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CN107427808B - 用于制备核酸测序文库的方法和系统以及用其制备的文库 - Google Patents

用于制备核酸测序文库的方法和系统以及用其制备的文库 Download PDF

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CN107427808B CN201680015074.XA CN201680015074A CN107427808B CN 107427808 B CN107427808 B CN 107427808B CN 201680015074 A CN201680015074 A CN 201680015074A CN 107427808 B CN107427808 B CN 107427808B
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Abstract

本公开内容提供了用于制备测序文库的方法，其包括下述步骤：提供模板核酸序列、dNTP、dUTP、引物、聚合酶、dUTP切除酶和多个包含寡核苷酸衔接子序列区段的珠子；利用所述聚合酶、dNTP、dUTP和随机六聚体扩增所述模板核酸以提供包含偶见dUTP的互补核酸序列；以及利用所述dUTP切除酶切除所掺入的dUTP以在所述互补核酸序列中提供切口，从而提供测序文库。

Description

用于制备核酸测序文库的方法和系统以及用其制备的文库
相关申请的交叉引用
本申请要求提交于2015年1月12日的美国临时专利申请62/102,420和提交于2015年12月3日的美国临时专利申请62/262,769的权益，所述临时申请通过引用全文并入本文用于所有目的。
背景
近年来，核酸测序技术已经经历了快速和巨大的进步。与末端序列延伸产物的嵌套要由科学家通过目视来解读的基于凝胶的分离方法相比，今天的测序技术产生大量的序列数据，允许对之前从未测序的基因组和基因组区域的阐明，并且提供允许将测序广泛应用于常规生物学研究和诊断的通量和成本。
基因组测序可以用来获得各种各样的生物医学背景的信息，包括诊断学、预后、生物技术和法医生物学。测序可包括基本方法，其包括Maxam-Gilbert测序和链终止法或从头测序法(包括鸟枪法测序和桥式PCR)，或新一代方法，其包括聚合酶克隆测序、454焦磷酸测序、Illumina测序、SOLiD测序、Ion Torrent半导体测序、HeliScope单分子测序、
Figure BDA0001404450070000011
测序，等等。对于大多数测序应用，样品如核酸样品在引入测序仪之前先进行处理。例如，可通过扩增或通过附接独特标识符处理样品。独特标识符通常用来标识特定样品的来源。
尽管测序技术取得了巨大进步，又或许被这样巨大的进步所启发，需要能够从核酸样品产生广泛、多样且有代表性的测序文库。此外，随着测序技术应用的扩展，对用于应对大相径庭的样品类型的这些文库制备方法的需求也在增加。例如，均匀探询整个基因组(或至少是基因组的整个感兴趣的部分)的能力对分子生物学家而言是重要的困难来源。均匀性的缺乏源自于向所有各种测序技术中的大量过程输入。例如，片段大小偏倚可能使得测序技术更可能仅对基因组的短片段进行测序。类似地，特定的序列环境可提高或降低部分基因组不会在预测序步骤中被引发和测序或扩增的可能性，从而导致所得序列数据中的序列覆盖不均匀。最后，序列的许多其他特征，例如，二级结构或三级结构，或测序技术，例如，长读与短读技术，可导致测序文库内起始序列的偏倚呈现。
由于这些挑战，将样品核酸转化为可测序文库的过程在例如片段化、分离、扩增、测序仪特异性文库组分掺入和清理方面具有显著的复杂性和时间投入。本文提供了用于制备改进的测序文库的方法和系统，以及所制备的具有简化流程的额外优点的文库。
发明内容
本发明提供了用于制备用作测序文库的核酸文库的改进方法和系统，以及使用这些方法制备的文库。本文所述的文库具有覆盖度提高、错误率低和适用于从较短读序列数据生成长距离序列信息的优点。
本公开内容总体上提供了用于制备测序文库例如条形码测序文库的方法，该文库对于例如采用NGS(下一代测序)的途径是有用的。与常规的基于引物的扩增(引发扩增)文库制备途径相比，通过在切口位点处聚合(无引发扩增)采用无引发扩增如本文所述产生的测序文库提供优异的测序结果，例如，全基因组测序结果。
通常，在一个方面，提供了创建测序文库的方法，其包括从模板核酸创建多个条形码化的核酸片段，所述多个条形码化核酸片段中的每一个均包含共同条形码序列；以及将第一衔接子序列附加至所述多个条形码化核酸片段中的每一个，所述第一衔接子包含一个或多个功能序列。
在一个实施方案中，所述创建步骤包括使所述模板核酸与第一组寡核苷酸接触，所述第一组寡核苷酸包含多个条形码寡核苷酸，所述多个条形码寡核苷酸中的每一个均具有共同条形码序列和在其3’末端处的引物序列；以及使所述多个条形码寡核苷酸上的引物序列与所述模板核酸退火并使所述多个条形码寡核苷酸沿着所述模板核酸延伸，以从所述模板核酸创建所述多个条形码化核酸片段。
在另一实施方案中，所述附加步骤包括使所述多个条形码化核酸片段与第二组寡核苷酸接触，所述第二组寡核苷酸包含与所述多个条形码化核酸片段的至少一部分互补的多个引物序列，和至少一个功能序列；以及使所述第二组寡核苷酸与所述多个条形码化核酸片段退火并使所述第二组寡核苷酸沿着所述多个条形码化核酸片段延伸，以创建包含所述至少一个功能序列的复制条形码化片段。
在又一实施方案中，所述附加步骤包括将所述第一衔接子序列连接至所述多个条形码化核酸片段中的每一个。设想到将所述第一衔接子序列连接至所述多个条形码化核酸片段中的每一个的步骤包括对所述多个条形码化核酸片段中的每一个进行剪切以创建剪切的片段，以及将所述第一衔接子序列连接至所剪切片段的3’末端。
通常，在一个方面，提供了制备测序文库的方法，其包括：(a)提供模板核酸序列、dNTP、dUTP、引物、聚合酶、dUTP切除酶和多个包含寡核苷酸衔接子序列区段的珠子；(b)利用所述聚合酶、dNTP、dUTP和随机六聚体扩增所述模板核酸以提供包含偶见dUTP的互补核酸序列；以及(c)利用所述dUTP切除酶切除所掺入的dUTP以在所述互补核酸序列中提供切口，从而提供测序文库。
在一个实施方案中，所述方法进一步包括步骤(d)，扩增所述带切口的互补核酸序列，以及步骤(e)，采用核酸延伸工具延伸经扩增的核酸序列的序列。在一些实施方案中，上述方法的步骤在单个反应中进行。
在另一实施方案中，所述多个珠子为合并的珠子群体。在具体实施方案中，将所述合并珠子群体的珠子与步骤(a)中所列出的组分中的一种或多种共同分配，并且其中分区任选地包含乳液中的小液滴。
在一些实施方案中，所述珠子包括可降解的珠子，其选自可化学降解的珠子、可光降解的珠子和可热降解的珠子。在具体实施方案中，所述珠子包含可化学还原的交联剂。更具体地，所述可化学还原的交联剂可包括二硫键。
在另一实施方案中，步骤(b)中的所述扩增是等温的。
在进一步的实施方案中，所述聚合酶为phi29DNA聚合酶。
在不同的实施方案中，所述核酸延伸工具选自连接酶、核酸延伸酶和转座酶。在相关的实施方案中，经扩增的核酸序列的文库包含单链DNA，并且所述连接酶包括不依赖ATP的酶。所述不依赖ATP的酶可包括热稳定的5’App DNA/RNA连接酶。在另一相关实施方案中，所述连接酶包括拓扑异构酶。具体地，该拓扑异构酶可为拓扑异构酶I。在又一相关实施方案中，所述连接酶包括T4DNA连接酶。
通常，在另一方面，提供了制备条形码测序文库的方法，其包括：(a)提供模板核酸序列、dNTP、dUTP、引物、聚合酶、dUTP切除酶、核酸延伸工具和多个包含寡核苷酸条形码序列区段的珠子；(b)利用所述聚合酶、dNTP、dUTP和随机六聚体扩增所述模板核酸以提供包含偶见dUTP的互补核酸序列；以及(c)利用所述dUTP切除酶切除所掺入的dUTP以在所述互补核酸序列中提供切口；(d)扩增所述带切口的互补核酸序列以提供经扩增的核酸序列的文库；以及(e)从合并的珠子群体释放所述条形码序列区段；以及(f)使用所述条形码序列区段和所述核酸延伸工具延伸所述经扩增的核酸序列的序列以提供条形码文库，或者备选地，使用核酸连接酶将所述条形码序列区段连接至经扩增的核酸序列的文库以提供条形码文库。
在所述方法的一些实施方案中，所述步骤在单个反应中进行。在一个实施方案中，所述多个珠子为合并的珠子群体。在另一实施方案中，将所述合并珠子群体的珠子与步骤(a)中所列出的组分中的一种或多种共同分配，并且其中分区任选地包含乳液中的小液滴。在进一步的实施方案中，所述珠子包括可降解的珠子，其选自可化学降解的珠子、可光降解的珠子和可热降解的珠子。在特定实施方案中，所述珠子包含可化学还原的交联剂。所述可化学还原的交联剂可包括二硫键。
在其他实施方案中，步骤(b)中的所述扩增是等温的。在一些实施方案中，所述聚合酶为phi29DNA聚合酶。在其他实施方案中，所述核酸延伸工具选自连接酶、核酸延伸酶和转座酶。在一些实施方案中，经扩增的核酸序列的文库包含单链DNA，并且所述连接酶包括不依赖ATP的酶。在具体实施方案中，所述不依赖ATP的酶包括热稳定的5’AppDNA/RNA连接酶。在不同的实施方案中，所述连接酶包括拓扑异构酶。预期该拓扑异构酶可为拓扑异构酶I。
在又一实施方案中，所述连接酶包括T4DNA连接酶。
在一个实施方案中，所述条形码序列区段包含至少4个核苷酸、至少10个核苷酸或至少20个核苷酸。在另一实施方案中，所述条形码序列区段包括至少1000个不同的条形码序列区段。在一些实施方案中，将至少1,000,000个寡核苷酸分子附接至每个珠子。在其他实施方案中，所述合并的珠子群体包含至少10个不同的珠子群体。在不同的实施方案中，所述合并的珠子群体包含至少100个不同的珠子群体。在一个具体的实施方案中，所述合并的珠子群体包含至少500个不同的珠子群体。
在进一步的实施方案中，所述寡核苷酸条形码序列区段包含至少一个功能序列。在一个实施方案中，所述功能序列选自衔接子、引物序列、引物退火序列、附接序列和测序引物序列。在特定实施方案中，所述功能序列是隔绝的(sequestered)并且可在包含刺激的释放步骤中释放，该刺激选自热量增加和化学裂解。在不同的实施方案中，所述释放步骤包括降解包含寡核苷酸条形码序列区段的所述珠子群体的至少一部分珠子。在具体实施方案中，降解所述珠子包括裂解化学键，该化学键包括所述条形码序列区段与所述珠子之间的二硫桥键，并且所述释放步骤包括使所述珠子暴露于还原剂。在特定实施方案中，所述还原剂包括选自DTT和TCEP的还原剂。
援引并入
在本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其引用程度如同具体地且单独地指出每个单独的出版物、专利或专利申请通过引用而并入。
附图简述
图1是说明模板的无引发扩增过程的图示。
图2A是说明采用延伸条形码化途径对模板进行条形码化的图示。
图2B是说明采用连接途径对单链或双链模板进行条形码化的图示。
图2C是说明采用APP DNA/RNA连接酶途径对单链文库分子进行条形码化的图示。
图3示出了基于全基因组测序数据对T碱基偏倚进行测试的结果。
图4A是引发扩增的图，示出了在人类基因组的1000个碱基对分箱(binned)的GC含量上的覆盖均匀性。
图4B是无引物扩增的图，示出了在人类基因组的1000个碱基对分箱的GC含量上的覆盖均匀性。
图5A是未添加dUTP的反应的GC覆盖图。
图5B是添加0.5％dUTP的反应的GC覆盖图。
图5C是添加1％dUTP的反应的GC覆盖图。
图5D是添加2％dUTP的反应的GC覆盖图。
图5E是添加3％dUTP的反应的GC覆盖图。
图6示出了dUTP滴定结果和对嵌合率(chimera rate)、深度位置CV(DPCV)的影响。
图7示出了DTT添加对于DPCV和扩增速率的结果。
图8A示出了采用标准条件，SSB、DTT或二者对DPCV的影响。
图8B示出了SSB添加对扩增速率的影响。
图8C示出了SSB添加对嵌合体减少的影响。
图9示出了时间对DPCV和扩增速率的影响。
图10示出了在具有及没有变性步骤的情况下的DPCV和扩增速率。
图11示出了衔接子浓度对重复率(dup rate)(文库复杂性的量度)和DPCV的影响。
图12A示出了条形码化连接反应时间对DPCV的影响。
图12B示出了条形码化连接反应时间对插入物大小的影响。
图12C示出了条形码化连接反应时间对嵌合体的影响。
图12D示出了条形码化连接反应时间对未映射的分数的影响。
图12E示出了条形码化连接反应时间对扩增速率的影响。
图13示出了用于测试基于T4连接酶的条形码化的特异性的对照实验的结果。
图14A是说明引发扩增反应中测序覆盖的均匀性的直方图。
图14B是说明无引发扩增中测序覆盖的均匀性的直方图。
图15示出了nMer浓度(uM)对五个不同的条形码化模板文库样品的影响。
图16示出了SPRI(固相可逆固定)严格性截止对六个不同的条形码化模板文库样品的影响。
图17示出了总反应时间对五个不同的条形码化模板文库样品的DPCV的影响。
图18示出了尿嘧啶特异性切除试剂
Figure BDA0001404450070000071
浓度对六个不同的条形码化模板文库样品的DPCV的影响。
图19图示了用于制备条形码化测序文库的过程。
图20A、图20B和图20C图示了用于制备条形码化测序文库的备选过程。
图21示出了不同酶在制备测序文库中的表现的比较。
图22图示了在测序文库的制备中对核酸的条形码化片段的处理。
图23图示了用于在测序文库的制备中进一步处理片段核酸的备选过程。
图24图示了备选的文库生成过程。
图25图示了采用连接过程代替引物延伸过程的文库条形码化过程。
发明详述
I.概述
通过在切口位点处聚合，采用无引发扩增进行文库制备
与常规的基于引物的扩增(引发扩增)文库制备途径相比，通过在切口位点处聚合(无引发扩增)采用无引发扩增如本文所述产生的测序文库提供优异的测序结果，例如，全基因组测序结果。有利地，例如，与引发扩增的结果相比，无引发扩增途径产生跨越广泛范围的GC碱基含量的更均匀的测序覆盖。另外，无引发扩增中实现了提高的测序覆盖均匀性，导致与引发扩增的分布相比更加呈泊松式分布。
本发明的设计在图1中概括地示出，图1说明了采用模板的无引发扩增进行文库制备的过程。所示途径还用于如下文实施例中公开的示例性的实验性或预言性支持。在一些实施方案中，测序文库用分子条形码标记并且适合用于NGS(下一代测序)反应。
虽然在图1中作为一系列的小图示出，但所示反应过程可通过聚合过程利用共同存在于无引发扩增中的所有试剂同时进行。该过程可与用于制备测序文库的标准引发扩增过程形成对比。
通常，本发明的一种方法在图1中示出。在图1的(i)中，示出了DNA聚合酶，例如，用于进行等温扩增的phi29DNA聚合酶(New England
Figure BDA0001404450070000081
Inc.(NEB),Ipswich,MA)，包括：采用六聚体(短箭头)和具有极高持续能力和保真度从而导致均匀覆盖和低错误率的phi29DNA聚合酶(椭圆)的启动。随着聚合酶沿着靶序列(长直线)加工，产生拷贝的DNA模板。图1的(ii)示出了在所有dNTP和少量dUTP的存在下，在初始扩增时，dUTP(U)向正在生长的模板链(长箭头)中的基于聚合酶的掺入。图1中的(iii)示出了在反应中包含能够在拷贝的模板DNA链(长箭头)而非原始靶序列(长直线)中切除dUTP并创建切口的酶(带闪电符号的椭圆)。图1中的(iv)示出了通过能够切除dUTP的酶来形成切口的结果，其中来自(iii)的原始扩增链现在为例如四条更短的扩增链(短箭头)。另外，显示了phi29DNA聚合酶(椭圆)，其在切口位点处接合，用于在不依赖引发的扩增过程中的额外扩增。图1中的(v)示出了由于高度持续性的phi29DNA聚合酶(椭圆)，在释放的扩增片段(短箭头)的链置换后，作为模板的原始靶序列(长直线)的再循环。随后的扩增重复(ii)中所示的过程以产生额外的释放的扩增片段(短箭头)。
本公开内容提供了在通过向样品组分的子集受控递送试剂来处理样品材料、随后部分地利用所递送的试剂来分析那些样品组分中有用的方法、系统和组合物。在许多情况下，该方法和组合物用于样品处理，尤其是通常用于核酸分析应用，特别是核酸测序应用。本公开内容包括包含多样性的组的试剂的珠子组合物，如附接至大量含有条形码序列的寡核苷酸的多样性珠子文库，及其制备和使用方法。
制备珠子的方法通常包括，例如，将珠子前体(如单体或聚合物)、引物和交联剂在水溶液中混合，将所述水溶液与油相混合，有时使用微流体装置或小液滴发生器，以及使油包水小液滴形成。在一些情况下，可在小液滴形成之前或之后添加催化剂，如加速剂和/或引发剂。在一些情况下，可通过施加能量，例如通过施加热或光(例如，紫外线)来实现引发。可以在小液滴中发生聚合反应以产生珠子，在一些情况下该珠子与寡核苷酸(例如，引物)的一个或多个拷贝共价连接。可采用多种方法将附加序列连接至功能化的珠子。在一些情况下，将功能化的珠子与模板寡核苷酸(例如，含有条形码)组合并分配，使得平均一个或少数几个模板寡核苷酸与功能化珠子占据相同的分区。尽管分区可以是多种不同类型分区(例如，孔、微孔、管、小瓶、微胶囊等)中的任一种，但在优选的方面，分区可以是乳液内的小液滴(例如，水性小液滴)。可通过反应如引物延伸反应、连接反应或其他方法将寡核苷酸(例如，条形码)序列附接至分区内的珠子。例如，在一些情况下，将用引物功能化的珠子与包含引物结合位点的模板条形码寡核苷酸组合，使得引物能在珠子上延伸。在多轮扩增之后，使单个条形码序列的拷贝与附接至珠子的多个引物相附接。条形码序列附接至珠子后，可将乳液破坏，并且可将条形码化的珠子(或与另一种类型的扩增产物连接的珠子)与不具有扩增的条形码的珠子分离。然后，可采用例如引物延伸法或其他扩增反应，将附加序列如随机序列(例如，随机N-mer)或靶向序列添加至与珠子结合的条形码序列。该过程可产生条形码化珠子的多样性的大文库。
预期功能序列包括，例如，用于将含有条形码的序列固定到表面上(例如，用于测序应用)的固定序列。为方便讨论，在下文中描述了若干特定的功能序列，诸如P5、P7、R1、R2、样品索引、随机Nmer等，和这些序列的部分序列，以及上述任一种的互补序列。但是，应当理解，这些说明是为了讨论的目的，并且含有条形码的寡核苷酸内包含的多种功能序列中的任一种均可替代这些特定的序列，包括但不限于，不同的附接序列、不同的测序引物区域、不同的n-mer区域(靶向的和随机的)以及具有不同功能(例如，二级结构形成，例如，发夹或其他结构)的序列、探针序列(例如，允许探询寡核苷酸的存在与否或允许沉降(pulldown)所产生的扩增子)，或多种其他功能序列中的任一种。
本公开内容还包括用于核酸分析、特别是用于测序应用的样品制备方法。样品制备通常可包括，例如，从来源获得包含样品核酸的样品，任选地进一步处理样品，使样品核酸与条形码化的珠子混合，以及形成含有包含样品核酸和条形码化珠子的流体小液滴的乳液。例如，可借助于微流体装置和/或通过任何合适的乳化方法产生小液滴。流体小液滴也可包含这样的试剂，该试剂能够溶解、降解或以其他方式破坏条形码化的珠子，和/或破坏与所附接的序列的联接，由此将所附接的条形码序列从珠子释放。可通过降解珠子、使寡核苷酸与珠子解离(如通过裂解反应)或两者的组合来释放条形码序列。例如，通过扩增(例如，经由本文所述的扩增方法)流体小液滴中的样品核酸，游离的条形码序列可附接至样品核酸。然后可破坏包含流体小液滴的乳液，并且如果需要，然后可使用例如其他扩增方法将附加序列(例如，有助于特定测序方法的序列、附加条形码序列等)添加至条形码化的样品核酸。然后可在条形码化的、扩增的样品核酸上进行测序，并采用一种或多种测序算法来解释测序数据。如本文所用的，样品核酸可包括多种核酸中的任一种，包括例如，DNA和RNA，特别包括例如，基因组DNA、cDNA、mRNA、总RNA以及由mRNA或总RNA转录物产生的cDNA。
本公开内容的方法和组合物可与任何合适的数字处理器一起使用。数字处理器可被编程，例如，用以操作装置的任何组件和/或执行本文所述的方法。在一些实施方案中，可在与小液滴发生器通信的数字处理器的帮助下执行珠子形成。数字处理器可控制小液滴形成的速度或控制产生的小液滴的总数。在一些实施方案中，可在微流体装置和与该微流体装置通信的数字处理器的帮助下完成条形码序列与样品核酸的附接。在一些情况下，数字处理器可控制向微流体装置的通道提供的样品和/或珠子的量，通道内材料的流速，以及包含条形码序列和样品核酸的小液滴的产生速率。
本公开内容的方法和组合物可用于多种不同的分子生物学应用，包括但不限于核酸测序、蛋白质测序、核酸定量、测序优化、检测基因表达、定量基因表达、表观遗传学应用以及基因组的或表达的标记物的单细胞分析。此外，本公开内容的方法和组合物具有许多医学应用，包括多种遗传和非遗传疾病和病症(包括癌症)的鉴别、检测、诊断、治疗、分期或风险预测。
II.珠子或颗粒
本公开内容的方法、组合物、装置和试剂盒可与任何合适的珠子或颗粒(包括凝胶珠子和其他类型珠子)一起使用。珠子可充当将依照本文所述的方法被递送的试剂的载体。特别地，这些珠子可提供表面(试剂可释放地附接至其上)或体积(试剂被夹带在其中或以其他方式可释放地分配)。然后可依照期望的方法(例如，在试剂向离散分区中的受控递送中)递送这些试剂。许多不同的试剂或试剂类型可以与珠子关联，其中可希望向分区递送这类试剂。这类试剂的非限制性实例包括，例如，酶、多肽、抗体或抗体片段、标记试剂(例如，染料、荧光团、生色团等)、核酸、多核苷酸、寡核苷酸，以及上述两种或更多种的任意组合。在一些情况下，珠子可提供表面，在该表面上合成或附接寡核苷酸序列。包括寡核苷酸、条形码序列、引物、交联剂等在内的多种实体可以与珠子的外表面关联。在多孔珠子的情况下，实体可与珠子的外表面和内表面均关联。实体可直接附接至珠子的表面(例如，通过共价键、离子键、范德华相互作用等)、可附接至其他已附接至珠子表面的寡核苷酸序列(例如，衔接子或引物)、可在珠子的整个内部扩散和/或可在分区(例如，流体小液滴)中与珠子组合。在优选的实施方案中，寡核苷酸共价地附接至珠子的聚合物基质内的位点，因此其存在于珠子的内部和外部。在一些情况下，实体如细胞或核酸被封装在珠子内。包括扩增试剂(例如，PCR试剂、引物)在内的其他实体还可在整个珠子中扩散或在珠子的内部(例如，通过孔，共价附接至聚合物基质)化学地连接。
珠子可用来定位实体或样品。在一些实施方案中，实体(例如，寡核苷酸、条形码序列、引物、交联剂、衔接子等)可以与珠子的外表面和/或内表面关联。在一些情况下，实体可位于整个珠子上。在一些情况下，实体可与珠子的整个表面关联或与珠子表面的至少一半关联。
珠子可作为支持物，在其上合成寡核苷酸序列。在一些实施方案中，寡核苷酸的合成可包括连接步骤。在一些情况下，寡核苷酸的合成可包括将两个较小的寡核苷酸连接在一起。在一些情况下，通过附接至珠子的引物，引物延伸或其他扩增反应可用于在珠子上合成寡核苷酸。在这类情况下，附接至珠子的引物可以与也含有模板核苷酸序列的寡核苷酸的引物结合位点杂交。然后可通过引物延伸反应或其他扩增反应将引物延伸，并且与模板寡核苷酸互补的寡核苷酸可由此附接至珠子。在一些情况下，与珠子关联的一组相同的寡核苷酸可以与一组多样性的寡核苷酸相连接，使得每个相同的寡核苷酸附接至这组多样性的寡核苷酸的不同成员。在其他情况下，与珠子关联的一组多样性的寡核苷酸可以与一组相同的寡核苷酸相连接。
珠子的特征
本公开内容的方法、组合物、装置和试剂盒可与任何合适的珠子一起使用。在一些实施方案中，珠子可以是多孔的、无孔的、固体的、半固体的、半流体的或流体的。在一些实施方案中，珠子可以是可溶解的、可破坏的或可降解的。在一些情况下，珠子可以不是可降解的。在一些实施方案中，珠子可以是凝胶珠子。凝胶珠子可以是水凝胶珠子。凝胶珠子可以由分子前体如聚合物或单体物质形成。半固体珠子可以是脂质体珠子。固体珠子可包含金属，包括氧化铁、金和银。在一些情况下，珠子是二氧化硅珠子。在一些情况下，珠子是刚性的。在一些情况下，珠子可以是柔性的。
在一些实施方案中，珠子可含有分子前体(例如，单体或聚合物)，该分子前体可通过前体的聚合形成聚合物网络。在一些情况下，前体可以是已经聚合的、能够经历进一步聚合(例如，通过化学交联)的物质。在一些情况下，前体包含丙烯酰胺或甲基丙烯酰胺单体、寡聚物或聚合物中的一种或多种。在一些情况下，珠子可包含预聚物，该预聚物是能够进一步聚合的寡聚物。例如，可采用预聚物制备聚氨酯珠子。在一些情况下，珠子可含有可进一步聚合在一起的单独的聚合物。在一些情况下，可通过不同前体的聚合产生珠子，使得其包含混合的聚合物、共聚物和/或嵌段共聚物。
珠子可包含天然的和/或合成的材料，包括天然的和合成的聚合物。天然聚合物的实例包括蛋白质和糖，诸如脱氧核糖核酸、橡胶、纤维素、淀粉(例如，直链淀粉、支链淀粉)、蛋白质、酶、多糖、丝、聚羟基烷酸酯、壳聚糖、葡聚糖、胶原、角叉菜胶、卵叶车前子、阿拉伯树胶、琼脂、明胶、虫胶、梧桐胶、黄原胶、玉米糖胶、瓜尔胶、刺梧桐胶(gum karaya)、琼脂糖、藻酸、藻酸盐或其天然聚合物。合成聚合物的实例包括丙烯酸、尼龙、硅酮、氨纶(spandex)、粘胶人造丝、聚羧酸、聚醋酸乙烯酯、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚乙二醇、聚氨酯、聚乳酸、二氧化硅、聚苯乙烯、聚丙烯腈、聚丁二烯、聚碳酸酯、聚乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚(氯三氟乙烯)、聚(环氧乙烷)、聚(对苯二甲酸乙二醇酯)、聚乙烯、聚异丁烯、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲醛)、聚甲醛、聚丙烯、聚苯乙烯、聚(四氟乙烯)、聚(乙烯基)(poly(vinyl))、聚(乙烯醇)、聚(氯乙烯)、聚(偏二氯乙烯)、聚(乙烯基二氟乙酸酯材料)(poly(vinylidene diflu acetate oride materials))、聚(氟乙烯)和其组合(例如，共聚物)。珠子也可由除聚合物之外的材料形成，该材料包括脂质、胶束、陶瓷、玻璃陶瓷、材料复合物、金属、其他无机材料以及其他材料。
在一些情况下，化学交联剂可以是在单体聚合过程中用于交联单体的前体和/或可用于用物质将珠子功能化。在一些情况下，聚合物可与交联剂物质或其他类型的单体进一步聚合，以产生进一步聚合的网络。化学交联剂的非限制性实例包括胱胺、戊二醛、辛二亚氨酸二甲酯、N-羟基琥珀酰亚胺交联剂BS3、甲醛、碳二亚胺(EDC)、SMCC、Sulfo-SMCC、乙烯基硅烷(vinylsilance)、N,N'二烯丙基酒石二酰胺(DATD)、N,N'-二(丙烯酰)胱胺(BAC)或其同系物。在一些情况下，在本公开内容中使用的交联剂含有胱胺。
根据所使用的特定交联剂，交联可以是永久的或可逆的。可逆交联可使得聚合物线性化，或在合适的条件下离解。在一些情况下，可逆的交联也可使得结合至珠子表面的材料能够可逆附接。在一些情况下，交联剂可以形成二硫键。在一些情况下，形成二硫键的化学交联剂可以是胱胺或修饰的胱胺。在一些实施方案中，二硫键可在分子前体单元(例如，单体、寡聚物或线性聚合物)之间形成。在一些实施方案中，二硫键可在引入到珠子中的前体或分子前体单元(例如，单体、寡聚物或线性聚合物)和寡核苷酸之间形成。
例如，胱胺(包括修饰的胱胺)是包含二硫键的有机试剂，其可用作珠子的单独单体或聚合前体之间的交联剂。聚丙烯酰胺可在胱胺或包含胱胺的物质(例如，修饰的胱胺)的存在下聚合，以产生包含二硫键的聚丙烯酰胺凝胶珠子(例如，含有可化学还原的交联剂的可化学降解的珠子)。二硫键可允许珠子在暴露于还原剂时被降解(或溶解)。
在至少一个可替代的实例中，一种线性多糖聚合物—壳聚糖，可通过亲水链与戊二醛交联以形成珠子。壳聚糖聚合物的交联可通过由热、压力、pH变化和/或辐射引发的化学反应实现。
在一些实施方案中，珠子可在聚合物前体(例如，单体、寡聚物、线性聚合物)、寡核苷酸、引物和其他实体之间包含共价键或离子键。在一些情况下，该共价键包含碳-碳键或硫醚键。
在一些情况下，珠子可包含acrydite部分，其在某些方面可用于将一种或多种物质(例如，条形码序列、引物、其他寡核苷酸)附接至珠子。在一些情况下，acrydite部分可以指由acrydite与一种或多种物质反应(例如，在聚合反应期间acrydite与其他单体和交联剂的反应)产生的acrydite类似物。可以修饰acrydite部分以与待附接的物质如寡核苷酸(例如，条形码序列、引物、其他寡核苷酸)形成化学键。例如，acrydite部分可以用能够形成二硫键的巯基基团修饰，或者可以用已经包含二硫键的基团修饰。巯基或二硫键(通过二硫键交换)可用作待附接的物质的锚定点，或者acrydite部分的另一部分可用于附接。在一些情况下，附接是可逆的，使得当二硫键断裂时(例如，在还原剂的存在下)，试剂从珠子释放。在其他情况下，acrydite部分包含可用于附接的反应性羟基基团。
为附接其他物质(例如，核酸)对珠子的功能化可通过多种不同的途径实现，包括聚合物内化学基团的活化、聚合物结构中活性或可激活的官能团的引入、或在珠子产生的预聚物或单体阶段的附接。
例如，在一些实例中，聚合以形成珠子的前体(例如，单体、交联剂)可包含acrydite部分，使得当珠子产生时，该珠子还包含acrydite部分。通常，acrydite部分附接至寡核苷酸序列，如期望引入珠子中的引物(例如，用于扩增靶核酸和/或对靶核酸条形码序列、结合序列等进行测序中的一种或多种的引物)。在一些情况下，该引物包含P5序列。例如，丙烯酰胺前体(例如，交联剂、单体)可包含acrydite部分，使得当其聚合以形成珠子时，该珠子还包含acrydite部分。
在一些情况下，诸如单体和交联剂的前体可包含例如单个寡核苷酸(例如，如引物或其他序列)或其他物质。在一些情况下，诸如单体和交联剂的前体可包含多个寡核苷酸、其他序列或其他物质。在每个前体中包含多个acrydite部分或其他连接体物质可改善所连接的物质(例如，寡核苷酸)向由前体产生的珠子中的加载，因为每个前体均包含待加载的物质的多个拷贝。
