CN105801707A

CN105801707A - 一种草鱼出血病口服疫苗及其制备与应用

Info

Publication number: CN105801707A
Application number: CN201610213530.3A
Authority: CN
Inventors: 余新炳; 任鹏丽; 黄艳; 陈庭金; 唐泽丽; 孙恒昌; 林志鹏; 姜红烨; 周心怡
Original assignee: Sun Yat Sen University
Current assignee: Sun Yat Sen University
Priority date: 2016-04-07
Filing date: 2016-04-07
Publication date: 2016-07-27
Anticipated expiration: 2036-04-07
Also published as: CN105801707B

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种草鱼出血病口服疫苗及其制备与应用。本发明首先提供了提供一种融合蛋白，含有枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白CotC和草鱼呼肠孤病毒VP4蛋白。所述融合蛋白，制备成草鱼出血病口服疫苗，能够在鱼体肠道内成功定植，免疫效果良好，能够使得鱼体攻毒感染后死亡率较阴性组降低30%~45%。

Description

一种草鱼出血病口服疫苗及其制备与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种草鱼出血病口服疫苗及其制备与应用。

背景技术

草鱼出血病(GrassCarpHemorrhage)是一种由草鱼呼肠孤病毒(Grasscarpreovirus，GCRV)引起的危害草鱼养殖的病毒性传染病，主要引起患病草鱼鱼种各器官、组织不同程度的充血、出血症状，并因此得名。1970年首次发现，此后相继在我国湖北、湖南、广东、广西、江苏、浙江、安徽、福建、上海、四川等省、市、自治区各养殖区流行，还可感染青鱼、鲫鱼、麦穗鱼等多种鱼种。由于草鱼出血病危害鱼类种类多，流行范围广，发病季节长(每年6月下旬到9月底为主要流行季节)，死亡率高达85％，对水产养殖带来巨大危害和经济损失。

GCRV隶属水生呼肠孤病毒属(Aquareoviridae，AQRV)，是中国分离的第一种鱼类病毒，也是水生呼肠孤病毒属中致病力最强的毒株。GCRV病毒属于AQRV的C群，为二十面体对称的球形体，成熟病毒直径为70-80nm，具有双层衣壳，无囊膜，基因组由11条dsRNA组成。主要通过呼吸道感染宿主，具有高度传染性和致死性。GCRV主要危害10cm左右的草鱼鱼种(4-5月龄)，通过鱼鳃进入鱼体，前3天为潜伏期，第四天后开始发病，侵染草鱼肝脏、肾脏、肠道、肌肉等组织，5-7天后出现明显充血、出血症状。

目前，免疫接种仍是防治该病毒性疾病最有效的途径，包括灭活疫苗、减毒疫苗、亚单位疫苗、载体疫苗、DNA疫苗等。蛋白酶抑制剂、RNA干扰技术、免疫增强剂也取得一定的进展和应用。譬如，中国水产科学研究院珠江水产研究所通过多代培养、减毒研制的弱毒活疫苗已实现商品化并得到广泛应用，使草鱼出血病在一定程度上得到了控制。近年来，基因工程制备亚单位疫苗和核酸疫苗为综合防治草鱼出血病提供了新方法。亚单位疫苗具有滴度高、抗体出现早、持续时间长等优点，具有胸腺依赖性免疫原的性质。核酸疫苗也称基因疫苗，以其抗原性强、改造方便、保护时间长、制备和运输方便而越来越受到人们的重视。贡成良等也构建了带有草鱼出血病病毒结构蛋白VP6基因的重组杆状病毒BmNPV-IIVP6并接种至五龄家蚕幼虫或蛹，再将五龄家蚕幼虫或蛹冷冻干燥制备的冻干粉与鱼饲料均匀混合获得口服疫苗。

