CN108026566A

CN108026566A - 用于使dna片段化的方法和试剂盒

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Publication number: CN108026566A
Application number: CN201680039772.3A
Authority: CN
Inventors: 朱听; Y.埃本斯泰恩; 娄春波; 姜文君; 赵学金; T.加布里伊里
Original assignee: Tsinghua University; Institute of Microbiology of CAS; Ramot at Tel Aviv University Ltd
Current assignee: Tsinghua University
Priority date: 2015-05-04
Filing date: 2016-04-14
Publication date: 2018-05-11
Also published as: EP3292219B9; EP3292219A4; WO2016178207A1; US20180044659A1; EP3292219B1; US11845928B2; EP3292219A1

Abstract

提供了DNA片段化的方法。所述方法包括用对DNA的预定义位点具有结合亲和力和选择性的辅助结构域‑定向的核酸酶孵育包含DNA的半固体生物样品，以得到目的DNA片段，从而使DNA片段化。

Description

用于使DNA片段化的方法和试剂盒

发明领域和背景

本发明在其一些实施方案中涉及用于使DNA片段化的方法和试剂盒，其可进一步用于DNA测序、成像、扩增和克隆。

长基因组序列、特别是包含大的基因簇的那些的克隆对于产生药物和生物燃料的合成生物学和基因工程工作特别重要。传统的基于PCR的克隆方法通常受限于DNA模板的长度和GC含量：标准的PCR反应常规产生至多10 kb的片段，而更长的PCR产物需要反应条件的繁琐优化，并且甚至在理想条件下，通常受限于35 kb⁵。或者，可通过装配多个短片段，例如重叠PCR产物或化学合成的DNA寡聚物，产生长的目的基因组序列，但这样的方法趋于耗时和昂贵，特别是对于获得长于50 kb的序列(其通常需要3-5阶段，每个包含多个装配事件)^6,7。获得长的基因组序列的另一方法是通过基因组DNA的限制性酶消化。然而，作为一种非靶向的方法，从巨大量的限制性消化产物中选择特定目的序列可能是剧烈挑战和不方便的⁸。某些技术，例如转化关联的重组^9,10和单链重叠退火¹¹已被开发以克隆特定的大的细菌基因簇。然而，这些技术的利用仍受到限制，因为它们依赖于靶基因组区域侧翼的独特限制性位点的可用性，和通常靶序列中选择标记的存在。为了促进生物技术和合成生物学的进步，开发克隆几乎任意的长基因组序列(其使用常规方法难以获得)的通用方法势在必行。类似地，分离这样的几乎任意的长基因组序列将使得特异性靶向这些区域的基因组应用成为可能，所述应用例如超深或多路下一代测序、光学DNA作图和其它靶向基因组应用。

CRISPR-Cas9，初始作为酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)适应性免疫系统的组分被发现，包含Cas9内切核酸酶，其可通过指导RNA定向切割特定序列¹²。其长的可编程的识别位点(20 bp)导致比传统限制性酶(具有限于6-8 bp的固定识别位点)更高得多的靶向特异性和通用性，这已促进广泛开发基于Cas9的基因组体内编辑¹³。相比之下，Cas9系统的体外潜在应用尚未被充分研究；而是，它们主要聚焦于测试该酶的切割效率和序列识别特异性或处理短的序列^14,15。

另外的背景技术包括：

WO2013142578

US20140357523。

发明简述

根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了使DNA片段化的方法，所述方法包括用对DNA的预定义位点具有结合亲和力和选择性的辅助结构域-定向的核酸酶孵育包含DNA的半固体生物样品，以得到目的DNA片段，从而使DNA片段化。

根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了克隆的方法，所述方法包括：

(a) 按本文所述使DNA片段化，以得到至少一个目的DNA片段；和

(b) 克隆所述目的DNA片段。

根据本发明的一些实施方案，所述方法进一步包括在片段化之后和克隆之前，熔解半固体生物样品。

根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了DNA测序的方法，所述方法包括：

(a) 按本文所述使DNA片段化，以得到至少一个目的DNA片段；

(b) 从DNA分离所述目的DNA片段；和

(c) 测序所述目的DNA片段。

根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了核酸扩增的方法，所述方法包括：

(a) 按本文所述使DNA片段化，以得到至少一个目的DNA片段；

(b) 从DNA分离所述目的DNA片段；和

(c) 扩增所述目的DNA片段。

根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了原位成像DNA的方法，所述方法包括：

(a) 按本文所述使DNA片段化，以得到至少一个目的DNA片段；

(b) 从DNA分离所述目的DNA片段；

(c) 连接标记试剂至目的DNA片段；和

(d) 使目的DNA片段进行适合于检测标记试剂的成像方法。

根据本发明的一些实施方案，目的DNA片段长度是50-150 kb。

根据本发明的一些实施方案，DNA是基因组DNA。

根据本发明的一些实施方案，DNA是人DNA。

根据本发明的一些实施方案，DNA是染色体DNA。

根据本发明的一些实施方案，目的DNA片段包含基因簇。

根据本发明的一些实施方案，半固体生物样品呈凝胶的形式。

根据本发明的一些实施方案，半固体生物样品阻止DNA剪切。

根据本发明的一些实施方案，从DNA分离所述目的DNA片段通过以下至少一项来实现：

(a) 熔解半固体生物样品；和

(b) 使半固体生物样品进行酶处理，所述酶处理消化半固体生物样品的凝胶基质。

根据本发明的一些实施方案，从DNA分离所述目的DNA片段包括脉冲场凝胶电泳。

根据本发明的一些实施方案，克隆通过Gibson装配实现。

根据本发明的一些实施方案，所述方法进一步包括在片段化之前，在半固体生物样品中提供包含染色体DNA的细胞和裂解所述细胞。根据本发明的一些实施方案，所述方法进一步包括在片段化之后评估DNA的片段化效率。

根据本发明的一些实施方案，评估片段化效率通过脉冲场凝胶电泳实现。

根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了用于DNA片段化的试剂盒，所述试剂盒包含：

(i) 包含辅助结构域-定向的核酸酶的第一容器；

(ii) 包含低熔解凝胶基质的第二容器；和任选地

(iii) 包含细胞裂解缓冲液的第三容器。

根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了用于DNA克隆的试剂盒，所述试剂盒包含按上文所述的组分和包含用于Gibson装配的外切核酸酶的另外的容器。

根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了用于DNA扩增的试剂盒，所述试剂盒包含按上文所述的组分和包含聚合酶的另外的容器。

根据本发明的一些实施方案，试剂盒包含上文所述的组分和包含标记试剂的另外的容器。

根据本发明的一些实施方案，辅助结构域-定向的核酸酶是寡核苷酸-定向的核酸酶。

根据本发明的一些实施方案，寡核苷酸-定向的核酸酶选自Cas和RISC。

根据本发明的一些实施方案，Cas包含Cas-9。

除非另外定义，本文使用的所有技术和/或科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管类似或等同于本文所述的那些的方法和材料可用于实践或测试本发明的实施方案，但下文描述了示例性的方法和/或材料。在冲突的情况下，以本专利说明书，包括定义为准。此外，材料、方法和实施例仅是说明性的，和不意图必然是限制性的。

附图简述

本发明的一些实施方案在本文仅通过实例的方式，参考附图进行描述。现在详细地特别提及附图，应强调所示的具体细节为通过实例的方式，和为说明性论述本发明的实施方案的目的。在此方面，伴随附图的描述使得本领域技术人员对可如何实施本发明的实施方案显而易见。

在附图中：

图1是通过染色体区段的CRISPR-Cas9-辅助靶向(CATCH)的一步大基因簇克隆的示意图。在细菌细胞的凝胶内裂解后，染色体通过RNA-指导的Cas9在指定的靶位点处切割。在两个末端处与靶DNA共有30 bp末端序列重叠(黑色十字)的克隆载体(长度未按比例)，在Gibson装配混合物中与靶片段连接。重组质粒然后被电转化至克隆宿主。

图2A-G描述了通过CATCH，具有不同长度的长基因组序列的克隆。图2A – 总共5个sgRNA对(SEQ ID NOs: 3-13)经设计以靶向大肠杆菌基因组中不同长度的片段(分别为50、75、100、150和200 kb)，全都包含lacZ基因。图2B - 琼脂糖凝胶块中的大肠杆菌染色体被具有相应的sgRNA对的Cas9消化，和通过PFGE分析。图2C - 具有不同插入物大小的CATCH克隆的阳性率(50-100 kb；用150 kb插入物仅获得1个阳性克隆，和用200 kb没有获得阳性克隆)。图2D - 带有自大肠杆菌克隆的靶序列的质粒从蓝-白筛选和PCR-阳性的克隆纯化，线性化和通过PFGE分析。图2E-G - 带有分别从枯草芽孢杆菌(B. subtilis)、委内瑞拉链霉菌(S. venezuelae)或金霉素链霉菌(S. aureofaciens)克隆的大的靶基因簇的质粒从PCR-阳性克隆纯化，线性化和通过PFGE分析。M，标志物。

图3描述了在大肠杆菌中靶向测序的结果。197 kb基因组区被选择和按上所述“凝胶内”切割。将包含片段化的基因组材料的凝胶块置于琼脂糖板的孔中和在脉冲场凝胶电泳(PFGE)仪器上运行，以在凝胶上分离切割的片段为不同的DNA条带。从PFGE凝胶切出5个泳道的靶条带(197kb)，使用GIAquick凝胶提取试剂盒(柱)回收DNA，用15 ul洗脱缓冲液洗脱和在Qubit仪器上测试浓度。得到的样品包含约0.426 ng/ul靶DNA。使用用于文库制备的Truseq试剂盒制备测序文库，和作为泳道中的许多样品之一在150x2 miseq运行中测序文库。测序总共产生265386x2个读出，和约91 MGbx2数据，证实了对于这样的靶区域可实现的极度深的覆盖度。

图4A-B显示微生物基因组的凝胶内Cas9消化和阳性克隆的验证。图4A – 显示分别带有从大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、委内瑞拉链霉菌和金霉素链霉菌克隆的靶插入物的阳性克隆的PCR验证(用于验证的引物为SEQ ID NOs: 25-38)。对于具有从大肠杆菌克隆的靶插入物的蓝色菌落，在相对于lacZ基因的两个接合位点之一处进行PCR，而对于来自其它细菌的那些，验证两个接合位点。使用的PCR引物的名称列于子图下方。在所有子图中使用相同的DNA标志物。M，标志物。图4B显示凝胶内Cas9消化的酿酒酵母(S. cerevisiae)染色体I(具有约230 kb)通过PFGE分析以评价切割效率和脱靶作用。在各实验中，一次RNA-指导的Cas9切割将染色体分成2个片段(分别具有58加172 kb，62加168 kb，和73加157 kb)。预期的片段长度显示在加样孔上方。E，空泳道。

本发明的具体实施方案的描述

在详细说明本发明的至少一个实施方案之前，应理解本发明不必然将其应用局限于以下描述中阐明或通过实施例举例说明的细节。本发明能够具有其它实施方案或能够以各种方式实施或进行。

在将本发明转化为实践时，本发明人使用辅助单位-定向的核酸酶，例如细菌CRISPR系统的辅助单位-定向的核酸酶，已经设计了物理提取大的目的基因组区用于遗传分析的方法。通过特异性靶向核酸酶(例如，Cas9)以在目的区域的两个末端处切割双链DNA，从基因组分离目的基因组区。或者，通过极接近而在平行链中的两个单链缺口，可导致片段化。内切核酸酶的靶向通过辅助亚单位来实现，所述辅助亚单位对于核酸酶而言不是天然的，例如，带有长的识别序列，例如与基因组杂交以允许高度特异性靶向的至多20nt的序列的指导RNA。切割在半固体介质(例如，凝胶)中进行，其保护基因组DNA免于剪切。凝胶电泳用于物理分离基因组片段与剩余的基因组。脉冲场凝胶电泳(PFGE)允许分离至多若干Mbp长的DNA (例如完整的粟酒酵母染色体)，但鉴于大的染色体大小(例如，人染色体)而不分离剩余的基因组DNA。需要的DNA可从凝胶切下，和用于进一步遗传和表观遗传分析，例如测序或在纳米通道中光学作图。因此，本发明的教导提供了靶向基因组的方案，其允许寻址特定的基因组区。

通过体外使用辅助结构域-定向的核酸酶，本发明能够从基因组消化和分离至多兆碱基长度的特定DNA片段。与测序技术，例如Sanger测序、下一代测序、单分子实时测序、纳米孔测序和光学作图组合，本发明可实现填充许多物种的整个基因组的缺口，快速诊断突变相关的遗传疾病和准确检测DNA表观遗传特性的目的。无论应用于哪种测序方法，本发明会提高其准确性和减少时间和经济成本。

因此，根据本发明的一个方面，提供了使DNA片段化的方法，所述方法包括用对DNA的预定义位点具有结合亲和力和选择性的辅助结构域-定向的核酸酶孵育包含DNA的半固体生物样品，以得到目的DNA片段，从而使DNA片段化。

如本文使用的，术语“片段化”，其可互换地称为“切割”、“消化”或“限制”，是指在双链DNA分子的两条链中选择性断裂两个相邻的核苷酸之间的磷酸二酯键，从而导致DNA分子的双链断裂的酶反应。为了产生至少一个片段，在DNA分子的不同预定义位点处定向的至少两个切割事件必须发生。

切割可以是在DNA的互补位点处或相邻位于DNA上的切口的结果。

术语"切口"，如本文使用的，是指在双链DNA分子的一条链中断裂两个核苷酸之间的磷酸二酯键以产生3'羟基和5'磷酸酯基团的反应。

如本文使用的“DNA”是指包含脱氧核糖核酸\核苷酸的双链聚合物。DNA分子，在本文中亦称为“多核苷酸”，包含至少一个目的序列。根据本发明的一些实施方案，DNA可具有任何长度，例如大于约10 Kb碱基，大于约50 Kb碱基，大于100 Kb碱基，直至整个染色体，例如细菌、酵母、植物或人。DNA可包含天然存在的核苷酸、合成的核苷酸或二者的组合，只要对于至少一部分的DNA分子允许Watson-Crick碱基配对相互作用。DNA可包含在染色体或合成的载体中，例如粘粒、F粘粒、bac或噬菌体。

因此，可使用基本上任何来源的DNA，包括但不限于基因组DNA和互补DNA (cDNA)、质粒DNA、线粒体DNA、合成DNA和BAC克隆等。此外，任何生物体、有机材料或含核酸物质可用作DNA的来源以根据本发明的方法处理，包括但不限于植物、动物(例如，爬行动物、哺乳动物、昆虫、蠕虫、鱼类等)、组织样品、细菌、真菌(例如，酵母)、噬菌体、病毒、尸体组织、考古学/古代样品等。

在某些实施方案中，用于所述方法的基因组DNA可源自哺乳动物，其中在某些实施方案中哺乳动物是人。

根据特定的实施方案，DNA是基因组DNA。

根据特定的实施方案，DNA是染色体DNA。

如本文使用的“生物样品”是指包含DNA的体外或离体样品。除了DNA之外，生物样品可以或可以不包含各种分析物。其可以包含天然存在的组分(例如，染色体)或合成的组分(例如，质粒)。生物样品可以是自身体(例如，人体)分离的结果，因此包含细胞或无细胞DNA。因此，考虑了体液例如全血、血清、血浆、脑脊液、尿、淋巴液、和呼吸、肠和泌尿生殖道的各种外分泌物、泪液、唾液、乳以及白细胞、恶性组织、羊水和绒毛膜绒毛。

根据特定的实施方案，DNA包含在一种或多种细胞中。

不管DNA的来源如何，样品经处理，使得其以半固体形式配制。

本发明人已意识到，在半固体环境中配制DNA允许保护DNA免于剪切。

根据特定的实施方案，半固体生物样品呈凝胶的形式。

如本文使用的，术语“凝胶”是指包含从约50%或从约80%，和直至99.9% (质量)液体(例如水)的三维纤维网络。凝胶可被视为由于在由天然和/或合成的聚合物链制成的液体内的三维交联网络，主要是液体、但行为像固体或半固体的材料。根据本发明的一些实施方案，凝胶是水凝胶，其可包含各种长度和化学组成的聚合物链，其可来源于单体、寡聚体、嵌段聚合物单元，其通过化学键(共价键、氢键和离子/络合/金属键)互相连接(交联)。

如本文使用的，词语“胶凝剂”描述了可添加至液体中的化合物，其中在其添加至液体中时，得到的组合物变成凝胶。

在本发明的一些实施方案中，凝胶是触变凝胶。

如本文使用的，术语“触变的”和“触变性”描述了凝胶的一种性质，其中当扰乱时(例如，搅拌，例如通过搅动，通过顺流)凝胶变成流体，和在扰乱停止后回到半固体状态。

在一些实施方案中，凝胶当能够粘附至垂直表面而不向下流动时被认为是半固体。

在一些实施方案中，胶凝剂在其意欲胶化的液体介质中是部分可溶的，或部分不可混溶的，因此如该术语在下文定义的，在施加应力/热/搅拌/超声处理时，或在允许环境温度在一定时间(例如数分钟)内起作用的一些情况下，将液体介质转化为胶体混合物(混悬液或乳液)或胶质分散体。胶凝剂可形成网络样结构，赋予得到的溶液半固体的稠度，同时仍基本上由液体构成。

胶体或胶质的分散体是一类具有两个单独相的均质的混合物：分散相和连续相。在胶体中，分散相由均匀分散在整个连续相中的微滴组成。胶质的分散体，其看似溶液，亦称为胶质的气溶胶、胶质的乳液、胶质的泡沫、胶质的分散体或水溶胶。许多熟悉的物质，包括黄油、乳、乳酪、气溶胶(雾、烟雾、烟)、沥青、墨水、涂料、胶水和海水泡沫，在本质上是胶体。水状胶体是本领域用于描述与水形成凝胶的物质的常见术语。

本文应注意，每种胶凝剂具有一组特征性的胶凝性质，例如凝结时间、凝结收缩、凝胶条件(温度、离子强度、离子类型和pH)、最终凝胶的物理机械性质(例如弹性、脆性和粘结性)、溶胶至凝胶转变的可逆性(例如热-可逆性)和其它化学和机械性质。还应注意，包含超过一种胶凝剂的组合物通常具有独特的特征性胶凝性质，其不同于组合物中每种单独的胶凝剂或其它组合物的特征性胶凝性质。

根据特定的实施方案，胶凝剂是琼脂糖，例如低熔解琼脂糖，其具有低于65 °C的熔解温度。

因此，在其它凝胶中，半固体基质可以受控方式分解以释放其内容物。本文考虑了这样的转变可通过化学物、酶、热、光、辐射和其它刺激物引起。

因此，包含DNA的半固体生物样品然后与对DNA的预定义位点具有结合亲和力和选择性的辅助结构域定向的核酸酶孵育。

然而，如果DNA包含在细胞中，半固体块首先在合适的蛋白酶和去垢剂的存在下孵育以裂解半固体生物样品中的细胞，然后在核酸酶的存在下将DNA片段化。

通常，半固体块在裂解缓冲液的存在下孵育，裂解缓冲液为一种用于裂解细胞以在分子生物学实验中使用的目的的缓冲溶液。在该特定情况下维持细胞器的结构不是重要的，因此条件可以是严格的，其不维持内部结构。大多数裂解缓冲液包含盐(例如Tris-HCl或EDTA)以调节裂解物的酸度和摩尔渗透压浓度，同时加入去垢剂(例如Triton X-100或SDS)以破坏膜结构。

因为DNA是非常稳定的分子，用于细胞裂解的条件可以是非常极端的。

用于细胞裂解的具体条件在随后的实施例部分中提供。根据特定的实施方案，在细胞裂解后，半固体样品被洗涤以除去细胞组分。

一旦细胞被裂解，半固体生物样品(本文亦称为“块(plug)”)在对DNA的预定义位点具有结合亲和力和选择性的辅助结构域定向的核酸酶的存在下孵育，以得到目的DNA片段。核酸酶可以用辅助结构域预装配，或二者可单独加入反应溶液。

如本文使用的，术语“核酸酶"是指任何多肽，或包含多肽的复合物，其可产生DNA、例如基因组DNA中的链断裂。辅助结构域-定向的核酸酶是位点特异性的，其由辅助亚单位(在本文中与结构域可互换使用)，例如寡核苷酸(寡核苷酸-定向的)赋予。辅助结构域通常不与核酸酶共价结合。

应注意，核酸酶和辅助结构域的组合提供在靶位点处切割所需的亲和力和选择性。辅助结构域在靶位点处结合DNA，其通常与目的核酸序列相邻数个碱基(例如，1或更多个，例如1-100个碱基)，因此不影响其完整性。

可根据本发明的教导使用的实例性的核酸酶包括限制性酶(例如，II型限制性内切核酸酶)、拓扑异构酶[例如，DNA旋转酶、真核生物拓扑异构酶II (topo II)和细菌拓扑异构酶IV (topo IV)]、重组酶(例如，Cre重组酶、Hin重组酶)、整合酶、DNA酶、内切-外切核酸酶(例如，微球菌核酸酶)和归巢内切核酸酶。

根据一个实施方案，使用的核酸酶可包含非特异性DNA切割结构域。

根据本发明的一个实施方案，核酸酶包含寡核苷酸-依赖性核酸酶，例如Cas或RISC。

RISC酶在Martinez J, Tuschl T. RISC is a 5’ phosphomonoester-producingRNA endonuclease. Genes Dev. 2004;18:975–980中教导。

术语“Cas9”、"Cas9酶"和"Cas9-gRNA复合物"是指包含Cas9蛋白和指导RNA(gRNA)的复合物。在该情况下，辅助结构域是指导RNA，其可包含两个分子，即杂交至靶标和提供序列特异性的一个RNA ("crRNA")，和能够杂交至crRNA的一个RNA，"tracrRNA"。或者，指导RNA可以是单个分子(即，sgRNA)，其包含crRNA和tracrRNA序列。Cas9蛋白可以与野生型Cas9蛋白、例如酿脓链球菌Cas9蛋白具有至少60%同一性(例如，至少70%、至少80%或90%同一性、至少95%同一性或至少98%同一性或至少99%同一性)。Cas9蛋白可具有野生型Cas 9蛋白的所有功能，或仅一种或一些功能，包括核酸酶活性。

根据一个实施方案，Cas9或RISC连接至单一指导RNA (sgRNA)，以序列特异性方式切割基因组DNA。

如本文使用的，“单一指导RNA”或“sgRNA”是指嵌合RNA分子，其包含成簇规律间隔短回文重复(CRISPR) RNA (crRNA)和反式-编码CRISPR RNA (tracrRNA)。crRNA定义了Cas9蛋白的位点特异性靶向。序列通常是19-22个核苷酸长，例如与靶标互补的20个连续核苷酸，和通常位于sgRNA分子的5’端。crRNA可与靶序列具有100%互补性，尽管根据本发明的教导也考虑与靶序列至少80%、85%、90%和95%的总体同源性。

tracrRNA是100-300个核苷酸长并且提供核酸酶，例如Cas9蛋白的结合位点，形成CRISPR/Cas9复合物。

根据特定的实施方案，提供多个寡核苷酸，例如sgRNA (与不同的靶核酸序列互补的DNA)，并且核酸酶例如Cas9酶以位点特异性方式切割不同的靶核酸序列，以产生至少一个目的DNA片段。

因此，本发明的寡核苷酸-定向的核酸酶包含至少一种核酸酶(例如Cas9或RISC)和至少一个RNA结合结构域(例如sgRNA)。本发明的CRISPR/Cas蛋白可包含核酸酶结构域、DNA结合结构域、解旋酶结构域、RNA酶结构域、蛋白-蛋白相互作用结构域和/或二聚化结构域。

根据一个实施方案，CRISPR/Cas蛋白可以是野生型CRISPR/Cas蛋白、修饰的CRISPR/Cas蛋白或野生型或修饰的CRISPR/Cas蛋白的片段。此外，CRISPR/Cas蛋白可经修饰以增加核酸结合亲和力和/或特异性，或改变蛋白的酶活性。例如，CRISPR/Cas蛋白的核酸酶(即，Cas9)结构域可被修饰。

可根据本发明的教导使用的合适的Cas蛋白的非限制性实例包括Cas3、Cas4、Cas5、Cas5e (或CasD)、Cas6、Cas6e、Cas6f、Cas7、Cas8a1、Cas8a2、Cas8b、Cas8c、Cas9、Cas10、Casl Od、CasF、CasG、CasH、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1 (或CasA)、Cse2 (或CasB)、Cse3(或CasE)、Cse4 (或CasC)、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3,Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csz1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4和Cu1966。

根据特定的实施方案，Cas核酸酶是Cas9。Cas9是导向邻近前间区序列邻近基序(PAM)的DNA靶序列的单体的DNA核酸酶。Cas9蛋白包含与RuvC和HNH核酸酶同源的两个核酸酶结构域。HNH核酸酶结构域切割互补DNA链，而RuvC-样结构域切割非互补链，并且作为结果，平端切割被引入靶DNA。

在一些实施方案中，CRISPR/Cas系统包含野生型Cas9蛋白或其片段。

在其它实施方案中，CRISPR/Cas系统包含修饰的Cas9蛋白。例如，Cas9蛋白的氨基酸序列可经修饰以改变蛋白的一种或多种性质(例如，核酸酶活性、亲和力、稳定性等)。或者，未参与RNA-指导的切割的Cas9蛋白的结构域可从蛋白消除，以致修饰的Cas9蛋白小于野生型Cas9蛋白。

根据一个实施方案，Cas9蛋白可经修饰以缺少至少一个功能性核酸酶结构域。根据一个实施方案，Cas9蛋白可经修饰以缺少所有核酸酶活性。根据另一个实施方案，CRISPR/Cas系统与各种效应子结构域、例如DNA切割结构域融合。DNA切割结构域可获自任何内切核酸酶或外切核酸酶。DNA切割结构域可源自的内切核酸酶的非限制性实例包括但不限于限制性内切核酸酶和归巢内切核酸酶(参见例如，New England Biolabs Catalog或Belfort等(1997) Nucleic Acids Res.)。在实例性的实施方案中，CRISPR/Cas系统的切割结构域是Fokl内切核酸酶结构域或修饰的Fokl内切核酸酶结构域。

设计CRISPR/Cas的各种方法是本领域已知的，和可根据本发明的教导实现。涉及CRISPR/Cas的其它细节可见于PCT公开号WO 2014089290，其通过引用以其整体结合到本文中。

根据另一个实施方案，寡核苷酸-定向的核酸酶是大范围核酸酶(meganuclease)。

如本文使用的，术语"大范围核酸酶"是指具有大的寡核苷酸识别位点，例如至少12个碱基对(bp)或12 bp-40 bp的DNA序列的双链内切核酸酶。大范围核酸酶也可称为罕见切割或极罕见切割内切核酸酶。本发明的大范围核酸酶可以是单体的或二聚体的。大范围核酸酶可包括任何天然的大范围核酸酶，例如归巢内切核酸酶，但也可以包括赋予高特异性的任何人工或人造的大范围核酸酶，其源自I类内含子和内蛋白的归巢内切核酸酶，或其它蛋白例如锌指蛋白或II类内含子蛋白，或化合物例如与化学化合物融合的核酸。

本发明的人工大范围核酸酶包括但不限于，定制的大范围核酸酶，其是源自任何初始大范围核酸酶(天然或非天然的)的大范围核酸酶，提供不同于初始大范围核酸酶的位点的识别和切割位点，即，定制的大范围核酸酶以天然大范围核酸酶的至少10倍、至少50倍或至少100倍的效率切割新的位点。

定制的大范围核酸酶可通过本领域已知的任何方法产生，例如通过制备大范围核酸酶变体文库和通过选择和/或筛选分离能够切割靶向的DNA序列的变体。多样性可通过本领域技术人员已知的任何方法引入大范围核酸酶，例如，多样性可通过定向诱变(即盒诱变、寡核苷酸定向密码子诱变、定向随机诱变)，通过随机诱变(即，增变株，Neurosporacrassa系统(美国专利号6,232,112; WO 01/70946，易错PCR)，通过DNA改组，通过定向突变或这些技术的组合引入(参见Current Protocols in Molecular Biology, 第8章"Mutagenesis in cloned DNA", Ausubel等编辑, John Wiley and Sons)。多样性可在接触DNA靶标或与DNA靶标相互作用(直接或间接)的残基的位置引入，或可特别地在相互作用氨基酸的位置引入。在通过定向诱变产生的文库中，20个氨基酸可在选择的可变位置处引入。根据一个实施方案，在可变位置处存在的氨基酸是众所周知通常参与蛋白-DNA相互作用的氨基酸。更特别地，这些氨基酸通常是亲水的氨基酸，例如包含D、E、H、K、N、Q、R、S、T、Y。也可使用合成的或修饰的氨基酸。

定制的大范围核酸酶可源自任何初始大范围核酸酶。

根据一个实施方案，初始大范围核酸酶经选择，使得其天然识别和切割位点最接近靶向的DNA位点。根据一个实施方案，初始大范围核酸酶是归巢内切核酸酶。根据充分保守的氨基酸基序，归巢内切核酸酶分为4个单独的家族，即LAGLIDADG家族、GIY-YIG家族、His-Cys盒家族和HNH家族(Chevalier等, 2001, N.A.R, 29, 3757-3774)。根据一个实施方案，归巢内切核酸酶是I-Dmo I、PI-Sce I、I-SceI、PI-Pfu I、I-Cre I、I-Ppo I或杂合归巢内切核酸酶I-Dmo I/I-Cre I，称为E-Dre I (如Chevalier等, 2001, Nat StructBiol, 8, 312-316中所教导)。

涉及大范围核酸酶的其它细节，见于美国专利号8,697,395，其通过引用结合到本文中。

根据本发明的另一个实施方案，核酸酶包含嵌合核酸酶。

如本文使用的，词语“嵌合核酸酶"是指合成的嵌合多肽，其形成单一的开放阅读框(ORF)和以序列特异性方法介导DNA切割。

根据特定的实施方案，本发明的该方面的嵌合核酸酶包含用于核酸结合(例如DNA结合)和用于核酸切割(例如DNA切割)的单独的结构域，使得切割是序列特异性的。

如本文使用的，词语"序列特异性的"是指引入核酸切割(例如DNA切割)的独特染色体位置。

如本文使用的，词语"核酸结合结构域"是指天然或合成的氨基酸序列，例如蛋白基序的氨基酸序列，其以序列特异性方式结合双链或单链DNA或RNA (即靶位点)。

为了诱导有效基因靶向，本发明的核酸(例如DNA)结合结构域需要偶联至DNA切割结构域(例如核酸酶)，以允许在靶序列的可用附近内的DNA切割。可用附近是仍促进序列靶向的任何距离。任选地，DNA结合结构域重叠靶序列或可在靶序列内结合。

根据一个实施方案，嵌合核酸酶诱导在靶位点中单链或双链切割。

在产生嵌合核酸酶中，可使用以足够特异性识别所需靶序列(例如DNA结合序列)的任何DNA或RNA结合结构域。各种这样的DNA和RNA结合结构域是本领域已知的。

DNA结合结构域的实例包括但不限于，大范围核酸酶结合结构域、螺旋-转角-螺旋(pfam 01381)结合结构域、亮氨酸拉链(ZIP)结合结构域、有翼螺旋(WH)结合结构域、有翼螺旋转角螺旋结构域(wHTH)结合结构域、螺旋-环-螺旋结合结构域、转录激活子-样(TAL)结合结构域、重组酶和锌指结合结构域。

在本发明的实例性实施方案中，DNA结合结构域是锌指结合结构域。

因此，根据该方面的一个实施方案，嵌合核酸酶是包含特定的锌指结合结构域(例如，pfam00096)和DNA切割结构域，例如FokI限制性酶的DNA切割结构域(本文亦称为FokI切割结构域)的嵌合蛋白，在本文称为锌指核酸酶(ZFN)。

锌指结构域是30个氨基酸长和由识别螺旋和2-链β-片组成。该结构域还包含4个规则分隔的锌配体(组氨酸或半胱氨酸)。Zn离子稳定该结构域的3D结构。每个指包含一个Zn离子和识别特定的DNA碱基对三联体。

锌指结构域可经改造以结合预确定的核苷酸序列。每个单独的锌指(例如Cys2/His2)主要接触模块方式的三个连续的DNA碱基对[Pavletich等, Science (1991) 252:809-817; Berg等, Science (1996) 271:1081-1085]。通过操纵锌指的数量和直接接触DNA的关键氨基酸残基的性质，可发展和选择具有新的特异性的DNA结合结构域[参见例如，Desjarlais等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89:7345-7349; Rebar等,Science (1994) 263:671-673; Greisman等, Science (1997) 275:657-661; Segal等,Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999) 96:2758-2763]。因此，非常广泛的DNA序列可用作锌指蛋白的特定识别靶标。根据锌指识别，具有数种不同的特异性的嵌合核酸酶之前已经公开[参见例如，Huang等, J. Protein Chem. (1996) 15:481-489; Kim等, Biol. Chem.(1998) 379:489-495]。

用于设计具有锌指结合结构域的嵌合核酸酶的各种方法是本领域已知的。

在一个实施方案中DNA结合结构域包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个锌指结构域，分别结合3、6、9、12、15或18个核苷酸序列。技术人员将理解，识别序列越长，获得的特异性越高。

特定的DNA结合锌指可通过使用多肽展示文库选择。靶标位点与多肽展示文库一起用于亲和选择步骤，以选择结合靶标位点的变体锌指。通常，恒定锌指和随机化的锌指从任何合适的C2H2锌指蛋白，例如SP-1、SP-1C、TFIIIA、GLI、Tramtrack、YY1或ZIF268制成[参见例如，Jacobs, EMBO J. 11:4507 (1992); Desjarlais & Berg, Proc. Natl. Acad.Sci. U.S.A. 90:2256-2260 (1993)]。编码锌指蛋白的变体的多肽展示文库根据本领域已知的方法构建，所述文库包含随机化的锌指(其一个或多个变体将被选择)和取决于选择步骤，一个或多个恒定锌指。任选地，文库包含限制性位点，其经设计以易于除去恒定锌指和在随机化锌指中加入。锌指被随机化，例如通过使用简并寡核苷酸、诱变盒或易错PCR进行。参见例如，美国专利号6,326,166、6,410,248和6479626。

锌指也可通过设计进行选择。设计的锌指蛋白不是天然存在的蛋白，其设计/组成主要自合理的标准产生。用于设计的合理的标准包括应用取代规则和计算机化算法以处理储存现有ZFP设计和结合数据的信息的数据库中的信息。参见例如，美国专利号6,140,081;6,453,242;和6,534,261；亦参见WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536和WO 03/016496。

根据另一个实施方案，嵌合核酸酶是TALENs或小型-TALENs (cTALENs)。

如本文使用的，术语“TALENs”或“转录激活子-样效应子核酸酶”是指通过融合TAL效应子DNA结合结构域至DNA切割结构域产生的人工限制性酶。本发明的TALENs能够导致有效、可程序化和特异性的DNA切割。

将理解，转录激活子-样效应子(TALEs)可经快速改造以实际上结合任何DNA序列。术语TALEN，如本文使用的，是广义的，和包括可切割双链DNA而无需其它TALEN的辅助的单体TALEN。术语TALEN还用于指经改造以一起发挥作用来在同一位点处切割DNA的TALEN对的一个或两个成员。一起发挥作用的TALENs可被称为左-TALEN和右-TALEN。涉及TALENS的其它细节可见于美国专利号8,450,471; 美国专利号8,440,431; 美国专利号8,440,432;和美国专利申请号20140256798，其全部通过引用以其整体结合到本文中。

TALEs是由黄杆菌属(Xanthomonas)细菌分泌的蛋白。TALEs的DNA结合结构域包含高度保守的33-34个氨基酸的序列，除了第12和13个氨基酸之外。这两个位置高度可变[重复可变二残基(RVD)]和显示与特异性核苷酸识别强相关。在氨基酸序列和DNA识别之间的这种简单的关系允许通过选择包含合适的RVD的重复区段的组合来改造特定的DNA结合结构域。

本发明的TALENs通常使用非特异性DNA切割结构域、例如FokI内切核酸酶的非特异性DNA切割结构域来构建。因此，可使用野生型FokI切割结构域，以及具有经设计以改进切割特异性和切割活性的突变的FokI切割结构域变体。FokI结构域作为二聚体起作用，需要具有对靶基因组的位点的独特DNA结合结构域的两个构建体，具有合适的取向和间隔。在TALEN DNA结合结构域和DNA切割结构域(例如FokI切割结构域)之间的氨基酸残基的数量和在两个单独的TALEN结合位点之间的碱基的数量都是实现高水平的活性的参数。在TALENDNA结合结构域和DNA切割结构域(例如FokI切割结构域)之间的氨基酸残基的数量可通过在许多TAL效应子重复序列和核酸酶(例如FokI内切核酸酶结构域)之间引入间隔物而被修改。间隔物序列可以是12-30个核苷酸。

此外，小型TALENs (cTALENs)可根据本发明的教导而使用。这些cTALENs通常用部分特异性的I-TevI催化结构域设计，并且是单体的DNA-切割酶，即作为一半大小的、单多肽小型转录激活子-样效应子核酸酶的TALENs (参见Beurdeley M.等, NatureCommunications (2013) 4: 1762，其通过引用以其整体结合到本文中)。

在TALEN结合结构域的氨基酸序列和DNA识别之间的关系允许可设计的蛋白。在该情况下，可使用软件程序(例如DNAWorks)，其计算适合于在两步PCR中装配的寡核苷酸；寡核苷酸装配后是整个基因扩增。也可使用用于产生改造的TALE构建体的模块装配方案。两种方法提供了系统途径以改造DNA结合结构域，在概念上类似于用于产生锌指DNA识别结构域的模块装配方法(上文所述)。

使由此产生的核酸酶(例如ZFN、TALENs和CRISPR/Cas)和大范围核酸酶有资格用于特异性靶标识别可使用本领域众所周知的方法实现。

所述方法中使用的辅助结构域，例如sgRNAs可经设计，使得它们引导核酸酶结合至DNA的预定义位点，以得到至少一个目的DNA片段。在某些情况下，切割位点可经选择，以释放包含未知序列的区域或含有SNP、核苷酸插入、核苷酸缺失、重排等的区域的片段。因为基因组分离方法，和许多生物体(包括许多细菌、真菌、植物和动物，例如哺乳动物例如人、灵长类动物和啮齿动物，例如小鼠和大鼠)的核苷酸序列是已知的，设计用于本发明的方法的这样的辅助结构域，例如指导RNA应该在本领域技术人员的技能范围内。

根据特定的实施方案，目的DNA片段是10-150 Kb长。根据特定的实施方案，目的DNA片段是20-150 Kb长。根据特定的实施方案，目的DNA片段是30-150 Kb长。根据特定的实施方案，目的DNA片段是40-150 Kb长。根据特定的实施方案，目的DNA片段是50-150 Kb长。根据特定的实施方案，目的DNA片段是60-150 Kb长。根据特定的实施方案，目的DNA片段是70-150 Kb长。根据特定的实施方案，目的DNA片段是80-150 Kb长。根据特定的实施方案，目的DNA片段是90-150 Kb长。根据特定的实施方案，目的DNA片段是100-150 Kb长。根据特定的实施方案，目的DNA片段是50-100 Kb长。根据特定的实施方案，目的DNA片段是60-100 Kb长。根据特定的实施方案，目的DNA片段是70-100 Kb长。根据特定的实施方案，目的DNA片段是80-100 Kb长。根据特定的实施方案，目的DNA片段是80-140 Kb长。根据特定的实施方案，目的DNA片段是80-130 Kb长。

因为本发明的教导可特别用于产生大的DNA片段，它们可甚至用于从基因组DNA分离完整基因簇或操纵子。这些可例如包括完整的聚酮化合物合酶(pks)簇或非核糖体肽合成酶。用于实现片段化的酶反应的条件，一旦DNA被片段化，目的片段可用于许多分子生物学应用的任何一种，其实例在下文提供。

因此，目的DNA片段可被克隆。

引人注意的是，本发明人已发现，目的DNA片段的克隆不必须将其从DNA中分离，尽管这样的分离可仍发生。

如本文使用的，术语“分离”或"分隔"是指从剩余的DNA例如基因组中分离目的DNA片段，以产生分离的产物。术语"分隔"包括富集。

因此，在一些实施方案中，通过所述方法产生的片段可以克隆至载体，例如F粘粒、bac或粘粒载体用于贮存和随后分析。在一些情况下，片段可用Taq聚合酶处理以产生包含3' A突出的片段，其随后通过TA克隆进行克隆。片段(无论它们是否克隆至载体)可经基因分型，例如测序。在一些情况下，片段可扩增，然后克隆和/或分析，其可包括连接衔接子到片段末端上，和使用与连接的衔接子杂交的引物扩增片段。

根据一个实施方案，克隆通过Gibson装配实现。在这样的情况下，在片段化(按上所述)后，半固体生物样品被熔化(通过增加温度)，然后进行酶处理，其消化半固体生物样品的凝胶基质。因此，例如，在基质是琼脂糖(例如，低熔点琼脂糖)时，块经过高温度处理，例如高于45 °C。

利用该反应的高序列特异性，而不需要大小选择和从背景DNA (例如，基因组)凝胶纯化，使用Gibson装配是特别考虑的。该反应的实例性概要在下文提供。首先制备BAC载体，其与靶标DNA共有末端序列重叠(进一步参见下文的方法)。消化的块进一步通过乙醇沉淀进行纯化，和重悬于缓冲液或无核酸酶的水中(参见方法)。回收的DNA和载体在包含T55′-3′外切核酸酶、Taq DNA连接酶和高保真聚合酶的Gibson装配混合物中混合。最后，连接混合物被转化至大肠杆菌感受态细胞。

如所述的，片段化DNA可进一步进行其它高效分子生物学方案。

一些实例在下文中提供。

因此，根据一个实施方案，提供了DNA测序的方法，所述方法包括：

(a) 使DNA片段化以得到至少一个目的DNA片段；

(b) 从DNA分离所述目的DNA片段；和

(c) 测序目的DNA片段。

根据备选的或另外的实施方案，提供了核酸扩增的方法，所述方法包括：

(a) 使DNA片段化以得到至少一个目的DNA片段；

(b) 从DNA分离所述目的DNA片段；和

(c) 扩增目的DNA片段。

根据备选的或另外的实施方案，提供了原位成像DNA的方法，所述方法包括：

(a) 使DNA片段化以得到至少一个目的DNA片段；

(b) 从DNA分离所述目的DNA片段；

(c) 连接标记试剂至目的DNA片段；和

(d) 使目的DNA片段进行适合于检测所述标记试剂的成像方法。

在这些方法的每一种中，分离(分隔)的步骤通常通过凝胶电泳进行。脉冲场凝胶电泳的使用排除了对于熔解半固体生物样品和进一步使其进行消化凝胶基质的酶处理的需要。

脉冲场凝胶电泳(PFGE)是一种通过向凝胶基质施加周期性改变方向的电场，分离大的脱氧核糖核酸(DNA)分子的技术。因此，至少一部分的块(即，片段化后的半固体生物样品)位于PFGE的孔中和进行该程序。

本发明的教导因此可用于分离启动子、终止子、外显子、内含子、完整基因、同源基因、通过功能、表达或序列相关的一组基因序列(例如，操纵子和簇，如上文所述)、包含插入、缺失或易位断点的区域或包含SNP的区域、表观遗传修饰(例如甲基化)。或者，该方法可用于在分析前降低基因组的序列复杂性，或富集目的基因组区。

在某些实施方案中该方法可用于产生目的片段(即，一个或多个基因组区域)，其中得到的样品是至少50%、例如至少80%、至少90%、至少95%、至少99%不含基因组的其它部分。在具体的实施方案中，该方法的产物可在分析前经扩增。在其它实施方案中，该方法的产物可以未改变的形式进行分析，即，不扩增。

如上所述，该方法可用于从基因组分离目的区域。分离的区域可通过任何分析方法进行分析，包括但不限于例如，DNA测序(使用Sanger、焦磷酸测序或Roche/454、Helicos、Illumina/Solexa、ABI (SOLiD)、PacBio和Oxford纳米孔的测序系统)、聚合酶链反应测定、杂交测定、使用与突变互补的探针的杂交测定、微阵列测定、珠阵列测定、引物延伸测定、酶错配切割测定、分支杂交测定、NASBA测定、分子信标测定、循环探针测定、连接酶链反应测定、侵入切割结构测定、ARMS测定或夹心杂交测定。通过该方法产生的一些产物(例如，单链产物)可经测序和分析SNP的存在或相对于参比序列的其它不同。如本领域技术人员将显而易见的，通过允许技术人员将他们的分析聚焦于目的基因组区，提议的方法可用于数个基因分析领域。

如所提及的，本发明的教导还可用于原位成像，藉此在目的DNA片段的分离后，标记试剂与该片段连接和进行适合于检测标记试剂的成像方法。因此，本发明的实施方案涉及标记目的DNA片段和在单分子水平上使标记的DNA分子成像，同时保持高的灵敏性的方法。这样的方法描述于WO2014191981和可特别用于检测表观遗传修饰。

如本文使用的，“标记试剂”是指可检测部分或探针。适合用于这些实施方案背景中的实例性的标记试剂包括但不限于荧光试剂、放射性试剂、磁性试剂、生色团、生物发光试剂、化学发光试剂、磷光试剂和重金属簇，以及任何其它已知的可检测试剂。

在一些实施方案中，标记试剂是通过分光光度测量可检测的，和/或可用于产生光学成像的试剂。这样的试剂包括例如，生色团、荧光试剂、磷光试剂和重金属簇。

如本文使用的，术语“生色团”是指化学部分，其当连接另一分子时，赋予后者颜色，并因此当应用各种分光光度测量时可见。

词语“荧光试剂”是指在暴露于来自外源的辐射期间发射特定波长的光的化合物。

词语“磷光试剂”是指在没有可感知的热或外部激发的情况下(如通过磷的缓慢氧化)发射光的化合物。

重金属簇可以是例如金原子簇，用于例如在电子显微镜技术(例如AFM)中标记。

术语"生物发光试剂"描述了通过生物化学过程发射光的物质。

术语"化学发光试剂"描述了由于化学反应而发射光的物质。

根据本发明的一些实施方案，标记试剂是荧光标记试剂。

荧光试剂可以是蛋白、量子点或小分子。常见的染料家族包括但不限于呫吨衍生物：荧光素、罗丹明、俄勒冈绿、伊红、德克萨斯红等；花青衍生物：花青、靛炭花青(indocarbocyanine)、噁炭花青(oxacarbocyanine)、噻炭花青(thiacarbocyanine)和部花青；萘衍生物(丹酰和prodan衍生物)；香豆素衍生物；噁二唑衍生物：吡啶基噁唑、硝基苯并噁二唑和苯并噁二唑；芘衍生物：瀑布蓝等；BODIPY (Invitrogen)；噁嗪衍生物：尼罗河红、尼罗河蓝、甲酚紫、噁嗪170等；吖啶衍生物：原黄素、吖啶橙、吖啶黄等；芳基次甲基衍生物：金胺、结晶紫、孔雀绿；CF染料(Biotium)；Alexa Fluor (Invitrogen)；Atto和Tracy(Sigma Aldrich)；FluoProbes (Interchim)；四吡咯衍生物：卟吩、酞花青、胆红素；瀑布黄；天蓝B；吖啶橙；DAPI；Hoechst 33258；萤光黄；吡罗昔康; 奎宁和蒽醌；squarylium；寡聚次苯基等。

其它荧光团包括：羟基香豆素；氨基香豆素；甲氧基香豆素；瀑布蓝；太平洋蓝；太平洋橙；萤光黄；NBD；R-藻红蛋白(PE)；PE-Cy5缀合物；PE-Cy7缀合物；Red 613；PerCP；TruRed；FluorX；荧光素；BODIPY-FL；TRITC；X-罗丹明；丽丝胺罗丹明B；德克萨斯红；Aliaphycocyanin；APC-Cy7缀合物。

Alexa Fluor染料(Molecular Probes)包括：Alexa Fluor 350, Alexa Fluor405, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 500, Alexa Fluor 514,Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 555, Alexa Fluor 568, AlexaFluor 594, Alexa Fluor 610, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor660, Alexa Fluor 680, Alexa Fluor 700, Alexa Fluor 750和Alexa Fluor 790。

Cy染料(GE Healthcare)包括Cy2, Cy3, Cy3B, Cy3.5, Cy5, Cy5.5和Cy7。

核酸探针包括Hoechst 33342、DAPI、Hoechst 33258、SYTOX蓝、色霉素A3、光神霉素、YOY0-1、溴化乙锭、吖啶橙、SYTOX绿、TOT0-1、TO-PR0-1、TO-PRO、花青单体、噻唑橙、碘化丙锭(PI)、LDS 751、7-AAD、SYTOX橙、TOT0-3、TO-PR0-3和DRAQ5。

在一些实施方案中，各标记试剂(例如，荧光团)通过点击化学与DNA分子连接，但连接标记试剂的其它方法也被考虑，并且是本领域技术人员众所周知的。

本发明的组合物可在试剂盒中包装，其可伴随有合适的使用说明书。

因此，根据本发明的一些实施方案，提供了用于DNA片段化的试剂盒，所述试剂盒包含：

(i) 包含辅助结构域-定向的核酸酶的第一容器；

(ii) 包含低熔解凝胶基质的第二容器；和任选地

(iii) 包含细胞裂解缓冲液的第三容器。

根据特定的实施方案，辅助结构域例如gRNA不是试剂盒的一部分，因为这是序列特异性的。

根据任选的实施方案，试剂盒包含另外的容器，其包含用于Gibson装配的外切核酸酶。

根据任选的实施方案，试剂盒包含另外的容器，其包含聚合酶。

根据任选的实施方案，试剂盒包含另外的容器，其包含标记试剂。

预期从本申请成熟的专利期期间，许多相关的寡核苷酸-定向的核酸酶将被开发，和术语“寡核苷酸-定向的核酸酶”的范围意欲包括所有先验的这样的新技术。

如本文使用的，术语“约”是指± 10 %。

术语"包含"、"包括"、"含有"、"含"、“具有”和它们的变化意指"包括但不限于"。

术语“由……组成”意指“包括和限于”。

术语"基本上由……组成"意指组合物、方法或结构可包括另外的成分、步骤和/或部件，但仅在所述另外的成分、步骤和/或部件本质上不改变要求保护的组合物、方法或结构的基本和新的特征的情况下。

如本文使用的，单数形式"一个"、"一种"和"所述"包括复数指代物，除非上下文清楚另外指明。例如，术语"化合物"或"至少一种化合物"可包括多种化合物，包括其混合物。

在本申请全文中，本发明的各种实施方案可以范围形式提供。应理解，范围形式的描述仅是为了方便和简明，不应解释为对本发明的范围的僵硬限制。因此，范围的描述应视为已明确公开了所有可能的子范围以及该范围内的单个数值。例如，范围的描述例如1-6应视为已明确公开了子范围例如1-3、1-4、1-5、2-4、2-6、3-6等以及该范围内的单个数值，例如1、2、3、4、5和6。不管范围宽度如何这都适用。

在本文指明数字范围时，其意图包括在指定范围内的任何引用的数字(分数或整数)。词语在第一指示数字和第二指示数字之间的“范围”和“从”第一指示数字“至”第二指示数字的“范围”在本文中可互换使用，意图包括第一和第二指示数字和其之间的所有分数和整数数字。

如本文使用的，术语"方法"是指用于实现给定任务的方式、手段、技术和程序，包括但不限于，由化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的从业者已知或从已知的方式、手段、技术和程序容易开发的那些方式、手段、技术和程序。

如本文使用的，术语“治疗”包括废除、显著抑制、减慢或逆转病况的进展，显著改善病况的临床或美学症状，或显著预防病况的临床或美学症状的出现。

当提及具体的序列表时，这样的提及应理解为还包括基本对应于其互补序列的序列，如包括微小序列变化，其自例如测序误差、克隆误差或导致碱基取代、碱基缺失或碱基添加的其它改变产生，条件是这样的变化的频率小于1/50个核苷酸，或者小于1/100个核苷酸，或者小于1/200个核苷酸，或者小于1/500个核苷酸，或者小于1/1000个核苷酸，或者小于1/5,000个核苷酸，或者小于1/10,000个核苷酸。

应理解，本发明的某些特征，为清楚起见其在单独的实施方案中进行描述，也可在单一实施方案中组合提供。相反地，本发明的各种特征，为简明起见在单一实施方案中进行描述，也可单独或以任何合适的子组合或按合适在本发明的任何其它描述的实施方案中提供。各种实施方案背景中描述的某些特征不被视为这些实施方案的必需特征，除非实施方案在没有这些要素时不可实行。

上文描述和下文权利要求部分中要求的本发明的各种实施方案和方面在以下实施例中找到实验支持。

实施例

现在参照以下实施例，其与上文的描述一起，以非限制性方式说明本发明。

一般而言，本文使用的命名法和本发明使用的实验室程序包括分子、生物化学、微生物学和重组DNA技术。这样的技术在文献中充分说明。参见例如, "Molecular Cloning:A laboratory Manual" Sambrook等, (1989); "Current Protocols in MolecularBiology" Volumes I-III Ausubel, R. M.编辑(1994); Ausubel等, "CurrentProtocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland(1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons,New York (1988); Watson等, "Recombinant DNA", Scientific American Books, NewYork; Birren等(编辑) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); 美国专利号4,666,828;4,683,202; 4,801,531; 5,192,659和5,272,057中描述的方法; "Cell Biology: ALaboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E.编辑(1994); "CurrentProtocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E.编辑(1994); Stites等 (编辑), "Basic and Clinical Immunology" (第8版), Appleton & Lange, Norwalk, CT(1994); Mishell和Shiigi (编辑), "Selected Methods in Cellular Immunology", W.H. Freeman and Co., New York (1980); 可用的免疫测定法广泛描述于专利和科学文献中，参见例如美国专利号3,791,932; 3,839,153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987;3,867,517; 3,879,262; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074;4,098,876; 4,879,219; 5,011,771和5,281,521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait,M. J.编辑(1984); “Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D.和Higgins S. J.编辑(1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D.和Higgins S. J.编辑(1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I.编辑(1986); "Immobilized Cellsand Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning"Perbal, B., (1984)和"Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCRProtocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego,CA (1990); Marshak等, "Strategies for Protein Purification andCharacterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996)；其全部通过引用并入，如同在本文中充分阐明一样。其它一般性参考资料在本文件的全文中提供。认为本文的程序是本领域众所周知的，和为读者方便而提供。其中包含的所有信息通过引用并入本文。

材料和方法

Cas9制备– 编码酿脓链球菌Cas9接着His₆-标签的基于pET的表达载体(SI)由ZhenXie教授(Tsinghua, Beijing)提供。蛋白主要按之前在Jinek等, Science 17 August2012: Vol. 337 no. 6096 pp. 816-821中所述纯化，不同之处在于(1) 在Ni-NTA柱洗脱缓冲液中不加入甘油，(2) His-标签不从蛋白切割，(3) 蛋白仅在Mono S柱(GEHealthcare)上通过色谱纯化，(4) 因为蛋白级分足够纯，省略了凝胶过滤步骤。最终，蛋白被浓缩至约0.1mg/ml和在-20℃下贮存在20mM HEPES, 150mM KCl, 1mM DTT, 50%甘油pH7.5中。T7 RNA聚合酶蛋白表达质粒由Yan Nieng教授(Tsinghua, Beijing)提供，和按之前所述纯化[Zawadzki, V. & Gross, H. J. Rapid and Simple Purification of T7 Rna-Polymerase. Nucleic Acids Res19, 1948-1948, (1991)]。

体外转录(IVT)在包含100mM Tris-HCl, pH8.0, 10mM MgCl₂, 30mM DTT, 2mM亚精胺, 2.5mM每种rNTP, 100ng/ul PCR产物, 10% DMSO, 50ug/ml T7 RNA聚合酶的缓冲液中进行和在37℃下孵育2小时。

sgRNA制备 - sgRNA IVT模板通过3种引物的重叠PCR制备：包含T7启动子和靶序列的引物(X-sgRNA-P)，和2种包含sgRNA的crRNA-tracrRNA嵌合序列的其它引物(sgRNA-F和sgRNA-R)。此研究中使用的所有引物列于表1。PCR产物通过苯酚(pH >7.8)/氯仿提取和异丙醇沉淀进行纯化，接着重悬于无RNA酶的水中。IVT在37℃下在100 mM Tris-HCl, pH8.0, 10 mM MgCl₂, 30 mM DTT, 2 mM亚精胺, 2.5 mM (每种) rNTP, 10% DMSO, 100ng/µl PCR产物和50 µg/ml T7 RNA聚合酶中进行2 h。孵育后，IVT产物通过苯酚(pH <5.2)/氯仿提取和异丙醇沉淀纯化。最后，将sgRNA以300 ng/µl的浓度重悬于无RNA酶的水中和在-80℃下贮存。

细胞裂解–将大肠杆菌或枯草芽孢杆菌细胞以5×10⁸个细胞/ml (~2.5 ug/mlDNA)包埋在琼脂糖凝胶块中。这些块通过溶菌酶，蛋白酶K (溶菌酶的终浓度是0.25 mg/ml，和蛋白酶K是0.1mg/ml)处理，和根据CHEF Bacterial Genomic DNA Plug Kit (Bio-Rad)的说明书通过缓冲液连续洗涤。在第二次洗涤时，加入1 mM的PMSF以灭活残留的蛋白酶K，和0.1×洗涤缓冲液用于最后一次洗涤。收获链霉菌菌丝体和用于制备凝胶块，如Kieser等²⁶所述。充分洗涤的块可在4℃下在1×洗涤缓冲液中贮存2个月，和应使用0.1×洗涤缓冲液进行另一轮洗涤，然后紧接进行Cas9消化。

对于裂解反应，2块(200ul)首先在室温下在1 ml包含20 mM HEPES, 150 mM KCl,10 mM MgCl₂, 0.5 mM DTT和0.1 mM EDTA pH 7.5的无RNA酶的裂解缓冲液中平衡30分钟，然后转移至一批新的包含Cas9蛋白(0.1 mg/ml)和对应的sgRNA对(各自30 ng/µl)的裂解缓冲液(至少240 ul)中并且在37℃下孵育2 h。反应后，用0.1×洗涤缓冲液洗涤块，和切出1/3的凝胶块，用于通过PFGE评价切割效率。PFGE用1%琼脂糖凝胶在0.5× TBE中使用CHEFMapper XA系统(Bio-Rad)进行，其设定为自动算法程序，具有5 kb-250 kb参数(6V/cm，0.22 s-21.79 s，15 h 16 min, 120°)和在14℃下循环。PFGE后，凝胶用SYBR Gold (LifeTechnologies)染色，和DNA条带使用ChemiDoc XRS+成像系统(Bio-Rad)可视化。将剩余的块(5/3，来自总共2个起始块)熔化，和根据GELase Agarose Gel-Digesting PreparationKit (Epicentre)的说明书通过琼脂水解酶消化。消化的DNA通过乙醇沉淀，和用大孔管尖轻轻重悬于20 µl无DNA酶的水中。得到的DNA可在4℃下贮存数天，但直接连接是优选的。

Gibson装配 - 载体使用pCC1BAC (Epicentre)或p15A载体作为模板通过PCR扩增，接着DpnI (NEB)处理²⁷制备。各PCR引物由退火至载体模板的约20 nt序列和与靶DNA的一个末端重叠的约30 nt突出组成。Gibson装配混合物按一步等温DNA装配方案⁹所述制备。体积1 µl载体(约50 ng)和4 µl的之前制备的表现出粘性的靶DNA通过轻轻吸取添加至15µl的Gibson装配混合物，和在50℃下孵育1 h。连接后，2 µl的混合物以1,300 V使用ECM399电穿孔系统(BTX)转化至在1-mm比色皿(BTX)中的50 µl TransforMax EPI300(Epicentre)电感受态大肠杆菌细胞。细胞在37℃下在1 ml不含抗生素的LB培养基中恢复2h，然后铺板到包含12.5 µg/ml氯霉素、IPTG和X-gal的LB培养基上。在37℃下孵育12 h后，蓝色菌落经选择用于在相对于lacZ基因的两个接合位点之一处PCR (一个引物对于pCC1BAC (BAC-vF)和另一个引物对于插入物(lacZ-X kb-vR))。阳性克隆在5 ml包含12.5µg/ml氯霉素l和3 µl CopyControl BAC Autoinduction Solution (Epicentre)的LB培养基中在37℃下生长过夜。使用QIAprep Miniprep试剂盒，使用QIAcube系统(Qiagen)，根据制造商的说明书，从这些细胞提取质粒。纯化的质粒通过λ-末端酶(Epicentre)线性化和按上所述通过PFGE分析。为从枯草芽孢杆菌克隆pks基因簇，不添加IPTG或X-gal至LB培养基，和所有菌落在两个接合位点处经PCR验证(图1)。来自委内瑞拉链霉菌的jad基因簇和来自金霉素链霉菌的ctc基因簇使用类似的方法被克隆至p15A载体，不同之处在于菌落在含50µg/ml氨苄西林的LB培养基上生长和质粒通过XbaI线性化。

表1 - PCR引物

对于酵母测定法(图4B显示)：

酵母-sgR1-P:

5′-TAATACGACTCACTATAgggtctggaatggtacagttGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAA (SEQ IDNO: 42)

酵母-sgR2-P:

5′-TAATACGACTCACTATAgaaagccaataaaagtaagaGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAA (SEQ IDNO: 43)

酵母-sgR3-P:

5′-TAATACGACTCACTATAgaccaagctaaacaattattGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAA (SEQ IDNO: 44)

在图4B中从左至右，sgR1、2和3分别对应于3个泳道。

结果

在本发明的通过染色体区段的CRISPR-Cas9-辅助靶向(CATCH)的克隆方法中(图1)，在细胞裂解后在琼脂糖凝胶中细菌染色体通过RNA-指导的Cas9在指定的靶位点处消化。克隆载体经设计，使得它们与靶DNA在两个末端共有末端序列重叠(30 bp)，和在Gibson装配混合物中通过序列互补性连接至靶DNA⁷。重组质粒然后电转化至克隆宿主。该程序在1-2天内需要约8 h的工作台时间以使用标准设备和以低成本完成，这有力地简化和加速克隆大的细菌基因组序列的工作。

具体地，为了测试在琼脂糖凝胶中Cas9的核酸酶活性和其分离长的DNA序列的有效性，5个单一-指导RNA (sgRNA)对经设计以靶向大肠杆菌基因组的不同长度的片段(分别50、75、100、150和200 kb；见方法)，全部包含lacZ基因(图2A)。在包埋至低熔解温度琼脂糖凝胶块后，细菌细胞用溶菌酶和蛋白酶K处理，和用缓冲液连续洗涤以除去细胞组分，留下基因组DNA。完整的染色体被琼脂糖基质保护，允许以最小机械剪切进一步操作。将块浸泡在包含预装配的Cas9与相应的sgRNA对的反应缓冲液中并且在37℃孵育2 h，以允许在琼脂糖凝胶中充分的酶扩散和基因组DNA的消化。消化后，自块切下1/3用于脉冲场凝胶电泳(PFGE)以评价切割效率(图2B)。在5个泳道的每一个中观察到预期长度的明显条带，而对照泳道显示没有条带或严重拖尾，表明在琼脂糖凝胶中RNA-指导的Cas9的足够的切割特异性和效率。

从细菌染色体成功切割长的目的基因组序列后，利用Gibson装配的高的序列特异性，不需要在PFGE上大小选择和从背景基因组DNA凝胶纯化，将靶DNA在Gibson装配混合物⁷中连接至BAC载体。首先制备BAC载体，其与靶DNA共有30 bp末端序列重叠(参见方法)。剩余的Cas9-消化的块(5/3，来自总共2个起始块)经合并，熔化和通过琼脂水解酶消化，之后通过乙醇沉淀纯化DNA内容物和重悬于无核酸酶的水中(参见方法)。回收的DNA和载体在包含T5 5′-3′外切核酸酶、Taq DNA连接酶和高保真聚合酶的Gibson装配混合物中混合。最后，连接混合物经电转化至大肠杆菌感受态细胞。根据待克隆的靶DNA的长度，在包含氯霉素、IPTG和X-gal的选择性LB平板上获得50-100个菌落，其中20-65%显示蓝色(图2C)。选择所有蓝色克隆和在相对于lacZ基因的两个接合位点之一处通过PCR验证(参见上述的方法，图4A)。克隆的BAC质粒经纯化，线性化和通过PFGE分析(图2D)。所有蓝色菌落显示阳性克隆，具有正确的插入物大小，范围为50-150 kb。

受来自大肠杆菌的可变长度的基因组序列的成功靶向分离和克隆的鼓舞，尝试从其它细菌基因组克隆大的基因簇。此处，对于克隆78 kb bacillaene-产生的psk基因簇(在枯草芽孢杆菌中最大的基因簇)¹⁶至BAC载体，测试该方法。使用上述相同的方法，在3个试验中总共获得12个阳性菌落，阳性率约12% (图4A和2E)。另外，来自委内瑞拉链霉菌的36 kbjadomycin-产生的jad基因簇¹⁷和来自金霉素链霉菌的32 kb金霉素-产生的ctc基因簇¹⁸被克隆至p15A载体。总体上，约60个阳性菌落在各实验中获得，阳性率约90% (图4A和2F)，表明了CATCH对于克隆各种细菌基因组序列至不同的克隆载体的通用性。图4B显示凝胶内Cas9消化的酿酒酵母染色体I (约230 kb)，通过PFGE分析以评价切割效率和脱靶作用。在各实验中，一次RNA-指导的Cas9切割将染色体分成2个片段(分别为58加172 kb，62加kb和73加157 kb)。预期的片段长度在加样孔的上方示出。E，空泳道。

图3描述了在大肠杆菌中靶向测序的结果。197 kb基因组区被选择和“凝胶内”切割，如上所述。将包含片段化的基因组材料的凝胶块置于琼脂糖板的孔中和在脉冲场凝胶电泳(PFGE)仪器上运行，以在凝胶上分离切割的片段为不同的DNA条带。来自5个泳道的靶标条带(197kb)从PFGE凝胶中切出，和DNA使用GIAquick凝胶提取试剂盒(柱)回收，用15 ul洗脱缓冲液洗脱，和在Qubit仪器上测试浓度。得到的样品包含约0.426 ng/ul的靶DNA。测序文库使用用于文库制备的Truseq试剂盒制备和文库在150x2 miseq运行中作为在泳道中的许多样品之一测序。测序总共产生265386x2读出和约91 MGbx2数据，证实了对于这样的靶标区可实现的极度深的覆盖度。

尽管本发明已结合其具体的实施方案进行了描述，但明显的是，许多替代方案、改变和变化对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，意欲包括所有这样的替代方案、改变和变化，其落入随附权利要求的精神和广泛范围内。

本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请通过引用以其整体并入本说明书，至如同各单独的出版物、专利或专利申请明确和单独指明通过引用并入本文的相同程度。此外，在本申请中任何参考文献的引用或鉴定不应解释为承认这样的参考文献可用作本发明的现有技术。在使用章节标题的方面来说，它们不应解释为必然是限制性的。

参考文献

(其它参考文献在本申请中引用)

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Claims

1.使DNA片段化的方法，所述方法包括用对DNA的预定义位点具有结合亲和力和选择性的辅助结构域-定向的核酸酶孵育包含DNA的半固体生物样品，以得到目的DNA片段，从而使DNA片段化。

2. 克隆的方法，所述方法包括：

(a) 根据权利要求1使DNA片段化，以得到至少一个目的DNA片段；和

(b) 克隆所述目的DNA片段。

3.权利要求2的方法，进一步包括在所述片段化之后和所述克隆之前，熔解所述半固体生物样品。

4. DNA测序的方法，所述方法包括：

(a) 根据权利要求1使DNA片段化，以得到至少一个目的DNA片段；

(b) 从DNA分离所述目的DNA片段；和

(c) 测序所述目的DNA片段。

5.核酸扩增的方法，所述方法包括：

(b) 从DNA分离所述目的DNA片段；和

(c) 扩增所述目的DNA片段。

6.原位成像DNA的方法，所述方法包括：

(b) 从DNA分离所述目的DNA片段；

(c) 连接标记试剂至目的DNA片段；和

(d) 使目的DNA片段进行适合于检测所述标记试剂的成像方法。

7. 权利要求1-6中任一项的方法，其中所述目的DNA片段长度是50-150 kb。

8.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述DNA是基因组DNA。

9.权利要求1-8中任一项的方法，其中所述DNA是人DNA。

10.权利要求8-9中任一项的方法，其中所述DNA是染色体DNA。

11.权利要求1-10中任一项的方法，其中所述目的DNA片段包含基因簇。

12.权利要求1-11中任一项的方法，其中所述半固体生物样品呈凝胶的形式。

13.权利要求1-12中任一项的方法，其中所述半固体生物样品阻止DNA剪切。

14. 权利要求1-13中任一项的方法，其中所述从DNA分离目的DNA片段通过以下至少一项来实现：

(a) 熔解所述半固体生物样品；和

(b) 使所述半固体生物样品进行酶处理，所述酶处理消化所述半固体生物样品的凝胶基质。

15.权利要求1-14中任一项的方法，其中所述从DNA分离目的DNA片段包括脉冲场凝胶电泳。

16.权利要求2和7-15中任一项的方法，其中所述克隆通过Gibson装配实现。

17.权利要求10-16中任一项的方法，进一步包括在所述片段化之前，在所述半固体生物样品中提供包含所述染色体DNA的细胞，和裂解所述细胞。

18.权利要求1-17中任一项的方法，进一步包括在所述片段化之后，评估DNA的片段化效率。

19.权利要求18的方法，其中所述评估片段化效率通过脉冲场凝胶电泳来实现。

20.用于DNA片段化的试剂盒，所述试剂盒包括：

(i) 包含辅助结构域-定向的核酸酶的第一容器；

(ii) 包含低熔解凝胶基质的第二容器；和任选地

(iii) 包含细胞裂解缓冲液的第三容器。

21.用于DNA克隆的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求20的组分，和包含用于Gibson装配的外切核酸酶的另外的容器。

22.用于DNA扩增的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求20的组分，和包含聚合酶的另外的容器。

23.用于DNA原位成像的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求20的组分，和包含标记试剂的另外的容器。

24.权利要求1-23中任一项的方法或试剂盒，其中所述辅助结构域-定向的核酸酶是寡核苷酸-定向的核酸酶。

25.权利要求24的方法或试剂盒，其中所述寡核苷酸-定向的核酸酶选自Cas和RISC。

26.权利要求25的方法，其中所述Cas包含Cas-9。