在一些情况下，包含反应性官能团或能够被激活从而使其变为反应性的官能团的前体可与其他前体聚合，以形成包含激活的或可激活的官能团的凝胶珠子。然后，官能团可用于使附加物质(例如，二硫键连接体、引物、其他寡核苷酸等)附接至凝胶珠子。例如，一些包含羧酸(COOH)基团的前体可与其他前体共聚，以形成还包含COOH官能团的凝胶珠子。在一些情况下，丙烯酸(包含游离COOH基团的物质)、丙烯酰胺和二(丙烯酰)胱胺可以共聚在一起以生成包含游离羟基的凝胶珠子。该凝胶珠子的COOH基团可被激活(例如，通过1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)或4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-二甲基吗啉鎓氯化物(DMTMM))，使其是反应性的(例如，在EDC/NHS或DMTMM用于激活的情况下，对胺官能团是反应性的)。然后，激活的COOH基团可以与包含将要连接至珠子的部分的合适物质(例如，在羧酸基团被激活为对胺官能团具有反应性的情况下，包含胺官能团的物质)反应。
可通过使一些二硫键还原为游离的巯基，将在其聚合物网络中包含二硫键的珠子用附加物质功能化。例如，可通过还原剂(例如，DTT、TCEP等)的作用，在不溶解珠子的情况下使二硫键还原，以产生游离的巯基基团。然后，珠子的游离巯基可以与物质的游离巯基或者与包含另一个二硫键的物质反应(例如，通过巯基-二硫键交换)，使得该物质可连接至珠子(例如，通过产生的二硫键)。然而，在一些情况下，珠子的游离巯基可以与任何其他合适的基团反应。例如，珠子的游离巯基可以与包含acrydite部分的物质反应。珠子的游离巯基基团可通过迈克尔加成化学与acrydite反应，使得包含acrydite的物质连接至珠子。在一些情况下，可以通过包含巯基封端剂例如N-乙基马来酰亚胺和碘乙酸盐来防止不受控制的反应。
可以控制珠子内的二硫键的活化，使得只有少量的二硫键被激活。例如，可通过控制用于产生游离巯基基团的还原剂的浓度和/或控制用于在珠子聚合中形成二硫键的试剂的浓度来施加控制。在一些情况下，可将低浓度(例如，还原剂分子：凝胶珠子的比例小于约10000、100000、1000000、10000000、100000000、1000000000、10000000000或100000000000)的还原剂用于还原。控制被还原成游离巯基的二硫键的数目对于在功能化期间确保珠子结构完整性可能是有用的。在一些情况下，光活性剂如荧光染料可通过珠子的游离巯基偶联至珠子，并用于定量珠子中存在的游离巯基的数目和/或追踪珠子。
在一些情况下，在凝胶珠子形成之后向凝胶珠子添加部分可以是有利的。例如，在凝胶珠子形成后物质的添加可避免在聚合期间可能发生的链转移终止过程中的物质损失。此外，较小的前体(例如，不包含侧链基团和连接的部分的单体或交联剂)可用于聚合，并几乎不受由粘滞效应引起的对生长链末端的阻碍。在一些情况下，在凝胶珠子合成之后的功能化可使待加载的物质(例如，寡核苷酸)在可能的损伤剂(例如，自由基)和/或化学环境中的暴露最小化。在一些情况下，所产生的凝胶可具有上临界溶解温度(UCST)，UCST可允许珠子的温度驱使的溶胀和瓦解。这种功能性可在随后用物质对珠子的功能化期间帮助物质(例如，引物，P5引物)渗透到珠子中。产生后的功能化还可用于控制珠子中物质的加载比，使得例如加载比的可变性最小化。另外，物质加载可以在分批工艺中进行，使得多个珠子可在单批中用该物质功能化。
在一些情况下，与前体连接的acrydite部分、与前体连接的另一物质或前体本身包含不稳定的键，诸如，例如，化学、热或光敏感的键，例如，二硫键、UV敏感的键等。一旦包含不稳定键的acrydite部分或其他部分被引入珠子中，该珠子也可包含该不稳定键。例如，不稳定的键可以在将物质(例如，条形码、引物等)可逆地连接(共价连接)至珠子时是有用的。在一些情况下，热不稳定的键可包括基于核酸杂交的附接(例如，当寡核苷酸与附接至珠子的互补序列杂交时)，使得杂合体的热解链从珠子或微胶囊释放寡核苷酸，例如，含有条形码的序列。此外，向凝胶珠子添加多种类型的不稳定键可导致能够响应于不同刺激的珠子的产生。每种类型的不稳定键可以对相关的刺激(例如，化学刺激、光、温度等)敏感，使得可通过施加合适的刺激来控制通过每种不稳定键附接至珠子的物质的释放。这种功能性对物质从凝胶珠子上的受控释放是有用的。在一些情况下，例如，通过如上文所述的凝胶珠子的活化官能团，可在凝胶珠子形成后将包含不稳定键的另一物质连接至凝胶珠子。应当理解，可释放地、可裂解地或可逆地附接至本文所述的珠子的条形码包括通过条形码分子与珠子之间的联接的裂解而被释放或可释放的条形码，或通过基础珠子自身的降解而被释放的条形码，从而使条形码能够被其他试剂接近或可接近，或包括这两者。通常，如本文所述的可释放的条形码通常可被称为可激活的，因为其一旦被释放即可用于反应。因此，例如，可通过将条形码从珠子(或本文所述的其他合适类型的分区)释放来激活可激活的条形码。应当理解，在描述的方法和系统的背景下也想到其他可激活的配置。特别地，可提供可释放地附接至珠子或以其他方式布置在分区中的试剂(带有关联的可激活的基团)，使得一旦递送至期望的一组试剂(例如，通过共同分配)，可激活的基团可以与期望的试剂反应。这类可激活的基团包括笼蔽基团、可去除的阻断或保护基团，例如，光不稳定基团、热不稳定基团，或可化学去除的基团。
除热可裂解的键、二硫键和UV敏感的键之外，可与前体或珠子偶联的不稳定键的其他非限制性实例还包括酯联接(例如，可用酸、碱或羟胺裂解的)、邻二醇联接(例如，可通过高碘酸钠裂解的)、Diels-Alder联接(例如，可通过热裂解的)、砜联接(例如，可通过碱裂解的)、甲硅烷基醚联接(例如，可通过酸裂解的)、糖苷联接(例如，可通过淀粉酶裂解的)、肽联接(例如，可通过蛋白酶裂解的)或磷酸二酯联接(例如，可通过核酸酶(DNA酶)裂解的)。
珠子可以与不同数目的acrydite部分连接。例如，珠子可包含约1、10、100、1000、10000、100000、1000000、10000000、100000000、1000000000或10000000000个连接至珠子的acrydite部分。在其他实例中，珠子可包含至少1、10、100、1000、10000、100000、1000000、10000000、100000000、1000000000或10000000000个连接至珠子的acrydite部分。例如，珠子可包含约1、10、100、1000、10000、100000、1000000、10000000、100000000、1000000000或10000000000个共价连接至珠子(如通过acrydite部分)的寡核苷酸。在其他实例中，珠子可包含至少1、10、100、1000、10000、100000、1000000、10000000、100000000、1000000000或10000000000个共价连接至珠子(如通过acrydite部分)的寡核苷酸。
还可在珠子产生期间(例如，在前体聚合期间)将不参与聚合的物质封装在珠子中。这类物质可以进入聚合反应混合物，使得在珠子形成时所产生的珠子包含该物质。在一些情况下，这类物质可在凝胶珠子形成后添加至凝胶珠子。这类物质可包括，例如，寡核苷酸、包括本文所述的那些的核酸扩增反应所需的物质(例如，引物、聚合酶、dNTP、辅因子(例如，离子型辅因子))、酶反应所需的物质(例如，酶、辅因子、底物)或核酸修饰反应如聚合、连接或消化所需的物质。这类物质的捕获可通过在前体聚合期间产生的聚合物网络密度、凝胶珠子内离子电荷的控制(例如，通过与聚合的物质连接的离子型物质)或通过其他物质的释放来控制。封装的物质可在珠子降解时和/或通过施加能够使物质从珠子释放的刺激而从珠子释放。
珠子可以具有均匀的大小或不均匀的大小。在一些情况下，珠子的直径可以为约1μm、5μm、10μm、20μm、30μm、40μm、45μm、50μm、60μm、65μm、70μm、75μm、80μm、90μm、100μm、250μm、500μm或1mm。在一些情况下，珠子可以具有至少约1μm、5μm、10μm、20μm、30μm、40μm、45μm、50μm、60μm、65μm、70μm、75μm、80μm、90μm、100μm、250μm、500μm、1mm或更大的直径。在一些情况下，珠子可以具有小于约1μm、5μm、10μm、20μm、30μm、40μm、45μm、50μm、60μm、65μm、70μm、75μm、80μm、90μm、100μm、250μm、500μm或1mm的直径。在一些情况下，珠子可以具有在约40-75μm、30-75μm、20-75μm、40-85μm、40-95μm、20-100μm、10-100μm、1-100μm、20-250μm或20-500μm的范围内的直径。
在某些优选的方面，珠子以具有相对单分散的大小分布的珠子群体提供。应当理解，在一些期望在分区内提供相对一致量的试剂的应用中，维持相对一致的珠子特征如大小有助于总体的一致性。特别地，本文所述的珠子可以具有这样的大小分布，该大小分布具有小于50％、小于40％、小于30％、小于20％的珠子横截面尺寸的变化系数，并且在一些情况下，该变化系数小于15％、小于10％或者甚至小于5％。
珠子可以具有规则形状或不规则形状。珠子形状的实例包括球形、非球形、椭圆形、长方形、无定形的、圆形、圆柱形和其同系物。
可降解的珠子
除了上述珠子与相关联的分子(例如，含有条形码的寡核苷酸)之间的可裂解联接之外或作为其替代，珠子可以是自发地或在暴露于一种或多种刺激(例如，温度变化、pH变化、暴露于特定化学物质或化学相、暴露于光、还原剂等)时可降解的、可破坏的或可溶解的。在一些情况下，珠子可以是可溶解的，使得当暴露于特定化学物质或环境变化(诸如，例如温度或pH)时，珠子的材料组分溶解。例如，凝胶珠子可以在升高的温度和/或碱性条件下降解或溶解。在一些情况下，珠子可以是可热降解的，使得当珠子暴露于合适的温度变化(例如，热)时，珠子降解。与物质(例如，核酸物质)结合的珠子的降解或溶解可导致物质从珠子上的释放。
可降解的珠子可包含一种或多种具有不稳定键的物质，使得当珠子/物质暴露于合适的刺激时，该键被破坏并且珠子降解。该不稳定键可以是化学键(例如，共价键、离子键)，或者可以是另一种类型的物理相互作用(例如，范德华相互作用、偶极-偶极相互作用等)。在一些情况下，用于产生珠子的交联剂可包含不稳定键。当暴露于合适的条件时，不稳定键被破坏并且珠子被降解。例如，聚丙烯酰胺凝胶珠子可包含胱胺交联剂。当珠子暴露于还原剂时，胱胺的二硫键被破坏并且珠子被降解。
可降解的珠子对于在向珠子施加合适的刺激时更快地从珠子释放所附接的物质(例如，寡核苷酸、条形码序列)可以是有用的。例如，对于结合至多孔珠子内表面的物质或在封装的物质的情况下，当珠子降解时，该物质可以具有更高的迁移性和对溶液中其他物质的易接近性。在一些情况下，还可通过可降解的连接体(例如，二硫键连接体)将物质附接至可降解的珠子。可降解的连接体可以与可降解的珠子响应于相同的刺激，或者两种可降解的物质可以响应于不同的刺激。例如，可通过二硫键将条形码序列附接至包含胱胺的聚丙烯酰胺珠子。当条形码化的珠子暴露于还原剂时，珠子降解，并且在条形码序列与珠子之间的二硫键以及珠子中胱胺的二硫键被破坏时条形码序列得到释放。
可将可降解的珠子引入到分区如乳液的小液滴或孔中，使得当施加合适的刺激时，分区内的珠子降解并且任何关联的物质均释放到小液滴中。游离的物质可以与其他物质相互作用。例如，可将包含胱胺且与条形码序列通过二硫键连接的聚丙烯酰胺珠子与还原剂在油包水乳液的小液滴内混合。在小液滴内，该还原剂破坏多个二硫键，导致珠子降解和条形码序列向小液滴的水性内环境中的释放。在另一个实例中，将包含结合珠子的条形码序列的小液滴在碱性溶液中加热也可导致珠子降解和所附接的条形码序列向小液滴的水性内环境中的释放。
从上述公开内容将会理解，尽管称为珠子的降解，但在许多上面提到的情况下，该降解可以指结合的或所夹带的物质从珠子上的离解，伴随和不伴随物理珠子自身的结构降解。例如，可通过例如由化学环境改变导致的渗透压差，使所夹带的物质从珠子释放。举例而言，通常可能在珠子自身没有结构降解的情况下发生由渗透压差引起的珠子孔大小的改变。在一些情况下，由珠子的渗透性溶胀导致的孔大小的增加可使得珠子中所夹带的物质能够释放。在其他情况下，由于孔大小收缩，珠子的渗透性萎缩可使珠子更好地保持所夹带的物质。
应当理解，当提供可降解的珠子时，可能期望避免在所需的时间之前将这类珠子暴露于导致这类降解的一种或多种刺激，以便避免珠子过早降解以及由这种降解所导致的问题，包括例如流动特性差、结块和聚集。举例而言，当珠子包含可还原的交联基团如二硫键基团时，将期望避免使这类珠子与还原剂(例如，DTT或其他二硫键裂解试剂)接触。在这类情况下，对本文所述的珠子的处理在一些情况下会是无还原剂如DTT的。因为还原剂常常在商用的酶制剂中提供，所以通常期望在处理本文所述的珠子时提供无还原剂(或无DDT)的酶制剂。这类酶的实例包括，例如，聚合酶制剂、连接酶制剂以及许多其他可用于处理本文所述的珠子的酶制剂。所谓“无还原剂的”或“无DTT的”制剂是指对于在降解珠子中使用的这类材料，该制剂将具有小于其下限的1/10、小于1/50和甚至小于1/100。例如，对于DTT，无还原剂的试剂通常将含有少于0.01mM、0.005mM、0.001mM的DTT、0.0005mM DTT或者甚至少于0.0001mM的DTT或更少。在许多情况下，DTT的量将是检测不到的。
用于降解珠子的方法
在一些情况下，刺激可用于触发珠子的降解，这可导致内含物从珠子的释放。通常，刺激可导致珠子结构的降解，如共价键或其他类型的物理相互作用的降解。这些刺激在诱导珠子降解和/或释放其内含物方面可能是有用的。如下面更详细描述的，可使用的刺激的实例包括化学刺激、热刺激、光刺激及其任意组合。
许多化学触发物可用于触发珠子的降解。这些化学变化的实例可包括但不限于珠子内组分完整性的pH介导的变化、通过交联键的裂解发生的珠子组分的降解以及珠子组分的解聚。
在一些实施方案中，珠子可以由包含可降解化学交联剂如BAC或胱胺的材料形成。这类可降解交联剂的降解可通过多种机制实现。在一些实例中，可以使珠子与可诱导氧化、还原或其他化学变化的化学降解剂接触。例如，化学降解剂可以是还原剂，如二硫苏糖醇(DTT)。还原剂的其他实例可包括β-巯基乙醇、(2S)-2-氨基-1,4-二巯基丁烷(二硫丁胺或DTBA)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)或其组合。还原剂可以降解在形成珠子的凝胶前体之间形成的二硫键，因此使珠子降解。在其他情况下，溶液pH的变化，如pH增加，可触发珠子的降解。在其他情况下，暴露于水溶液如水可触发水解降解，因此使珠子降解。
当施加热刺激时，也可诱导珠子释放其内含物。温度的变化可导致珠子的多种变化。例如，热可导致固体珠子液化。热的变化可导致珠子的熔化，使得珠子的一部分降解。在其他情况下，热可增加珠子组分的内部压力，使得珠子破裂或爆炸。热还可作用于用作构建珠子的材料的热敏性聚合物。
本公开内容的方法、组合物、装置和试剂盒可以与任何合适的试剂一起使用以降解珠子。在一些实施方案中，温度或pH的变化可用于降解珠子内的热敏感的或pH敏感的键。在一些实施方案中，化学降解剂可用于通过氧化、还原或其他化学变化降解珠子内的化学键。例如，化学降解剂可以是还原剂，如DTT，其中DTT可以降解在交联剂与凝胶前体之间形成的二硫键，从而使珠子降解。在一些实施方案中，可添加还原剂以降解珠子，这可导致或可不导致珠子释放其内含物。还原剂的实例可包括二硫苏糖醇(DTT)、β-巯基乙醇、(2S)-2-氨基-1,4-二巯基丁烷(二硫丁胺或DTBA)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)或其组合。还原剂可以以0.1mM、0.5mM、1mM、5mM或10mM存在。还原剂可以以高于0.1mM、0.5mM、1mM、5mM、10mM或更高的浓度存在。还原剂可以以低于0.1mM、0.5mM、1mM、5mM或10mM存在。
降解步骤的时机
可以降解珠子以释放附接至和包含在珠子内的内含物。该降解步骤可以在样品与珠子组合的同时发生。该降解步骤可以在样品与珠子在可在微流体装置中形成的流体小液滴内组合时同时发生。该降解步骤可以在样品与珠子在可在微流体装置中形成的流体小液滴内组合之后发生。应当理解，在许多应用中可以不发生降解步骤。
还原剂可以与样品组合，然后与珠子组合。在一些情况下，可将还原剂与样品同时引入微流体装置。在一些情况下，可在引入样品之后将还原剂引入微流体装置。在一些情况下，可使样品与还原剂在微流体装置中混合，然后与微流体装置中的凝胶珠子接触。在一些实施方案中，可使样品与还原剂预混合，然后将其加入装置中并与凝胶珠子接触。
可降解的珠子可以在施加在合适的刺激时立即降解。在其他情况下，珠子的降解可随时间发生。例如，珠子可以在施加合适的刺激时立即降解或在约0、0.01、0.1、0.5、1、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、11、12、13、14、15或20分钟之内降解。在其他实例中，珠子可以在施加合适的刺激时立即降解或在至多约0、0.01、0.1、0.5、1、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、11、12、13、14、15或20分钟之内降解。
珠子还可以相对于与样品组合在不同的时间降解。例如，珠子可以与样品组合并随后在稍后的时间点降解。样品与珠子组合与随后的珠子降解之间的时间可以为约0.0001、0.001、0.01、1、10、30、60、300、600、1800、3600、18000、36000、86400、172800、432000或864000秒。样品与珠子组合与随后的珠子降解之间的时间可以超过约0.0001、0.001、0.01、1、10、30、60、300、600、1800、3600、18000、36000、86400、172800、432000、864000秒或更长。样品与珠子组合与随后的珠子降解之间的时间可以少于约0.0001、0.001、0.01、1、10、30、60、300、600、1800、3600、18000、36000、86400、172800、432000或864000秒。
制备用寡核苷酸预功能化的珠子
可采用多种方法产生本文所述的珠子。合适的珠子在于2014年6月26日提交的公开号为20140378350的美国专利申请中描述，其内容通过引用并入本文。在一些情况下，珠子可以由含有分子前体(例如，线性聚合物、单体、交联剂)的液体形成。然后使该液体经历聚合反应，并由此硬化或胶凝成为珠子(或凝胶珠子)。该液体还可含有在聚合过程中引入珠子中的实体如寡核苷酸。该引入可通过与珠子共价或非共价缔合而实现。例如，在一些情况下，可在形成期间使寡核苷酸夹带在珠子中。或者，它们可以在形成过程中或形成之后偶联至珠子或珠子框架。通常，寡核苷酸与acrydite部分连接，该acrydite部分在聚合过程中变得与珠子交联。在一些情况下，寡核苷酸通过二硫键附接至acrydite部分。结果，形成了包含珠子-acrydite-S-S-寡核苷酸联接的组合物。
在一个示例性过程中，可通过将多种聚合物和/或单体与一种或多种寡核苷酸例如一种或多种包含引物(例如，通用引物、测序引物)的寡核苷酸混合产生功能化的珠子。该聚合物和/或单体可包含丙烯酰胺并且可以交联，使得在聚合物和/或单体之间形成二硫键，从而导致形成硬化的珠子。该寡核苷酸可在硬化的珠子形成过程中(例如，同时地)共价连接至所述多种聚合物和/或单体，或者可在硬化的珠子形成之后(例如，顺序地)共价连接至所述多种聚合物和/或单体。在一些情况下，该寡核苷酸可通过acrydite部分连接至珠子。
在多数情况下，一个群体的珠子均用相同的寡核苷酸如通用引物或引物结合位点预功能化。在一些情况下，珠子群体中的珠子用多种不同的寡核苷酸预功能化。这些寡核苷酸可任选地包含多种不同功能序列中的任何序列，例如，用于在随后的珠子处理或应用中使用。功能序列可包括，例如，引物序列(诸如靶向引物序列、通用引物序列，例如，足够短从而能够与样品核酸上的许多不同位置杂交并引发从所述位置延伸的引物序列，或随机引物序列)、附接或固定序列、连接序列、发夹序列、标记序列(例如，条形码或样品索引序列)或多种其他核苷酸序列中的任何序列。
举例而言，在一些情况下，通用引物(例如，P5或其他合适的引物)可用作每个珠子上的引物，以将附加内含物(例如，条形码、随机N-mer、其他功能序列)附接至珠子。在一些情况下，通用引物(例如，P5)还可与测序装置相兼容，并且可稍后使得期望的链能够附接至测序装置内的流动池。例如，这类附接或固定序列可提供约束在测序装置中流动池表面的寡核苷酸的互补序列，以使得序列能够固定到该表面上以供测序。或者，这类附接序列可额外地在附接至珠子的寡核苷酸序列内提供或添加至其上。在一些情况下，珠子和其附接的物质可提供为与后续分析过程如测序装置或系统相兼容。在一些情况下，可将超过一种引物附接至珠子，并且超过一种引物可含有通用序列，以便例如使得寡核苷酸以及任何偶联至该序列的附加序列能够在不同的顺序或平行处理步骤中差异处理，例如，第一引物用于靶序列的扩增，而第二引物用于扩增产物的测序。例如，在一些情况下，附接至珠子的寡核苷酸将包含用于进行第一扩增或复制过程(例如，沿着靶核酸序列使引物延伸)的第一引物序列，以便产生扩增的条形码化靶序列。通过还在寡核苷酸内包含测序引物，所得的扩增靶序列将包含这样的引物，并且容易地转移至测序系统中。例如，在一些情况下，例如，当希望采用例如Illumina测序系统对扩增的靶标进行测序时，还可将R1引物或引物结合位点附接至珠子。
引入珠子中的实体可包括具有如上所述的多种功能序列中的任何序列的寡核苷酸。例如，这些寡核苷酸可包括以下的任一个或多个：P5、R1和R2序列、不可裂解的5’acrydite-P5、可裂解的5’acrydite-SS-P5、R1c、测序引物、读取引物、通用引物、P5_U、通用读取引物和/或任意这些引物的结合位点。在一些情况下，引物可含有一种或多种修饰的核苷酸、核苷酸类似物或核苷酸模拟物。例如，在一些情况下，寡核苷酸可包括肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)核苷酸，等等。在一些情况下，这些寡核苷酸可另外或备选地包括可被不同地处理的核苷酸或类似物，以便允许在其应用的不同步骤中差异处理。例如，在一些情况下，一种或多种功能序列可包括不受特定的聚合酶处理的核苷酸或类似物，因此在使用该酶的过程步骤中未被拷贝。例如，在一些情况下，寡核苷酸的一种或多种功能序列组分会包括例如，含有尿嘧啶的核苷酸、含有非天然碱基的核苷酸、阻断寡核苷酸、阻断的3’端、3’ddCTP。应当理解，根据特定的应用，任何这些实体的序列均可作为引物或引物结合位点起作用。
聚合可自发地发生。在一些情况下，聚合可由引发剂和/或加速剂、电磁辐射、温度变化(例如，添加或去除热)、pH变化、其他方法及其组合来引发。引发剂可以指能够通过激活(例如，通过产生自由基)聚合反应中所用的一种或多种前体而引发聚合反应的物质。加速剂可以指能够加快聚合反应发生的速率的物质。在一些情况下，加速剂可以加快随后用于激活单体(例如，通过产生自由基)的引发剂的活化(例如，通过产生自由基)，并因此引发聚合反应。在一些情况下，引发剂更快的活化可导致更快的聚合速率。然而，在一些情况下，加速还可通过非化学手段实现，诸如热(例如，添加和去除热)手段、不同类型的辐射手段(例如，可见光、紫外线等)或任何其他合适的手段。为创建含有分子前体(其然后可聚合形成硬化的珠子)的小液滴，可采用乳液技术。例如，可将分子前体添加至水溶液。然后可以用油将该水溶液乳化(例如，通过搅拌、微流体小液滴发生器或其他方法)。然后，该分子前体可在乳化的小液滴中聚合以形成珠子。
例如，可通过任何合适的方法制备乳液，该方法包括本领域公知的方法，如批量振荡、批量搅拌、流动聚焦和微筛分(见例如，Weizmann等人，Nature Methods,2006,3(7)：545-550；Weitz等人，美国公开号2012/0211084)。在一些情况下，可使用微流体装置制备乳液。在一些情况下，可使用油包水乳液。这些乳液中可引入氟表面活性剂，如具有含PEG的化合物如bis krytox peg(BKP)的Krytox FSH。在一些情况下，可使用水包油乳液。在一些情况下，可形成多分散乳液。在一些情况下，可形成单分散乳液。在一些情况下，单分散乳液可在微流体流动聚焦装置中形成。(Gartecki等人，Applied Physics Letters,2004,85(13)：2649-2651)。
在至少一个实例中，用于制备珠子的微流体装置可含有通道区段，该通道区段在组合两条或更多条不混溶流体流(如含有分子前体和油的水溶液)的单个交叉点处相交。
在单个交叉点处组合两条不混溶的流体可导致形成流体小液滴。所形成的流体小液滴的大小可取决于流体流进入流体交叉点的流速、两种流体的性质以及微流体通道的大小。在离开流体交叉点的流体小液滴形成后引发聚合可导致由流体小液滴形成硬化的珠子。用于产生小液滴，以便同时用于珠子形成和用于将珠子分配至如本文其他各处讨论的离散小液滴的微流体装置、通道网络和系统的实例在例如美国公开号20150292988中描述，其为了所有目的通过引用以全文并入本文。
为了操控单独的分子前体、寡聚物或聚合物何时开始聚合以形成硬化的珠子，可在珠子形成过程中的不同时间点添加引发剂和/或加速剂。加速剂可以是这样一种试剂，其可引发聚合过程(例如，在一些情况下，通过聚合引发剂的活化)并因此可缩短珠子硬化的时间。在一些情况下，单种加速剂或多种加速剂可用于聚合。仔细调整加速对实现合适的聚合反应可能是重要的。例如，如果加速过快，重量和过度的链转移事件可导致较差的凝胶结构和任何期望的物质的低加载。如果加速过慢，由于聚合物缠结和高粘度，高分子量聚合物可产生受限制的活化位点(例如，自由基)。高粘度可阻碍用于珠子加载的物质的扩散，从而导致物质的低加载或无加载。例如，可通过选择合适的加速剂、合适的加速剂组合或通过选择合适的加速剂以及任何能够调节加速剂作用的刺激(例如，热、电磁辐射(例如，光、紫外线)、另一种化学物质等)来实现加速剂作用的调整。引发剂作用的调整也可以类似的方式实现。
加速剂可以是水溶性的、油溶性的，或者可以既是水溶性的又是油溶性的。例如，加速剂可以是四甲基乙二胺(TMEDA或TEMED)、二甲基乙二胺、N,N,N’,N’-四甲基甲烷二胺、N,N’–二吗啉基甲烷或N,N,N’,N’-四(2-羟基丙基)乙二胺。基于偶氮的引发剂可以在TEMED和APS不存在时使用，并可以充当基于热的引发剂。基于热的引发剂可通过热激活物质(例如，通过产生自由基)，因此引发剂作用的速率可通过温度和/或引发剂的浓度来调整。聚合加速剂或引发剂可包含官能团，该官能团包括膦酸酯、磺酸酯、羧酸酯、羟基、白蛋白结合部分、N-乙烯基基团以及磷脂。聚合加速剂或引发剂可以是低分子量单体化合物。加速剂或引发剂可以a)在小液滴产生前加入油中，b)在小液滴产生后加入管线中，c)在小液滴产生后加入出口储器中，或d)其组合。
聚合还可通过电磁辐射引发。某些类型的单体、寡聚物或聚合物可含有光敏性质。因此，可通过将这类单体、寡聚物或聚合物暴露于紫外线、可见光、与敏化剂组合的紫外线、与敏化剂组合的可见光或其组合来引发聚合。敏化剂的实例可以是核黄素。
珠子完全聚合或硬化的时间可根据珠子的大小、是否可添加加速剂、何时可添加加速剂、引发剂的类型、何时可施加电磁辐射、溶液的温度、聚合物组成、聚合物浓度以及其他相关参数而变化。例如，聚合可以在约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20分钟后完成。聚合可以在超过约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20分钟或更长时间后完成。聚合可以在少于约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20分钟内完成。
可通过连续相交换从乳液(例如，凝胶-水-油)中回收珠子。可向乳液(例如，凝胶-水-油)中添加过量的水性流体，并且硬化的珠子可经历沉降，其中可以使珠子聚集并且可去除含有过量油的上清液。可以重复进行添加过量水性流体、随后沉降并去除过量油的这一过程，直至珠子相对于连续相油悬浮在给定纯度的水性缓冲液中。水性缓冲液的纯度可以为约80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％(v/v)。水性缓冲液的纯度可以超过约80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更高(v/v)。水性缓冲液的纯度可以低于约80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％(v/v)。沉降步骤可以重复约2、3、4或5次。沉降步骤可以重复超过约2、3、4或5次或更多次。沉降步骤可以重复少于约2、3、4或5次。在一些情况下，沉降和上清液的去除也可以去除未反应的起始材料。
小液滴发生器的实例可包括单一流动聚焦器、平行流动聚焦器和微筛分膜，如Nanomi B.V.使用的那些，及其他。优选地，微流体装置用于产生小液滴。
条形码和随机N-mer(介绍)
某些应用，例如多核苷酸文库测序，可依赖于独特标识符(“条形码”)来鉴定序列以及例如由经测序的片段组装更大的序列。因此，在测序前将条形码添加至多核苷酸片段可能是期望的。在核酸应用的情况下，这类条形码通常由附接至样品序列的核苷酸的相对较短的序列组成，其中条形码序列是已知的或可通过其位置或序列元件鉴定的。在一些情况下，独特标识符对样品索引化可以是有用的。然而，在一些情况下，条形码在其他的情况下也可以是有用的。例如，条形码可用于在整个处理过程中追踪样品(例如，样品在实验室中的位置、样品在多个反应容器中的位置等)；提供制造信息；追踪条形码随时间(例如，从条形码制造到使用)和在现场的表现；追踪条形码批次在现场随时间的表现；在测序期间提供产物信息以及可能当与产物关联的条形码在测序期间被读取时触发自动化方案(例如，自动化方案在计算机的帮助下开始并执行)；追踪并修复有问题的条形码序列或产物批次；充当涉及条形码的反应中的分子触发器，以及其组合。在特别优选的方面，并如上文所提到的，如本文所述的条形码序列可用于提供两个确定的离散核酸序列之间的关联信息。该连接信息可包括，例如，与共同的样品、共同的反应容器(例如，孔或分区)或甚至共同的起始核酸分子的关联。特别地，通过将共同条形码附接至特定样品组分或给定反应体积内样品组分的子集，可以把带有该条形码的所得序列归于该反应体积。反过来，当根据其来源样品、其随后暴露于的处理步骤或在单个分子的基础上将样品分配至该反应体积时，可以更好地将所得序列鉴定为是来源于该反应体积的。
