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CN107405320B - 用于治疗癌症的包含金属乳酸盐的药物组合物 - Google Patents

用于治疗癌症的包含金属乳酸盐的药物组合物 Download PDF

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CN107405320B CN201580076775.XA CN201580076775A CN107405320B CN 107405320 B CN107405320 B CN 107405320B CN 201580076775 A CN201580076775 A CN 201580076775A CN 107405320 B CN107405320 B CN 107405320B
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J·J·沈
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Abstract

本发明涉及：用于治疗癌症的药物组合物，其包含金属乳酸盐作为活性成分，所述金属乳酸盐可以在癌细胞中解离成乳酸根，该乳酸根能够通过干扰癌细胞的代谢过程有效抑制例如癌细胞增殖、侵袭和转移的作用；用于抑制癌症转移的药物组合物；用于缓解癌症的食品组合物；以及用于治疗癌症的方法和用于抑制癌症转移的方法，两种方法都包括施用金属乳酸盐的步骤。本发明的金属乳酸盐通过干扰癌症的主要能量产生途径中的代谢过程来抑制癌细胞的生长和诱导癌细胞的死亡，并且抑制诱导对放射暴露的抗性的因子的表达，同时不具有副作用。因此，金属乳酸盐可以广泛应用于更有效的抗癌疗法。

Description

用于治疗癌症的包含金属乳酸盐的药物组合物
技术领域
本公开涉及用于治疗癌症的药物组合物，其包含金属乳酸盐，更具体地，本公开涉及用于治疗癌症的药物组合物，其包含能够解离成乳酸根的金属乳酸盐作为活性成分，该乳酸根可以干扰癌细胞的代谢并且由此有效地抑制癌细胞内例如癌细胞生长、侵袭和转移这样的活性；本公开还涉及抑制癌症转移的药物组合物，以及改善癌症的食品组合物。
背景
根据2011年公布的数据，据报道2011年韩国共发生218,017例癌症病例。男性发病率每100,000人约为439.2人，女性发病率每100,000人约为431.0人。癌症发病次序为胃癌、结肠直肠癌、肺癌、肝癌和乳癌。上述前5名的癌症占所有癌症发病率的50％以上。男性最常见的癌症依次是胃癌、结肠直肠癌、肺癌和肝癌，女性是乳癌、结肠直肠癌、胃癌和肺癌，甲状腺癌除外。如果韩国人寿命达到平均预期寿命，发生癌症的机会将达36.9％。推定5名男性中有2名(38.1％)并且3名女性中有1名(33.8％)可能发生癌症。韩国按世界标准人口调整的标准化年龄率(ASR)为每100,000人有295.1人，低于美国(318.0)或澳大利亚(323.0)、但高于OECD平均水平(271.5)的数据。据国家统计局的数据显示，2013年韩国癌症死亡人数为75344人，占总死亡人数的28.3％，并且预计癌症死亡率在2-3年内将增长8.8％。因此，为了治疗具有高发病率和死亡率的癌症，世界各地正在尝试多种治疗方法。到目前为止，手术和抗癌药疗法或放射治疗是积极治疗早期和晚期癌症的最佳选择。
对于手术治疗癌症，应通过肿瘤诊断来确定肿瘤的种类和类型。在大多数情况下，进行活检以用于诊断。手术是根除性治疗，其采用根除性的切除术除去肿瘤周围的所有淋巴结和原发性损害。优先进行根除性切除术，目的在于完全康复。死亡率因切除术而降低至1％至3％，并且患者的5年生存率提高了50％以上。然而，众所周知，接受手术的患者有复发的风险。此外，手术可能具有急性副作用，例如出血、肠梗阻、血管损伤、输尿管损伤、直肠破裂、肺炎和由并发症引起的肺栓塞，因此可能需要再次手术。化学治疗是使用药物、即抗癌药物治疗疾病，其应用于全身扩散的癌细胞。然而，大多数抗癌药被制备为抑制癌细胞的快速生长，并且因此将导致癌细胞损伤，并且还可能在较小程度上导致正常细胞损伤。而正常细胞例如血细胞、包括口腔的胃肠道上皮细胞、毛发细胞和快速分裂或增殖的生殖细胞都受到很大的影响，并且产生副作用，例如贫血、脱发和生育机能病。在严重的情况下，抗癌药可能会降低骨髓的功能，并且可能在2-3周治疗内引起感染，导致死于败血症。放射疗法是指用高能放射诱导癌组织细胞凋亡的治疗。这种治疗方法是允许患者保持正常生活的方法之一，但作为高能放射的副作用，可能会对局部区域的正常皮肤造成损害。在转移性癌症的情况下，癌症干细胞可能对放射具有抗性，并且可能发生复发或转移。
为了克服这些缺点，积极开展了将放射治疗与化学治疗或基因疗法相结合的治疗方法的研究。例如，韩国专利未审公开号KR2002-0042606公开了包含N-乙酰基植物鞘氨醇和二甲基植物鞘氨醇衍生物的放射增敏剂组合物，韩国专利未审公开号KR2003-0055878公开了包含神经酰胺及其衍生物和二甲基鞘氨醇的放射增敏剂，其为鞘氨醇激酶抑制剂，以及韩国专利号KR620751公开了包含丹皮酚及其药学上可接受的盐作为活性成分的放射增敏组合物。然而，在将放射治疗与上述抗癌药组合以改善放射治疗的治疗效果的情况下，除了放射治疗的副作用外，还可能发生抗癌药的毒性，例如在放射治疗部位的炎症、胃障碍、恶心、呕吐和腹泻。因此，抗癌药的应用是有限的。此外，已知由于免疫抑制环境，肿瘤不能完全被消除，并且复发的风险高。
因此，迫切需要开发易于应用于治疗癌症并且能够有效治疗癌症而对正常组织影响较小的新型治疗方法。根据最近的研究结果，已知癌细胞具有其自身的特性并且能够在保持该特性的同时持续生长。首先，癌细胞具有连续维持分化信号的特征。例如，通过维持β-连环蛋白信号传导的细胞分化和存活是众所周知的。正常细胞通过蛋白质遍在蛋白化抑制β-连环蛋白信号传导的过度产生，而癌细胞避免β-连环蛋白遍在蛋白化并且连续维持生长信号。其次，癌细胞具有通过使用葡萄糖的糖酵解产生过量乳酸以高效率产生能量的系统。第三，癌细胞具有避免细胞凋亡的特征。通过激活聚ADP核糖聚合酶(PARP)即细胞凋亡逃逸分子，癌细胞避免细胞凋亡，对多种基因靶向治疗具有抗性，并且持续维持肿瘤形成。第四，癌症侵袭或转移优良，也能通过血管发生创造其自身的环境。如果癌症持续生长，则肿瘤周围发生坏死，并且供氧减少，导致已知直接或间接涉及上述现象的缺氧诱导因子(HIF)-1α的增加。
针对上述癌症特征，已经基于细胞生长和转移抑制调节开发了多种抗癌药。然而，介导生长信号的酪氨酸激酶抑制剂显示出不令人满意的治疗结果和耐药性。在抗癌药的开发中，仍然难以找到有效抑制由复杂信号传导途径网络调节的癌细胞生长的方法。
