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CN107636005B - 在色谱过程中利用碱洗涤去除杂质 - Google Patents

在色谱过程中利用碱洗涤去除杂质 Download PDF

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CN107636005B CN201680015033.0A CN201680015033A CN107636005B CN 107636005 B CN107636005 B CN 107636005B CN 201680015033 A CN201680015033 A CN 201680015033A CN 107636005 B CN107636005 B CN 107636005B
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Abstract

在特定的实施方案中，本发明提供从包含感兴趣的蛋白质及一种或多种污染物的混合物纯化感兴趣的蛋白质的方法，所述方法包括：a)将所述混合物暴露于第一色谱基质，其中所述感兴趣的蛋白质与第一色谱基质结合；b)使第一色谱基质与pH为至少9.0，并且不包含精氨酸或精氨酸衍生物的第一洗涤溶液接触；和c)将感兴趣的蛋白质从第一色谱基质洗脱到洗脱溶液中。

Description

在色谱过程中利用碱洗涤去除杂质
对相关申请的交叉引用
本申请要求2015年3月13日递交的美国临时申请序列号62/132,974的优先权，该申请的全部内容通过提述并入本文。
发明背景
蛋白质的大规模经济纯化越来越成为生物医药产业的重要课题。治疗用蛋白质通常是利用工程化原核或真核细胞系表达的，它们经过工程化从而自含有编码感兴趣的蛋白质的基因的重组质粒表达感兴趣的蛋白质。对于生物制品制造者而言，从投放给细胞的组分与细胞副产品的混合物中纯化期望的蛋白质至足够纯度，例如足以用作人用治疗剂的纯度，是一项严峻的挑战。
因此，本领域对这样的替代的蛋白质纯化方法存在需求：其能够用于加快基于蛋白质的治疗剂，例如来自细胞培养物的抗体的大规模加工。
发明概述
在特定实施方案中，本发明提供一种从包含感兴趣的蛋白质和一种或多种污染物的混合物中纯化感兴趣的蛋白质的方法，包括a)使所述混合物暴露于第一色谱基质，其中感兴趣的蛋白质结合至该第一色谱基质；b)使所述第一色谱基质与具有至少9.0的pH、且不包含精氨酸或精氨酸衍生物的第一洗涤溶液接触，和c)将感兴趣的蛋白质从第一色谱基质洗脱到洗脱溶液中。示例而言，污染物选自宿主细胞蛋白质、宿主细胞代谢物、宿主细胞组成型蛋白质、核酸、内毒素、病毒、产品相关的污染物、脂质、培养基添加剂和培养基衍生物。任选地，第一色谱是亲和色谱(例如蛋白A亲和色谱或蛋白G亲和色谱)。优选地，所述亲和色谱是蛋白A色谱。示例而言，感兴趣的蛋白质选自抗体、抗体片段和Fc融合蛋白。一种示例的感兴趣的蛋白质是抗体，如单克隆抗体(包括但不限于人抗体、人源化抗体和嵌合抗体)。
在特定的具体实施方案中，第一洗涤溶液的pH为约9到约11之间。任选地，第一洗涤溶液的pH为约9.5到约10.5之间(例如9.5，9.6，9.7，9.8，9.9，10.0，10.1，10.2，10.3，10.4或10.5)。第一洗涤溶液的一个示例性pH是约9.6。第一洗涤溶液的另一个示例性pH是约10.4。
在特定的具体实施方案中，所述方法进一步包括，在所述第一洗涤溶液之后，使第一色谱基质与具有至少9.0的pH、且不包含精氨酸或精氨酸衍生物的第二洗涤溶液接触。例如，所述第一洗涤溶液包含浓度在约0.01-1.0M范围的碳酸钠，和浓度在约0.5-2M范围的氯化钠。例如，所述第二洗涤溶液包含浓度在约0.01-1.0M范围的碳酸钠。
在特定的具体实施方案中，混合物被暴露于一种或多种其他色谱基质。示例而言，第一色谱是亲和色谱，而一种或多种其他色谱基质选自离子交换色谱(例如阴离子交换色谱或阳离子交换色谱)、疏水相互作用色谱、以及混合模式色谱。任选地，所述混合物选自：收获的细胞培养物流体、细胞培养物上清、和条件化的细胞培养物上清、细胞裂解物、和经澄清化的粗料(clarified bulk)。例如，细胞培养物是哺乳动物细胞培养物，如中华仓鼠卵巢(CHO)细胞培养物。
附图简要说明
图1显示标准纯化过程和新过程的概览。
图2显示各种pH洗涤对CHO-HCP减少的影响。
图3显示高pH洗涤对CHO-HCP减少的影响。
图4显示高pH洗涤对CHO-DNA水平的清除的影响。
图5显示高pH洗涤对残余蛋白A水平的清除的影响。
图6显示各种备选过程降低CHO-HCP水平的效率的比较。
发明详细说明
本发明提供使用亲和色谱在蛋白质纯化过程中去除杂质的高度有效、独特的方法。具体地说，该方法利用非常高pH(例如9-11)的碱性洗涤溶液。碱性洗涤溶液的另一个特征是它们不要求精氨酸或精氨酸衍生物的存在。碱性洗涤溶液可极为有效地去除施加到亲和色谱基质的进料材料中的宿主细胞蛋白质(HCP)。如下文的工作实施例中所示，这种方法是鲁棒的，能够有效地用于不同mAb亚类。在亲和色谱中使用这样的洗涤溶液可以维持高的过程产率和产品的完整性。此外，该方法可增加过程效率、缩短开发时间线。
在特定实施方案中，本发明提供一种从包含感兴趣的蛋白质和一种或多种污染物的混合物中纯化感兴趣的蛋白质的方法，包括a)使混合物暴露于第一色谱基质；b)使第一色谱基质与具有至少9.0的pH、且不包含精氨酸或精氨酸衍生物的第一洗涤溶液接触；和c)将感兴趣的蛋白质从第一色谱基质洗脱到洗脱溶液中。示例而言，污染物选自宿主细胞蛋白质、宿主细胞代谢物、宿主细胞组成型蛋白质、核酸、内毒素、病毒、产品相关的污染物、脂质、培养基添加剂和培养基衍生物。任选地，第一色谱是亲和色谱(例如蛋白A亲和色谱或蛋白G亲和色谱)。优选地，所述亲和色谱是蛋白A色谱。示例而言，感兴趣的蛋白质选自抗体、抗体片段和Fc融合蛋白。一种示例的感兴趣的蛋白质是抗体，如单克隆抗体(包括但不限于人抗体、人源化抗体和嵌合抗体)。
在特定的具体实施方案中，第一洗涤溶液的pH为约9到约11之间。任选地，第一洗涤溶液的pH为约9.5到约10.5之间(例如9.5，9.6，9.7，9.8，9.9，10.0，10.1，10.2，10.3，10.4或10.5)。第一洗涤溶液的一个示例性pH是约9.6。第一洗涤溶液的另一个示例性pH是约10.4。
在特定的具体实施方案中，所述方法进一步包括，在所述第一洗涤溶液之后，使第一色谱基质与具有至少9.0的pH、且不包含精氨酸或精氨酸衍生物的第二洗涤溶液接触。任选地，所述方法进一步包括，在所述第二洗涤溶液之后，使第一色谱基质与具有约6到约7之间的pH、且不包含精氨酸或精氨酸衍生物的第三洗涤溶液接触。例如，所述第一洗涤溶液包含浓度在约0.01-1.0M范围的碳酸钠，和浓度在约0.5-2M范围的氯化钠。例如，所述第二洗涤溶液包含浓度在约0.01-1.0M范围的碳酸钠。
在特定的具体实施方案中，混合物被暴露于一种或多种其他色谱基质。示例而言，第一色谱是亲和色谱，而一种或多种其他色谱基质选自离子交换色谱(例如阴离子交换色谱或阳离子交换色谱)、疏水相互作用色谱、以及混合模式色谱。任选地，所述混合物选自：收获的细胞培养物流体、细胞培养物上清、和条件化的细胞培养物上清、细胞裂解物、和经澄清化的粗料。例如，细胞培养物是哺乳动物细胞培养物，如中华仓鼠卵巢(CHO)细胞培养物。
I.定义
为了更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中使用的，除非在本文中另有明确规定，下述各术语应当具有下面给出的意义。更多的定义在本申请全文中给出。
如本文中使用的，术语“感兴趣的蛋白质”以其最广泛的意义使用，包括存在于某种混合物中期望加以纯化的任何蛋白质(天然的或者重组的)。这样的感兴趣的蛋白质包括但不限于激素、生长因子、细胞因子、免疫球蛋白(例如抗体)、以及含有免疫球蛋白样结构域的分子(例如含有ankyrin或fibronectin结构域的分子)。
如本文中使用的，“细胞培养物”指液体培养基中的细胞。任选地，细胞培养物包含在生物反应器中。细胞培养物中的细胞可以来自任何生物体，包括例如细菌、真菌、昆虫、哺乳动物或植物。在一个具体的实施方案中，细胞培养物中的细胞包括用含有编码感兴趣的蛋白质(例如抗体)的核酸的表达构建体转化过的细胞。合适的液体培养基包括，例如，营养培养基和非营养培养基。在一个具体的实施方案中，细胞培养物包括含有中华仓鼠卵巢(CHO)细胞系的营养培养基，其不通过例如过滤或离心被纯化。