可以从不同的形式产生条形码，该形式包括批量合成的多核苷酸条形码，随机合成的条形码序列，基于微阵列的条形码合成，天然核苷酸，与N-mer、随机N-mer、伪随机N-mer部分互补的互补序列，或其组合。条形码的合成在本文中以及在例如美国公开号20140228255中描述，其全部公开内容为了所有目的通过引用以全文并入本文。
如上所述，充当独特标识符的引入条形码序列段的寡核苷酸还可包含附加序列段。这类附加序列段可包括功能序列，诸如引物序列、引物退火位点序列、固定序列或对后续处理有用的其他识别或结合序列，例如用于附接有含条形码的寡核苷酸的样品测序的测序引物或引物结合位点。此外，如本文所用的，提及特定功能序列被包含在含有条形码的序列内还想到包含任何这类序列的互补序列，使得互补复制将产生特定的所描述的序列。
在一些实例中，条形码或部分条形码可由获自或适用于寡核苷酸阵列如微阵列或珠子阵列的寡核苷酸产生。在这类情况下，可裂解微阵列的寡核苷酸(例如，使用将寡核苷酸锚定在阵列上的可裂解的联接或部分(诸如光可裂解的、化学可裂解的或可以其他方式裂解的联接))，使得游离的寡核苷酸能充当条形码或部分条形码。在一些情况下，条形码或部分条形码从具有已知序列的阵列获得。例如，已知序列(包括从阵列获得的那些序列)的使用可以有利于避免与未知序列的条形码相关的测序错误。微阵列可以提供至少约10,000,000、至少约1,000,000、至少约900,000、至少约800,000、至少约700,000、至少约600,000、至少约500,000、至少约400,000、至少约300,000、至少约200,000、至少约100,000、至少约50,000、至少约10,000、至少约1,000、至少约100或至少约10种可用作条形码或部分条形码的不同序列。
本文提供的珠子可以附接至可作为独特标识符(例如，条形码)的寡核苷酸序列。通常，本文提供的珠子群体含有条形码的多样性文库，其中每个珠子均附接至单一条形码序列的多个拷贝。在一些情况下，条形码序列是预先合成的和/或用已知序列设计的。在一些情况下，文库中的每个珠子均附接至独特的条形码序列。在一些情况下，多个珠子将附接有相同的条形码序列。例如，在一些情况下，文库中约1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、25％、30％、50％、75％、80％、90％、95％或100％的珠子附接至与附接至该文库中不同珠子的条形码序列相同的条形码序列。有时，约1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、25％或30％的珠子附接至相同的条形码序列。
条形码序列的长度可以是任何合适的长度，这取决于应用。在一些情况下，条形码序列的长度可以为约2到约500个核苷酸、约2到约100个核苷酸、约2到约50个核苷酸、约2到约20个核苷酸、约6到约20个核苷酸或约4到16个核苷酸。在一些情况下，条形码序列的长度为约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、85、90、95、100、150、200、250、300、400或500个核苷酸。在一些情况下，条形码序列的长度大于约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、85、90、95、100、150、200、250、300、400、500、750、1000、5000或10000个核苷酸。在一些情况下，条形码序列的长度小于约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、85、90、95、100、150、200、250、300、400、500、750或1000个核苷酸。
可将条形码加载到珠子中，使得一种或多种条形码被引入到特定的珠子中。在一些情况下，每个珠子可含有同一组条形码。在其他情况下，每个珠子可含有不同组的条形码。在其他情况下，每个珠子可包含一组相同的条形码。在其他情况下，每个珠子可包含一组不同的条形码。
本文提供的珠子可以附接至寡核苷酸序列，该寡核苷酸是能够在下游过程中引发样品(例如，基因组样品)的随机的、伪随机的或靶向的N-mer。在一些情况下，在附接至单个珠子或珠子群体的寡核苷酸上将存在相同的n-mer序列。这可能是靶向引发方法的情况，例如，当选择引物以靶向较大靶序列内的某些序列区段时。在其他情况下，本文珠子群体内的每个珠子均附接至大量多样化的N-mer序列，从而使这些引物针对模板分子的采样多样化等，藉此这类随机n-mer序列将针对样品核酸的不同部分随机引发。
N-mer的长度可以变化。在一些情况下，N-mer(例如，随机N-mer、伪随机N-mer或靶向N-mer)的长度可以在约2到约100个核苷酸之间、约2到约50个核苷酸之间、约2到约20个核苷酸之间、约5到约25个核苷酸之间或约5到约15个核苷酸之间。在一些情况下，N-mer(例如，随机N-mer、伪随机N-mer或靶向N-mer)的长度可以为约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、85、90、95、100、150、200、250、300、400或500个核苷酸。在一些情况下，N-mer(例如，随机N-mer、伪随机N-mer或靶向N-mer)的长度可以大于约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、85、90、95、100、150、200、250、300、400、500、750、1000、5000或10000个核苷酸。在一些情况下，N-mer(例如，随机N-mer、伪随机N-mer或靶向N-mer)的长度可以小于约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、85、90、95、100、150、200、250、300、400、500、750或1000个核苷酸。
可以对N-mer(包括随机N-mer)进行工程化以用于引发特定的样品类型。例如，可以针对不同类型的样品核酸或样品核酸的不同区域产生不同长度的N-mer，使得每个N-mer长度与每个不同类型的样品核酸或样品核酸的每个不同区域相对应。例如，可以针对来源于一个物种的基因组(例如，人类基因组)的样品核酸产生一种长度的N-mer，并且可以针对来源于另一物种(例如，酵母基因组)的样品核酸产生另一种长度的N-mer。在另一个实例中，可以针对包含基因组的特定序列区域的样品核酸产生一种长度的N-mer，并且可以针对包含基因组的另一序列区域的样品核酸产生另一种长度的N-mer。此外，除N-mer长度之外或作为其替代，还可对N-mer的碱基组成(例如，N-mer的GC含量)进行工程化，以与样品核酸的特定类型或区域相对应。例如，特定类型的样品核酸或样品核酸的特定区域中的碱基含量可以变化，因此具有不同碱基含量的N-mer可以用于引发不同样品类型的核酸或样品核酸的不同区域。
可以用针对特定样品类型或特定样品序列区域工程化的N-mer产生在本文其他各处描述的珠子群体。在一些情况下，可以产生在N-mer长度和含量方面混合的珠子群体(例如，包含针对一种样品类型或序列区域工程化的N-mer的珠子和包含针对另一样品类型或序列区域工程化的另一种N-mer的珠子的混合物)。在一些情况下，可以产生珠子群体，其中一个或多个珠子可包含针对多种样品类型或序列区域工程化的N-mer的混合群体。
如上所述，在一些情况下，随机的或靶向的N-mer均可包含核苷酸类似物、模拟物或非天然核苷酸，以便提供在后续处理步骤中具有改善的性能的引物。例如，在一些情况下，可能期望提供在经历热循环时(例如，在扩增期间)具有不同解链/退火谱的N-mer引物，以便提高n-mer序列的相对引发效率。在一些情况下，可将核苷酸类似物或非天然核苷酸掺入到N-mer引物序列中，以便改变该引物序列相比于包含天然核苷酸的相应引物的解链温度谱。在某些情况下，引物序列，如本文所述的N-mer序列，可在该序列内的一个或多个位置处包含修饰的核苷酸或核苷酸类似物，例如，LNA碱基，以便在与模板序列杂交时为引物提供提高的温度稳定性，以及提供通常增强的双链体稳定性。在一些情况下，在引物合成中使用LNA核苷酸代替A或T碱基，以便用更紧密结合的LNA类似物替换那些较弱结合的碱基。通过提供增强的杂交引物序列，可采用这类引物产生更高效率的扩增过程，同时能够在不同的温度模式中操作。
还可为上述寡核苷酸提供其他修饰。例如，在一些情况下，寡核苷酸可以具有受保护的末端或其他区域，以便防止或减少寡核苷酸例如通过任何存在的核酸外切酶活性的任何降解。在一个实例中，寡核苷酸可以在寡核苷酸序列内的一个或多个位置(例如，邻近或接近3’和/或5’末端位置)处具有一种或多种硫代磷酸核苷酸类似物。这些硫代磷酸核苷酸通常在寡核苷酸内的核苷酸间联接中提供硫基团以代替非连接氧，从而减少或消除核酸酶对寡核苷酸的活性，包括，例如，3’-5’和/或5’-3’核酸外切酶。通常，硫代磷酸类似物可用于为包含它们的寡核苷酸提供外切和/或内切核酸酶抗性，包括针对例如寡核苷酸的3’-5’和/或5’-3’核酸外切酶消化提供保护。因此，在一些方面，这些一个或多个硫代磷酸酯联接将处于寡核苷酸3’或5’末端的最后5到10个核苷酸间联接的一个或多个中，并且优选地包括最后的3’或5’末端核苷酸间联接和倒数第二个5’末端核苷酸间联接中的一个或多个，以便针对3’-5’或5’-3’核酸外切酶活性提供保护。还可在寡核苷酸内的其他位置提供硫代磷酸酯联接。除了对包含条形码序列(和任何关联的功能序列)的寡核苷酸提供这类保护之外，上述修饰在本文所述的阻断序列的情况下也是有用的，例如，在阻断序列中(例如，邻近或接近3’和/或5’末端位置以及可能寡核苷酸内的其他位置)引入硫代磷酸类似物。
将内含物附接至预功能化的珠子
可将多种内含物附接至本文所述的珠子，包括用寡核苷酸功能化的珠子。通常，附接寡核苷酸，特别是具有所需序列(例如，条形码、随机N-mer)的寡核苷酸。在本文提供的许多方法中，通过引物延伸反应将寡核苷酸附接至珠子。用引物预功能化的珠子可以与寡核苷酸模板接触。然后可进行扩增反应，使得引物得到延伸，从而使寡核苷酸模板的互补序列的拷贝附接至引物。其他附接方法如连接反应也是可能的。
在一些情况下，具有不同序列(或相同序列)的寡核苷酸在单独的步骤中附接至珠子。例如，在一些情况下，具有独特序列的条形码附接至珠子，使得每个珠子之上均具有第一条形码序列的多个拷贝。在第二步中，可用第二序列将珠子进一步功能化。第一和第二系列的组合可充当附接至珠子的独特条形码或独特标识符。可继续该过程以添加起条形码序列作用的附加序列(在一些情况下，向每个珠子连续添加超过1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个条形码序列)。还可进一步用随机N-mer将珠子功能化，该随机N-mer可例如充当下游全基因组扩增反应的随机引物。
在一些情况下，在用某些寡核苷酸序列(例如，条形码序列)功能化后，可将珠子合并，然后与大量的随机Nmer接触，这些Nmer随后附接至珠子。在一些情况下，特别是当在随机Nmer附接之前合并珠子时，每个珠子均具有一个与之附接的条形码序列(经常为多个拷贝)，但具有许多不同的与之附接的随机Nmer序列。
有限稀释可用于将寡核苷酸附接至珠子，使得珠子平均附接至不超过一个独特寡核苷酸序列如条形码。通常，在该过程中珠子已经用某种寡核苷酸如引物功能化。例如，可将用引物(例如，诸如通用引物)功能化的珠子和多种模板寡核苷酸混合(通常以高的珠子：模板寡核苷酸比)，以产生珠子和模板寡核苷酸的混合物。然后，可通过例如批量乳化过程(平板内的乳液)或通过微流体装置，例如，微流体小液滴发生器，将混合物分配到多个分区(例如，油包水乳液内的水性小液滴)中。在一些情况下，可将混合物分配到多个分区中，使得平均每个分区包含不超过一个模板寡核苷酸。
可以以预期或预测的条形码/待条形码化的珠子的比例，将条形码加载到珠子中。在一些情况下，加载条形码，使得每个珠子加载约0.0001、0.001、0.1、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50、100、500、1000、5000、10000、20000、50000、100000、500000、1000000、5000000、10000000、50000000、100000000、500000000、1000000000、5000000000、10000000000、50000000000或100000000000个条形码的比例。在一些情况下，加载条形码，使得每个珠子加载超过0.0001、0.001、0.1、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50、100、500、1000、5000、10000、20000、50000、100000、200000、300000、400000、500000、600000、700000、800000、900000、1000000、2000000、3000000、4000000、5000000、6000000、7000000、8000000、9000000、10000000、20000000、30000000、40000000、50000000、60000000、70000000、80000000、90000000、100000000、200000000、300000000、400000000、500000000、600000000、700000000、800000000、900000000、1000000000、2000000000、3000000000、4000000000、5000000000、6000000000、7000000000、8000000000、9000000000、10000000000、20000000000、30000000000、40000000000、50000000000、60000000000、70000000000、80000000000、90000000000、100000000000个或更多个条形码的比例。在一些情况下，加载条形码，使得每个珠子加载小于约0.0001、0.0002、0.0003、0.0004、0.0005、0.0006、0.0007、0.0008、0.0009、0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50、100、500、1000、5000、10000、20000、50000、100000、500000、1000000、5000000、10000000、50000000、100000000、500000000、1000000000、5000000000、10000000000、50000000000或100000000000个条形码的比例。
珠子，包括本文所述的那些珠子(例如，基本可溶解的珠子，在一些情况下，基本可被还原剂溶解的)，可与多个寡核苷酸共价或非共价地连接，其中所述寡核苷酸的至少一个子集包含恒定区或结构域(例如，条形码序列、条形码结构域、共同的条形码结构域或在该子集的寡核苷酸之间恒定的其他序列)和可变区或结构域(例如，随机序列、随机N-mer或在该子集的寡核苷酸之间可变的其他序列)。在一些情况下，如本文其他各处所述，寡核苷酸可以可释放地偶联至珠子。寡核苷酸可通过任何合适的联接(包括本文其他各处所述的共价和非共价联接的类型)共价或非共价地连接至珠子。在一些情况下，寡核苷酸可通过可裂解的联接例如化学可裂解的联接(例如，二硫键)、光可裂解的联接或热可裂解的联接共价连接至珠子。珠子可包含超过约或至少约1、10、50、100、500、1000、5000、10000、50000、100000、500000、1000000、5000000、10000000、50000000、100000000、500000000、1000000000、5000000000、10000000000、50000000000、100000000000、500000000000或1000000000000个寡核苷酸，该寡核苷酸包含恒定区或结构域以及可变区或结构域。
在一些情况下，所述寡核苷酸可各自包含相同的恒定区或结构域(例如，相同的条形码序列、相同的条形码结构域、共同的结构域等)。在一些情况下，所述寡核苷酸可各自包含具有不同序列的可变结构域。在一些情况下，包含相同恒定区(或共同的结构域)的寡核苷酸的百分比可以至少为约0.01％、0.1％、1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。在一些情况下，包含具有不同序列的可变区的寡核苷酸的百分比可以至少为约0.01％、0.1％、1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。在一些情况下，多个珠子中包含具有不同核苷酸序列的寡核苷酸(包括包含可变和恒定区或结构域的那些)的珠子的百分比至少为约0.01％、0.1％、1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。在一些情况下，所述寡核苷酸还可包含一个或多个附加序列，例如，引物结合位点(例如，测序引物结合位点)、通用引物序列(例如，预期将与具有特定长度的任意核酸片段上的一个或多个基因座杂交并将其引发的引物序列，基于具有该长度的序列内存在这类基因座的可能性)或任何其他期望的序列，包括本文其他各处所述的附加序列的类型。
如本文其他各处所述，可产生多个珠子以形成例如珠子文库(例如，条形码化珠子文库)。在一些情况下，在所述多个珠子中的至少一个子集的单独珠子之间，共同结构域(例如，共同的条形码结构域)或区域的序列可以不同。例如，在多个珠子中的约2个或更多个、10个或更多个、50或个更多个、100个或更多个、500个或更多个、1000个或更多个、5000个或更多个、10000个或更多个、50000个或更多个、100000个或更多个、500000个或更多个、1000000个或更多个、5000000个或更多个、10000000个或更多个、50000000个或更多个、100000000个或更多个、500000000个或更多个、1000000000个或更多个、5000000000个或更多个、10000000000个或更多个、50000000000个或更多个或者100000000000个或更多个珠子之间，所述多个珠子中的单独珠子之间的共同结构域或区域的序列可以不同。在一些情况下，多个珠子中的每个珠子可包含不同的共同结构域或区域。在一些情况下，多个珠子中包含不同的共同结构域或区域的单独珠子的百分比可以至少为约0.01％、0.1％、1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。在一些情况下，多个珠子可包含至少约2、10、50、100、500、1000、5000、10000、50000、100000、500000、1000000、5000000、10000000、50000000、100000000、500000000个或更多个不同的共同结构域，该结构域偶联至所述多个珠子中的不同珠子。
作为有限稀释的替代(例如，通过乳液的小液滴)，可采用其他分配方法将寡核苷酸附接至珠子。例如，可使用平板的孔。可在平板的孔中将包含引物(例如，通过acrydite和任选的二硫键连接至珠子的P5引物)的珠子与模板寡核苷酸(例如，包含条形码序列的模板寡核苷酸)以及扩增试剂组合。每个孔可包含独特模板条形码序列的一个或多个拷贝和一个或多个珠子。平板的热循环通过模板寡核苷酸与引物的杂交而使引物延伸，使得珠子包含具有与寡核苷酸模板互补的序列的寡核苷酸。热循环可持续期望次数的循环(例如，至少约1、2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50个或更多个循环)，直至所有的引物均已经被延伸。
热循环完成时，可将珠子合并到共同的容器中，洗涤(例如，通过离心、磁性分离等)，将互补链变性，再次洗涤，并且如果需要然后使其经历额外轮次的批量处理。例如，可以采用上文针对有限稀释所述的引物延伸方法，将随机N-mer序列添加至与珠子结合的寡核苷酸。
PCR试剂可包括任何合适的PCR试剂。在一些情况下，在引物延伸或其他扩增反应过程中，dUTP可以替代dTTP，使得寡核苷酸产物包含含有尿嘧啶的核苷酸，而不是含有胸腺嘧啶的核苷酸。通用序列的含尿嘧啶的部分稍后可以与不接受或处理含尿嘧啶的模板的聚合酶一起使用，以减少不想要的扩增产物。
扩增试剂可包括通用引物、通用引物结合位点、测序引物、测序引物结合位点、通用读取引物、通用读取结合位点或者与测序装置(例如，Illumina测序仪、Ion Torrent测序仪等)兼容的其他引物。扩增试剂可包括P5、不可裂解的5’acrydite-P5、可裂解的5’acrydite-SS-P5、R1c、生物素R1c、测序引物、读取引物、P5_Universal、P5_U、52-BioR1-rc、随机N-mer序列、通用读取引物等。在一些情况下，引物可包含修饰的核苷酸、锁核酸(LNA)、LNA核苷酸、含尿嘧啶的核苷酸、含非天然碱基的核苷酸、阻断寡核苷酸、阻断的3'末端和3'ddCTP。
如本文所述，在一些情况下，分配包含条形码的寡核苷酸，使得每个珠子平均被分配有少于一个独特寡核苷酸序列、少于两个独特寡核苷酸序列、少于三个独特寡核苷酸序列、少于四个独特寡核苷酸序列、少于五个独特寡核苷酸序列或者少于十个独特寡核苷酸序列。因此，在一些情况下，一部分珠子不含有寡核苷酸模板，并因此不可能含有扩增的寡核苷酸。因此，将包含寡核苷酸的珠子与不包含寡核苷酸的珠子分离可能是期望的。在一些情况下，这可以使用捕获部分实现。
在一些实施方案中，捕获部分可以与分离方法如磁性分离一起使用，以将包含条形码的珠子与可能不包含条形码的珠子分离。这样，在一些情况下，扩增试剂可包含附接至引物或探针的捕获部分。捕获部分可允许从未标记的珠子中分选标记的珠子，以确认引物和下游扩增产物附接至珠子。示例性的捕获部分包括生物素、链霉亲和素、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、cMyc、HA等。该捕获部分可以是或包括荧光标记物或磁性标记物。该捕获部分可包含多个分子的捕获部分，例如，多个分子的生物素、链霉亲和素等。在一些情况下，扩增反应可以利用附接至捕获部分(如本文其他各处所述)的捕获引物，使得该引物与扩增产物杂交，并且该捕获部分在扩增反应的额外循环过程中整合到其他扩增的寡核苷酸中。在其他情况下，在扩增反应完成后，包含捕获部分的探针可以与扩增的寡核苷酸杂交，使得该捕获部分与扩增的寡核苷酸相关联。
捕获部分可以是结合对的成员，使得在分离期间该捕获部分可以与其结合对结合。例如，可产生包含寡核苷酸的珠子，该寡核苷酸包含为结合对的成员的捕获部分(例如，生物素)。可将珠子与包含结合对的另一成员(例如，链霉亲和素)的捕获珠子混合，使得两个结合对成员在所得的混合物中结合。然后，可采用任何合适的手段，包括，例如离心和磁性分离(例如，包括捕获珠子是磁珠的情况)，将珠子-捕获珠子复合物与混合物的其他组分分离。
III.条形码文库
珠子可含有一个或多个附接的条形码序列。附接至单个珠子的条形码序列可以是相同或不同的。在一些情况下，每个珠子可以附接至约1、5、10、50、100、500、1000、5000、10000、20000、50000、100000、500000、1000000、5000000、10000000、50000000、100000000、500000000、1000000000、5000000000、10000000000、50000000000或100000000000个相同的条形码序列。在一些情况下，每个珠子可以附接至约1、5、10、50、100、500、1000、5000、10000、20000、50000、100000、500000、1000000、5000000、10000000、50000000、100000000、500000000、1000000000、5000000000、10000000000、50000000000或100000000000个不同的条形码序列。在一些情况下，每个珠子可以附接至至少约1、5、10、50、100、500、1000、5000、10000、20000、50000、100000、200000、300000、400000、500000、600000、700000、800000、900000、1000000、2000000、3000000、4000000、5000000、6000000、7000000、8000000、9000000、10000000、20000000、30000000、40000000、50000000、60000000、70000000、80000000、90000000、100000000、200000000、300000000、400000000、500000000、600000000、700000000、800000000、900000000、1000000000、2000000000、3000000000、4000000000、5000000000、6000000000、7000000000、8000000000、9000000000、10000000000、20000000000、30000000000、40000000000、50000000000、60000000000、70000000000、80000000000、90000000000、100000000000个或更多个相同的条形码序列。在一些情况下，每个珠子可以附接至至少约1、5、10、50、100、500、1000、5000、10000、20000、50000、100000、200000、300000、400000、500000、600000、700000、800000、900000、1000000、2000000、3000000、4000000、5000000、6000000、7000000、8000000、9000000、10000000、20000000、30000000、40000000、50000000、60000000、70000000、80000000、90000000、100000000、200000000、300000000、400000000、500000000、600000000、700000000、800000000、900000000、1000000000、2000000000、3000000000、4000000000、5000000000、6000000000、7000000000、8000000000、9000000000、10000000000、20000000000、30000000000、40000000000、50000000000、60000000000、70000000000、80000000000、90000000000、100000000000个或更多个不同的条形码序列。在一些情况下，每个珠子可以附接至少于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、500000、1000000、5000000、10000000、50000000,1000000000、5000000000、10000000000、50000000000或100000000000个或更多个相同的条形码序列。在一些情况下，每个珠子可以附接至少于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、500000、1000000、5000000、10000000、50000000,1000000000、5000000000、10000000000、50000000000或100000000000个或更多个不同的条形码序列。
单个条形码文库可包含一个或多个条形码化的珠子。在一些情况下，单个条形码文库可以包含约1、5、10、50、100、500、1000、5000、10000、20000、50000、100000、500000、1000000、5000000、10000000、50000000、100000000、500000000、1000000000、5000000000、10000000000、50000000000或100000000000个单独的条形码化珠子。在一些情况下，每个文库可包含至少约1、5、10、50、100、500、1000、5000、10000、20000、50000、100000、200000、300000、400000、500000、600000、700000、800000、900000、1000000、2000000、3000000、4000000、5000000、6000000、7000000、8000000、9000000、10000000、20000000、30000000、40000000、50000000、60000000、70000000、80000000、90000000、100000000、200000000、300000000、400000000、500000000、600000000、700000000、800000000、900000000、1000000000、2000000000、3000000000、4000000000、5000000000、6000000000、7000000000、8000000000、9000000000、10000000000、20000000000、30000000000、40000000000、50000000000、60000000000、70000000000、80000000000、90000000000、100000000000个或更多个单独的条形码化珠子。在一些情况下，每个文库可包含少于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、500000、1000000、5000000、10000000、50000000,1000000000、5000000000、10000000000、50000000000或100000000000个单独的条形码化珠子。文库内的条形码化珠子可具有相同的序列或不同的序列。