在这些情况下，本公开的发明人研究和尝试开发了有效抑制癌细胞生长和治疗癌症的方法，并且作为结果，通过如下发现完成了本公开：能够解离成乳酸根的金属乳酸盐可以干扰癌细胞的代谢，并且因此在癌细胞内有效地抑制例如癌细胞的生长、侵袭和转移这样的活性，可用作抗癌药的活性成分。
概述
本公开努力提供了用于治疗癌症的药物组合物，其包含金属乳酸盐作为活性成分。
此外，本公开努力提供了用于抑制癌症转移的药物组合物，其包含金属乳酸盐作为活性成分。
此外，本公开努力提供了用于改善癌症的食品组合物，其包含金属乳酸盐作为活性成分。
此外，本公开努力提供了用于治疗癌症的方法，其包括施用金属乳酸盐。
此外，本公开努力提供了用于抑制癌症转移的方法，其包括施用金属乳酸盐。
根据本公开的示例性实施方案，本公开的金属乳酸盐没有副作用并且在主要能量产生中干扰代谢，以抑制癌细胞的生长，诱导细胞凋亡并且还抑制诱导耐放射的因子的表达，并且由此可广泛用于更有效的抗癌治疗。
附图简述
图1显示了比较乳酸钙、各自具有类似于乳酸钙的分子结构的乳酸钠和乳酸钾的结构和结合能的图和表。
图2提供了显示取决于是否用乳酸钙(CaLa)处理，比较癌细胞中钙水平的结果的荧光显微镜图像。
图3是显示取决于是否用乳酸钙(CaLa)处理，比较癌细胞中乳酸根水平的结果的图。
图4提供了显示用乳酸钙处理的癌细胞的细胞内和细胞外pH的变化的图，并且左图显示了癌细胞的细胞外pH的变化，并且右图显示了癌细胞的细胞内pH的变化。
图5的上部分提供了显示比较用多种浓度的乳酸钙处理的人结肠直肠癌细胞系(HCT-116、HT-29和DLD-1)中β-连环蛋白的mRNA表达水平的结果的电泳图像，并且图5的下部分提供了蛋白质印迹图像，其显示了比较用多种浓度的乳酸钙处理的人结肠直肠癌细胞系(HCT-116、HT-29和DLD-1)中β-连环蛋白的蛋白表达水平的结果。
图6提供了蛋白质印迹图像，其显示了用多种浓度的乳酸钙处理的人乳癌细胞系(MCF-7和MDA-MB-231)中总β-连环蛋白和活化的β-连环蛋白的蛋白表达水平的比较结果。
图7是实时PCR，以及蛋白质印迹显示在缺氧条件下乳酸钙在癌细胞系中的作用。该图显示葡萄糖转运蛋白(GLUT)-1和己糖激酶(HK)2的mRNA表达水平，其涉及糖酵解的早期阶段，以及显示HK2的蛋白表达水平的蛋白质印迹图像。
图8提供了显示乳酸钙对人乳癌细胞系(MCF-7和MDA-MB-231)中表达的PARP和切割的PARP的蛋白表达水平的影响的蛋白质印迹图像。
图9提供了显示比较用单独或组合的乳酸钙、作为碳酸酐酶抑制剂的5-茚满磺酰胺(IS)或作为MCT-4抑制剂的肉桂酸(CA)处理的结肠直肠癌细胞系中的PARP的蛋白表达水平(其为乳酸根流出途径)的结果的蛋白质印迹图像和图。
图10提供了蛋白质印迹图像，其显示了比较用多种浓度的乳酸钙处理的人黑素瘤细胞系(SKMEL-02和SKMEL-28)中PARP蛋白表达水平的结果。
图11a提供了显示取决于用乳酸钙处理的癌细胞系中LDH-B的蛋白表达水平变化的荧光显微镜图像。图11b提供了显示取决于用乳酸钙处理的癌细胞系的荧光吸收的荧光显微镜图像。图11c提供了取决于LDH-B的蛋白表达水平的显示荧光展开水平的定量分析图。
图12是显示取决于用乳酸钙处理的癌细胞中丙酮酸根浓度的变化的图。
图13a提供了荧光显微镜图像，其显示取决于乳酸钙处理的癌细胞系中PDH的蛋白表达水平的变化。图13b提供了取决于用乳酸钙处理的显示PDH的荧光展开水平的定量分析图。
图14a提供了定量分析图，其显示了在正常培养基中用乳酸钙处理的癌细胞系中α-KG的浓度变化。图14b提供了定量分析图，其显示了在不含谷氨酰胺的培养基中用乳酸钙处理的癌细胞系中α-KG的浓度变化。
图15(上部分)提供了蛋白质印迹图像，其显示了在常氧或缺氧条件下用或不用2.5mM乳酸钙处理培养24小时的人结肠直肠癌细胞系(HCT-116和HT-29)中HIF-1α蛋白的表达水平，图15的下部分提供了蛋白质印迹图像，其显示了在缺氧条件下用0.5mM、1.5mM和2.5mM乳酸钙培养24小时的人结肠直肠癌细胞系(HCT-116和HT-29)中HIF-1α蛋白的表达水平。
图16a提供了定量分析图，其显示了在常氧或缺氧条件下用或不用2.5mM乳酸钙培养24小时的人结肠直肠癌细胞系(HCT-116和HT-29)中VEGF的mRNA表达水平的测量结果。图16b提供了定量分析图，其显示了常氧或缺氧条件下用或不用2.5mM乳酸钙培养24小时的人结肠直肠癌细胞系(HCT-116和HT-29)中VEGF的蛋白表达水平的测量结果。
图17是显示了用多种浓度的乳酸钙处理的人血管内皮细胞(HUVEC)中的管形成水平的荧光图像。应用具有不同浓度的乳酸钙的培养的癌细胞系的培养基培养HUVEC。
图18提供了显示证实细胞迁移结果的照片，其显示了取决于是否用乳酸钙处理的结肠直肠癌细胞系的转移能力。
图19提供了显示证实细胞迁移结果的照片，其显示了取决于是否用乳酸钙处理的乳癌细胞系的转移能力。
图20提供了显示证实细胞迁移结果的照片，其显示了取决于是否用乳酸钙处理的黑素瘤细胞系的转移能力。
图21a提供了显示证实细胞迁移结果的照片，其显示了取决于是否用乳酸钙处理的乳癌细胞系(MCF-7)的转移能力。图21b提供了流式细胞术分析，其显示了未用乳酸钙处理的乳癌细胞系(MCF-7)的存活率。图21c提供了流式细胞术分析，其显示了用乳酸钙处理的乳癌细胞系(MCF-7)的存活率。图21d提供了显示证实细胞迁移结果的照片，其显示了取决于是否用乳酸钙处理的乳癌细胞系(MDA-MB231)的转移能力。图21e提供了流式细胞术分析，其显示了未用乳酸钙处理的乳癌细胞系(MDA-MB231)的存活率。图21f提供了流式细胞术分析，其显示了用乳酸钙处理的乳癌细胞系(MDA-MB231)的存活率。
图22提供了显示来自用乳酸钙处理的结肠直肠癌干细胞系的球体变化的显微图像。
图23提供了有代表性的图片和定量分析图(左：HCT-116，中间：HT-29，右：DLD-1)，其显示了取决于乳酸钙浓度的结肠直肠癌细胞系的集落形成能力的比较。
图24a提供了显示取决于乳酸钙的浓度的黑色素瘤细胞系SKMEL-02的集落形成能力的比较结果的图和表。图24b提供了取决于乳酸钙的浓度的黑色素瘤细胞系SKMEL-28的集落形成能力的比较结果的图和表。
图25a提供了定量分析图，其显示了单独用乳酸钙、作为碳酸酐酶抑制剂的5-茚满磺酰胺(IS)或作为MCT-4抑制剂的肉桂酸(CA)处理的结肠直肠癌细胞系的存活率的比较结果，其是乳酸根流出的途径。图25b提供了定量分析图，其显示了组合用乳酸钙、作为碳酸酐酶抑制剂的5-IS或作为MCT-4抑制剂的CA处理的结肠直肠癌细胞系的生存率的比较结果，其是乳酸根流出的途径。
图26提供了定量分析图，其显示了乳酸钙对于在超低粘性板中培养的结肠直肠癌细胞系的存活率的影响的比较结果。
图27是使用动物模型的乳酸钙处理试验方案的流程图。