如本文中使用的，术语“澄清化的粗料”是指从中已基本上去除颗粒物质的混合物。澄清化的粗料包括这样的细胞培养物或细胞裂解物，其中已经基本上去除了细胞或细胞碎片，例如通过过滤或离心。
如本文中使用的，术语“生物反应器”采取其在现有技术中公认的含义，指设计用于细胞培养物受控生长的室(chamber)。生物反应器可以是任何尺寸，只要其能用于培养细胞，例如哺乳动物细胞。典型地，生物反应器有至少30ml，而且可以有至少1、10、100、250、500、1000、2500、5000、8000、10,000、12,0000升或更多，或任何中间的体积。生物反应器的内部条件，包括但不限于pH和温度，通常在整个培养期间是受控的。合适的生物反应器可以由任何这样的材料构成(即用这样的材料构建)：适合于在培养条件下容纳悬浮在培养基中的细胞培养物，并且有助于细胞生长和存活；这样的材料包括玻璃、塑料或金属；该材料不得干扰感兴趣的蛋白质的表达或稳定性。本领域普通技术人员将知晓并能够选择适合用于实施本发明的生物反应器。
如本文中使用的，“混合物”包含感兴趣的蛋白质(期望纯化的)以及一种或多种污染物，即杂质。在一个实施方案中，混合物是从表达感兴趣的蛋白质(天然地或重组方式)的宿主细胞或生物体产生的。这样的混合物包括，例如，细胞培养物、细胞裂解物、和澄清化的粗料(例如澄清化的细胞培养物上清)。
如本文中使用的，术语“分离”和“纯化”可互换使用，指从含有感兴趣的蛋白质(例如抗体)的混合物中选择性地去除污染物。
如本文中使用的，术语“污染物”以其最广泛的意义使用，涵盖混合物中任何不期望的组分或化合物。在细胞培养物、细胞裂解物或澄清的粗料(例如澄清的细胞培养物上清)中，污染物包括，例如，存在于细胞培养基中的宿主细胞核酸(例如DNA)和宿主细胞蛋白质。宿主细胞污染物蛋白质包括，但不限于，由宿主细胞天然或重组地表达者，以及与感兴趣的蛋白质相关或从感兴趣的蛋白质衍生的蛋白质(例如蛋白水解片段)，和其他过程相关的污染物。在特定的实施方案中，使用本领域公认的手段，例如离心、无菌过滤、深度过滤和切向流过滤，来从细胞培养物分离污染物沉淀物。
如本文中使用的，术语“离心”是这样的过程，其涉及通过在工业和实验室环境中使用的离心机，利用离心力来沉降不均一的混合物。该过程被用于分离两种不可混溶的液体。例如，在本发明的一种方法中，可以利用离心来从混合物去除污染物沉淀物，所述混合物包括但不限于细胞培养物或澄清化的细胞培养物上清或捕捉柱捕捉的合并洗脱液。
如本文中使用的，“无菌过滤”是这样一种使用膜过滤器的过滤方法，膜过滤器通常是孔径为0.2μm的滤器，用以有效地去除微生物或小颗粒。例如，在本发明的一种方法中，可以利用无菌过滤来从混合物中去除污染物沉淀物，所述混合物包括但不限于细胞培养物或澄清化的细胞培养物上清或捕捉柱捕捉的合并洗脱液。
如本文中使用的，“深度过滤”是一种使用深度过滤器的过滤方法，深度过滤器通常以其由于滤器基质内的一定范围的孔径而保留颗粒的设计为特征。深度过滤器的能力通常由基质的深度(例如10英寸或20英寸)——因此，基质容纳固体的能力——所限定。例如，在本发明的一个方法中，可以利用深度过滤来从混合物中去除污染物沉淀物，所述混合物包括但不限于细胞培养物或澄清化的细胞培养物上清或捕捉柱捕捉的合并洗脱液。
如本文中使用的，术语“切向流过滤”指这样一种过滤过程，其中样品混合物循环穿过膜的顶部，同时施加的压力导致特定的溶质和小分子穿透膜。例如，在本发明的一个方法中，可以利用切向流过滤来从混合物中去除污染物沉淀物，所述混合物包括但不限于细胞培养物或澄清化的细胞培养物上清或捕捉柱捕捉的合并洗脱液。
如本文中使用的，术语“色谱”是指这样的过程：通过使混合物渗滤通过(percolation through)某种吸附剂，在该过程的特定缓冲pH下，由于混合物中感兴趣的溶质(例如感兴趣的蛋白质)的性质，例如pI、疏水性、大小和结构，该吸附剂对该溶质的吸附或保留较强或较弱，从而将该溶质与混合物中的其他溶质分开。在本发明的一种方法中，可以在从混合物(包括但不限于细胞培养物或经澄清化的细胞培养物上清或捕捉柱捕捉的合并洗脱液)去除沉淀物之后，利用色谱来去除污染物。
术语“离子交换”和“离子交换色谱”指这样的色谱过程，其中在合适的pH的电导率的条件下，可离子化的感兴趣溶质(例如混合物中的感兴趣的蛋白质)与连接于(例如通过共价附接)固相离子交换材料的带相反电荷的配体相互作用，使得感兴趣的溶质与带电化合物的非特异性相互作用多于或少于该混合物中的溶质杂质或污染物。混合物中的污染性溶质可以从离子交换材料的柱上被洗去、或者比感兴趣的溶质更快地或更慢地结合到树脂或被从树脂排除。“离子交换色谱”具体地包括阳离子交换、阴离子交换、和混合模式色谱。
短语“离子交换材料”指带负电(即阳离子交换树脂或膜)或带正电(即阴离子交换树脂或膜)的固相。在一个实施方案中，电荷可通过附接(例如通过共价连接)一种或多个带电的配体(或吸附剂)至固相而提供。或者/并且，电荷可以是固相的固有性质(例如，像二氧化硅那样，其整体带负电荷)。
“阳离子交换树脂”或“阳离子交换膜”指这样的固相，其带负电，且具有游离的阴离子，以供与流经或流过该固相的水溶液中的阳离子交换。可以使用任何附接于适合形成阳离子交换树脂的固相的带负电配体，例如羧酸根(carboxylate)、磺酸根(sulfonate)，以及其他下述者。可商购的阳离子交换树脂包括，但不限于，例如，具有下列基团者：基于磺酸根的基团(例如，GE Healthcare生产的MonoS、MiniS、Source 15S和30S、SP
Figure BDA0001404238400000061
Fast Flow、SP
Figure BDA0001404238400000062
High Performance；Tosoh产的
Figure BDA0001404238400000063
SP-650S和SP-650M；BioRad产的
Figure BDA00014042384000000610
High S；PallTechnologies产的Ceramic HyperD S、
Figure BDA0001404238400000065
M和LS SP，以及Spherodex LS)；基于磺基乙基的基团(例如
Figure BDA0001404238400000066
SE，产自EMD；
Figure BDA0001404238400000067
S-10和S-20，产自Applied Biosystems)；基于磺基丙基的基团(例如来自Tosoh的Gel SP 5PW和SP-5PW-HR；来自Life Technologies的
Figure BDA0001404238400000068
HS-20、HS 50、和
Figure BDA0001404238400000069
XS)；基于磺基异丁基的基团(例如来自EMD的
Figure BDA0001404238400000071
EMD SO3-)；基于磺氧基乙基的基团(例如来自Whatman的SE52，SE53和Express-Ion S)；基于羧甲基的基团(例如来自GE Healthcare的CM
Figure BDA0001404238400000072
Fast Flow；来自Biochrom Labs Inc.的Hydrocell CM；来自BioRad的
Figure BDA00014042384000000732
CM；来自Pall Technologies的Ceramic HyperD CM，
Figure BDA0001404238400000074
MCM，
Figure BDA0001404238400000075
LS CM；来自Millipore的Matrx
Figure BDA0001404238400000076
C500和C200；来自Whatman的CM52、CM32、CM23和Express-Ion C；来自Tosoh的
Figure BDA0001404238400000077
CM-650S，CM-650M和CM-650C)；基于磺酸和羧酸的基团(例如来自J.T.Baker的
Figure BDA0001404238400000078
