CN107586809A - 一种生物催化合成大豆低聚糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生物催化合成大豆低聚糖的方法，本发明通过建立由蔗糖合成酶、尿苷二磷酸葡萄糖4‑差向异构酶、肌醇半乳糖苷合成酶、棉子糖合成酶、水苏糖合成酶组成的体外多酶级联反应体系，以蔗糖为底物合成肌醇半乳糖苷、棉子糖和水苏糖中单一组分或者混合组分，该方法实现了二磷酸尿苷和肌醇的循环利用转化，体系中所添加粗酶液中含有少量的二磷酸尿苷，可以避免昂贵的二磷酸尿苷；本发明肌醇半乳糖苷产量达到50g/L，转化率为70％，棉子糖达到20g/L，水苏糖产量达到10g/L，所得到的肌醇半乳糖苷、棉子糖或者水苏糖可用于食品和医药等领域，本发明对于蔗糖以及富含蔗糖的生物质高附件值利用有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及生物催化领域，具体涉及体外多酶级联催化蔗糖转化为大豆低聚糖的方法。
背景技术
大豆低聚糖是大豆中可溶性糖质的总称。主要成分是指单糖数为3～4的蔗糖(双糖)、棉子糖(三糖)和水苏糖(四糖)等，是一种低甜度、低热量的甜味剂，能替代蔗糖应用在功能性食品或低能量食品中；具有改善肠道菌群平衡，防治便秘；抑制肠道有害物质的产生；降低血清胆固醇和血脂的浓度；增强机体免疫能力，抑制肿瘤细胞生长；促进肠道内营养物质的生成与吸收和保护肝脏的作用等。大豆寡糖在大肠中发酵或部分发酵，产生短链脂肪酸，后者可以促进结肠细胞的代谢、生长、分化；为肠黏膜上皮细胞及肌肉、肾、心、脑提供能量，影响肝脂质与碳水化合物的调控等；可降低大肠中的pH值，抑制致病菌的生长、繁殖，减少结肠癌发病率。
大豆低聚糖广泛存在于大豆等豆科作物种子中，在成熟大豆中的含量最高，约占大豆总质量的10％，不同国家的大豆中寡糖组成也各不相同。目前商品化大豆低聚糖的来源是植物提取法，从大豆种子中直接提取，然而植物提取法的提取得率较低，并且很难获得纯度高的单一大豆低聚糖，致使纯的肌醇半乳糖苷、棉子糖或者水苏糖售价很高，因此，亟待开发一种低成本、低污染的制备纯度高的大豆低聚糖的新方法。目前国内外专利主要集中在大豆低聚糖的提取工艺(US20160264957，W0/2015/068769A1，201110060048.8)，本专利提出一种酶法催化转化蔗糖合成大豆低聚糖(肌醇半乳糖苷、棉子糖、水苏糖)的方法，对于蔗糖以及富含蔗糖的生物质高附件值利用以及高纯度大豆低聚糖的生物合成有重要意义。
发明内容
本发明第一个目的是提供一种制备大豆低聚糖的方法，其特征在于，以蔗糖和肌醇为底物通过多酶体外级联反应合成大豆低聚糖。
在优选的实施方式中，所述的制备大豆低聚糖的方法，其特征在于，所述大豆低聚糖为肌醇半乳糖苷。
在更优选的实施方式中，所述的制备大豆低聚糖的方法，其特征在于，所述多酶包括蔗糖合成酶，尿苷二磷酸葡萄糖4-差向异构酶和肌醇半乳糖苷合成酶。
在最优选的实施方式中，所述的制备大豆低聚糖的方法，其特征在于，体外级联反应体系包括，所述蔗糖为1-150g/L，所述肌醇为1-150g/L，所述蔗糖合成酶为0.1-100U/mL，所述尿苷二磷酸葡萄糖4-差向异构酶为0.1-100U/mL，所述肌醇半乳糖苷合成酶为0.1-100U/mL，体外级联反应的条件为：20℃-37℃，缓冲液pH为6-8，反应1-48小时。
在具体实施方式中，所述的制备大豆低聚糖的方法，其特征在于，体外级联反应体系包括，所述蔗糖为136g/L，所述肌醇为36g/L，所述蔗糖合成酶为4U/mL，所述尿苷二磷酸葡萄糖4-差向异构酶为4U/mL，所述肌醇半乳糖苷合成酶为4U/mL，体外级联反应的条件为：37℃，缓冲液pH为7.2，反应24小时。