图28是显示取决于乳酸钙的处理方法以及是否用乳酸钙处理的从异种移植动物模型的肿瘤组织提取的PARP蛋白的表达水平变化的图。
图29提供了显示从口服施用乳酸钙的动物模型的肿瘤组织中提取的蛋白质中，取决于是否用乳酸钙处理，HIF-1α或GAPDH的表达水平的变化的照片。
图30提供了显示在口服施用2.5mg乳酸钙的动物模型中取决于是否用乳酸钙处理的肿瘤体积变化的图。
图31提供了显示取决于是否在肿瘤周围用乳酸钙处理的从异种移植动物模型的肿瘤组织提取的蛋白质中HIF-1α或GAPDH的表达水平的变化的蛋白质印迹。
图32提供了显示取决于是否在肿瘤周围用2.5mM乳酸钙处理的肿瘤体积变化的图。
图33提供了显示取决于在肿瘤周围注射2.5mM乳酸钙的动物模型的肿瘤形态变化的有代表性的图片。
图34提供了显示在动物模型中取决于是否用乳酸钙处理的肿瘤体积变化的图，其中25mM乳酸钙在肩胛间区周围皮下注射。
图35提供了显示取决于乳酸钙处理的动物模型中肿瘤形态的变化的代表性的图片。
图36是使用动物模型对放射和乳酸钙组合治疗的试验方案的流程图。
图37a提供了显示取决于是否单独或组合用放射和乳酸钙处理的动物癌症模型中肿瘤体积随时间的变化的图，所述动物癌症模型通过将HT-29结肠直肠癌细胞系植入胁腹来制备。图37b提供了显示取决于是否单独或组合用放射和乳酸钙处理的动物癌症模型中肿瘤体积随时间变化的图，所述动物癌症模型通过将HCT-116结肠直肠癌细胞系植入胁腹来制备。
图38a显示了当用2.5mM乳酸钙和1μM、2.5μM和5μM伊马替尼单独或组合处理人结肠直肠癌细胞系(HT-29)时集落数量减少的比较结果。图38b显示了当用2.5mM乳酸钙和1μM、2.5μM和5μM伊马替尼单独或组合处理人结肠直肠癌细胞系(HT-29)时各集落形成抑制的比较结果。
图39a显示了当用2.5mM乳酸钙和1μM、2.5μM和5μM伊马替尼单独或组合处理人结肠直肠癌细胞系(HCT-116)时集落数量减少的比较结果。图39b显示了当用2.5mM乳酸钙和1μM、2.5μM和5μM伊马替尼单独或组合处理人结肠直肠癌细胞系(HCT-116)时各集落形成抑制的比较结果。
图40a显示了当用2.5mM乳酸钙和2.5μM、5μM和10μM 5-FU单独或组合处理人结肠直肠癌细胞系(HT-29)时集落数量减少的比较结果。图40b显示了当用2.5mM乳酸钙和2.5μM、5μM和10μM 5-FU单独或组合处理人结肠直肠癌细胞系(HT-29)时各集落形成抑制的比较结果。
图41a显示了当用2.5mM乳酸钙和2.5μM、5μM和10μM 5-FU单独或组合处理人结肠直肠癌细胞系(HCT-116)时集落数减少的比较结果。图41b显示了当用2.5mM乳酸钙和2.5μM、5μM和10μM 5-FU单独或组合处理人结肠直肠癌细胞系(HCT-116)时各集落形成抑制的比较结果。
图42a显示了当用2.5mM乳酸钙和0.63nM、1.3nM和2.5nM紫杉醇单独或组合处理人乳癌细胞系(MCF-7)时集落数量减少的比较结果。图42b显示了当用2.5mM乳酸钙和0.63nM、1.3nM和2.5nM紫杉醇单独或组合处理人乳癌细胞系(MCF-7)时各集落形成抑制的比较结果。
图43a显示了当用2.5mM乳酸钙和0.63nM、1.3nM和2.5nM紫杉醇单独或组合处理人肺癌细胞系(A549)时集落数量减少的比较结果。图43b显示了当用2.5mM乳酸钙和0.63nM、1.3nM和2.5nM紫杉醇单独或组合处理人肺癌细胞系(A549)时各集落形成抑制的比较结果。
图44a显示了当用2.5mM乳酸钙和1.3μM、2.5μM和5μM吉非替尼单独或组合处理人肺癌细胞系(A549)时集落数量减少的比较结果。图44b显示了当用2.5mM乳酸钙和1.3μM、2.5μM和5μM吉非替尼单独或组合处理人肺癌细胞系(A549)时各集落形成抑制的比较结果。
图45a显示了当用2.5mM乳酸钙和1μM、2.5μM和5μM索拉非尼单独或组合处理人肝细胞癌细胞系(Hep3B)时集落数量减少的比较结果。图45b显示了当用2.5mM乳酸钙和1μM、2.5μM和5μM索拉非尼单独或组合处理人类肝细胞癌细胞系(Hep3B)时各集落形成抑制的比较结果。
图46a显示了当用2.5mM乳酸钙和0.5μM、1μM和2μM的伊立替康单独或组合处理人结肠直肠癌细胞系(HT-29)时集落数量减少的比较结果。图46b显示了当用2.5mM乳酸钙和0.5μM、1μM和2μM的伊立替康单独或组合处理人结肠直肠癌细胞系(HT-29)时各集落形成抑制的比较结果。
图47a显示了当用2.5mM乳酸钙和0.5μM、1μM和2μM厄洛替尼单独或组合处理人肺癌细胞系(A549)时集落数量减少的比较结果。图47b显示了当用2.5mM乳酸钙和0.5μM、1μM和2μM厄洛替尼单独或组合处理人肺癌细胞系(A549)时各集落形成抑制的比较结果。
图48a显示了当用2.5mM乳酸钙和0.5μM、1μM和2μM舒尼替尼单独或组合处理人结肠直肠癌细胞系(HT-29)时集落数量减少的比较结果。图48b显示了当用2.5mM乳酸钙和0.5μM、1μM和2μM舒尼替尼单独或组合处理人结肠直肠癌细胞系(HT-29)时各集落形成抑制的比较结果。
图49a显示了当用2.5mM乳酸钙和5nM、10nM和20nM甲氨蝶呤单独或组合处理人肺癌细胞系(A549)时集落数量减少的比较结果。图49b显示了当用2.5mM乳酸钙和5nM、10nM和20nM甲氨蝶呤单独或组合处理人肺癌细胞系(A549)时各集落形成抑制的比较结果。
图50a显示了当用2.5mM乳酸钙和2.5μM、5μM和10μM卡铂单独或组合处理人肺癌细胞系(A549)时集落数量减少的比较结果。图50b显示了当用2.5mM乳酸钙和2.5μM、5μM和10μM卡铂单独或组合处理人肺癌细胞系(A549)时各集落形成抑制的比较结果。
图51a显示当用2.5mM乳酸钙和0.6nM、1.3nM和2.5nM多西他赛单独或组合处理人肺癌细胞系(A549)时集落数量减少的比较结果。图51b显示了当用2.5mM乳酸钙和0.6nM、1.3nM和2.5nM多西他赛单独或组合处理人肺癌细胞系(A549)时各集落形成抑制的结果比较。
图52a显示了当用2.5mM乳酸钙和2μM、4μM和8μM拉帕替尼单独或组合处理人乳癌细胞系(MCF-7)时集落数量减少的比较结果。图52b显示了当用2.5mM乳酸钙和2μM、4μM和8μM拉帕替尼单独或组合处理人乳癌细胞系(MCF-7)时各集落形成抑制的比较结果。
图53a显示了当用2.5mM乳酸钙和0.3nM、0.5nM和1nM依维莫司单独或组合处理人肾癌细胞系(Caki-1)时集落数量减少的比较结果。图53b显示了当用2.5mM乳酸钙和0.3nM、0.5nM和1nM依维莫司单独或组合处理人肾癌细胞系(Caki-1)时各集落形成抑制的比较结果。