枯草芽孢作为口服型疫苗载体，具有很多常规疫苗载体不可比拟的优点：它属于革兰阳性菌，不产生毒素，生物安全性高，稳定性极好，是常用的益生菌之一，已用作为人的功能性食品、动物饲料添加剂等。此外，枯草芽孢有独特的免疫学特性，口服的芽孢在动物肠道能被肠道相关淋巴组织识别，发挥免疫佐剂作用，活化肠粘膜上的淋巴组织，增加分泌型(SIgA)抗体分泌，提高免疫识别能力，并诱导T、B淋巴细胞和巨噬细胞分泌细胞因子，通过淋巴细胞再循环活化全身免疫系统，从而增强机体的非特异性和特异性免疫系统。

枯草芽孢杆菌有完善的分泌系统，能将外源重组蛋白直接分泌至培养液中，大大减少了表达产物的分离纯化步骤，已应用于许多重组蛋白的表达。枯草芽孢杆菌芽孢生产成本低，生长快速，对营养要求低，适于现代工业发酵生产。生产的重组芽孢疫苗，稳定性高，方便储存、运输，并可以作为食品添加剂使用。因此枯草芽孢杆菌已作为益生菌得到广泛应用畜牧业和渔产业，特别是作为添加剂，不仅克服了抗生素对消化道内其它微生物菌群的不良影响，而且避免了抗生素长期使用的毒副作用、抗药性和耐药性，并能促进禽畜及鱼类的生长，增强动物防病抗病能力，提高饲料的消化、吸收利用率和转化率，提高养殖业产量。由于枯草芽孢作为疫苗载体所具有独特优势，被认为是最有前景的口服疫苗载体并开始应用于病原微生物疫苗的研制。

现有灭活疫苗、弱毒活疫苗使草鱼出血病在一定程度上得到了控制，但在野外应用中其逐一注射方式仍有一定局限性，对鱼体也会造成损伤。同时灭活疫苗、弱毒活疫苗也存在毒力返祖的安全性隐患。与之相比，口服疫苗具有实施方便，不受时间、地点和鱼体大小的限制，对鱼无损伤等优点。

虽然枯草芽孢杆菌具有良好的微生物疫苗研究价值，但是基因工程操作过程中低转化率和遗传不稳定性限制了其在工业发酵生产中的广泛应用。大肠杆菌/枯草芽孢杆菌穿梭表达质粒的构建和应用技术可以提高枯草芽孢杆菌转化成功率，简化基因工程操作步骤，有利于枯草芽孢杆菌作为疫苗载体的应用推广。

发明内容

为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种草鱼出血病口服疫苗及其制备与应用。

为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种融合蛋白，含有枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白CotC和草鱼呼肠孤病毒VP4蛋白。

优选地，所述枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白CotC的氨基酸序列对应于如SEQIDNO.2所示核苷酸序列所编码的氨基酸序列。

更优选地，所述枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白CotC的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，具体为：

MGYYKKYKEEYYTVKKTYYKKYYEYDKKDYDCDYDKKYDDYDKKYYDHDKKDYDYVVEYKKHKKHY。

进一步优选地，所述枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白CotC的编码核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，具体为：

TGTAGGATAAATCGTTTGGGCCGATGAAAAATCGGCTCTTTATTTGATTTGTTTTGTGTCATCTGTCTTTTTCTATCATTTGGACAGCCCTTTTTTCCTTCTATGATTTTAACTGTCCAAGCCGCAAAATCTACTCGCCGTATAATAAAGCGTAGTAAAAATAAAGGAGGAGTATATATGGGTTATTACAAAAAATACAAAGAAGAGTATTATACGGTCAAAAAAACGTATTATAAGAAGTATTACGAATATGATAAAAAAGATTATGACTGTGATTACGACAAAAAGTATGATGACTATGATAAAAAATATTATGATCACGATAAAAAAGACTATGATTATGTTGTAGAGTATAAAAAGCATAAAAAACACTAC。

优选地，所述草鱼呼肠孤病毒VP4蛋白的氨基酸序列对应于如SEQIDNO.4所示核苷酸序列所编码的氨基酸序列。

更优选地，所述草鱼呼肠孤病毒VP4蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示，具体为：

MSAIWEPETVSAAGNYYLWPTVIGDASMTSDWGTISTSLANGRLRVAPLDLTHALHKGNVVEPIVPSDVLGNASPEEMRSALPADVLTAFKAKLTTVASVVGRALNPNDSAHAPSSGTVLGPLAIENKAQSKPKPVSDLWIAAXRGVNLFVASPSASLQTGVPVMGDSSVLTSLTGGATTALNTGDMGTPSLEATAKRAARVAGGLLRQRVMDKLTRYWPLR。

