[go: up one dir, main page]

CN111876447B - 一种生产迷迭香酸的菌株及方法 - Google Patents

一种生产迷迭香酸的菌株及方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111876447B
CN111876447B CN201910554108.8A CN201910554108A CN111876447B CN 111876447 B CN111876447 B CN 111876447B CN 201910554108 A CN201910554108 A CN 201910554108A CN 111876447 B CN111876447 B CN 111876447B
Authority
CN
China
Prior art keywords
acid
polyphosphate kinase
rosmarinic acid
recombinant
recombinant cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201910554108.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111876447A (zh
Inventor
蔡宇杰
燕毅
丁彦蕊
白亚军
郑晓晖
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shaanxi Hongdao Institute Of Biological Analysis Science And Technology Co ltd
Original Assignee
Shaanxi Hongdao Institute Of Biological Analysis Science And Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to CN201910554108.8A priority Critical patent/CN111876447B/zh
Application filed by Shaanxi Hongdao Institute Of Biological Analysis Science And Technology Co ltd filed Critical Shaanxi Hongdao Institute Of Biological Analysis Science And Technology Co ltd
Priority to JP2021577280A priority patent/JP7565306B2/ja
Priority to PCT/CN2020/076363 priority patent/WO2020258896A1/zh
Priority to MX2022000059A priority patent/MX2022000059A/es
Priority to CA3145416A priority patent/CA3145416A1/en
Priority to EP20830994.8A priority patent/EP3992298A4/en
Priority to KR1020227002342A priority patent/KR20220038352A/ko
Priority to AU2020303019A priority patent/AU2020303019A1/en
Priority to BR112021026392A priority patent/BR112021026392A2/pt
Publication of CN111876447A publication Critical patent/CN111876447A/zh
Priority to US17/209,449 priority patent/US12252716B2/en
Priority to IL289360A priority patent/IL289360A/en
Application granted granted Critical
Publication of CN111876447B publication Critical patent/CN111876447B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62—Carboxylic acid esters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/64—General methods for preparing the vector, for introducing it into the cell or for selecting the vector-containing host
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1229—Phosphotransferases with a phosphate group as acceptor (2.7.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C12Y203/0114—Rosmarinate synthase (2.3.1.140)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/04—Phosphotransferases with a phosphate group as acceptor (2.7.4)
    • C12Y207/04001—Polyphosphate kinase (2.7.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y602/00—Ligases forming carbon-sulfur bonds (6.2)
    • C12Y602/01—Acid-Thiol Ligases (6.2.1)
    • C12Y602/01012—4-Coumarate-CoA ligase (6.2.1.12)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/185—Escherichia
    • C12R2001/19—Escherichia coli

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种生产迷迭香酸的菌株及方法，属于生物工程技术领域。本发明构建了表达4‑香豆酸辅酶A连接酶、迷迭香酸合成酶、多聚磷酸激酶2‑I、多聚磷酸盐激酶2‑II的重组细胞或者重组细胞的组合，并利用重组细胞或者重组细胞的组合催化丹参素和咖啡酸合成迷迭香酸。本发明具有良好的工业化应用前景。

