CN107903256A - 一种含取代噻唑的2,4‑二氨基嘧啶及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种含取代噻唑的2,4‑二氨基嘧啶，该2,4‑二氨基嘧啶的化学结构如下式(Ⅰ)所示，式(Ⅰ)中，R1是氢、氟或甲基，R2为氢，R3是氢、甲基，R4为4‑甲磺酰基苯基、4‑磺酰胺基苯基、4‑甲氧基苯基、3,4,5‑三甲氧基苯基或3‑硝基苯基。本发明所述的含取代噻唑的2,4‑二氨基嘧啶能够抑制细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKs)，特别是CDK2，控制乳腺或结肠肿瘤细胞增殖的效果显著。
Description
技术领域
本发明涉及含氮杂环化合物，具体涉及含取代噻唑的2,4-二氨基嘧啶。该化合物可以抑制细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)。
背景技术
肿瘤是一类渐进性细胞周期调控机制被破坏的疾病，恶性肿瘤的发生、发展均与细胞周期调控功能紊乱有关，因此，调节或阻断细胞周期是治疗肿瘤的重要途径。
近年来，随着对细胞周期调控机制的深入研究，尤其是揭示了细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKs)在细胞周期调控中的核心地位以来，CDKs已经成为当前新型抗癌药物研发的热点领域。目前发现的CDK亚型共有13个(CDK1–13)，不同亚型的CDKs都含有一个约300个氨基酸组成的保守性催化中心。在细胞周期不同时期中，不同cyclins的集聚与相应CDKs结合并被激活。根据经典的细胞周期模型，直接参与细胞周期各时相转换即在细胞周期调控中起重要作用的CDK，包括CDK1、CDK2、CDK4、CDK6等亚型。Cyclin D与CDK4及CDK6结合后在G1期发挥着重要作用；CDK2/cyclin E可以促使细胞从G1期进入S期；cyclin A分别与CDK2及CDK1结合后，可以促使细胞周期完成S期的转换，准备进入M期；而M期的进入和调节则是在CDKl/cyclinB的控制下完成的。其中，CDK2可与周期蛋白E1结合使底物磷酸化，控制G1时期的进行，由于正常细胞通常在G0～G1时期之间休眠，要缓解肿瘤细胞对正常细胞的威胁，在G1阶段抑制肿瘤细胞生长要比在细胞周期的其它阶段的程度大，且对正常细胞的毒副作用较小，因此，近年来，CDK2已经成为基于CDKs抗肿瘤药物设计中最吸引人的一个靶标，同时也已被列为最具前景的肿瘤治疗靶点之一，因而备受关注。
美国专利US2008/0096899A1披露了一种治疗肺癌、胃癌、肝癌、结肠癌、胰腺癌等癌症的Imatinib及其类似物的制备方法。Imatinib(商品名：Gleevec)是最早上市的小分子蛋白激酶抑制剂，用于治疗慢性粒细胞白血病以及胃肠道间质细胞瘤的治疗。虽然刚上市时在肿瘤治疗中取得了令人瞩目的成就，但是随着使用时间的延长及治疗病例的增多，问题逐渐暴露出来。其中一是由耐药性问题而造成药物的肿瘤治疗效果明显下降；二是此类药物的使用面相当局限，必须是其靶激酶高表达或过度激活的病例才能发挥其疗效。因此，为了扩大肿瘤适应症研究范围，进一步提高药物的肿瘤治疗效果，寻找和发现新型的蛋白激酶抑制剂作为抗肿瘤药物，具有非常迫切的意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种含取代噻唑的2,4-二氨基嘧啶，该2,4-二氨基嘧啶控制乳腺或结肠肿瘤细胞增殖的效果显著。
本发明解决上述技术问题的方案如下：
一种含取代噻唑的2,4-二氨基嘧啶，该2,4-二氨基嘧啶的化学结构如下式(Ⅰ)所示，
式(Ⅰ)中，R1是氢、氟、氯、甲基或甲氧基，R2为氢，R3是氢、甲基或氟，R4为4-甲磺酰基苯基、4-磺酰胺基苯基、4-甲氧基苯基、3,4,5-三甲氧基苯基或3-硝基苯基。
本发明所述的含取代噻唑的2,4-二氨基嘧啶优选为下述化合物之一：
N2-(4-甲磺酰基苯基)-N4-(噻唑-2-基)-2,4-二氨基嘧啶，
N2-(4-磺酰胺基苯基)-N4-(噻唑-2-基)-2,4-二氨基嘧啶，
N2-(4-甲氧基苯基)-N4-(噻唑-2-基)-2,4-二氨基嘧啶，