进一步优选地，所述草鱼呼肠孤病毒VP4蛋白的编码核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，具体为：

TTTGGCAATATTCGCAACATTACCGACTTCTCAATGTCTGCAATTTGGGAACCAGAGACAGTCAGCGCGGCAGGCAATTACTATCTATGGCCGACCGTAATCGGTGATGCATCAATGACATCAGATTGGGGGACAATTAGCACATCCCTAGCTAATGGCAGACTCCGTGTCGCACCTCTGGACCTGACTCATGCACTCCACAAAGGCAATGTCGTGGAGCCGATCGTACCATCTGATGTGCTAGGTAATGCCTCACCAGAGGAAATGCGTTCCGCGTTGCCAGCAGATGTGCTGACAGCTTTCAAAGCCAAGCTCACAACAGTGGCTTCCGTAGTCGGCCGTGCCTTAAATCCCAACGACAGTGCGCATGCACCATCATCCGGCACCGTCCTCGGCCCGCTTGCAATCGAAAACAAGGCCCAATCAAAACCTAAACCCGTATCAGATCTGTGGATAGCCGCTYGTCGTGGTGTGAATCTATTCGTAGCCTCTCCAAGCGCGAGTCTGCAAACAGGTGTGCCGGTCATGGGGGACAGCAGCGTGTTGACAAGCTTGACGGGTGGTGCAACTACCGCGTTGAATACTGGTGACATGGGTACCCCAAGCTTGGAGGCCACAGCGAAACGGGCAGCTAGAGTTGCTGGAGGACTGCTACGACAGAGAGTCATGGACAAACTAACTCGATACTGGCCCCTCCGTC。

优选地，所述融合蛋白的氨基酸序列中含有如SEQIDNO.5所示核苷酸序列所编码的氨基酸序列。

进一步优选地，所述融合蛋白的编码核苷酸序列中含有如SEQIDNO.5所示的核苷酸序列。如SEQIDNO.5所示的核苷酸序列具体为：

TCTATAATAATATTTGGGAAATATTCATTCTAATTGGCTCGAGGTCGACTGTAGGATAAATCGTTTGGGCCGATGAAAAATCGGCTCTTTATTTGATTTGTTTTGTGTCATCTGTCTTTTTCTATCATTTGGACAGCCCTTTTTTCCTTCTATGATTTTAACTGTCCAAGCCGCAAAATCTACTCGCCGTATAATAAAGCGTAGTAAAAATAAAGGAGGAGTATATATGGGTTATTACAAAAAATACAAAGAAGAGTATTATACGGTCAAAAAAACGTATTATAAGAAGTATTACGAATATGATAAAAAAGATTATGACTGTGATTACGACAAAAAGTATGATGACTATGATAAAAAATATTATGATCACGATAAAAAAGACTATGATTATGTTGTAGAGTATAAAAAGCATAAAAAACACTACGGATCCTTTGGCAATATTCGCAACATTACCGACTTCTCAATGTCTGCAATTTGGGAACCAGAGACAGTCAGCGCGGCAGGCAATTACTATCTATGGCCGACCGTAATCGGTGATGCATCAATGACATCAGATTGGGGGACAATTAGCACATCCCTAGCTAATGGCAGACTCCGTGTCGCACCTCTGGACCTGACTCATGCACTCCACAAAGGCAATGTCGTGGAGCCGATCGTACCATCTGATGTGCTAGGTAATGCCTCACCAGAGGAAATGCGTTCCGCGTTGCCAGCAGATGTGCTGACAGCTTTCAAAGCCAAGCTCACAACAGTGGCTTCCGTAGTCGGCCGTGCCTTAAATCCCAACGACAGTGCGCATGCACCATCATCCGGCACCGTCCTCGGCCCGCTTGCAATCGAAAACAAGGCCCAATCAAAACCTAAACCCGTATCAGATCTGTGGATAGCCGCTYGTCGTGGTGTGAATCTATTCGTAGCCTCTCCAAGCGCGAGTCTGCAAACAGGTGTGCCGGTCATGGGGGACAGCAGCGTGTTGACAAGCTTGACGGGTGGTGCAACTACCGCGTTGAATACTGGTGACATGGGTACCCCAAGCTTGGAGGCCACAGCGAAACGGGCAGCTAGAGTTGCTGGAGGACTGCTACGACAGAGAGTCATGGACAAACTAACTCGATACTGGCCCCTCCGTCGAGCTCTAGCACTTTGCCACTCATTTTTTGCGTTAGCAA。