Description

一种生产迷迭香酸的菌株及方法
技术领域
本发明涉及一种生产迷迭香酸的菌株及方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
迷迭香酸(Rosmarinic acid，RA)，是一种天然的多酚类化合物。在结构上，RA是由咖啡酸(Caffeic acid)和D-丹参素(D-Danshensu)所组成的酯，广泛分布于唇形科、紫草科、葫芦科、椴树科、伞形科等植物中，尤以唇形科和紫草科中含量最高。RA作为迷迭香中最有效的抗氧化成分，已被美国食品药物管理局(FDA)认可为“公众安全食品”。早在1998年Nakamura等就提出邻二酚羟基是清除自由基活性的物质基础，而C3位的共轭双键具有增效作用(OhtoY,MurakamiA,Nakamura Y,et al.Superoxide scavenging activity ofrosmarinic acid from Perillafrutescens Britton var.acuta f.viridis[J].Journalof Agricultural and Food Chemistry,1998,46(11):4545-4550)。近几年的研究表明，迷迭香酸对多种疾病有明显的作用，迷迭香酸在抗氧化、抑制病原微生物、抗癌抗肿瘤、抗炎活性和免疫抑制活性、抗血栓、抗血小板凝集、抗抑郁、防辐射、防止细胞损伤及记忆损伤等方面都具有良好的生物活性。随着人们对迷迭香酸生物学活性及体内代谢特征的不断研究，越来越多的生物活性被开发出来。因此，进一步地合理开发、利用迷迭香酸使其为人类所用，将成为以后的研究热点。
目前迷迭香酸的工业化生产还不成熟，且大都处于实验室阶段。其小量制备主要有以下两种方式：1)通过对唇形科植物进行纤维素酶酶解法、超声法、回流法处理，再进一步获得迷迭香酸；2)利用化学合成的方法制备迷迭香酸。从植物中提取迷迭香酸，方法简便，易于实现，产品质量得到保障。但是此方法需要大量的有机溶剂，提取耗时长并且迷迭香酸的回收率不高。通过化学合成的方法虽然能成功合成迷迭香酸，但由于原料和试剂成本昂贵，反应过程中产生许多副产物，并且合成步骤较长，反应剧烈不易控制等缺点，使得化学合成方法不适合工业化生产。除此之外，由于迷迭香酸是重要的食品、药物、保健品的原材料，因此通过化学方法得到的产品不受人们欢迎。目前市场上的这一类物质主要从植物中提到得到，例如，中国发明专利CN 108658769A公开了一种基于响应面法夏枯草迷迭香酸的提取工艺；中国发明专利CN 107935855A通过回流法从迷迭香中提取迷迭香酸的方法。由于植物资源及其含量的限制，并且提取过程繁琐、复杂，使得这些产品价格昂贵，因此通过微生物法生产受到了广泛的关注。
2014年，Bloch等人提出以大肠杆菌自身代谢产生的酪氨酸和4-羟基苯丙酮酸为底物，在羟基酸脱氢酶的作用下将内源的4-羟基苯丙酮酸转化成4-羟基苯乳酸，随后通过从大肠杆菌克隆的羟化酶HpaBC进行间羟基化，得到3,4-二羟基苯乳酸；而在另一边是以内源性的酪氨酸为底物生成咖啡酸，首先以酪氨酸在酪氨酸氨裂解酶作用下生成对香豆酸，然后也是通过从大肠杆菌克隆的羟化酶HpaBC进行间羟基化得到咖啡酸，得到咖啡酸后在4-香豆酸-CoA连接酶的作用下生成咖啡酰辅酶A，最终咖啡酰辅酶A和3,4-二羟基苯乳酸在迷迭香酸合成酶作用下经过72小时后转化得到1.8±0.3μm迷迭香酸(Construction of achimeric biosynthetic pathway for the de novo biosynthesis of rosmarinic acidin Escherichia coli.Chembiochem,15(16):2393-2401(2014))。但这些方法中HpaBC酶活力较低，导致迷迭香酸的产量极低。也有文献尝采用过表达4-香豆酸-CoA连接酶和迷迭香酸合成酶的大肠杆菌来转化咖啡酸和丹参素生成迷迭香酸，但由于缺少辅酶及快速再生体系，产量也极低(Synthesis of rosmarinic acid analogues in Escherichia coli,Biotechnol Lett38:619–627(2016))。
发明内容
[技术问题]
本发明要解决的技术问题是以酚酸为底物合成迷迭香酸，提高生物法或酶法合成迷迭香酸的产量。同时，克服现有的生物合成法只能合成D-迷迭香酸的问题。
[技术方案]
本发明提供了以酚酸为底物合成迷迭香酸的方法，所述酚酸为咖啡酸和丹参素；咖啡酸被4-香豆酸辅酶A连接酶(4-coumarate:CoA ligase)与辅酶A(CoA)连接生成咖啡酰辅酶A(Caffeyl-CoA)，迷迭香酸合成酶(Rosmarinic acid synthase)利用ATP的能量将咖啡酰辅酶A和丹参素合成为迷迭香酸。在此过程中CoA被释放，ATP被水解成AMP。多聚磷酸激酶2-II(polyphosphate kinase 2-II，PPK2-II)将AMP生成为ADP，进一步ADP被多聚磷酸盐激酶2-I(polyphosphate kinase 2-I,PPK2-I)实现ATP的再生。
在一种实施方式中，所述4-香豆酸辅酶A连接酶为来自于Scutellariabaicalensis、Ocimumtenuiflorum、Ocimumbasilicum、Arabidopsisthaliana、Penicilliumchrysogenum、Streptomyces coelicolor A3(2)、Rhodococcusjostii RHA1。或者，所述4-香豆酸辅酶A连接酶，其氨基酸序列是NCBI上accession NO.为BAD90936.1、ADO16242.1、AGP02119.1、AAD47193.1、CAA04820.1、CAB95894.1、ABG96911.1的序列。或者，4-香豆酸辅酶A连接酶的核苷酸序列是NCBI上accession NO.为AB166767.1REGION:42..1691、HM990148.1REGION:1..1704、KC576841.1REGION:1..1704、AF106086.1REGION:67..1737、AJ001540.1REGION:89..1825、AL645882REGION:complement(4799896..4801464)、CP000431.1REGION:complement(5466961..5468496)的序列。
在一种实施方式中，所述多聚磷酸盐激酶2-I为来自于Sinorhizobium_meliloti。或者，所述多聚磷酸盐激酶2-I，其氨基酸序列是NCBI上accession NO.为NP_384613.1的序列。或者，多聚磷酸盐激酶2-I的核苷酸序列是NCBI上accession NO.为NC_003047REGION:complement(564142..565044)的序列。
在一种实施方式中，所述迷迭香酸合成酶为来自于Plectranthusscutellarioides、Lavandulaangustifolia、Melissa officinalis、Salviamiltiorrhiza、Coffeacanephora、Nicotianatabacum、Dianthus caryophyllus。或者，所述迷迭香酸合成酶，其氨基酸序列是NCBI上accession NO.为CAK55166.1、ABI48360.1、CBW35684.1、ADA60182.1、ABO47805.1、CAE46932.1、CAB06430.1的序列。或者，迷迭香酸合成酶的核苷酸序列是NCBI上accession NO.为AM283092.1、DQ886904.1REGION:51..1433、FR670523.1、FJ906696.1、EF137954.1REGION:3..1307、AJ582651.1、Z84386.1REGION:137..1477的序列。
在一种实施方式中，所述多聚磷酸盐激酶2-II为来自于Acinetobacterjohnsonii。或者，所述多聚磷酸盐激酶2-II，其氨基酸序列是NCBI上accession NO.为BAC76403.1的序列。或者，多聚磷酸盐激酶2-II的核苷酸序列是NCBI上accession NO.为AB092983REGION:339..1766的序列。
在一种实施方式中，所述丹参素是D-丹参素或者L-丹参素。当丹参素是L-丹参素时，迷迭香酸合成酶选择来自Coffeacanephora或Dianthus caryophyllus的迷迭香酸合成酶。
本发明还提供了一种能够以酚酸为底物合成迷迭香酸的重组细胞或一种能够以酚酸为底物合成迷迭香酸的重组细胞的组合，所述单个重组细胞表达了4-香豆酸辅酶A连接酶(4-coumarate:CoA ligase)、迷迭香酸合成酶(Rosmarinic acid synthase)、多聚磷酸激酶2-II(polyphosphate kinase 2-II，PPK2-II)、多聚磷酸盐激酶2-I(polyphosphatekinase 2-I,PPK2-I)；所述重组细胞的组合包含分别表达4-香豆酸辅酶A连接酶、迷迭香酸合成酶、多聚磷酸激酶2-II、多聚磷酸盐激酶2-I中的一种或以上的重组细胞，由这多个重组细胞共同配合以实现合成迷迭香酸的目的。