在优选的实施方式中，所述的制备大豆低聚糖的方法，其特征在于，所述的大豆低聚糖为棉籽糖。
在更优选的实施方式中，所述的制备大豆低聚糖的方法，其特征在于，所述的多酶包括蔗糖合成酶、尿苷二磷酸葡萄糖4-差向异构酶、肌醇半乳糖苷合成酶和棉子糖合成酶。
在最优选的实施方式中，所述的制备大豆低聚糖的方法，其特征在于，体外级联反应体系包括，所述底物蔗糖为1-150g/L，所述肌醇为1-5g/L，所述蔗糖合成酶为0.1-100U/mL，所述尿苷二磷酸葡萄糖4-差向异构酶为0.1-100U/mL，所述肌醇半乳糖苷合成酶为0.1-100U/mL，棉子糖合成酶为0.1-100U/mL，体外级联反应条件为：20℃-37℃，缓冲液pH为6-8，反应1-48小时。
在具体实施方式中，所述的制备大豆低聚糖的方法，其特征在于，体外级联反应体系包括，所述底物蔗糖为136g/L，所述肌醇为4g/L，所述蔗糖合成酶为4U/mL，所述尿苷二磷酸葡萄糖4-差向异构酶为4U/mL，所述肌醇半乳糖苷合成酶为4U/mL，棉子糖合成酶为4U/mL，体外级联反应条件为：37℃，缓冲液pH为7.2，反应24小时。
在优选的实施方式中，所述的制备大豆低聚糖的方法，其特征在于，所述的大豆低聚糖为水苏糖。
在更优选的实施方式中，所述的制备大豆低聚糖的方法，其特征在于，所述的多酶包括蔗糖合成酶、尿苷二磷酸葡萄糖4-差向异构酶、肌醇半乳糖苷合成酶、棉子糖合成酶和水苏糖合成酶。
在最优选的实施方式中，所述的制备大豆低聚糖的方法，其特征在于，体外级联反应体系包括，所述底物蔗糖为1-150g/L，所述肌醇为1-5g/L，所述蔗糖合成酶为0.1-100U/mL，所述尿苷二磷酸葡萄糖4-差向异构酶为0.1-100U/mL，所述肌醇半乳糖苷合成酶为0.1-100U/mL，棉子糖合成酶为0.1-100U/mL，水苏糖合成酶为0.1-100U/mL，体外级联反应条件为：20℃-37℃，缓冲液pH为6-8，反应1-48小时。
在具体实施方式中，所述的制备大豆低聚糖的方法，其特征在于，体外级联反应体系包括，所述底物蔗糖为136g/L，所述肌醇为4g/L，所述蔗糖合成酶为4U/mL，所述尿苷二磷酸葡萄糖4-差向异构酶为4U/mL，所述肌醇半乳糖苷合成酶为4U/mL，棉子糖合成酶为4U/mL，水苏糖合成酶为4U/mL，体外级联反应条件为：37℃，缓冲液pH为7.2，反应24小时。
本发明提供一种肌醇半乳糖苷的制备方法，具体是通过体外多酶级联催化蔗糖生产肌醇半乳糖苷，反应过程如图1所示，蔗糖和二磷酸尿苷(Uridine diphosphate，UDP)经蔗糖合成酶催化合成UDP-葡萄糖，后者经尿苷二磷酸葡萄糖4-差向异构酶催化合成UDP-半乳糖，UDP-半乳糖和肌醇在肌醇半乳糖苷合成酶的作用下合成肌醇半乳糖苷和UDP，该方法可以实现二磷酸尿苷的循环转化，具有成本低、无污染等优点。具体包括以下步骤：
以蔗糖和肌醇为底物，向反应体系中加入蔗糖合成酶、尿苷二磷酸葡萄糖4-差向异构酶、肌醇半乳糖合成酶，建立多酶催化体系，进行酶催化反应，即得。
所述多酶催化反应体系中，底物蔗糖的添加量为1-150g/L，肌醇的添加量为1-150g/L，所述蔗糖合成酶的添加量为0.1-100U/mL，所述尿苷二磷酸葡萄糖4-差向异构酶的添加量为0.1-100U/mL，所述肌醇半乳糖苷合成酶的添加量为0.1-100U/mL，所述的酶催化反应条件为：20℃-37℃，反应1-48小时，优选37℃，反应12小时，所述反应体系中还包括缓冲液20-100mM，pH 6.0-8.0；优选的缓冲液为4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液，优选的pH为7.0。
