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CN104903466B - 条形编码核酸 - Google Patents

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CN104903466B
CN104903466B CN201380069090.3A CN201380069090A CN104903466B CN 104903466 B CN104903466 B CN 104903466B CN 201380069090 A CN201380069090 A CN 201380069090A CN 104903466 B CN104903466 B CN 104903466B
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Abstract

本文提供了条形编码核酸，如基因组DNA的方法。在一些实施方案中，基因组DNA的片段可以包含第一条形码和第二条形码。

Description

条形编码核酸
本申请要求2012年11月5日提交的美国临时申请号61/722,357的优先权权益，该美国临时申请的全部内容以引用的方式并入本文。
序列表通过电子提交而随本文一起提交并且以引用的方式并入本文，所述序列表被包含在被命名为“RUBCP0031WO_ST25.txt”的文件中，所述文件是2KB(如在Microsoft中所测量)并且在2013年11月5日创建。
技术领域
本发明大体上涉及分子生物学和核酸测序的领域。更具体地说，它涉及条形编码(barcoding)核酸的方法。
背景技术
条形码可以被用于鉴定核酸分子，例如其中测序可以揭示与所关注的核酸分子连接的特定条形码。在一些情况下，可以使用序列特异性事件来鉴定核酸分子，其中所述条形码的至少一部分在所述序列特异性事件中被识别出，例如所述条形码的至少一部分可以参与连接反应或延伸反应。所述条形码因此可以允许对与其连接的gDNA分子进行鉴定、选择或扩增。
一种使条形码与所关注的核酸分子结合的方法包括制备Ion gDNA片段文库，如由生命科技公司(Life Technologies)对于Ion Torrent系统所述。在这种方法中，使gDNA的片段与衔接子连接，其中使每一个基因组DNA片段的至少一端与包含条形码的衔接子连接。可以使用PCR用针对所述衔接子的引物对所连接的衔接子和gDNA片段进行切口修复、尺寸选择、以及扩增以产生扩增的文库。举例来说，可以使用包括16种不同的条形码的连接衔接子制备16种不同的gDNA样品，每一种gDNA样品具有独特的条形码，因此可以将每一种样品通过PCR使用相同的PCR引物单独地扩增，然后汇集(混合在一起)或者可以首先将每一种样品汇集，然后使用相同的PCR引物同时扩增。因此，每一种gDNA样品可以通过它所附接的独特的条形码来被鉴定。然而，所需的不同的连接衔接子的数目等于条形码的数目。举例来说，以混合物的形式产生能够被测序的256种样品文库将需要256种不同的连接衔接子。
发明内容
本发明的实施方案提供了制备用于测序的带双重条形码的核酸分子的方法。在核酸分子的同一端上具有第一条形码和第二条形码可以容许测序读取从第二条形码开始，继续经过第一条形码，然后进入到核酸分子中。因此可以在单次读取中获得对第二条形码、第一条形码以及所述核酸分子的序列进行的鉴定，而不是不得不使得从核酸分子的每一端进行测序读取以从核酸分子的远端向后对单个条形码的序列进行读取，正如在使用双重测序条形码的传统方法中的情况那样。
因而，本发明的一个实施方案涉及一种制备带双重条形码的核酸分子的方法，所述方法包括：使茎-环寡核苷酸的一条链与核酸分子结合以形成第一条形码结合的核酸分子，所述茎-环寡核苷酸包含分子内反向重复序列和环，所述反向重复序列包含第一条形码；通过链置换或通过切口平移聚合将所述茎-环寡核苷酸的一条链从所述第一条形码结合的核酸分子中置换，以形成带第一条形码的核酸分子；使引物与所述带第一条形码的核酸分子退火，所述引物包括与所述带第一条形码的核酸分子互补的第一部分和包含第二条形码的第二部分；以及使退火的引物延伸以形成带双重条形码的核酸分子，所述带双重条形码的核酸分子包含所述第二条形码、所述第一条形码、以及所述核酸分子的至少一部分。在一些方面，所述引物的第一部分与所述第一条形码或所述第一条形码的一部分退火。在其它方面，所述引物的第一部分不在所述第一条形码内退火。可以通过使用聚合酶，例如经由聚合酶链反应或PCR来进行延伸。所述核酸分子可以是基因组DNA、cDNA、扩增的DNA、核酸文库、或其片段。
在本发明的一个实施方案中，存在一种制备核酸分子的方法，所述方法包括：提供双链核酸分子；以及使茎-环寡核苷酸的一条链与所述双链核酸分子附接以产生寡核苷酸附接的核酸分子，所述茎-环寡核苷酸包含反向重复序列和环。在一些实施方案中，所述双链核酸分子可以是双链DNA分子。在具体实施方案中，所述附接被进一步限定为使所述寡核苷酸与所述双链核酸分子在所述寡核苷酸附接的核酸分子中产生非共价接合的条件下附接，所述非共价接合如切口、缺口或5'端侧翼结构(flap structure)。在本发明的具体方面，所述附接被进一步限定为连接(ligating)。连接可以被限定为使所述茎-环寡核苷酸衔接子的3'端与所述靶核酸分子的5'端连接。所述方法可以进一步包括通过链置换或通过切口平移聚合将所述寡核苷酸的一条链从所述寡核苷酸附接的核酸分子中置换。在一个具体实施方案中，诸如通过例如聚合酶链反应、RNA转录、或链置换使所述寡核苷酸附接的核酸分子的至少一部分扩增。本发明的方法可以进一步包括使与寡核苷酸附接的核酸分子扩增，其中所述茎-环衔接子的分子内反向重复序列的至少一部分被排除在扩增的寡核苷酸附接的核酸分子之外。
连接实施方案可以被进一步限定为包括：在所述双链核酸分子上产生可连接的末端；在所述茎-环寡核苷酸上产生可连接的末端；以及使所述茎-环寡核苷酸的可连接的末端的一条链与所述核酸分子的末端的一条链连接，从而在所述寡核苷酸附接的核酸分子中产生非共价接合，如切口、缺口、或5'端侧翼结构。在另外的方面，所述方法包括在所述核酸分子上产生平末端；在所述茎-环寡核苷酸上产生平末端；以及使所述茎-环寡核苷酸的平末端的一条链与所述核酸分子的平末端的一条链连接，从而在所述寡核苷酸连接的核酸分子中产生切口。
在一些方面，所述方法可以包括使茎-环寡核苷酸衔接子的一条链与靶核酸分子的每一端连接。在一些方面，与靶核酸分子的每一端连接的茎-环衔接子的反向重复序列可以包含相同的序列。在这个方面，所述茎-环衔接子与所述靶核酸分子的每一端的结合将产生包含末端反向重复序列的核酸分子，从而允许所述分子形成茎环。在其它方面，与靶核酸分子的每一端结合的茎-环衔接子的反向重复序列可以不包含相同的序列。在这个方面，使所述茎-环衔接子与所述靶核酸分子的每一端结合将产生缺乏末端反向重复序列的核酸分子并且因此所述分子将不能形成茎环。
在另外的实施方案中，所述寡核苷酸附接的核酸分子包含具有3'端羟基的切口，其中存在从所述寡核苷酸附接的核酸分子的至少一部分的3'端羟基进行的聚合。
链置换或切口平移聚合可以被进一步限定为在环中或邻近于环的茎区域中的不可复制碱基或区域处停止的聚合。
在本发明的一个具体方面，所述方法进一步包括以下步骤：使用核酸内切酶对双链DNA分子进行消化以产生DNA片段，其中所述寡核苷酸变成与所述DNA片段的一条链连接，并且其中通过使寡核苷酸连接的DNA片段进行在环中或邻近于环的茎区域中的碱基或序列处停止的链置换或切口平移聚合，所述寡核苷酸连接的DNA片段的聚合排除所述茎-环衔接子的分子内反向重复序列的至少一部分。
在一些实施方案中，所述茎-环寡核苷酸被进一步限定为包含可裂解的碱基。具体来说，在一些情况下，所述可裂解的碱基存在于寡核苷酸的环中或邻近于环的茎的序列中。可裂解的碱基或序列可以包含与糖-磷酸骨架或碱基附接的脱碱基位点或序列、六乙二醇和/或庞大的化学部分。在具体实施方案中，所述脱碱基位点或序列是通过单一溶液中的一种或多种酶而引入的。在另一个具体的实施方案中，所述茎-环寡核苷酸的环包含至少一个脱氧尿苷。
在具体方面，所述茎-环寡核苷酸的5'端缺少磷酸酯。
条形码还被称为“条码”，可以基于选择特定的核酸序列而产生。举例来说，IlluminaTM测序可以利用6个碱基以有效地产生48种不同的条形码。Ion Torrent测序仪(例如Ion ProtonTM测序仪或Ion PGMTM测序仪)可以利用6个碱基产生16种条形码。在一些实施方案中，可以应用规则以产生如下的条形码，所述条形码允许即使在测序期间出现两处错误也可以正确地鉴定不同的条形码。条形编码描述于例如美国专利7,902,122和美国专利公开2009/0098555中。可以使用U.S.5,935,793或US 2010/0227329中所述的方法通过引物延伸，例如经由PCR，来掺入条形码。在一些实施方案中，可以经由使用连接将条形码掺入到核酸中，随后可以扩增；例如，美国专利5,858,656、美国专利6,261,782、美国专利公开2011/0319290、或美国专利公开2012/0028814中所述的方法可以与本发明一起使用。在一些实施方案中，可以使用一种或多种条形码，例如如美国专利公开2007/0020640、美国专利公开2009/0068645、美国专利公开2010/0273219、美国专利公开2011/0015096、或美国专利公开2011/0257031中所述。
尽管一些实施方案将第二条形码掺入到例如经由美国专利7,803,550中所述的方法所产生的基因组文库中，但本发明的方法可以与用于产生核酸文库的多种多样的技术组合使用。举例来说，可以将第二条形码掺入到核酸文库的片段中，其中所述核酸文库是使用与Illumina测序相容的方法而产生，如NexteraTM DNA样品制备试剂盒，并且用于产生Illumina新一代测序文库构建的另外的方法描述于例如Oyola等(2012)中。在其它实施方案中，核酸文库是使用与SOLiDTM或Ion Torrent测序方法相容的方法(例如片段文库构建试剂盒、末端配对文库构建试剂盒、ChIP-Seq试剂盒、总RNA序列试剂盒、SAGETM试剂盒、RNA序列文库构建试剂盒等)而产生。用于新一代测序方法的另外的方法，包括可以与本发明的实施方案一起使用的用于文库构建的各种方法描述于例如Pareek(2011)和Thudi(2012)中。
在另一个实施方案中，存在一种试剂盒，所述试剂盒被装在合适的容器中，所述试剂盒包含本发明的一种或多种组合物和/或包含适用于本发明的至少一种方法的一种或多种组合物。
本发明的另外的实施方案包括通过本发明的方法制备的DNA分子的文库。
如本说明书中所用，“a/an(一)”可以意指一个(种)或多个(种)。如本文在一项或多项权利要求中所用，当结合词语“包含”使用时，词语“a/an(一)”可以意指一个(种)或多于一个(种)。
除非明确地表示指的是单独的替代方案或这些替代方案相互排斥，否则在权利要求书中术语“或”的使用是用于意指“和/或”，尽管本公开支持指的是单独的替代方案以及“和/或”的定义。如本文所用的“另一个(种)”可以意指至少第二个(种)或更多个(种)。
在整个本申请中，术语“约”用于表示值包括被用于测定所述值的装置、方法固有的误差变异或研究对象间存在的变异。
根据以下详细说明，本发明的其它目的、特征以及优势将变得显而易见。然而，应当了解的是，虽然详细说明和具体实施例表明了本发明的优选的实施方案，但是所述详细说明和所述具体实施例仅是以说明的方式给出的，这是因为根据这一详细说明，落入本发明的精神和范围内的各种变化方案和改动方案对于本领域技术人员来说将变得显而易见。
附图说明
下列附图形成本说明书的一部分并且被包括以进一步说明本发明的某些方面。通过参考这些附图中的一个或多个，结合本文所提供的具体实施方案的详细说明，可以更好地了解本发明。
图1：对单组条形码的使用相比于第一组条形码和第二组条形码的使用的示意性比较。
图2：使用茎-环衔接子添加第一条形码、随后进行PCR扩增以添加第二条形码的图示说明。
图3：含有串联的双重条形码、但不产生末端反向重复序列的衔接子的图示说明。
图4：使用无反向重复序列的串联的双重条形码进行实时PCR文库扩增的结果。
图5：产生末端反向重复序列的含有串联的双重条形码的衔接子的图示说明。
图6：使用有反向重复序列的串联的双重条形码进行实时PCR文库扩增的结果。
具体实施方式