所述重组细胞或者重组细胞的组合可以选择大肠杆菌为宿主，例如Escherichiacoli BL21(DE3)。
所述4种酶可以在宿主中借助载体进行表达融合表达或共表达，或者整合到宿主的基因组上进行表达。所述4种酶借助载体进行表达时，可以选择一个或多个载体表达4种酶中的一种或多种。
特别地，本发明还提供了一种能够以咖啡酸、L-丹参素为底物合成L-迷迭香酸的重组细胞，所述重组细胞表达了Coffeacanephora或Dianthus caryophyllus来源的编码迷迭香酸合成酶的基因，以及编码多聚磷酸盐激酶2-I、多聚磷酸盐激酶2-Ⅱ、4-香豆酸辅酶A连接酶的基因。所述重组细胞以大肠杆菌为宿主，以pRSFDuet-1为载体表达编码多聚磷酸盐激酶2-I、多聚磷酸盐激酶2-Ⅱ的基因，以pTDuet-1为载体表达编码4-香豆酸辅酶A连接酶、迷迭香酸合成酶的基因。每个基因前均包含T7启动子和RBS结合点，每个基因后带有T7终止子。
本发明还提供了一种全细胞催化生产迷迭香酸的方法，是利用本发明的重组细胞或者重组细胞的组合为全细胞催化剂，以咖啡酸和D-丹参素(L-丹参素)为底物合成迷D-迭香酸(L-迭香酸)。所述全细胞催化剂的制备，是培养、繁殖重组细胞或者重组细胞的组合，并使得重组细胞或者重组细胞的组合表达所述4种酶，然后收集重组细胞。使用所述全细胞催化剂时，除了提供底物，还需要维持适当的温度和pH，必要时还提供一些辅酶或者营养物质，以帮助全细胞催化剂更好地发挥催化作用。
在一种实施方式中，所述全细胞转化生产的体系中，包括细胞湿重为1-200g/L，丹参素(D或L)1-100g/L，咖啡酸1-100g/L，ATP 0-1g/L，CoA0-1g/L，六聚偏磷酸钠300g/L，pH5.0-9.0；于15-40℃反应，时间1-48小时。
[有益效果]
本发明构建了强化表达4种酶的基因工程菌应用于迷迭香酸的生产。本发明采用的底物为咖啡酸和丹参素，咖啡酸和丹参素这两种酚酸易于得到。
本发明通过合理的表达策略，在表达4-香豆酸辅酶A连接酶、迷迭香酸合成酶的同时，还表达了多聚磷酸激酶2-II、多聚磷酸盐激酶2-I，实现了ATP和CoA的双辅酶再生，有效地保证了酶催化反应的持续进行，并提高了迷迭香酸的产量。
自然界中迷迭香酸的丹参素基团部分均匀为D型，因此，常见的迷迭香酸均是D型的。本发明获得了能够以L-丹参素为底物的迷迭香酸合成酶，在此基础上，以L-丹参素和咖啡酸为原料，通过生物法合成得到了L-迷迭香酸。
附图说明
图1实施例4中合成得到的迷迭香酸的液相图谱。
图2实施例6中合成得到的迷迭香酸的液相图谱。
具体实施方式
1、本发明所涉及的菌株及质粒
购自Novagen公司的pRSFDuet-1、pETDuet-1、pCDFDuet-1、pACYCDuet-1质粒和Escherichia coli BL21(DE3)。
2、多基因共表达体系的构建及细胞的培养
目前大肠杆菌多基因共表达的有多种方法(例如：“大肠杆菌多基因共表达策略，中国生物工程杂志，2012，32(4):117-122”这篇文章所记载的方法)，本发明采用刘向磊的博士论文(合成生物学技术改造大肠杆菌生产莽草酸及白藜芦醇，2016，上海医药工业研究院)所记载的方法来构建重组大肠杆菌。下述实施例中，共表达多基因时，每个基因前均包含T7启动子和RBS结合点，每个基因后带有T7终止子。理论上来讲，因为每个基因前都有T7和RBS，因此，基因的表达强度受基因在质粒上的排列次序的影响不大。将构建好的质粒热转导入大肠杆菌感受态细胞中，并涂布于单抗或混合抗生素固体平板上，筛选得到阳性转化子，即得到重组大肠杆菌。
细胞的培养：根据经典的重组大肠杆菌培养及诱导表达方案，将重组大肠杆菌按体积比为2％的量转接到LB发酵培养基(蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L)中，当细胞OD600达到0.6-0.8后，加入终浓度为0.4mM的IPTG，在20℃诱导表达培养8h。诱导表达结束后，4℃、8000rpm、20分钟离心收集细胞。
3、相关酶的选择
(1)多聚磷酸盐激酶2-I
选择源于Sinorhizobium_meliloti的编码多聚磷酸盐激酶2-I的基因smpkk，基因smpkk在NCBI上accession NO为NC_003047REGION:complement(564142..565044)，对应的氨基酸序列是NP_384613.1。
(2)多聚磷酸盐激酶2-II
选择源于Acinetobacterjohnsonii的编码多聚磷酸盐激酶2-II的基因ajpkk，基因ajpkk NCBI上accession NO.为AB092983REGION:339..1766的序列，对应的氨基酸序列是BAC76403.1。
(3)4-香豆酸辅酶A连接酶
参见实施例1。
(4)迷迭香酸合成酶
参见实施例2。
4、样品的检测分析
迷迭香酸含量测定方法根据文献进行测定(Enhanced accumulation of caffeicacid,rosmarinic acid and luteolin-glucoside in red perilla cultivated underred diode laser and blue LED illumination followed by UV-Airradiation.Journalof functional foods 2(2010)66–7 0)。丹参素、咖啡酸、迷迭香酸的溶解度较低，本发明中的转化过程会加入过量底物，底物会边反应边溶解，产物则在高浓度情况下会边反应边析出，测定时加入纯水使之完全溶解后测定。
迷迭香酸合成酶活力根据文献测定：Rosmarinic acid synthase is a newmember of the superfamily of BAHD acyltransferases,Planta,2006,224:1503–1510.
4-香豆酸辅酶A连接酶活力根据文献测定：4-Coumarate:CoA ligase from cellsuspension cultures of PetroselinumhortenseHoffm.Arch.Biochem.Biophys.1977,184,237-248
比酶活(U mg-1)定义为每mg酶所具有的酶活力单位。一个酶活力单位(U)定义为1min生成1μmol产物所需的酶量。
实施例1：4-香豆酸辅酶A连接酶的筛选与表达
4-香豆酸辅酶A连接酶广泛各类生物体中，分别根据Scutellariabaicalensis、Ocimumtenuiflorum、Ocimumbasilicum、Arabidopsis thaliana、Penicilliumchrysogenum、Streptomyces coelicolor A3(2)、Rhodococcusjostiid在NCBI上的4-香豆酸辅酶A连接酶基因信息全合成得到4-香豆酸辅酶A基因sb4cl、ot4cl、ob4cl、at4cl、pc4cl、sc4cl、rj4cl。氨基酸序列在NCBI上accession NO为：BAD90936.1、ADO16242.1、AGP02119.1、AAD47193.1、CAA04820.1、CAB95894.1、ABG96911.1。将合成得到的基因连接到pETDuet-1载体上，并在Escherichia coli BL21(DE3)中得到诱导表达。诱导表达方法：将重组大肠杆菌按体积比为2％的量转接到LB发酵培养基(蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L)中，当细胞OD600达到0.6-0.8后，加入终浓度为0.4mM的IPTG，在20℃诱导表达培养8h。诱导表达结束后，4℃、8000rpm、20分钟离心收集细胞。破胞后histag标签法纯化酶，得到纯酶后测定活性。
当以咖啡酸和辅酶A为底物时，4-香豆酸辅酶A连接酶基因sb4cl、ot4cl、ob4cl、at4cl、pc4cl、sc4cl、rj4cl各自表达的酶的比酶活分别为：152、143、161、179、202、174、88U/mg。
实施例2：迷迭香酸合成酶的筛选与表达
迷迭香酸合成酶主要存在于植物中，根据Plectranthusscutellarioides、Lavandulaangustifolia、Melissa officinalis、Salvia miltiorrhiza、Coffeacanephora、Nicotianatabacum、Dianthus caryophyllus在NCBI上的迷迭香酸合成酶基因信息全合成了迷迭香酸合成酶基因psras、laras、moras、smras、ccras、ntras、dcras。氨基酸序列在NCBI上accession NO为：CAK55166.1、ABI48360.1、CBW35684.1、ADA60182.1、ABO47805.1、CAE46932.1、CAB06430.1的序列。将合成得到的基因分别连接到pETDuet-1载体上，与实施例1同样的方法表达纯化。