N2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-N4-(噻唑-2-基)-2,4-二氨基嘧啶，
N2-(4-磺酰胺基苯基)-N4-(噻唑-2-基)-5-氟-2,4-二氨基嘧啶，
N2-(3-硝基苯基)-N4-(5-甲基-噻唑-2-基)-5-氟-2,4-二氨基嘧啶，
N2-(4-甲磺酰基苯基)-N4-(噻唑-2-基)-5-氟-2,4-二氨基嘧啶，
N2-(4-甲磺酰基苯基)-N4-(5-甲基-噻唑-2-基)-2,4-二氨基嘧啶，
N2-(4-甲磺酰基苯基)-N4-(5-甲基-噻唑-2-基)-2,4-二氨基嘧啶，
N2-(4-甲磺酰基苯基)-N4-(5-甲基-噻唑-2-基)-5-甲基-2,4-二氨基嘧啶，
N2-(4-磺酰胺基苯基)-N4-(噻唑-2-基)-5-甲基-2,4-二氨基嘧啶。
上述含取代噻唑的2,4-二氨基-5-取代嘧啶的制备方法包括以下步骤：
(1)将化学式II所示的2,4-氨基-5-取代嘧啶和化学式III所示的2-氨基-4,5-二取代噻唑按照反应式(V)反应，制备得化学式IV所示的N4-取代噻唑基-2氯-5-取代嘧啶；
(2)将化学式(IV)所示的N4-取代噻唑基-2氯-5-取代嘧啶和化学式VI所示的取代苯胺按照反应式(VII)反应，制备得到化学式(I)所示的含取代噻唑的2,4-二氨基-5-取代嘧啶
上述反应式(V)和(VII)中，R1是氢、氟、氯、甲基或甲氧基，R2为氢，R3是氢、甲基或氟，R4为4-甲磺酰基苯基、4-磺酰胺基苯基、4-甲氧基苯基、3,4,5-三甲氧基苯基、3-硝基苯基或4-溴苯基、4-氟苯基。
上述的含取代噻唑的2,4-二氨基嘧啶具有抑制CDK2的活性，控制乳腺或结肠肿瘤细胞增殖的效果显著，可用于制备抗肿瘤药物；所述的抗肿瘤药物由权利要求1所述的含取代噻唑的2,4-二氨基嘧啶和医学上可接受的辅料组成。
采用MTT法标准操作程序测定本发明所述的含取代噻唑的2,4-二氨基-5-取代嘧啶的抗肿瘤活性，发现该类化合物具有较好的抗肿瘤活性。采用流式细胞仪技术进一步研究了对结肠癌细胞细胞周期的影响，发现该类化合物能明显的将细胞生长阻滞在G2/M期，并表现出剂量依赖效应。
以下结合附图和具体实施方式对本发明作进一步说明。
附图说明
图1为本发明所述的2,4-二氨基嘧啶对不同细胞浓度肿瘤细胞HCT116周期影响的流式结果图，其中，A图为Control，B图的细胞浓度为0.2μM，C图的细胞浓度为0.4μM，D图的细胞浓度为0.8μM。
具体实施方式
下述实施例1-18所述制备方法的反式均为发明内容中的反应式(V)和(VII)。
实施例1、制备N2-(4-甲磺酰基苯基)-N4-(噻唑-2-基)-2,4-二氨基嘧啶(Ⅰa)
将2.2mmol N4-(噻唑-2基-)-2-氯-嘧啶和2.0mmol 4-甲磺酰基苯胺加入15ml无水乙二醇乙醚中，搅拌，加热至回流，反应30分钟后，加入0.2ml浓盐酸，TLC监测，反应结束后，将反应液倾入100mL水中，用乙酸乙酯(100mL×3)萃取，静置分液，有机相分别用5％的NaHCO3(80mL×3)、饱和食盐水(80mL×3)洗涤，然后用无水硫酸镁干燥，抽滤，减压除去乙酸乙酯得白色固体，将固体用热的甲醇洗涤三次得到白色固体粉末0.305克，mp278.1–279.2℃。
将所得到的白色固体采用核磁共振谱、质谱及元素分析技术进行鉴定，鉴定结果为：1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：3.17(s，3H，CH3)，6.62(d，J＝5.6Hz，1H，ArH)，7.24(d，J＝3.6Hz，1H，ArH)，7.47(d，J＝3.6Hz，1H，ArH)，7.82(dd，J1＝1.8Hz，J2＝7.0Hz，2H，ArH)，8.07(dd，J1＝2.0Hz，J2＝7.2Hz，2H，ArH)，8.25(d，J＝5.6Hz，1H，ArH)，9.75(br，1H，NH)，11.56(br，1H，NH).13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ：44.4，100.7，113.6，114.8，119.2，128.2，132.7，138.3，145.6，157.0，157.9，158.8，159.0.ESI-MS：m/z＝346.6[M+1]-.Anal.Calcd.forC14H13N5O2S2：C 48.40，H 3.77，N 20.16，S 18.46；Found C48.03，H 3.92，N 20.29，S18.57.由上述鉴定结果可知，所得白固体为N2-(4-甲磺酰基苯基)-N4-(噻唑-2-基)-2,4-二氨基嘧啶，其结构式为经计算本例所述方法的产率为44.0％。