本发明的技术涉及核酸分子的条形编码。条形码还被描述为标签、索引序列或标识码，包括被掺入到核酸分子中用于鉴定目的的特定序列。举例来说，可以通过连接和/或引物延伸使合成核酸分子与基因组DNA(gDNA)接合。本发明的技术涉及具有多个条形码、特别是相继或串联的条形码的核酸分子。串联的条形码的实例包括通过连接事件(例如与合成茎-环衔接子连接)而与gDNA分子的至少一端结合的第一条形码，随后是通过引物延伸(例如PCR)与所述gDNA结合的第二条形码，其中所述第一条形码在所述gDNA分子的近端(距插入序列更近)并且所述第二条形码在所述gDNA的远端(距插入序列更远)。使用茎环衔接子连接以及引物延伸或PCR添加额外序列的方法描述于例如美国专利7,803,550中，所述美国专利以引用的方式整体并入本文。这些方法可以在本发明的实施方案中被用于将第一条形码和/或第二条形码添加到核酸分子中。
条形码可以被用于鉴定核酸分子，例如其中测序可以揭示与所关注的核酸分子结合的特定条形码。在一些情况下，可以使用序列特异性事件来鉴定核酸分子，其中所述条形码的至少一部分在所述序列特异性事件中被识别出，例如所述条形码的至少一部分可以参与连接反应或延伸反应。所述条形码因此可以允许对与其连接的gDNA分子进行鉴定、选择或扩增。
一种使条形码与所关注的核酸分子结合的方法包括制备Ion gDNA片段文库，如由生命科技公司对于Ion Torrent系统所述。在这种方法中，使gDNA的片段与衔接子连接，其中使每一个基因组DNA片段的至少一端与包括条形码的衔接子连接。可以使用PCR用针对所述衔接子的引物对所连接的衔接子和gDNA片段进行切口修复、尺寸选择、以及扩增以产生扩增的文库。举例来说，可以使用包括16种不同的条形码的连接衔接子制备16种不同的gDNA样品，每一种gDNA样品具有独特的条形码，因此可以将每一种样品通过PCR使用相同的PCR引物单独地扩增，然后汇集(混合在一起)，或者可以首先将每一种样品汇集，然后使用相同的PCR引物同时扩增。因此，每一种gDNA样品可以通过它所附接的独特的条形码来被鉴定。然而，这种方法的一个问题在于所需的不同的连接衔接子的数目等于条形码的数目。举例来说，以混合物的形式产生能够被测序的256种样品文库将需要256种不同的连接衔接子。
为了解决这个问题，可以使基因组DNA的片段与具有第一组条形码的衔接子连接，例如使用如美国专利7,803,550中所述的茎-环衔接子和方法。可以产生具有16种不同的条形码的衔接子，并且可以例如与Ion Torrent测序系统(例如Ion ProtonTM测序仪或Ion PGMTM测序仪)一起使用所述衔接子。然后可以使用具有第二组条形码的引物对所连接的具有第一组条形码的衔接子和gDNA片段进行引物延伸反应或PCR。所得的核酸分子各自在核酸分子的至少一端上具有来自第一组条形码的一个条形码，所述条形码与来自第二组条形码的一个条形码相邻。条形码的确切数目可以基于具体的应用来确定；例如，在一些实施方案中，第二条形码可以利用六个碱基来产生例如16种额外的条形码。尽管如此，根据应用和/或测序方法，可以利用1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、或16个或更多个碱基来产生第二条形码。在一些实施方案中，可以使用至少2个、至少3个或3-16个碱基来产生第二条形码。
在一些实施方案中，第二组条形码可以包括16种不同的引物。以这种方式，可以使用16种不同的引物(针对第二组的条形码)对具有十六种不同的条形码(第一组条形码)的连接衔接子进行扩增以产生16×16种独特的条形码组合，这允许将256种样品汇集，使得样品被256倍多重化。仅使用16+16种寡核苷酸就实现了这种多重化水平使得产生256种有用的文库的成本和时间大幅节省。优选地，第一条形码和第二条形码可以处在gDNA的同一侧上(即，作为同一衔接子的一部分)并且可以彼此串联以及与gDNA串联的方式被测序以节省测序时间和成本。
此外，第一条形码可以直接与gDNA附接，而第二条形码可以在通过PCR扩增期间附接。因此，可以使用第一组条形码以：a)使用相同的条形码对gDNA样品的所有成员进行标记；或b)使用不同的条形码对gDNA样品的不同成员进行标记。举例来说，如果使用单个条形码进行连接，则gDNA的所有成员将普遍带有相同的条形码。然而，如果使用随机或部分随机的条形码来合成连接衔接子，那么gDNA样品中的不同分子将具有不同的条形码。在极端情况下，如果条形码区域含有16个随机碱基，则在所连接的核酸文库内可以表现出65,536种条形码。所述条形码可以用于区分输入gDNA文库的不同成员；例如，这些方法可以用于对gDNA文库中的分子复本(其大部分将具有不同的条形码)以及在PCR扩增期间形成的复本(其大部分将带有相同的第一条形码)进行独立的计数。可以使用部分随机的第一条形码以提供有关个别样品和个别分子的信息。
I.定义
如本文所用的“扩增”指的是用于使一个或者多个核苷酸序列的拷贝数增加的任何体外过程。核酸扩增使得核苷酸被掺入到DNA或RNA中。如本文所用，一个扩增反应可以由多轮DNA复制组成。举例来说，一个PCR反应可以由30-100个“循环”的变性和复制组成。
如本文所用的“核苷酸”是本领域中指代碱基-糖-磷酸酯组合的术语。核苷酸是核酸聚合物，即DNA和RNA的单体单元。该术语包括核糖核苷三磷酸，如rATP、rCTP、rGTP或rUTP；以及脱氧核糖核苷三磷酸，如dATP、dCTP、dUTP、dGTP或dTTP。
“核苷”是碱基-糖组合，即缺少磷酸酯的核苷酸。在本领域中应当认识到，在术语核苷和核苷酸的使用中存在一定的可互换性。举例来说，核苷酸脱氧尿苷三磷酸dUTP是脱氧核糖核苷三磷酸。在被掺入到DNA中之后，它用作DNA单体，在形式上是脱氧尿苷酸，即dUMP或脱氧尿苷单磷酸。可以说是将dUTP掺入到DNA中，尽管在所得的DNA中不存在dUTP部分。类似地，可以说是将脱氧尿苷掺入到DNA中，尽管那只是底物分子的一部分。
如本文所用的“掺入”意指变成核酸聚合物的一部分。
如本文所用的“寡核苷酸”共同地并且可互换地指的是本领域的两个术语，即“寡核苷酸”和“多核苷酸”。应当指出的是，尽管寡核苷酸和多核苷酸是本领域的不同术语，但它们之间不存在确切的分界线并且它们在本文中可互换使用。术语“衔接子”也可以与术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”可互换使用。
如本文所用的“引物”指的是在扩增期间通过共价添加核苷酸单体而延伸的单链寡核苷酸或单链多核苷酸。通常，核酸扩增是基于通过核酸聚合酶进行的核酸合成。许多这样的聚合酶需要可以延伸以开始核酸合成的引物的存在。
如本文所用的术语“发夹”和“茎-环寡核苷酸”指的是由包含5'末端区域和3'末端区域以及非自身互补的中央区域的寡核苷酸形成的结构，所述5'末端区域和3'末端区域是形成双链茎的分子内反向重复序列，所述非自身互补的中央区域形成单链环。
II.本发明的各个方面
本发明的实施方案可以提供如下的一种或多种益处或优势。在核酸分子的同一端上具有第一条形码和第二条形码可以容许测序读取从第二条形码开始，继续经过第一条形码，然后进入到核酸分子中。因此可以在单次读取中获得对第二条形码、第一条形码以及所述核酸分子的序列进行的鉴定，而不是不得不使得从核酸分子的每一端进行测序读取以从核酸分子的远端向后对单个条形码的序列进行读取，正如在使用双重测序条形码的传统方法中的情况那样。
在某些实施方案中，另一优势在于可以优选地在两个单独的步骤中添加第一条形码和第二条形码。这种添加顺序可以显著增加所编码的样品身份信息的可能的组合。此外，不同于如目前在一些新一代测序平台中所实行的使用通用的PCR引物对汇集的样品进行的扩增，使用个别PCR引物对个别样品进行扩增可以降低条形码之间由于引物引发和扩增失真(artifact)所引起的交叉污染的可能性(图1)。具体来说，可以使用短衔接子，例如短茎-环衔接子使第一条形码与核酸分子的至少一端进行连接。举例来说，短衔接子具有包含约14至约23个核苷酸的茎，而长衔接子具有约24至约40个核苷酸的茎。
定性观测和定量实验证实连接被设计成在靠近连接位点处含有共同序列的单个衔接子或两个不同的衔接子可以对下述能力具有有益的作用：优先扩增包含具有受控尺寸的靶插入序列的分子并且辨别不带插入序列的衔接子二聚体或包含具有很少或没有信息价值的短插入序列的分子。这种现象被称为抑制或抑制PCR。抑制指的是当用于扩增的一种或多种引物对应于整个末端反向重复序列或所述重复序列的一部分时，选择性排除侧翼为所述末端反向重复序列的小于一定尺寸的分子，这种选择性排除是由于它们的低效扩增(Chenchik等,1996；Lukyanov等,1999；Siebert等,1995；Shagin等,1999)。这种现象的原因在于产出性PCR引物退火与片段互补端的非产出性自身退火之间的平衡。在侧翼末端反向重复序列的尺寸固定的情况下，插入序列越短，抑制作用越强，反之亦然。同样，在插入序列尺寸固定的情况下，末端反向重复序列越长，抑制作用越强(Chenchik等,1996；Lukyanov等,1999；Siebert等,1995；Shagin等,1999)。
借助于通过连接和/或引物延伸使末端反向重复序列与核酸分子的两端附接，相对于不期望的衔接子二聚体或短插入序列副产物，可以实现对期望最小尺寸的靶插入序列的引物退火和延伸的效率进行精确的控制，如由美国专利7,803,550所述。可以利用经由衔接子连接附接第一条形码的效率来防止偏差以及保持样品中核酸分子的表征。相反，经由引物延伸来结合第二条形码可以高效地使用包括第二条形码的长引物。
在本发明的这个实施方案中，将靶核酸与包含以下各项的示例性混合物一起孵育：具有3'端凹末端、3'端突末端或平末端的茎-环寡核苷酸；3'端校正DNA聚合酶(DNA聚合酶I的克列诺片段(Klenow fragment)、T4DNA聚合酶等)；T4DNA连接酶；ATP；以及dNTP。同时发生以下四种示例性酶促反应：DNA末端以及寡核苷酸双链茎区的“抛光”；寡核苷酸3'端与DNA的5'磷酸酯的连接，从而在DNA的3'端与寡核苷酸双链茎区的5'端之间留下切口；朝向茎-环寡核苷酸的末端增长的3'DNA末端的聚合酶延伸；以及寡核苷酸茎区内的链置换反应。这个过程产生DNA片段的文库，所述DNA片段在它们的末端处具有包括第一条形码序列的反向重复序列衔接子。
III.本发明的方法
下列概述提供了有关本发明技术的方法和组合物的另外的细节。所提供的所有具体实例应当被理解成非限制性实例。
A.所关注的核酸分子的制备
所关注的核酸分子可以是单个核酸分子或多个核酸分子。而且，所关注的核酸分子可以是生物来源的或合成来源的。核酸分子的实例包括基因组DNA、cDNA、RNA、扩增的DNA、预先存在的核酸文库等。
可以对所关注的核酸分子进行各种处理，如修复处理和片段化处理。片段化处理包括机械片段化处理、声波片段化处理、化学片段化处理、酶促片段化处理、随时间降解等。修复处理包括经由延伸和/或连接进行的切口修复、抛光以形成平末端、去除受损的碱基，如脱氨基核苷酸、衍生化核苷酸、无碱基核苷酸、或交联的核苷酸等。还可以对所关注的核酸分子进行化学修饰(例如亚硫酸氢盐转化、甲基化/脱甲基)、延伸、扩增(例如PCR、等温扩增等)等。
B.第一条形码结合
第一条形码或第一组条形码可以被结合至所关注的核酸分子的至少一端。在一些方面，第一条形码可以在茎-环衔接子内提供，或第一组条形码可以茎-环衔接子群的形式提供。茎-环衔接子可以包含如由美国专利7,803,550所述的茎-环衔接子。在一些方面，茎-环衔接子可以在茎-环衔接子的茎部分内包括条形码。在一些方面，茎-环衔接子的环部分可以包括可裂解的复制终点。
在一些方面，包含条形码的茎-环衔接子可以被结合至靶核酸分子的一端或靶核酸分子的两端。在一些方面，结合至靶核酸分子的每一端的茎-环衔接子的分子内反向重复序列可以包含相同的序列。在这个方面，所述茎-环衔接子与所述靶核酸分子的每一端的结合将产生包含末端反向重复序列的核酸分子，从而允许所述分子形成茎环。在其它方面，结合至靶核酸分子的每一端的茎-环衔接子的分子内反向重复序列可不包含相同的序列。在这个方面，所述茎-环衔接子与所述靶核酸分子的每一端的结合将产生缺乏末端反向重复序列的核酸分子并且因此所述分子将不能形成茎环。
在一些方面，包含条形码的茎-环衔接子可以经由与核酸分子的5'端连接，例如通过平末端连接被结合至核酸分子。使茎-环衔接子与靶核酸分子的一端或两端连接可以引起切口形成。所述一个或多个切口可以从所连接的茎-环衔接子和所述核酸分子中去除。