以咖啡酰辅酶A和D-丹参素为底物时，迷迭香酸合成酶基因psras、laras、moras、smras、ccras、ntras、dcras各自表达的酶的比酶活分别为：410、320、414、233、361、521、371U/mg。
以咖啡酰辅酶A和L-丹参素为底物时，迷迭香酸合成酶基因psras、laras、moras、smras、ccras、ntras、dcras各自表达的酶的比酶活分别为：0、0、0、0、120、0、142U/mg。可见，只有ccras、dcras编码的迷迭香酸合成酶具有以L-丹参素为底物合成迷迭香酸的能力。
实施例3:同时表达4种酶的重组大肠杆菌的构建
重组大肠杆菌构建：
如表1所示，从pETDuet-1、pACYCDuet-1、pRSFDuet-1、pCDFduet-1四种质粒中进行选择，将编码四种酶的基因连接到同一个质粒上，或者分别连接到两个质粒上(每个质粒上表达2个基因)，或者分别连接到四个质粒上(每个质粒上表达1个基因)。每个基因前均包含T7启动子和RBS结合点，每个基因后均带有T7终止子。将构建得到的重组质粒转化入大肠杆菌Escherichia coli BL21中，利用混合抗生平板筛选得到阳性转化子，即得到可强化表达4个基因的重组大肠杆菌。
对重组大肠杆菌进行诱导表达，诱导表达完成后收集菌体，于100ml反应体系中，细胞湿重为200g/L，D-丹参素20g/L，咖啡酸20g/L，CoA1g/L，ATP 1g/L，六聚偏磷酸钠60g/L，pH 8；于30℃反应，反应时间24小时。丹参素和咖啡酸的溶解度均很小，因此是边转化边溶解，转化结束后将溶液稀释后利用液相色谱测定反应液中迷迭香酸的浓度，结果如表1所示。
表1
Figure BDA0002106360380000071
Figure BDA0002106360380000081
实施例4：应用四种酶体外合成迷迭香酸
将smpkk、ajpkk、pc4cl、ntras四个基因分别连接到pEDTDuet-1载体上，得到4个重组载体，将4个重组载体分别转化到Escherichia coli BL21中，得到分别表达4种酶的重组大肠杆菌。采用与实施例1同样的方法表达纯化后得到四种纯酶。然后于100ml反应体系中加入这四种纯酶各2mg，D-丹参素20g/L，咖啡酸20g/L，CoA 1g/L，ATP 1g/L，六聚偏磷酸钠60g/L，pH 8；于30℃反应5小时，最终液相色谱测定反应液中迷迭香酸浓度为36g/L，其液相图谱如说明书附图1。
实施例5：应用四种酶细胞合成迷迭香酸
将smpkk、ajpkk、pc4cl、ntras四个基因分别连接到pEDTDuet-1载体上，得到4个重组载体，将4个重组载体分别转化到Escherichia coli BL21中，得到分别表达4种酶中的一种的重组大肠杆菌。采用与实施例1同样的方法诱导重组大肠杆菌表达酶。然后于100ml反应体系中加入这四种全细胞各20g/L，D-丹参素20g/L，咖啡酸20g/L，CoA1g/L，ATP 1g/L，六聚偏磷酸钠60g/L，pH 8；于30℃反应，时间5小时，最终液相色谱测定反应液中迷迭香酸浓度为23g/L。
实施例6：以重组大肠杆菌全细胞催化合成L-迷迭香酸
自然界中迷迭香酸的丹参素基团部份均匀为D型，本发明进一步以L-丹参素和咖啡酸为原料合成L-迷迭香酸(与迷迭香酸不同之处在于丹参素基团部份为L型)。此前，L-迷迭香酸一直未能以生物法合成得到。
选择Coffeacanephora、Dianthus caryophyllus来源的编码迷迭香酸合成酶的基因ccras、dcras，与编码多聚磷酸盐激酶2-I、多聚磷酸盐激酶2-Ⅱ、4-香豆酸辅酶A连接酶的基因一起，构建重组菌Escherichia coli BL21(DE3)/pRSFDuet-1-smpkk-ajpkk+pTDuet-1-pc4cl-dcras。根据实施例1所述的方法，将其诱导表达，然后收集菌体。
于100ml反应体系中，细胞湿重为100g/L，L-丹参素20g/L，咖啡酸20g/L，CoA 1g/L，ATP 1g/L，六聚偏磷酸钠60g/L，pH 8；于30℃反应，时间24小时。转化结束后液相色谱测定L-迷迭香酸浓度为33g/L，其液相图谱如说明书附图2。采用江苏汉邦科技有限公司的DAC-HB50制备色谱柱制备转化样品，制备色谱条件为：流动相50％甲醇、柱温自然、流速3ml/min、进样量5ml。样品达到色谱纯99.9％，反复进样分离得到的产品于50℃下真空旋转蒸干。称取制备得到的样品0.5g，溶于去离子水中并定容至50ml，采用日本爱宕AP-300全自动旋光仪测定旋光度，其旋光度为
Figure BDA0002106360380000091
因此，确认本实施例制备得到的迷迭香酸为L-迷迭香酸。
实施例7：以重组大肠杆菌全细胞催化合成迷迭香酸
构建如下2种重组菌Escherichia coli BL21(DE3)/pRSFDuet-1-smpkk-ajpkk(合名为E1)，Escherichia coli BL21(DE3)/pETDuet-1-sc4cl-ccras(命名为E2)。
根据实施例1所述的方法，将E1和E2分别诱导表达，然后收集菌体。于100ml反应体系中，E1细胞湿重为30g/L，E2细胞湿重为50g/L、D-丹参素100g/L，咖啡酸10g/L，六聚偏磷酸钠300g/L，CoA1g/L，ATP 1g/L，pH 9；于40℃反应，时间48小时。转化结束后液相色谱测定迷迭香酸含量为162g/L。
实施例8：以重组大肠杆菌全细胞催化合成迷迭香酸
构建如下2种重组菌Escherichia coli BL21(DE3)/pRSFDuet-1-smpkk-ajpkk-at4cl(合名为E3)，Escherichia coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-ccras(命名为E4)。
根据实施例1所述的方法，将E3和E4分别诱导表达，然后收集菌体。于100ml反应体系中，E3细胞湿重为100g/L，E4细胞湿重为100g/L，D-丹参素1g/L，咖啡酸1g/L，CoA0.5g/L，ATP 1g/L，六聚偏磷酸钠3g/L，pH 5；于15℃反应，时间48小时。转化结束后液相色谱测定迷迭香酸含量为1.3g/L。
实施例9：以重组大肠杆菌全细胞催化合成迷迭香酸
构建如下2种重组菌Escherichia coli BL21(DE3)/pRSFDuet-1-ntras-at4cl(合名为E5)，Escherichia coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-smpkk-ajpkk(命名为E6)。
根据实施例1所述的方法，将E5和E6分别诱导表达，然后收集菌体。于100ml反应体系中，E5细胞湿重为100g/L，E6细胞湿重为100g/L，D-丹参素1g/L，咖啡酸1g/L，六聚偏磷酸钠3g/L，CoA 1g/L，ATP 0.5g/L，pH 7；于15℃反应，时间1小时。转化结束后液相色谱测定迷迭香酸含量为1.5g/L。
实施例10：以重组大肠杆菌全细胞催化合成迷迭香酸
构建重组菌Escherichia coli BL21(DE3)/pRSFDuet-1-ntras-at4cl+pCDFDuet-1-smpkk-ajpkk。根据实施例1所述的方法，将重组菌诱导表达，然后收集菌体。于100ml反应体系中，细胞湿重为1g/L，D-丹参素1g/L，咖啡酸1g/L，ATP 1g/L，CoA 1g/L，六聚偏磷酸钠20g/L，pH8；于40℃反应，时间48小时。转化结束后液相色谱测定迷迭香酸含量为1.6g/L。若该反应体积中的ATP和CoA浓度为0g/L，则在其他转化条件不变的情况下，迷迭香酸含量为0.4g/L。
实施例11：以重组大肠杆菌全细胞催化合成迷迭香酸
构建如下2种重组菌Escherichia coli BL21(DE3)/pRSFDuet-1-smpkk-ajpkk(合名为E1)，Escherichia coli BL21(DE3)/pETDuet-1-sc4cl-ccras(命名为E2)。
根据实施例1所述的方法，将E1和E2分别诱导表达，然后收集菌体。于100ml反应体系中，E1细胞湿重为30g/L，E2细胞湿重为50g/L、D-丹参素100g/L，咖啡酸10g/L，六聚偏磷酸钠300g/L，CoA 1g/L，ATP 0.1g/L，pH 9；于40℃反应，时间48小时。转化结束后液相色谱测定迷迭香酸含量为146g/L。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (7)