实施例2、制备N2-(4-磺酰胺基苯基)-N4-(噻唑-2-基)-2,4-二氨基嘧啶(Ⅰb)
将2.2mmol N4-(噻唑-2-基)-2氯-嘧啶和2.0mmol 4-磺酰胺基苯胺加入15ml无水乙二醇乙醚中，搅拌，加热至回流，反应30分钟后，加入0.2ml浓盐酸，TLC监测，反应结束后，将反应液倾入100mL水中，用乙酸乙酯(100mL×3)萃取，静置分液，有机相分别用5％的NaHCO3(80mL×3)、饱和食盐水(80mL×3)洗涤，然后用无水硫酸镁干燥，抽滤，减压除去乙酸乙酯得白色固体，将固体用热的甲醇洗涤三次得到白色固体粉末0.609克，mp277.2–279.8℃。
将所得到的白色固体采用核磁共振谱、质谱及元素分析技术进行鉴定，鉴定结果为：1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：6.59(d，J＝6.0Hz，1H，ArH)，7.19(br，2H，NH)，7.21(d，J＝3.6Hz，1H，ArH)，7.46(d，J＝3.2Hz，1H，ArH)，7.74(d，J＝8.4Hz，2H，ArH)，7.96(d，J＝8.4Hz，2H，ArH)，8.22(d，J＝5.6Hz，1H，ArH)，9.61(br，1H，NH)，11.53(br，1H，NH).13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ：100.3，113.5，119.1，126.8，136.7，138.3，143.9，157.1，157.9，159.0，159.1.ESI-MS：m/z＝347.5[M+1]-.Anal.Calcd.For C13H12N6O2S2：C 44.82，H 3.47，N24.12，S 18.41；Found C 44.84，H 3.639，N 24.31，S 18.49.由上述鉴定结果可知，所得白固体为N2-(4-磺酰胺基苯基)-N4-(噻唑-2-基)-2,4-二氨基嘧啶，其结构式为经计算本例所述方法的产率为87.8％。
实施例3、制备N2-(4-甲氧基苯基)-N4-(噻唑-2-基)-2,4-二氨基嘧啶(Ⅰc)
将2.2mmol N4-(噻唑-2-基)-2,4-二氨基嘧啶和2.0mmol 4-甲氧基苯胺加入15ml无水乙二醇乙醚中，搅拌，加热至回流，反应30分钟后，加入0.2ml浓盐酸，TLC监测，反应结束后，将反应液倾入100mL水中，用乙酸乙酯(100mL×3)萃取，静置分液，有机相分别用5％的NaHCO3(80mL×3)、饱和食盐水(80mL×3)洗涤，然后用无水硫酸镁干燥，抽滤，减压除去乙酸乙酯得白色固体，将固体用热的甲醇洗涤三次得到白色固体粉末0.518克，mp 237.8–240.9℃。
将所得到的白色固体采用核磁共振谱、质谱及元素分析技术进行鉴定，鉴定结果为：1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：3.74(s，3H，OCH3)，6.41(d，J＝5.6Hz，1H，ArH)，6.89(d，J＝8.8Hz，2H，ArH)，7.14(d，J＝3.6Hz，1H，ArH)，7.42(d，J＝3.6Hz，1H，ArH)，7.58(d，J＝8.8Hz，2H，ArH)，8.09(d，J＝5.6Hz，1H，NH)，9.00(br，1H，NH)，11.37(br，1H，NH).13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ：55.6，98.6，113.3，114.0，122.9，133.5，138.1，155.1，157.1，157.7，159.2，159.8.ESI-MS：m/z＝298.3[M+1]-.Anal.Calcd.for C14H13N5OS：C 56.17，H 4.38，N23.40，S 10.71；Found C 56.45，H 4.59，N 23.71，S 10.31.由上述鉴定结果可知，所得白固体为N2-(4-甲氧基苯基)-N4-(噻唑-2-基)-2,4-二氨基嘧啶，其结构式为经计算本例所述方法的产率为86.7％。