Carboxy-Sulfon)；基于羧酸的基团(例如来自J.T Baker的WP CBX；来自Dow LiquidSeparations的
Figure BDA0001404238400000079
MAC-3；来自Sigma-Aldrich的
Figure BDA00014042384000000710
弱阳离子交换剂、
Figure BDA00014042384000000711
弱阳离子交换剂和
Figure BDA00014042384000000712
弱阳离子交换剂；和来自EMD的
Figure BDA00014042384000000713
EMD COO-)；基于磺酸的基团(例如来自Biochrom Labs Inc.的HydrocellSP；来自Dow Liquid Separations的
Figure BDA00014042384000000714
细网孔强酸阳离子树脂；来自J.T.Baker的UNOsphere S，WP Sulfonic；来自Sartorius的
Figure BDA00014042384000000715
S膜；来自Sigma-Aldrich的
Figure BDA00014042384000000716
强阳离子交换剂、
Figure BDA00014042384000000717
Strong Cation和
Figure BDA00014042384000000718
强阳离子交换剂)；和基于正磷酸盐的基团(例如来自Whatman的P11)。
“阴离子交换树脂”或“阴离子交换膜”指带正电、例如有一个或多个附接于其上的带正电配体的固相。可以使用任何附接于固相的适于形成阴离子交换树脂的带正电配体，例如季胺基团。可商购的阴离子交换树脂包括来自Applied Biosystems的DEAE纤维素、
Figure BDA00014042384000000719
PI 20、PI 50、HQ 10、HQ 20、HQ 50、D 50；来自Sartorius的
Figure BDA00014042384000000720
Q；MonoQ、MiniQ、Source 15Q和30Q、Q、DEAE和ANX
Figure BDA00014042384000000721
Fast Flow、Q
Figure BDA00014042384000000722
High Performance、QAE
Figure BDA00014042384000000723
和FAST Q
Figure BDA00014042384000000724
(GEHealthcare)；来自J.T.Baker的WP PEI、WP DEAM、WP QUAT；来自Biochrom Labs Inc.的Hydrocell DEAE和Hydrocell QA；来自Biorad的UNOsphere Q、
Figure BDA00014042384000000731
DEAE和
Figure BDA00014042384000000730
High Q；来自Pall Technologies的Ceramic HyperD Q、ceramicHyperD DEAE、
Figure BDA00014042384000000725
M和LS DEAE、Spherodex LS DEAE、QMA
Figure BDA00014042384000000726
LS、QMA
Figure BDA00014042384000000727
M和
Figure BDA00014042384000000728
Q；来自Dow Liquid Separatiohs的
Figure BDA00014042384000000729
细网孔强碱I型和II型阴离子树脂及
Figure BDA0001404238400000081
MONOSPHER E 77弱碱阴离子；来自Millipore的
Figure BDA0001404238400000082
Q膜、Matrex
Figure BDA0001404238400000083
A200、A500、Q500和Q800；来自EMD的
Figure BDA0001404238400000084
EMD TMAE、
Figure BDA0001404238400000085
EMD DEAE知
Figure BDA0001404238400000086
EMDDMAE；来自Sigma-Aldrich的
Figure BDA0001404238400000087
弱强阴离子交换剂I型及II型、
Figure BDA0001404238400000088
弱和强阴离子交换剂I型及II型、
Figure BDA0001404238400000089
弱和强阴离子交换剂I型及II型、
Figure BDA00014042384000000810
来自Tosoh的TSK gel Q和DEAE5PW及5PW-HR、
Figure BDA00014042384000000811
SuperQ-650S、650M和650C，QAE-550C及650S、DEAE-650M及650C；来自Whatman的QA52、DE23、DE32、DE51、DE52、DE53、Express-Ion D及Express-Ion Q；以及
Figure BDA00014042384000000812
Q(SartoriusCorporation，New York，USA)。
“混合模式离子交换树脂”、“混合模式离子交换膜”、或“混合模式”，是指这样的固相，其被用阳离子、阴离子和/或疏水部分共价修饰。混合模式离子交换树脂的例子包括
Figure BDA00014042384000000813
ABX(J.T.Baker；Phillipsburg，NJ)，陶瓷羟基磷灰石I型和II型氟化羟基磷灰石(BioRad；Hercules，CA)以及MEP和MBI HyperCel(Pall Corporation；EastHills，NY)。
“疏水相互作用色谱树脂”或“疏水相互作用色谱膜”指被苯基、辛基或丁基化学剂共价修饰的固相。疏水相互作用色谱是一种利用疏水性质来将各种蛋白质相互分离的分离技术。在这种色谱中，疏水性基团，例如苯基、辛基或丁基，附接于固定柱。通过该柱子的具有疏水性氨基酸侧链的蛋白质能够与柱子上的疏水性基团相互作用并且结合于这些疏水性基团。疏水相互作用色谱树脂的例子包括：(1)Butyl FF，Butyl HP，Octyl FF，PhenylFF，Phenyl HP，Phenyl FF(高取代)；Phenyl FF(低取代)；Capto Phenyl ImpRes，CaptoPhenyl(高取代)，Capto Octyl，Capto ButylImpRes，Capto Butyl(GE Healthcare，Uppsala，Sweden)；(2)
Figure BDA00014042384000000814
Super Butyl-550C，
Figure BDA00014042384000000815
Hexyl-650C，Butyl-650C，Phenyl-650C，Butyl 600M，Phenyl-600M，PPG-600M，Butyl-650M，Phenyl-650M，Ether-650M，Butyl-650S，Phenyl-650S，Ether-650S，TSKgel Pheny-5PW，TSKgel Ether-5PW(Tosoh Bioscience，Tokyo，Japan)；(3)
Figure BDA00014042384000000816
-butyl，MACRO-
Figure BDA00014042384000000817
-methyl(Bio-Rad)；以及(4)
Figure BDA00014042384000000818
Phenyl(Sartoriuscorporation，New York，USA)。
II.感兴趣的蛋白质
在特定的方面，本发明的方法可以用于纯化任何感兴趣的蛋白质，包括但不限于具有药学性质、诊断性质、农业性质、和/或任何其他多种在商业、实验或其他应用中有用的性质。此外，感兴趣的蛋白质可以是蛋白质治疗剂。在特定的实施方案中，使用本发明的方法纯化的蛋白质可以是被加工或者修饰的。例如，根据本发明的感兴趣的蛋白质可以是被糖基化的。