本发明的第二方面，提供了一种制备前述融合蛋白的方法，包括如下步骤：

(1)获得目的基因；

(2)构建重组质粒：将步骤(1)所得目的基因以及载体质粒采用相同的限制性内切酶切割，然后进行连接，获得重组质粒；

(3)将步骤(2)所得重组质粒导入感受态细胞，转化；

(4)筛选阳性克隆，并将正确的重组质粒转化宿主感受态细胞；

(5)诱导表达融合蛋白。

优选地，步骤(1)中，所述目的基因的核苷酸序列含有枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白CotC的编码核苷酸序列和草鱼呼肠孤病毒VP4蛋白的编码核苷酸序列。

优选地，步骤(1)中，所述枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白CotC的编码核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。所述草鱼呼肠孤病毒VP4蛋白的编码核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。

进一步优选地，步骤(1)中，所述目的基因的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示，具体为：

GTCGACTGTAGGATAAATCGTTTGGGCCGATGAAAAATCGGCTCTTTATTTGATTTGTTTTGTGTCATCTGTCTTTTTCTATCATTTGGACAGCCCTTTTTTCCTTCTATGATTTTAACTGTCCAAGCCGCAAAATCTACTCGCCGTATAATAAAGCGTAGTAAAAATAAAGGAGGAGTATATATGGGTTATTACAAAAAATACAAAGAAGAGTATTATACGGTCAAAAAAACGTATTATAAGAAGTATTACGAATATGATAAAAAAGATTATGACTGTGATTACGACAAAAAGTATGATGACTATGATAAAAAATATTATGATCACGATAAAAAAGACTATGATTATGTTGTAGAGTATAAAAAGCATAAAAAACACTACGGATCCTTTGGCAATATTCGCAACATTACCGACTTCTCAATGTCTGCAATTTGGGAACCAGAGACAGTCAGCGCGGCAGGCAATTACTATCTATGGCCGACCGTAATCGGTGATGCATCAATGACATCAGATTGGGGGACAATTAGCACATCCCTAGCTAATGGCAGACTCCGTGTCGCACCTCTGGACCTGACTCATGCACTCCACAAAGGCAATGTCGTGGAGCCGATCGTACCATCTGATGTGCTAGGTAATGCCTCACCAGAGGAAATGCGTTCCGCGTTGCCAGCAGATGTGCTGACAGCTTTCAAAGCCAAGCTCACAACAGTGGCTTCCGTAGTCGGCCGTGCCTTAAATCCCAACGACAGTGCGCATGCACCATCATCCGGCACCGTCCTCGGCCCGCTTGCAATCGAAAACAAGGCCCAATCAAAACCTAAACCCGTATCAGATCTGTGGATAGCCGCTYGTCGTGGTGTGAATCTATTCGTAGCCTCTCCAAGCGCGAGTCTGCAAACAGGTGTGCCGGTCATGGGGGACAGCAGCGTGTTGACAAGCTTGACGGGTGGTGCAACTACCGCGTTGAATACTGGTGACATGGGTACCCCAAGCTTGGAGGCCACAGCGAAACGGGCAGCTAGAGTTGCTGGAGGACTGCTACGACAGAGAGTCATGGACAAACTAACTCGATACTGGCCCCTCCGTCGAGCTC。

优选地，步骤(2)中，所述载体质粒为PEB03质粒。

所述PEB03质粒为现有技术中已有质粒。例如可参考文献“productionofn-acetyl-d-neuraminicacidbyuseisofanefficientsporesurfacedisplaysystem”。