1.一种能够以酚酸为底物合成迷迭香酸的重组细胞或者重组细胞的组合，其特征在于，所述酚酸是丹参素和咖啡酸，所述迷迭香酸包括D-迷迭香酸、L-迷迭香酸，所述重组细胞表达了4-香豆酸辅酶A连接酶、Coffeacanephora或Dianthus caryophyllus来源的迷迭香酸合成酶、多聚磷酸激酶2-I、多聚磷酸盐激酶2-II；所述重组细胞的组合包含分别表达4-香豆酸辅酶A连接酶、迷迭香酸合成酶、多聚磷酸激酶2-II、多聚磷酸盐激酶2-I中的一种或以上的重组细胞，由这多个重组细胞共同配合以实现合成迷迭香酸的目的；
编码所述多聚磷酸盐激酶2-I的基因在NCBI上accession NO. 为NC_003047 REGION:complement 564142..565044，对应的氨基酸序列是NP_384613.1，
编码所述多聚磷酸盐激酶2-II的基因在NCBI上accession NO. 为AB092983 REGION:339..1766，对应的氨基酸序列是BAC76403.1，
所述重组细胞选择大肠杆菌为宿主，是Escherichia coli BL21（DE3）。
2.根据权利要求1所述的一种能够以酚酸为底物合成迷迭香酸的重组细胞或者重组细胞的组合，其特征在于，4-香豆酸辅酶A连接酶、迷迭香酸合成酶、多聚磷酸激酶2-I、多聚磷酸盐激酶2-II在宿主中借助载体进行共表达或整合到宿主基因组中进行表达；4-香豆酸辅酶A连接酶、迷迭香酸合成酶、多聚磷酸激酶2-I、多聚磷酸盐激酶2-II借助载体进行表达时，选择多个载体，每个载体表达4种酶中的一种或多种，或者，选择一个载体，由一个载体同时表达这4种酶。
3.根据权利要求2所述的一种能够以酚酸为底物合成迷迭香酸的重组细胞或者重组细胞的组合，其特征在于，将编码4-香豆酸辅酶A连接酶、迷迭香酸合成酶、多聚磷酸激酶2-I、多聚磷酸盐激酶2-II的基因分配到pETDuet-1、pACYCDuet-1、pRSFDuet-1、pCDFduet-1这4种质粒中的一种或多种上，每种质粒上携带编码4-香豆酸辅酶A连接酶、迷迭香酸合成酶、多聚磷酸激酶2-I、多聚磷酸盐激酶2-II的基因中1种基因或多种。
4.根据权利要求1或2所述的一种能够以酚酸为底物合成迷迭香酸的重组细胞或者重组细胞的组合，其特征在于，所述重组细胞表达了Coffeacanephora或Dianthus caryophyllus来源的编码迷迭香酸合成酶的基因，以及编码多聚磷酸盐激酶2-I、多聚磷酸盐激酶2-Ⅱ、4-香豆酸辅酶A连接酶的基因；所述重组细胞以大肠杆菌为宿主，以pRSFDuet-1为载体表达编码多聚磷酸盐激酶2-I、多聚磷酸盐激酶2-Ⅱ的基因，以pTDuet-1为载体表达编码4-香豆酸辅酶A连接酶、迷迭香酸合成酶的基因；编码4-香豆酸辅酶A连接酶、迷迭香酸合成酶、多聚磷酸激酶2-I、多聚磷酸盐激酶2-II的基因前均包含T7启动子和RBS结合点，基因后带有T7终止子。
5.一种全细胞催化生产迷迭香酸的方法，其特征在于，是利用权利要求1~4任一所述的重组细胞或者重组细胞的组合为全细胞催化剂，以丹参素和咖啡酸为底物合成迷迭香酸。
6.根据权利要求5所述的一种全细胞催化生产迷迭香酸的方法，其特征在于，所述全细胞催化剂的制备，是培养、繁殖重组细胞或者重组细胞的组合，并使得重组细胞或者重组细胞的组合表达所述4种酶，然后收集重组细胞。
7.权利要求1~4任一所述的重组细胞或者重组细胞的组合在生产迷迭香酸或者含有迷迭香酸的产品或者以迷迭香酸为前体的物质中的应用。
CN201910554108.8A 2019-06-25 2019-06-25 一种生产迷迭香酸的菌株及方法 Active CN111876447B (zh)