因此，本发明可以用于培养细胞以产生任何治疗性蛋白质，例如药学上或产业上重要的酶、受体、受体融合蛋白、抗体(例如单克隆或多克隆抗体)、抗体的抗原结合片段、Fc融合蛋白、细胞因子、激素、调节因子、生长因子、共凝集/凝血因子、或抗原结合剂。上述蛋白质的列表仅仅是示例性的，并不意在构成限制性表述。本领域普通技术人员会知晓可以根据本发明产生其他蛋白质，并且将能够利用本文公开的方法产生这样的蛋白质。
在本发明的一个具体的实施方案中，使用本发明的方法纯化的蛋白质是抗体。术语“抗体”以其最宽泛的意义使用，涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、抗体片段、免疫粘合素、以及抗体-免疫粘合素嵌合物。
“抗体片段”包括全长抗体的至少一部分，通常包括其抗原结合区或可变区。抗体片段的例子包括Fab、Fab’、F(ab’)2、以及Fv片段；单链抗体分子；双抗体；线性抗体；以及自工程化的抗体片段形成的多特异性抗体。
术语“单克隆抗体”以其常规意义使用，指从一个基本上均一的抗体的群体获得的抗体，组成该群体的抗体个体除了可能以微量存在的、可能天然发生的突变之外都是完全相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原性位点。这与多克隆抗体形成对照；多克隆抗体通常包括针对抗原的不同决定簇(表位)的不同抗体，而单克隆抗体针对的是抗原上的单一决定簇。术语“单克隆”在描述抗体时，表示该抗体获自基本上均一的抗体群体这一性质，而并非解释为要求用任何特定方法来产生该抗体。例如，本发明中使用的单克隆抗体可以使用由Kohler et al.，Nature，256：495(1975)首先描述的常规杂交瘤技术来产生，或者可以用重组DNA方法(参见例如美国专利4,816,567)来生产它们。单克隆抗体还可以从噬菌体抗体文库中分离，例如使用下述文献中描述的技术：Clackson et al.，Nature，352：624-628(1991)；Marks et al.，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)；以及美国专利5,223,409；5,403,484；5,571,698；5,427,908；5,580,717；5,969,108；6,172,197；5,885,793；6,521,404；6,544,731；6,555,313；6,582,915和6,593,081)。
本文中描述的单克隆抗体包括“嵌合”和“人源化”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与来源于特定物种、或属于特定抗体类别或亚类的抗体、以及此类抗体的片段中的相应序列相同或同源，而该链的其余部分与来源于另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体、以及此类抗体的片段中的相应序列相同或同源，使得它们展示期望的生物学活性(美国专利号4,816,567；以及Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851-6855(1984))。非人(例如小鼠)抗体的“人源化”形式是这样的嵌合抗体，其含有极少的源自非人免疫球蛋白的序列。大体上，人源化抗体是这样的人免疫球蛋白(接受体抗体)，其中接受体的高变区被来自例如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类的非人物种(供体抗体)的、具有期望的特异性、亲和力和能力的高变区残基所替换。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包括在接受体抗体或供体抗体中找不到的残基。进行这些修饰以进一步改良抗体性能。一般而言，人源化抗体将包含至少一个、通常两个可变域的基本上全部，这些可变域的全部或基本上全部的高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，且全部或基本上全部的FR区均为人免疫球蛋白的序列。人源化抗体任选地还会包含至少一部分的免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的。更多的细节可见Jones et al.，Nature，321：522-525(1986)；Riechmann et al.，Nature，332：323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2：593-596(1992)。
嵌合或人源化抗体可以基于如上制备的鼠单克隆抗体的序列来制备。可以从感兴趣的鼠源杂交瘤获得编码重链和轻链免疫球蛋白的DNA，并利用标准分子生物学技术加以工程改造以使其包含非鼠源(例如人的)免疫球蛋白序列。例如，为了创建嵌合抗体，可以将利用本领域已知的方法将鼠可变区连接到人恒定区(参见例如授予Cabilly等人的美国专利4,816,567)。为了创建人源化抗体，可以利用本领域已知的方法将鼠CDR区插入人框架(参见例如授予Winter的美国专利5,225,539；以及授予Queen等人的美国专利5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
本文中描述的单克隆抗体亦包括“人”抗体，其可以从诸多来源分离，包括例如来源于人患者的血液或利用转基因动物重组制备。此类转基因动物的例子包括
Figure BDA0001404238400000103
(Medarex，Inc.，Princeton，NJ)，其具有人重链转基因以及人轻链转染色体(见WO 02/43478)、
Figure BDA0001404238400000102
(Abgenix，Inc.，Fremont CA；描述于例如授予Kucherlapati等人的美国专利5,939,598；6,075,181；6,114,598；6,150,584和6,162,963)，以及
Figure BDA0001404238400000111
(Medarex，Inc.；描述于例如Taylor，L.et al.，NucleicAcids Research，20：6287-6295(1992)；Chen，J.et al.，International Immunology，5：647-656(1993)；Tuaillon et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：3720-3724(1993)；Choiet al.，Nature Genetics，4：117-123(1993)；Chen，J.et al.，EMBO J.，12：821-830(1993)；Tuaillon et al.，J.Immunol.，152：2912-2920(1994)；Taylor，L.et al.，International Immunology，6：579-591(1994)；和Fishwild，D.et al.，NatureBiotechnology，14：845-851(1996)；美国专利5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,789,650；5,877,397；5,661,016；5,814,318；5,874,299；5,770,429；和5,545,807；以及PCT公布号WO 92/03918，WO 93/12227，WO 94/25585，WO 97/13852，WO 98/24884，WO99/45962和WO 01/14424，Korman等人)。本发明的人单克隆抗体还可以利用SCID小鼠来制备，SCID小鼠中已经重建了人免疫细胞，以至于一旦免疫时可产生人抗体应答。这样的小鼠在例如授予Wilson等人的美国专利5,476,996和5,698,767中有描述。
III.含有感兴趣的蛋白质的混合物