所述反应体系中所使用的蔗糖合成酶的制备工艺为，含有蔗糖合成酶的重组大肠杆菌，经诱导、表达后，收集菌体，随后进行超声破碎，离心后获得含有蔗糖合成酶的上清液，反应体系中直接添加含有蔗糖合成酶的上清液。所述反应体系中所使用的尿苷二磷酸葡萄糖4-差向异构酶，肌醇半乳糖合成酶的制备工艺同蔗糖合成酶相同，反应体系中直接添加分别含有尿苷二磷酸葡萄糖4-差向异构酶，肌醇半乳糖合成酶的上清液，上述获得的酶上清液中含有一定量的UDP和UDP-葡萄糖，这样避免在反应体系中添加昂贵的二磷酸尿苷UDP，有利于降低生产成本。
所述以蔗糖为底物经多酶级联催化合成肌醇半乳糖苷，肌醇半乳糖苷产量达到50g/L，转化率达到70％。
本发明还公开了一种棉子糖的制备方法，具体是通过体外多酶级联催化蔗糖生产棉子糖，反应过程如图1所示，蔗糖和二磷酸尿苷(Utidine diphosphate，UDP)经蔗糖合成酶催化合成UDP-葡萄糖，后者经尿苷二磷酸葡萄糖4-差向异构酶催化合成UDP-半乳糖，UDP-半乳糖和肌醇在肌醇半乳糖苷合成酶的作用下合成肌醇半乳糖苷，最后棉子糖合成酶催化肌醇半乳糖苷和蔗糖合成棉子糖和肌醇，该方法可以实现二磷酸尿苷和肌醇循环利用，具有生产成本低、无污染等优点。具体包括以下步骤：
以蔗糖为底物，向反应体系中加入肌醇，蔗糖合成酶、尿苷二磷酸葡萄糖4-差向异构酶、肌醇半乳糖合成酶、棉子糖合成酶，建立多酶催化体系，进行酶催化反应，即得。
所述多酶催化反应体系中，底物蔗糖的添加量为1-150g/L，所述蔗糖合成酶的添加量为0.1-100U/mL，所述尿苷二磷酸葡萄糖4-差向异构酶的添加量为0.1-100U/mL，所述肌醇半乳糖苷合成酶的添加量为0.1-100U/mL，所述棉子糖合成酶的添加量为0.1-100U/mL；所述的酶催化反应条件为：20℃-37℃，反应1-48小时，优选37℃，反应12小时，所述反应体系中还包括缓冲液20-100mM，pH 6.0-8.0；优选的缓冲液为4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液，优选的pH为7.0。
所述反应体系中所使用的蔗糖合成酶、尿苷二磷酸葡萄糖4-差向异构酶、肌醇半乳糖合成酶和棉子糖合成酶的制备工艺同发明目的一所述蔗糖合成酶的制备工艺相同，获得的酶上清液中含有一定量的UDP和UDP-葡萄糖，可提供反应体系中所需要的UDP。所述反应体系中还需加入少量肌醇，用于参与反应体系中中间产物的生成，肌醇的添加量为1-5g/L。
所述以蔗糖为底物经多酶级联催化合成棉子糖，棉子糖产量达到20g/L，转化率为10％。
本发明还公开了一种水苏糖的制备方法，具体是通过体外多酶级联催化蔗糖生产水苏糖，反应过程如图1所示，蔗糖和二磷酸尿苷(Uridine diphosphate，UDP)经蔗糖合成酶催化合成UDP-葡萄糖，后者经尿苷二磷酸葡萄糖4-差向异构酶催化合成UDP-半乳糖，UDP-半乳糖和肌醇在肌醇半乳糖苷合成酶的作用下合成肌醇半乳糖苷，棉子糖合成酶催化肌醇半乳糖苷和蔗糖合成棉子糖和肌醇，水苏糖合成酶催化生成的棉子糖和半乳糖肌醇合成棉子糖。具体包括以下步骤：
以蔗糖为底物，向反应体系中加入肌醇，蔗糖合成酶、尿苷二磷酸葡萄糖4-差向异构酶、肌醇半乳糖合成酶、棉子糖合成酶和水苏糖合成酶建立多酶催化体系，进行酶催化反应，即得。