图54a显示了当用2.5mM乳酸钙和0.23μg/mL、0.45μg/mL和1.8μg/mL曲妥珠单抗单独或组合处理人乳癌细胞系(MCF-7)时集落数量减少的比较结果。图54b显示了当用2.5mM乳酸钙和0.23μg/mL、0.45μg/mL和1.8μg/mL曲妥珠单抗单独或组合处理人乳癌细胞系(MCF-7)时各集落形成抑制的比较结果。
图55a显示了当用2.5mM乳酸钙和1.3μM、2.5μM和5μM奥沙利铂单独或组合处理人结肠直肠癌细胞系(HT-29)时集落数量减少的比较结果。图55b显示了当用2.5mM乳酸钙和1.3μM、2.5μM和5μM奥沙利铂单独或组合处理人结肠直肠癌细胞系(HT-29)时各集落形成抑制的比较结果。
详细描述
在下面的详细描述中，参考形成其一部分的附图。详细描述、附图和权利要求中描述的示例性实施方案并不意味着限定。在不脱离本文所呈现的主题的精神或范围的情况下，可以使用其它实施方案，并且可以进行其它改变。
本公开的发明人已经进行了多种研究，以开发通过有效抑制癌细胞的生长和转移并且关注癌细胞的代谢途径来治疗癌症的方法。在癌细胞中，通过其中不使用氧的糖酵解、而不是通过使用大量氧的线粒体呼吸链从葡萄糖产生能量。在癌症代谢过程中，大量产生乳酸根。然而，乳酸根的酸度导致癌细胞存活率低下。因此，剩余的乳酸根被输送至细胞外部。由于该原因，推定通过对癌症患者人工施用金属乳酸盐并且在癌细胞内积累乳酸根，累积的乳酸根可引起癌症的代谢紊乱或发展不利于癌症存活的癌症微环境，并且由此导致致命的损伤。
因此，将金属乳酸盐选作干扰癌细胞代谢的材料。这是因为预计由于通过糖酵解将葡萄糖转化为丙酮酸根，然后形成乳酸根，如果乳酸根可以蓄积在癌细胞中，则糖酵解可能减慢或停止。然而，乳酸根可以易于在体内降解，并且由此不能有效地转运到癌细胞。因此，预期乳酸根不能容易地在细胞外环境中降解，而是可以容易地被导入细胞中并且通过使用金属乳酸盐在其中有效地降解。
同时，本公开的发明人认为，在使用包含不容易在体内代谢的金属组分的金属乳酸盐的情况下，金属组分可能由于可能频繁地以大量施用的抗癌药物的特性而引起副作用，并且因此在多种金属乳酸盐中选出选自乳酸钠、乳酸钾和乳酸钙的金属乳酸盐，其对乳酸根具有极佳的结合力和极佳的乳酸根递送至不含不易于在体内代谢的金属组分的癌细胞的效率。结果证实，乳酸钙在乳酸根方面具有最高的结合力和对癌细胞的最高乳酸根输送效率，并且最终选择乳酸钙。
作为将选择的乳酸钙施用于癌细胞的结果，证实细胞中乳酸根、影响乳酸根代谢的LDH-B(乳酸脱氢酶B)、丙酮酸根、影响丙酮酸根代谢的PDH(丙酮酸脱氢酶)和α-KG(α-酮戊二酸根)的水平增加；细胞中作为癌生长因子的β-连环蛋白的水平、抑制胞内DNA损伤的PARP、影响癌细胞转移、侵袭和血管发生的HIF-1α(缺氧诱导因子1α)和VEGF(血管内皮生长因子)减少；并且癌细胞的生长、转移(迁移)和管形成的水平降低。
此外，使用动物模型测定乳酸钙的抗癌活性，并且证实在动物模型中施用乳酸钙抑制癌细胞的生长。
此外，在与常规放射组合施用的情况下，证实与常规情况相比，可以以降低的放射量获得相当的抗癌效果。此外，在与多种众所周知的抗癌药物组合施用于相关癌细胞系的情况下，证实与单独施用的情况相比，可以以降低浓度的抗癌药物获得更高的抗癌效果。
显示出这类抗癌活性的大部分金属乳酸盐可以在体内被代谢并且被称为没有副作用。因此，金属乳酸盐可以用作具有安全性和极佳抗癌活性的抗癌药物或保健食品的活性成分。这些金属乳酸盐的抗癌作用迄今为止未知，但是首次由本公开的发明人证实。
本公开的示例性实施方案提供了用于治疗癌症的药物组合物，其包含金属乳酸盐作为活性成分。
本文所用的术语“金属乳酸盐”是指以键合至金属离子的乳酸形式生产或合成的化合物。
在本公开中，如果将金属乳酸盐施用于癌细胞，则使用金属乳酸盐来解离成乳酸根，并且由此增加癌细胞中乳酸根的浓度。对用作本公开用于治疗癌症的药物组合物的活性成分的金属乳酸盐没有特别的限制，只要它们可以干扰癌细胞的代谢。在一个实例中，能够在细胞外形成稳定化合物并且解离成乳酸根并且由此增加癌细胞中乳酸根浓度的乳酸钙、乳酸锌、乳酸镁、乳酸钠、乳酸钾、乳酸亚铁、乳酸铬、乳酸铜和乳酸锰可以单独使用或组合使用。在另一个实例中，能够在细胞外形成稳定化合物并且离解出乳酸根并且由此增加癌细胞中乳酸根的浓度，而不含不容易在体内代谢的金属组分的乳酸钙、乳酸钠和乳酸钾可以单独使用或组合使用。在另一个实例中，能够在细胞外形成稳定的化合物并且解离成乳酸根并且由此在癌细胞中增加乳酸根浓度，具有极佳输送效率而不含不易于在体内代谢的金属组分的乳酸钙可以使用。
在本公开中，所有的乳酸钙、乳酸钠和乳酸钾均以金属乳酸盐的形式合成，并且证实这些金属乳酸盐可以在癌细胞中解离成乳酸根。特别是使用具有最高乳酸根输送效率的乳酸钙证实了多种抗癌活性。
然而，乳酸钙仅仅是本公开中提供的金属乳酸盐的一个实例。本公开中提供的金属乳酸盐不限于乳酸钙、并且显然可以使用多种金属乳酸盐作为根据本公开的用于治疗癌症的药物组合物的活性成分。
在与常规抗癌药物组合施用的情况下，金属乳酸盐可以显示改善的抗癌活性。这是因为常规抗癌药物不具有参与癌细胞糖酵解的机制。因此，对可与本公开中提供的治疗癌症的药物组合物组合施用的抗癌药物没有特别限定，只要它们不直接参与癌细胞的糖酵解即可。例如，可以使用伊马替尼、5-FU(5-氟尿嘧啶)、伊立替康、舒尼替尼、奥沙利铂、紫杉醇、拉帕替尼、曲妥珠单抗(赫赛汀)、吉非替尼、埃罗替尼、甲氨蝶呤、卡铂、多西他赛、依维莫司和索拉非尼，它们是众所周知的抗癌药；5-茚满磺酰胺(IS)，其为称作具有抗癌活性的碳酸酐酶抑制剂；和肉桂酸(CA)，其为单羧酸转运蛋白抑制剂。
此外，金属乳酸盐减少PARP、HIF-1α和VEGF的表达，它们在放射的情况下使得癌细胞对放射产生耐受性。因此，在将金属乳酸盐与放射组合施用的情况下，金属乳酸盐改善了放射的抗癌活性。因此，与常规情况相比，使用减少的放射量，能够获得相当的抗癌效果。在这种情况下，对于放射量没有特别限制，并且可以是每天2-10Gy。放射可以每天照射一次，或者可以通过分开放射量历经几天照射。
术语“乳酸钙”是指金属乳酸盐的类型，并且由C6H10O6Ca·5H2O表示，其中钙离子与乳酸根结合。乳酸钙在室温为白色粉末或颗粒形式，在120℃加热条件下为无水状态，并且具有5％(w/v)的溶解度。此外，乳酸钙具有极佳的生物利用度和身体吸收性，并且未被认为具有副作用，并且由此主要用作食品的钙增强剂或pH调节剂。
在本公开中，乳酸钙可以用作作为用于治疗癌症的药物组合物的活性成分的金属乳酸盐的实例。由于与乳酸根结合的钙比正常细胞更可吸收到癌细胞中，因此乳酸钙具有比其它类型的金属乳酸盐相对更高的向癌细胞递送效率的优点。