本发明的方法可以适用于任何含有感兴趣的蛋白质的混合物。在一个实施方案中，所述混合物是从表达要纯化的蛋白质(例如天然表达或通过基因工程表达)的活细胞获得或者由这样的活细胞产生的。任选地，细胞培养物中的细胞包括用含有编码感兴趣的蛋白质的核酸的表达构建体转化的细胞。基因工程化细胞使其表达蛋白质的方法是本领域公知的。参见例如Ausubel等人编，Current Protocols in Molecular Biology，Wiley，NewYork(1990)；和美国专利5,534,615与4,816,567，上述文献均明确通过提述并入本申请。此类方法包括导入编码蛋白质和容许蛋白质表达的核酸到活的宿主细胞中。这些宿主细胞可以是细菌细胞、真菌细胞、昆虫细胞或者，优选地，养在培养物中的动物细胞。细菌宿主细胞包括，但不限于，大肠杆菌细胞。合适的大肠杆菌菌株的实例包括：HB101，DH5α，GM2929，JM109，KW251，NM538，NM539，以及任何不能切割外来DNA的大肠杆菌菌株。可以使用的真菌宿主细胞包括，但不限于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)、以及曲霉属(Aspergillus)细胞。可以使用的昆虫细胞包括，但不限于家蚕(Bombyx mori)、甘蓝夜蛾(Mamestra drassicae)、草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)、黑腹果蝇(Drosophilia melanogaster)。
有多种哺乳动物细胞系是表达感兴趣的蛋白质的合适的宿主细胞。哺乳动物宿主细胞系包括，例如，COS、PER.C6、TM4、VERO076、DXB11、MDCK、BRL-3A、W138、Hep G2、MMT、MRC5、FS4、CHO、293T、A431、3T3、CV-1、C3H10T1/2、Col0205、293、HeLa、L细胞、BHK、HL-60、FRhL-2、U937、HaK、Jurkat细胞、Rat2、BaF3、32D、FDCP-1、PC12、M1x、鼠骨髓瘤(例如SP2/0和NS0)和C2C12细胞，以及转化的灵长动物细胞系、杂交瘤、正常二倍体细胞、以及来源于原代组织和原代外植体的体外培养的细胞系。可以利用本领域技术人员熟知的方法建立新的动物细胞系(例如通过转化、病毒感染、和/或选择)。任何能够表达感兴趣的蛋白质的真核细胞均可在公开的细胞培养方法中使用。诸多细胞系可从商业来源如美国典型培养物保藏中心
Figure BDA0001404238400000121
获得。在本发明的一个实施方案中，细胞培养物，例如大规模细胞培养物，使用杂交瘤细胞。产生抗体的杂交瘤细胞的构建是本领域熟知的。在本发明的一个实施方案中，细胞培养，例如大规模细胞培养，利用CHO细胞来产生感兴趣的蛋白质例如抗体(参见例如WO94/11026)。诸多类型的CHO细胞在本领域是已知的，例如CHO-K1、CHO-DG44、CHO-DXB11、CHO/dhfr-和CHO-S。
在一个具体实施方案中，本发明的方法包括从含有高浓度的感兴趣的蛋白质(例如抗体)的混合物(例如细胞培养物、细胞裂解物或者经澄清化的粗料)有效地去除污染物。例如，感兴趣的蛋白质的浓度范围可以是约0.5至约50mg/ml(例如0.5、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45或50mg/ml)。
混合物的制备最先取决于蛋白质的表达方式。某些细胞系统直接将蛋白质(例如抗体)从细胞分泌到周围的生长培养基中，而其他细胞将抗体保留在胞内。对于胞内产生的蛋白质，可以使用多种方法中的任何一种，例如机械剪切、渗透休克、以及酶处理，来破坏细胞。破坏后细胞的全部内容物释放到匀浆中，并且产生亚细胞碎片，后者可以通过离心或过滤去除。直接分泌的蛋白质由于蛋白质生产过程中细胞的自然死亡和胞内宿主细胞蛋白质释放会有类似的问题，虽然程度轻些。
在一个实施方案中，从混合物去除细胞或细胞碎片，例如以制备经澄清化的粗料。本发明的方法可以利用任何方法学来去除细胞。如果蛋白质是胞内生成的，作为第一步，可以去除颗粒状碎片，其或是宿主细胞或是裂解片段，例如通过离心或过滤步骤去除，以制备一混合物，然后将其根据本文中描述的方法进行纯化(即从中纯化出感兴趣的蛋白质)。如果蛋白质是分泌到培养基中的，则可以通过，例如，离心、切向流过滤或深度过滤来从细胞培养基分离出重组宿主细胞，以制备一混合物，从中纯化出感兴趣的蛋白质。
IV.高pH(碱性)洗涤溶液
本发明的方法涉及将第一色谱基质(例如亲和色谱基质)与具有至少9.0的pH的碱性洗涤溶液接触。这样的碱性洗涤溶液不要求精氨酸或精氨酸缓冲液的存在。任选地，这样的碱性洗涤溶液可以或可以不包含非缓冲盐。
在特定的实施方案中，碱性缓冲溶液的pH是9到11之间。任选地，第一洗涤溶液的pH是约9.5到约10.5之间(例如9.5，9.6，9.7，9.8，9.9，10.0，10.1，10.2，10.3，10.4或10.5)。第一洗涤溶液的一种示例性pH是约9.6。第一缓冲溶液的另一示例性pH是约10.4。任选地，碱性洗涤溶液包含碳酸钠。任选地，碱性洗涤溶液包含氯化钠。在一个具体的实施方案中，碱性缓冲溶液包含浓度在约0.01-1.0M范围的碳酸钠，以及浓度在约0.5-2M范围的氯化钠，且具有约9.5到约10.5的pH。
任选地，所述方法还包括将第一色谱基质(例如亲和色谱基质)与第二碱性洗涤溶液接触。第二碱性洗涤溶液具有至少9.0的pH，并且不包含精氨酸或精氨酸衍生物。例如，第二碱性洗涤溶液包含浓度在约0.01-1.0M范围的碳酸钠。
在特定的实施方案中，在第一色谱纯化后，将混合物暴露于一种或多种其他的色谱基质。例如，所述一种或多种其他的色谱基质选自离子交换色谱(例如阴离子交换色谱或阳离子交换色谱)、疏水相互作用色谱、以及混合模式色谱。
本公开由下述的实施例进一步说明，这些实施例不应解释为进一步限定。将所有附图和本申请全文中引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请明确地通过提述整体并入本申请。
实施例1
介绍
由于临床的需要，当前有多种单克隆抗体在进行其作为治疗剂应用的开发。面对市场竞争，生物制药公司不断在寻求加速开发时间线并创建更高效的前临床和临床制造过程。一个途径是改良和精简纯化方案来满足所需的产品规格。为此原因，使每个单元操作的杂质清除率最大化是可取的[1，4]。然而，纯化进料流含有多种对于去除而言关键、但可能难以去除的杂质，包括宿主细胞蛋白质、DNA、外来的和内源的病毒、内毒素、以及聚集物。产业上的纯化开发密切追踪这些产品质量属性，并且具有明确限定的产品验收标准的一般指南(表1)[2，3，4]。理想地，一个多阶段纯化方案中的每个单元操作应当在整体产品质量中占据一个指定的角色，因为多余的纯化步骤往往会往往会降低蛋白回收率，并增加操作时间和成本。尽管如此，为了保证过程的鲁棒性，杂质清除往往要求大规模的纯化方案和正交方法。
亲和分离是选择性最高的色谱，因为其是基于mAb与共价偶联于基质的配体之间可逆的、高度特异性的相互作用而进行的[1，4，16]。利用蛋白A的亲和色谱常常是下游纯化方案的关键选择，因为其可以从单克隆抗体进料流中去除超过98％的杂质[1，5]。然而，利用蛋白A的过程经常仍需要两到三个后续的色谱精细纯化步骤[2，3]。进一步的，亲和色谱是下游加工中最昂贵的单元操作之一[15]。由于这些原因，开发工作往往聚焦于使利用蛋白A的亲和捕捉色谱的杂质清除最大化。
因此，在改进杂质清除的驱动下，对亲和色谱性能的优化一直是人们高度的兴趣所在。在过去二十多年中，增强的洗脱前洗涤(enhanced pre-elution washes)的开发已经被应用到蛋白A亲和色谱。几个方面的证据已经显示，添加盐、有机溶剂、非离子型表面活性剂、离液剂、疏水性修饰剂、以及氨基酸，均已显示可减少洗脱的IgG中的HCP含量和聚集体含量[1，6，7，18，19]。虽然它们有前景，但对它们的对抗体的总体作用的表征很少乃至没有。在本研究中，申请人测试了在亲和色谱过程中利用碱性洗涤来改善杂质清除这一非常规的策略。申请人报道了施加pH 9.6和10.4的碱性预洗脱的应用，并使用了一系列分析技术来表征被洗脱的抗体的状态和质量。这些分析包括SEC-UPLC、IEF、CE-SDS、SEC-MALS、结合ELISA、差示扫描量热、圆二色谱法、CHO-HCP ELISA、DNA和残余ProA。
“基线”ProA捕捉过程(图1)利用通常被认为是工业标准的过程，其中所有色谱缓冲液的pH比mAb的等电点低1个或更多个单位。结合和洗涤步骤在中性pH下进行，产品在酸性pH下洗脱[3，5，6]。这里，通过建立一种独特的“碱性pH洗涤策略”(图1)，使基线捕捉步骤更为高效。在结合之后，实施碱性pH洗涤。然后用中性pH的缓冲液洗涤mAb，并如基线过程中一样洗脱。