Priority Applications (11)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910554108.8A CN111876447B (zh) 2019-06-25 2019-06-25 一种生产迷迭香酸的菌株及方法
BR112021026392A BR112021026392A2 (pt) 2019-06-25 2020-02-24 Cepa e método para produção de ácido rosmarínico
MX2022000059A MX2022000059A (es) 2019-06-25 2020-02-24 Cepa y metodo para producir acido rosmarinico.
CA3145416A CA3145416A1 (en) 2019-06-25 2020-02-24 Strain and method for producing rosmarinic acid
EP20830994.8A EP3992298A4 (en) 2019-06-25 2020-02-24 Strain and method for producing rosmarinic acid
KR1020227002342A KR20220038352A (ko) 2019-06-25 2020-02-24 로즈마린산의 생산을 위한 균주 및 방법
JP2021577280A JP7565306B2 (ja) 2019-06-25 2020-02-24 ロスマリン酸を産生するための株および方法
PCT/CN2020/076363 WO2020258896A1 (zh) 2019-06-25 2020-02-24 一种生产迷迭香酸的菌株及方法
AU2020303019A AU2020303019A1 (en) 2019-06-25 2020-02-24 Strain and method for producing rosmarinic acid
US17/209,449 US12252716B2 (en) 2019-06-25 2021-03-23 Strain and method for producing rosmarinic acid
IL289360A IL289360A (en) 2019-06-25 2021-12-23 strain and method for the preparation of rosmarinic acid