对可以用本公开中提供的药物组合物治疗的癌症没有特别的限定，只要可以通过干扰其代谢来抑制其生长，侵袭和转移。在一个实例中，可以包括实体癌，例如肺癌、乳癌、结肠直肠癌、胃癌、脑癌、胰腺癌、甲状腺癌、皮肤癌、骨癌、淋巴瘤、子宫癌、宫颈癌、肾癌和黑素瘤，它们的生长、侵袭和转移可以通过干扰糖酵解来抑制。在另一个实例中，可以包括结肠直肠癌、乳癌和黑素瘤，它们的生长、侵袭和转移可以通过用金属乳酸盐处理来抑制。
根据本公开的示例性实施方案，为了合成金属乳酸盐，在多种金属乳酸盐中，合成乳酸钙、乳酸钠和乳酸钾中的每一种，它们不含有在体内可能有害的金属。然后，通过与癌细胞的结合能和乳酸根递送效率的比较，证实乳酸钙对乳酸根的结合力最高，并且对癌细胞的乳酸根输送效率最高，并且最终选择乳酸钙(图1)。
在用选择的乳酸钙处理癌细胞的情况下，证实癌细胞中的钙浓度(图2)和乳酸根浓度(图3)增加，并且细胞中的pH降低(图4)。此外，证实根据基因解码抑制了作为癌生长因子的β-连环蛋白的表达(图5)，并且随着乳酸钙浓度的增加，β-连环蛋白和活化的β-连环蛋白两者都在蛋白质表达中降低(图6)。此外，证实在乳癌细胞系(图8)、结肠直肠癌细胞系(图9)和黑素瘤细胞系(图10)中，乳酸钙降低了修复胞内DNA损伤的PARP的蛋白质表达；增加了影响胞内乳酸根代谢的LDH-B(乳酸脱氢酶B)的蛋白质表达(图11a、11b和11c)，增加了丙酮酸根水平(图12)，增加了PDH(丙酮酸脱氢酶)的蛋白质表达(图13a和13b)和增加了α-KG(α-酮戊二酸根)水平(图14a和14b)；抑制影响癌细胞的转移、侵袭和血管发生的HIF-1α(缺氧诱导因子1α)(图15)和VEGF(血管内皮生长因子)(图16a和16b)的蛋白质表达，并且抑制HUVEC的管形成水平(图17)；抑制结肠直肠癌细胞系(图18)、乳癌细胞系(图19)和黑素瘤细胞系(图20)的细胞迁移；增加乳癌细胞系(图21a、21b、21c、21d和21e)和结肠直肠癌细胞系(图22)的细胞凋亡率；抑制结肠直肠癌细胞系(图23)和黑素瘤细胞系(图24a和24b)的集落形成能力；并且在与常规抗癌药组合施用的情况下提高抗癌效率(图25a和25b)。
此外，作为使用动物模型试验乳酸钙的抗癌活性的结果，证实在通过扩散结肠直肠癌细胞系制备的小鼠动物模型中，PARP降解活性增加(图28)，HIF-1α和VEGF的表达被抑制(图29和31)，肿瘤的生长被抑制(图30、32和34)，并且肿瘤体积减小，并且血管发生也减少(图33和35)。同时，作为与放射组合施用乳酸钙的结果，证实肿瘤的生长更有效地减少(图37a和37b)。
此外，在与用于治疗多种癌症的多种抗癌药物组合施用乳酸钙的情况下，证实与其中单独施用抗癌药物的情况相比，肿瘤的生长被更有效地抑制(图38a、38b-55a和55b)。
可以将本公开的药物组合物制备成用于治疗癌症的药物组合物的形式，并且还可以包含通常用于制备药物组合物的适合的载体、赋形剂或稀释剂。特别地，根据传统方法，可以将药物组合物配制成口服剂型，例如散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂、气雾剂、口腔贴剂等，外用制剂，外用贴剂，栓剂或无菌注射溶液的形式。在本公开中，可以包含在药物组合物中的载体、赋形剂和稀释剂可以是乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藓醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、无定形纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油。组合物的制剂可以涉及使用稀释剂或赋形剂，例如填充剂、增充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、表面活性剂等。用于口服施用的固体制剂可以包括片剂、贮库制剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂、口腔贴剂等。固体制剂可以通过将至少一种赋形剂例如淀粉，碳酸钙、蔗糖，乳糖或明胶等与其提取物和级分混合来制备。除了这样的一般赋形剂之外，还可以使用润滑剂如硬脂酸镁或滑石粉。用于口服施用的液体制剂可以包括混悬剂、体内使用的溶液剂、乳剂、糖浆剂等。除了一般的稀释剂例如水和液体石蜡之外，还可以包括不同的赋形剂，例如润湿剂、矫味剂、香料、防腐剂等。用于非肠道施用的制剂可以包括无菌水溶液剂、非水溶剂、混悬剂、乳剂、冻干制剂、外用贴剂或栓剂。非水溶液剂和混悬剂可以包含丙二醇、聚乙二醇、植物油例如橄榄油、可注射的酯例如油酸乙酯等。栓剂用基质可以包括witepsol、聚乙二醇、吐温61、可可脂、月桂精黄油(laurin butter)、甘油凝胶等。
包含在本公开的药物组合物中的金属乳酸盐的量可以是但不特别地限于0.0001wt％-50wt％，或更优选0.01wt％-20wt％，基于最终组合物的总重量。包含在单剂量的药物组合物中的金属乳酸盐的浓度可以是2.5mM至25mM。
本公开的药物组合物可以以药学有效量施用，并且如本文所用，术语“药学有效量”是指足以以合理的益处/风险比适用进行任何医学治疗或预防的治疗或预防疾病的量。有效剂量水平可以取决于疾病的严重性，药物的活性，患者的年龄、体重、健康状况和性别，对药物的敏感性，本公开组合物的施用时间、施用途径和排泄速率，治疗持续时间，同时使用或与本公开的组合物组合使用的药物，以及医疗领域中已知的其它因素来确定。本公开的药物组合物可以单独施用或与已知具有抗癌活性的其它公知的抗癌药物或组分组合施用。考虑到上述所有因素，重要的是以最小量施用组合物，其可显示最大效果而不引起副作用。
本公开的药物组合物的剂量可以由本领域技术人员考虑使用目的，疾病的严重程度，患者的年龄、体重、性别和既往症，用作活性成分的材料种类等来确定。本公开的药物组合物可以例如以每个成人约0.1ng至约1,000mg/kg的剂量或优选每个成年人1ng至约100mg/kg的剂量施用，并且本公开组合物的施用频率可以是但不特别地限于每天1次或每天几次分开的剂量。剂量或施用频率不以任何方式限制本公开的范围。
本公开的另一个示例性实施方案提供了治疗癌症的方法，包括向具有癌症的个体施用药学有效量的药物组合物的步骤。
本文所用的术语“个体”包括具有癌症的所有哺乳动物，包括小鼠、家畜和人以及农场鱼，但不限于此。
本文所用的术语“治疗”是指通过将本公开的包含作为活性成分的金属乳酸盐的药物组合物施用于具有癌症的个体来缓解或改善癌症症状的所有活动。
在本公开的治疗癌症的方法中，待治疗的癌症的种类与上述相同。
组合物可以以单一或多种剂型施用。在这种情况下，可以将组合物配制成液体、散剂、气雾剂、注射剂、输液(静脉滴注液)、胶囊剂、丸剂、片剂、栓剂或贴剂。
本公开用于治疗癌症的药物组合物可以通过任意常见途径施用，只要其能够到达靶组织即可。