实施例4、制备N2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-N4-(噻唑-2-基)-2,4-二氨基嘧啶(Ⅰd)
将2.2mmol N4-(噻唑-2-基)-2,4-二氨基嘧啶和2.0mmol 3,4,5-三甲氧基苯胺加入15ml无水乙二醇乙醚中，搅拌，加热至回流，反应30分钟后，加入0.2ml浓盐酸，TLC监测，反应结束后，将反应液倾入100mL水中，用乙酸乙酯(100mL×3)萃取，静置分液，有机相分别用5％的NaHCO3(80mL×3)、饱和食盐水(80mL×3)洗涤，然后用无水硫酸镁干燥，抽滤，减压除去乙酸乙酯得白色固体，将固体用热的甲醇洗涤三次得到白色固体粉末0.567克，mp210.4–212.3℃。
将所得到的白色固体采用核磁共振谱、质谱及元素分析技术进行鉴定，鉴定结果为：1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：3.64(s，3H，OCH3)，3.75(s，6H，2×OCH3)，6.46(d，J＝5.6Hz，1H，ArH)，7.16(d，J＝4.0Hz，3H，ArH)，7.44(d，J＝3.6Hz，1H，ArH)，8.16(d，J＝6.0Hz，1H，ArH)，9.03(s，1H，NH)，11.44(s，1H，NH).13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ：56.1，60.6，98.7，99.2，113.2，133.0，136.7，138.2，152.9，157.1，157.7，159.1，159.4.ESI-MS：m/z＝360.9[M+1]+.Anal.Calcd.for C16H17N5O3S：C 53.47，H 4.77，N 19.49，S 8.92；Found C 53.14，H4.838，N 19.59，S 8.563.由上述鉴定结果可知，所得白固体为N2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-N4-(噻唑-2-基)-2,4-二氨基嘧啶，其结构式为经计算本例所述方法的产率为78.6％。
实施例5、制备N2-(4-磺酰胺基苯基)-N4-(噻唑-2-基)-5-氟-2,4-二氨基嘧啶(Ⅰe)
将2.2mmol N4-(噻唑-2-基)-5-氟-2,4-二氨基嘧啶和2.0mmol 4-磺酰胺基苯胺加入15ml无水乙二醇乙醚中，搅拌，加热至回流，反应30分钟后，加入0.2ml浓盐酸，TLC监测，反应结束后，将反应液倾入100mL水中，用乙酸乙酯(100mL×3)萃取，静置分液，有机相分别用5％的NaHCO3(80mL×3)、饱和食盐水(80mL×3)洗涤，然后用无水硫酸镁干燥，抽滤，减压除去乙酸乙酯得白色固体，将固体用热的甲醇洗涤三次得到白色固体粉末0.341克，mp270.3–272.7℃。
将所得到的白色固体采用核磁共振谱、质谱及元素分析技术进行鉴定，鉴定结果为：1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：7.18(br，2H，NH)，7.27(d，J＝4.0Hz，1H，ArH)，7.51(d，J＝4.0Hz，1H，ArH)，7.73(d，J＝8.8Hz，2H，ArH)，7.91(d，J＝8.8Hz，2H，ArH)，8.28(d，J＝3.2Hz，1H，ArH)，9.62(br，1H，NH)，11.97(br，1H，NH).13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ：112.9，113.7，118.7，126.8，127.8，136.5，140.5，141.6，141.8，142.9，144.0，147.7，148.4，154.8，159.5.ESI-MS：m/z＝365.3[M+1]-.Anal.Calcd.for C13H11FN6O2S2：C42.62，H 3.03，N22.94，S 17.50；Found C 42.26，H 3.286，N 22.98，S 17.67.由上述鉴定结果可知，所得白固体为N2-(4-磺酰胺基苯基)-N4-(噻唑-2-基)-5-氟-2,4-二氨基嘧啶，其结构式为经计算本例所述方法的产率为46.7％。