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910554108.8A CN111876447B (zh) 2019-06-25 2019-06-25 一种生产迷迭香酸的菌株及方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111876447A CN111876447A (zh) 2020-11-03
CN111876447B true CN111876447B (zh) 2022-04-01

Family

ID=73153865

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910554108.8A Active CN111876447B (zh) 2019-06-25 2019-06-25 一种生产迷迭香酸的菌株及方法

Country Status (11)

Country Link
US (1) US12252716B2 (zh)
EP (1) EP3992298A4 (zh)
JP (1) JP7565306B2 (zh)
KR (1) KR20220038352A (zh)
CN (1) CN111876447B (zh)
AU (1) AU2020303019A1 (zh)
BR (1) BR112021026392A2 (zh)
CA (1) CA3145416A1 (zh)
IL (1) IL289360A (zh)
MX (1) MX2022000059A (zh)
WO (1) WO2020258896A1 (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115895984B (zh) * 2021-09-22 2025-12-02 西安卓虹超源生物科技有限公司 基因工程菌及其应用
CN114410494B (zh) * 2021-12-31 2024-04-16 扬州大学 一种生产迷迭香酸的酿酒酵母工程菌及其构建方法和应用
CN119307468B (zh) * 2024-12-17 2025-04-22 浙江中医药大学金华研究院 一种酶活提高的丹参迷迭香酸合成酶突变体、制备方法及应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1884558A (zh) * 2006-05-30 2006-12-27 天津大学 复合酶水解丹参强化提取丹参多酚酸的方法
CN104415045A (zh) * 2013-08-29 2015-03-18 天士力制药集团股份有限公司 一种药物组合物
CN104611373A (zh) * 2015-02-10 2015-05-13 南京中医药大学 利用生物转化技术从丹参地上茎叶中高效制备丹参酚酸类成分的方法
CN108546722A (zh) * 2018-04-24 2018-09-18 上海中医药大学 一种利用丹参功能基因从头生物合成迷迭香酸的方法
WO2018203482A1 (ja) * 2017-05-01 2018-11-08 株式会社カネカ Ａｔｐを利用した物質の製造方法