取决于目的的不同，本公开的药物组合物可以通过腹膜内、静脉内、肌内、皮下、皮内、以透皮贴剂的形式、口服、鼻内、肺内或直肠内施用，但不特别限于此。然而，药物组合物可以以非配制的形式施用以便口服施用，并且由于金属乳酸盐在口服施用时可能被胃酸变性，所以用于口服施用的组合物的活性成分应当被包衣或配制以防止在胃中降解，或以用于口服施用的贴剂形式口服施用。此外，组合物可以使用能够将活性成分输送到靶细胞的特定装置来施用。
本公开的另一个示例性实施方案提供了用于治疗癌症的药物组合物，其包含金属乳酸盐和抗癌药物作为活性成分。
如上所述，本公开中提供的金属乳酸盐可以在与常规抗癌药组合施用的情况下显示出改善的抗癌活性。这是因为常规抗癌药物不具有参与癌细胞糖酵解的机制。因此，本公开中提供的包含金属乳酸盐的抗癌药物和公知的抗癌药物的活性成分可以更有效地用于治疗癌症。
本文中，金属乳酸盐、公知的抗癌药物、治疗癌症的药物组合物可以应用的癌症、剂量、施用方法等与上述相同。
本公开的又一示例性实施方案提供了用于抑制癌症转移的药物组合物，其包含金属乳酸盐作为活性成分。
本公开中提供的金属乳酸盐可以抑制可诱导癌细胞转移的多种特征，例如转移、侵袭、癌细胞的血管发生、管形成、细胞迁移、集落形成能力等，并且由此可以用作抑制癌症转移的药物组合物的活性成分。
本文中，转移抑制的靶癌与如上述定义的相同。例如，用于抑制癌症转移的药物组合物可用于抑制一种或多种转移性癌症的发生，其选自转移性肺癌、乳癌、结肠直肠癌、胃癌、脑癌、胰腺癌、甲状腺癌、皮肤癌、骨癌、淋巴瘤、子宫癌、宫颈癌、肾癌和黑素瘤。
根据本公开的一个示例性实施方案，当用作为本公开中提供的一种金属乳酸盐的乳酸钙处理多种癌细胞时，证实抑制了影响癌细胞的转移、侵袭和血管发生的HIF-1α(缺氧诱导因子1α)(图15)和VEGF(血管内皮生长因子)(图16)的蛋白质表达以及HUVEC的管形成水平(图17)；抑制了结肠直肠癌细胞系(图18)、乳癌细胞系(图19)和黑素瘤细胞系(图20)的细胞迁移；增加乳癌细胞系(图21)和结肠直肠癌细胞系(图22)的细胞凋亡率；并且抑制结肠直肠癌细胞系(图23)和黑素瘤细胞系(图24)的集落形成能力。
本公开的另一个示例性实施方案提供了用于改善癌症的食品组合物，其包含作为活性成分的金属乳酸盐。
金属乳酸盐通常用于体内代谢，并且乳酸钙被证实为没有副作用并且已经用作官方食品添加剂。因此，金属乳酸盐可以以可以每天食用的食品的形式摄取，并且可以促进癌症的改善。本文中，食品中包含的金属乳酸盐的量可以是但不特别地限于0.001wt％-10wt％或0.1wt％-1wt％，基于食品组合物的总重量。如果食物是饮料，则可以以1g-10g或2g-7g/100mL的比例包含金属乳酸盐。
此外，组合物还可以包含典型地用于食品组合物中以改善气味、味道、外观等的其它组分，例如维生素A、C、D、E、B1、B2、B6、B12、烟酸、生物素、叶酸、泛酸等。此外，组合物还可以包含矿物质，例如Zn、Fe、Ca、Cr、Mg、Mn、Cu等。此外，组合物还可以包含氨基酸，例如赖氨酸、色氨酸、半胱氨酸、缬氨酸等。此外，组合物还可以包含食品添加剂，例如防腐剂(山梨酸钾、苯甲酸钠、水杨酸、脱氢乙酸钠等)、消毒剂(漂白粉、高级漂白粉、次氯酸钠等)、抗氧化剂(丁羟茴香醚(BHA)，丁羟甲苯(BHT)等)、着色剂(焦油着色剂等)、显色剂(亚硝酸钠等)、漂白剂(亚硫酸钠)、调味料(谷氨酸一钠(MSG)等)、甜味剂(甘素、环氨酸盐(cyclemate)、糖精、钠等)、矫味剂(香草、内酯等)、溶胀剂(明矾、D-酒石酸氢钾等)、增强剂、乳化剂、增稠剂(粘合糊剂)、成膜剂、胶基剂、消泡剂、溶剂、改良剂等。食品添加剂可以根据食品的种类选择，并且以适量使用。
同时，可以使用用于改善癌症的包含金属乳酸盐的食品组合物来制备用于改善癌症的功能性食品。
特别地，可以使用食品组合物制备能够改善癌症的加工食品。可以将加工食品的实例制成饼干、饮料、酒精饮料、发酵食品、罐装食品、牛奶加工食品、肉加工食品或面条形式的功能性食品。本文中，饼干的实例包括饼干、馅饼、蛋糕、面包、糖果、胶冻、口香糖、谷物(膳食替代物，例如谷粒薄片)。饮料的实例包括饮用水、碳酸软饮料、功能性等渗饮料、果汁(例如苹果汁、梨汁、葡萄汁、芦荟汁、橘汁、桃汁、胡萝卜汁、番茄汁等)、甜稻米饮料等。酒精饮料的实例包括精制米酒、威士忌酒、烧酒(soju)(韩国蒸馏酒)、啤酒、酒、果酒等。发酵食品的实例包括酱油、豆酱、红辣椒酱等。罐装食品的实例包括海鲜罐装食品(例如罐装金枪鱼、鲭鱼、秋刀鱼、海螺等)、家畜罐装食品(罐装牛肉、猪肉、鸡肉、火鸡等)和农产品罐装食品(罐装玉米、桃子、菠萝等)。牛奶加工食品的实例包括奶酪、黄油、酸奶等。肉加工食品的实例包括猪排、牛排、鸡肉排、香肠、酸甜猪肉、肉块(nuggets)、烤牛肉(neobiani)等。面条的实例包括干面条、阳春面(plain noodles)、拉面、乌冬面、韩国冷面、密封和包装的新鲜面条等。此外，该组合物可用于制备蒸煮食品、汤等。
本文所用的术语“功能性食品”与术语“专用保健应用食品(FoSHU)”具有相同的含义，是指在药物和医疗中具有高效的食品，其被加工以便有效地表现出身体调节功能以及提供营养。可以以多种形式制备功能性食品，包括片剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、液体、丸剂等，以获得癌症改善的有用效果。
在下文中，将参考以下实施例更详细地描述本公开。然而，提供这些实施例仅用于示例性目的，但不旨在限制本公开的范围。
实施例1：金属乳酸盐的制备
使碳酸钙、碳酸钠或碳酸钾与乳酸根反应，分别得到金属乳酸盐(乳酸钙、乳酸钠或乳酸钾)溶液。将其各自过滤，干燥并且粉碎，得到粉末形式的金属乳酸盐(乳酸钙、乳酸钠或乳酸钾)。然后，分析得到的金属乳酸盐(乳酸钙、乳酸钠或乳酸钾)的结构和结合能(图1)。
图1显示了比较乳酸钙、乳酸钠和乳酸钾的结构和结合能的图和表，其各自具有类似于乳酸钙的分子结构。正如可以从图1中看出的，证实与乳酸钠和乳酸钾相比，乳酸钙具有相对较高的结合能。
在下文中，进行使用具有相对较高结合能的乳酸钙的试验。
实施例2：乳酸钙对肿瘤微环境的作用
在用乳酸钙处理癌细胞后，分析细胞中钙浓度的变化，乳酸根浓度的变化和pH的变化，以预测乳酸钙的流入水平。
实施例2-1：钙水平的变化
在37℃与5％CO2下用2.5mM乳酸钙处理在癌细胞培养基(包含10％FBS和1％青霉素/链霉素的RPMI1640培养基)中培养的细胞数为5×105个细胞的人结肠直肠癌细胞系的每一种(HCT-116和HT-29)，然后培养24小时。培养的癌细胞用10μM Fluo-3/AM钙指示剂和25％Pluronic F-127处理，在37℃反应30分钟，应用荧光探针，然后用共聚焦显微镜摄影(图2)。在这种情况下，未用乳酸钙处理的癌细胞用作对照组。
图2提供了显示取决于是否用乳酸钙(CaLa)处理的癌细胞中钙水平的比较结果的荧光显微镜图像。正如可以从图2中看出的，证实用乳酸钙处理的癌细胞中钙浓度增加。
实施例2-2：乳酸根水平的变化
将实施例2-1中培养的细胞再次在包含3mM(低)或11mM(正常)葡萄糖的培养基中培养。培养的细胞通过超声处理破碎。使用乳酸根测定试剂盒(AbCam，Cambridge，MA)测定包含在破碎的细胞中的乳酸根的浓度(图3)。在这种情况下，未用乳酸钙处理的癌细胞用作对照组。
图3是显示取决于是否用乳酸钙(CaLa)处理的癌细胞中的乳酸根水平的比较结果的图。正如可以从图3中看出的，证实无论培养基中包含的葡萄糖浓度如何，乳酸根浓度在用乳酸钙处理的癌细胞中增加，这种情况在具有高浓度葡萄糖的培养基中培养细胞的情况下更明显。
实施例2-3：癌细胞内部和外部的pH的变化
从图2和图3中所示的结果中证实在用乳酸钙处理癌细胞的情况下，乳酸钙流入癌细胞。然后，检查乳酸钙是否改变了癌细胞内外的pH。
特别地，对于实施例2-1中培养的细胞，用pH计对来自培养基的用乳酸钙处理然后培养的细胞测量胞外pH，并且用pH检测试剂盒(Life Technologies，CA)测定来自用乳酸钙处理然后培养的细胞的胞内pH(图4)。在这种情况下，未用乳酸钙处理的癌细胞用作对照组。
图4提供了显示用乳酸钙处理的癌细胞的胞内和胞外pH的变化的图，左图显示了癌细胞的胞外pH的变化，右图显示了癌细胞的胞内pH的变化。正如可以从图4中看出的，证实在用乳酸钙处理细胞的情况下，胞外pH没有变化，但胞内pH降低到酸性条件。正如可以从图4的左图看出的，乳酸钙自身并没有改变癌细胞外的pH，但是当乳酸钙流入癌细胞时，pH降低，因此乳酸钙的流入改变了癌细胞的胞内环境。
实施例3：乳酸钙对癌生长因子表达的影响
根据实施例2的结果，证实用乳酸钙可以改变癌细胞的胞内环境。因此，为了检查这样的变化是否导致癌细胞的生长发生变化，取决于用乳酸钙处理，检查在结肠直肠癌或乳癌细胞系中作为癌生长因子之一的β-连环蛋白在基因和蛋白表达水平上的表达水平。
实施例3-1：乳酸钙对结肠直肠癌细胞系中β-连环蛋白表达水平的影响
通过与实施例2-1相同的方法培养人结肠直肠癌细胞系(HCT-116、HT-29和DLD-1)，除了用0mM、1.5mM或2.5mM乳酸钙处理它们，并且得到培养的癌细胞。然后，在其中包含的mRNA和蛋白质的表达水平上，比较取决于乳酸钙浓度的β-连环蛋白的表达水平。
首先，为了比较mRNA表达水平，使用RNeasy小型试剂盒从每种癌细胞中提取总RNA，并且使用逆转录酶合成cDNA。通过逆转录酶PCR，使用合成的cDNA作为模板和下述引物获得β-连环蛋白的基因。
β-连环蛋白F：5’-AAAATGGCAGTGCGTTTAG-3’(SEQ ID NO:1)
β-连环蛋白R：5’-TTTGAAGGCAGTCTGTCGTA-3’(SEQ ID NO:2)
肌动蛋白F：5’-AAC-TGGAACGGTGAAGGT-3’(SEQ ID NO:3)
肌动蛋白R：5’-CCTGTAACAACGCATCTCAT-3’(SEQ ID NO:4)
图5的上部分提供了显示用多种浓度的乳酸钙处理的人结肠直肠癌细胞系(HCT-116、HT-29和DLD-1)中β-连环蛋白的mRNA表达水平的比较结果的电泳图像。图5的下部分提供了显示用多种浓度的乳酸钙处理的人结肠直肠癌细胞系(HCT-116、HT-29和DLD-1)中β-连环蛋白的蛋白表达水平的比较结果的蛋白质印迹图像。正如可以从图5的上部分看出的，取决于乳酸钙的浓度，β-连环蛋白的mRNA表达水平没有差异。
然后，为了比较蛋白表达水平，破碎每种癌细胞并且对其进行电泳。然后，使用抗-β-连环蛋白抗体作为初级抗体和抗兔IgG缀合物作为二次抗体进行蛋白质印迹(图5的下部分)，并且用Image-J程序分析印迹。在这种情况下，将肌动蛋白用作内部对照组。
图5的上部分提供了显示用多种浓度的乳酸钙处理的人结肠直肠癌细胞系(HCT-116、HT-29和DLD-1)中β-连环蛋白的mRNA表达水平的比较结果的电泳图像。图5的下部分提供了显示在多种浓度的乳酸钙处理的人结肠直肠癌细胞系(HCT-116、HT-29和DLD-1)中β-连环蛋白的蛋白表达水平的比较结果的蛋白质印迹图像。正如可以从图5的下部分看出的，证实随着乳酸钙浓度的增加，不同于β-连环蛋白的mRNA表达水平，β-连环蛋白的蛋白表达水平下降。
因此，证实流入癌细胞的乳酸钙改变了癌细胞的胞内环境，并且由此在基因解码水平上抑制了作为癌生长因子的β-连环蛋白的表达。
实施例3-2：乳酸钙对乳癌细胞系中β-连环蛋白表达水平的影响
使用与实施例3-1相同的方法，取决于乳酸钙的浓度，在蛋白表达水平上使用如下细胞系比较β-连环蛋白和活化的β-连环蛋白的表达水平(图6)：在37℃与5％CO2下在癌细胞培养基(包含10％FBS和1％青霉素/链霉素的RPMI1640培养基)中培养的人乳癌细胞系(MCF-7)和在37℃与5％CO2下在另外的癌细胞培养基(包含10％FBS和1％青霉素/链霉素的DMEM培养基)中培养的人乳癌细胞系(MDA-MB-231)。
图6提供了显示用多种浓度的乳酸钙处理的人乳癌细胞系(MCF-7和MDA-MB-231)中总β-连环蛋白和活化的β-连环蛋白的蛋白表达水平的比较结果的蛋白质印迹图像。正如可以从图6中看出的，证实随着乳酸钙浓度的增加，β-连环蛋白和活化的β-连环蛋白两者的蛋白表达水平都降低。
实施例4：乳酸钙对癌症能量学的影响
通过实施例2，证实当用乳酸钙处理癌细胞系时，癌细胞系中乳酸钙的浓度增加。然后，检查增加的乳酸根是否改变乳酸根合成。
在常氧或缺氧条件下培养人结肠直肠癌细胞系(HCT-116和HT-29)。用乳酸钙处理在缺氧条件下培养的细胞系，然后在mRNA和蛋白表达水平上比较每种培养的细胞系中GLUT1和HK2的表达水平(图7)。
图7是实时PCR和蛋白质印迹，其显示了在缺氧条件下癌细胞系中乳酸钙的作用。该图显示葡萄糖转运蛋白(GLUT)-1和己糖激酶(HK)2(参与糖酵解的早期阶段)的mRNA表达水平，并且蛋白质印迹图像显示了HK2的蛋白表达水平。正如可以从图7中看出的，证实在缺氧条件下，糖酵解早期阶段中起作用的GLUT1和HK2的表达水平升高，结果使糖酵解活化，但用乳酸钙处理的细胞系活化降低。
实施例5：乳酸钙导致的癌基因的稳定化分析
检查乳酸钙处理是否导致聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)的表达水平改变，所述的聚(ADP-核糖)聚合酶在维持作为修复受损基因的碱基切除途径的一部分的DNA的完整性中起重要作用。
实施例5-1：乳酸钙对乳癌细胞系中PARP表达水平的影响