所述多酶催化反应体系中，底物蔗糖的添加量为1-150g/L，所述蔗糖合成酶的添加量为0.1-100U/mL，所述尿苷二磷酸葡萄糖4-差向异构酶的添加量为0.1-100U/mL，所述肌醇半乳糖苷合成酶的添加量为0.1-100U/mL，所述棉子糖合成酶的添加量为0.1-100U/mL，所述水苏糖合成酶的添加量为0.1-100U/mL；所述的酶催化反应条件为：20℃-37℃，反应1-48小时，优选37℃，反应12小时，所述反应体系中还包括缓冲液20-100mM，pH 6.0-8.0；优选的缓冲液为4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液，优选的pH为7.0。
所述反应体系中所使用的蔗糖合成酶、尿苷二磷酸葡萄糖4-差向异构酶、肌醇半乳糖合成酶，棉子糖合成酶，水苏糖合成酶的制备工艺同发明目的一所述蔗糖合成酶的制备工艺一致，获得的酶上清液中含有一定量的UDP和UDP-葡萄糖，可提供反应体系中所需要的UDP。所述反应体系中还需加入少量肌醇，用于参与反应体系中中间产物的生成，肌醇的添加量为1-5g/L。
所述以蔗糖为底物经多酶级联催化合成水苏糖，水苏糖产量达到10g/L，转化率为6％。
本发明所述的蔗糖包括蔗糖，也包括富含蔗糖的糖蜜，具体包括大豆糖蜜和甘蔗糖蜜等。
本发明具有以下有益效果：
(1)原料廉价并且来源丰富。本发明以蔗糖为底物，价格相对低廉，并且来源非常丰富。因此，本发明对于蔗糖以及富含蔗糖生物质的高附加值利用和转化具有很强的应用潜力。
(2)本发明制备方法不需要添加昂贵的二磷酸尿苷，所使用粗酶液中含有的二磷酸尿苷足以实现二磷酸尿苷的循环转化，将有利于降低产物的生产成本。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
附图说明
图1为以蔗糖为底物合成大豆低聚糖的技术路线。
图2为以蔗糖为底物合成肌醇半乳糖苷的高效液相色谱分析结果。
图3为以蔗糖为底物合成棉子糖的高效液相色谱分析结果。
图4为以蔗糖为底物合成水苏糖的高效液相色谱分析结果。
具体实施方式
以下结合实施例进一步详述本发明。
本发明及实施例中提到的百分比浓度如无特别说明均为质量/质量(W/W，单位g/100g)百分比浓度、质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度或体积/体积(V/V，单位mL/100mL)百分比浓度。
各实施例中所用相同名称的材料或试剂如无特别说明即为相同的。实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为实施本发明时对生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。
本发明中酶活性测定方法及酶活性单位定义如下：
蔗糖合成酶酶活性测定：在200uL反应体系中含有蔗糖合成酶(1mg)，UDP(10mM)，蔗糖(10mM)，HEPES缓冲液(50mmol，pH 7.0)，30℃水浴反应1h，快速煮沸终止反应，进行HPLC检测果糖的生成。蔗糖合成酶酶活性定义为，每毫克蔗糖合成酶每分钟所生成的果糖的微摩尔含量。
尿苷二磷酸葡萄糖4-差向异构酶活性测定：在200uL反应体系中含有蔗糖合成酶(1mg)，UDP-葡萄糖(10mM)，HEPES缓冲液(50mmol，pH 7.0)，30℃水浴反应1h，快速煮沸终止反应，进行HPLC检测UDP-半乳糖的生成。尿苷二磷酸葡萄糖4-差向异构酶活性定义为，每毫克尿苷二磷酸葡萄糖4-差向异构酶每分钟所生成的UDP-半乳糖的微摩尔含量。