实施例6、制备N2-(3-硝基苯基)-N4-(5-甲基-噻唑-2-基)-5-氟-2,4-二氨基嘧啶(Ⅰf)
将2.2mmol N4-(5-甲基-噻唑-2-基)-5-氟-2,4-二氨基嘧啶和2.0mmol 3-硝基苯胺加入15ml无水乙二醇乙醚中，搅拌，加热至回流，反应30分钟后，加入0.2ml浓盐酸，TLC监测，反应结束后，将反应液倾入100mL水中，用乙酸乙酯(100mL×3)萃取，静置分液，有机相分别用5％的NaHCO3(80mL×3)、饱和食盐水(80mL×3)洗涤，然后用无水硫酸镁干燥，抽滤，减压除去乙酸乙酯得白色固体，将固体用热的甲醇洗涤三次得到白色固体粉末0.367克，mp292.7–295.5℃。
将所得到的白色固体采用核磁共振谱、质谱及元素分析技术进行鉴定，鉴定结果为：1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：2.34(s，3H，CH3)，7.16(s，1H，ArH)，7.57(t，J＝8.0Hz，1H，ArH)，7.80(d，J＝7.6Hz，1H，ArH)，8.13(d，J＝8.0Hz，1H，ArH)，8.26(s，J＝2.4Hz，1H，ArH)，8.79(s，1H，ArH)，9.69(br，1H，NH)，11.86(br，1H，NH).13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ：11.9，113.5，116.0，125.5，125.8，130.0，141.2，141.4，142.3，148.4，149.1，154.8，158.7.ESI-MS：m/z＝345.4[M+1]-.Anal.Calcd.for C14H11FN6O2S：C 48.55，H3.20，N 24.27，S 9.26；Found C 48.37，H 3.472，N 24.42，S 9.567.由上述鉴定结果可知，所得白固体为N2-(3-硝基苯基)-N4-(5-甲基-噻唑-2-基)-5-氟-2,4-二氨基嘧啶，其结构式为经计算本例所述方法的产率为53.1％。
实施例7、制备N2-(4-甲磺酰基苯基)-N4-(噻唑-2-基)-5-氟-2,4-二氨基嘧啶(Ⅰg)
将2.2mmol N4-(噻唑-2-基)-5-氟-2,4-二氨基嘧啶和2.0mmol 4-甲磺酰基苯胺加入15ml无水乙二醇乙醚中，搅拌，加热至回流，反应30分钟后，加入0.2ml浓盐酸，TLC监测，反应结束后，将反应液倾入100mL水中，用乙酸乙酯(100mL×3)萃取，静置分液，有机相分别用5％的NaHCO3(80mL×3)、饱和食盐水(80mL×3)洗涤，然后用无水硫酸镁干燥，抽滤，减压除去乙酸乙酯得白色固体，将固体用热的甲醇洗涤三次得到白色固体粉末0.278克，mp278.1–280.2℃。
将所得到的白色固体采用核磁共振谱、质谱及元素分析技术进行鉴定，鉴定结果为：1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：3.16(s，3H，CH3)，7.29(d，J＝3.6Hz，1H，ArH)，7.51(d，J＝4.0Hz，1H，ArH)，7.81(d，J＝8.8Hz，2H，ArH)，8.02(d，J＝8.8Hz，2H，ArH)，8.30(d，J＝3.2Hz，1H，ArH)，9.76(br，1H，NH)，12.08(s，1H，NH).13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ：44.4，113.7，118.7，128.3，132.6，136.0，140.7，141.5，141.7，145.6，148.5，154.6，159.6.ESI-MS：m/z＝364.3[M+1]-.Anal.Calcd.for C14H12FN5O2S2：C 46.02，H3.31，N 19.17，S 17.55；Found C 46.03，H 3.245，N 19.29，S 17.32.由上述鉴定结果可知，所得白固体为N2-(4-甲磺酰基苯基)-N4-(噻唑-2-基)-5-氟-2,4-二氨基嘧啶，其结构式为经计算本例所述方法的产率为38.1％.