通过实施碱性pH洗涤策略，令纯化方案更加高效，使得省略另一精细纯化步骤成为可能。对实施该策略的一个担忧是，碱性pH条件的使用可能与产品的不稳定性，例如脱酰胺、蛋白质去折叠、以及聚合物形成等相关[3，8]。将3种不同产品的基线色谱过程与利用高pH洗涤的捕捉过程相比较之后，未观察到理论上的产品不稳定性。此外，实施碱性pH洗涤对于去除产品相关的杂质特别有效。这里我们描述了一种非常规的策略，其利用碱性pH洗涤减少了一个必需的过程步骤，从而实现了更高效、成本节约的过程。
表1
本研究中使用的重要质量属性和公认验收标准
Figure BDA0001404238400000151
材料和方法
细胞培养物
使用来自含有全人单克隆抗体的中华仓鼠卵巢(CHO)细胞的细胞培养物上清。mAb1是一种IgG4型分子，pI为7.6；mAb2是IgGl分子，pI为8.4；mAb3为IgG1，pI为9.2。
色谱
所有捕捉色谱实验均使用GE Healthcare的MabSelect树脂。利用由Unicorn 6.3软件控制的
Figure BDA0001404238400000163
Avant instrument(GE Lifesciences)。所有柱子均在实验室中根据树脂制造商的推荐方案装填。
基线ProA捕捉和洗涤添加筛选
在上样施加(load application)之后，先用PBS，pH7.4，再用5mM琥珀酸，pH5.8洗涤柱子。使用10mM磷酸，pH3.0的缓冲液将mAb从柱上洗脱。为了评价添加洗脱添加剂的色谱性能，在第一次和第二次洗涤之间插入一次额外的可变洗涤。所测试的可变洗涤包括20mM琥珀酸500mM NaCl、500mM L-精氨酸pH5.8、20mM琥珀酸0.1％Triton X-100pH 5.8、20mM琥珀酸5％PEG400pH 5.8、和17mM磷酸钠4％辛酸pH 7.4。
利用高pH洗涤策略的ProA捕捉
在上样施加之后，先用PBS，pH7.4缓冲液洗涤柱子，然后再用200mM碳酸钠，1M氯化钠缓冲液，pH 9.6或10.4进行第二个洗涤步骤。第二个洗涤步骤之后是用100mM碳酸钠缓冲液，pH 9.6或10.4的第三个洗涤步骤，之后是用35mM磷酸钠，pH 6.0缓冲液进行的第四个洗涤步骤。使用10mM磷酸，pH3.0缓冲液从柱上洗脱mAb。
病毒灭活、中和及过滤
洗脱之后，将来自亲和色谱的合并的产品进行低pH病毒灭活，具体地说是利用0.1N HCl调整到低pH(3.4至3.6)，然后保持1小时。然后使用2M Tris将产品中和(7.0至7.4)。在中和之后将合并的产品用0.2μM滤器过滤。
ELISA-CHO宿主细胞蛋白分析
利用
Figure BDA0001404238400000162
液体操作系统，以高通量方式进行对残余CHO宿主细胞蛋白质(CHO-HCP)的定量的ELISA。利用CHO宿主细胞蛋白第三代试剂盒(批号F550，CygnusTechnologies，Southport，NC)，根据制造商的规程定量样品中宿主细胞蛋白的水平。使用
Figure BDA0001404238400000161
Infinite M1000 Pro读数仪测量450/650nm的吸收值。
残余DNA分析
利用实时定量PCR(RT-PCR)来确定样品中的残余CHO-DNA的水平。RT-PCR使用MyiQ单色实时PCR检测系统(Bio-Rad Lab.，Hercules，CA，USA)根据制造商的说明进行，使用
Figure BDA0001404238400000171
绿色PCR主预混物(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA)。
残余蛋白A分析
利用
Figure BDA0001404238400000172
液体操作系统，以高通量方式进行对残余蛋白A(rProA)的定量的ELISA。使用残余蛋白A试剂盒(批号9333-1，Repligen)，根据制造商的规程定量残余蛋白A。使用
Figure BDA0001404238400000173
Infinite M1000 Pro读数仪测量450/650nm的吸收值。
圆二色性
用配备自动调温的六室切换器的Jasco J-815 CD分光光度计采集圆二色谱。将mAb样品用它们相应的缓冲液稀释到0.25mg/mL，在25℃下、1.0mm光径的石英小室中采集260至195nm的光谱。用SpectraManager软件(Jasco)处理数据，将经缓冲液校正的光谱对平均残基椭圆率(基于每种mAb的实验肽浓度、MW和氨基酸数)归一化。
差示扫描量热
为了确认热稳定性特征，对来自每一批次的mAb进行DSC。将各样品在其相应的缓冲液中归一化为0.75mg/mL。在
Figure BDA0001404238400000174
毛细管DSC上进行扫描，10-100℃变温，变温速率为90℃/hr。从样品信号减去单独缓冲液的扫描特征，使用
Figure BDA0001404238400000175
Origin 7.0分析软件将数据拟合为非2态模型，以获得变性中点(Tm)值。
SE-UPLC
在利用每种捕捉策略实施纯化后，利用大小排阻色谱来评估mAb纯度，大小排阻色谱使用Waters产的Acquity H-Class Bio
Figure BDA0001404238400000176
使用Acquity
Figure BDA0001404238400000177
BEH200 SEC 1.7μm柱(4.6x150mm)来实施该测定，流动相的组成为PBS pH 6.8，以1mL/min的流速运行。在运行全程中柱子保持在25℃。
SEC-MALS
用大小排阻色谱偶联在线多角度光散射检测器(SEC-MALS)来检查mAb。用连接在Prominence Shimadzu UFLC上的Shodex PROTEIN KW-803柱进行等度分离，缓冲液含200mM磷酸钾、150mM氯化钠、pH 6.8，且含有0.02％叠氮化钠，流速为0.5mL/min。用SIL-20ACProminence Shimadzu自动进样器将50μg的样品注射到柱上，从串联的三个在线检测器获取数据：一个Prominence SPD-20AD二极管阵列UV/可见分光光度计，然后是一个WyattminiDAWN
Figure BDA0001404238400000181
多角度光散射检测器，继而是一个Wyatt
Figure BDA0001404238400000182
T-REX折射率检测器。用Astra(Wyatt)和Labsolutions(Shimadzu)软件采集数据。直接报告获取的大小变体的分子量和百分比，并由专业分析员汇总为可比较的或不可比较的。
iCIEF
实施毛细管等点聚焦结合全柱成像(iCIEF)来查明mAb等电点(pI)同型和降解体(degradants)的相对丰度的分布。样品pI分布分为三个分区来报告：酸性基团、主峰、和碱性基团，与每个实验中参考标准品的pI分布比较。包括了pI标记物(6.14和9.46)，并用于校准每次注射中的pI值。从每个电泳图计算相对丰度，具体而言是对来源于样品的峰下面积级分，并将每个分区中的峰的总数表示为总面积级分的分数(％面积)。
CE-SDS
在注满含有SDS的凝胶的毛细管中进行毛细管电泳，以测量mAb相关的蛋白质种类(亚单位、污染物和降解体)相对丰度的分子量(MW)分布。各蛋白质基于其大小和电泳迁移率被分开。该方法利用总长度为30cm、有效长度20cm、定点检测214nm吸收的毛细管(50μmID)。针对存在于每个样品中的内标(10kDa)，校准注射内相对迁移时间(within-injectionrelative migration time)。计算来了相对迁移时间和校正的峰面积，并与定标参比标准品(bracketing reference standard)注射相比较。在还原和非还原条件下分别评估CE-SDS分布的相对丰度。
结合ELISA
用0.5-2.0μg/mL的抗原包被微孔板。用0.05％PBST洗涤平板，然后封闭。然后再次洗涤平板，加入12种不同浓度的mAb并温育。洗涤之后，加入HRP缀合的第二抗体。在温育之后，洗涤平板并加入TMB底物。在酶标仪(Tecan Infinite M1000 Pro)上测量450nm及650nm的信号。将结合曲线与参考材料比较，以确定百分比结合能力。
溶解度作图(solubility mapping)
为了测试在每种被测试的洗涤缓冲液中的溶解度，利用脱盐平板(ThermoScientific，批号89808)根据制造商的规程以高通量方式对mAb进行缓冲液交换。在缓冲液交换之后，将mAb在19-25℃温育24小时，如上所述通过SE-UPLC评估溶解度。
胰蛋白酶肽作图LC/MS
将抗体样品还原、烷基化、并用胰蛋白酶消化。将胰蛋白酶肽在C-18柱(WatersBEH C18，1.7u 2.1*100mm 130A)上分离，用UV检测器在215nm和280nm检测，然后用质谱仪(LTQ-Orbitrap-Elite)检测。通过将选定的离子色谱图中完整肽的峰面积与修饰肽的峰面积比较来进行相对定量。
结果和讨论
为了评估亲和色谱过程中pH 9.6和10.4碱性洗涤的用处，检查了过程和产品质量属性。通过分析CHO-HCP、CHO-DNA和rProA检查杂质清除。利用SE-HPLC、iCIEF、CE-SDS和SEC-MALS检查纯度特征。使用结合ELISA、CD、DSC、完整质量、N-末端肽作图来检查分子的功能和结构完整性。利用高pH洗涤纯化产品，基线洗涤得到的回收率可比。对于mAb1，回收率为90％至99％，mAb 2回收率84％至90％，mAb3回收率93％至97％。
杂质清除
为了最大化亲和色谱过程中的杂质清除，申请人首先审视了洗涤pH对CHO-HCP清除的影响。传统上，对于蛋白A色谱，在上样施加和驱赶(chase)之后，在洗脱之前施加pH转变洗涤。转变洗涤的目的是降低pH并准备好树脂以供洗脱。这里，申请人在二者之间增加了范围从pH7.0到10.4的额外洗涤，使用与驱赶步骤同样的电导率，以定义出有助于HCP清除的pH范围。图2显示，随着洗涤pH的增加，洗脱物中的CHO-HCP水平降低。根据这些结果，最好的杂质清除在pH9.0以上观察到，而且在测试的最高pH(10.4)洗涤最为有效。为了确认这些结果，并且确定该现象并非对单克隆抗体特异的，用pH9.6和10.4的洗涤进行了三种不同mAb的纯化。这里的研究显示，在亲和捕捉过程中使用碱性pH洗涤策略可有效地去除mAb进料中的CHO宿主细胞蛋白质。在亲和捕捉色谱的过程中使用碱性洗涤，可以在当mAb结合在柱上时改变mAb、ProA配体、以及CHO-HCP蛋白质表面的静电性质，由此破坏产品/杂质和/或杂质/树脂的相互作用。在亲和色谱的过程中，CHO-HCP可能结合于mAb，结合于基质(basematrix)，或者结合于proA配体。有证据表明HCP与mAb的相互作用是占主导地位的机理[6，9，12]。然而，同样清楚的是，HCP的某些部分可能与基质本身[1，2，6]或者与proA配体[12，17]相互作用。例如，在两种不同的pH下从亲和树脂上洗脱可导致两个显著不同的洗脱物HCP水平[10，11，12]。无论HCP与mAb、基质还是proA相互作用，在极高pH下破坏蛋白质-蛋白质相互作用都显示出非常有效。产品-杂质相互作用主要是静电性的，而Mab与配体的结合更强。蛋白A与抗体的结合主要是通过诱导配合(induced fitting)，结合能量的大部分来自疏水相互作用，具有四个稳定化的氢键[20，21]。此外，范德华力、疏水相互作用和静电力等相互作用也对蛋白A-Mab结合有贡献[13]。这里的数据提示，当结合于树脂时，可以使用高pH洗涤来选择性地破坏杂质与mAb之间的相互作用和/或杂质与树脂的相互作用。
如图3所示，对于所有的分子，使用碱性洗涤与基线条件相比均显著提高了CHO-HCP清除。利用碱性洗涤，CHO-HCP清除对于mAb1而言增加到～2-3倍，对于mAb2增加到～6至13倍，对于mAb 3增加到～17至23倍。无论mAb的亚类为何，均观察到CHO-HCP清除的增加。基于这些结果，申请人选择考察在pH 9.6和10.4进行的碱性洗涤，以便接下来在旨在查明洗涤对产品质量的影响的研究中使用。
蛋白A色谱还可以将宿主细胞DNA清除4-5个log值[2]。不奇怪的是，观察到当使用高pH洗涤时，洗脱物中DNA的水平大大降低。如图4所示，对于所有分子，与基线条件相比，使用碱性pH洗涤时，洗脱物中CHO-DNA清除水平显著降低。使用碱性pH洗涤，mAb 1的CHO-DNA水平降低～5至19倍，mAb 2降低～209至490倍，mAb 3降低～627至1913倍。在亲和捕获过程中使用高pH洗涤增强的DNA清除，减少了单独的DNA去除步骤例如阴离子交换色谱的重要性。
另外，监测残留蛋白A以评估碱性pH洗涤对蛋白A色谱的影响。蛋白A浸出的机理仍有待确定。亲和色谱过程中的pH循环可能导致琼脂糖基质中糖苷键的化学断裂，导致ProA与mAb共洗脱。如果游离ProA与树脂上的IgG非特异性和非共价结合，则这将是明显的[4]。申请人发现使用高pH洗涤策略时，ProA的浸出量为25～450ppm。这一水平的ProA浸出量通常被认为是低的，对我们的过程而言是可以接受的。然而，浸出对树脂循环的影响尚需研究。此外，观察到残留的ProA在随后的病毒灭活步骤过程中被清除。虽然该提高的ProA浸出水平仍然相当低，并且相对容易除去，但是可以探索许多途径来防止ProA浸出，首先是使用碱稳定树脂，如MabSelect Sure。此外，申请人已经观察到，当用纯化产品作为进料时，浸出不明显。由此可见，进料中的杂质，例如在较高pH下活性较高的蛋白酶，也可能是增加ProA浸出量的原因。事实上，有几篇参考文献支持该观点[2]。在这种情况下，一种解决办法是在进料中加入蛋白酶抑制剂。如图5所示，观察到更高水平的rProA浸出，其被随后的病毒灭活和过滤步骤有效地清除。
因此，在亲和色谱过程中使用碱性pH洗涤能够将如表1所示的所有分子的杂质清除到可接受的水平。在单一步骤中提高清除水平提高了工艺鲁棒性，并且为省略随后用于去除这些杂质的精细纯化步骤提供了可能。
产品纯度
使用SE-UPLC，iCIEF，CE-SDS和SEC-MALS检查纯度特征。如表2所示，SE-UPLC分析表明，对于所有测试的三种mAb，使用碱性pH洗涤将产品纯度提高超过百分之一。使用iCIEF的产品质量分析表明，酸性或碱性物质水平没有由于使用碱性pH洗涤而提高，分子的pI未变化。申请人在使用碱性pH洗涤测试的任何mAb中未观察到脱酰胺化。通过还原型和非还原型CE-SDS测量的总体纯度与基线条件相比没有显示显著差异。
Figure BDA0001404238400000221
在捕获色谱过程中在使用大量碱性pH洗涤后mAbs的功能和结构完整性得以维持
虽然mAb是相对稳定的蛋白质，并且是药物的理想候选物，但它们可能容易受到化学和物理变化，例如药用物质和药品制造过程中的降解和损伤的影响。因为我们的过程策略包括碱性pH洗涤，进行了研究来评估每种mAb的物理化学和结构完整性。通过圆二色性未检测到二级结构身份或含量的差异。熔点——mAbs折叠程度的另一种量度——也未受影响。此外，ELISA结合活性(正确折叠的一种量度)表明碱性pH洗涤未影响mAb的折叠、活性和总体功能。通过等电聚焦或通过胰蛋白酶肽图谱LC/MS，未观察到使用高pH洗涤的mAb在电荷变体、氧化或脱酰胺方面的不同。
多角度光散射
对于每组mAb样品，使用碱性pH洗涤产生两个样品，并使用基线方法制备另外两个样品。作为对照，将基线样品缓冲液交换以制得与使用碱性pH洗涤产生的两个样品相同的缓冲液物质的样品。结果表明，所有样品中的聚集均小于1％。检测到的聚集体的低聚状态只有微小的差异。每个样品的主峰的分子量值在仪器的误差范围内。
表3
SEC-MALS分析
Figure BDA0001404238400000231
Figure BDA0001404238400000241
结合ELISA
结合ELISA检测分子与其特异性受体结合的能力，并且与正确折叠的单克隆抗体直接相关。结合ELISA数据表明，无论洗涤策略如何，所有mAb都具有与参考标准品相似的结合。这表明碱性pH洗涤对分子的三级结构没有显著影响。
表4
结合ELISA
Figure BDA0001404238400000242
DSC
差示扫描量热法(DSC)是一种可以指示mAb的结构性质的生物物理学技术，因为部分变性的mAb将显示比正确折叠时更低的熔解温度。测量使用碱性pH洗涤以及基线方案纯化的各种mAb的DSC，以了解洗涤对抗体熔点的影响。