肌醇半乳糖苷合成酶活性测定：在200uL反应体系中含有肌醇半乳糖苷合成酶(1mg)，UDP-半乳糖(10mM)，肌醇(10mM)，HEPES缓冲液(50mmol，pH 7.0)，30℃水浴反应1h，快速煮沸终止反应，进行HPLC检测UDP-半乳糖的生成。肌醇半乳糖苷合成酶活性定义为，每毫克肌醇半乳糖苷合成酶每分钟所生成的肌醇半乳糖苷的微摩尔含量。
棉子糖合成酶活性测定：在200uL反应体系中含有棉子糖合成酶(1mg)，肌醇半乳糖苷(10mM)，蔗糖(10mM)，HEPES缓冲液(50mmol，pH 7.0)，30℃水浴反应1h，快速煮沸终止反应，进行HPLC检测棉子糖的生成。棉子糖合成酶活性定义为，每毫克棉子糖合成酶每分钟所生成的棉子糖的微摩尔含量。
水苏糖合成酶活性测定：在200uL反应体系中含有水苏糖合成酶(1mg)，肌醇半乳糖苷(10mM)，棉子糖(10mM)，HEPES缓冲液(50mmol，pH 7.0)，30℃水浴反应1h，快速煮沸终止反应，进行HPLC检测水苏糖的生成。水苏糖合成酶活性定义为，每毫克水苏糖合成酶每分钟所生成的水苏糖的微摩尔含量。
实施例1、体外多酶催化将蔗糖转化为肌醇半乳糖苷
通过一个体外多酶催化体系将蔗糖转化为肌醇半乳糖苷(图1)。这些关键酶包括：(1)蔗糖合成酶(SS，EC 2.4.1.13)，催化蔗糖和二磷酸尿苷(UDP)合成UDP-葡萄糖；(2)尿苷二磷酸葡萄糖4-差向异构酶(UGE，EC 5.1.3.2)，催化UDP-葡萄糖合成UDP-半乳糖；(3)肌醇半乳糖苷合成酶(GS，EC 2.4.1.123)，催化UDP-半乳糖和肌醇合成肌醇半乳糖。
在本发明中，蔗糖合成酶和肌醇半乳糖苷合成酶来源于拟南芥Arabidopsisthaliana，基因在KEGG上的编号分别为AT5G20830和AT1G09350，尿苷二磷酸葡萄糖4-差向异构酶来源于大肠杆菌Escherichia coli，基因在GeneBank上的编号为945354，这些基因组DNA都可从ATCC的官方网站(www.atcc.org)上获得。这四个基因分别用不同的引物从相应的基因组DNA中通过PCR获取，并通过重组酶连接的方法克隆至pET28a载体中，获得相应的表达载体pET28a-SS、pET28a-UGE和pET28a-GS。这三个质粒都转化至大肠杆菌表达菌BL21(DE3)中，并进行蛋白质表达，具体操作方法如下：
首先，培养及诱导分别含有蔗糖合成酶基因的大肠埃希氏菌重组菌株，选用LB培养基(蛋白胨(10g/L)，酵母抽提物(5g/L)，氯化钠(10g/L)，培养基中添加卡那霉素(100mg/L)，在37℃、200rmp条件下对大肠埃希氏菌重组菌株进行培养，当OD600达到0.6-0.8时，添加IPTG，终浓度为1mmol，降低摇床转速为120rmp，诱导约20h。
其次，收集和浓缩大肠埃希氏菌重组菌株，将诱导得到的大肠埃希氏菌重组菌株菌液(100mL)，4℃、8000rmp离心15min收集菌体，用4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液(50mmol，pH 7.0)洗涤菌液两次，最终用HEPES缓冲液(50mmol，pH 7.0)浓缩菌液至2mL。
再次，制备蔗糖合成酶粗酶液，针对菌株浓缩液超声破碎，4℃、14000rpm离心30min，得破碎上清，即得含有蔗糖合成酶的粗酶液。
所述尿苷二磷酸葡萄糖4-差向异构酶和肌醇半乳糖苷合成酶的制备方法与蔗糖合成酶相同。
在一个0.5毫升的反应体系中含有50mM的HEPES缓冲液(pH 7.2)，所述蔗糖合成酶的用量为4U/mL，所述尿苷二磷酸葡萄糖4-差向异构酶的用量为4U/mL，所述肌醇半乳糖苷合成酶的用量为4U/mL，136g/L蔗糖和36g/L肌醇，在37℃进行催化反应，反应24个小时。
