骨，制备成0.5cm×0.5cm×0.5cm至1.0cm×1.0cm×1.0cm块状物或1.5cm×0.5cm×0.5cm至2.0cm×1.0cm×1.0cm条形物；
(2)于蒸馏水煮6h，干燥过夜；
(3)800℃马弗炉内煅烧1h，升温速度10℃/min；
(4)置于0.04mol/ml焦磷酸钠溶液中于40KHz超声振动30min，干燥过夜；
(5)再次1150℃马弗炉内煅烧1h，升温速度10℃/min；
(6)120℃高温高压消毒，得BCBB支架(图1)。
2、CS包被BCBB情况、包被质量变化、细胞相容性、缓释能力检测：
(1)200mg CS(粘度50～800mpas，脱乙酰度90～95％)，加入到10ml 1％v/v醋酸溶液中，搅拌2h充分溶解，得到2％CS液，再将BCBB支架置于其中，玻璃试管内40KHz超声振动30min使CS液进入BCBB支架孔隙内部，取出自然风干，可见SDF-1/CS/BCBB支架呈现出棕红色，CS/BCBB支架呈现出淡黄色(图1)。
(2)随机选取CS包被后的BCBB，酒精浓度梯度脱水冻干后，粘样喷金放入扫描电镜。观察包被后BCBB形态变化，BCBB支架表面可见包被有多孔的CS(图2)。
其中，酒精浓度梯度脱水冻干和粘样喷金的具体步骤为：乙醇梯度脱水(分别为30％、50％、70％、85％、90％乙醇各1次，100％乙醇2次，15min/次)。将样品分别在20℃、40℃和80℃冷冻12h，于冷冻干燥仪中干燥12h，备用。将干燥好的支架用镊子取出，用导电胶把支架粘附在铝制托盘上，用离子溅射镀膜仪在样品表面镀上一层1500nm厚度的金属膜。
(3)将BCBB支架放置于预先配制的100μg/ml的FITC绿色荧光标记的CS液中(该部分CS加入了FITC荧光标记，写作FITC-CS/BCBB，仅限该部分使用了FITC-CS/BCBB)，超声30min，使壳聚糖溶液完全进入BCBB孔隙中。超净台内风干过夜。倒置荧光显微镜下观察可见包被于BCBB内孔隙表面发出亮绿色荧光的CS(图3)，表明超声振动的方法可将CS有效均匀包被于BCBB支架的多孔内壁。
(4)随机选取5块BCBB支架，称重后记下每块支架重量，记为W0，随后进行CS包被，50℃鼓风式烘箱中干燥过夜，再次称重记为W1，ΔW＝(W1-W0)/W0×100％，并进行统计学分析，测得的BCBB的包被后平均质量增加53.2±9.63％(表1)。
表1包被壳聚糖前后支架质量比较(n＝5,)
其中，T：T检验(Student's t test)，主要用于样本含量较小(例如本例n＝5)，总体标准差σ未知的正态分布资料。
P：P值(P value)就是当原假设为真时所得到的样本观察结果或更极端结果出现的概率。如果P值很小，说明原假设情况的发生的概率很小。
S：标准差(Standard Deviation)，是离均差平方的算术平均数的平方根，反映一个数据集的离散程度。
(5)细胞相容性研究：实验分为3组，实验A组为BCBB支架；实验B组CS/BCBB支架组；实验C组为空白对照组(无支架)，按以上相应分组将支架放入4块96孔培养板中(该实验中每组均有20个样本，每组5个样本放入1块板，即每块板都有A、B、C组样本5个，共计4块板)，每组有5个复孔，采用LG-DMEM完全培养基培养24h，未发现细菌污染。吸去培养基后，按以上相应分组将BMSCs按密度为5×104个/mL 100μL接种于三组中，于37℃、5％CO2培养箱中培养，LG-DMEM完全培养基培养，每2天换液一次。分别按培养后第2、4、6、8天取出一块培养板，吸去培养基，每孔加入新培养基100μl，在避光条件下每孔加入CCK-8液体10μl，放入培养箱中孵育2h后检测OD值，并绘制生长曲线，并做统计学分析。倒置相差显微镜观察第8天细胞与支架共培养生长良好，电镜观察第8天细胞能很好的粘附于CS/BCBB支架之上(图5，图6)。CCK-8法细胞增殖检测得到细胞与支架共培养2天后各组间OD值无统计学差异(P＞0.05)。培养第8天后3组的OD值统计分析显示BBCB支架组与CS/BBCB支架组间无明显统计学差异(P＞0.05)，但CS/BBCB支架组与空白对照组间存在统计学差异(P＜0.05)(图4)。
(6)运用细胞色素C释放实验检测包被层缓释功能。
1)将25mg的细胞色素C用10ml双蒸水溶解后得到母液，分别取母液0.1ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml、1.2ml稀释至总体积为2ml，得到细胞色素C浓度62.5μg/ml、250μg/ml、357μg/ml、500μg/ml、625μg/ml、750μg/ml的溶液，进行紫外分光吸光度检测绘制标准曲线(图7)，细胞色素C的最大紫外吸收波长为410nm，在该波长下测定吸光度。
2)取2.5mg/ml细胞色素C溶液1.6ml，加入到10ml 2％CS液中，得到约浓度为400μg/ml细胞色素C/CS液，将大小为1.0cm×0.5cm×0.5cm的6块BCBB支架放入其中，40KHz超声振动30min后取出，风干过夜，得到细胞色素C/CS/BCBB支架。将风干后的支架用PBS预湿2h，按每孔1块数量放入六孔培养板中，每孔加入4.5ml PBS液后放入37℃、湿度97％细胞培养箱中孵育模拟体内环境。分别于第1天、2天、3天、6天、9天将浸泡液体吸出，再加入4.5mlPBS继续浸泡。将浸泡液分别加入3个比色皿中，每个加入1ml，进行紫外分光吸光度检测，计算所得浓度值均值作累计释放曲线，从释放曲线可以看出浸泡后第1-3天为细胞色素C的快速释放期，而后释放速度逐渐减慢，到第9天依仍能检测到细胞色素C的释放(图8)。
(7)根据SDF-1试剂盒检测说明绘制0ng/ml、1.0ng/ml、2.0ng/ml、4.0ng/ml、8.0ng/ml、16ng/ml的浓度的标准曲线。选择浓度为1000ng/ml的SDF-1作为缓释因子包被于BCBB上，制作方法同细胞色素C包被方法。具体制作方法如下：
将大小为0.5cm×0.5cm×0.5cm的3块BCBB支架放入SDF-1/CS液中(SDF-1/CS液的制备方法为取2.5mg/ml SDF-1溶液1.6ml，加入到10ml 2％CS液中，得到SDF-1/CS液)，40KHz超声振动30min后取出，自然风干4h，得到SDF-1/CS/BCBB支架。将风干的支架PBS预湿2h，按每孔1块的数量放入六孔培养板中，每孔加入4.5ml PBS液后放入37℃、湿度97％细胞培养箱中静置孵育。分别于第1天、2天、3天、5天、7天将浸泡液体吸出，再加入4.5ml PBS继续浸泡支架。将收集到的浸泡液用PBS稀释5倍后，按96孔酶标板SDF-1ELISA试剂盒操作说明书在酶标仪450nm波长下检测OD值，计算所得浓度值均值乘以稀释倍数后作累计浓度释放曲线，从释放曲线可以看出浸泡后第1-3天为SDF-1快速释放期，后释放速度减慢，7天时可检测到SDF-1的释放。说明CS缓释系统能够将SDF-1缓慢释放入溶液中，SDF-1/CS系统具有缓释功能(图8)。
本发明在检测时，采用细胞色素C来替换SDF-1，这是由于细胞色素C作为与SDF-1带电性质相同、分子大小相似的化合物，价格较低，许多研究中都将其作为SDF-1的替代物进行有关SDF-1功能的相关检测，所以用细胞色素C作为SDF-1的替代蛋白检测CS/SDF-1SDF-1/CS缓释功能。细胞色素C的最大吸收波长为410nm，细胞色素C与CS混合，最大吸光度波长依旧为410nm。Transwell趋化小室常被用于细胞迁移和侵袭的相关实验，所以此小室可用于检测CS携载SDF-1的BCBB支架趋化BMSCs的性能。
3、具有缓释功能的SDF-1/CS/BBCB支架体外对BMSCs的趋化作用研究：
(1)200mg CS(粘度50～800mpas，脱乙酰度90～95％)，加入到10ml 1％v/v醋酸溶液中，搅拌2h充分溶解混合均匀，得到CS液；之后，将BCBB支架置于已装入玻璃试管CS液中，封闭管口以确保产品无菌，在玻璃试管内40KHz超声振动30min使CS液进入材料孔隙内部，取出自然风干获得CS/BCBB支架。
(2)选取浓度为400ng/ml的SDF-1。将1μg/μl SDF-1取出4μl，溶于10ml CS液中，室温下搅拌2h混合均匀获得SDF-1/CS缓释液，将BCBB支架放入SDF-1/CS缓释液并装入玻璃试管，封闭管口，40kHz超声振动包被30min获得SDF-1/CS/BCBB支架，放置于无菌孔板中超净台冰浴下风干4h，备后续实验用(整个过程在无菌操作下进行)
(3)(3)实验分为3组，A组为BCBB支架组，B组为CS/BCBB支架组，C组为SDF-1/CS/BCBB支架组，每组3个平行样本。预先分别用PBS润湿三组支架30min，后分别将支架放入24孔板不同孔的底部中央，并于支架上方放入趋化小室，将BMSCs消化成单细胞悬液，用2％FBS的LG-DMEM调整密度为2×105个/mL，取200μl BMSCs的单细胞悬液加入趋化小室上层，下层加入2％FBS的LG-DMEM500μl。放入37℃、湿度97％细胞培养箱孵育培养(图9)。
(4)放入培养箱培养36h后，取出支架，除净培养基(除净培养基的方式为吸去培养基后采用PBS清洗3次)，4％多聚甲醛固定15min，PBS清洗2次，加入1ml 0.1％结晶紫溶液染10min，PBS清洗3次，用蘸水医用棉签擦除小室上层未穿膜细胞，倒置相差显微镜观察穿膜细胞，200倍下随机选5个视野细胞计数，做统计学分析。通过对比BCBB支架、CS/BCBB支架和SDF-1/CS/BCBB支架趋化的BMSCs细胞数目，发现SDF-1/CS/BCBB支架对BMSCs的趋化作用明显(图10)，统计学分析结果显示SDF-1/CS/BCBB支架趋化细胞数目较其他组有明显差异(P＜0.05)(图11)。说明CS可作为SDF-1的缓释载体将其包被在材料表面，并且混合于CS中的SDF-1可缓慢释放进入液体环境中，且释放出的SDF-1依然具有趋化BMSCs活性。
其中，4％多聚甲醛为4g多聚甲醛溶到100ml PBS所得；
1％结晶紫溶液为结晶紫2g溶于20mL 95％乙醇、1％草酸铵水溶液80mL后所得。
4、具有缓释功能的SDF-1/CS/BCBB支架生物降解性实验：
将18只SD大鼠随机分为3组，每组6只，A组为BCBB支架组，B组为CS/BCBB组，C组为SDF-1/CS/BCBB组。3％戊巴比妥钠按0.3ml/100g腹腔麻醉，麻醉成功后，选取大鼠股部肌肉处、除毛、碘伏消毒。切开皮肤后钝性分离肌肉，做成肌袋，分别将A、B、C组支架植入双侧股部肌袋内(图12)，再次碘伏消毒局部伤口，丝线依次缝合肌袋，缝合切口。腹腔注射40万单位青霉素3天，预防切口感染。分别于4w、8w取材，进行HE染色、Masson染色、Ⅰ型胶原染色、硬组切片组织学检测。
其中3％戊巴比妥钠为戊巴比妥钠3g溶于100ml生理盐水所得戊巴比妥钠溶液。
(1)取材大体观察：
将支架植入大鼠后腿肌袋内，分别在4w、8w取材，取材可见大鼠伤口完全愈合，各组支架与周围肌肉组织相容性良好，未见明显瘢痕包裹支架，肌肉床血供良好，未见瘢痕硬化区域及组织坏死。植入4w取材，可见各组支架与肌床间无明显瘢痕硬化及组织坏死，BCBB支架、CS/BCBB支架表面孔隙仍清晰可见，其间有部分组织填塞，CS/BCBB支架颜色偏黄，为壳聚糖包被颜色，而SDF-1/CS/BCBB支架表面有白色纤维组织包裹，未见支架表面孔隙(图13)。植入8w后取材可见，支架与肌床间无明显瘢痕硬化及组织坏死，支架周围血供较4w的结果变得丰富，各组支架与周围肌肉组织联系更紧密，SDF-1/CS/BCBB支架表面包裹组织呈粉红色，表面具有血供，未见各组支架表面孔隙(图13)。植入4w、8w支架表面孔隙内均有组织的长入，且随着植入时间延长，BCBB组和CS/BCBB组支架的表面新生组织量逐渐增多，SDF-1/CS/BCBB组空隙中长入的组织量在4w和8w均较其他组多(图14)。
(2)组织学观察：
A组：BCBB支架植入4w后，材料孔隙内长入少量的肌肉组织和新生纤维组织，Masson染色胶原纤维组织为红色，肌肉组织呈现蓝色(图15)。植入8w后，明显观察到长入孔隙内组织量较前增多，胶原纤维组织HE染色呈粉红色，Masson染色呈蓝色，胶原纤维排列紊乱(图16)。植入8w的HE染色结果显示包裹支架的组织和长入孔隙内部的组织，BCBB支架组未见新生小血管(图17)。植入4w的Ⅰ型胶原免疫组化结果显示孔隙内新生组织内的细胞外基质和个别细胞中出现阳性反应(图18)，植入8w的免疫组化结果较4w结果出现更多的阳性反应(图20)，主要集中于孔隙内新生组织与材料交界面。植入8w后的BCBB支架硬组织切片结果显示长入空隙内新生组织与材料边缘有少量排列紊乱的胶原组织生成，HE染色呈粉红色，胶原排列紊乱，表面无排列有序的成骨细胞，无类骨组织或钙化组织形成(图22)。
B组：CS/BCBB支架植入4w后的HE染色结果显示支架内部仍有CS残留，且空隙内新生组织量较A组和C组少，Masson染色结果显示被染成红色部分为肌肉组织，染成蓝色部分为胶原组织(图15)。植入8w后，材料中包被的CS成分基本消失，但孔隙内新生组织量较A组和C组少，Masson和HE染色结果提示长入组织为胶原成分(图16)。植入8w的HE染色结果显示支架包裹组织和空隙内新生组织无明显小血管形成(图17)。
C组：SDF-1/CS/BCBB支架在植入4w后，孔隙内新生组织较其他两组明显多，且HE和Masson结果未发现包被CS残留，孔隙内新生组织性质为胶原纤维成分(图15)。植入8w后的长入组织量较4w明显增多，为胶原纤维成分(图16)。植入8w的HE染色结果显示包裹支架的组织和孔隙内新生组织有较多的小血管形成(图17)。Ⅰ型胶原免疫组化结果显示SDF-1/CS/BCBB支架组Ⅰ型胶原生成量多且呈片状，孔隙内长入新生组织(图19，图21)，具有膜内成骨的特点。同时植入8w的SDF-1/CS/BCBB支架硬组织切片HE染色结果显示孔隙内新生组织与材料交界边缘有着色为粉红色的胶原纤维形成，同时可见胶原组织表面具有排列成排状的细胞，具有膜内成骨的特点，孔隙内新生组织小血管生成量较单纯BCBB支架组多，同时孔隙内新生组织内部可见着色为蓝色的不成熟骨组织生成，具有软骨内成骨特点，但孔隙内新生组织中未见钙化组织的生成(图23)。
(3)材料内组织长入率计算结果
将所得数码照片用Photoshop CS6软件直方图功能进行组织长入面积的计量分析，即组织长入率＝长入组织面积像素÷整幅图片像素×100％。结果通过SPSS 17软件进行统计学分析，通过计算得出不同组支架的组织长入率，统计学分析(表2)，如图24所示植入8w后的组织长入率要高于4w；三组间的组织长入率在同一时间点存统计学差异(P＜0.05)；CS/BCBB支架组的组织长入率最低，且与其他组有统计学差异(P＜0.05)；SDF-1/CS/BCBB支架组组织长入率比其他两组更高，与其他两组有统计学差异(P＜0.05)。
表2三组材料不同时间点组织长入率比较(n＝6，)
4w 8w
A组 14.97±0.67 34.57±0.54
B组 12.32±0.88 29.38±0.75
C组 18.21±0.86 51.06±2.09
F值 40.037 220.182
P值 0.000 0.000
F值表示整个拟合方程的显著性，F越大，表示方程越显著，拟合程度也就越好。P值表示不拒绝原假设的程度，P<0.5表示假设更可能是正确的，反之则可能是错误的
5、具有缓释功能的SDF-1/CS/BCBB支架异位成骨实验：
将12只SD大鼠随机分为2组，每组6只，A组植入BCBB支架，B组植入SDF-1/CS/BCBB支架。3％戊巴比妥钠按0.3ml/100g腹腔麻醉，麻醉成功后，选取大鼠股骨部肉处、去毛、碘伏消毒。切开皮肤后钝性分离肌肉，做成肌袋，分别将A、B组支架植入双侧股部肌袋内，再次碘伏消费局部伤口，丝线依次缝合肌袋，缝合切口。腹腔注射40万单位青霉素3天，预防切口感染。分别于4w、8w、12w取材，进行硬组切片组织学检测。
(1)硬组织切片观察：
A组：BCBB支架植入4w，HE染色和VG染色均可见孔隙内填充纤维组织及细胞(图25，图28)。植入8w后，明显观察到长入孔隙内组织量较前增多，血管成分较少(图26)，VG染色中见胶原纤维呈均质蓝染，孔隙内可见小血管(黑色箭头示)，纤维排列紊乱(图29)。植入12w后VG染色结果明显发现支架表面有蓝染胶原物质(白色箭头示)(图30)，在HE染色下呈现红染，沿材料表面分布(图27)，是软骨内成骨早期表现。
B组：SDF-1/CS/BCBB支架植入4w后的HE染色和VG染色结果显示支架孔隙内新生组织量较A组多，并且在VG染色下见蓝染胶原物质沿材料表面分布(图28)，在HE染色中组织内新生血管生成(白色箭头示)，比同时期A组多(图25)。植入8w后，孔隙内新生组织量较A组多，HE染色见材料表面细胞聚集(黑色箭头示)，孔隙内小血管多见(白色箭头示)(图26)，VG染色见材料表面有明显红染的成骨组织(白色箭头示)，结果提示8w出现异位成骨(图29)。植入12w的HE染色结果见材料表面有红色成骨组织(白色箭头示)(图27)，VG染色结果显示红染的成骨组织增多(图30)。
(2)成骨量计算结果
将所得数码照片用Photoshop CS6软件直方图功能进行组织长入面积的计量分析，即新生骨组织量＝新生骨组织面积像素÷整幅图片像素×100％。结果通过SPSS 17软件进行统计学分析(表3)，通过计算得出不同组支架的组织长入率，如图31可见，植入4w、8w、12w后的B组的成骨量均高于A组，并且存在明显统计学差异(P＜0.05)。
表3两组间不同时间点组织长入率对比(n＝6，)(％)
4w 8w 12w
A组 0.09±0.06 0.46±0.05 5.96±0.80
B组 0.71±0.33 25.59±4.43 42.97±6.25
F值 20.555 193.117 206.968
P值 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05
F值表示整个拟合方程的显著性，F越大，表示方程越显著，拟合程度也就越好。P值表示不拒绝原假设的程度，P<0.5表示假设更可能是正确的，反之则可能是错误的。
6、SDF-1/CS/BCBB支架与空白组、自体骨组、BCBB组修复兔大段骨缺损对比实验：
将40只健康成年日本大耳白兔随机分为A(空白组)、B(自体骨组)、C(BCBB组)、D(SDF-1/CS/BCBB组)，每组各有10只。以双侧前肢的桡侧正中为手术部位；将10％水合氯醛以3ml/kg腹腔注射麻醉；麻醉后将兔固定在动物手术台上，前肢充分脱毛，暴露手术部位，用0.5％碘伏反复消毒3遍；铺无菌洞巾，用手术刀在前肢桡侧桡骨中段处切长2.0cm皮肤切口，逐层分离皮肤、皮下组织、脂肪、筋膜、肌肉、血管，仔细止血，暴露桡骨；确定桡骨中段位置，用骨膜剥离子将骨表面骨膜剥离，用不锈钢尺测量拟截骨部位长度，确保制成1.5cm长度桡骨缺损(图32)；取出骨长度1.5cm自体骨；于缺损部位植入材料：A组不作特殊处理，B组植入自体对侧桡骨，C组植入BCBB支架，D组植入SDF-1/CS/BCBB支架，并确保植入物固定在位；术后沿耳缘静脉输注预先准备的浓度为107个/mL的eGFP-BMSCs 1ml，术后3天连续每天肌注青霉素40万U预防术口感染，隔日换药。分别于2w、4w、8w、12w、24w取材进行一般观察、X线摄片检查、硬组织切片观察及4w时GFP蛋白免疫组化染色观察。
其中，10％水合氯醛为水合氯醛10g溶于100ml生理盐水所得水合氯醛溶液。
(1)大体观察
A组：各组均能明显看到骨缺损部位。2周可见骨断端明显，断端内大量组织液渗出与新生组织生成，无感染迹象(图33)；4周渗出减少，髓腔被纤维组织封闭，周围组织形成纤维化粘连(图34)；8周骨断端形成骨性封闭，大量纤维组织包裹，与周围组织、肌肉难以分离，断端间渗出减少、吸收，形成纤维瘢痕(图35)；12周骨缺损部位骨吸收，周围纤维组织形成瘢痕粘连(图36)；24周肉眼观与12周无明显差异,缺损依然存在(图37)。
B组：2周骨断端整齐，间隙内见大量新生纤维样组织(图33)；4周骨断端可见新生纤维骨痂包裹，自体骨表面见骨膜样组织(图34)；8周后自体骨与宿主骨形成骨性愈合，骨痂生长明显，移植骨发生吸收与重塑(图35)；12周自体骨与宿主骨完全融合，表面覆盖骨膜样组织，血供丰富(图36)；24周缺损部位外形接近正常桡骨(图37)。
C组：2周可观察到植入材料与骨断端界限清晰，其中有纤维组织填充，无明显感染征象(图33)；4周材料表面完整，与宿主骨组织结合紧密，材料表面周围新生骨痂包绕(图34)；8周可见材料轮廓完整，与宿主骨结合紧密，材料表面及孔隙内组织填充，材料不同程度吸收、降解(图35)；12周材料与骨组织分界不清，形成牢固愈合，修复段塑型较好(图36)；24周材料表面组织包被紧密，血供丰富，与宿主骨组织分界不清，仍有部分材料残留(图37)。
D组：2周与C组无明显差异，材料结构完整，与宿主骨间缝隙由纤维组织填充，材料内部孔隙有新生组织长入，未见明显感染征象(图33)；4周时材料表面结构完整，与宿主骨结合紧密，周围新生骨痂形成，血供丰富(图34)；8周材料结构较完整，表面可见大量骨痂形成，材料与宿主骨结合紧密，可见材料部分吸收(图35)；12周后材料与宿主骨形成牢固愈合，界限不清，材料大部分吸收，新生骨长入，缺损部分塑型(图36)；24周修复段塑型好，与宿主骨外形无明显差异(图37)。
(2)组织学观察
4w对GFP蛋白进行免疫组化染色，A组可见组织内大量纤维组织增生，细胞浸润，少见阳性细胞(图38)；B组可见新生组织内有大量呈圆形、椭圆形的阳性细胞(白色箭头示)，为四个组中数量最多(图39)；C组BCBB残留物呈细颗粒状，孔隙内组织填充，细胞多且呈纤维条索样分布，偶见少量染色阳性细胞(白色箭头示)(图40)；D组材料与壳聚糖残留物较多，细颗粒样分布，孔隙内细胞丰富，阳性细胞与阴性细胞混杂，可见分布于材料-组织界面(白色箭头示)，且数量较C组多(图41)。
(3)X片结果及评分
A组：各时间点均观察到骨缺损透亮区存在。2周骨缺损部位明显、透亮，纤维组织填充，缺损边缘整齐；4周缺损端出现少量骨质吸收、重塑；8周缺损端骨质吸收、重塑明显，可见髓腔封闭；12周缺损端骨皮质吸收、硬化；24周与12周X片下变化不明显，缺损仍然存在(图42)
B组：2周缺损端与植入材料间隙清晰；4周缺损端与自体骨分界模糊；8周缺损端与植入骨间形成骨性连接，骨性连接处骨皮质增厚，髓腔部分再通；12周缺损端与植入骨连接，髓腔相通，连接处部分骨皮质亮度增高，形态较粗糙；24周缺损部位骨皮质连续完整，髓腔改建完成，与正常桡骨无差异(图43)。
C组：2周植入材料与缺损端对合良好，无明显移位，材料形态完整，与宿主骨断端间隙清晰可见，未见明显骨痂生长；4周缺损骨出现不同程度吸收、重塑，植入材料边缘稍模糊，材料完整可见；8周植入材料边缘出现不同程度降解吸收，髓腔未见封闭；12周材料密度大部分降低，仍表现为高亮度影，与桡骨密度相近，部分包绕新生骨；24周材料密度仍高，与缺损区连接部位密度与桡骨相近，与骨连接紧密(图43)。
D组：2周植入材料与缺损端对和良好，无明显移位，材料形态完整，与宿主骨断端之间间隙清晰；4周材料外形完整，与骨断端接触面密度仍高，材料被部分骨痂包裹；8周材料与宿主骨分界不清，密度与宿主骨相近，材料内孔隙结构不清晰；12周材料部分吸收，变短变窄，与缺损端呈骨性愈合，修复区密度与桡骨相近，分界不清；24周髓腔改建完成，修复区骨皮质连续、平滑，与桡骨相近，髓腔内密度稍高，为材料残影(图45)。
根据Lane等人的X线评分标准对所拍摄的X片进行评分，评估内容为材料与宿主骨的愈合、髓腔的形成、髓腔的改建程度。使用SPSS17.0，方差分析对结果进行分析比较。2周时因各组评分为0，不纳入统计范围；A组因各时间点分为0，不纳入统计范围。经方差分析，B组与C组在8-24周同一时间点均存在差异(P＜0.05)，B组与D组在8周时间点时存在差异(P＜0.05)，12周后无显著性差异(P＞0.05)，C组与D组在24周时间点存在差异(P＜0.05)。12周后B组与D组的骨修复效果X线结果上无明显差异(表4，图46)。表明SDF-1/CS/BCBB支架与自体骨相接近。
表4各组不同时间点的X片评分(n＝3,)
时间 2周 4周 8周 12周 24周
A组 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0
B组 0±0 2.33±1.54 6.33±0.58□■ 7.33±1.53□ 10.33±1.53□
C组 0±0 2.00±1.00 3.67±0.58□ 5.00±1.00□ 5.33±1.53□▲
D组 0±0 2.33±0.58 4.00±1.00■ 6.33±0.58 8.67±1.12▲
F - 0.125 11.400 3.364 9.722
P - 0.885 0.000 0.105 0.002
注：□B组与C组比较，P＜0.05；■B组与D组比较，P＜0.05；▲C组与D组比较，P＜0.05。
F值表示整个拟合方程的显著性，F越大，表示方程越显著，拟合程度也就越好。P值表示不拒绝原假设的程度，P<0.5表示假设更可能是正确的，反之则可能是错误的。
(4)硬组织切片观察
A组：2周缺损端齐整，周围纤维组织增生，细胞浸润，缺损端周围可见多核细胞，参与骨质吸收，未见明显感染征象(图47)；4周缺损端周围骨质吸收、重塑(图48)，VG染色可见大片紫染骨形成区逐渐封闭髓腔(图52)；8周缺损端骨小梁纹理清晰，周围骨形成区范围减小，骨吸收、重塑区骨小梁紊乱(图49，图54)；12周髓腔封闭，缺损处纤维组织充填(图50，图56)；24周髓腔侧骨质旁可见多核细胞聚集，骨质吸收变突、缺损处依然存在(图51，图57)。
B组：2周骨自体骨与宿主骨间见纤维组织连接，大量细胞浸润(图47)；4周自体骨与宿主骨结合紧密，周围有大量蓝染纤维骨痂混合红染骨性骨痂(图48，图52)；8周自体骨髓腔再通，新生骨小梁纹理排列不整，与宿主骨区分明显(图49，图54)；12周自体骨髓腔再通，髓腔侧细胞聚集，可见髓腔骨质吸收、改建，修复区骨小梁纹理规则(图50，图56)；24周皮质骨结构清晰，骨小梁排列规则，髓腔改建完成(图51，图57)。
C组：2周新生血管和纤维组织长入材料，较D组少，骨断端齐整，无明显感染征象(图47)；4周更多的血管和纤维组织长入材料，并出现少量骨形成，材料与宿主骨之间纤维组织连接，血管和纤维组织长入材料(图48，图52，图53)；8周材料内红染成骨组织增多，成骨细胞在材料表面形成胶原组织(图49，图54，图55)；12周材料内红染成骨组织增多，沿材料表面分布，血管增多，血管周围有胶原组织形成(图50，图56)；24周材料大部分吸收，内部被新生骨组织填充，骨组织中血管丰富，材料与新生骨组织骨性结合，纹理较紊乱(图51，57)。
D组：2周新生血管和纤维组织长入材料，较C组多，大量细胞浸润，无明显感染征象(图47)；4周更多的血管和纤维组织长入材料，材料内见新生骨组织，胶原沿材料表面分布(图48，图52，图53)；8周新生骨增多，从缺损两端逐渐长入，材料内出现红染成骨组织，成骨细胞胞体大，着色深，间充质细胞核浅，多突起，沿材料边缘分布(图49，图54，图55)；12周新生骨增多，材料部分降解吸收，新生骨小梁排列紊乱，细胞成骨活跃，材料与新生骨为骨性结合(图50，图56)；24周材料全部吸收，新生骨小梁排列整齐，钙化良好，髓腔改建完成(图51，图57)。
(5)成骨面积计算
将所得数码照片用Photoshop CS6软件直方图功能进行组织长入面积的计量分析(图61)，即组织长入率＝长入组织面积像素÷整幅图片像素×100％。结果通过SPSS 17软件进行统计学分析，通过计算得出不同组支架的组织长入率，统计学分析(表4)，各组在不同时间点时成骨量存在差异(P＜0.05)，4周前C组与D组成骨量无明显差异(P＞0.05)，4周后D组成骨量多于C组。C组在观察时间内与B组始终存在差异(P＜0.05)，D组与B组在12周无明显差异(P＞0.05)。B组与D组在12周后成骨量无明显差异，表明二者最终成骨效果相当(表5，图59)。
表5各组不同时间点的成骨面积比较(n＝12)(％)