如表5所示，对于每组mAb样品，前两个样品是使用碱性pH洗涤产生的，最后两个样品是使用基线方法制备的。样品3、7和11自基线方案进行了缓冲液交换，以制得与使用碱性pH洗涤产生的两种样品相同的缓冲液种类的样品。对样品进行缓冲液交换以控除缓冲液对DSC的影响。
结果表明，样品4Tm值比来自相同mAb组的其它分子低1℃。如图6所示，Tonset也似乎向下偏移，表示对缓冲液或过程的敏感性。由于缓冲液交换样品(样品3)Tm值类似于碱性pH洗涤样品(样品1和2)，可以推断该样品的Tm变化是由于样品缓冲液组成对DSC的影响。因此，对于mAb 1，碱性pH洗涤对Tm没有显著影响。对于mAb 2，在Tm1或Tm2值中没有观察到显著差异，表明不同的洗涤条件不影响该样品的熔点。与mAb 1类似，mAb 3的样品12的Tm比其他条件有些降低，可能表明在该缓冲液条件或过程中的稳定性稍低。缓冲液交换的样品(样品11)的Tm值与碱性pH洗涤样品(样品9和10)类似，由此可见样品的Tm变化是由于样品缓冲液组成对DSC的影响所致。因此，对于mAb 3，碱性pH洗涤对Tm没有显著影响。
表5
差示扫描量热
Figure BDA0001404238400000251
Figure BDA0001404238400000261
圆二色性
使用远紫外圆二色性(CD)光谱来表征使用两种方法纯化的三种mAb的二级结构。在波长为260nm和195nm之间评估各种条件下的CD光谱参考标准品和mAb。使用基于每个mAb的氨基酸序列计算出的分子量和氨基酸残基数，将CD信号从毫度转换为平均残基椭圆率。远紫外光谱表明，mAb 1在217和229nm有最小值，mAb 2在217-218nm有最小值，mAb3在217-218nm有最小值。mAb1的平均残基椭圆率在217nm处为-3128±358度cm2dmol-1残基-1(4个条件的平均±标准偏差)，在229nm处为-1738±204度cm2dmol-1残基-1。mAb2的平均残基椭圆率在217nm处为-3477±454度cm2dmol-1残基-1。mAb3的平均残基椭圆率在217nm处为-3392±83度cm2dmol-1残基-1。无论用于纯化mAb的方案如何，每种mAb的最小值和光谱形状得以维持。在CD光谱的形状和强度方面的定性的相似性表明，碱性pH洗涤策略不影响被研究的mAb的二级结构。尽管mAb之间存在差异，但是对于每种单独的mAb，在所有测试的洗涤条件下，CD光谱在定性上是相似的。所有样品的光谱与β片层含量一致。
胰蛋白酶图谱LC/MS
将来自三个过程的药物物质加以还原、烷基化，并用胰蛋白酶消化。将胰蛋白酶肽在C-18柱上分离，并利用UV检测器在215和280nms进行检测，然后用质谱仪(LTQ-Orbitrap-Elite)检测。通过比较在选定的离子色谱图中完整肽以及修饰的肽的峰面积来实现相对定量。通过重链中的指示物肽的氧化产物的峰面积百分比来监测氧化，并通过重链中另一种指示物肽的四种脱酰氨基化产物的峰面积百分比来监测脱酰胺度。在所有三种mAb中，氧化和脱酰胺的水平在基线样品和碱性pH样品中都是相当的。
表6
胰蛋白酶肽作图LC/MS
Figure BDA0001404238400000271
在pH 9.6至10.4下使用碱性洗涤的策略之所以成为可能，其一部分原因是配体-受体结合为一种强相互作用，可将mAb保持为其适当的构象，并可保护其免受变性和其他损害。测得的抗体/抗原结合的亲和常数的范围从低于105M-1到高于1012M-1[13]，对于蛋白A配体，Fcγ在中性pH和室温下为107-108[14]。配体与受体的结合会使mAb的结构处于比配体未与受体结合时的mAb结构更低能量的状态。因此，当处于结合状态时，mAb更远离变性的过渡状态并被保护。尽管mAb在与配体结合时处于更稳定的状态，申请人还研究了在没有配体存在时，当mAb暴露于碱性pH缓冲液时，mAb聚集的可能性(表7)。在室温下温育24小时后，单体含量没有变化，表明在这些条件下未结合的mAb是稳定的。
Figure BDA0001404238400000291
增加杂质清除的替代策略包括在捕获过程中在洗涤中使用添加剂，如盐、有机溶剂、非离子表面活性剂、离液剂、疏水改性剂和氨基酸[6，7]。图6显示碱性pH洗涤策略是使用洗涤步骤减少CHO-HCP的最有效方法之一。此外，碱性pH洗涤策略不使用可能需要随后清除和监测的添加剂。还有可能在碱性pH洗涤缓冲液中包含添加剂以进一步增强杂质清除率。
Shukla等人已经表明在捕获过程中在洗涤液中加入精氨酸是减少洗脱液中杂质的有效途径[6]。进行了比较使用具有和不具有精氨酸的碱性pH洗涤时的杂质去除的研究(表8)。结果表明在碱性洗涤液中加入精氨酸没有实现额外的清除。
表8
使用碱性pH策略和精氨酸洗涤策略纯化的mAb的产品和过程质量的比较
Figure BDA0001404238400000301
碱性pH洗涤策略的实施可以免去mAb纯化方案中额外的精细纯化步骤的需要
大多数纯化方法利用2-3个精细纯化色谱步骤来满足工业质量标准。虽然杂质清除的正交方法可以提高过程的鲁棒性，但制造经济学驱使工艺开发者创建简化的流程。在这里，申请人证明，在亲和色谱过程中，可以将洗涤步骤变得越来越有效，这使得省略一个或多个精细纯化步骤成为可能。表9说明，在捕获色谱法中使用高pH洗涤可使杂质清除率达到不需要CEX精细纯化步骤的程度。通过利用亲和色谱中结合的广泛性，申请人证实了可以使用较激烈的pH洗涤来提高杂质清除率。
Figure BDA0001404238400000321
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等同方案
本领域技术人员在使用不超过例行实验的条件下，将认识到或者能够确定本文中描述的本发明具体实施方案的诸多等同方案。下面的权利要求书意图涵盖这些等同方案。
提述并入
通过提述并入本文中援引的全部专利、待审批专利申请、以及其他出版物的全部内容。

Claims (15)

1.一种从包含感兴趣的蛋白质和一种或多种污染物的混合物中纯化感兴趣的蛋白质的方法，其中所述混合物是哺乳动物细胞培养物，所述方法包括：
a)将所述混合物暴露于第一色谱基质，其中所述感兴趣的蛋白质与第一色谱基质结合，且其中所述第一色谱是亲和色谱；
b)使第一色谱基质与pH为9.6-10.4、并且不包含精氨酸或精氨酸衍生物的第一洗涤溶液接触；
c)在所述第一洗涤溶液之后，使所述第一色谱基质与pH为至少9.0、并且不包含精氨酸或精氨酸衍生物的第二洗涤溶液接触；和
d)将感兴趣的蛋白质从第一色谱基质洗脱到洗脱溶液中，
其中所述亲和色谱是蛋白A亲和色谱。
2.权利要求1的方法，其中所述污染物选自宿主细胞蛋白、宿主细胞代谢物、宿主细胞组成型蛋白、核酸、内毒素、病毒、产品相关污染物、脂质、培养基添加剂和培养基衍生物。
3.权利要求1的方法，其中所述感兴趣的蛋白质选自抗体、抗体片段和Fc融合蛋白。
4.权利要求3的方法，其中所述抗体是单克隆抗体。
5.权利要求4的方法，其中所述单克隆抗体选自人抗体、人源化抗体、和嵌合抗体。
6.权利要求1所述的方法，其中所述第一洗涤溶液的pH为9.6。
7.权利要求1的方法，其中所述第一洗涤溶液的pH为10.4。
8.权利要求1的方法，还包括在所述第二洗涤溶液之后，使所述第一色谱基质与pH为6至7之间、并且不包含精氨酸或精氨酸衍生物的第三洗涤溶液接触。
9.权利要求1的方法，其中所述第一洗涤溶液包含浓度在0.01-1.0M范围内的碳酸钠和浓度在0.5-2M范围内的氯化钠。
10.权利要求1的方法，其中所述第二洗涤溶液包含浓度在0.01-1.0M范围内的碳酸钠。
11.权利要求1的方法，其中所述混合物被暴露于一种或多种另外的色谱基质。
12.权利要求11的方法，其中所述一种或多种另外的色谱基质选自离子交换色谱、疏水相互作用色谱和混合模式色谱。
13.权利要求11的方法，其中所述一种或多种另外的色谱基质为阴离子交换色谱或阳离子交换色谱。
14.权利要求1的方法，其中所述混合物选自收获的细胞培养液、细胞培养上清液、和条件化的细胞培养物上清液、细胞裂解物、和经澄清化的粗料。
15.权利要求1的方法，其中所述哺乳动物细胞培养物是中华仓鼠卵巢(CHO)细胞培养物。
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