在一些实施方案中，每个珠子可具有独特的条形码序列。但是，条形码文库内的具有独特条形码序列的珠子的数目可以受到组合限度的限制。例如，使用四种不同的核苷酸，如果条形码的长度为12个核苷酸，那么独特构建体的数目可限制在412＝16777216个独特构建体。由于条形码文库可包含多于1677216个珠子，因此可能存在一些具有多个拷贝的相同条形码的文库。在一些实施方案中，给定文库内多个拷贝的相同条形码的百分比可以是1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、40％或50％。在一些情况下，给定文库内多个拷贝的相同条形码的百分比可以大于1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％或更多。在一些情况下，给定文库内多个拷贝的相同条形码的百分比可以小于1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、40％或50％。
在一些实施方案中，每个珠子可包含一个独特的条形码序列，但包含多个不同的随机N-mer。在一些情况下，每个珠子可具有一个或多个不同的随机N-mer。另外，条形码文库内的具有不同随机N-mer的珠子的数目可以受到组合限度的限制。例如，使用四种不同的核苷酸，如果N-mer序列的长度为12个核苷酸，那么不同构建体的数目可限制在412＝16777216个不同的构建体。由于条形码文库可包含多于16777216个珠子，因此可能存在一些具有多个拷贝的相同N-mer序列的文库。在一些实施方案中，给定文库内多个拷贝的相同N-mer序列的百分比可以是1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、40％或50％。在一些情况下，给定文库内多个拷贝的相同N-mer序列的百分比可以大于1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％或更多。在一些情况下，给定文库内多个拷贝的相同N-mer序列的百分比可以小于1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、40％或50％。
在一些实施方案中，对于每个珠子内的每个引物，条形码内的独特标识符序列可以是不同的。在一些情况下，对于每个珠子内的每个引物，条形码序列内的独特标识符序列可以是相同的。
IV.样品
样品的类型
本公开内容的方法、组合物、装置和试剂盒可与任何合适的样品或物质一起使用。例如，样品(例如，样品材料、样品材料的组分、样品材料的片段等)或物质可以是样品处理中所用的任何物质，诸如试剂或分析物。示例性的样品可包括以下的一个或多个：全细胞、染色体、多核苷酸、有机分子、蛋白质、核酸、多肽、碳水化合物、糖类、糖、脂质、酶、限制性内切酶、连接酶、聚合酶、条形码(例如，包括条形码序列、核酸条形码序列、条形码分子)、衔接子、小分子、抗体、荧光团、脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)、双脱氧核苷酸三磷酸(ddNTP)、缓冲液、酸性溶液、碱性溶液、温度敏感的酶、pH值敏感的酶、光敏感的酶、金属、金属离子、氯化镁、氯化钠、锰、水性缓冲液、温和缓冲液、离子缓冲液、抑制剂、油、盐、离子、去污剂、离子型去污剂、非离子型去污剂、寡核苷酸、模板核酸分子(例如，模板寡核苷酸、模板核酸序列)、核酸片段、模板核酸片段(例如，片段化过程中由模板核酸的片段化产生的模板核酸的片段、由核酸扩增反应产生的模板核酸的片段)、核苷酸、DNA、RNA、肽多核苷酸、互补DNA(cDNA)、双链DNA(dsDNA)、单链DNA(ssDNA)、质粒DNA、粘粒DNA、染色体DNA、基因组DNA(gDNA)、病毒DNA、细菌DNA、mtDNA(线粒体DNA)、mRNA、rRNA、tRNA、nRNA、siRNA、snRNA、snoRNA、scaRNA、微RNA、dsRNA、核酶、核酸开关及病毒RNA、蛋白酶、完整或部分的锁核酸、锁核酸核苷酸、核酸酶、蛋白酶抑制剂、核酸酶抑制剂、螯合剂、还原剂、氧化剂、探针、生色团、染料、有机物、乳化剂、表面活性剂、稳定剂、聚合物、水、药物、放射性分子、防腐剂、抗生素、适体等等。总之，所使用的样品将根据特定的处理需求而不同。
样品可来自于人类和非人类来源。在一些情况下，样品来自于哺乳动物、非人类哺乳动物、啮齿动物、两栖动物、爬行动物、狗、猫、牛、马、山羊、绵羊、鸡、鸟、鼠、兔、昆虫、蛞蝓、微生物、细菌、寄生虫或鱼。样品可以来自于多种细胞，包括但不限于：真核细胞、原核细胞、真菌细胞、心脏细胞、肺细胞、肾细胞、肝细胞、胰腺细胞、生殖细胞、干细胞、诱导多能干细胞、胃肠细胞、血细胞、癌细胞、细菌细胞、从人类微生物组样品分离的细菌细胞，等等。在一些情况下，样品可包含细胞的内含物，诸如，例如，单个细胞的内含物或多个细胞的内含物。本文所述的方法和系统的单细胞应用的实例在美国公开号20140378345中提出。样品还可以是无细胞的，如循环核酸(例如，DNA、RNA)。
样品可以是天然存在的或合成的。样品可以获自任何合适的位置，包括生物体、全细胞、细胞制品以及来自任何生物体、组织、细胞或环境的无细胞组合物。样品可以从环境的活检物、抽吸物、福尔马林固定包埋的组织、空气、农业样品、土壤样品、石油样品、水样品或灰尘样品中获得。在一些情况下，样品可以从体液获得，体液可包括血液、尿液、粪便、血清、淋巴液、唾液、粘膜分泌物、汗液、中枢神经系统液体、阴道液或精液。样品还可以从制造的产品如化妆品、食品、个人护理用品等中获得。样品可以是实验操作的产物，该实验操作包括重组克隆、多核苷酸扩增、聚合酶链反应(PCR)扩增、纯化方法(如基因组DNA或RNA的纯化)和合成反应。
将条形码附接至样品的方法
可通过将两个核酸片段通过酶的作用接合在一起，来将条形码(或其他寡核苷酸，例如，随机N-mer)附接至样品。这可以通过引物延伸、聚合酶链反应(PCR)、使用聚合酶的另一种类型的反应或通过使用连接酶的连接来实现。参见，例如，图2A、2B和2C并且如实施例中所述。
当使用连接方法将样品附接至条形码时，在连接步骤之前，该样品可以被或可以不被片段化。在一些情况下，将寡核苷酸(例如，条形码、随机N-mer)附接至样品，同时寡核苷酸仍附接至珠子。在一些情况下，在寡核苷酸从珠子释放(例如，通过包含条形码的寡核苷酸从珠子上裂解和/或通过珠子的降解)之后，将寡核苷酸(例如，条形码、随机N-mer)附接至样品。
寡核苷酸可包含一个或多个随机N-mer序列。一批独特的随机N-mer序列可引发DNA区段的随机部分，由此扩增样品(例如，全基因组)。所得产物可以是代表整个样品(例如，基因组)的一批条形码化的片段。
样品在连接至条形码化的珠子之前可以被或可以不被片段化。DNA片段化可包括将DNA链分离或破坏成小片或区段。可采用多种方法对DNA进行片段化，包括限制性消化或产生剪切力的多种方法。限制性消化可利用限制性内切酶，以通过对两条链的平端切割或通过不均匀切割以产生粘端而在DNA序列中制造有意的切口。剪切力介导的DNA链破坏的实例可以包括超声处理、声剪切、针剪切、移液或雾化。超声处理是一种类型的流体动力学剪切，其使DNA序列暴露于短期的剪切力，这可产生约700bp的片段大小。声剪切向碗形换能器内的DNA样品施加高频声能。针剪切通过使DNA穿过小直径的针来产生剪切力，以将DNA物理地撕裂成较小的区段。雾化力可通过使DNA通过喷雾器单元的小孔而产生，在该单元中从离开该单元的微细雾沫中收集所得的DNA片段。
在一些情况下，使用连接反应将寡核苷酸与样品连接。一个实例在图2B中示出(如实施例中所述)。该连接可包括通过催化磷酸二酯键的形成将两个核酸区段如条形码序列和样品接合在一起。连接反应可包括DNA连接酶，诸如大肠杆菌DNA连接酶、T4DNA连接酶、哺乳动物连接酶(诸如DNA连接酶I、DNA连接酶III、DNA连接酶IV)、热稳定连接酶等。T4DNA连接酶可以连接含有DNA、寡核苷酸、RNA和RNA-DNA杂合体的区段。连接反应可以不包括DNA连接酶，而是采用替代物如拓扑异构酶。为了将样品与条形码序列连接，采用高浓度的DNA连接酶且包含PEG可实现快速连接。为了选择连接反应的有利温度，可以考虑DNA连接酶的最适温度(其可以是37℃)以及待连接的DNA的解链温度(可以变化)。可将样品和条形码化的珠子悬浮在缓冲液中以使可能影响连接的离子作用最小化。
尽管上文就条形码序列与样品核酸组分的连接或直接附接进行了描述，但如本文所用的，条形码与样品核酸的附接还包括条形码序列与样品的互补序列或该互补序列的拷贝或互补序列的附接，例如，如本文其他各处更详细描述的，当条形码与用于复制样品核酸的引物序列相关联时。特别地，当在使用样品核酸(或样品核酸的复制物)作为模板的引物延伸反应中使用包含引物序列的条形码时，所得的延伸产物，无论是样品核酸的互补序列还是样品核酸的复制物，都将被称为具有与之附接的条形码序列。
在一些情况下，将样品与条形码化的珠子组合(手动地或在微流体装置的帮助下)，并且将组合的样品和珠子例如在微流体装置中分配。分区可以是油包水乳液内的水性小液滴。当样品与条形码化的珠子组合时，在每个流体小液滴中平均可存在少于两种目标分析物。在一些实施方案中，每个流体小液滴平均可出现少于三种目标分析物。在一些情况下，每个流体小液滴平均可出现超过两种目标分析物。在其他情况下，每个流体小液滴平均可出现超过三种目标分析物。在一些情况下，在同一流体小液滴中可出现相同目标分析物的一条或多条链。在一些情况下，在流体小液滴内存在少于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、50、100、1000、5000、10000或100000种目标分析物。在一些情况下，在流体小液滴内存在多于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、50、100、1000、5000、10000或100000种目标分析物。通常，本文所述分区的特征在于具有极小的体积。例如，在基于小液滴的分区的情况下，小液滴可以具有小于1000pL、小于900pL、小于800pL、小于700pL、小于600pL、小于500pL、小于400pL、小于300pL、小于200pL、小于100pL、小于50pL、小于20pL、小于10pL或者甚至小于1pL的总体积。当与珠子共同分配时，应当理解，分区内的样品流体体积可以小于上述体积的90％、小于80％、小于70％、小于60％、小于50％、小于40％、小于30％、小于20％或者甚至小于上述体积的10％。
当样品与条形码化的珠子组合时，在每个流体小液滴中平均可存在少于一个珠子。在一些实施方案中，每个流体小液滴中平均可存在少于两个珠子。在一些实施方案中，每个流体小液滴平均可存在少于三个珠子。在一些情况下，每个流体小液滴中平均可存在超过一个珠子。在其他情况下，每个流体小液滴中平均可存在超过两个珠子。在其他情况下，每个流体小液滴平均可存在超过三个珠子。在一些实施方案中，可采用有限稀释技术实现每个流体小液滴少于一个条形码化珠子的比例。这里，条形码化的珠子可在与样品混合前稀释、在与样品混合期间稀释或在与样品混合后稀释。
被分配的不同条形码或不同组条形码的数目(例如，不同组条形码，每个不同组偶联至不同的珠子)可以根据例如待分配的特定条形码和/或应用而不同。不同组条形码可以是，例如，相同条形码在各组之间有差异的成组相同条形码。或者不同组条形码可以是，例如，每一组就其包含的条形码而言有差异的成组不同条形码。在一些情况下，通过将不同的条形码附接至不同的珠子(例如，凝胶珠子)而分配不同的条形码。在一些情况下，通过将每个不同的组放置在不同的分区中而分配不同组的条形码。在一些情况下，分区可包含一个或个多不同的条形码组。例如，每个不同组的条形码可偶联至不同的珠子(例如，凝胶珠子)。可将每个不同的珠子分配到流体小液滴中，使得每个不同组的条形码被分配到不同的流体小液滴中。例如，可以分配约1、5、10、50、100、1000、10000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000、100000、200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000、1000000、2000000、3000000、4000000、5000000、6000000、7000000、8000000、9000000、10000000、20000000、50000000、100000000个或更多个不同的条形码或不同组的条形码。在一些实例中，可以分配至少约1、5、10、50、100、1000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000、1000000、2000000、3000000、4000000、5000000、6000000、7000000、8000000、9000000、10000000、20000000、50000000、100000000个或更多个不同的条形码或不同组的条形码。在一些实例中，可以分配少于约1、5、10、50、100、1000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000、1000000、2000000、3000000、4000000、5000000、6000000、7000000、8000000、9000000、10000000、20000000、50000000或100000000个不同的条形码或不同组的条形码。在一些实例中，可以分配约1-5、5-10、10-50、50-100、100-1000、1000-10000、10000-100000、100000-1000000、10000-1000000、10000-10000000或10000-100000000个不同的条形码或不同组的条形码。
条形码可以以特定密度进行分配。例如，可以分配条形码以使得每个分区含有约1、5、10、50、100、1000、10000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000、100000、200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000、1000000、2000000、3000000、4000000、5000000、6000000、7000000、8000000、9000000、10000000、20000000、50000000或100000000个条形码/分区。可以分配条形码以使得每个分区含有至少约1、5、10、50、100、1000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000、1000000、2000000、3000000、4000000、5000000、6000000、7000000、8000000、9000000、10000000、20000000、50000000、100000000个或更多个条形码/分区。可以分配条形码以使得每个分区含有少于约1、5、10、50、100、1000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000、1000000、2000000、3000000、4000000、5000000、6000000、7000000、8000000、9000000、10000000、20000000、50000000或100000000个条形码/分区。可以分配条形码以使得每个分区含有约1-5、5-10、10-50、50-100、100-1000、1000-10000、10000-100000、100000-1000000、10000-1000000、10000-10000000或10000-100000000个条形码/分区。在一些情况下，分配的条形码可以偶联至一个或多个珠子，例如，凝胶珠子。在一些情况下，该分区是流体小液滴。
可以分配条形码以使得相同的条形码以特定密度分配。例如，可以分配相同的条形码以使得每个分区含有约1、5、10、50、100、1000、10000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000、100000、200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000、1000000、2000000、3000000、4000000、5000000、6000000、7000000、8000000、9000000、10000000、20000000、50000000或100000000个相同的条形码/分区。可以分配条形码以使得每个分区含有至少约1、5、10、50、100、1000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000、1000000、2000000、3000000、4000000、5000000、6000000、7000000、8000000、9000000、10000000、20000000、50000000、100000000个或更多个相同的条形码/分区。可以分配条形码以使得每个分区含有少于约1、5、10、50、100、1000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000、1000000、2000000、3000000、4000000、5000000、6000000、7000000、8000000、9000000、10000000、20000000、50000000或100000000个相同的条形码/分区。可以分配条形码以使得每个分区含有约1-5、5-10、10-50、50-100、100-1000、1000-10000、10000-100000、100000-1000000、10000-1000000、10000-10000000或10000-100000000个相同的条形码/分区。在一些情况下，分配的相同条形码可以偶联至珠子，例如，凝胶珠子。在一些情况下，该分区是流体小液滴。
可以分配条形码以使得不同的条形码以特定密度分配。例如，可以分配不同的条形码以使得每个分区含有约1、5、10、50、100、1000、10000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000、100000、200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000、1000000、2000000、3000000、4000000、5000000、6000000、7000000、8000000、9000000、10000000、20000000、50000000或100000000个不同的条形码/分区。可以分配条形码以使得每个分区含有至少约1、5、10、50、100、1000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000、1000000、2000000、3000000、4000000、5000000、6000000、7000000、8000000、9000000、10000000、20000000、50000000、100000000个或更多个不同的条形码/分区。可以分配条形码以使得每个分区含有少于约1、5、10、50、100、1000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000、1000000、2000000、3000000、4000000、5000000、6000000、7000000、8000000、9000000、10000000、20000000、50000000或100000000个不同的条形码/分区。可以分配条形码以使得每个分区含有约1-5、5-10、10-50、50-100、100-1000、1000-10000、10000-100000、100000-1000000、10000-1000000、10000-10000000或10000-100000000个不同的条形码/分区。在一些情况下，分配的不同条形码可以偶联至珠子，例如，凝胶珠子。在一些情况下，该分区是流体小液滴。
用于分配条形码或不同组的条形码的分区的数目可以变化，例如，取决于应用和/或待分配的不同条形码或不同组的条形码的数目。例如，用于分配条形码或不同组的条形码的分区的数目可以是约5、10、50、100、250、500、750、1000、1500、2000、2500、5000、7500或10,000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100,000、200000、300000、400000、500000、600000、700000、800000、900000、1,000,000、2000000、3000000、4000000、5000000、10000000、20000000或更多。用于分配条形码或不同组的条形码的分区的数目可以是至少约5、10、50、100、250、500、750、1000、1500、2000、2500、5000、7500、10,000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、200000、300000、400000、500000、600000、700000、800000、900000、1000000、2000000、3000000、4000000、5000000、10000000、20000000或更多。用于分配条形码或不同组的条形码的分区的数目可以少于约5、10、50、100、250、500、750、1000、1500、2000、2500、5000、7500、10,000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、200000、300000、400000、500000、600000、700000、800000、900000、1000000、2000000、3000000、4000000、5000000、10000000或20000000。用于分配条形码的分区的数目可以是约5-10000000、5-5000000、5-1,000,000、10-10,000、10-5,000、10-1,000、1,000-6,000、1,000-5,000、1,000-4,000、1,000-3,000或1,000-2,000。在一些情况下，该分区可以是流体小液滴。
如上所述，可以分配不同的条形码或不同组的条形码(例如，每组包含多个相同的条形码或不同的条形码)，以使得每个分区通常包含不同的条形码或不同的条形码组。在一些情况下，每个分区可以包含不同组的相同条形码，如相同组的偶联至珠子(例如凝胶珠子)的条形码。当分配不同组的相同条形码时，每个分区中相同条形码的数目可以变化。例如，约100,000个或更多个不同组的相同条形码(例如，附接至珠子的一组相同的条形码)可以在约100,000个或更多个不同的分区中进行分配，使得每个分区包含不同组的相同条形码(例如，每个分区包含偶联至不同组的相同条形码的珠子)。在每个分区中，每组条形码的相同条形码的数目可以是约1,000,000个或更多相同的条形码(例如，每个分区包含偶联至一个或多个珠子的1,000,000个或更多相同的条形码)。在一些情况下，不同组条形码的数目可以等于或基本等于分区的数目，或者可以小于分区的数目。不同条形码或不同条形码组的任何合适的数目、每个分区中条形码的数目和分区的数目可以组合起来。因此，应当理解，可以用任何上述的每个分区的条形码密度以及任何上述的分区数目提供任何上述不同数目的条形码。
微流体装置和小液滴
在一些情况下，本公开内容提供了用于制备珠子和用于将珠子(或其他类型的分区)与样品组合的装置，例如，用于共同分配样品组分和珠子。这样的装置可以是微流体装置(例如，小液滴发生器)。该装置可以由任何合适的材料形成。在一些实例中，装置可由选自下组的材料形成：熔融二氧化硅、钠钙玻璃、硼硅酸盐玻璃、聚(甲基丙烯酸甲酯)PMMA、PDMS、蓝宝石、硅、锗、环烯烃共聚物、聚乙烯、聚丙烯、聚丙烯酸酯、聚碳酸酯、塑料、热固性塑料、水凝胶、热塑性塑料、纸、弹性体及其组合。
可以以装置包含流体流动通道的方式形成装置。可以使用任何合适的通道。在一些情况下，装置包含一个或多个流体输入通道(例如，入口通道)和一个或多个流体出口通道。在一些实施方案中，流体通道的内径可以为约10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、65μm、70μm、75μm、80μm、85μm、90μm、100μm、125μm或150μm。在一些实施方案中，流体通道的内径可以大于10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、65μm、70μm、75μm、80μm、85μm、90μm、100μm、125μm、150μm或更大。在一些实施方案中，流体通道的内径可以小于约10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、65μm、70μm、75μm、80μm、85μm、90μm、100μm、125μm或150μm。流体通道内的体积流速可以本领域已知的任何流速。
如本文其他各处所述，可以使用微流体装置通过形成包含一种或多种凝胶前体、一种或多种交联剂、任选的引发剂和任选的水性表面活性剂的流体小液滴而形成珠子。该流体小液滴可以被不混溶的连续流体如油包围，该流体还可以包含表面活性剂和/或加速剂。
在一些实施方案中，可以使用微流体装置通过形成同时包含珠子和样品的流体小液滴(或其他类型的第二分区，包括本文所述的任何合适类型的分区)而使珠子(例如，条形码化的珠子或其他类型的第一分区，包括本文所述的任何合适类型的分区)与样品(例如，核酸样品)组合。该流体小液滴可以具有被油相包围的水性核心，例如，油包水乳液内的水性小液滴。该流体小液滴可含有一个或多个条形码化的珠子、样品、扩增试剂和还原剂。在一些情况下，该流体小液滴可包含以下的一种或多种：水、无核酸酶的水、乙腈、珠子、凝胶珠子、聚合物前体、聚合物单体、聚丙烯酰胺单体、丙烯酰胺单体、可降解的交联剂、不可降解的交联剂、二硫键、acrydite部分、PCR试剂、引物、聚合酶、条形码、多核苷酸、寡核苷酸、核苷酸、DNA、RNA、肽多核苷酸、互补DNA(cDNA)、双链DNA(dsDNA)、单链DNA(ssDNA)、质粒DNA、粘粒DNA、染色体DNA、基因组DNA、病毒DNA、细菌DNA、mtDNA(线粒体DNA)、mRNA、rRNA、tRNA、nRNA、siRNA、snRNA、snoRNA、scaRNA、微RNA、dsRNA、探针、染料、有机物、乳化剂、表面活性剂、稳定剂、聚合物、适体、还原剂、引发剂、生物素标记物、荧光团、缓冲液、酸性溶液、碱性溶液、光敏感的酶、pH敏感的酶、水性缓冲液、油、盐、去污剂、离子型去污剂、非离子型去污剂，等等。总之，该流体小液滴的组成将根据特定的处理需求而改变。
流体小液滴可以具有均匀的大小或不均匀的大小。在一些情况下，流体小液滴的直径可以为约1μm、5μm、10μm、20μm、30μm、40μm、45μm、50μm、60μm、65μm、70μm、75μm、80μm、90μm、100μm、250μm、500μm或1mm。在一些情况下，流体小液滴可以具有至少约1μm、5μm、10μm、20μm、30μm、40μm、45μm、50μm、60μm、65μm、70μm、75μm、80μm、90μm、100μm、250μm、500μm、1mm或更大的直径。在一些情况下，流体小液滴可以具有小于约1μm、5μm、10μm、20μm、30μm、40μm、45μm、50μm、60μm、65μm、70μm、75μm、80μm、90μm、100μm、250μm、500μm或1mm的直径。在一些情况下，流体小液滴可以具有在约40-75μm、30-75μm、20-75μm、40-85μm、40-95μm、20-100μm、10-100μm、1-100μm、20-250μm或20-500μm的范围内的直径。
在一些实施方案中，所述装置可包含两个或更多个流体输入通道的一个或多个交叉点。例如，该交叉点可以是流体交叉点。该流体交叉点可包含两个或更多个流体输入通道和一个或多个流体出口通道。在一些情况下，该流体交叉点可包含两个流体输入通道和两个流体出口通道。在其他情况下，该流体交叉点可包含三个流体输入通道和一个流体出口通道。在一些情况下，该流体交叉点可以在形成该交叉点的两个或更多个流体通道之间形成基本垂直的角度。
在一些情况下，微流体装置可包含在接合处与出口通道流体连接的第一和第二输入通道。在一些情况下，例如，出口通道可以与第三输入通道在接合处流体连接。在一些情况下，可包含第四输入通道并且其可以与第三输入通道和出口通道在接合处相交。在一些情况下，微流体装置可包含第一、第二和第三输入通道，其中第三输入通道与第一输入通道、第二输入通道或者第一输入通道与第二输入通道的接合处相交。
如本文其他各处所述，所述微流体装置可用于从液体产生凝胶珠子。例如，在一些实施方案中，在流体输入通道内包含一种或多种凝胶前体、一种或多种交联剂和任选的引发剂、任选的水性表面活性剂以及任选的醇的水性流体可以进入流体交叉点。在第二流体输入通道内，任选地具有表面活性剂和加速剂的油可以进入相同的流体交叉点。水性和油组分可在流体交叉点处混合，导致在连续油相中形成水性流体小液滴。离开流体交叉点的流体小液滴内的凝胶前体可以聚合形成珠子。