在一些方面，延伸反应可以使核酸分子的3'端延伸穿过茎-环衔接子，其中环部分在可裂解的复制终点处被裂解。
C.第二条形码结合
第二条形码或第二组条形码可被结合至与核酸分子结合的第一条形码或第一组条形码。以这种方式，第一条形码可以是核酸分子和第二条形码的中间体。在一些方面，第二条形码可以在引物内提供，或第二组条形码可以引物群的形式提供。在一些方面，可以使用引物延伸或PCR来掺入第二条形码。在一些方面，引物可以包括3'部分和5'部分，其中所述3'部分可以与第一条形码的一部分退火并且所述5'部分包含第二条形码。
关于所述方法的另外的信息可以参见于Ausubel等人(2003)或Sambrook等人(1989)中。如将由本领域技术人员所认识到的那样，可以对各种参数进行操控以优化所关注的核酸的制备、引物延伸、或PCR以掺入第二条形码。
IV.实施例
包括下列实施例以说明本发明的优选的实施方案。本领域技术人员应当了解的是，随后的实施例中所公开的技术代表了本申请的发明人所发现的在实施本发明中运行良好的技术，并且因此可以被认为构成了用于实施本发明的优选方式。然而，本领域技术人员根据本公开应当了解的是，可以在所公开的具体实施方案中作出许多变化并且仍获得同样的或类似的结果而不背离本发明的精神和范围。
实施例1：用于DNA测序的双重线内条形编码衔接子序列
图1提供了对单组条形码(例如Ion Torrent系统)的使用相比于在本发明技术的实施方案中第一组条形码和第二组条形码的使用的示意性比较。引物被示出与第一条形码外部的序列结合；然而，在一些实施方案中，引物可以与第一条形码或甚至与gDNA序列结合。在本发明的各个方面，可以与被添加到gDNA的两端的独特的衔接分子(例如茎环)或具有不同序列的两个(或更多个)不同的衔接分子进行连接。为了减少来自衔接子二聚体的背景，如果使用不同的衔接分子，那么它们可以优选地具有共同序列，所述共同序列将抑制包括衔接子二聚体在内的非常短的分子的PCR扩增。
图2图示了利用如美国专利号7,803,550中所述的茎-环衔接子和方法来添加具有第一条形码的衔接子的本发明的一个具体实施方案。在所述方法之后进一步进行PCR扩增以添加第二条形码。
本申请的发明人试图对含有串联的双重条形码，但缺少产生末端反向重复序列的序列的Ion Torrent衔接子进行测试。茎-环衔接子和PCR引物如图3和表1中所示来设计。值得注意的是，本发明的方法可以被改动成与其它新一代测序平台一起使用，并且不限于与Ion Torrent平台一起使用。
表1：寡核苷酸序列
加下划线＝第一条形码；具有灰色背景的加下划线＝第二条形码。
模板制备：将10微升的每一种DNA样品(0.1ng/μL的经过Coavris剪切的人类gDNA)添加到PCR管或孔中。对于非模板对照(NTC)，以10μL无核酸酶的水代替DNA样品。在单独的管中制备补充有dNTP混合物(每一种dNTP 2.5mM))的2μL/样品的模板制备缓冲液((包含以下各项的6.5×无ATP连接酶缓冲液：325mM Tris-HCl(pH 7.6，在25℃)、65mM MgCl2、3.25mM DTT)和1μL/样品的模板制备酶(末端修复混合物(End RepairMix)，酶科技公司(Enzymatics)目录号Y914-LC-L)的预混物，并且通过移液管混合。然后，将3μL的预混物添加到PCR管或孔中的10μL的DNA样品中并且使用被设定为8μL的移液管混合4-5次。反应组分的最终浓度如下：50mM Tris-HCl(pH 7.6，在25℃)、10mM MgCl2、0.5mM DTT、385μM dNTP、1×末端修复酶。将PCR板离心并且在热循环仪中使用下列条件孵育：在22℃进行1个循环25分钟；在55℃进行1个循环20分钟；保持在22℃。
文库合成：在单独的管中制备1μL/样品的文库合成缓冲液(包含以下各项的2×无ATP连接酶缓冲液：100mM Tris-HCl(pH 7.6，在25℃)、20mMMgCl2、1.0mM DTT，补充有15mM ATP和15μM每一种茎-环衔接子寡核苷酸)和1μL/样品的文库合成酶混合物(包含：1.2U的尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG，酶科技公司目录号G5010L)和8U T4DNA连接酶(酶科技公司目录号L603-HC-L))的新鲜文库合成预混物，并且通过移液管混合。然后，将2μL的文库合成预混物添加到每一种样品中并且使用被设定为10μL的移液管混合4-5次。反应组分的最终浓度如下：50mM Tris-HCl(pH 7.6，在25℃)、10mM MgCl2、0.5mM DTT、334μM dNTP、1mM ATP、1.2U尿嘧啶DNA糖基化酶、8U T4DNA连接酶、1μM每一种衔接子寡核苷酸。将板离心并且在热循环仪中使用下列条件孵育：在22℃进行1个循环40分钟；保持在4℃。
ThruPLEX-FD文库扩增：在临用前在单独的管中制备4.25μL/样品的无核酸酶的水、3.75μL/样品的EvaGreen:FC(9:1)、50.5μL/样品的文库扩增缓冲液(包含：150mM Tris-SO4(pH 8.5，在25℃)、120mM TMAC、0.75mM MgCl2、0.06％w/v明胶，补充有0.375μM的每一种PCR寡核苷酸)以及1.5μL/样品的文库扩增酶(KAPA高保真DNA聚合酶(KK2102)，1U/μl)的文库扩增预混物。然后，将60μL的文库扩增预混物添加到每一种文库中并且使用被设定为60μL的移液管混合3-4次。反应组分的最终浓度如下：100mM Tris-SO4(pH 8.5，在25℃)、80mM TMAC、2.5mM MgCl2、0.04％w/v明胶、1×EvaGreen、1×FCD、1.5U KAPA高保真DNA聚合酶、0.25μM每一种PCR寡核苷酸。将板离心，然后如下在实时热循环仪中孵育：在72℃进行1个循环3分钟；在85℃进行1个循环2分钟；在98℃进行1个循环2分钟；在98℃持续20秒、在67℃持续20秒、在72℃持续40秒的4个循环；以及在98℃持续20秒和在72℃持续50秒的4-21个循环。
结论：出现衔接子二聚体的显著扩增(图4)。这可能是由于在构建体中缺乏抑制作用；因此，本申请的发明人对含有将产生末端反向重复序列的序列并且包含近端线内条形码的版本(version)进行了测试。
实施例2：含有末端反向重复序列的用于DNA测序的双重线内条形编码衔接子序列
本申请的发明人试图对含有串联的双重条形码的具有由第二条形码表示的末端反向重复序列(靠近连接位点)的Ion衔接子进行测试。茎-环衔接子和PCR引物如图5和表2中所示来设计。
表2：用于产生末端反向重复序列的寡核苷酸序列
加下划线＝第一条形码；具有灰色背景的加下划线＝第二条形码。
使用寡核苷酸分析器(IDT)计算得出，0.25μM的寡核苷酸、100mMNa+、2.5mM Mg++以及0.3mM dNTP条件下Ion通用衔接子P1/A的TM是61℃。
实验条件如实施例1中所述，除了使用表2中所示的寡核苷酸序列并且使用单个通用茎-环衔接子(在文库合成反应中2μM)将末端反向重复序列附接到DNA片段的两端。含有用于产生末端反向重复序列的序列的茎-环衔接子与实施例1中所述的不含用于产生反向重复序列的此类序列的设计(图4)相比显示出信噪比的显著提高(图6)。
根据本公开可以进行并且完成本文所公开并且要求保护的所有方法而无需过多的实验。虽然已经关于优选的实施方案对本发明的组合物和方法进行描述，但对于本领域技术人员来说将显而易见的是，变化可以被应用到本文所述的方法以及本文所述的方法的步骤或步骤的顺序中而不脱离本发明的构思、精神以及范围。更确切地说，将显而易见的是，在化学和生理学这两方面相关的某些试剂可以代替本文所述的试剂，而仍将实现相同或类似的结果。所有这些对于本领域技术人员来说显而易见的类似的替代和改动均被认为落入如由所附权利要求书所限定的本发明的精神、范围以及构思内。
参考文献
下列参考文献就它们提供了补充本文所阐述的示例性程序或其它细节来说明确地以引用的方式并入本文。
美国专利5,858,656
美国专利5,935,793
美国专利6,261,782
美国专利7,803,550
美国专利7,902,122
美国专利公开号2007/0020640
美国专利公开号2009/0068645
美国专利公开号2010/0227329
美国专利公开号2010/0273219
美国专利公开号2011/0015096
美国专利公开号2011/0257031
美国专利公开号2011/0319290
美国专利公开号2012/0028814
Ausubel等,In:Current Protocols in Molecular Biology(《最新分子生物学实验方法汇编》),John Wiley&Sons,NY,2003。
Chenchik等,Full-length cDNA cloning and determination of mRNA 5'and 3'ends by amplification of adaptor-ligated cDNA(通过与衔接子连接的cDNA的扩增进行的全长cDNA克隆和mRNA 5'端和3'端的测定),Biotechniques,21:526-534,1996。
Lukyanov等,Selective suppression of polymerase chain reaction(对聚合酶链反应的选择性抑制),Bioorganicheskaya Khimiya,25:163-170,1999。
Oyola等,Optimizing Illumina next-generation sequencing librarypreparation for extremely AT-biased genomes(针对极端偏向AT的基因组对Illumina新一代测序文库制备进行优化),BMC Genomics,13:1,2012。
Pareek等,Sequencing technologies and genome sequencing(测序技术和基因组测序),J.Appl.Genet.,52(4):413-435,2011。
Sambrook等,In:Molecular cloning:a laboratory manual(《分子克隆：实验室手册》),第2版,纽约州冷泉港的冷泉港实验室出版社(Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY),1989。
Shagin等,Regulation of average length of complex PCR product(复杂PCR产物的平均长度的调节),Nucleic Acids Research,27,e23,1999。
Siebert等,An Improved PCR Method for Walking in Uncloned GenomicDNA(一种用于在未克隆的基因组DNA中步移的改进的PCR方法),NucleicAcids Research,23:1087-1088,1995。
Thudi等,Current state-of-art of sequencing technologies for plantgenomics research(用于植物基因组研究的测序技术的当前技术发展水平),Brief Funct.Genomics.,11(1):3-11,2012。

Claims (21)

1.一种制备带双重条形码的核酸分子的方法，所述方法包括：
(a)使茎-环寡核苷酸的一条链与靶核酸分子的至少一端结合以形成第一条形码结合的核酸分子，其中所述茎-环寡核苷酸包含分子内反向重复序列和环，并且其中所述反向重复序列包含所述第一条形码；
(b)通过链置换或通过切口平移聚合将所述茎-环寡核苷酸的一条链从所述第一条形码结合的核酸分子中置换以形成带第一条形码的核酸分子；
(c)使引物与所述带第一条形码的核酸分子退火，其中所述引物包含与所述带第一条形码的核酸分子互补的第一部分和包含第二条形码的第二部分；以及
(d)使所述退火的引物延伸以形成带双重条形码的核酸分子，所述带双重条形码的核酸分子包含所述第二条形码、所述第一条形码、以及所述靶核酸分子的至少一部分。
2.一种制备带双重条形码的核酸分子的方法，所述方法包括：
(a)使衔接子的一条链与靶核酸分子的至少一端结合以形成第一条形码结合的核酸分子，其中所述衔接子包含所述第一条形码；
(b)通过链置换或通过切口平移聚合将所述衔接子的一条链从所述第一条形码结合的核酸分子中置换以形成带第一条形码的核酸分子；