根据保留时间的不同，高效液相色谱(HPLC)可以用来区分反应液中的蔗糖、肌醇、肌醇半乳糖苷、UDP-半乳糖和UDP-葡萄糖，并且可以对进行肌醇半乳糖苷定量。高效液相色谱分析按如下条件进行：仪器为安捷伦高效液相色谱仪1200，分析柱：Sugar-Pak，流动相：超纯水，流速：0.4mL/min，柱温：80℃，检测器：示差折光检测器，上样量为10μL。
反应结束后，最终肌醇半乳糖苷(图2)的终浓度是50g/L，转化率为70％。
实施例2、体外多酶催化蔗糖转化为棉子糖
建立体外多酶催化体系将蔗糖转化为棉子糖(图1)。这些关键酶包括：(1)蔗糖合成酶(SS，EC 2.4.1.13)，催化蔗糖和二磷酸尿苷(UDP)合成UDP-葡萄糖；(2)尿苷二磷酸葡萄糖4-差向异构酶(UGE，EC 5.1.3.2)，催化UDP-葡萄糖合成UDP-半乳糖；(3)肌醇半乳糖苷合成酶(GS，EC 2.4.1.123)，催化UDP-半乳糖和肌醇合成肌醇半乳糖；(4)棉子糖合成酶(RS，EC 2.4.1.82)，催化半乳糖肌醇和蔗糖合成棉子糖和肌醇。
蔗糖合成酶，肌醇半乳糖苷合成酶，尿苷二磷酸葡萄糖4-差向异构酶的来源同实施案例1相同，棉子糖合成酶来源于拟南芥Arabidopsis thaliana，基因在KEGG上的编号分别为AT5G40390。棉子糖合成酶基因通过引物从Arabidopsis thaliana基因组DNA中通过PCR获取，并通过重组酶连接的方法克隆至pET28a载体中，获得相应的表达载体pET28a-RS，将该质粒转化至大肠杆菌表达菌BL21(DE3)中，进行蛋白质表达。
所述反应体系中所需要的酶制备方法与实施案例1一致。
在一个0.5毫升的反应体系中含有50mM的HEPES缓冲液(pH 7.2)，所述蔗糖合成酶的用量为4U/mL，所述尿苷二磷酸葡萄糖4-差向异构酶的用量为4U/mL，所述肌醇半乳糖苷合成酶的用量为4U/mL，所述棉子糖合成酶的用量为4U/mL，136g/L蔗糖和4g/L肌醇，在37℃进行催化反应，反应24个小时。
根据保留时间的不同，高效液相色谱(HPLC)可以用来区分反应液中的蔗糖、肌醇、肌醇半乳糖苷、UDP-半乳糖和UDP-葡萄糖，棉子糖，并且可以对进行棉子糖定量。高效液相色谱分析按如下条件进行：仪器为安捷伦高效液相色谱仪1200，分析柱：Sugar-Pak，流动相：超纯水，流速：0.4mL/min，柱温：80℃，检测器：示差折光检测器，上样量为10μL。
反应结束后，最终棉子糖(图3)的终浓度是20g/L，转化率为10％。
实施例3、体外多酶催化蔗糖转化为水苏糖
建立体外多酶催化体系将蔗糖转化为水苏糖(图1)。这些关键酶包括：(1)蔗糖合成酶(SS，EC 2.4.1.13)，催化蔗糖和二磷酸尿苷(UDP)合成UDP-葡萄糖；(2)尿苷二磷酸葡萄糖4-差向异构酶(UGE，EC 5.1.3.2)，催化UDP-葡萄糖合成UDP-半乳糖；(3)肌醇半乳糖苷合成酶(GS，EC 2.4.1.123)，催化UDP-半乳糖和肌醇合成肌醇半乳糖；(4)棉子糖合成酶(RS，EC 2.4.1.82)，催化肌醇半乳糖和蔗糖合成棉子糖和肌醇；(5)水苏糖合成酶(SS，EC：2.4.1.67)，催化肌醇半乳糖苷和棉子糖合成水苏糖和肌醇。
蔗糖合成酶，肌醇半乳糖苷合成酶，尿苷二磷酸葡萄糖4-差向异构酶，棉子糖合成酶的来源同实施案例2相同，水苏糖合成酶来源于拟南芥Arabidopsis thaliana，基因在KEGG上的编号为AT4G01970。水苏糖合成酶基因通过引物从Arabidopsis thaliana基因组DNA中通过PCR获取，并通过重组酶连接的方法克隆至pET28a载体中，获得相应的表达载体pET28a-SS，将该质粒转化至大肠杆菌表达菌BL21(DE3)中，进行蛋白质表达。