优选地，步骤(2)中，所述限制性内切酶为SalI、SacI。

优选地，步骤(3)中，所述感受态细胞为枯草芽孢杆菌WB600感受态细胞。

优选地，步骤(4)中，所述宿主感受态细胞为枯草芽孢杆菌WB600感受态细胞。

优选地，步骤(5)中，所述诱导采用DSM芽孢培养基诱导。

本发明的第三方面，提供了前述融合蛋白在制备草鱼出血病口服疫苗中的用途。

本发明的第四方面，提供了一种草鱼出血病口服疫苗，含有前述融合蛋白。

优选地，所述草鱼出血病口服疫苗还含有疫苗载体，所述疫苗载体选用枯草芽孢杆菌芽孢。

进一步优选地，所述草鱼出血病口服疫苗还含有鱼肝油和饲料。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明通过广泛而深入的研究获得的融合蛋白，制备成草鱼出血病口服疫苗，能够在鱼体肠道内成功定植，免疫效果良好，能够使得鱼体攻毒感染后较阴性组死亡率降低40％～50％。

附图说明

图1：CotC目的片段、VP4编码序列片段的扩增及CotC-VP4目的基因片段的鉴定，说明CotC目的片段以及VP4编码序列片段连接成功。

图2：SDS-PAGE分析融合蛋白PEBO3-CotC-VP4表达情况。

图3：Westernblotting分析融合蛋白PEBO3-CotC-VP4表达情况。

图4：免疫荧光分析融合蛋白PEBO3-CotC-VP4表达情况。

图5：PCR检测重组芽孢在草鱼肠道内的定植情况。

图6：ELISA测定草鱼血清特异性抗体IgM水平。

图7：real-timeqPCR检测草鱼脾、肾相关细胞因子水平。

图8：不同浓度GCRV攻毒后累计死亡率的统计。

具体实施方式

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULARCLONING：ALABORATORYMANUAL，Secondedition，ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989andThirdedition，2001；Ausubel等，CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY，JohnWiley&Sons，NewYork，1987andperiodicupdates；theseriesMETHODSINENZYMOLOGY，AcademicPress，SanDiego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTUREANDFUNCTION，Thirdedition，AcademicPress，SanDiego，1998；METHODSINENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.WassarmanandA.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，SanDiego，1999；和METHODSINMOLECULARBIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)HumanaPress，Totowa，1999等。

本发明所涉及术语解释：

bpbasepair碱基对

BSAbovineserumalbumin牛血清白蛋白

cDNAcomplementaryDNA互补DNA

CFUColony-FormingUnits菌落形成单位

Cy3CyanineDyes荧光试剂

DEPCDiethypyrocarbonate焦碳酸二乙酯

E.coliEscherichiacoli大肠埃希菌

EDTAethylenediaminetetraaceticacid乙二胺四乙酸

ELISAenzymelinkedimmunosorbentassay酶联免疫吸附测定

HRPHorseradishPeroxidase辣根过氧化物酶

LBlysogenybrothLB培养基

LD50medianlethaldose半数致死量

ODopticaldensity光密度

ORFopenreadingframe开放阅读框

PAGEpolyacrylamidegelelectrophoresis聚丙烯酰胺凝胶电泳

PCRPolymeraseChainReaction聚合酶链反应

PMSFphenylmethanesulfonylfluoride苯甲基磺酰氟

SDSsodiumdodecylsulfate十二烷基硫酸钠

WBWesternblotting蛋白质印迹法

实施例1草鱼出血病口服疫苗的制备

(1)枯草芽孢杆菌/大肠杆菌穿梭表达系统的构建

提取枯草芽孢杆菌WB600基因组DNA，将CotC目的片段从枯草芽孢杆菌基因组DNA中扩增出后与载体pBluescriptIISK(+)重组，获得重组质粒pBluescriptIISK(+)-CotC；再将VP4编码序列片段连接至重组质粒pBluescriptIISK(+)-CotC，获得重组质粒pBluescriptIISK(+)-CotC-VP4；将CotC-VP4目的基因片段整体从重组质粒pBluescriptIISK(+)-CotC-VP4上切下，连接至PEB03获得重组质粒PEB03-CotC-VP4。