如本文其他各处所述，所述微流体装置(例如，小液滴发生器)可用于将样品与珠子(例如，条形码化珠子的文库)以及(如果需要)能够降解珠子的试剂(例如，如果珠子以二硫键连接，则是还原剂)组合。在一些实施方案中，可向与第一流体交叉点(例如，第一流体接合处)流体连接的第一流体输入通道提供样品(例如，核酸样品)。可以向同样与第一流体交叉点流体连接的第二流体输入通道提供预形成的珠子(例如，条形码化的珠子、可降解的珠子)，其中第一流体输入通道与第二流体输入通道在该第一流体交叉点交汇。样品和珠子可以在第一流体交叉点混合以形成混合物(例如，水性混合物)。在一些情况下，可向第三流体输入通道提供还原剂，该第三流体输入通道同样与第一流体交叉点流体连接，并且与第一和第二流体输入通道在第一流体交叉点交汇。然后，还原剂可以与珠子和样品在第一流体交叉点混合。在其他情况下，可在进入微流体装置之前将还原剂与样品和/或珠子预混合，使得通过第一流体输入通道向微流体装置提供样品和/或通过第二流体输入通道向微流体装置提供珠子。在其他情况下，可以不添加还原剂。
在一些实施方案中，样品和珠子混合物可以通过与第一流体交叉点(并因此，与构成第一流体交叉点的任何流体通道)流体连接的第一出口通道离开第一流体交叉点。可以向与第一出口通道流体连接的第二流体交叉点(例如，第二流体接合处)提供混合物。在一些情况下，油(或其他合适的不混溶的)流体可以从与第二流体交叉点(并因此，与构成该交叉点的任何流体通道)流体连接且在第二流体交叉点与第一出口通道交汇的一个或多个单独的流体输入通道进入第二流体交叉点。在一些情况下，可以在与第二流体交叉点(并因此，与第一出口通道)流体连接且在第二流体交叉点与第一出口通道以及彼此交汇的一个或两个单独的流体输入通道中提供油(或其他合适的不混溶的流体)。两种组分—油以及样品与珠子的混合物—可以在第二流体交叉点混合。该混合将样品与珠子混合物分配至多个流体小液滴(例如，油包水乳液内的水性小液滴)，其中形成的小液滴的至少一个子集封装条形码化的珠子(例如，凝胶珠子)。形成的流体小液滴可在油内被运送通过从第二流体交叉点离开的第二流体出口通道。在一些情况下，从第二流体交叉点离开第二出口通道的流体小液滴可被分配到孔中以供进一步处理(例如，热循环)。
在许多情况下，控制所得的小液滴(或第二分区)相对于珠子(或第一分区)的占有率将是期望的。这种控制在例如美国公开号20150292988中描述，其全部公开内容为了所有目的通过引用以全文并入本文。通常，将形成小液滴(或第二分区)，使得至少50％、60％、70％、80％、90％或更多的小液滴(或第二分区)含有不超过一个珠子(或第一分区)。另外，或备选地，将形成小液滴(或第二分区)，使得至少50％、60％、70％、80％、90％或更多的小液滴(或第二分区)包含恰好一个珠子(或第一分区)。在一些情况下，所得的小液滴(或第二分区)平均可各自包含至多约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个珠子(或第一分区)。在一些情况下，所得的小液滴(或第二分区)平均可各自包含至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个珠子(或第一分区)。
在一些实施方案中，可以在混合物进入微流体装置中之前将样品与包含条形码和任何其他试剂(例如，样品扩增所需的试剂、还原剂等)的珠子(例如，可降解的珠子)预混合以产生水性反应混合物。在水性混合物进入流体装置时，该混合物可从第一流体输入通道流动并进入流体交叉点。在一些情况下，油相可以从同样与流体交叉点流体连接的第二流体输入通道(例如，与第一流体输入通道垂直或基本垂直的流体通道)进入流体交叉点。该水性混合物和油可以在流体交叉点混合，使得乳液(例如，凝胶-水-油乳液)形成。该乳液可包含在连续油相中的多个流体小液滴(例如，包含水性反应混合物的小液滴)。在一些情况下，每个流体小液滴可包含单个珠子(例如，附接至一组相同的条形码的凝胶珠子)、样品的等份以及任何其他试剂(例如，还原剂、样品扩增所需的试剂等)的等份。然而，在一些情况下，流体小液滴可包含多个珠子。在小液滴形成时，小液滴可通过连续油相被运送通过离开流体交叉点的流体出口通道。离开出口通道的流体小液滴可被分配到孔中以供进一步处理(例如，热循环)。
在可在进入微流体装置之前将还原剂添加至样品或者可在第一流体交叉点添加还原剂的情况下，在第二流体交叉点形成的流体小液滴可含有还原剂。在这种情况下，当小液滴穿过离开第二流体交叉点的出口通道行进时，还原剂可降解或溶解流体小液滴内含有的珠子。
在一些实施方案中，微流体装置可含有平行的三个离散的流体交叉点。流体小液滴可以在这三个流体交叉点的任一个处形成。样品和珠子可以在这三个流体交叉点的任一个内混合。还原剂可以在这三个流体交叉点的任一个处添加。油可以在这三个流体交叉点的任一个处添加。
本公开内容的方法、组合物、装置和试剂盒可与任何合适的油一起使用。在一些实施方案中，油可用于产生乳液。该油可以包括氟化油、硅油、矿物油、植物油及其组合。
在一些实施方案中，微流体装置内的水性流体也可含有醇。例如，醇可以是甘油、乙醇、甲醇、异丙醇、戊醇、乙烷、丙烷、丁烷、戊烷、己烷及其组合。该醇可以以约5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％(v/v)存在于水性流体内。在一些情况下，该醇可以以至少约5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％或更高(v/v)的浓度存在于水性流体内。在一些情况下，该醇可以以小于约5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％(v/v)存在于水性流体内。
在一些实施方案中，所述油也可含有表面活性剂以稳定乳液。例如，表面活性剂可以是含氟表面活性剂、Krytox润滑剂、Krytox FSH、工程化的流体、HFE-7500、硅酮化合物、含PEG的硅化合物，如bis krytoxpeg(BKP)。该表面活性剂可以以约0.1％、0.5％、1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2％、5％或10％(w/w)存在。在一些情况下，该表面活性剂可以以至少约0.1％、0.5％、1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2％、5％、10％(w/w)或更高的浓度存在。在一些情况下，该表面活性剂可以以小于约0.1％、0.5％、1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2％、5％或10％(w/w)存在。
在一些实施方案中，可向油中添加加速剂和/或引发剂。例如，加速剂可以是四甲基乙二胺(TMEDA或TEMED)。在一些情况下，引发剂可以是过硫酸铵或钙离子。该加速剂可以以约0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％或2％(v/v)存在。在一些情况下，该加速剂可以以至少约0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％或2％(v/v)或更高的浓度存在。在一些情况下，该加速剂可以以小于约0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％或2％(v/v)存在。
V.扩增
DNA扩增是一种用于创建DNA小区段或长区段的多个拷贝的方法。本公开内容的方法、组合物、装置和试剂盒可采用DNA扩增来将一个或多个期望的寡核苷酸序列(如条形码序列或随机N-mer序列)附接至单独的珠子。DNA扩增还可用于利用随机N-mer序列沿感兴趣的样品如基因组DNA引发和延伸，以便产生样品序列的片段并将与引物相关联的珠子偶联至该片段。
例如，可通过将模板核酸序列和包含多个附接的寡核苷酸(例如，可释放地附接的寡核苷酸)的珠子共同分配到分区(例如，乳液的小液滴、微胶囊或任何其他合适的分区类型，包括本文其他各处描述的合适的分区类型)中而扩增核酸序列。附接的寡核苷酸可包含与模板样品核酸序列的一个或多个区域互补的引物序列(例如，可变引物序列，如随机N-mer，或者靶向引物序列，如靶向N-mer)，并且此外还可包含共同序列(例如，如条形码序列)。该引物序列可以与模板核酸序列退火并延伸(例如，在引物延伸反应或任何其他合适的核酸扩增反应中)，以产生模板核酸的至少一部分的一个或多个第一拷贝，使得该一个或多个第一拷贝包含引物序列和共同序列。在包含引物序列的寡核苷酸可释放地附接至珠子的情况下，可在引物序列与模板核酸序列退火之前从珠子释放寡核苷酸。此外，通常，该引物序列可通过同样在该分区中提供的聚合酶(例如，如本文其他各处所述的链置换聚合酶、如本文其他各处所述的核酸外切酶缺陷的聚合酶或任何其他类型的合适的聚合酶，包括本文其他各处所述的聚合物类型)延伸。此外，可释放地附接至珠子的寡核苷酸可以是核酸外切酶抗性的，并因此可以包含一个或多个如本文其他各处所述的硫代磷酸酯联接。在一些情况下，所述一个或多个硫代磷酸酯联接可包含在寡核苷酸的末端核苷酸间联接处的硫代磷酸酯联接。
在一些情况下，在产生一个或多个第一拷贝后，可使引物序列与一个或多个第一拷贝退火，并且再次延伸引物序列以产生一个或多个第二拷贝。所述一个或多个第二拷贝可包含引物序列、共同序列，并且还可以包含与所述一个或多个第一拷贝的单个拷贝的至少一部分互补的序列，和/或与可变引物序列互补的序列。上述步骤可以重复所需的循环数以产生扩增的核酸。
上述寡核苷酸可包含在延伸反应(如产生上述一个或多个第一或第二拷贝的延伸反应)期间没有被拷贝的序列段。如本文其他各处所述，这样的序列段可包含一个或多个含尿嘧啶的核苷酸，并且还可导致在退火条件下形成发夹(或部分发夹)分子的扩增子的产生。
在另一实例中，可通过将不同的核酸分配到各自包含第二分区(例如，珠子，包括本文其他各处所述的珠子类型)的单独的第一分区(例如，乳液中的小液滴)中而扩增多种不同的核酸。第二分区可以与多个寡核苷酸可释放地关联。第二分区可包含任何合适数目的寡核苷酸(例如，每个本文所述的分区有超过1,000个寡核苷酸、超过10,000个寡核苷酸、超过100,000个寡核苷酸、超过1,000,000个寡核苷酸、超过10,000,000个寡核苷酸或任何其他数目的寡核苷酸)。此外，第二分区可包含任何合适数目的不同条形码序列(例如，至少1,000个不同的条形码序列、至少10,000个不同的条形码序列、至少100,000个不同的条形码序列、至少1,000,000个不同的条形码序列、至少10,000,000个不同的条形码序列或任何其他数目的本文其他各处所述的不同条形码序列)。
此外，与给定第二分区相关联的多个寡核苷酸可包含引物序列(例如，可变引物序列、靶向引物序列)和共同序列(例如，条形码序列)。而且，与不同第二分区相关联的多个寡核苷酸可包含不同的条形码序列。与多个第二分区相关联的寡核苷酸可被释放到第一分区中。释放之后，第一分区内的引物序列可以与第一分区内的核酸退火，然后可以延伸引物序列以在第一分区内产生该核酸的至少一部分的一个或多个拷贝。通常，所述一个或多个拷贝可包含释放到第一分区中的条形码序列。
在小液滴内的扩增和样品索引化
可以对流体小液滴内的内含物进行核酸(例如，DNA)扩增。如本文所述，流体小液滴可含有附接至珠子的寡核苷酸。流体小液滴还可包含样品。流体小液滴还可包含适合于扩增反应的试剂，该试剂可包括Kapa HiFi Uracil Plus、修饰的核苷酸、天然核苷酸、含尿嘧啶的核苷酸、dTTP、dUTP、dCTP、dGTP、dATP、DNA聚合酶、Taq聚合酶、突变校正聚合酶、9degrees North、修饰的(NEB)、exo(-)、exo(-)Pfu、Deep Ventexo(-)、Vent exo(-)以及无环核苷酸(acyNTPS)。
附接至流体小液滴内的珠子的寡核苷酸可用于扩增样品核酸，使得该寡核苷酸变为附接至样品核酸。该样品核酸可包含几乎任何寻求分析的核酸，包括，例如，全基因组、外显子组、扩增子、靶向的基因组区段(例如，基因或基因家族)、细胞核酸、循环核酸等，并且如上所述，可包括DNA(包括gDNA、cDNA、mtDNA等)、RNA(例如，mRNA、rRNA、总RNA等)。这类用于条形码化的核酸的制备通常可通过易于获得的方法来实现，例如，富集或沉降方法、分离方法、扩增方法等。为了扩增期望的样品，如gDNA，流体小液滴内的寡核苷酸的随机N-mer序列可用于引发期望的靶序列并作为靶序列的互补序列延伸。在一些情况下，可在引发前，如本文其他各处所述将寡核苷酸从小液滴中的珠子释放。对于这些引发和延伸过程，可以使用任何合适的DNA扩增方法，包括聚合酶链反应(PCR)、数字PCR、逆转录PCR、多重PCR、巢式PCR、重叠-延伸PCR、定量PCR、多重置换扩增(MDA)或连接酶链反应(LCR)。在一些情况下，可以进行流体小液滴内的扩增，直到可产生一定量的包含条形码的样品核酸。在一些情况下，扩增可以进行约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个循环。在一些情况下，扩增可以进行超过约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多的循环。在一些情况下，扩增可以进行少于约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个循环。
在一些情况下，可在使用或不使用分区或产生或不产生附加分区的情况下，在原始条形码添加至样品核酸之后将样品索引添加至样品核酸。在一些情况下，样品索引批量加入。在一些情况下，样品索引向样品核酸的添加可在条形码向样品核酸的添加之前发生。在一些情况下，样品索引向样品核酸的添加可以与样品索引向样品核酸的添加同时或平行发生。
在备选的方面，附加序列段可以与部分发夹结构的5’端连接，其中这类序列段不与发夹结构的非重叠部分互补。当经历引物延伸反应时，部分发夹结构可充当其自身的引物，并且其5’序列得到延伸(如由虚线箭头示出的)，直到其形成完整的或几乎完整的发夹结构，例如，没有或几乎没有突出端序列。该完整的发夹结构将具有大得多的双链体稳定性，由此可能消极地影响破坏发夹结构以引发其复制的能力，即使当采用更高亲和性的引物(例如，含LNA的引物/探针)时。
在一些情况下，微流体装置(例如，微流体芯片)可能在样品索引化的平行化方面是有用的。这样的装置可包含平行模块，每个模块均能够通过同时包含条形码序列和样品索引的引物将条形码序列和样品索引添加至样品的核酸分子。每个平行模块可包含含有不同样品索引的引物组，使得在每个模块中处理的样品与不同的样品索引和条形码组相关联。例如，具有8个模块的微流体装置可以能够对8种不同的样品进行样品索引化。在通过将序列附接至样品核酸而进行条形码化和样品索引化后，可以利用通过例如连续扩增批量添加附加序列(例如，R2、P7、其他条形码序列)来产生如本文其他各处所述的测序仪就绪产物。
测序仪就绪产物可以包含条形码序列，该条形码序列可以用来比对序列读取结果并提供样品核酸的序列。可例如采用PHASE扩增并随后如本文其他各处所述进行批量扩增来生成测序仪就绪产物。此外，条形码序列可属于特定的一组已知条形码序列。这组条形码序列可与特定的样品关联，使得可通过所读取的条形码序列来实现特定测序读取结果所源自的样品的鉴定。每个样品均可与一组已知条形码序列关联，其中每个条形码序列组包含不与和其他样品关联的其他条形码组中的条形码序列重叠的条形码序列。因此，条形码序列的独特性以及其在不同条形码序列组之间的独特性可以用于多重化。
在其他情况下，可在将条形码序列添加至样品核酸之前将样品索引添加至样品核酸。例如，可批量预扩增样品核酸，使得所得扩增子在条形码化之前附接至样品索引序列。例如，可采用包含样品索引序列的引物扩增样品，使得该样品索引序列可附接至样品核酸。在一些情况下，所述引物可以是随机引物(例如，包括随机N-mer)并且扩增可以是随机的。随后可使用任何合适的方法(包括本文所述的条形码化方法)对产生的包含样品索引的扩增子进行条形码化。
可将样品核酸分子与上述引物组合至分区(例如，乳液的小液滴)。在一些情况下，每一个分区可包含多个样品核酸分子(例如，较大核酸的较小碎片)。在一些情况下，每一个分区中存在独特样品核酸分子的不多于一个拷贝。在一些情况下，每一个分区通常可包含含有相同条形码序列和样品引发序列(例如，可变随机N-mer、靶向N-mer)的引物，其中分区之间的条形码序列通常不同。在这样的情况下，每一个分区(因此分区中的样品核酸)可与独特的条形码序列关联，并且所述独特的条形码序列可用于确定分区中生成的条形码化的样品核酸的序列。
在一些情况下，生成条形码化的样品核酸时，该条形码化的样品核酸可从它们各自的分区中释放、合并并经历批量扩增方案，以添加全部下游测序仪就绪产物共同的附加序列(例如，附加测序引物结合位点、附加测序仪引物结合位点、附加条形码序列、样品索引序列)。在分区为乳液的小液滴的情况下，可破乳并合并条形码化的样品核酸。可例如使用本文所述的系列扩增方法向释放的、条形码化的样品核酸中批量添加样品索引。在批量添加样品索引的情况下，由相同的样品生成的每一个测序仪就绪产物将包含相同的样品索引，该样品索引可用于鉴定生成测序仪就绪产物的读取结果的样品。在条形码化期间添加样品索引的情况下，用于条形码化的每一个引物可包含相同的样品索引序列，使得由相同样品生成的每一个测序仪就绪产物将包含相同的样品索引序列。
对于每一个样品，可使用针对每一个样品不同的样品索引，重复进行样品核酸的分配以生成条形码化的(或条形码化的且样品索引化的)样品核酸以及随后向条形码化的样品核酸添加附加序列(例如，包括样品索引)。在一些情况下，微流体小液滴发生器可用于分配样品核酸。在一些情况下，微流体芯片可包含多个小液滴发生器，使得可在每一个小液滴发生器处理不同的样品，从而允许平行的样品索引化。经由每一个不同的样品索引，可实现测序期间的多重化。
一旦生成测序仪就绪寡核苷酸，随后可将测序仪就绪寡核苷酸提供给测序装置以供测序。因此，例如，向测序装置提供的整个序列可包含一个或多个与测序装置相兼容的衔接子(例如，P5、P7)、一个或多个条形码序列、一个或多个引物结合位点(例如，读取1(R1)序列引物，读取2(R2)测序引物、索引引物)、N-mer序列、通用序列、感兴趣的序列及其组合。条形码序列可位于序列的任一端。在一些情况下，条形码序列可位于P5与读取1序列引物结合位点之间。在其他情况下，条形码序列可位于P7与读取2序列引物结合位点之间。在一些情况下，第二条形码序列可位于P7与读取2序列引物结合位点之间。可在测序装置中使用索引序列引物结合位点以确定条形码序列。
有待向测序仪装置提供的序列的各种组分(例如，衔接子、条形码序列、样品索引序列、样品序列、引物结合位点等)的配置可根据例如期望的特定配置和/或序列的各种组分的添加顺序而变化。可以使用用于测序的任何合适的配置并且可以以任何合适的顺序向寡核苷酸添加任何序列。可在样品核酸的条形码化之前、期间和之后向该样品核酸添加附加序列。例如，可在条形码化期间向样品核酸添加P5序列，并可在该样品核酸的条形码化之后以批量扩增方式添加P7。或者，可在条形码化期间向样品核酸添加P7序列，并可在该样品核酸的条形码化之后以批量扩增方式添加P5序列。本文实例所示的示例性配置并非旨在限制。而且，经由扩增向寡核苷酸添加序列组分也并不意味着限制。还可使用其他方法，例如，连接。此外，本文所述的衔接子、条形码序列、样品索引序列、引物结合位点、测序仪就绪产物等并不意味着限制。可使用本文所述的方法，针对任何合适类型的测序平台(例如，Illumina测序、LifeTechnologies Ion Torrent、Pacific Biosciences SMRT、Roche 454测序、Life Technologies SOLiD测序等)，产生本文所述的任何类型的寡核苷酸，包括测序仪就绪产物。
可使用本文所述方法采用适合于特定测序平台的任何衔接子序列生成测序仪就绪寡核苷酸。例如，可使用本文所述方法生成包含一个或多个条形码序列以及在LifeTechnologies Ion Torrent测序中有用的P1和A衔接子序列的测序仪就绪寡核苷酸。在一个实例中，可生成包含经由二硫键与P1序列连接的acrydite部分的珠子(例如，凝胶珠子)。可生成包含P1序列、条形码序列和随机N-mer序列的条形码构建体。该条形码构建体可进入扩增反应(例如，在分区如流体小液滴中)以对样品核酸进行条形码化。条形码化的扩增子随后可经历进一步的批量扩增，以添加A序列和任何其他期望的序列，诸如样品索引。或者，P1和A序列可互换，使得在样品条形码化期间添加A并且批量添加P1。完整序列随后可进入Ion Torrent测序仪。可以以类似方式添加用于其他测序平台的其他衔接子序列(例如，用于Life Technologies SOLiD测序的P1衔接子序列、用于Roche 454的A和B衔接子序列等)。
尽管本文描述为生成部分发夹分子，以及在一些情况下，防止形成完整发夹，但在一些情况下可能希望提供包含本文所述的条形码序列的完整发夹片段。特别地，这样的完整发夹分子可以进一步经历常规样品制备步骤，该步骤是通过在常规测序工作流程中处理单个发夹分子的3’和5’端，如同双链双链体分子的一个末端。特别地，通过使用常规的连接步骤，可容易地将合适的衔接子序列附接至发夹分子的3’和5’端两个末端，其附接方式与它们附接至双链体分子的3’和5’末端的方式相同。例如，在基于Illumina的测序过程的情况下，可使用标准的Illumina方案将包括P5和P7衔接子的标准Y衔接子以及R1和R2引物序列附接至发夹的一端，如同它是双链体分子的一个末端。
VII.数字处理器
本公开内容的方法、组合物、装置和试剂盒可与任何合适的处理器、数字处理器或计算机一起使用。可将数字处理器编程，例如，以操作装置的任何部件和/或执行本文所述的方法。该数字处理器可以能够通过计算机网络例如因特网发送或接收电子信号和/或与远程计算机通信。一个或多个外围设备如屏幕显示器、打印机、存储器、数据存储和/或电子显示适配器可以与该数字处理器通信。一个或多个输入设备如键盘、鼠标或控制杆可与该数字处理器通信。该数字处理器还可与探测器通信，以使得探测器在期望的或其他预定的时间点或在由从预处理单元或其他装置接收的反馈所确定的时间点执行测量。
在一个实例中，控制器包括计算机，该计算机充当控制组件的中央集线器(hub)。该计算机与显示器、一个或多个输入设备(例如，鼠标、键盘、照相机等)和任选的打印机通信。该控制组件经由其计算机与以下的一个或多个装置通信：任选的样品预处理单元、一个或多个样品处理单元(诸如测序仪、热循环仪或微流体装置)和任选的探测器。该控制组件可经由例如以太网连接来联网。用户可使用输入设备向计算机提供输入(例如，对于期望的一组核酸扩增反应所必需的参数或微流体装置的流速)。该输入由计算机解释以生成指令。该计算机将这样的指令传递至任选的样品预处理单元，所述一个或多个样品处理单元和/或任选的探测器以供执行。
而且，在任选的样品预处理单元、一个或多个样品处理单元和/或任选的探测器的运行过程中，每一个装置可将信号回传至计算机。这样的信号可由计算机解释并使用，以确定任何装置是否需要进一步的指令。该计算机也可调节样品预处理单元，使得样品的组分适当地混合并以期望的或以其他方式预定的速率进料至样品处理单元(诸如微流体装置)。
计算机还可与探测器通信，以使得该探测器在期望的或以其他方式预定的时间点或在由从预处理单元或样品处理单元接收的反馈所确定的时间点执行测量。该探测器还可将测量过程中获得的原始数据回传至计算机，以供进一步分析和解释。
分析可经由显示器和/或由打印机生成的打印输出以对终端用户有用的格式进行汇总。用于控制样品预处理单元、样品处理单元和/或探测器的指令或程序，通过执行本文所述的任何方法而获得的数据，或经分析和/或解释的数据，可经由网络(例如可以是因特网)传输至一个或多个远程计算机或从一个或多个远程计算机接收。
在一些实施方案中，珠子形成方法可在与小液滴发生器通信的数字处理器的帮助下执行。该数字处理器可控制小液滴形成的速度或控制生成的小液滴总数。在一些实施方案中，将样品附接至条形码化珠子的方法可在与微流体装置通信的数字处理器的帮助下执行。具体地，该数字处理器可控制向输入通道中注入的样品和/或珠子的体积量，并且还可控制该通道内的流速。在一些实施方案中，附接寡核苷酸、引物等的方法可在与热循环仪或其他可编程的加热元件通信的数字处理器的帮助下执行。具体地，该数字处理器可在连接或扩增过程中控制循环的时间和温度。在一些实施方案中，样品测序方法可在与测序装置通信的数字处理器的帮助下执行。
VIII.试剂盒
在一些情况下，本公开内容提供了一种试剂盒，其包含微流体装置、多个条形码化的珠子以及关于使用该微流体装置和将条形码化的珠子与客户样品组合以创建含有条形码化珠子和客户样品的流体小液滴的说明。如贯穿本公开内容所详细说明的，任何合适的样品均可并入该流体小液滴。如贯穿本公开内容所述，珠子可被设计为可降解的或不可降解的。在这种情况下，该试剂盒可包含或可不包含用于珠子降解的还原剂。
在一些情况下，本公开内容提供了一种试剂盒，其包含多个条形码化的珠子、合适的扩增试剂(例如，任选地包括聚合酶、核苷三磷酸或其类似物、引物序列、缓冲液等中的一种或多种)以及关于将条形码化珠子与客户样品组合的说明。如贯穿本公开内容所详细说明的，可使用任何合适的样品。如贯穿本公开内容所详细说明的，所述扩增试剂可包括将不接受或处理含尿嘧啶的模板的聚合酶。本公开内容的试剂盒还可提供用来形成乳液的试剂，包括油和表面活性剂。
IX.应用
样品材料的条形码化
本文所述的方法、组合物和系统对于将条形码、尤其是核酸条形码序列附接至样品材料和这些样品材料的组分是特别有用的。通常，这通过将样品材料组分分配至具有共同分配的多个条形码(该条形码随后附接至相同分区内的样品组分)的单独的分区或反应体积中来完成。
在示例性过程中，提供包含多个寡核苷酸(例如，核酸条形码分子)的第一分区，所述多个寡核苷酸各自包含共同的核酸条形码序列。第一分区可包含多种便携式分区中的任何分区，例如，珠子(例如，可降解的珠子、凝胶珠子)、小液滴(例如，乳液中的水性小液滴)、微胶囊等，寡核苷酸与该分区可释放地附接、可释放地偶联或可释放地关联。而且，第一分区中可包含任何合适数目的寡核苷酸，包括本文别处所述的每一分区的寡核苷酸数。例如，寡核苷酸可经由可裂解的联接如化学可裂解的联接(例如，二硫键或本文所述的任何其他类型的化学可裂解的联接)、光可裂解的联接和/或热可裂解的联接与第一分区可释放地附接、可释放地偶联或可释放地关联。在一些情况下，所述第一分区可以是珠子，并且该珠子可以是可降解的珠子(例如，光可降解的珠子、化学可降解的珠子、热可降解的珠子或本文别处所述的任何其他类型的可降解的珠子)。而且，该珠子可包含如本文别处所述的化学可裂解的交联(例如，二硫键交联)。
随后将第一分区与样品材料、样品材料组分、样品材料的片段或样品材料组分的片段共同分配至第二分区。样品材料(或其组分或片段)可以是任何合适的样品类型，包括本文别处所述的示例样品类型。在样品材料或样品材料的组分包含一个或多个核酸片段的情况下，所述一个或多个核酸片段可具有任何合适的长度，包括例如本文别处所述的核酸片段的长度。所述第二分区可包括多种分区中的任何分区，包括例如孔、微孔、纳米孔、管或容器，或者优选情况下的小液滴(例如，乳液中的水性小液滴)或微胶囊，在该分区中第一分区可被共同分配。在一些情况下，第一分区可在第一水性流体中提供，并且样品材料、样品材料组分或样品材料组分的片段可在第二水性流体中提供。在共同分配过程中，第一水性流体和第二水性流体可在不混溶流体内的小液滴内组合。在一些情况下，第二分区可包含不多于一个第一分区。在其他情况下，第二分区可包含不多于一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个第一分区。在其他情况下，第二分区可包含至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个第一分区。
一旦共同分配，包含条形码序列的寡核苷酸可从第一分区中释放至第二分区(例如，经由第一分区的降解、裂解寡核苷酸与第一分区之间的化学联接或任何其他合适类型的释放，包括本文别处所述的释放类型)，并附接至与其共同分配的样品组分。在一些情况下，第一分区可包含珠子，并且珠子的交联可包括二硫键。此外，或者作为备选方案，寡核苷酸可经由二硫键与珠子连接。在任一情况下，可通过将第一分区暴露于还原剂(例如，DTT、TCEP或本文别处所述的任何其他示例性的还原剂)来使寡核苷酸从第一分区中释放。
如本文别处所述，将条形码附接至样品组分包括例如通过连接、杂交或其他关联将条形码寡核苷酸直接附接至样品材料。此外，在许多情况下，例如，在核酸样品材料(例如，模板核酸序列、模板核酸分子)、其组分或片段的条形码化中，这样的附接可另外包括使用含条形码的寡核苷酸，该寡核苷酸还包含引发序列。该引发序列可与核酸样品材料的至少一部分互补，并可沿着核酸样品材料延伸以产生此类样品材料的互补序列以及这些序列或其互补序列的至少部分扩增产物。
在另一个示例性过程中，可提供包含多个不同的核酸条形码序列的多个第一分区。每一个第一分区可包含多个核酸条形码分子，该核酸条形码分子具有与之关联的相同的核酸条形码序列。任何合适数目的核酸条形码分子可与每一个第一分区关联，包括本文别处所述的每一分区的核酸条形码分子的数目。第一分区可包含任何合适数目的不同核酸条形码序列，包括例如至少约2、10、100、500、1000、5000、10000、50000、100000、500000、1000000、5000000、10000000、50000000或1000000000个或更多个不同的核酸条形码序列。
在一些情况下，所述多个第一分区可包含多个不同的第一分区，其中每一个不同的第一分区包含多个可释放地附接、可释放地偶联或可释放地关联的包含共同条形码序列的寡核苷酸，且与每一个不同的第一分区关联的寡核苷酸包含不同的条形码序列。不同的第一分区的数目可以是，例如，至少约2、10、100、500、1000、5000、10000、50000、100000、500000、1000000、5000000、10000000、50000000或1000000000个或更多个不同的第一分区。
可将第一分区与样品材料、样品材料的片段、样品材料的组分或样品材料的组分的片段共同分配至多个第二分区。在一些情况下，第二分区的子集可包含相同的核酸条形码序列。例如，至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多的第二分区可包含相同的核酸条形码序列。而且，每个第二分区的第一分区的分布还可根据例如本文别处所述的占有率而变化。在多个第一分区包含多个不同的第一分区的情况下，可将每一个不同的第一分区安置在单独的第二分区内。
共同分配之后，可将与第一分区关联的核酸条形码分子释放至多个第二分区。所释放的核酸条形码分子随后可附接至第二分区内的样品材料、样品材料组分、样品材料的片段或样品材料组分的片段。在条形码化的核酸物质(例如，条形码化的样品核酸、条形码化的模板核酸、一个或多个模板核酸序列的条形码化的片段等)的情况下，可如本文别处所述对条形码化的核酸物质进行测序。
在另一个示例性过程中，可提供可激活的核酸条形码序列，并且可将它与一个或多个样品材料、样品材料的组分、样品材料的片段或样品材料的组分的片段分配至第一分区。在第一分区中，可将可激活的核酸条形码序列激活，以产生活性核酸条形码序列。该活性核酸条形码序列随后可附接至一个或多个样品材料、样品材料的组分、样品材料的片段或样品材料的组分的片段。
在一些情况下，所述可激活的核酸条形码序列可与第二分区偶联，该第二分区也被分配在具有可激活的核酸条形码序列的第一分区中。如本文别处所述，可通过将可激活的核酸条形码序列从关联的分区(例如，珠子)中释放，来激活可激活的核酸条形码序列。因此，在可激活的核酸条形码序列与被分配在第一分区(例如，流体小液滴)中的第二分区(例如，珠子)关联的情况下，可通过将可激活的核酸条形码序列从其所关联的第二分区中释放，来激活所述可激活的核酸条形码序列。此外，或者作为备选方案，也可通过从可激活的核酸条形码序列中去除可去除的阻断基团或保护基团，来激活可激活的条形码。
在另一个示例性过程中，核酸样品可与条形码化的珠子(包括本文别处所述的珠子类型)的文库组合以形成混合物。在一些情况下，珠子的条形码除了条形码序列之外还可各自包含一个或多个附加序列，例如，通用序列和/或功能序列(例如，如本文别处所述的随机N-mer或靶向N-mer)。可将该混合物分配至多个分区，其中分区的至少一个子集包含至多一个条形码化的珠子。在所述分区内，可使用任何合适的途径(包括本文所述的释放类型)使条形码从珠子释放。条形码化的珠子的文库可经由任何合适的途径生成，包括使用本文别处所述的方法和组合物。在一些情况下，如本文别处所述，核酸样品可在微流体装置的帮助下与条形码化珠子的文库和/或所得到的经分配的混合物组合。在释放的条形码也包含引物序列(例如，如本文别处所述的靶向N-mer或随机N-mer)的情况下，条形码的引物序列可与样品核酸杂交，并且如果需要，扩增反应可在分区中完成。
多核苷酸测序
通常，本文提供的方法和组合物可用于制备寡核苷酸片段以用于下游应用如测序。特别是，这些方法、组合物和系统在测序文库的制备中是有用的。测序可以通过任何可用的技术进行。例如，测序可以通过经典Sanger测序方法进行。测序方法还可以包括：高通量测序、焦磷酸测序、连接测序、合成测序、杂交测序、RNA-Seq(Illumina)、数字基因表达(Helicos)、下一代测序、单分子合成测序(SMSS)((Helicos)、大规模平行测序、克隆单分子阵列(Solexa)、鸟枪法测序、Maxim-Gilbert测序、引物步移法以及本领域中已知的任何其他测序方法。
例如，可通过提供多个靶核酸序列和将靶核酸序列分离至多个单独的分区来对多个靶核酸序列进行测序。每一个单独的分区可包含一个或多个靶核酸序列和多个寡核苷酸。单独的分区可包含任何合适数目的不同的条形码序列(例如，至少1,000个不同的条形码序列、至少10,000个不同的条形码序列、至少100,000个不同的条形码序列、至少1,000,000个不同的条形码序列、至少10,000,000个不同的条形码序列或如本文别处所述的任何其他数目的不同的条形码序列)。而且，给定分区中的寡核苷酸可包含共同的条形码序列。给定分区中的寡核苷酸和关联的共同的条形码序列可附接至该给定分区内的一个或多个靶核酸的片段或靶核酸序列的部分的拷贝。附接之后，可随后合并单独的分区。然后可对靶核酸的片段或靶核酸的部分的拷贝以及附接的条形码序列进行测序。
在另一个实例中，可通过提供靶核酸序列和将它们分离至多个单独的分区来对多个靶核酸序列进行测序。所述多个单独的分区中的每一个分区可包含一个或多个靶核酸序列和具有多个附接的寡核苷酸的珠子。附接至给定珠子的寡核苷酸可包含共同的条形码序列。与珠子关联的寡核苷酸可附接至给定分区内的靶核酸序列的片段或靶核酸序列的部分的拷贝，以使得给定分区的片段或拷贝也附接至与珠子关联的共同的条形码序列。将寡核苷酸附接至靶核酸序列的片段或靶核酸序列的部分的拷贝之后，可随后合并单独的分区。然后可对靶核酸序列的片段或靶核酸序列的部分的拷贝以及任何附接的条形码序列进行测序(例如，使用任何合适的测序方法，包括本文别处所述的那些方法)，以提供条形码化的片段序列或条形码化的拷贝序列。部分地基于条形码化的片段序列或条形码化的拷贝序列的条形码部分，条形码化的片段序列或条形码化的拷贝序列可组装成一个或多个毗连的核酸序列。
在一些情况下，对不同数目的条形码化的寡核苷酸进行测序。例如，在一些情况下，对约30％-90％的条形码化的寡核苷酸进行测序。在一些情况下，对约35％-85％、40％-80％、45％-75％、55％-65％或50％-60％的条形码化的寡核苷酸进行测序。在一些情况下，对至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的条形码化的寡核苷酸进行测序。在一些情况下，对小于约30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的条形码化的寡核苷酸进行测序。
在一些情况下，从片段组装序列，从而为可能比单独的序列读取结果更长的原始靶多核苷酸的毗连区提供序列信息。单独的序列读取结果可为约10-50、50-100、100-200、200-300、300-400个或更多个核苷酸的长度。序列组装方法的实例包括在提交于2014年6月26日提交的美国专利申请号14/752,773中阐述的那些。
条形码的身份可用于整理来自单独片段的序列读取结果以及区别单元型。例如，当在流体小液滴内组合单独的样品片段与条形码化的珠子时，亲本多核苷酸片段可分离至不同的小液滴。随着流体小液滴和小液滴内珠子的数目的增加，来自母本和父本单元型两者的片段包含在与相同珠子关联的相同流体小液滴内的可能性可能变得极小。因此，可组装并整理来自与相同珠子关联的相同流体小液滴中的片段的序列读取结果。
在至少一个实例中，本公开内容提供了核酸测序方法、系统、组合物和这些的组合，其可用于在序列组装和读长等价两方面提供种种益处，而这样做具有非常高的通量并减少了样品制备时间和成本。
通常，本文所述的测序方法提供了遗传序列的片段的局部标记或条形码化。通过标记来源于较大遗传序列内相同位置的片段，可利用标签或条形码的存在来告知如上所提到的组装过程。此外，可使用本文所述的方法由单一的长核酸分子生成较短的片段并对该较短的片段进行条形码化。对这些较短片段的测序和组装提供了长读等价序列，但并不需要低通量较长读长测序技术。
根据前文，将大遗传组分如长核酸片段(例如长度为1、10、20、40、50、75、100、1000kb或更多kb)、染色体片段或全染色体或整个基因组的一部分(例如，基因组DNA)片段化成较小的第一片段。通常，这些片段可为约1000至约100000个碱基之间的任何长度。在某些优选方面，片段将为约1kb至约100kb，或约5kb至约50kb，或约10kb至约30kb，并且在一些情况下，为约15kb至约25kb。这些较大遗传组分的片段化可通过多种方便可得的方法中的任何方法来进行，该方法包括可商购获得的基于剪切的片段化系统(例如，Covaris片段化系统)、大小靶向片段化系统(例如Blue Pippin(Sage Sciences))、酶片段化方法(例如，使用限制性内切核酸酶)等等。如上所述，较大遗传组分的第一片段可包括重叠或非重叠的第一片段。尽管本文描述为在分配之前进行片段化，但应当理解片段化可任选地和/或另外地在例如一个或多个扩增步骤之后的过程中较晚地进行，以产生用于测序应用的所需大小的片段。
在优选的方面，第一片段由较大遗传组分或其部分的多个拷贝生成，使得产生重叠的第一片段。在优选的方面，重叠的片段将构成潜在较大遗传组分或其部分的大于1X覆盖范围、大于2X覆盖范围、大于5X覆盖范围、大于10X覆盖范围、大于20X覆盖范围、大于40X覆盖范围或甚至更大的覆盖范围。随后将第一片段隔离至不同的反应体积。在一些情况下，可分离第一片段以使得反应体积含有一个或较少的第一片段。这通常通过以在溶液中有限稀释的方式提供片段来实现，以使得将溶液分配至不同的反应体积导致多于一个片段被放置于给定反应体积的概率非常低。然而，在多数情况下，给定反应体积可包含多个不同的第一片段，并且可能甚至具有2、5、10、100、100个或甚至高达10,000个或更多个在给定反应体积中的不同的第一片段。此外，通常基于对该起始材料中的核酸浓度的理解，通过对第一片段所源自的溶液的适当稀释来得到在单独反应体积内期望范围的片段数目。
反应体积可包含各种不同类型的容器或分区中的任何一种。例如，反应体积可包括常规反应容器，诸如试管、反应孔、微孔、纳米孔，或者反应体积可包括较小的常规反应体积，诸如稳定乳液，例如油包水乳液体系内的小液滴。在优选的方面，由于小液滴具有极高的多重化能力，例如，允许使用单一容器内成千上万、数百万、数千万个或甚至更多个离散小液滴/反应体积，因此优选小液滴作为反应体积。在每一个反应体积内，随后使其中包含的片段经历处理，该处理衍生每一个第一片段的重叠第二片段组，并且还为这些第二片段提供附接的条形码序列。应当理解，在优选的方面，将第一片段分配至还含有一个或多个微胶囊或珠子的小液滴中，所述微胶囊或珠子包含用于生成第二片段和对第二片段进行条形码化的条形码文库的成员。
在优选的方面，这些第二片段的生成通过引入包含条形码序列的引物序列以及能够与部分第一片段杂交并沿着第一片段延伸的引物序列来进行，以提供包含条形码序列的第二片段。这些引物可包含靶向引物序列例如以衍生与第一片段的特定部分重叠的片段，或者它们可包含通用引发序列，例如，将引发第一片段的多个不同区域以产生大且多样性组的第二片段(其跨越第一片段并提供多倍重叠覆盖范围)的随机引物。这些延伸的引物序列可用作第二片段，或者它们可被进一步复制或扩增。例如，针对延伸的序列反复引发(例如，使用含相同引物的条形码化的寡核苷酸)。在某些优选的方面，第二组片段的生成产生了第一片段的部分的部分发夹复制物，如本文别处所述，这些复制物各自包含条形码序列，例如，用于如本文所述的PHASE扩增。如本文别处所述，通常期望形成部分发夹以防止重新引发复制的链，例如，制备拷贝的拷贝。同样地，相对于与扩增产物退火的引物，部分发夹通常优先由扩增产物在退火期间形成，例如，发夹将具有高于引物产物对的Tm。
通常选择具有适合于后续测序的长度的第二片段。对于短读测序技术，这样的片段将通常为约50个碱基至约1000个碱基的可测序长度、约50个碱基至约900个碱基的可测序长度、约50个碱基至约800个碱基的可测序长度、约50个碱基至约700个碱基的可测序长度、约50个碱基至约600个碱基的可测序长度、约50个碱基至约500个碱基的可测序长度、约50个碱基至约400个碱基的可测序长度、约50个碱基至约300个碱基的可测序长度、约50个碱基至约250个碱基的可测序长度、约50个碱基至约200个碱基的可测序长度、或约50个碱基至约100个碱基的可测序长度(包括条形码序列段和经历测序过程的功能序列)。
一旦重叠，则生成条形码化的第二片段组，它们可合并用于后续处理和最终的测序。例如，在一些情况下，如本文别处所述，随后可使条形码化的片段经历附加扩增，例如，PCR扩增。同样地，这些片段可另外地或同时被提供有用于鉴定条形码化的片段的集合所源自的样品的样品索引序列，以及提供用于在测序过程中使用的附加功能序列。
此外，还可任选地进行清理步骤，例如，以从其他杂质中纯化核酸组分，按大小选择用于测序的片段组等。这样的清理步骤可包括对SPRI珠子(诸如可从Beckman Coulter,Inc.获得的
Figure BDA0001404450070000751
珠子)进行纯化和/或大小选择。在一些情况下，当片段与SPRI珠子关联时，多个过程步骤可在一个集成过程中执行，例如，如在Fisher等人,GenomeBiol.2011:12(1):R1(E-pub 2011年1月4日)中所述，该文献为了所有目的通过引用以全文并入本文。
如先前所述，在许多情况下，使用短读测序技术来提供第二片段组的序列信息。因此，在优选的方面，第二片段组通常将包含片段，该片段在包含条形码序列时将在所用测序系统的读长内。例如，对于Illumina
Figure BDA0001404450070000752
测序，当进行配对末端测序时，这样的片段可通常为约100个碱基至约200个碱基的长度。在一些情况下，当通过测序过程仅获得片段的末端部分时可对较长的第二片段进行测序。
应当理解，尽管基于短序列数据，但可推断出共享相同条形码的两个序列很可能源于相同的较长第一片段序列，尤其是在这样的序列能够以其他方式组装成毗连序列段的情况下，例如，使用带有共同条形码的其他重叠序列。一旦第一片段被组装，则第一片段可组装成较大的序列段，例如，完整长度的遗传组分。
在一个示例性过程中，一个或多个模板核酸序列的一个或多个片段可使用本文所述方法进行条形码化。所述一个或多个片段中的片段可至少部分地基于附接至其上的核酸条形码序列进行表征。片段的表征还可包括将片段定位到其各自的模板核酸序列或模板核酸序列所源自的基因组。而且，表征还可包括鉴定单独的核酸条形码序列以及附接至其上的模板核酸序列的片段的序列。
在一些情况下，本文所述的测序方法在表征核酸段或靶核酸中可能是有用的。在一些示例性方法中，可通过将核酸区段和包含多个寡核苷酸(其包含共同的核酸条形码序列)的珠子(例如，包括本文所述的任何合适类型的珠子)共同分配至分区(包括本文所述的任何合适类型的分区，例如，小液滴)中来表征核酸区段。所述寡核苷酸可被可释放地附接至如本文别处所述的珠子(例如，向珠子施加刺激时可从珠子释放，例如，热刺激、光刺激和化学刺激)，和/或可包含一个或多个功能序列(例如，引物序列、引物退火序列、固定序列、本文别处所述的任何其他合适的功能序列等)和/或如本文别处所述的一个或多个测序引物序列。而且，可将任何合适数目的寡核苷酸附接至珠子，包括本文别处所述的附接至珠子的多个数目的寡核苷酸。
在所述分区内，寡核苷酸可附接至核酸区段的片段或核酸区段的部分的拷贝，以使得该片段或拷贝也附接至共同的核酸条形码序列。该片段可以是核酸区段的重叠片段，并且可提供例如核酸区段的大于2X覆盖范围、大于5X覆盖范围、大于10X覆盖范围、大于20X覆盖范围、大于40X覆盖范围或甚至更大的覆盖范围。在一些情况下，寡核苷酸可包含能够与核酸区段的一部分或其互补序列退火的引物序列。在一些情况下，可通过延伸寡核苷酸的引物序列来附接寡核苷酸，以复制核酸区段的至少一部分或其互补序列，从而产生核酸区段的至少一部分的拷贝，该拷贝包含寡核苷酸并因此包含共同的核酸条形码序列。
将寡核苷酸附接至核酸区段的片段或核酸区段的部分的拷贝之后，可经由任何合适的测序方法(包括本文所述的任何类型的测序方法)对核酸区段的片段或核酸区段的部分的拷贝以及附接的寡核苷酸(包括寡核苷酸的条形码序列)进行测序，以提供多个条形码化的片段序列或条形码化的拷贝序列。测序之后，核酸区段的片段或核酸区段的部分的拷贝可至少部分地基于它们附接至共同的核酸条形码序列而被表征为在核酸段内连接。应当理解，这样的表征可包括被表征为连接的和毗连的序列，以及可能在相同的片段内连接的序列，而非毗连的序列。而且，测序过程中生成的条形码化的片段序列或条形码化的拷贝序列可至少部分地基于共同核酸条形码序列和/或条形码化的片段序列或条形码化的拷贝序列的非条形码部分而组装成一个或多个毗连的核酸序列。
在一些情况下，可将多个核酸区段(例如，如本文别处所述的基因组的至少一部分的片段)与多个不同的珠子共同分配至多个单独的分区中，使得单独分区中的多个不同分区中的每一个分区均含有单个珠子。所述多个不同珠子可包含多个不同的条形码序列(例如，至少1,000个不同的条形码序列、至少10,000个不同的条形码序列、至少100,000个不同的条形码序列、至少1,000,000个不同的条形码序列或如本文别处所述的任何其他数目的不同的条形码序列)。在一些情况下，所述多个单独分区中的两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个可包含含有相同条形码序列的珠子。在一些情况下，至少0.01％、0.1％、1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的单独分区可包含具有相同条形码序列的珠子。而且，每一个珠子可包含多个附接的寡核苷酸，该寡核苷酸包含共同的核酸条形码序列。
共同分配之后，可将条形码序列附接至每一个分区中核酸区段的片段或核酸区段的部分的拷贝。随后可将核酸区段的片段或核酸区段的部分的拷贝从单独的分区中合并。合并后，可对核酸区段的片段或核酸区段的部分的拷贝以及任何关联的条形码序列进行测序(例如，使用任何合适的测序方法，包括本文所述的那些方法)，以提供经测序的片段或经测序的拷贝。经测序的片段或经测序的拷贝可至少部分地基于包含共同的条形码序列的经测序的片段或经测序的拷贝而被表征为来源于共同的核酸区段。而且，可组装从经测序的片段或经测序的拷贝获得的序列，以提供经测序的片段或经测序的拷贝所源自的序列的毗连序列(例如，基因组的至少一部分)。可至少部分地基于经测序的片段的每一个核苷酸序列和经测序的片段的共同条形码序列完成从经测序的片段或经测序的拷贝进行的序列组装。
在另一示例方法中，可通过将靶核酸的片段分至配多个小液滴中来表征靶核酸。每一个小液滴可包含附接至包含共同的条形码序列的多个寡核苷酸的珠子。共同的条形码序列可附接至小液滴中靶核酸的片段的片段。然后可将小液滴合并，并使用任何合适的测序方法(包括本文所述的测序方法)对合并的小液滴的片段和关联的条形码序列进行测序。测序之后，可至少部分地基于包含共同的条形码序列的靶核酸的片段的片段将靶核酸的片段的片段定位到靶核酸的片段。
本文所述的方法、组合物和系统在测序中的应用通常可适用于多种不同的测序技术中的任何技术，包括NGS测序技术如Illumina MiSeq、HiSeq和X10测序系统，以及可从Life Technologies,Inc.获得的测序系统如Ion Torrent测序系统线。尽管关于条形码序列进行了讨论，但应当理解经测序的条形码序列可能不包括被包含在内的整个条形码序列，例如，导致测序错误。同样地，当提及将两个条形码序列表征为相同的条形码序列时，应当理解这可能是基于对条形码序列的很大一部分的识别，例如变化了少于5、4、3、2个或甚至单个碱基。
从少量细胞进行测序
本文提供的方法还可以用来以使得能够获得细胞特异性信息的方式制备细胞内含有的多核苷酸。该方法使得能够从极小的样品如包含约10-100个细胞的样品检测遗传变异。在一些情况下，在本文描述的方法中可以使用约1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个细胞。在一些情况下，在本文描述的方法中可以使用至少约1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个细胞。在其他情况下，在本文描述的方法中可以使用至多约5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个细胞。
在一个实例中，方法可包括分配细胞样品(或粗细胞提取物)以使得在分区例如微流体小液滴内存在至多一个细胞(或一个细胞的提取物)，并且将其与例如以上所述的条形码寡核苷酸共同分配。处理然后包括裂解细胞，对细胞内包含的多核苷酸进行片段化，将片段化的多核苷酸附接至条形码化的珠子，合并该条形码化的珠子，并对所得的条形码化的核酸片段进行测序。
如本文别处所述，条形码和其他试剂可以封装在珠子(例如，凝胶珠子)内、包覆于其上、与之关联或分散于其内。该珠子可以与样品(例如，细胞)加载同时加载到流体小液滴内，使得每个细胞与不同的珠子接触。该技术可以用来将独特条形码附接至从每个细胞获得的寡核苷酸。然后可以将所得的标记的寡核苷酸合并且测序，并可以使用条形码追踪该寡核苷酸的起源。例如，可以确定具有相同条形码的寡核苷酸起源于相同的细胞，同时可以确定具有不同条形码的寡核苷酸起源于不同的细胞。
本文描述的方法可以用来检测可以指示存在疾病如癌症的特定基因突变。例如，检测结肠组织样品的BRAF基因中V600突变的存在可以指示结肠癌的存在。在其他情况下，预后应用可包括检测可充当发生特定疾病的提高的风险因素的一个或多个特定基因中的突变。例如，检测乳腺组织样品中BRCA1突变的存在可指示比没有该突变的个人更高水平的发生乳腺癌的风险。在一些实例中，本公开内容提供了鉴别两个不同癌基因(例如，KRAS和EGRF)中的突变的方法。如果相同细胞包含具有两个突变的基因，这可以指示癌症的更具侵袭性的形式。与此相反，如果突变位于两个不同的细胞中，这可以指示该癌症可能是更加良性的或不到晚期。
基因表达的分析
本公开内容的方法可适用于处理样品以用于检测基因表达的变化。样品可包含细胞、mRNA或由mRNA反转录的cDNA。样品可以是包含来自数个不同细胞或组织的提取物的合并样品，或者包含来自单个细胞或组织的提取物的样品。
可将细胞直接置于流体小液滴中并裂解。裂解后，可使用本公开内容的方法对细胞的寡核苷酸进行片段化和条形码化以供测序。寡核苷酸也可以在将其引入在本公开内容的方法中使用的流体小液滴中之前从细胞提取。mRNA的逆转录可在本文所述的流体小液滴中，或在这样的流体小液滴的外部进行。cDNA测序可提供随时间或在暴露于特定条件后特定细胞中的特定转录物的丰度的指示。
从细胞或蛋白质分配多核苷酸
在一个实例中，本公开内容提供的组合物、方法、装置和试剂盒可用来将细胞或蛋白质封装在流体小液滴内。在一个实例中，可以将单个细胞或多个细胞(例如，2、10、50、100、1000、10000、25000、50000、10000、50000、1000000个或更多个细胞)与流体小液滴内的裂解缓冲液一起加载至珠子之上、之内或内部，并温育指定的一段时间。该珠子可以是多孔的，以允许洗涤珠子的内含物以及将试剂引入珠子中，同时将一个或多个细胞的多核苷酸(例如，染色体)保持在流体小液滴内。然后可根据本公开内容中提供的或本领域已知的任何方法，处理封装的一个或多个细胞的多核苷酸(例如，染色体)。该方法也可应用于任何其他的细胞组分，如蛋白质。
表观遗传应用
本公开内容的组合物、方法、装置和试剂盒在表观遗传应用中可能中是有用的。例如，DNA甲基化可以是表观遗传的指标，包括单核苷酸多态性(SNP)。因此，可对包含核酸的样品进行处理，以便确定在测序过程中被甲基化的碱基。在一些情况下，可将待条形码化的包含核酸的样品分成两个等份。样品的一个等份可用亚硫酸氢盐处理，以便将未甲基化的含胞嘧啶的核苷酸转化为含尿嘧啶的核苷酸。在一些情况下，亚硫酸氢盐处理可在样品分配之前发生或可在样品分配之后发生。然后可分配每一个等份(如果还没有分配)，在分区中进行条形码化，并如本文所述批量添加附加序列以生成测序仪就绪产物。针对每一个等份(例如，亚硫酸氢盐处理的样品与未处理的样品)获得的测序数据的比较可用于确定样品核酸中哪些碱基被甲基化。
在一些情况下，分开的样品的一个等份可用甲基化敏感性限制酶(MSRE)进行处理。甲基化特异性酶可处理样品核酸，使得样品核酸在甲基化位点裂解。样品等份的处理可在样品分配之前发生或可在样品分配之后发生，并可分配每一个等份以用于生成条形码化的测序仪就绪产物。针对每一个等份(例如，MSRE处理的样品与未处理的样品)获得的测序数据的比较可用于确定样品核酸中哪些碱基被甲基化。
低输入DNA应用
本文所述的组合物和方法在低多核苷酸输入应用的分析和测序中可能是有用的。本文所述的方法如PHASE可帮助在低多核苷酸输入应用中获得良好的数据质量和/或帮助滤掉扩增错误。这些低输入DNA应用包括用于对在不相关的或相关性较低的核酸的混合物(其中感兴趣的序列仅为少数组分)中的感兴趣的特定核酸序列进行测序和鉴定的样品分析，以能够对存在于不同核酸的聚集体中的多个不同核酸进行单独测序和鉴定，以及其中输入DNA的绝对量非常低的分析。具体的实例包括对来自组织样品或来自循环细胞的体细胞突变的测序和鉴定，其中样品的绝大部分将来源于正常的健康细胞，而小部分可来源于肿瘤或其他癌细胞。其他的实例包括在例如微生物组分析应用中对多个单独群体组分的表征，其中在庞大而多样化的微生物元素群体中单个群体成员的贡献可能不能以其他方式容易地鉴定。在进一步的实例中，能够单独地测序并鉴定来自不同染色体例如母本和父本染色体的相同区域的不同链允许鉴定每一个染色体上的独特变体。本文所述的组合物、方法和系统的低多核苷酸输入应用的其他实例在提交于2014年6月26日的美国临时专利申请号为62/017,580中进行了阐述。
经对本领域现状所面临的问题的讨论，本文所述的方法和系统的优势更加清晰。在分析样品材料例如细胞或组织样品的遗传组成时，多数测序技术依赖于样品中靶核酸的广泛扩增，以便产生足以用于测序过程的材料。遗憾的是，在这些扩增过程中，多数本发明的材料将优先压倒性多于样品中以较低水平存在的部分。例如，在来自样品的遗传材料由95％的正常组织DNA和5％的来自肿瘤细胞的DNA组成的情况下，典型的扩增过程例如基于PCR的扩增将快速扩增多数本发明的材料(少数本发明的材料排除在外)。此外，因为这些扩增反应通常在合并的环境中进行，因此在该过程中，就特定的染色体、多核苷酸或生物体而言，扩增序列的起源通常不会保留下来。
相比之下，本文所述的方法和系统将单独的或小数目的核酸分配至这些核酸组分可进行初始扩增的单独的反应体积例如小液滴中。在该初始扩增中，独特标识符可与在那些单独的反应体积中的组分偶联。在整个测序过程(包括后续的扩增过程，例如PCR扩增)中，不同组分的单独的分配扩增以及独特标识符例如条形码序列的应用允许保留每一个样品组分的贡献以及其起源的属性。
如本文和整个公开内容所用的术语“约”通常指可以比特定使用的情况内的规定数值大15％或小15％的范围。例如，“约10”将包括8.5至11.5的范围。
可以理解，本公开内容提供了本文所述的任何组合物、文库、方法、装置和试剂盒用于特定用途或目的(包括本文所述的各种应用、用途和目的)的应用。例如，本公开内容提供了本文所述的组合物、方法、文库、装置和试剂盒在分配物质、分配寡核苷酸、物质从分区中的刺激选择性释放、在分区中进行反应(例如，连接和扩增反应)、进行核酸合成反应、对核酸进行条形码化、为测序准备多核苷酸、多核苷酸测序、多核苷酸取相(参见，例如，提交于2014年6月26日的美国临时专利申请号62/017,808)、从少量细胞对多核苷酸进行测序、分析基因表达、从细胞分配多核苷酸、突变检测、神经系统病症诊断、糖尿病诊断、胎儿非整倍性诊断、癌症突变检测和法医学、疾病检测、医学诊断、低输入核酸应用如循环肿瘤细胞(CTC)测序、其组合中以及在本文所述的任何其他应用、方法、过程或使用中的用途。
本文提供的任何浓度值作为混合浓度值提供，不考虑任何原位转化、修饰、反应、隔绝等。而且，在适当的情况下，本文所述方法(例如，测序方法、条形码化方法、扩增方法、靶向扩增方法、分析条形码化的样品的方法等)的灵敏度和/或特异性可变化。例如，本文所述方法可具有大于50％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％的特异性，和/或大于50％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％的灵敏度。
其他测序途径
多种不同的测序技术在广泛的行业中实践，包括生物技术、制药研究、医学诊断、农业、基础研究、食品安全等。这些技术包括较老的Sanger测序法，其中末端有带有可区分标签的四种不同核苷酸的模板核酸的巢式片段通过其大小来分离，并通过该可区分标签，根据其终止核苷酸来鉴定。
测序方法还包括较新的“合成测序”法(或称SBS)，其中在模板依赖性聚合酶介导的延伸反应中特定核苷酸的迭代添加被鉴定并用于提供模板核酸的潜在序列。这些SBS过程通常分为(1)短读测序技术，例如，在Illumina HiSeq、MiSeq和NextSeq测序系统以及可从Thermo Fisher获得的Ion Torrent Proton和PGM系统中采用的技术，以及(2)长读测序技术，如可从Pacific Biosciences获得的单分子实时(或
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)测序系统。
短读技术通常利用整体途径，其中在核苷酸添加的单独循环中观察或检测排列在基底上的相同核酸模板分子的片或簇，以便以逐步的方式鉴定所添加的碱基。通过提供大量各自代表不同分子的簇，可在测序运行期间对大量不同的核酸片段进行测序。此外，通过依赖于所添加的经鉴定的碱基在给定簇内的所有分子(即，具有数十万个分子)中的一致性，延伸反应的任何低水平的不准确性(例如，掺入不正确的碱基)均被正确的碱基添加所压制，从而导致非常高的序列读取准确率。然而，由于延伸反应中固有的低效率，任何给定簇内的不同模板分子的延伸均可以随着时间彼此变为异相，导致在几百个碱基的读取长度之后不能准确地判定碱基，即使在整体途径中。
相比之下，长读单分子SBS法，如SMRT测序，检测单个核酸分子内的各个碱基。例如，SMRT测序依赖于当模板被单个DNA聚合酶复制时，对模板分子的复制中各个碱基的掺入的观察，其中使用特定的光学检测技术和荧光团标记的核苷酸，可观察碱基向复制链中的连续添加。通过观察单个长核酸模板分子的复制，可获得非常长的读取长度，例如，大约数万个碱基。然而，由于这些技术观察单个核酸分子的复制，因此在聚合酶反应中产生的任何错误均被观察到并引入感知的读取中。此外，为了避免混杂的序列信息，不使用例如具有校正能力的高度精确的聚合酶。这导致仅大约85％的碱基判定正确的单程准确性。对单程准确性的这种缺陷的补救方法采用呈圆形结构的模板分子，使得单个聚合酶可以围绕该圆形分子多次通过，从而模拟整体途径以提高准确性，例如，在相同序列分子上的多次测序通过为该序列提供了更高的一致准确性。
在其他方法中，当分子本身通过例如纳米孔测序系统中的检测区时，各个模板分子将被直接读出。然而，虽然这些系统已经在原理实验的证明中得到描述，但它们通常不可商购获得，并且通常容易不准确和产生噪声数据。
对于这些测序技术中的大多数，在实际测序过程之前采取了重要步骤，以便为所使用的测序系统提供可测序形式的模板核酸。这些步骤包括将待测序的核酸从样品中的其他物质中纯化出的常规工艺步骤，例如，从细胞或组织提取中对其进行提取、净化掉杂质蛋白质、酶和其他细胞碎片，以及将诸如引物序列、衔接子序列、发夹序列和标识符序列(如寡核苷酸条形码或样品索引寡核苷酸)等可操作组分掺入至核酸中以允许测序的步骤。已经开发了许多不同的工艺步骤来制备核酸分子的可测序文库(本文中也称为“测序文库”)，其中许多高度依赖于所使用的测序系统。
其他条形码化文库
在一个实例中，使用分配和条形码化过程从模板核酸得到长距离序列信息，而无需长读测序过程。简而言之，将来自样品例如细胞或组织的核酸的长片段分配至水：油乳液中的离散水性小液滴中。将带有条形码化引物序列群体的珠子与样品片段、聚合反应组分例如聚合酶、核苷三磷酸、Mg2+等共同分配至这些小液滴中。将条形码化引物从珠子上释放并使其沿着模板核酸的部分引发，从而产生模板的复制片段。因此，每个分区或小液滴均可包含原始起始片段的复制片段，但其中每个片段均包含条形码序列，该条形码序列可归属于被分配至给定小液滴中的单个珠子。然后进一步处理这些复制片段，例如，以附接附加功能序列，诸如扩增引物序列、其他测序仪特异性序列例如流动池附接序列、测序引物序列等，以及扩增片段的数目，以便使其通过测序过程。
然后，对复制的条形码化片段的测序产生短序列读取，该短序列读取也包含条形码序列。然后，可将该条形码序列连同序列信息一起用于将相关联的片段序列归属于起源起始片段，从而从短读序列提供例如关于起源长片段的长距离序列信息。通过确保复制片段覆盖整个起源片段(甚至多次覆盖)，可以容易地将序列组装成起源片段的虚拟长读取。此外，即使没有用于完全从头测序的完全多重覆盖，不同短序列上共同条形码的存在也可允许推断出两个不同短序列之间更长距离的连接，从而在例如基因组作图、结构变体检测、分相(phased)变体鉴定中提供优于单独的短读测序的许多优点(参见，例如，提交于2014年10月29日的美国专利申请号62/072,214，其通过引用全文并入本文用于所有目的)以及其他有价值的长距离序列连接信息。这些方法及其应用在例如提交于2014年6月26日的共同未决的美国专利申请号14/316,383、提交于2014年6月26日的62/017,808、提交于2014年10月29日的62/072,214、提交于2014年10月29日的62/072,164和提交于2014年6月26日的62/017,558中详细讨论，它们的全部公开内容通过引用全文并入本文用于所有目的。
其他片段化和条形码化
如本文所述，提供了用于从样品核酸制备改进的测序文库的方法和系统。所述改进的测序文库提供更均匀的覆盖、更低的序列错误率、对原始序列的更高扩增速率和更低的嵌合体生成率中的一种或多种优点。
如上文所提到的，用于提供模板核酸的条形码化复制片段以用作测序文库的方法在提交于2014年6月26日的共同未决的美国专利申请号14/316,383中详细描述，并在之前通过引用并入本文。简言之，如图19所示，将包含条形码序列的寡核苷酸连同样品核酸104一起共同分配在例如乳液中的小液滴102中。寡核苷酸108可提供在与样品核酸104共同分配的珠子106上，该寡核苷酸优选地是可从珠子106上释放的，如小图A所示。寡核苷酸108除了一个或多个功能序列例如序列110、114和116之外还包含条形码序列112。例如，寡核苷酸108以包含条形码序列112以及序列110的方式示出，该序列110可用作给定测序系统的附接或固定序列，例如，用于附接在Illumina Hiseq或Miseq系统的流动池中的P5序列。如图所示，该寡核苷酸还包含引物序列116，该引物序列116可包含通用、随机或靶向N-mer，以用于引发样品核酸104的部分的复制。寡核苷酸108内还包含序列114，该序列114可提供用于引发测序系统中的聚合酶介导的、模板指导的合成测序反应的测序引发区，如“读取1”或R1引发区。在许多情况下，条形码序列112、固定化序列110和R1序列114可对附接于给定珠子的所有寡核苷酸而言是共同的。引物序列116可因随机N-mer引物而变化，或者对用于某些靶向应用的给定珠子上的寡核苷酸而言可以是共同的。虽然参照条形码寡核苷酸内的功能序列区段元件的具体定位和类型进行了描述，但应当理解，条形码寡核苷酸内的功能区段的位置和性质可以变化。例如，可使用针对不同测序系统的引物序列代替P5、读取1等引物。类似地，如本文其他各处所述，可提供靶向引物序列以允许将条形码序列附接至基因组或样品遗传物质的靶向部分。另外，在一些情况下，可改变不同区段的位置环境。例如，在一些情况下，可能期望将条形码序列区段定位在序列读取引物或R1区段114的5'侧，例如，区段114与116之间，使得该条形码可在第一次通过或初始序列读取中得到测序，例如，在生成的条形码化片段的测序期间对读取1序列的引发之后，而不是在随后对反向互补序列的测序读取时获得条形码读取。本公开内容设想到这种和多种其他变化。
基于引物序列116的存在，所述寡核苷酸能够如小图B所示引发样品核酸，这允许利用聚合酶和其他同样与珠子106和样品核酸104共同分配的延伸试剂来延伸寡核苷酸108和108a。如本文其他各处所述，这些聚合酶可包括热稳定的聚合酶，例如，当期望有分区内双链样品核酸的初始变性时。或者，样品核酸的变性可以在分配之前，使得单链靶核酸被存放到分区中，从而允许在需要时使用非热稳定的聚合酶，例如，Klenow、phi29、Pol1等。如小图C所示，在对于随机N-mer引物能够与样品核酸104的多个不同区域退火的寡核苷酸的延伸后，创建核酸的多个重叠互补序列或片段，例如，片段118和120。尽管包含与样品核酸的部分互补的序列部分，例如，序列122和124(也称为“插入物”)，但这些构建体在本文中通常被称为包含样品核酸104片段，具有附接的条形码序列。在一些情况下，可能期望人工地限制所产生的复制片段的大小，以便从第一扩增步骤维持可处理的片段大小。在一些情况下，如上所述，这可以通过机械手段实现，例如，采用片段化系统如Covaris系统，或者可以通过引入随机延伸终止剂(例如，以低浓度)以防止过长片段的形成而实现。
然后，可对这些片段进行序列分析，或者对其进行进一步的处理，例如，以扩增可用于测序的核酸的量(例如，如小图D所示的过程所示)和/或提供附加功能序列。例如，同样从珠子106释放的附加寡核苷酸，例如寡核苷酸108b，可引发片段118和120。特别地，再次，基于寡核苷酸108b中随机N-mer引物116b(其在许多情况下将不同于给定分区中的其他随机N-mer，例如，引物序列116)的存在，该寡核苷酸与片段118退火，并被延伸以创建包含序列128的片段118的至少一部分的互补序列126，其包含样品核酸序列的一部分的复制物。寡核苷酸108b的延伸持续直到其已经复制通过片段118的寡核苷酸部分108。如小图D所示，该寡核苷酸可被配置用于在期望的点促进聚合酶引起的复制的停止，例如，在复制通过包含在片段118内的寡核苷酸108的序列116和114之后。在一些情况下，这通过掺入未被用于复制反应的聚合酶处理的核苷酸或核苷酸类似物来实现。例如，在许多情况下，可在引物序列中包含含有尿嘧啶的碱基，以停止经由不通读含有尿嘧啶的碱基的聚合酶引起的复制。这可以进行以供生成例如具有部分内部互补性的部分发夹序列，以便防止拷贝的过度复制和相关的偏倚，例如，部分发夹将会至少部分地从后续的复制步骤中去除。
如本文所述，这可以通过不同的方法实现，包括例如引入不能被所使用的聚合酶处理的不同核苷酸和/或核苷酸类似物。例如，这可以包括在序列区域112内包含含尿嘧啶的核苷酸，以使非尿嘧啶耐受的聚合酶停止该区域的复制。结果，创建了片段126，其在一端包含全长寡核苷酸108b，包括条形码序列112、附接序列110、R1引物区域114以及随机n-mer序列116b。
在该序列的另一端可包含第一寡核苷酸108的随机n-mer的互补序列116'，以及R1序列的全部或一部分的互补序列，示为序列114'。然后，R1序列114及其互补序列114'能够杂交在一起以形成部分发夹结构128。应当理解，因为不同寡核苷酸之间随机n-mer不同，所以通常预计这些序列及其互补序列将不会参与发夹形成，例如，作为随机N-mer116的互补序列的序列116'，预计将不会与随机n-mer序列116b互补。对于其他应用通常不是这样，例如，靶向引物，其中N-mer可以在给定分区内的寡核苷酸之间是共同的。
通过形成这些部分发夹结构，将允许从进一步复制中去除样品序列的大量第一水平复制物，例如，降低拷贝的迭代复制的普遍性。这种部分发夹结构还提供对所创建的片段(例如，片段126)的后续处理有用的结构。另外，在条形码化过程中使用含U寡核苷酸和非U处理聚合酶减少了该条形码化过程中会以其他方式降低该过程效率的引物二聚体伪迹的量(例如，因为没有或者几乎没有延伸会在充当延伸模板的含U引物中发生)。
在改进的途径的一个实例中，采用如上所述的分配方法，但向反应混合物中添加还包含足以能够允许条形码附接的功能序列元件的单独引物寡核苷酸，但该单独引物寡核苷酸不是条形码寡核苷酸的一部分。该途径在图20A中图示。如图所示，待与样品核酸片段共同分配的携带条形码寡核苷酸208的珠子206包含寡核苷酸，该寡核苷酸具有条形码序列以及一个或多个其他序列，例如，附接序列210(例如，P5)、条形码序列212和测序引物序列214(例如，R1)。如上所述，序列的条形码部分212可在不同的珠子之间变化，而其他序列中的至少一种在各种不同珠粒上是恒定的。在所示实例中，珠子206上的寡核苷酸208包含可变条形码部分212和一个或多个恒定部分，如图所示，该恒定部分包含例如附接序列210和测序引物区段214。单独引物寡核苷酸216也与条形码寡核苷酸共同分配，其包含引物序列部分216a以及与条形码寡核苷酸208的恒定部分的至少一部分(例如，测序引物214)相同的部分216b。虽然引物序列部分216a以随机N-mer引物示出，但同样应理解，还可采用特异性引物序列，例如，靶向特异性引发序列或与基因组中感兴趣的区域相邻的序列，以用于生成用于靶向基因、基因分组或基因组部分的测序文库，或不是完全随机的引物序列，例如，如本文别处所述。
一旦与模板核酸204共同分配，引物序列部分216a可与模板204的部分退火，并且延伸以创建模板204的复制片段222，该复制片段222包含引发序列216a和与条形码寡核苷酸208的恒定部分的至少一部分(例如，序列214)相同的其他序列区段216b。在初始延伸之后，第二引物序列216与新创建的复制片段222退火，并且延伸以创建互补复制片段224，该复制片段224包含与条形码寡核苷酸208上恒定序列区段214的至少一部分(例如，在5'末端)互补的序列部分226(以及原始引物序列的互补序列，示为nnnn)。然后，条形码寡核苷酸能够通过恒定区段214与互补序列部分226退火，并且该序列的延伸产生样品核酸序列的复制拷贝228，其具有附接的条形码序列212，以及附接的恒定部分，例如，附接序列210和测序引物序列214，以及部分恒定序列216b的互补序列230。如图所示，将条形码寡核苷酸208和复制片段224二者延伸以同时产生复制拷贝228及其互补序列228c。应理解，在一些情况下，条形码寡核苷酸的5'末端可具有封端基团，以阻止延伸，例如，阻止片段228的生成，并且仅允许条形码寡核苷酸复制到片段224上。这可以在一些情况下进行，以便避免条形码寡核苷酸以不太受控制的方式对潜在样品核酸(例如，基因组)进行引发，该引发可能导致次优的文库生成。可采用多种封端基团或其他不可延伸的核苷酸基团，包括封端的核酸、双脱氧终止的核酸等。
在过程中使用具有将条形码序列与其附接的能力的单独引物序列可为与条形码文库本身分离的引发操作提供可控性的优点。特别地，可构建可广泛适用于不同应用的条形码文库，其中这些不同的应用可受益于不同的引发策略，例如，除纯粹随机的n-mer启动之外的引发策略。然后，将应用特异性引物序列添加至反应混合物，而不必重新构建包含引物序列的整个条形码文库来追求所需的应用。特别地，可容易地替代靶向引物序列、偏倚引物序列(例如，GC偏倚的，AT偏倚的)或其他结构化引物序列(例如，对于引物序列的区段具有定义的亚基序、亚偏倚的)等，以便针对给定应用优化文库生成过程。
如下文更详细地讨论的，可在条形码化复制核酸片段(例如，图20A所示的片段228和228c)上进行附加处理步骤，以便在这些复制片段或这些片段的拷贝或互补序列上提供附加功能序列。例如，在如下所述的一些情况下，可进行附加扩增步骤，其将用于测序过程的附加功能序列偶联至条形码化片段的末端上，例如，条形码化片段228的末端230处。然而，在某些方面，可将附加序列的附接并入条形码复制过程中，以产生同时包含条形码寡核苷酸部分和处于复制片段相对端的其他功能序列的片段。举例而言，在原始条形码化反应混合物中可包含第二组引物序列，该第二组引物序列包括引发序列，例如与期望的附加功能序列(例如，如本文其他各处讨论的R2和P7序列)偶联的随机n-mer引物序列，从而允许单个步骤反应过程在一端对片段进行条形码化，同时在另一端附接附加的功能序列。然后，条形码化片段两端的功能序列的存在可允许容易地进一步处理该片段。例如，可在条形码化片段的反向平行扩增中使用这些功能序列。
这在图20B中图示，并且参考图20A，其中将第二引物寡核苷酸250连同条形码寡核苷酸208和模板204一起引入反应混合物中。除引物序列例如随机n-mer 250a外，第二引物组250还包含附加的所需功能序列250b和250c，它们可分别为读取2引发序列和P7附接序列。
同样，正如图20A所示的过程，第一引物组216与模板退火并沿着模板204的一部分延伸以产生第一复制片段222。然后，第二引物组250与复制片段222退火并沿着该复制片段延伸以产生包含那些功能序列元件250b和250c的互补拷贝252，以及针对条形码寡核苷酸208上的区段214的至少一部分的互补序列。然后，条形码寡核苷酸208可与复制片段252退火，其中条形码寡核苷酸(和片段252)的延伸可产生条形码化的复制片段254及其互补序列254c，两者均可包含该条形码寡核苷酸中所含的序列区段或该序列区段的互补序列，以及由第二引物组250递送的那些附加功能序列或该附加功能序列的互补序列。应理解，第一和第二引物组在同一反应混合物中的存在可潜在地导致一组包含许多结构(包括期望的结构)的复制片段，其中插入物区段在一侧的侧翼为第一引物组或其互补序列并且在另一侧的侧翼为第二引物组或其互补序列。然而，还可存在其他布置，包括第一或第二引物组中仅一组在插入物区段两侧的侧翼的那些布置。一般来说，这可以是在测序过程中可分解的，或是可通过后续扩增过程可分解的，在该扩增过程中使用例如P5和P7作为扩增引物序列，仅扩增携带存在的期望序列的两端的序列。例如，关于复制片段254c，可通过针对由区段250c表示的P7序列进行引发，同时针对P5序列区段(例如，段210)的互补序列(如由段210c表示的)进行引发来选择性地扩增该区段。
应理解，图20B中描述的这种简化的过程也可应用于图19所示过程的改进版本中。特别地，条形码反应混合物中可存在两个不同的引物组，以便提供产生两端具有功能序列的条形码化片段的“一锅”反应。
这在图20C中图示。如图所示，模板核酸序列280与条形码/引物寡核苷酸260和第二衔接子/引物序列270共同分配。优选地将条形码/引物260分配、可释放地附接至珠子，并且作为例如如上所述的多样性条形码文库的成员。由于衔接子/引物序列270通常可包含定义的或共同的功能序列，因此可将其例如连同核酸模板280或添加至分配过程的其他试剂(例如，酶，核苷酸等)一起成批分配。然而，在一些情况下，可将衔接子/引物270分配、可释放地附接至与条形码/引物260相同或不同的珠子。
除了条形码和引物部分之外，条形码/引物260和衔接子/引物270中的每一个均可包含附加的功能序列。例如，条形码/引物序列260被示为包含条形码序列264和随机n-mer引物序列268，也包含一个或多个附加的功能序列，如流动池附接序列、测序读取引物序列等。为便于讨论，描述了图20C中所示的实例，其中条形码引物260包含P5附接序列262、条形码序列264、第一序列读取引物，例如，在Illumina测序过程中使用的读取1引物序列，和随机样品引发序列或n-mer 268。衔接子引物270被描述为包含P7附接序列272(例如，在Illumina测序中使用的)、第二序列读取引物(例如，读取2引物274)和随机引发序列或n-mer276。
在引物延伸反应开始时，例如，在进行所需试剂的混合、条形码引物从珠子的释放和/或反应混合物的热循环开始中的一项或多项时，引物序列例如268和276可与模板核酸280退火(仅以引物268退火示出)，并沿着模板延伸，从而创建作为延伸产物282附接至条形码/引物的模板的复制部分。虽然未示出，但连同延伸产物282一起，可基于已与模板序列退火的衔接子/引物270的延伸来创建延伸产物。
在该第一次延伸之后，延伸产物随后充当后续轮次的引物退火和延伸的模板。如图所示，衔接子/引物270与延伸产物282退火并延伸以复制包含原始模板序列(以插入区段284示出)的互补部分以及原始条形码/引物的延伸产物282的部分，以创建包含原始条形码引物的互补序列(以区段260c示出)的延伸产物286。同样，尽管未显示，但可进行类似的互补反应以复制由衔接子/引物序列沿着模板延伸所创建的延伸产物，这可导致插入物序列的一端为条形码引物，并且该插入物的另一端为衔接子/引物序列的互补序列。
应理解，并且如上文提到的，在一些情况下，在大约50％的延伸产物中，插入物的两端可存在相同的序列或其互补序列。然而，方便地，上述条形码化和衔接子附接过程的产物，例如包括延伸产物286，和在每一端均具有相同序列或其互补序列的那些“产物”，可经历额外的处理。特别地，在至少一个实例中，可采用PCR过程通过针对P5和P7序列两者进行引发而使产物经历反向平行扩增。因此，同时包括P5和P7序列的那些片段或其互补序列可以快速且指数式地扩增，而其他“产物”则不会。
应理解，在该实例中对功能序列及其互补序列的具体提及是说明性而非限制性的。实际上，根据所需产物的所需最终状态，可针对上述任何序列区段，例如，P5、P7、读取1、读取2等，来选择特定序列或其互补序列。
应理解，在一些情况下，从长模板核酸生成条形码化复制片段的过程可在潜在核酸片段的覆盖量方面有变化，例如，一些区域由比其他区域更多的复制片段表示，并且覆盖度的变化可转化为针对该模板的测序覆盖度。通常，期望生成代表在模板核酸的全长上更均匀覆盖的复制片段，或期望满足就模板序列的重要部分而言的最小覆盖度阈值。
如上文所提到的，在一些情况下，可调整寡核苷酸的引物部分的组成，例如图19所示的条形码寡核苷酸的引物区段116，或图20A和图20B所示的引物区段216，以加强文库制备。特别地，在一些情况下，可控制用于与模板核酸退火的引物序列的组成，以提供对模板序列的更均匀的取样，并因此提供更均匀的序列覆盖。特别地，通过控制引物序列(无论是随机引物序列还是更加靶向的引物序列)的相对GC含量，可增强得到的测序覆盖。在一些方面，提供具有大于50％GC含量、优选大于60％GC含量、大于70％GC含量或甚至80％GC含量或更高的引物序列。在优选的方面，引物的GC含量可为50％至约90％以及由此定义的任何范围，或约50％至约60％、约60％至约70％、约70％至约80％，或约80％至约90％。
在一些情况下，可使用各自具有不同GC百分比的引物亚群的共混物，例如，其中包含在整个混合物中的引物具有大于50％至90％或更高的GC浓度范围。在许多情况下，引物可在大于50％GC至约80％GC的范围内。这些引物群体可跨越所述范围内的GC浓度的整个范围，或者它们可构成各自具有不同GC百分比的引物的设定亚群。
例如，在一些情况下，可将引物的亚群共混以创建具有引物中GC浓度的设定亚群的混合物，例如，具有60％GC的引物亚群与具有80％GC的引物亚群共混。应理解，在这样的情况下，共混物可包含两种、三种、四种或更多种不同的引物构建物亚群，例如具有不同GC含量的亚群。通常，这样的亚群可为50％GC至90％GC，而每个亚群均可为共混物的1％至99％。在优选方面，亚群可具有约50％至80％GC(包含端值)之间的GC含量，并且每个亚群均可占总引物群体的10％至90％、20％至80％、30％至70％、40％至60％，或甚至每个亚群占50％。
除了上述用于改善文库制备的过程外，还可利用对聚合反应进行改进以便提供改进的文库，例如，具有更均匀的覆盖、更少的错误和更少的嵌合体形成。特别地，在至少一个实例中，可组合使用不同的聚合酶，以便改善反应产物。特别地，通过使用具有不同但互补的性质的聚合酶，可产生更高质量的文库。举例而言，在复制模板序列片段中提供非常低错误率的第一聚合酶与提供更均匀覆盖或更高反应速率或更高持续性的第二聚合酶的共混物可提供产生改进的文库的反应。在一个具体实例中，高度准确和持续性的聚合酶如保留其野生型核酸外切酶活性(exo+)的9°North聚合酶的共混物，可与可从NEB获得的另一古细菌聚合酶如Deep Vent聚合酶共混，提供比单独使用任一聚合酶具有更均匀的覆盖和更低的错误率的测序文库。
图21示出了不同聚合酶的嵌合体和Q35错误率的比较。如图所示，9°N(exo+)聚合酶表现出相对较低的Q35错误率，但当其独自使用时具有相对较高的嵌合率(见圆A)。相比之下，Deep Vent聚合酶显示出相对较高的错误率，但嵌合率相对较低(见圆B)。当两种酶以两种酶的共混物的方式使用时，观察到在嵌合率和错误率方面都优于单独任一种的益处(参见圆C)。
除了上述处理之外，本文所述的方法还可用于靶向基因组文库的选择性条形码化。一种采用本文提到的条形码化方法对靶向基因组文库例如包含靶向遗传区(例如，基因、基因小组、外显子组、激酶组等)的测序文库进行条形码化的途径在提交于2014年10月31日的临时美国专利申请号62/073,659中描述，并通过引用全文并入本文用于所有目的。特别地，所描述的方法利用本文所述的条形码化途径以便将条形码与全基因组(或样品)的片段相附接，以便提供原始分子环境或属性的指示物。一旦片段被条形码化，它们可被选择用于使用常规的靶向过程，例如，沉降，例如，使用常规试剂盒，例如沉降板，外显子组试剂盒等，如可从Agilent Technologies,Inc.获得的
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外显子组试剂盒。在备选的途径中，可使用本文所述并参照图24说明的方法将条形码与靶向序列(也称为靶诱饵或靶向引物)相附接，然后例如使用本文所述的处理步骤将其用于创建包含该条形码序列的靶向测序文库。应理解，虽然描述为将条形码序列附接至靶向引物，但所述方法可用于将条形码寡核苷酸附接至几乎任何序列，例如，任何靶向的、随机的、通用的或其他的引物序列或探针，而无需在珠子上的条形码寡核苷酸上掺入样品引发序列，例如随机n-mer或靶向引物。在一个实例中，使用如上所述的条形码化珠子文库将共同条形码序列的群体递送至单独的分区，例如，作为乳液中的小液滴。珠子可连同如上所述的样品核酸共同分配。另外，珠子可与靶向引物序列例如与感兴趣的特定靶向序列相同或互补的序列共同分配。靶向引物序列通常可包含这样的部分，该部分允许其与条形码寡核苷酸的下游部分杂交，以便条形码化引物沿条形码寡核苷酸延伸，从而将条形码复制到靶向引物序列中。此刻条形码化的靶向序列的复制可创建条形码化的靶向引物序列，该条形码化的靶向引物序列可探询靶向区域的样品核酸，并产生包含条形码序列的复制片段。
该过程的实例在图24中图示。如图所示，来自本文其他各处所述的条形码珠子文库的条形码化珠子上设置有含条形码的寡核苷酸602，该寡核苷酸602包含条形码区段604以及附加功能序列，例如附接序列/引物序列606，如P5附接序列，以及第一已知序列区段，例如，已知的引物序列608，如读取1引物序列。当例如更通用的条形码珠子文库用于许多不同的应用或过程时，可任选地包含附加的功能序列，例如，随机引物序列等，如本文其他各处所讨论的。附加的靶向引物寡核苷酸610也与条形码寡核苷酸602共同分配。靶向引物寡核苷酸610包含第一部分612，第一部分612提供针对靶向引物序列(例如，用于引发样品序列中与感兴趣的序列区邻近的已知序列部分的序列(称为靶向引物))的互补序列。如图所示，靶向引物寡核苷酸610还包含以区段608c示出的部分，该部分与在条形码区段604的3'侧的条形码寡核苷酸602的部分(如读取1引物区段608的部分)互补。
如图所示，然后，靶向引物寡核苷酸610与条形码寡核苷酸602的部分的退火和采用例如分区内的聚合酶反应的随后延伸，创建了条形码寡核苷酸的反向互补序列(以614示出)，该反向互补序列具有条形码寡核苷酸的多个区段的互补序列(例如，604c、606c和608c)，附接有靶向引物序列612，以完整的寡核苷酸614示出。寡核苷酸614的进一步复制(例如，使用例如与区段606相同且与区段606c互补的P5引物序列616来引发寡核苷酸614的复制)，导致产生包含条形码区段620(与条形码区段604相同，作为互补序列的互补序列)、功能区段例如P5区段622(与区段606相同)和读取1引物区段624(与区段608相同)以及靶向引物序列626(与靶向区段612互补)的互补寡核苷酸618。然后，靶向引物序列626能够以上述相同的方式针对样品核酸628(同样与条形码寡核苷酸602和靶向引物寡核苷酸610共同分配)的靶向部分进行引发以使用随机n-mer引物生成条形码化文库。
由此可以产生针对靶向序列特异性选择的测序文库，其包含指示原始分子环境的条形码和一个或多个所需的功能序列，例如引物，如P5、读取1等。
应理解，可通过在本体溶液中提供这样的寡核苷酸，例如并且与其他试剂例如聚合酶、dNTP等一起共同分配，将靶向引物寡核苷酸与条形码寡核苷酸一起共同分配。或者，可将不同的靶向寡核苷酸或靶向寡核苷酸组预先安置在与本文所述的条形码珠子文库中的那些相似的珠子上，其中条形码珠子和靶向引物珠子可一起共同分配至单个分区，例如，小液滴。
在又一进一步的备选过程中，可以以与上述过程类似的方式，但通过将条形码寡核苷酸与分配的片段核酸连接来制备条形码化文库。一般来说，可从分区内所含的长片段在该分区内创建片段文库，以便保留分子环境。可以以某种方式制备片段文库，该方式使得该片段可用于与例如经由如本文所述的基于珠子的递送系统与那些片段共同分配的条形码化寡核苷酸连接。在某些情况下，基于连接的过程可避免可潜在地与基于延伸的条形码化途径相关的基于扩增的异常如引发偏倚的可能性。
这样的途径的一个实例在图25中图示。如图所示，将样品核酸片段702分配到小液滴或其他分区中。长片段702在分区内片段化成较短的片段。如图所示，该片段化步骤通过首先使用高保真度聚合酶(例如phi29DNA聚合酶)复制该长片段来进行。该复制步骤可通过例如在预分配样品制备步骤期间，对可作为与起源片段连接的衔接子序列而提供的已知末端序列区段进行引发来进行。或者，如图所示，可在起源双链片段上提供衔接子序列，例如衔接子序列704，这在每条链内提供了已知的切口位点706。在用适当的切口酶处理后，可使用能够引发带切口的链的DNA聚合酶(例如，phi29聚合酶)来复制一条链，同时置换另一条链。可利用低水平浓度的可移除核苷酸(例如，UTP)进行该复制，以便创建具有分散在其整个序列中的随机分散的含尿嘧啶碱基708的复制物。通过使用酶(例如，在例如尿嘧啶特异性切除试剂或USER(可从New England Biolabs获得)或其他试剂中发现的尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG))在尿嘧啶碱基处切割，可创建复制物的一组片段，例如，片段710、712、714、716和718。
可通过使phi29聚合酶从切口点延伸这些片段，置换第一组片段并且以随机分散的间隔创建掺入含尿嘧啶碱基的另外的复制拷贝(其随后可如上所述被片段化)来产生另外的片段。或者，通过与起源片段上的随机位置退火并被本聚合酶例如phi29等延伸，可将例如使用随机n-mer引物(例如，六聚体、7-mer、8-mer、9-mer、10-mer或更大的引物)的随机引发和延伸过程用于从起源片段生成随机片段。可采用这些备选的引发机制，而通过例如如上所述引发随机切口位点，可减少可来自外源引入引物的引发偏倚，从而允许从起源片段创建较少偏倚的片段文库。
一旦生成了这些片段文库，可使用例如也与该片段共同分配的随机六聚体引物720将它们进一步复制。使用短引物序列720复制这些片段可导致创建不同长度的双链平端片段722。一旦创建了平端片段722，可对它们进行处理，以便例如经由本文所述的基于珠子的递送系统来附接与该片段共同分配的双链条形码寡核苷酸。例如，如图所示，首先使用例如Klenow聚合酶给平端片段722加A尾。然后，采用标准连接酶系统，例如T4连接酶，将加A尾的片段724连接至双链条形码寡核苷酸726，例如该双链条形码寡核苷酸包含条形码区段728，以及诸如P5序列730和R1区段732等功能序列，以及连接点处的互补T碱基734。由此创建了条形码化双链片段。然后，可使该条形码化片段经受如本文其他各处所述的另外处理，例如，以在另一端扩增并附接衔接子序列。
条形码化文库的其他处理
通过上文所述的初始条形码化步骤之后的处理步骤，可另外地或替代地实现文库制备的改进。例如，在例如如上所述创建模板核酸的条形码化复制片段之后，可利用条形码化片段进行额外的处理，例如，以进一步扩增那些片段并且/或者在那些片段或其拷贝上提供附加功能序列，例如额外的测序引物、样品索引序列等。
在许多情况下，可进一步处理条形码化的复制片段，以提供更大量的条形码化核酸以供测序，并且还将额外的功能核酸序列区段附接至文库成员，以便在测序系统上有效地处理该文库。因为这种额外的处理在条形码序列与片段附接之后发生，例如，从而凭借共同包含的条形码序列来保存从给定分区内的给定核酸分子产生的片段的连接信息，所以随后的处理可作为合并的反应进行，例如，其中各个分区的内容物被合并在一起以供批量处理。
举例而言，如提交于2014年6月26日并且之前通过引用并入本文的美国专利申请号14/316,383中所述，条形码化片段核酸，例如图19中的片段126，可经历额外的处理，以扩增那些片段的存在，以及附接用于测序过程的附加功能序列。例如，一旦在各个分区内制备了条形码化片段126，则可使各个单独的分区破裂(例如，通过破坏油包水乳液)，从而导致来自不同分区并携带不同条形码序列的所有条形码化片段的合并。然后，可通过针对所复制的功能序列(例如，R1互补序列114')引发来进行条形码化片段126的扩增，其中用于该扩增的引物还包含附加功能序列，例如P7和R2序列，或它们的互补序列。因此，所产生的序列可在每一端包含必需的功能序列或其互补序列。此外，还可通过将针对原始功能序列110的引物用作引物退火序列以引发反向平行扩增(例如，PCR)来进行反向平行引发的扩增。
一个示例性过程在图22中示出，并且参考图19。特别地，在如图19所示的条形码过程的情况下，可获得图22中的条形码化的核酸片段组402，其将会是例如来自多个分区的一组合并的片段，并且在所附接的条形码寡核苷酸408上带有多个不同的条形码序列，包括附接至样品片段或插入物422的条形码序列412以及其他功能序列，例如，附接序列410和测序引物414。
然后将第二组引物序列450引入反应混合物中。如图所示，第二组引物序列450包含在序列文库中使用的附加功能序列，例如用于附接至测序仪流动池(例如，P7序列452)，以及用于引发测序仪的第二读取步骤(例如，R2引发序列454)。这些引物序列中还包括一组随机引发序列，例如，随机n-mer 456，以及对任何给定样品而言将为共有的任选样品索引序列(未示出)。随机n-mer 456c随机引发反应混合物中的条形码化片段402，并且这些引物的延伸将产生条形码化片段402的复制拷贝458，包括条形码寡核苷酸408的互补复制物，例如，该互补复制物包括条形码序列412的互补序列(以区段412c示出)和该条形码化片段中包含的任何功能序列的互补序列，例如，P5附接序列410的互补序列(以互补序列410c示出))和R1引物序列414的互补序列(以互补序列414c示出)。
在该复制之后，所得到的片段458现在两端都包含功能序列，例如，插入物序列区段460的P5和P7序列(分别为区段410和452)。然后，可使用片段的已知末端区段(例如，P5和P7序列或它们各自的互补序列，如区段410c和452)作为反向平行扩增的引发区域，使这些完成的片段经历额外的扩增步骤，例如，PCR。
应理解，在一些情况下，在条形码化片段的最初生成之后，可能期望例如使用SPRI珠子等将条形码化片段从用来产生它们的反应混合物中纯化出来。例如，当使用不能处理通过含尿嘧啶的碱基的聚合酶时，例如，如上文参照图19所述，将该聚合酶替换为待用于进一步处理片段的不同聚合酶可能是有用的，从而允许复制条形码寡核苷酸的含尿嘧啶的部分，如图22所示。在该过程中可采用多种不同的、高度持续性的、高度准确的聚合酶，包括例如热稳定聚合酶，例如，taq、9°North、DeepVent聚合酶，以及非热稳定聚合酶，例如，Bst、Klenow、phi29等。在一些情况下，例如，如上文针对发夹或部分发夹结构所述，还可能期望在随后的扩增步骤中使用具有链置换活性、尿嘧啶耐受性、校正能力(例如，包括核酸外切酶活性)等一种或多种的聚合酶。
类似地，在第二复制步骤之后，例如，如图22所示，可能期望在使复制的片段458经历进一步的PCR或其他扩增之前将它们纯化，以便去除外来的引物序列(例如，引物450)以使其不能参与所得片段458的选择扩增。
尽管以在引物组450中掺入功能序列区段的方式示出，但应理解，这些序列中的一些可在后续处理步骤中掺入。例如，在一些情况下，引物组450可能不包括如P7序列(例如，区段452)的功能序列。在条形码化片段的复制之后，可向所得片段文库添加附加功能序列，例如，片段458。同样，可通过例如如下文参照图23所述的连接步骤来完成其他序列的添加，或者备选地，其可作为用于随后扩增所得片段458的引物序列的组分引入。特别地，可提供附接至可引发片段的一部分的引物序列的额外序列，例如，区段454(假设不存在片段452)。然后，可通过该引物，利用所添加的序列区段进行片段458的扩增。
在另一个示例性过程中，可通过剪切和连接过程对初始条形码化片段(例如分别来自图19或图22的片段118或402)进行后续处理，以提供带有必需功能序列的完成片段。该过程在图23中图示。如图所示，从例如如图19和图20中任一个所示的初始条形码化步骤产生条形码化的双链核酸片段502的集合。然后，使片段及其相关联的互补链504(例如，复制出它们的模板)经历例如采用酶、机械和/或声学剪切过程的剪切过程，例如，Covaris AFA剪切过程，以产生剪切的双链片段506。
然后，使用例如一个或多个补平反应，例如，使用Klenow和/或核酸酶处理，将剪切的双链片段506平端化。在平端化后，例如在dATP的存在下使用Taq或其他非校正聚合酶将A碱基添加至3'末端，以得到加A尾的平端双链片段508。然后在适当的连接混合物例如T-4连接酶和相关试剂的存在下，将在3'末端包含T碱基的衔接子550添加至混合物。如图所示，衔接子550包含应用于所选测序仪所需的附加功能序列，例如，读取2引物(互补序列)552和P7(互补序列)554序列。还包含具有3'T-碱基突出端的部分互补序列(以部分R2区段556示出)，以便允许与条形码化片段的有效连接。
在连接之后，所得文库元件558包括例如衍生自原始样品模板序列的插入物序列560，第一组功能序列，例如P5 510和R1 514序列，条形码序列512，和第二组功能序列，例如，R2和P7序列或它们的互补序列(分别为区段552和554)。还包括来自条形码化寡核苷酸的原始引物序列516。
如上所述，随后可通过使用已知的末端序列区段(例如，P5序列510和P7序列554)作为引发靶标来引发扩增(例如，类似于PCR的反向平行扩增)而进一步扩增所得条形码化片段。
应当理解，在一些情况下，上述剪切步骤可产生其中原始条形码化序列已被剪掉的片段，或者可产生由不包含条形码片段的剪切片段产生的片段。
因为即使在例如通过衔接子550连接第二组功能序列后，这些片段仍缺乏完整的一组功能序列(例如，P5和P7两者)或用于引发后续扩增步骤的任何其他功能序列，所以它们将不会在依赖于这两组序列(例如P5和P7序列)的存在才能成功扩增的随后步骤中被扩增。重申一下，尽管最初可能创建错误连接的片段，但它们可能没有被随后扩增，并因此可降低至测序时系统的噪声水平以下。
在进一步处理条形码库元件时可采用多种额外或替代的过程。例如，当以条形码化核酸片段(例如，图19中的片段126)或其他类似条形码化片段开始时，可经由多种方法将附加功能序列附接至片段的末端，例如，非条形码化的末端。例如，如上所述，这可通过使用包含附加功能序列的引物从非条形码化末端扩增总序列来实现，使得这样的引物的延伸产物不仅包含条形码化片段126的拷贝，而且包含与该引物附接的功能序列。类似地，可简单地将额外的序列连接至序列的末端以添加功能序列。
在进一步处理、扩增和/或将额外序列附加至本文所述的条形码化片段时，可采用许多其他过程步骤。例如，在一些情况下，可使用不含尿嘧啶的条形码寡核苷酸来允许完整发夹分子的形成，而不是例如在条形码寡核苷酸中使用含尿嘧啶的碱基以阻断完全复制而创建部分发夹。通过选择性地除去3'末端的一部分，可为各种片段创建对于附加功能序列的连接位点。例如，通过将互补序列掺入例如上述R1引物区段中条形码寡核苷酸的共同已知部分中的切口酶识别位点，可间接地在发夹双链体的下游部分中创建切口位点。利用必需的切口酶处理发夹可产生具有已知单链DNA部分的部分发夹结构，该已知序列部分可用作将附加功能序列(例如，读取2、P7、样品索引等)连接至该部分发夹的3’端的着陆点。
在备选但相关的途径中，可使用图19中概述的途径，但采用能够处理通过含尿嘧啶的碱基的聚合酶，来创建完整的发夹结构。在这样的情况下，由含条形码的引物寡核苷酸(例如，含尿嘧啶的寡核苷酸108)的初始延伸产生的片段通过含第二条形码的引物寡核苷酸(例如，寡核苷酸108b)的延伸来完全复制，使得完整复制物包含在一端的条形码寡核苷酸108b(包含尿嘧啶碱基)和在另一端的原始条形码寡核苷酸108的互补序列(不含含尿嘧啶的碱基)，该互补序列将包含条形码区段112的互补序列和功能序列，例如，110和114。然后可例如使用UDG酶等在含尿嘧啶的碱基处切割所得的复制片段，以将条形码寡核苷酸108b的一部分留在片段的末端例如区段114上。同时，另一端仍可保留原始条形码寡核苷酸的互补序列，包括条形码序列的互补序列和功能序列。通过留下附接至经消化的末端的已知区段，提供了用于连接第二侧衔接子序列的手柄，该第二侧衔接子序列包括例如其他功能序列，例如，测序仪特异性附接序列和引物序列、样品索引序列等。
在其他方面，可利用在条形码化过程中创建的条形码化片段的发夹结构。例如，在一些情况下，如上所述，可能期望创建形成完整发夹结构的条形码化片段。参考上述和图19所示的过程，例如，可通过允许条形码/引物序列的完全复制来提供完整的条形码化发夹结构，其包含或不包含附加功能序列。然后，将发夹的双链体部分的末端视为双链体衔接子附接过程中的标准双链体的末端(参见，例如，Illumina Truseq Sample Preparation Guide(Illumina,Inc.part#15026486Rev C)和美国专利号8,053,192，它们的全部公开内容通过引用全文并入本文用于所有目的)，以将附加功能序列附接至发夹。特别地，基于读取1与读取2引物序列之间的至少部分互补性，Truseq衔接子包括与P7-读取2序列形成部分杂交结构的P5-读取2序列。因此，该衔接子的双链体部分可附接(例如，连接)至发夹结构的双链体端，以将P5-读取1序列附接至发夹分子的5'端，并将P7-R2附接至发夹的3'端。如上所述，一旦双链体衔接子附接至发夹的双链体端，即可例如通过针对P5和P7序列进行引发，使用反向平行PCR扩增过程对其进行扩增。应理解，可采用这种途径，使用与发夹连接的部分或完全互补的且双链体的结构将多种不同的附加功能序列和其他序列附接至发夹结构的末端。
类似地，可使用备选过程来修饰包含条形码寡核苷酸结构的完整发夹。特别地，可在互补双链体结构中引入允许在双链体的5'部分产生切口的选择性切口位点，而不是生成部分发夹结构，该双链体在被消化时可产生部分发夹结构，然后可如上所述对该部分发夹结构进行处理。
其他系统和试剂盒
尽管在文库生成和制备过程方面进行了主要描述，但应理解，本文还提供了用于实施上述过程的过程系统、试剂、消耗品和试剂与消耗性的试剂盒。例如，总体系统可包括进行上述反应过程所需的试剂，例如，包括条形码化试剂，如布置在可分区的珠子上的条形码寡核苷酸文库，例如，如先前通过引用整体并入本文用于所有目的的例如提交于2014年6月26日的共同未决的美国专利申请号14/316,383、提交于2014年6月26日的62/017,808、提交于2014年10月29日的62/072,214、提交于2014年10月29日的62/072和提交于2014年6月26日的62/017,558中详细描述的。这样的系统中还包括在该过程中使用的其他试剂，如分配流体，例如，氟化油、核苷三磷酸等，以及用于将样品核酸与条形码试剂共同分配的分配系统，包括其中生成分区的微流体消耗性组件以及用于驱动和控制微流体装置的运行的仪器。
如上所述，本文还提供了试剂盒，其包括进行本文所述的反应过程所需的试剂。通常，这样的试剂盒可包括条形码化试剂，包括带有珠子文库的必需条形码寡核苷酸，以及合适的酶反应试剂，例如，合适的聚合酶、单体和其他试剂，例如，UDG、USER等，以供进行所需反应。类似地，该试剂盒还可含有必需的分配试剂，如非水性分配流体，例如，氟化油等。最后，该试剂盒通常还可包括用于指导用户进行如上详述的所需反应过程的用户说明书。
虽然出于清楚和理解的目的更详细地描述了前述发明，但通过阅读本公开内容，本领域技术人员将会明白，在不脱离本发明的真实范围的情况下可进行形式和细节上的各种改变。例如，上述所有技术和设备可以以多种组合的方式使用。例如，颗粒递送可采用如所述的阵列孔尺寸选择方法来实现。本申请中引用的所有出版物、专利、专利申请和/或其他文件都通过引用全文并入本文以用于所有目的，其程度如同单独和分别地指明每个单独的出版物、专利、专利申请和/或其他文件均通过引用并入本文用于所有目的。
X.实施例
实施例1：无引发扩增模板的分子条形码化
预期许多途径对于分子条形码化由无引发扩增所产生的用于测序的模板而言将会是有效的。用于实现分子条形码化的反应和试剂可以是同一反应的一部分，并且可与模板的无引发扩增同时运行。该途径还可包括衔接子。例如，衔接子设计可包括来自Illumina引物设计的部分R1序列，接着是优选的条形码序列，接着是随机Nmer(序列大小在2至20个碱基之间不等)。这些衔接子可以是双链的并且包括条形码和具有排列为3’突出端的Nmer的R1序列。
在第一种途径中，如图2A所示，可采用延伸条形码化途径实现模板的条形码化。phi29DNA聚合酶的链置换和高持续性释放出扩增的片段，从而使得模板能够循环用于进一步扩增。可通过相同的聚合酶将链置换期间生成的单链片段转化成dsNDA，但衔接子的六聚体或Nmer部分除外。
分子条形码化的另一途径在图2B中示出。任选地通过用于条形码连接途径的单链或双链模板对如图1所述生成的扩增模板进行分子条形码化。如图所示，模板DNA分子转化成单链的(采用温度/酶；参见图的左半部分)或双链的(采用酶；参见图的右半部分)。通过使用ssDNA连接酶(椭圆)或dsDNA连接酶(椭圆)或其他核酸修饰酶的连接过程来附接分子条形码，例如，寡核苷酸。可在后续连接中将充当分子手柄的额外寡核苷酸添加至第一条形码标签。
对模板进行分子条形码化的另一途径在图2C中示出。在该示意图中，单链DNA分子(具有条形码/引物序列)在3’端附接至珠子。该寡核苷酸的5’端是预腺苷酸化的(化学地或酶促地)。若期望，可采用热启动(Hotstart)-IT结合蛋白将该寡核苷酸隔绝，该蛋白可采用热来释放。对于单链文库分子(由热处理或解旋酶生成的单链)的条形码化，APPDNA/RNA连接酶将会将5’预腺苷酸化的寡核苷酸与该文库分子的3’端连接。由于通过将3’端封端可避免寡核苷酸-寡核苷酸连接并且文库分子因未被腺苷酸化而不能自身连接，因此该过程是非常特异性的。
APP DNA/RNA连接酶可为热稳定的5′APP DNA/RNA连接酶，包括来自热自参甲烷杆菌(Methanobacterium thermoautotrophicum)的RNA连接酶的催化性赖氨酸的点突变体。该酶是不依赖于ATP的。其需要5’预腺苷酸化的连接体以供与RNA或单链DNA(ssDNA)的3′-OH端连接。
对模板进行分子条形码化的另一途径采用拓扑异构酶。例如，来自牛痘病毒的拓扑异构酶I在特异性位点与双链体DNA结合并切割一条链中的5′-CCCTT之后的磷酸二酯骨架。这里，可在衔接子序列(例如，寡核苷酸)与拓扑异构酶预先结合的情况下实现分子条形码化。可使用例如DNA聚合酶的Klenow片段制备经扩增的模板以用于平端连接。
实施例2：通过在切口位点进行聚合的无引发扩增导致胸苷(T)碱基偏倚
采用具有引物(A)或不具有引物(B)的扩增方案进行实验。
(A)具有引物制剂的扩增方案：
1X Thermopol缓冲液(NEB)、0.2mM dNTP混合物(各10mM)、0.3uM引物*、0.07％(v/v)甘油、0.5％(w/v)Synperonic-F108、1mM DTT、0.1ng/μL gDNA模板、0.4U/μL 9°N聚合酶。
*引物序列：TAGAUCGCACACUCUUUCCCUACACGACGCUCTTCCGATCTNNNNNNNNNN
热循环方案：
1.)4℃/∞
2.)98℃/5:00min-变温速率2℃/S
3.)4℃/0:30sec-变温速率2℃/S
4.)45℃/0:01sec-变温速率0.1℃/s
5.)70℃/0:20sec-变温速率2℃/S
6.)98℃/0:30sec-变温速率2℃/S
7.)前往步骤2，14X
8.)4℃/∞
(B)没有引物(通过聚合的无引发扩增)制剂的扩增方案：
50mM Tris，pH 7.5、10mM(NH4)2SO4、0.50％SymPeronic、1mM dNTP、0.03mM dUTP、7％甘油、25uM六聚体、17mM DTT、1ng gDNA、10ug/ml BSA、0.01％Triton X、0.006U/ulUDG、30U/ul EndoIV、0.2uM Phi29DNA Pol
热循环方案：
1.)30℃/3小时
2.)65℃/10:00min
3.)4℃/∞
采用通过聚合反应的无引发扩增，将dUTP的(U)掺入模板中。利用在模板中创建切口(产生聚合酶的启动位点)的裂合酶来实现“U”的切除。由于启动因U切除而发生，因此在所观察到的序列中反映的碱基胸苷(T)存在偏倚。
如图3所示，基于全基因组测序数据对T碱基偏倚的测试揭示了T碱基的偏倚。将T碱基偏倚与测试的dUTP浓度成比例地放大，有力支持了大部分启动是由U掺入/切除驱动的。在将序列与参考序列进行比对时，揭示了T碱基偏倚。
图3所示的结果验证了聚合酶从所创建的切口位点启动而非基于引物延伸的观点。
实施例3：GC覆盖：引发扩增与无引发扩增
图4A和图4B中的两幅图示出了在人类基因组的1000bp分箱的GC含量上的覆盖均匀性。从图中可见，引发扩增反应(图4)不具有均匀的覆盖，由此与具有0.35–0.5的GC含量的区域相比，低GC和高GC基因组区域表现得较少。相比之下，无引物扩增方法(图4B)显示出跨越广泛范围的GC含量的均匀覆盖。
实施例4：关于对GC覆盖的影响的dUTP滴定
图5A-5E所示的GC覆盖图显示了在按其GC含量分箱的基因组的不同部分中使用测序的覆盖均匀性。数据显示，当不存在dUTP时(图5A)，GC覆盖更向高GC倾斜，并且其在更高dUTP(>1％)的情况下变得更加均匀。无dUTP、0.5％、1％、2％和3％dUTP的结果分别在图5A、5B、5C、5D和5E中示出。总而言之，观察到，与无dUTP(图5A)或0.5％dUTP(图5B)相比，>1％dUTP的使用有利地导致多种GC分箱的均匀覆盖。
实施例5：对于嵌合体减少的dUTP滴定
在通过聚合反应的无引发扩增中，滴定了扩增期间的dUTP浓度，并且研究了对来自同一方向的读取的嵌合率、置信区域上去除重复(deduped)的深度位置变异系数(DPCV)和来自1000个碱基上全覆盖的扩增(amp)速率的影响。如图6所示，在约3.5％至约5.5％dUTP的范围内，观察到嵌合率的显著降低，而DPCV和扩增速率保持相对较强和稳定。
实施例6：DTT的添加降低DPCV
测试了DTT添加对通过聚合反应进行的无引发扩增中的DPCV和扩增速率的影响。如图7所示，在1.0mM至10mM的浓度范围上测试了DTT添加。有利地，在所测试的DTT浓度范围内，在没有明显影响扩增速率的情况下观察到DPCV的有益降低。较高浓度的DTT导致甚至更多的DPCV降低。由此通过DTT的添加改善了DPCV，而没有不利地影响扩增速率。
实施例7：针对全基因组分析的聚合条件优化
以许多组合的方式测试了通过聚合反应进行的无引发扩增的各种反应组分，以确定用于全基因组模板样品的优化聚合。如图8A所示，包括SSB、DTT或二者的添加在内的标准条件与具有较高dUTP(5％)浓度的相似条件相比具有降低的DPCV。如图8B所示，数据提示，SSB的添加降低了扩增速率，在5％dUTP的存在下降低得更多。如图8C所示，与省去SSB的条件相比，SSB减少了嵌合体。DTT也降低了扩增速率。
实施例8：聚合反应时间进程
在通过使用32nM的phi29聚合酶的聚合反应进行的本体无引发扩增中，随时间测量了DPCV和扩增速率二者，直到8个小时。如图9所示，从1至4小时，DPCV轻微改善(降低)(0.22至0.20)并在剩余的4小时内基本达到平台期。在所测试的整个时间系列中，扩增速率(以BAC-aware Amp示出)保持相对平坦。在80nM下测试的额外的phi29没有显著影响上述结果(数据未示出)。
实施例9：模板变性对DPCV和扩增速率的影响
为了测试模板变性对通过聚合反应进行的无引发扩增中的DPCV和扩增速率的影响，在空白GEM中测试了三种条件：i)无变性(无加热)，ii)NaOH变性，和iii)热变性。实验一式两份地进行。如图10所示，实验结果表明，DPCV在测试的所有条件下都相当稳定，但当模板未变性时，扩增明显较低。如所测试的，NaOH或热变性可有效地用于成功的聚合。然而，观察到热变性的微小优势。
实施例10：衔接子浓度的滴定
通过滴定衔接子并测量DPCV和重复率，测试了用于分子条形码化的衔接子浓度的合适范围。所测试的条件为0.4U/uL Phi29DNA聚合酶、54nM–500nM衔接子12(双链体pR1in-line BC衔接子)。
如图11所示，DPCV和重复率在所测试的54nM–500nM衔接子范围之间是稳定的，尽管随着衔接子浓度的提高，观察到未映射的分数的增加。
从这些结果可以预期，通过包含SSB(单链结合蛋白)或其他添加剂以减少未映射的分数，衔接子浓度的合适范围可能可扩展至1nM–10uM。
图11中的表格示出了衔接子浓度对重复率(文库复杂性的量度)和DPCV(覆盖均匀性的量度)的影响。第一列示出了所用的衔接子浓度，其中“LL对照”样品没有衔接子。第三列示出了测序的深度(去除重复的-在计算该数字之前去除了复制物)。第四列示出了将所有样品减采样(downsampling)至0.25X覆盖度后的重复率，该数字也采用条形码信息计算。第五列示出了覆盖均匀性的量度——DPCV。所示的结果表明，在广泛的衔接子浓度范围内，重复率和DPCV保持相对平坦，提示该反应耐受广泛范围的衔接子浓度。
实施例11：条形码化连接反应时间的影响
该实验被设计用于研究反应持续时间对不同测序基质的响应。该研究在两个不同衔接子(adptr)浓度0.2uM和2uM下进行。
图12的小图A显示：DPCV随反应时间缩短而降低；小图B显示：插入物大小随反应时间缩短而增大；小图C显示：嵌合体随反应时间缩短而减少；小图D显示：未映射的分数不受时间的影响；并且图E显示：在较低的衔接子浓度下，扩增(Amp)速率较平坦，较高的衔接子浓度显示出扩增在4小时后的增加。基于这些结果，可以解释3小时的反应时间对大多数基质而言是最佳的。
实施例12：无引发扩增产物的T4连接酶分子条形码化
图13示出了用于测试基于T4连接酶的条形码化的特异性的对照实验的结果。读出为P5/P7值。>5的P5/P7值被认为是阳性的。结果显示，必须存在连接酶、模板和衔接子才能制备有用的一组条形码化模板(例如，用于测序的模板文库)。这三种组分中的任一种的缺少均导致不适于用作例如用于测序的扩增模板文库)的一组条形码化模板。
实施例13：测序覆盖的均匀性-引发扩增与无引发扩增
图14A和14B为比较引发扩增(图14A)和无引发扩增(图14B)的覆盖均匀性的直方图。这两个图中的y轴均为基因组位置的数目。x轴从左(0)到右描绘了逐渐增加的覆盖度。数据清晰地显示出在无引发扩增方案中观察到改善的覆盖均匀性的优点，与引发扩增的分布相比，无引发扩增更加呈泊松式分布。
实施例14：nMer浓度(uM)对DPCV的影响
在如上述制备的五个不同的条形码化模板文库样品上测试了nMer浓度(uM)的影响。如图15所示，在较高的nMer浓度(高于30uM)下，观察到5个样品的4个中DPCV有利地降低。在40uM和50uM下，每个样品均显示出DPCV降低，其中在50uM nMer浓度下观察到最大的降低。结果表明，改善的DPCV降低需要更高而不是更低的nMer浓度。
实施例15：SPRI严格性截止对DPCV的影响
在如上所述的六个不同的条形码化模板文库样品上测试了SPRI(固相可逆固定)严格性截止的影响。如图16所示，更加严格的SPRI截止有利地导致DPCV降低。
实施例16：总反应时间对DPCV的影响
在如上所述的五个不同的条形码化模板文库样品上测试了总反应时间对DPCV的影响。如图17所示，在本测试条件下，DPCV相对不受时间的影响。所测试的时间点在2小时至超过10小时的范围内。
实施例17：USER浓度对DPCV的影响
在如上所述的六个不同的条形码化模板文库样品上测试了USERTM(尿嘧啶特异性切除试剂；New England
Figure BDA0001404450070001111
Inc.(NEB),Ipswich,MA)浓度对DPCV的影响。如图18所示，在实验测试条件下，总的来说DPCV相对不受USER浓度的影响。
根据上文应当理解，虽然已示出和描述了特定实施方式，但可以对其进行各种修改，并且这些修改是本发明所设想到的。本说明书中提供的具体实例并非意图限制本发明。虽然已参照上述说明书对本发明进行了描述，但此处的优选实施方案的说明和图示并不意味着以限制性的意义来解释。此外，应当理解，本发明的所有方面均不限于本文阐述的具体描述、构造或相对比例，这些取决于各种条件和变量。对本发明实施方案的形式和细节的各种修改对本领域技术人员来说将是显而易见的。因此可以预期，本发明也应涵盖任何这样的修改、变化和等同物。意图以所附权利要求限定本发明的范围，由此涵盖这些权利要求的范围内的方法和结构及其等同物。

Claims (28)

1.一种用于制备条形码化的核酸分子的方法，其包括：
(a)提供包含模板核酸序列的模板核酸分子、脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)、脱氧尿苷三磷酸(dUTP)、包含随机N-mer序列的引物、聚合酶、能够切除尿嘧啶的酶、和包含与其可释放地附接的多个寡核苷酸条形码分子的珠子；
(b)利用所述聚合酶、dNTP、dUTP和引物在足以提供包含所述模板核酸序列的双链核酸分子和包含尿嘧啶的互补核酸序列的条件下对所述模板核酸分子进行核酸扩增；
(c)利用所述能够切除尿嘧啶的酶从所述双链核酸分子的所述互补核酸序列切除尿嘧啶以在所述互补核酸序列中提供切口，从而产生带切口的互补核酸分子；
(d)对所述带切口的互补核酸分子在足以提供单链核酸分子的条件下进行核酸扩增，其中所述聚合酶在切口处接合所述带切口的互补核酸分子，其中所述核酸扩增包括不依赖引物的延伸过程，其中所述聚合酶包含链置换活性，且其中所述单链核酸分子从所述双链核酸分子被置换；以及
(e)使用所述多个寡核苷酸条形码分子中的寡核苷酸条形码分子和所述单链核酸分子生成条形码化的核酸分子。
2.如权利要求1所述的方法，其中(a)-(e)在单个反应体积中进行。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述珠子与所述模板核酸分子、dNTP、dUTP、引物、聚合酶、和酶共同分配至分区。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述分区为乳液中的小液滴。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述珠子为可降解的珠子，其选自下组：可化学降解的珠子、可光降解的珠子和可热降解的珠子。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述珠子为可化学降解的珠子，并且其中所述可化学降解的珠子包含可化学还原的交联剂。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述可化学还原的交联剂包含二硫键。
8.如权利要求1所述的方法，其中在(b)中，所述核酸扩增为等温扩增。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述聚合酶为phi29脱氧核糖核酸(DNA)聚合酶。
10.如权利要求1所述的方法，其中在(e)中，通过使用连接酶、聚合酶、或拓扑异构酶生成条形码化的核酸分子。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述连接酶包括不依赖ATP的酶。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述不依赖ATP的酶包括热稳定的5’App DNA/核糖核酸(RNA)连接酶。
13.如权利要求10所述的方法，其中所述拓扑异构酶为拓扑异构酶I。
14.如权利要求10所述的方法，其中所述连接酶包括T4脱氧核糖核酸(DNA)连接酶。
15.如权利要求1所述的方法，其中所述多个寡核苷酸条形码分子中的寡核苷酸条码分子包含长度为至少4个核苷酸、至少10个核苷酸或至少20个核苷酸的条形码序列。
16.如权利要求1所述的方法，其中所述珠子包含与其可释放地附接的至少1,000,000个寡核苷酸条形码分子。
17.如权利要求1所述的方法，其中所述多个寡核苷酸条形码分子中的寡核苷酸条形码分子包含一个或多个功能序列。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述一个或多个功能序列选自下组：衔接子序列、引物序列、引物退火序列、附接序列和测序引物序列。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述一个或多个功能序列包含随机N-mer。
20.如权利要求17所述的方法，其中所述一个或多个功能序列可在应用选自下组的刺激时释放：热刺激和化学刺激。
21.如权利要求1所述的方法，其进一步包括，在(e)之前，从所述珠子释放所述多个寡核苷酸条形码分子中的所述寡核苷酸条形码分子。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述释放包括降解包含所述多个寡核苷酸条形码分子的珠子。
23.如权利要求22所述的方法，其中降解所述珠子包括裂解化学键，该化学键包括在所述多个寡核苷酸条形码分子的所述寡核苷酸条形码分子与所述珠子之间的二硫桥键，并且所述释放步骤包括使所述珠子暴露于还原剂。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述还原剂包括选自二硫苏糖醇(DTT)和三(2-羧乙基)膦(TCEP)的还原剂。
25.如权利要求1所述的方法，其中所述dNTP的浓度大于所述dUTP的浓度。
26.如权利要求1所述的方法，进一步包括对所述条形码化的核酸分子或其衍生物进行测序。
27.如权利要求1所述的方法，其中在(b)中，所述模板核酸分子的所述核酸扩增包括对所述引物进行引物延伸以生成包含所述尿嘧啶的互补核酸序列。
28.如权利要求1所述的方法，其中在(e)中，所述条形码化的核酸分子通过等温扩增生成。
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