所述反应体系中所需要的酶制备方法与实施案例1一致。
在一个0.5毫升的反应体系中含有50mM的HEPES缓冲液(pH 7.2)，所述蔗糖合成酶的用量为4U/mL，所述尿苷二磷酸葡萄糖4-差向异构酶的用量为4U/mL，所述肌醇半乳糖苷合成酶的用量为4U/mL，所述棉子糖合成酶的用量为4U/mL，136g/L蔗糖和4g/L肌醇，所述水苏糖合成酶的用量为4U/mL，在37℃进行催化反应，反应24个小时。
根据保留时间的不同，高效液相色谱(HPLC)可以用来区分反应液中的蔗糖、肌醇、肌醇半乳糖苷，棉子糖，水苏糖，并且可以对进行水苏糖定量。高效液相色谱分析按如下条件进行：仪器为安捷伦高效液相色谱仪1200，分析柱：Sugar-Pak，流动相：超纯水，流速：0.4mL/min，柱温：80℃，检测器：示差折光检测器，上样量为10μL。
反应结束后，最终棉子糖(图3)的终浓度是10g/L，转化率为6％。
Claims (10)
1.一种制备大豆低聚糖的方法，其特征在于，以蔗糖和肌醇为底物通过多酶体外级联反应合成大豆低聚糖。
2.权利要求1所述的制备大豆低聚糖的方法，其特征在于，所述的大豆低聚糖为肌醇半乳糖苷。
3.权利要求2所述的制备大豆低聚糖的方法，其特征在于，所述多酶包括蔗糖合成酶，尿苷二磷酸葡萄糖4-差向异构酶和肌醇半乳糖苷合成酶。
4.权利要求3所述的制备大豆低聚糖的方法，其特征在于，体外级联反应体系包括，所述蔗糖为1-150g/L，所述肌醇为1-150g/L，所述蔗糖合成酶为0.1-100U/mL，所述尿苷二磷酸葡萄糖4-差向异构酶为0.1-100U/mL，所述肌醇半乳糖苷合成酶为0.1-100U/mL，体外级联反应的条件为：20℃-37℃，缓冲液pH为6-8，反应1-48小时。
5.权利要求1所述的制备大豆低聚糖的方法，其特征在于，所述的大豆低聚糖为棉籽糖。
6.权利要求5所述的制备大豆低聚糖的方法，其特征在于，所述的多酶包括蔗糖合成酶、尿苷二磷酸葡萄糖4-差向异构酶、肌醇半乳糖苷合成酶和棉子糖合成酶。
7.权利要求6所述的制备大豆低聚糖的方法，其特征在于，体外级联反应体系包括，所述底物蔗糖为1-150g/L，所述肌醇为1-5g/L，所述蔗糖合成酶为0.1-100U/mL，所述尿苷二磷酸葡萄糖4-差向异构酶为0.1-100U/mL，所述肌醇半乳糖苷合成酶为0.1-100U/mL，棉子糖合成酶为0.1-100U/mL，体外级联反应条件为：20℃-37℃，缓冲液pH为6-8，反应1-48小时。
8.权利要求1所述的制备大豆低聚糖的方法，其特征在于，所述的大豆低聚糖为水苏糖。
9.权利要求8所述的制备大豆低聚糖的方法，其特征在于，所述的多酶包括蔗糖合成酶、尿苷二磷酸葡萄糖4-差向异构酶、肌醇半乳糖苷合成酶、棉子糖合成酶和水苏糖合成酶。
10.权利要求9所述的制备大豆低聚糖的方法，其特征在于，体外级联反应体系包括，所述底物蔗糖为1-150g/L，所述肌醇为1-5g/L，所述蔗糖合成酶为0.1-100U/mL，所述尿苷二磷酸葡萄糖4-差向异构酶为0.1-100U/mL，所述肌醇半乳糖苷合成酶为0.1-100U/mL，棉子糖合成酶为0.1-100U/mL，水苏糖合成酶为0.1-100U/mL，体外级联反应条件为：20℃-37℃，缓冲液pH为6-8，反应1-48小时。
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