实施例8、制备N2-(4-甲磺酰基苯基)-N4-(5-甲基-噻唑-2-基)-2,4-二氨基嘧啶(Ⅰh)
将2.2mmol N4-(5-甲基-噻唑-2-基)-2,4-二氨基嘧啶和2.0mmol 4-甲磺酰基苯胺加入15ml无水乙二醇乙醚中，搅拌，加热至回流，反应30分钟后，加入0.2ml浓盐酸，TLC监测，反应结束后，将反应液倾入100mL水中，用乙酸乙酯(100mL×3)萃取，静置分液，有机相分别用5％的NaHCO3(80mL×3)、饱和食盐水(80mL×3)洗涤，然后用无水硫酸镁干燥，抽滤，减压除去乙酸乙酯得白色固体，将固体用热的甲醇洗涤三次得到白色固体粉末0.342克，mp290.7–292.3℃。
将所得到的白色固体采用核磁共振谱、质谱及元素分析技术进行鉴定，鉴定结果为：1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：2.37(s，3H，CH3)，3.16(s，3H，CH3)，6.58(d，J＝6.0Hz，1H，ArH)，7.12(d，J＝1.2Hz，1H，ArH)，7.82(d，J＝8.8Hz，2H，ArH)，8.07(d，J＝8.8Hz，2H，ArH)，8.21(d，J＝4.0Hz，1H，ArH)，9.69(br，1H，NH)，11.35(br，1H，NH).13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ：11.7，44.4，100.6，119.3，126.4，128.2，132.8，135.3，145.6，156.9，157.3，157.9，158.8.ESI-MS：m/z＝360.3[M+1]-.Anal.Calcd.for C15H15N5O2S2：C49.84，H 4.18，N 19.38，S 17.74；Found C 50.04，H 4.115，N 19.59，S 17.63.由上述鉴定结果可知，所得白固体为N2-(4-甲磺酰基苯基)-N4-(5-甲基-噻唑-2-基)-2,4-二氨基嘧啶，其结构式为经计算本例所述方法的产率为47.4％
实施例9、制备N2-(4-甲磺酰基苯基)-N4-(5-甲基-噻唑-2-基)-2,4-二氨基嘧啶(Ⅰi)
将2.2mmol N4-(5-甲基-噻唑-2-基)-2,4-二氨基嘧啶和2.0mmol 4-甲磺酰基苯胺加入15ml无水乙二醇乙醚中，搅拌，加热至回流，反应30分钟后，加入0.2ml浓盐酸，TLC监测，反应结束后，将反应液倾入100mL水中，用乙酸乙酯(100mL×3)萃取，静置分液，有机相分别用5％的NaHCO3(80mL×3)、饱和食盐水(80mL×3)洗涤，然后用无水硫酸镁干燥，抽滤，减压除去乙酸乙酯得白色固体，将固体用热的甲醇洗涤三次得到白色固体粉末0.34克，mp286.1–288.2℃。
将所得到的白色固体采用核磁共振谱、质谱及元素分析技术进行鉴定，鉴定结果为：1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：2.37(s，3H，CH3)，6.55(d，J＝5.6Hz，1H，ArH)，7.12(d，J＝1.2Hz，1H，ArH)，7.19(br，2H，NH)，7.73(d，J＝8.8Hz，2H，ArH)，7.97(d，J＝8.8Hz，2H，ArH)，8.19(d，J＝5.6Hz，1H，ArH)，9.56(br，1H，NH)，11.32(br，1H，NH).13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ：11.7，100.2，119.3，126.4，126.7，135.2，136.7，143.9，156.7，157.4，157.9，158.9.ESI-MS：m/z＝361.3[M+1]-.Anal.Calcd.for C14H14N6O2S2：C46.40，H3.89，N 23.19，S 17.6；Found C 46.34，H 3.847，N 23.00，S 17.95.由上述鉴定结果可知，所得白固体为N2-(4-甲磺酰基苯基)-N4-(5-甲基-噻唑-2-基)-2,4-二氨基嘧啶，其结构式为经计算本例所述方法的产率为47.1％
实施例10、制备N2-(4-甲磺酰基苯基)-N4-(5-甲基-噻唑-2-基)-5-甲基-2,4-二氨基嘧啶(Ⅰj)