同时将CotC目的片段从枯草芽孢杆菌基因组DNA中扩增出后与PEBO3重组，获得重组质粒PEBO3-CotC作为对照。电转化法分别将穿梭表达质粒PEB03-CotC-VP4和PEBO3-CotC转入枯草芽孢杆菌WB600中诱导表达。

具体的：

1.1枯草芽孢杆菌WB600基因组DNA的提取

1)-80℃冰箱取出枯草芽孢杆菌WB600菌株，划LB平板，37℃培养过夜；

2)挑取单克隆菌落接种于5mlLB培养基中，37℃摇床培养过夜；

3)按1:100比例取1ml菌液转入100mlLB培养基中，37℃摇床培养过夜；

4)4℃离心收集细菌(重约0.5g)，使用含0.5％溶菌酶的EDTA液吹悬菌体，37℃静置30分钟；

5)加入10％SDS至终浓度0.5％，吹匀，65℃水浴静置30分钟；

6)再加入与步骤5)中所用10％SDS等体积的酚、氯仿、异戊醇混合液(酚：氯仿：异戊醇体积比为25:24:1)抽提两次，每次冰浴15分钟，12000g离心5分钟，弃上清；

7)用0.6倍体积异丙醇沉淀基因组DNA，室温30min；12000g离心10分钟，弃上清；

8)用70％乙醇洗涤沉淀，晾干，DNA溶于500μlTE缓冲液中，加RNase至终浓度100μg/ml，65℃水浴静置30分钟；重复此步骤两次；

9)将DNA溶于100μlTE缓冲液中，取5μl样品进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，其余样品-20℃保存备用。

1.2重组质粒pBluescriptIISK(+)-CotC的构建

根据芽孢衣壳CotC编码序列和载体pBluescriptIISK(+)多克隆位点，设计特异性基因扩增引物，将CotC目的片段从枯草芽孢杆菌基因组DNA中扩出后与载体pBluescriptIISK(+)重组，获得重组质粒pBluescriptIISK(+)-CotC，引入多克隆位点。基因工程技术在大肠杆菌复制菌株DH5α中操作，重组质粒测序鉴定无误后常规保存。

所述CotC目的片段的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，具体为：

引物如下：

上游引物P1：5’-CATGTCGACTGTAGGATAAATCGTT-3’(SEQIDNO.7)，下划线为SalI酶切位点；

下游引物P2：5’-CGGGGATCCGTAGTGTTTTTTATGC-3’(SEQIDNO.8)，下划线为BamHI酶切位点。

1.3重组质粒pBluescriptIISK(+)-CotC-VP4的构建

依据GenBank中GCRV-HZ08株S6基因(GenBank:GQ896337.1)序列编码的蛋白保守结构域ReovirusM2(Accession:cl05506)，用Primerpremier5.0软件设计特异性基因扩增引物扩增VP4基因。

所述VP4编码序列片段的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，具体为：

上游引物P1：5′-CGCGGGATCCTTTGGCAATATTCGCAACATTACC-3′(SEQIDNO.9)，下划线为BamHI酶切位点；

下游引物P2：5′-CGTGAGCTCGACGGAGGAGGCCAGTATCGA-3′(SEQIDNO.10)，下划线为SacI酶切位点。

PCR扩增出GCRVVP4编码序列片段ORF(701bp)，连接至上述重组质粒pBluescriptIISK(+)-CotC。基因工程技术在大肠杆菌复制菌株DH5α中操作，重组质粒测序鉴定无误后常规保存。

1.4重组穿梭质粒PEB03-CotC-VP4的构建和电转化至枯草芽孢杆菌WB600

采用SalI、SacI酶切位点将CotC-VP4目的基因片段整体从重组质粒pBluescriptIISK(+)-CotC-VP4上切下，连接至PEB03获得重组穿梭质粒PEB03-CotC-VP4。将新重组质粒电转化至枯草芽孢杆菌WB600，具体步骤如下：

1)接菌WB600于3mlLB培养基中，37℃，250rpm，培养过夜；

2)将2.6ml菌液转入40ml电转化A培养基中，37℃，250rpm，摇至OD值0.8-0.9；

3)菌液冰水浴10min；5,000g，4℃离心5min；

4)用50ml预冷的电转化B培养基吹悬菌体；5,000g，4℃离心5min；重复此步骤4次；

5)将菌体吹悬于1ml电转化B培养基，分装10管，每个EP管分装100μl；

6)将100μlWB600感受态细胞中加入5μl(约1μg)重组质粒PEB03-CotC-VP4，冰上静置2min；

7)将100μlWB600感受态细胞吸入到预冷的电击杯中(1mm)，调整电转化仪参数：2.0kV,1mm,25μF,200Ω,4.5-5.0ms，电击一次；

8)电击结束后吸出电击杯中感受态细胞转移至新的EP管中，立即加入1ml电转化C培养基，37℃，150rpm，复苏3h，涂LB平板(壮观霉素抗性)，37℃温箱中培养20h；

9)挑取单克隆至LB培养基中(壮观霉素抗性)，37℃，250rpm，培养过夜；

10)菌液PCR及测序鉴定阳性克隆。

菌液PCR鉴定如图1所示，说明CotC目的片段以及VP4编码序列片段连接成功。

测序鉴定，也说明CotC目的片段以及VP4编码序列片段连接成功。

CotC-VP4目的基因的核苷酸序列如(SEQIDNO.6)所示，具体为：

编码融合蛋白的核苷酸序列含有如SEQIDNO.5所示的核苷酸序列。如SEQIDNO.5所示的核苷酸序列具体为：

(2)枯草芽孢杆菌融合表达GCRVVP4(融合蛋白)的检测

重组菌于DSM芽孢培养基中培养0h、6h、12h、24h(图2，1-4泳道)取样处理，并分离培养24h的芽孢上清液和衣壳蛋白(图2，5、6泳道)行SDS-PAGE，观察融合蛋白在枯草芽孢杆菌中的表达情况及其在芽孢中的定位。将诱导24h留取的全菌沉淀(图3，1泳道)及超声破壁分离的芽孢上清蛋白和衣壳蛋白(图3，2、3泳道)在进行SDS-PAGE后继续进行Westernblotting，检测融合蛋白在枯草芽孢杆菌中的表达情况及其在芽孢衣壳的定位。取诱导24h的芽孢液固定处理后，依次与大鼠抗VP4血清(对照组孵育正常大鼠血清)、羊抗大鼠Cy3标记的IgG反应，荧光显微镜下观察融合蛋白在芽孢衣壳表达情况(图4，A白光下芽孢形态，B实验组可见显著荧光，C对照组未见荧光)。

(3)枯草芽孢杆菌的扩大培养和芽孢的获得

1)按照1:100体积比接菌于40mlLB培养基中(壮观霉素抗性)，37℃摇床培养过夜；于次日转入4LDSM芽孢培养基中(不含抗生素)，37℃摇床培养24h；

2)12,000g离心10min，弃上清留取沉淀，加入溶菌酶至终浓度4mg/ml反复吹悬沉淀，室温静置30min；

3)用1MNaCl洗涤芽孢，同时加加入PMSF至终溶度1mM，充分混匀；

4)12,000g离心10min，弃上清留取沉淀，再用1MKCl洗涤芽孢同时加加入PMSF至终溶度1mM，充分混匀；

5)去离子水洗涤芽孢三次，12,000g离心10min，弃上清留取沉淀；

6)40ml去离子水吹悬芽孢沉淀，65℃水浴静置1h以杀灭残留的枯草芽孢杆菌繁殖体；

7)取3μl芽孢用去离子稀释，显微镜下计数，将芽孢于-40℃保存备用。

(4)口服疫苗的免疫效果评价

4.1枯草杆菌芽孢疫苗的制备和鱼体免疫

将获得的芽孢用鱼肝油包被后与饲料均匀混合，即获得草鱼出血病口服疫苗，芽孢量约10⁹CFU/g饲料。草鱼150尾，分别为口服疫苗组、阴性对照和阳性对照组(注射商品化减毒活疫苗)，每组50尾常规鱼缸饲养，根据枯草杆菌芽孢对草鱼生长、免疫以及对养殖水体水质的影响，每天投喂一次，约鱼体重2％的饲料，连续投喂6周。于6周免疫结束后，对三组草鱼分别尾静脉取血分离收集草鱼血清，分离保存肝、脾、肾、肠道等组织，-20℃保存备用。

4.2PCR方法鉴定草鱼肠道内芽孢

免疫6周后，口服疫苗组中的鱼肠道研磨液涂布的LB固体培养板上长出大量枯草杆菌菌落，挑取单克隆摇菌，进行菌液PCR，PCR产物经电泳鉴定，得到目的基因条带，说明枯草杆菌芽孢在肠道内成功定植(图5)。

4.3间接ELISA测定草鱼血清特异性抗体水平

以重组蛋白pET32a(+)-VP4(1μg/孔)包被酶标板过夜，将免疫6周后草鱼血清按照1：50稀释，HRP标记的羊抗草鱼IgM作为二抗(1：5000稀释)检测免疫草鱼血清抗体水平，口服疫苗组IgM水平较对照组有所升高，但不及注射组显著(图6)。

4.4.4草鱼脾、肾细胞因子的检测

取收集的脾、肾组织用TRIzol法提取总RNA并定量。将1μg总RNA逆转录为cDNA，1：4用DEPC水稀释后行real-timeqPCR检测相关细胞因子。结果显示草鱼脾内相关细胞因子注射组有显著升高，口服疫苗组与阴性组无明显变化；肾内细胞因子口服疫苗组与注射组均升高显著，其中IgM、MyD88、TLR22与阴性组有统计学差异(图7)。

4.5攻击感染

以上实验结果提示本实验中枯草杆菌芽孢能刺激鱼体产生一定程度的特异性免疫反应。每组分别取20尾上述免疫后草鱼各注射200ul约10³LD50GCRV-hunan1307进行攻毒感染，并以加热棒加热保持水体温度恒定28℃。攻毒后统计累计死亡率，即疫苗的免疫保护力。同上每组分别取20尾以10⁴LD50GCRV进行攻毒感染。结果显示，阴性组累计死亡率均高达90％，注射组在两次攻毒实验中均有显著保护力，累计死亡率10％，口服疫苗组虽不及注射组显著亦有一定保护力，累计死亡率分别为45％和60％(图8)。

4.6统计分析

SPSS16.0软件用于本研究中数据的统计学分析。实验结果均以均值±标准差表示，实验组与对照组比较采用t-test分析，P值小于0.05表明两组数据具有显著性差异。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims

1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白含有枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白CotC和草鱼呼肠孤病毒VP4蛋白。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白CotC的氨基酸序列对应于如SEQIDNO.2所示核苷酸序列所编码的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白CotC的编码核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。

4.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述草鱼呼肠孤病毒VP4蛋白的氨基酸序列对应于如SEQIDNO.4所示核苷酸序列所编码的氨基酸序列。

5.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述草鱼呼肠孤病毒VP4蛋白的编码核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。

6.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列中含有如SEQIDNO.5所示核苷酸序列所编码的氨基酸序列。

7.一种制备如权利要求1～6任一权利要求所述融合蛋白的方法，包括如下步骤：

(1)获得目的基因；

(3)将步骤(2)所得重组质粒导入感受态细胞，转化；

(5)诱导表达融合蛋白。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述目的基因的核苷酸序列含有枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白CotC的编码核苷酸序列和草鱼呼肠孤病毒VP4蛋白的编码核苷酸序列。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述限制性内切酶为SalI、SacI。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(3)和步骤(4)中，所述宿主感受态细胞为枯草芽孢杆菌WB600感受态细胞。

11.如权利要求1～6任一权利要求所述融合蛋白在制备草鱼出血病口服疫苗中的用途。

12.一种草鱼出血病口服疫苗，含有如权利要求1～6任一权利要求所述融合蛋白。