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3841914C1 (zh) * 1988-12-13 1990-06-07 Kernforschungsanlage Juelich Gmbh, 5170 Juelich, De
WO2004036979A2 (en) * 2002-10-23 2004-05-06 Rutgers, The State University Of New Jersey Production of vanillin in microbial cells
US20040202731A1 (en) * 2003-04-08 2004-10-14 Gow Robert T. Rosmarinic acid composition
CN102061301B (zh) * 2010-08-04 2012-12-05 陕西师范大学 丹参羟基肉桂酰转移酶基因序列和编码的氨基酸序列及其应用
US9801844B2 (en) * 2012-05-24 2017-10-31 The Research Foundation Of The City University Of New York Methods and compositions for the treatment of cancer
CN102876713B (zh) * 2012-09-20 2013-10-09 陕西师范大学 转基因同时提高丹参中迷迭香酸和丹酚酸b含量的方法
CN103834685A (zh) * 2013-11-29 2014-06-04 陕西师范大学 同时提高丹参中迷迭香酸和丹酚酸b含量的载体及其应用
CN107935855A (zh) 2018-01-04 2018-04-20 湖北瑞晟生物有限责任公司 一种从迷迭香中提取迷迭香酸的工艺
CN108658769A (zh) 2018-04-26 2018-10-16 铜仁职业技术学院 一种基于响应面法夏枯草迷迭香酸提取方法
CN109880862B (zh) * 2019-03-28 2022-07-26 上海中医药大学 一种异源从头生物合成丹酚酸b的方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1884558A (zh) * 2006-05-30 2006-12-27 天津大学 复合酶水解丹参强化提取丹参多酚酸的方法
CN104415045A (zh) * 2013-08-29 2015-03-18 天士力制药集团股份有限公司 一种药物组合物
EP3040077A1 (en) * 2013-08-29 2016-07-06 Tasly Pharmaceutical Group Co., Ltd. Traditional chinese medicine composition
CN104611373A (zh) * 2015-02-10 2015-05-13 南京中医药大学 利用生物转化技术从丹参地上茎叶中高效制备丹参酚酸类成分的方法
WO2018203482A1 (ja) * 2017-05-01 2018-11-08 株式会社カネカ Ａｔｐを利用した物質の製造方法
CN108546722A (zh) * 2018-04-24 2018-09-18 上海中医药大学 一种利用丹参功能基因从头生物合成迷迭香酸的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
药用丹参的基因工程改良研究现状与展望;田鹏;《中草药》;20090831;第40卷(第8期);第1335-1336页第1.2节 *

Also Published As

Publication number Publication date
IL289360A (en) 2022-02-01
EP3992298A1 (en) 2022-05-04
JP7565306B2 (ja) 2024-10-10
CN111876447A (zh) 2020-11-03
EP3992298A4 (en) 2023-06-28
BR112021026392A2 (pt) 2022-04-12
US12252716B2 (en) 2025-03-18
CA3145416A1 (en) 2020-12-30
JP2022540791A (ja) 2022-09-20
WO2020258896A1 (zh) 2020-12-30
KR20220038352A (ko) 2022-03-28
AU2020303019A1 (en) 2022-02-24
US20210207105A1 (en) 2021-07-08
MX2022000059A (es) 2022-05-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Cao et al. Highly efficient production of diverse rare ginsenosides using combinatorial biotechnology
CN111876447B (zh) 一种生产迷迭香酸的菌株及方法
CN110616180B (zh) 一种生产羟基酪醇的工程菌及其应用
CN106350565A (zh) 一种稀有人参皂苷Rh2的生产方法
CN104120141A (zh) 一种微生物催化合成β-石竹烯的方法及能够合成β-石竹烯的重组细胞
Li et al. Highly efficient biosynthesis of salidroside by a UDP-glucosyltransferase-catalyzed cascade reaction
Ruan et al. Efficient synthesis of tyrosol from L-tyrosine via heterologous Ehrlich pathway in Escherichia coli
Wu et al. Production of L-ribose from L-arabinose by co-expression of L-arabinose isomerase and D-lyxose isomerase in Escherichia coli
EP3901256A1 (en) Optimized production of cbga from olivetol acid and geranyl pyrophosphate via synnphb
CN114806998B (zh) 产葡萄糖的罗尔斯通氏菌工程菌及发酵生产方法
WO2023202122A1 (zh) 一种温郁金来源的姜黄素合成酶、基因、载体、工程菌及应用
KR102616750B1 (ko) 유전자 조작 박테리아 및 단삼소 생산에서 이의 응용
CN107828752A (zh) 一种蔗糖淀粉酶、制备方法及在生产α‑熊果苷中的应用
CN115896194B (zh) 一种生产三七素的菌株及方法
CN109370965B (zh) 葡萄糖合成1,3-丙二醇的基因工程菌及其应用
CA2619488A1 (en) Production of l-ribose and other rare sugars
CN113528366B (zh) 一种产beta-丙氨酸酵母菌及其构建方法
CN115838771B (zh) 一种生产β-榄香烯的菌株及方法
CN114395542B (zh) 一种蔗糖磷酸化酶及其应用
CN119709677B (zh) 一种糖基转移酶及其在制备金线莲苷中的应用
CN114317476B (zh) 葡萄糖基甘油的生物催化生产工艺及其蔗糖磷酸化酶
CN117844729B (zh) 一种重组菌株及其制备方法与应用、补身醇的制备方法
CN114231509B (zh) 一种蔗糖磷酸化酶及葡萄糖基甘油生产工艺
Mahmood et al. The production, properties, and applications of l-ribose
US20250250599A1 (en) POLYPHOSPHATE KINASES (PPKs) FOR EFFICIENT REGENERATION OF GUANOSINE TRIPHOSPHATE (GTP) AND USE THEREOF

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant