CN108265035A - 一种进化噬菌体宿主特异性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，提供了一种利用跳板宿主进化噬菌体宿主特异性的方法、获得的跳板宿主和噬菌体。本发明从遗传背景清晰的已知噬菌体出发，采用进化生物学与合成生物学理念和手段，改造噬菌体宿主中的脂多糖结构获得跳板宿主，噬菌体侵染跳板宿主得到受体结合蛋白发生变异的噬菌体，改变其宿主特异性，使其可以识别与侵染新的特定宿主菌。实验表明获得的噬菌体可以抗革兰氏阴性菌及多耐药菌，产生噬菌斑，抑制其生长，有潜力对抗生素治疗细菌感染起到一定的补充和加强作用。

Description

一种进化噬菌体宿主特异性的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用跳板宿主进化噬菌体宿主特异性的方法。

背景技术

噬菌体是感染细菌的一类病毒，是生态圈内最普遍和最多样化的物种。噬菌体广泛分布于细菌集中的区域，譬如土壤或动物肠道。海水也是噬菌体最密集的天然来源之一，高达70％的海洋细菌可被噬菌体侵染。噬菌体的特征是不具有细胞结构，主要由蛋白质外壳包裹单一核酸DNA或RNA基因组组成，可编码少至若干个、多达几百个基因。噬菌体必须利用宿主细胞中的能量和蛋白等资源来实现自身的生长和增殖，不能独立生长或复制。噬菌体通过与细菌表面的受体特异性结合识别宿主，然后将自身基因组注射入细菌细胞，其侵染具有高度的宿主专一性。噬菌体具有裂解性或溶源性，有的也可两者皆有。裂解性噬菌体譬如T7在进入细菌细胞后快速复制使细胞裂解释放子代噬菌体，这些子代再侵染新的宿主细胞。溶原性噬菌体并不立即裂解宿主细胞，它们可将自身基因组整合入宿主的DNA并且随之复制而不损害细胞，仅在宿主条件恶化时被激活然后裂解细胞。

噬菌体可以识别与侵染细菌治疗疾病。包括印度恒河在内的某些河流在当地传统观念里被认为具有神奇的康复力量，后来研究人员经验证认为可能是河水中含有噬菌体的缘故。一个世纪以来，在前苏联(如今的格鲁吉亚、波兰、俄罗斯等国)噬菌体常被用作抗生素的替代来治疗细菌导致的感染性疾病。但在西方发达国家噬菌体却早已不再用于治疗细菌感染，这有几个原因：1)尽管有医学实验被开展，但缺乏对噬菌体最基本的了解使得这些试验不可靠；2)抗生素的发现与广泛市场化，并且抗生素更易生产、保存和处方化；3)前苏联的研究得以继续，但研究成果大多以俄语或格鲁吉亚语发表并且多年未在国际流通；4)评估噬菌体制剂抗菌效价的临床试验缺乏充足的对照，并且方案的不完整有碍形成重要的结论。2009年6月，Journal of Wound Care杂志报道了首次规范化的随机双盲临床试验，该试验评估了一种噬菌体混合制剂用于治疗下肢静脉溃疡病人的安全性和效价，美国FDA批准该研究为临床I期试验。同年8月，Clinical Otolaryngology杂志报道了西欧的一次临床试验，结论是用噬菌体制剂治疗绿脓杆菌引起的人类慢性耳部感染是安全且有效的。此外，还有许多的动物和其它临床试验评估噬菌体对包括烧伤感染、肺部感染等的治疗效果。同时，研究人员也在开发工程病毒来克服细菌耐药性，改造噬菌体基因使其携带降解生物膜和细菌细胞壁的酶。

自然界噬菌体多样性极高而人们对其了解匮乏，用天然分离的噬菌体治疗细菌感染的效果具有一定的不可预见性，并且改造及批量生产未知噬菌体也具有不小的挑战。此外，由于强大的种属间进化壁垒的存在，直接基于野生型宿主和噬菌体进化噬菌体的宿主特异性几乎不可能实现。因此，改变噬菌体的宿主特异性，使其识别与侵染新的特定宿主菌具有重要意义。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术的缺陷，提供一种利用跳板宿主进化噬菌体宿主特异性的方法，以改变噬菌体的宿主特异性，使其识别与侵染新的特定宿主菌。

为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

一种利用跳板宿主进化噬菌体宿主特异性的方法，改造噬菌体宿主中的脂多糖结构获得跳板宿主，从而缩小噬菌体的进化壁垒，噬菌体侵染跳板宿主得到受体结合蛋白发生变异的噬菌体。

优选的，所述改造噬菌体宿主中的脂多糖结构具体为敲除宿主中脂多糖合成相关基因。

优选的，所述噬菌体选自识别细菌细胞表面LPS的T1、T2、T3、T4、T5、T6、T7、P1噬菌体中至少一种；所述噬菌体宿主为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)；所述脂多糖合成相关基因选自waaA、waaC、waaF、waaG、galU、waaO、waaR、waaU、gmhA、gmhB、waaD中至少一种。

优选的，所述侵染具体为噬菌体与跳板宿主混匀，在培养基上培养。

本发明还提供了所述方法得到的噬菌体。

本发明还提供了一种噬菌体的跳板宿主，所述宿主细胞中脂多糖合成相关基因缺失。

优选的，所述宿主细胞为大肠埃希氏菌W3110；所述脂多糖合成相关基因选自waaA、waaC、waaF、waaG、galU、waaO、waaR、waaU、gmhA、gmhB、waaD中至少一种。

本发明还提供了本发明所述噬菌体在抗革兰氏阴性菌中的应用。

优选的，所述革兰氏阴性菌为沙门氏菌(Salmonella Typhimurium)和鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)。

本发明还提供了一种抑制革兰氏阴性菌的方法，将所述噬菌体与含有革兰氏阴性菌的物质混合。

本发明还提供了包括本发明所述噬菌体的药物组合物。

由上述技术方案可知，本发明提供了一种利用跳板宿主进化噬菌体宿主特异性的方法、获得的跳板宿主和噬菌体。本发明从遗传背景清晰的已知噬菌体出发，采用进化生物学与合成生物学理念和手段，改造噬菌体宿主中的脂多糖结构获得跳板宿主，噬菌体侵染跳板宿主得到受体结合蛋白发生变异的噬菌体，改变其宿主特异性，使其可以识别与侵染新的特定宿主菌。实验表明获得的噬菌体可以抗革兰氏阴性菌及多耐药菌，产生噬菌斑，抑制其生长，可对抗生素治疗细菌感染起到一定的补充和加强作用。相比传统对噬菌体进行直接改造或进化的手段，本发明所述利用跳板宿主进化噬菌体宿主特异性的方法极大地简化和促进了改造噬菌体的宿主特异性的过程，具有一定普适性，在改造噬菌体使其识别与侵染新的特定宿主菌具有重要意义

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示本发明实施例1所述跳板宿主的waaC基因敲除片段在大肠杆菌W3110基因组上位置；

图2示本发明实施例1所述跳板宿主的验证引物的位置(A)以及用该对引物进行菌落PCR的产物电泳条带(B)，泳道1-5为同源重组后对Kan抗性平板上随机挑取的5个单菌落进行PCR的产物，泳道6为对未经同源重组的菌落进行PCR的产物(阴性对照)，泳道7为DNAladder DL2000；

图3示本发明实施例1所述跳板宿主与原始宿主的LPS结构对比；

图4示本发明实施例3所述超级噬菌体对比野生型噬菌体的变异位点，其中A为gene12的部分测序结果，B为gene17的部分测序结果；阴影部分为变异位点；

图5示本发明实施例4超级噬菌体侵染目标病原菌-沙门氏菌和鲍曼不动杆菌产生的噬菌斑。

具体实施方式

本发明公开了一种利用跳板宿主进化噬菌体宿主特异性的方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

一种利用跳板宿主进化噬菌体宿主特异性的方法，其特征在于，改造噬菌体宿主中的脂多糖结构获得跳板宿主，从而缩小噬菌体的进化壁垒，噬菌体侵染跳板宿主得到受体结合蛋白发生变异的噬菌体。

脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)通常由插入外膜的疏水域脂质A(lipid A)、磷酸化的核心糖以及远距离的O抗原组成。核心糖从概念上分为两个区域：外核与内核。内核高度保守，包含KDO(deoxy-D-manno-octulosonic acid)和庚糖(L-glycero-D-manno-heptose)，并且通常是磷酸化的。内核心糖在外膜的基本屏障功能上扮演着至关重要的脚色。外核包含一个三己糖骨架，不同菌株的该骨架由己糖和乙酰氨基己糖进行不同修饰。外核提供O抗原的结合位点。

本发明所述利用跳板宿主进化噬菌体宿主特异性的方法通过人工改造噬菌体原宿主，使原宿主脂多糖结构简化得到新的噬菌体宿主作为进化跳板，即跳板宿主。随后采用噬菌体侵染跳板宿主，即侵染脂多糖结构改变的新的噬菌体宿主，使子代噬菌体表达受体结合蛋白的基因发生变异，降低噬菌体的识别宿主的特异性，以使其广泛识别与侵染新的宿主菌。

其中，在一些实施方案中，所述改造噬菌体宿主中的脂多糖结构具体为敲除宿主中脂多糖合成相关基因。

进一步的，所述脂多糖合成相关基因选自waaA、waaC、waaF、waaG、galU、waaO、waaR、waaU、gmhA、gmhB、waaD中至少一种。

waaA基因编码Kdo转移酶，将最内部两个Kdo残基整合入脂质IVA-脂质A的前体；waaC基因编码的酶负责将首个庚糖转移至LPS内核的Kdo；w aaF基因编码的酶负责将第二个庚糖转移至LPS内核的Kdo组分；waaG基因编码的酶负责将外核的首个葡萄糖从UDP-glucose加在内核的第二个庚糖残基；galU基因编码UTP:glucose-1-phosphateuridylyltransferase；waaO基因编码α-1,3glucosyltransferase，负责将第二个葡萄糖加在第一个葡萄糖上；w aaR基因将第三个葡萄糖加在第二个葡萄糖上；waaU负责庚糖IV在外核葡萄糖III残基上的附着；gmhA基因编码Sedoheptulose 7-phosphate isomerase，催化LPS核心成分合成的第一个关键步骤；gmhB基因编码D,D-heptose 1,7-bisphosphatephosphatase；waaD基因编码ADP-L-glycero-D-mannoheptose-6-e pimerase，是核心LPS的ADP-庚糖前体合成路径中的最后一个酶。

在一些实施方案中，所述噬菌体为T7噬菌体；所述噬菌体宿主为大肠埃希氏菌W3110；所述脂多糖合成相关基因为waaC基因。所述waaC基因编码的酶负责将首个庚糖转移至LPS内核的Kdo组分。通过敲除大肠埃希氏菌W3110中的waaC基因，W3110细胞LPS不含庚糖而仅有Kdo，得到新的噬菌体宿主。随后采用T7噬菌体侵染该跳板宿主，即侵染LPS仅保留Kdo的新的噬菌体宿主，子代噬菌体表达受体结合蛋白的基因发生变异，得到变异的噬菌体T7waaC。将变异的噬菌体T7waaC与新的宿主菌混合，可以得到能识别及侵染新的宿主新的噬菌体。如将变异的噬菌体T7waaC与目标宿主沙门氏菌和鲍曼不动杆菌混匀铺板，得到能侵染沙门氏菌的STT7waaC以及能侵染鲍曼不动杆菌的AbT7waaC。

进一步，优选的，所述侵染具体为噬菌体与跳板宿主混匀，在培养基上培养。

在一些实施例中，所述侵染为T7噬菌体以MOI＝1与跳板宿主震荡混匀，静置20分钟后加入温度为50℃的含0.6％琼脂的LB培养基，震荡混匀，倒入预先配制好的下层LB固体培养基(琼脂含量1.5％)，室温静置1小时待上层琼脂凝固后放入37℃恒温培养箱，过夜培养后。

本发明还提供了所述方法得到的噬菌体。该噬菌体宿主特异性发生改变，可以识别与侵染新的宿主菌，命名为超级噬菌体1.0。

本发明还提供了上述脂多糖合成相关基因缺失的跳板宿主。

其中，所述宿主为大肠埃希氏菌。

所述脂多糖合成相关基因选自waaA、waaC、waaF、waaG、galU、waaO、waaR、waaU、gmhA、gmhB、waaD中至少一种。

在一些实施方案中，所述跳板宿主为waaC基因缺失的大肠埃希氏菌W3110

在某一实施例中，本发明分别将超级噬菌体1.0(如变异的噬菌体T7waaC)与目标宿主沙门氏菌和鲍曼不动杆菌等革兰氏阴性菌混匀铺板，培养后可见明显的噬菌斑。表明本发明所述超级噬菌体可以抗革兰氏阴性菌，产生噬菌斑，抑制其生长。因此本发明还提供了所述超级噬菌体在抗革兰氏阴性菌中的应用。

其中，所述革兰氏阴性菌可以为常见的革兰氏阴性病原菌，包括但不限于沙门氏菌和鲍曼不动杆菌。

进一步，本发明还提供了一种抑制革兰氏阴性菌的方法，具体为将本发明所述超级噬菌体与含有革兰氏阴性菌的物质混合。

本发明还提供了一种包括上述噬菌体的药物组合物。其中所述噬菌体为所述利用跳板宿主进化噬菌体宿主特异性的方法得到的噬菌体，即超级噬菌体1.0。

为了进一步理解本发明，下面结合具体实施例对本发明进行详细阐述，如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。

实施例1跳板宿主的构建

利用一对含同源臂的引物进行PCR扩增Kan抗性基因片段，然后通过同源重组替换大肠埃希氏菌W3110基因组上的waaC基因相应片段，获得正确的waaC敲除菌株。其中含同源臂的引物为

F:AGTTTAAAGGATGTTAGCATGTTTTACCTTTATAATGATGATAACTTTTC(SEQ ID NO.1)；

R:TACTGGAAGAACTCAACGCGCTATTGTTACAAGAGGAAGCCTGACGGATG(SEQ ID NO.2)。

所述PCR反应体系为：

所述PCR反应程序为：

95℃5min；

95℃30sec，54℃30sec，72℃1.5min 28个循环；

72℃10min。

所述同源重组的方法具体为：首先用Dpn I处理含同源臂和Kan抗性基因片段的PCR产物，然后胶回收PCR产物纯化；将约100ng纯化片段加入100μl新鲜制备的表达λ-red重组酶的大肠杆菌电转化感受态细胞，轻轻混匀后转移至电转杯，然后进行电击(1.8kV)；电击后立即加入1ml LB培养基，重悬的菌液复苏(37℃，220rpm)2小时后，取20％涂布于含Kan的LB平板上；37℃过夜培养后，对抗性平板上长出来的单菌落进行PCR验证。

本发明针对waaC上下游序列设计验证引物进行PCR扩增，验证获得的waaC敲除菌株即跳板宿主。其中所述验证引物为：

F：ATGAGCCATATTCAACGGGA(SEQ ID NO.3)；

R：TTATCGACGAATGCAATTATCA(SEQ ID NO.4)。

扩增结果如图2B所示。

图2B显示同源重组成功后挑取5个单菌落、1个野生型菌落(对照)进行PCR验证的电泳条带。5个单菌落中的2个菌落可见扩增条带，扩增产物约900bp(泳道1和泳道3)，3个菌落未见扩增条带(泳道2、泳道4和泳道5)。而野生型菌落未见扩增条带(泳道6)。

实施例2超级噬菌体的构建

将噬菌斑形成单位(PFU)为10⁷/ml的T7噬菌体以MOI＝1与跳板宿主震荡混匀，静置20分钟后加入温度为50℃的含0.6％琼脂的LB培养基，震荡混匀，倒入预先配制好的下层LB固体培养基(琼脂含量1.5％)，室温静置1小时待上层琼脂凝固后放入37℃恒温培养箱，过夜培养后，通常一块平板上产生1-2个噬菌斑，即为“超级噬菌体1.0”。

实施例3对超级噬菌体1.0进行测序

T7噬菌体的gene11、12、17的产物为主要受体结合蛋白，负责识别和结合LPS，其中gene11编码尾管蛋白A，gene12编码尾管蛋白B，gene17编码尾部纤维蛋白。挑取实施例2获得的超级噬菌体1.0，利用跳板宿主进行进一步放大培养，然后提取该噬菌体DNA，利用PCR扩增T7噬菌体以及超级噬菌体的gene11、gene12、gene17片段，纯化后进行Sanger测序，随后对比分析超级噬菌体的突变位点，结果如图3所示。

图4结果显示，gene12携带一个碱基突变(A被G取代)，gene17携带一个碱基突变(G被T取代)，二者均为有义突变。

实施例4超级噬菌体侵染病原菌

将PFU为10⁹/ml的T7噬菌体或超级噬菌体1.0以MOI＝10的比例与目标病原菌震荡混匀，静置20分钟后加入3mL 50℃的含0.6％琼脂的LB培养基，震荡混匀，倒入预先配制好的下层LB固体培养基(琼脂含量1.5％)，室温静置1小时待上层琼脂凝固后放入37℃恒温培养箱，过夜培养后，观察结果见图5。图5结果显示无添加噬菌体对照和添加T7噬菌体对照均未出现噬菌斑，仅有添加超级噬菌体1.0的平板可观察到噬菌斑，通常每十块平板上产生1-2个，该噬菌斑内的噬菌体即为超级噬菌体1.0经过近一步进化产生的可识别目标病原菌表面受体的噬菌体。

Claims (11)

1.一种利用跳板宿主进化噬菌体宿主特异性的方法，其特征在于，改造噬菌体宿主中的脂多糖结构获得跳板宿主，噬菌体侵染跳板宿主得到受体结合蛋白发生变异的噬菌体。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述改造噬菌体宿主中的脂多糖结构具体为敲除宿主中脂多糖合成相关基因。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述噬菌体选自识别细菌细胞表面脂多糖的T1、T2、T3、T4、T5、T6、T7、P1噬菌体中至少一种；所述噬菌体宿主为大肠埃希氏菌；所述脂多糖合成相关基因选自waaA、waaC、waaF、waaG、galU、waaO、waaR、waaU、gmhA、gmhB、waaD中至少一种。

4.根据权利要求1-3任意一项所述的方法，其特征在于，所述侵染具体为噬菌体与跳板宿主混匀，在培养基上培养。

5.权利要求1-4任意一项所述方法得到的噬菌体。

6.一种噬菌体的跳板宿主，其特征在于，宿主细胞中脂多糖合成相关基因缺失。

7.根据权利要求6所述的跳板宿主，其特征在于，所述宿主为大肠埃希氏菌；所述脂多糖合成相关基因选自waaA、waaC、waaF、waaG、galU、waaO、waaR、waaU、gmhA、gmhB、waaD中至少一种。

8.权利要求5所述噬菌体在抗革兰氏阴性菌中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述革兰氏阴性菌为沙门氏菌和鲍曼不动杆菌。

10.一种抑制革兰氏阴性菌的方法，其特征在于，将权利要求5所述噬菌体与含有革兰氏阴性菌的物质混合。

11.包括权利要求5所述噬菌体的药物组合物。