将2.2mmol N4-(5-甲基-噻唑-2-基)-5-甲基-2,4-二氨基嘧啶和2.0mmol 4-甲磺酰基苯胺加入15ml无水乙二醇乙醚中，搅拌，加热至回流，反应30分钟后，加入0.2ml浓盐酸，TLC监测，反应结束后，将反应液倾入100mL水中，用乙酸乙酯(100mL×3)萃取，静置分液，有机相分别用5％的NaHCO3(80mL×3)、饱和食盐水(80mL×3)洗涤，然后用无水硫酸镁干燥，抽滤，减压除去乙酸乙酯得白色固体，将固体用热的甲醇洗涤三次得到白色固体粉末0.345克，mp 239.5–241.3℃。
将所得到的白色固体采用核磁共振谱、质谱及元素分析技术进行鉴定，鉴定结果为：1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：2.18(s，3H，CH3)，2.38(s，3H，CH3)，3.16(s，3H，CH3)，7.17(s，1H，ArH)，7.80(d，J＝8.4Hz，2H，ArH)，8.06(t，J＝6.2Hz，3H，ArH)，9.50(br，1H，NH)，10.60(br，1H，NH).13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ；11.7，13.7，44.5，108.8，118.9，126.5，128.2，132.3，146.0，156.2，156.7，157.2，157.9.ESI-MS：m/z＝374.3[M+1]-.Anal.Calcd.forC16H17N5O2S2：C 51.18，H 4.56，N 18.65，S 17.08；Found C 51.34，H 4.626，N 19.0，S17.23.由上述鉴定结果可知，所得白固体为N2-(4-甲磺酰基苯基)-N4-(5-甲基-噻唑-2-基)-5-甲基-2,4-二氨基嘧啶，其结构式为经计算本例所述方法的产率46.2％
实施例11、制备N2-(4-磺酰胺基苯基)-N4-(噻唑-2-基)-5-甲基-2,4-二氨基嘧啶(Ⅰk)
将2.2mmol N4-(噻唑-2-基)-5-甲基-2,4-二氨基嘧啶和2.0mmol 4-磺酰胺基苯胺加入15ml无水乙二醇乙醚中，搅拌，加热至回流，反应30分钟后，加入0.2ml浓盐酸，TLC监测，反应结束后，将反应液倾入100mL水中，用乙酸乙酯(100mL×3)萃取，静置分液，有机相分别用5％的NaHCO3(80mL×3)、饱和食盐水(80mL×3)洗涤，然后用无水硫酸镁干燥，抽滤，减压除去乙酸乙酯得白色固体，将固体用热的甲醇洗涤三次得到白色固体粉末0.347克，mp238.4–239.3℃。
将所得到的白色固体采用核磁共振谱、质谱及元素分析技术进行鉴定，鉴定结果为：1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：2.20(s，3H，CH3)，7.16(br，2H，NH)，7.24(s，1H，ArH)，7.51(d，J＝2.8Hz，1H，ArH)，7.72(d，J＝8..4Hz，2H，ArH)，7.95(d，J＝8.8Hz，2H，ArH)，8.09(s，1H，ArH)，9.41(br，1H，NH)，10.75(br，1H，NH).13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ：13.7，108.4，113.8，118.6，126.8，136.2，137.8，144.3，156.5，157.3，159.5.ESI-MS：m/z＝361.4[M+1]-.Anal.Calcd.for C14H14N6O2S2：C 46.40，H 3.89，N 23.19，S 17.69；Found C 46.20，H3.774，N 23.26，S 17.39.由上述鉴定结果可知，所得白固体为N2-(4-磺酰胺基苯基)-N4-(噻唑-2-基)-5-甲基-2,4-二氨基嘧啶，其结构式为经计算本例所述方法的产率为48.3％。
实施例12(抗肿瘤活性研究)
本发明化合物的抗肿瘤活性采用如下方法测试所证明。这些效果表明本发明化合物可用于治疗癌症，特别是治疗实体肿瘤，如结肠癌、宫颈癌和肺癌。具体测试方法如下：
采用MTT法检测实施例1～18所制备的化合物(编号依次为Ⅰa～Ⅰr)的体外抗肿瘤活性。收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，以6×103-8×103个/mL接种于96孔板，孵育12-24h。待细胞贴壁后，加入不同浓度的药物，设置1.875，3.75，7.5，15，30，60ug/ml共6个浓度梯度，每个浓度4个复孔。置37℃、5％CO2培养箱，开始计时培养。在加药48h后取出96孔板，每孔加入5mg/mL MTT溶液20μL，37℃继续培养4h。然后，小心吸弃孔内上清液，每孔加入150μL DMSO，震荡10min，使结晶物溶解。选择570nm波长在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度值(OD值)。最后进行数据统计，以OD值(570nm)为纵轴，处理时间为横轴，描绘药物对细胞生长的抑制作用效果。按下列公式计算抑制率，抑制率＝(1-加药组OD值/对照组OD值)×100％。用CompuSyn软件计算半数抑制量IC50。
测活性结果如表1所示：
表1化合物Ⅰa～Ⅰt的抗肿瘤活性
上表中的阳性对照品为市适用售的氟尿嘧啶，对照品是公开号为US2008/0096899A1的美国专利申请实施例中所公开的4-(4-甲基-1-哌嗪)甲基-N-4-甲基-3-4-(3-吡啶)-2-嘧啶氨基苯基-苯甲酰胺，该化合物所制成的药物已上市，名称为Imatinib(中文名为伊马替尼)。
根据上述体外实验结果，我们可以看出具有式(Ⅰ)结构的化合物对HCT116、Hela和HepG2三种人类肿瘤细胞具有较强的抑制作用，均明显优于阳性对照品氟尿嘧啶与对照品Imatinib的抑制活性。
3、CDK2酶抑制活性
(1)药物的配制：用DMSO配制成10mM的母液，超声加速溶解，后用DMSO
及激酶缓冲液进行梯度稀释，保证DMSO的终浓度小于1％；(2)激酶反应缓冲液的成份：40mM Tris，pH 7.4，10mM MgCl2，0.1mg/ml BSA,1mM DTT，10μM ATP；(3)详细的实验步骤为：在白色的酶标板上，每孔加1ul的药物，然后加入10μl CDK2/Cyclin A2酶混匀，再加5μl的Histone H1底物，后加入34μl的分析缓冲液，混匀，在30℃孵育40分钟，然后加入ATP检测液50μl，室温反应5分钟，立即
在酶标仪上检测化学发光信号，酶活性大小与化学发光数值成反比，将数值代入如下公式，计算活性百分率：
％activity＝{(Lu药物–Lu本底)/(Lu酶–Lu本底)}×100％
用Graphpad Prism5软件处理，计算出化合物的IC50值。
上述体外酶活性实验的结果在下表中给出。
表2化合物Ⅰa～Ⅰt的CDK2酶活性
4、实施例9所制备的化合物Ⅰi对肿瘤细胞周期的影响
在MTT检测结果的基础上，我们采用流式细胞仪对实施例13所制备的化合物Ⅰi对结肠癌细胞HCT116细胞周期的影响进行了检测，结果如图1所示。
由图1可见，化合物Ⅰi可以改变结肠癌细胞HCT116在各周期数目分布的比例，明显的将细胞生长阻滞在G2/M期，而G1期细胞数目都相应的有所下降，并表现出剂量依赖效应。
Claims (4)
1.一种含取代噻唑的2,4-二氨基嘧啶，该2,4-二氨基嘧啶的化学结构如下式(Ⅰ)所示，
式(Ⅰ)中，R1是氢、氟或甲基，R2为氢，R3是氢、甲基，R4为4-甲磺酰基苯基、4-磺酰胺基苯基、4-甲氧基苯基、3,4,5-三甲氧基苯基或3-硝基苯基。
2.根据权利要求1所述的一种含取代噻唑的2,4-二氨基嘧啶，该2,4-二氨基嘧啶为下述化合物中的一种：
N2-(4-甲磺酰基苯基)-N4-(噻唑-2-基)-2,4-二氨基嘧啶，
N2-(4-磺酰胺基苯基)-N4-(噻唑-2-基)-2,4-二氨基嘧啶，
N2-(4-甲氧基苯基)-N4-(噻唑-2-基)-2,4-二氨基嘧啶，
N2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-N4-(噻唑-2-基)-2,4-二氨基嘧啶，
N2-(4-磺酰胺基苯基)-N4-(噻唑-2-基)-5-氟-2,4-二氨基嘧啶，
N2-(3-硝基苯基)-N4-(5-甲基-噻唑-2-基)-5-氟-2,4-二氨基嘧啶，
N2-(4-甲磺酰基苯基)-N4-(噻唑-2-基)-5-氟-2,4-二氨基嘧啶，
N2-(4-甲磺酰基苯基)-N4-(5-甲基-噻唑-2-基)-2,4-二氨基嘧啶，
N2-(4-甲磺酰基苯基)-N4-(5-甲基-噻唑-2-基)-2,4-二氨基嘧啶，
N2-(4-甲磺酰基苯基)-N4-(5-甲基-噻唑-2-基)-5-甲基-2,4-二氨基嘧啶，
N2-(4-磺酰胺基苯基)-N4-(噻唑-2-基)-5-甲基-2,4-二氨基嘧啶。
3.权利要求1或者2所述的含取代噻唑的2,4-二氨基嘧啶在制备抗肿瘤药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的抗肿瘤药物由权利要求1所述的含取代噻唑的2,4-二氨基嘧啶和医学上可接受的辅料组成。
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