时间 2周 4周 8周 12周 24周
A组 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0
B组 7.68±2.59□■ 9.57±1.55□■ 39.88±5.65□■ 48.30±7.78□ 71.92±6.39□
C组 3.15±1.94□ 4.07±1.12□ 4.88±0.12□▲ 7.37±3.42□▲ 34.66±4.41□▲
D组 3.36±1.78■ 5.70±1.27■ 26.56±5.21■▲ 42.88±8.59▲ 67.81±3.57▲
F 8.661 27.324 93.778 60.871 30.145
P ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05
注：B组与C组比较，P＜0.05；■B组与D组比较，P＜0.05；▲C组与D组比较，P＜0.05；
F值表示整个拟合方程的显著性，F越大，表示方程越显著，拟合程度也就越好。P值表示不拒绝原假设的程度，P<0.5表示假设更可能是正确的，反之则可能是错误的。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (10)

1.一种缓释SDF-1的壳聚糖包被BCBB骨修复支架材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤（1），将壳聚糖溶解于体积浓度为1%醋酸溶液中至壳聚糖浓度为20mg/ml，再向其中加入SDF-1至SDF-1浓度为400ng/ml，得到SDF-1/CS缓释液；
步骤（2），将BCBB支架置于SDF-1/CS缓释液中，超声30min，取出干燥，得到缓释SDF-1的壳聚糖包被BCBB骨修复支架材料。
2.根据权利要求1所述的缓释SDF-1的壳聚糖包被BCBB骨修复支架材料的制备方法，其特征在于，所述的壳聚糖粘度为50~800mpas，脱乙酰度为90~95%。
3.根据权利要求1所述的缓释SDF-1的壳聚糖包被BCBB骨修复支架材料的制备方法，其特征在于，将壳聚糖溶解于体积浓度为1%醋酸溶液中时，采用搅拌的方式使壳聚糖溶解；加入SDF-1后，搅拌至其混合均匀。
4.根据权利要求2所述的缓释SDF-1的壳聚糖包被BCBB骨修复支架材料的制备方法，其特征在于，搅拌时间均为2h。
5.根据权利要求1所述的缓释SDF-1的壳聚糖包被BCBB骨修复支架材料的制备方法，其特征在于，超声的频率为40kHz。
6.根据权利要求1所述的缓释SDF-1的壳聚糖包被BCBB骨修复支架材料的制备方法，其特征在于，所述的干燥方式为自然风干。
7.根据权利要求1所述的缓释SDF-1的壳聚糖包被BCBB骨修复支架材料的制备方法，其特征在于，BCBB支架的制备方法包括如下步骤：
采用市售新鲜猪骨的松质骨，于蒸馏水煮至少6h，干燥过夜，然后于马弗炉内以10℃/min的升温速度升至800℃后保持温度煅烧1h，之后置于浓度为0.04mol/ml的焦磷酸钠溶液中超声30min，取出，干燥过夜，再于马弗炉内以10℃/min的升温速度升至1150℃后保持温度煅烧1h，自然冷却后，120℃高温高压消毒，制得BCBB支架。
8.根据权利要求7所述的缓释SDF-1的壳聚糖包被BCBB骨修复支架材料的制备方法，其特征在于，水煮之前，需先将猪骨的松质骨制备成大小范围为0.5cm×0.5cm×0.5cm至1.0cm×1.0cm×1.0cm块状物或1.5cm×0.5cm×0.5cm至2.0cm×1.0cm×1.0cm条形物。
9.根据权利要求7所述的缓释SDF-1的壳聚糖包被BCBB骨修复支架材料的制备方法，其特征在于，超声的频率为40kHz。
10.权利要求1-9任意一项所述的缓释SDF-1的壳聚糖包被BCBB骨修复支架材料的制备方法制得的缓释SDF-1的壳聚糖包被BCBB骨修复支架材料的制备方法。
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