(c)使引物与所述带第一条形码的核酸分子退火，其中所述引物包含与所述带第一条形码的核酸分子互补的第一部分和包含第二条形码的第二部分；以及
(d)使所述退火的引物延伸以形成带双重条形码的核酸分子，所述带双重条形码的核酸分子包含所述第二条形码、所述第一条形码、以及所述靶核酸分子的至少一部分。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述引物的第一部分与所述带第一条形码的核酸分子中的所述第一条形码的一部分退火。
4.如权利要求1或2所述的方法，其中所述引物的第一部分不在所述带第一条形码的核酸分子中的所述第一条形码内退火。
5.如权利要求1所述的方法，其中步骤(a)包括使茎-环寡核苷酸的一条链与所述靶核酸分子的每一端结合。
6.如权利要求5所述的方法，其中附接到所述靶核酸分子的每一端的所述茎-环寡核苷酸的分子内反向重复序列包含相同的序列。
7.如权利要求5所述的方法，其中附接到所述靶核酸分子的每一端的所述茎-环寡核苷酸的分子内反向重复序列不包含相同的序列。
8.如权利要求1或2所述的方法，其中所述靶核酸分子是基因组DNA、cDNA、扩增的DNA、核酸文库、或其片段。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述茎-环寡核苷酸是茎-环寡核苷酸群。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述茎-环寡核苷酸的环包含可裂解的碱基。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述可裂解的碱基是脱氧尿苷。
12.如权利要求10所述的方法，其中所述可裂解的碱基在步骤(b)之前被裂解以产生无碱基位点。
13.如权利要求1所述的方法，其中使茎-环寡核苷酸的一条链与靶核酸分子的至少一端结合被进一步限定为使所述茎-环寡核苷酸衔接子的3′端与所述靶核酸分子的5′端连接。
14.如权利要求1或2所述的方法，其中所述引物是引物群。
15.如权利要求1或2所述的方法，其中延伸包括引物延伸或聚合酶链反应。
16.如权利要求1或2所述的方法，其进一步包括对所述带双重条形码的核酸分子的至少一部分的扩增。
17.如权利要求2所述的方法，其中步骤(a)包括使所述衔接子的一条链与所述靶核酸分子的每一端结合。
18.如权利要求2所述的方法，其中所述衔接子是衔接子群。
19.如权利要求2所述的方法，其中使衔接子的一条链与靶核酸分子的至少一端结合被进一步限定为使所述衔接子的3′端与所述靶核酸分子的5′端连接。
20.如权利要求1或2所述的方法，其中所述第一条形码包含随机或部分随机的条形码。
21.如权利要求13或19所述的方法，其中所述连接被进一步限定为平末端连接。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8835358B2 (en) 2009-12-15 2014-09-16 Cellular Research, Inc. Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse labels
JP6375230B2 (ja) 2012-02-27 2018-08-15 セルラー リサーチ， インコーポレイテッド 分子計数のための組成物およびキット
JP2015523626A (ja) * 2012-05-09 2015-08-13 エーピーディーエヌ （ビー．ブイ．アイ．） インコーポレイテッド デジタル表現およびその認証を用いる物理的暗号化タガントの検証
CA2881685C (en) 2012-08-14 2023-12-05 10X Genomics, Inc. Microcapsule compositions and methods
US10221442B2 (en) 2012-08-14 2019-03-05 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for sample processing
US9951386B2 (en) 2014-06-26 2018-04-24 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10323279B2 (en) 2012-08-14 2019-06-18 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US9701998B2 (en) 2012-12-14 2017-07-11 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US11591637B2 (en) 2012-08-14 2023-02-28 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for sample processing
US10752949B2 (en) 2012-08-14 2020-08-25 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10400280B2 (en) 2012-08-14 2019-09-03 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10273541B2 (en) 2012-08-14 2019-04-30 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10533221B2 (en) 2012-12-14 2020-01-14 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
EP2931919B1 (en) 2012-12-14 2019-02-20 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
EP2954104B1 (en) 2013-02-08 2020-09-16 10X Genomics, Inc. Polynucleotide barcode generation
US10227584B2 (en) * 2013-02-20 2019-03-12 Emory University Methods of sequencing nucleic acids in mixtures and compositions related thereto
EP3597772A1 (en) 2013-04-17 2020-01-22 Agency For Science, Technology And Research Method for generating extended sequence reads
CN105849275B (zh) 2013-06-25 2020-03-17 普罗格诺西斯生物科学公司 检测样品中生物靶标的空间分布的方法和系统
EP3039158B1 (en) 2013-08-28 2018-11-14 Cellular Research, Inc. Massively parallel single cell analysis
EP3055676A1 (en) 2013-10-07 2016-08-17 Cellular Research, Inc. Methods and systems for digitally counting features on arrays
CN110004208A (zh) 2014-03-11 2019-07-12 哈佛学院院长及董事 利用可编程核酸探针的高通量且高度多路复用的成像
DE202015009609U1 (de) 2014-04-10 2018-08-06 10X Genomics, Inc. Mikrofluidisches System zur Erzeugung von Emulsionen
WO2015200378A1 (en) 2014-06-23 2015-12-30 The General Hospital Corporation Genomewide unbiased identification of dsbs evaluated by sequencing (guide-seq)
JP2017522866A (ja) 2014-06-26 2017-08-17 １０エックス ジェノミクス， インコーポレイテッド 核酸配列の分析
EP4574974A3 (en) 2014-06-26 2025-10-08 10x Genomics, Inc. Methods of analyzing nucleic acids from individual cells or cell populations
US12312640B2 (en) 2014-06-26 2025-05-27 10X Genomics, Inc. Analysis of nucleic acid sequences
US12398391B2 (en) 2014-07-15 2025-08-26 Qiagen Sciences, Llc Semi-random barcodes for nucleic acid analysis
NZ730044A (en) * 2014-09-15 2024-08-30 Abvitro Llc High-throughput nucleotide library sequencing
CN114807307A (zh) 2014-10-29 2022-07-29 10X 基因组学有限公司 用于靶核酸测序的方法和组合物
US9975122B2 (en) 2014-11-05 2018-05-22 10X Genomics, Inc. Instrument systems for integrated sample processing
BR112017014902A2 (pt) 2015-01-12 2018-03-13 10X Genomics Inc processos e sistemas para a preparação de bibliotecas de sequenciamento de ácido nucleico e bibliotecas preparadas usando os mesmos
WO2016123419A1 (en) * 2015-01-30 2016-08-04 President And Fellows Of Harvard College Microscope-free imaging
US10697010B2 (en) 2015-02-19 2020-06-30 Becton, Dickinson And Company High-throughput single-cell analysis combining proteomic and genomic information
US10557134B2 (en) 2015-02-24 2020-02-11 Trustees Of Boston University Protection of barcodes during DNA amplification using molecular hairpins
EP4286516A3 (en) 2015-02-24 2024-03-06 10X Genomics, Inc. Partition processing methods and systems
JP2018505688A (ja) 2015-02-24 2018-03-01 １０エックス ゲノミクス，インコーポレイテッド 標的化核酸配列包括度（ｃｏｖｅｒａｇｅ）のための方法
ES2836802T3 (es) 2015-02-27 2021-06-28 Becton Dickinson Co Códigos de barras moleculares espacialmente direccionables
US20180073073A1 (en) * 2015-03-18 2018-03-15 Cellular Research, Inc. Methods and compositions for labeling targets and haplotype phasing
CN107406888A (zh) 2015-03-30 2017-11-28 赛卢拉研究公司 用于组合条形编码的方法和组合物
WO2016168351A1 (en) * 2015-04-15 2016-10-20 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Robust quantification of single molecules in next-generation sequencing using non-random combinatorial oligonucleotide barcodes
EP4582556A3 (en) * 2015-04-23 2025-10-08 Becton, Dickinson and Company Methods and compositions for whole transcriptome amplification
WO2016195963A1 (en) * 2015-05-29 2016-12-08 Tsavachidou Dimitra Methods for constructing consecutively connected copies of nucleic acid molecules
WO2016195382A1 (ko) * 2015-06-01 2016-12-08 연세대학교 산학협력단 바코드 서열을 포함하는 어댑터를 이용한 차세대 염기서열 분석 방법
US11124823B2 (en) 2015-06-01 2021-09-21 Becton, Dickinson And Company Methods for RNA quantification
GB2539675B (en) * 2015-06-23 2017-11-22 Cs Genetics Ltd Libraries of multimeric barcoding reagents and kits thereof for labelling nucleic acids for sequencing
JP6847496B2 (ja) * 2015-08-06 2021-03-24 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 単一プローブプライマー伸長による標的濃縮
CA3000816A1 (en) 2015-09-11 2017-03-16 The General Hospital Corporation Full interrogation of nuclease dsbs and sequencing (find-seq)
WO2017044574A1 (en) 2015-09-11 2017-03-16 Cellular Research, Inc. Methods and compositions for nucleic acid library normalization
CA3004310A1 (en) * 2015-11-04 2017-05-11 Atreca, Inc. Combinatorial sets of nucleic acid barcodes for analysis of nucleic acids associated with single cells
KR20240161696A (ko) 2015-12-04 2024-11-12 10엑스 제노믹스, 인크. 핵산 분석을 위한 방법 및 조성물
EP3400298B1 (en) 2016-01-08 2024-03-06 Bio-Rad Laboratories, Inc. Multiple beads per droplet resolution
ITUA20162640A1 (it) * 2016-04-15 2017-10-15 Menarini Silicon Biosystems Spa Metodo e kit per la generazione di librerie di dna per sequenziamento massivo parallelo
US10822643B2 (en) 2016-05-02 2020-11-03 Cellular Research, Inc. Accurate molecular barcoding
WO2017197343A2 (en) 2016-05-12 2017-11-16 10X Genomics, Inc. Microfluidic on-chip filters
WO2017197338A1 (en) 2016-05-13 2017-11-16 10X Genomics, Inc. Microfluidic systems and methods of use
US12043856B2 (en) 2016-05-24 2024-07-23 The Translational Genomics Research Institute Molecular tagging methods and sequencing libraries
US10301677B2 (en) 2016-05-25 2019-05-28 Cellular Research, Inc. Normalization of nucleic acid libraries
KR20170133270A (ko) * 2016-05-25 2017-12-05 주식회사 셀레믹스 분자 바코딩을 이용한 초병렬 시퀀싱을 위한 라이브러리 제조방법 및 그의 용도
ES2979395T3 (es) 2016-05-26 2024-09-25 Becton Dickinson Co Métodos de ajuste del recuento de etiquetas moleculares
US10640763B2 (en) 2016-05-31 2020-05-05 Cellular Research, Inc. Molecular indexing of internal sequences
US10202641B2 (en) 2016-05-31 2019-02-12 Cellular Research, Inc. Error correction in amplification of samples
US11708574B2 (en) 2016-06-10 2023-07-25 Myriad Women's Health, Inc. Nucleic acid sequencing adapters and uses thereof
CN118562788A (zh) * 2016-08-30 2024-08-30 元素生物科学公司 用于定相测序的方法和组合物
EP3516079B1 (en) 2016-09-20 2022-06-22 President and Fellows of Harvard College Molecular product authentication systems
EP4300099A3 (en) 2016-09-26 2024-03-27 Becton, Dickinson and Company Measurement of protein expression using reagents with barcoded oligonucleotide sequences
EP3518974A4 (en) 2016-09-29 2020-05-27 Myriad Women's Health, Inc. NON-INVASIVE PRENATAL SCREENING USING DYNAMIC ITERATIVE DEEP OPTIMIZATION
WO2018069484A2 (en) * 2016-10-13 2018-04-19 F. Hoffmann-La Roche Ag Molecular detection and counting using nanopores
SG11201903519UA (en) * 2016-10-19 2019-05-30 10X Genomics Inc Methods and systems for barcoding nucleic acid molecules from individual cells or cell populations
EP3529400B1 (en) 2016-10-24 2021-02-17 Geneinfosec, Inc. Concealing information present within nucleic acids
CN109844137B (zh) * 2016-10-31 2022-04-26 豪夫迈·罗氏有限公司 用于鉴定嵌合产物的条形码化环状文库构建
CN117056774B (zh) 2016-11-08 2026-01-27 贝克顿迪金森公司 用于细胞标记分类的方法
CN117594126A (zh) 2016-11-08 2024-02-23 贝克顿迪金森公司 用于表达谱分类的方法
US10011872B1 (en) 2016-12-22 2018-07-03 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10550429B2 (en) 2016-12-22 2020-02-04 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10815525B2 (en) 2016-12-22 2020-10-27 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
GB201622222D0 (en) 2016-12-23 2017-02-08 Cs Genetics Ltd Reagents and methods for molecular barcoding of nucleic acids of single cells
ES2961580T3 (es) 2017-01-13 2024-03-12 Cellular Res Inc Revestimiento hidrófilo de canales de fluidos
US12264411B2 (en) 2017-01-30 2025-04-01 10X Genomics, Inc. Methods and systems for analysis
CN110214186B (zh) 2017-01-30 2023-11-24 10X基因组学有限公司 用于基于微滴的单细胞条形编码的方法和系统
WO2018144217A1 (en) 2017-01-31 2018-08-09 Counsyl, Inc. Methods and compositions for enrichment of target polynucleotides
WO2018144216A1 (en) * 2017-01-31 2018-08-09 Counsyl, Inc. Methods and compositions for enrichment of target polynucleotides
EP3577232A1 (en) 2017-02-01 2019-12-11 Cellular Research, Inc. Selective amplification using blocking oligonucleotides
US20180223350A1 (en) * 2017-02-08 2018-08-09 Integrated Dna Technologies, Inc. Duplex adapters and duplex sequencing
EP3360962A1 (en) * 2017-02-14 2018-08-15 Technische Universität Dortmund Synthesis of dna-encoded libraries by micellar catalysis
WO2018175907A1 (en) 2017-03-24 2018-09-27 Counsyl, Inc. Copy number variant caller
EP4230746A3 (en) 2017-05-26 2023-11-01 10X Genomics, Inc. Single cell analysis of transposase accessible chromatin
US20180340169A1 (en) 2017-05-26 2018-11-29 10X Genomics, Inc. Single cell analysis of transposase accessible chromatin
EP4345172A3 (en) 2017-06-05 2024-07-03 Becton, Dickinson and Company Sample indexing for single cells
US10633651B2 (en) * 2017-07-10 2020-04-28 Agilent Technologies, Inc. Assay methods and compositions for detecting contamination of nucleic acid identifiers
US11505826B2 (en) 2017-07-12 2022-11-22 Agilent Technologies, Inc. Sequencing method for genomic rearrangement detection
EP3431611A1 (en) * 2017-07-21 2019-01-23 Menarini Silicon Biosystems S.p.A. Improved method and kit for the generation of dna libraries for massively parallel sequencing
JP7581046B2 (ja) 2017-08-23 2024-11-12 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション 変更されたＰＡＭ特異性を有する遺伝子操作されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ヌクレアーゼ
EP3694993A4 (en) 2017-10-11 2021-10-13 The General Hospital Corporation SITE-SPECIFIC AND PARASITIC GENOMIC DESAMINATION DETECTION METHODS INDUCED BY BASIC EDITING TECHNOLOGIES
WO2019099751A1 (en) 2017-11-15 2019-05-23 10X Genomics, Inc. Functionalized gel beads
US10829815B2 (en) 2017-11-17 2020-11-10 10X Genomics, Inc. Methods and systems for associating physical and genetic properties of biological particles
US11946095B2 (en) 2017-12-19 2024-04-02 Becton, Dickinson And Company Particles associated with oligonucleotides
WO2019166530A1 (en) * 2018-03-02 2019-09-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Generation of single-stranded circular dna templates for single molecule sequencing
US12142104B2 (en) 2018-03-22 2024-11-12 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for molecular authentication
GB201804641D0 (en) 2018-03-22 2018-05-09 Inivata Ltd Methods of sequencing nucleic acids and error correction of sequence reads
CN112262218B (zh) 2018-04-06 2024-11-08 10X基因组学有限公司 用于单细胞处理中的质量控制的系统和方法
EP3781585A4 (en) 2018-04-17 2022-01-26 The General Hospital Corporation SENSITIVE IN VITRO TESTS FOR SUBSTRATE PREFERENCES AND SITE FOR NUCLEIC ACID BINDERS, MODIFIERS AND CLEAVAGE AGENTS
US11365409B2 (en) * 2018-05-03 2022-06-21 Becton, Dickinson And Company Molecular barcoding on opposite transcript ends
US11773441B2 (en) 2018-05-03 2023-10-03 Becton, Dickinson And Company High throughput multiomics sample analysis
US11976275B2 (en) * 2018-06-15 2024-05-07 Kapa Biosystems, Inc. Generation of double-stranded DNA templates for single molecule sequencing
EP3814328A1 (en) 2018-06-27 2021-05-05 F. Hoffmann-La Roche AG Novel azetidine-substituted pyridine and pyrazine compounds as inhibitors of cannabinoid receptor 2
SG11202009103WA (en) 2018-06-27 2020-10-29 Hoffmann La Roche Novel pyridine and pyrazine compounds as inhibitors of cannabinoid receptor 2
DK3604525T3 (da) * 2018-08-02 2021-05-31 Univ Dresden Tech Fremgangsmåde til tilvejebringelse af et dna-indkodet bibliotek, dna-inkodet bibliotek og fremgangsmåde til at afkode et dna-indkodet bibliotek
US11519033B2 (en) 2018-08-28 2022-12-06 10X Genomics, Inc. Method for transposase-mediated spatial tagging and analyzing genomic DNA in a biological sample
JP7670607B2 (ja) 2018-10-01 2025-04-30 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー ５’転写物配列の決定
EP3877520B1 (en) 2018-11-08 2025-03-19 Becton, Dickson And Company Whole transcriptome analysis of single cells using random priming
WO2020123309A1 (en) 2018-12-10 2020-06-18 10X Genomics, Inc. Resolving spatial arrays by proximity-based deconvolution
US12529094B2 (en) 2018-12-10 2026-01-20 10X Genomics, Inc. Imaging system hardware
US11492660B2 (en) 2018-12-13 2022-11-08 Becton, Dickinson And Company Selective extension in single cell whole transcriptome analysis
EP3666904A1 (en) 2018-12-14 2020-06-17 Lexogen GmbH Nucleic acid amplification and identification method
US11926867B2 (en) 2019-01-06 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Generating capture probes for spatial analysis
WO2020150356A1 (en) 2019-01-16 2020-07-23 Becton, Dickinson And Company Polymerase chain reaction normalization through primer titration
WO2020154307A1 (en) * 2019-01-22 2020-07-30 Singular Genomics Systems, Inc. Polynucleotide barcodes for multiplexed proteomics
WO2020154247A1 (en) 2019-01-23 2020-07-30 Cellular Research, Inc. Oligonucleotides associated with antibodies
EP3924506A1 (en) 2019-02-14 2021-12-22 Becton Dickinson and Company Hybrid targeted and whole transcriptome amplification
WO2020214642A1 (en) 2019-04-19 2020-10-22 Becton, Dickinson And Company Methods of associating phenotypical data and single cell sequencing data
EP3976820A1 (en) 2019-05-30 2022-04-06 10X Genomics, Inc. Methods of detecting spatial heterogeneity of a biological sample
CN114051534B (zh) 2019-07-22 2025-02-21 贝克顿迪金森公司 单细胞染色质免疫沉淀测序测定
US11773436B2 (en) 2019-11-08 2023-10-03 Becton, Dickinson And Company Using random priming to obtain full-length V(D)J information for immune repertoire sequencing
EP3891300B1 (en) 2019-12-23 2023-03-29 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using rna-templated ligation
WO2021133842A1 (en) 2019-12-23 2021-07-01 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for using fixed biological samples in partition-based assays
US12365942B2 (en) 2020-01-13 2025-07-22 10X Genomics, Inc. Methods of decreasing background on a spatial array
WO2021146207A1 (en) 2020-01-13 2021-07-22 Becton, Dickinson And Company Methods and compositions for quantitation of proteins and rna
US12405264B2 (en) 2020-01-17 2025-09-02 10X Genomics, Inc. Electrophoretic system and method for analyte capture
US20210230681A1 (en) 2020-01-24 2021-07-29 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using proximity ligation
WO2021155057A1 (en) 2020-01-29 2021-08-05 Becton, Dickinson And Company Barcoded wells for spatial mapping of single cells through sequencing
US12076701B2 (en) 2020-01-31 2024-09-03 10X Genomics, Inc. Capturing oligonucleotides in spatial transcriptomics
US11898205B2 (en) 2020-02-03 2024-02-13 10X Genomics, Inc. Increasing capture efficiency of spatial assays
US12110541B2 (en) 2020-02-03 2024-10-08 10X Genomics, Inc. Methods for preparing high-resolution spatial arrays
US11732300B2 (en) 2020-02-05 2023-08-22 10X Genomics, Inc. Increasing efficiency of spatial analysis in a biological sample
US12129516B2 (en) 2020-02-07 2024-10-29 10X Genomics, Inc. Quantitative and automated permeabilization performance evaluation for spatial transcriptomics
US12281357B1 (en) 2020-02-14 2025-04-22 10X Genomics, Inc. In situ spatial barcoding
US11891654B2 (en) 2020-02-24 2024-02-06 10X Genomics, Inc. Methods of making gene expression libraries
WO2021173719A1 (en) 2020-02-25 2021-09-02 Becton, Dickinson And Company Bi-specific probes to enable the use of single-cell samples as single color compensation control
WO2021231779A1 (en) 2020-05-14 2021-11-18 Becton, Dickinson And Company Primers for immune repertoire profiling
WO2021237087A1 (en) 2020-05-22 2021-11-25 10X Genomics, Inc. Spatial analysis to detect sequence variants
WO2021236929A1 (en) 2020-05-22 2021-11-25 10X Genomics, Inc. Simultaneous spatio-temporal measurement of gene expression and cellular activity
WO2021247593A1 (en) 2020-06-02 2021-12-09 Becton, Dickinson And Company Oligonucleotides and beads for 5 prime gene expression assay
US12031177B1 (en) 2020-06-04 2024-07-09 10X Genomics, Inc. Methods of enhancing spatial resolution of transcripts
EP4450639B1 (en) 2020-06-25 2025-10-15 10X Genomics, Inc. Spatial analysis of dna methylation
US11761038B1 (en) 2020-07-06 2023-09-19 10X Genomics, Inc. Methods for identifying a location of an RNA in a biological sample
US11981960B1 (en) 2020-07-06 2024-05-14 10X Genomics, Inc. Spatial analysis utilizing degradable hydrogels
US12209280B1 (en) 2020-07-06 2025-01-28 10X Genomics, Inc. Methods of identifying abundance and location of an analyte in a biological sample using second strand synthesis
US11932901B2 (en) 2020-07-13 2024-03-19 Becton, Dickinson And Company Target enrichment using nucleic acid probes for scRNAseq
US12391940B2 (en) 2020-07-31 2025-08-19 Becton, Dickinson And Company Single cell assay for transposase-accessible chromatin
US11981958B1 (en) 2020-08-20 2024-05-14 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using DNA capture
US11926822B1 (en) 2020-09-23 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Three-dimensional spatial analysis
US11827935B1 (en) 2020-11-19 2023-11-28 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using rolling circle amplification and detection probes
EP4247967A1 (en) 2020-11-20 2023-09-27 Becton, Dickinson and Company Profiling of highly expressed and lowly expressed proteins
WO2022132206A1 (en) 2020-12-15 2022-06-23 Becton, Dickinson And Company Single cell secretome analysis
AU2021409136A1 (en) 2020-12-21 2023-06-29 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and systems for capturing probes and/or barcodes
WO2022181858A1 (ko) * 2021-02-26 2022-09-01 지니너스 주식회사 분자 바코딩 효율을 향상시키기 위한 조성물 및 이의 용도
US11866765B2 (en) 2021-02-26 2024-01-09 Geninus Inc. Composition for improving molecular barcoding efficiency and use thereof
EP4428246B1 (en) 2021-04-14 2025-12-24 10X Genomics, Inc. Methods of measuring mislocalization of an analyte
EP4320271B1 (en) 2021-05-06 2025-03-19 10X Genomics, Inc. Methods for increasing resolution of spatial analysis
KR20240007765A (ko) * 2021-05-16 2024-01-16 젠에디트바이오 리미티드 표적 핵산을 농축하는 방법, 오프-타겟을 식별하고 유전자 편집 효율성을 평가하는 방법
EP4582555A3 (en) 2021-06-03 2025-10-22 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, kits, and systems for enhancing analyte capture for spatial analysis
WO2023034489A1 (en) 2021-09-01 2023-03-09 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and kits for blocking a capture probe on a spatial array
EP4419707A1 (en) 2021-11-10 2024-08-28 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and kits for determining the location of an analyte in a biological sample
EP4305195A2 (en) 2021-12-01 2024-01-17 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and systems for improved in situ detection of analytes and spatial analysis

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010030683A1 (en) * 2008-09-09 2010-03-18 Rosetta Inpharmatics Llc Methods of generating gene specific libraries
WO2011156529A2 (en) * 2010-06-08 2011-12-15 Nugen Technologies, Inc. Methods and composition for multiplex sequencing
WO2012129363A2 (en) * 2011-03-24 2012-09-27 President And Fellows Of Harvard College Single cell nucleic acid detection and analysis

Family Cites Families (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2036946C (en) 1990-04-06 2001-10-16 Kenneth V. Deugau Indexing linkers
US5935793A (en) 1996-09-27 1999-08-10 The Chinese University Of Hong Kong Parallel polynucleotide sequencing method using tagged primers
CA2367400A1 (en) 1999-04-06 2000-10-12 Yale University Fixed address analysis of sequence tags
EP1606417A2 (en) * 2003-03-07 2005-12-21 Rubicon Genomics Inc. In vitro dna immortalization and whole genome amplification using libraries generated from randomly fragmented dna
GB0400584D0 (en) * 2004-01-12 2004-02-11 Solexa Ltd Nucleic acid chacterisation
GB0422551D0 (en) 2004-10-11 2004-11-10 Univ Liverpool Labelling and sequencing of nucleic acids
US7393665B2 (en) 2005-02-10 2008-07-01 Population Genetics Technologies Ltd Methods and compositions for tagging and identifying polynucleotides
US20070020640A1 (en) 2005-07-21 2007-01-25 Mccloskey Megan L Molecular encoding of nucleic acid templates for PCR and other forms of sequence analysis
WO2007018602A1 (en) 2005-08-02 2007-02-15 Rubicon Genomics, Inc. Isolation of cpg islands by thermal segregation and enzymatic selection-amplification method
WO2007018601A1 (en) * 2005-08-02 2007-02-15 Rubicon Genomics, Inc. Compositions and methods for processing and amplification of dna, including using multiple enzymes in a single reaction
US7537897B2 (en) 2006-01-23 2009-05-26 Population Genetics Technologies, Ltd. Molecular counting
KR100823684B1 (ko) 2006-12-06 2008-04-21 한국전자통신연구원 바코드 ｄｎａ를 이용한 생물학적 표적 물질의 검출 방법
EP2201143B2 (en) 2007-09-21 2016-08-24 Katholieke Universiteit Leuven Tools and methods for genetic tests using next generation sequencing
US8268564B2 (en) 2007-09-26 2012-09-18 President And Fellows Of Harvard College Methods and applications for stitched DNA barcodes
US8586310B2 (en) 2008-09-05 2013-11-19 Washington University Method for multiplexed nucleic acid patch polymerase chain reaction
US8383345B2 (en) 2008-09-12 2013-02-26 University Of Washington Sequence tag directed subassembly of short sequencing reads into long sequencing reads
US9080211B2 (en) * 2008-10-24 2015-07-14 Epicentre Technologies Corporation Transposon end compositions and methods for modifying nucleic acids
WO2010056728A1 (en) 2008-11-11 2010-05-20 Helicos Biosciences Corporation Nucleic acid encoding for multiplex analysis
US8691509B2 (en) 2009-04-02 2014-04-08 Fluidigm Corporation Multi-primer amplification method for barcoding of target nucleic acids
US8481699B2 (en) 2009-07-14 2013-07-09 Academia Sinica Multiplex barcoded Paired-End ditag (mbPED) library construction for ultra high throughput sequencing
US20120015821A1 (en) * 2009-09-09 2012-01-19 Life Technologies Corporation Methods of Generating Gene Specific Libraries
US8835358B2 (en) 2009-12-15 2014-09-16 Cellular Research, Inc. Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse labels
US9315857B2 (en) 2009-12-15 2016-04-19 Cellular Research, Inc. Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse label-tags
US20110257031A1 (en) 2010-02-12 2011-10-20 Life Technologies Corporation Nucleic acid, biomolecule and polymer identifier codes
US9255291B2 (en) 2010-05-06 2016-02-09 Bioo Scientific Corporation Oligonucleotide ligation methods for improving data quality and throughput using massively parallel sequencing
US20120244525A1 (en) * 2010-07-19 2012-09-27 New England Biolabs, Inc. Oligonucleotide Adapters: Compositions and Methods of Use
PT2623613T (pt) 2010-09-21 2016-10-11 Population Genetics Tech Ltd Aumento da confiança da designação de alelos por contagem molecular
US8865404B2 (en) * 2010-11-05 2014-10-21 President And Fellows Of Harvard College Methods for sequencing nucleic acid molecules
WO2012103154A1 (en) * 2011-01-24 2012-08-02 Nugen Technologies, Inc. Stem-loop composite rna-dna adaptor-primers: compositions and methods for library generation, amplification and other downstream manipulations
EP3736281A1 (en) 2011-02-18 2020-11-11 Bio-Rad Laboratories, Inc. Compositions and methods for molecular labeling
HUE068153T2 (hu) 2011-04-15 2024-12-28 Univ Johns Hopkins Biztonságos szekvenálási rendszer
EP2710172B1 (en) 2011-05-20 2017-03-29 Fluidigm Corporation Nucleic acid encoding reactions
GB201113214D0 (en) 2011-07-29 2011-09-14 Univ East Anglia Analysing sequencing bias
GB2496016B (en) 2011-09-09 2016-03-16 Univ Leland Stanford Junior Methods for obtaining a sequence
CN108611398A (zh) * 2012-01-13 2018-10-02 Data生物有限公司 通过新一代测序进行基因分型
EP2828218B9 (en) 2012-03-20 2021-04-07 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Methods of lowering the error rate of massively parallel dna sequencing using duplex consensus sequencing
CA2872141C (en) 2012-05-31 2016-01-19 Board Of Regents, The University Of Texas System Method for accurate sequencing of dna
US20150011396A1 (en) * 2012-07-09 2015-01-08 Benjamin G. Schroeder Methods for creating directional bisulfite-converted nucleic acid libraries for next generation sequencing

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010030683A1 (en) * 2008-09-09 2010-03-18 Rosetta Inpharmatics Llc Methods of generating gene specific libraries
WO2011156529A2 (en) * 2010-06-08 2011-12-15 Nugen Technologies, Inc. Methods and composition for multiplex sequencing
WO2012129363A2 (en) * 2011-03-24 2012-09-27 President And Fellows Of Harvard College Single cell nucleic acid detection and analysis

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