通过与实施例2-1相同的方法培养人乳癌细胞系(MCF-7和MDA-MB-231)，除了用0mM、2.5mM或5.0mM乳酸钙处理，并且获得培养的癌细胞。然后，在其中包含的PARP的蛋白表达水平上分析取决于乳酸钙浓度的表达水平的变化(图8)。在这种情况下，使用Image-J程序与抗PARP抗体作为初级抗体和抗兔IgG缀合物作为二次抗体，通过蛋白质印迹分析表达水平的变化，并且使用GAPDH作为内部对照组。
图8提供了显示乳酸钙对人乳癌细胞系(MCF-7和MDA-MB-231)中表达的PARP和切割的PARP的蛋白表达水平的影响的蛋白质印迹图像。正如可以从图8中看出的，证实随着乳酸钙的浓度的增加，每种乳癌细胞系(MCF-7和MDA-MB-231)中的PARP的蛋白表达水平降低。同时，MCF-7细胞系中截短的PARP的蛋白表达水平升高。因此，证实乳酸钙不仅能够使癌细胞中的糖酵解停止，而且通过停止糖酵解来诱导癌细胞的细胞凋亡，并且由此可以用作抗癌药物。
实施例5-2：乳酸钙对结肠直肠癌细胞系中PARP的表达水平的影响
单独或与5mM乳酸钙、作为碳酸酐酶抑制剂的5-茚满磺酰胺(IS)或作为乳酸根途径的MCT-4抑制剂的肉桂酸(CA)组合处理人结肠直肠癌细胞系(HCT-116)24小时后，比较在结肠直肠癌细胞系中表达的PARP的蛋白表达水平(图9)。在这种情况下，未处理的癌细胞系用作对照组。
图9提供了蛋白质印迹图像和图，其显示了用乳酸钙、作为碳酸酐酶抑制剂的5-茚满磺酰胺(IS)或作为乳酸根途径的MCT-4抑制剂的肉桂酸(CA)单独或组合处理的结肠直肠癌细胞系中的PARP的蛋白表达水平的比较结果。正如可以从图9中看出的，证实了在仅用上述每种材料单独进行处理的情况下，仅当用单独的乳酸钙处理人结肠直肠癌细胞系时，PARP的蛋白表达水平降低。然而，证实当用组合两种抑制剂、而不用乳酸钙处理人结肠直肠癌细胞系时，PARP的蛋白表达水平降低，并且当用每种抑制剂和乳酸钙组合处理结肠直肠癌细胞系时，PARP的蛋白表达水平进一步降低，并且当用所有三种材料组合处理人结肠直肠癌细胞系时，在细胞中未检测到PARP。
实施例5-3：乳酸钙对黑素瘤细胞系中PARP的表达水平的影响
在37℃与5％CO2下，用0mM，0.5mM、1.0mM、2.5mM、5.0mM或10mM乳酸钙将癌细胞培养基(包含10％FBS和1％青霉素/链霉素的RPMI1640培养基)中培养的每种人黑素瘤细胞系(SKMEL-02和SKMEL-28)处理12小时。然后比较黑素瘤细胞系中表达的PARP的蛋白表达水平(图10)。
图10提供了蛋白质印迹图像，其显示了用多种浓度的乳酸钙处理的人黑素瘤细胞系(SKMEL-02和SKMEL-28)中PARP的蛋白表达水平的比较结果。正如可以从图10中看出的，证实随着乳酸钙的浓度增加，黑色素瘤细胞系中PARP的蛋白表达水平也降低。
实施例6：乳酸钙对癌细胞中乳酸根相关代谢的影响
根据图2和4所示的结果，证实当乳酸钙在癌细胞中流动时，细胞中乳酸根浓度增加，并且由此通过糖酵解的能量供给可能不能正常进行。
然后，检查乳酸根对乳酸钙处理引起的胞内代谢的影响。
实施例6-1：乳酸钙对LDH-B(乳酸脱氢酶B)的蛋白表达水平的影响
检查乳酸钙对作为用于乳酸根转化为丙酮酸根的酶的LDH-B(乳酸脱氢酶B)的蛋白表达水平的影响。
用2.5mM乳酸钙处理人结肠直肠癌细胞系(HCT-116和HT-29)并且培养24小时。将培养的癌细胞系用4％低聚甲醛固定，并且用抗兔LDHB抗体处理15小时。然后，用PBS洗涤该癌细胞系，并且用与生物素缀合的二次抗体处理，然后在室温反应2小时。然后，用与FITC缀合的链霉亲和素处理癌细胞系，以便进行荧光染色，然后用荧光显微镜拍照(图11a-11c)。在这种情况下，使用在常氧条件(N-对照)或缺氧条件(H-对照)下培养的癌细胞系作为对照组，并且使用DAPI染色每个细胞的细胞核。此外，使用Xenogen In Vivo Imaging System100系列和Living成像软件(Xenogen)分析照片。
图11a提供了显示取决于用乳酸钙处理的癌细胞系中LDH-B的蛋白表达水平变化的荧光显微镜图像。图11b提供了显示取决于用乳酸钙处理的癌细胞系的荧光吸收的荧光显微镜图像。图11c提供了显示取决于LDH-B的蛋白表达水平的荧光展开水平的定量分析图。正如可以从图11a-11c中看出的，证实乳酸钙处理的细胞中LDH-B的蛋白表达水平急剧增加。
实施例6-2：乳酸钙对丙酮酸根水平的影响
根据实施例6-1的结果，证实了通过用乳酸钙处理，癌细胞中LDH-B的蛋白表达水平升高。然后检查乳酸钙对LDH-B产生的丙酮酸根的胞内表达水平的影响。
用2.5mM乳酸钙将每种细胞数为5×105个细胞的人结肠直肠癌细胞系(HCT-116和HT-29)处理24小时，并且通过超声处理破碎细胞并且使用10kDa过滤器过滤以获得滤液。将获得的滤液应用于丙酮酸根测定试剂盒(Abcam，Cambridge，MA)以测定滤液中包含的丙酮酸根的浓度(图12)。
图12是显示取决于用乳酸钙处理的癌细胞中丙酮酸根浓度的变化的图。正如可以从图12中看出的，证实用乳酸钙处理的细胞中的丙酮酸根水平急剧增加。
实施例6-3：乳酸钙对PDH(丙酮酸脱氢酶)的蛋白表达水平的影响
根据实施例6-2的结果，证实通过用乳酸钙处理增加了癌细胞中的丙酮酸根水平。然后，检查乳酸钙对作为将丙酮酸根转化为TCA循环的酶PDH(丙酮酸脱氢酶)的蛋白表达水平的影响。
除了使用抗兔PDH抗体代替抗兔LDHB抗体，进行与实施例6-1相同的方法后，测定用乳酸钙处理的人结肠直肠癌细胞系(HCT-116和HT-29)中的PDH的蛋白表达水平(图13)。
图13a提供了荧光显微镜图像，其显示了取决于乳酸钙处理的癌细胞系中PDH的蛋白表达水平的变化。图13b提供了显示取决于用乳酸钙处理的PDH的荧光展开水平的定量分析图。正如可以从图13a和13b图中看出的，证实用乳酸钙处理的细胞中PDH的蛋白表达水平急剧增加。
实施例6-4：乳酸钙对α-KG(α-酮戊二酸根)水平的影响
根据实施例6-3的结果，证实了通过用乳酸钙处理，癌细胞中PDH的蛋白表达水平升高。然后，检查乳酸钙对由PDH激活的TCA循环产生的α-KG(α-酮戊二酸根)胞内水平的影响。α-KG可以在培养基中由谷氨酰胺合成。因此，在这种情况下，使用在正常培养基或不含谷氨酰胺的培养基中培养的癌细胞系。
用2.5mM乳酸钙将在正常培养基或无谷氨酰胺培养基中培养的细胞数为5×105个细胞的癌细胞系处理24小时，并且通过超声处理破碎细胞，并且使用10kDa的过滤器过滤以获得滤液。将获得的滤液应用于α-酮戊二酸根测定试剂盒(BioVision，Exton，PA)以测定滤液中包含的α-KG的浓度(图14a和14b)。
图14a提供了定量分析图，其显示在正常培养基中乳酸钙处理的癌细胞系中α-KG的浓度变化。图14b提供了定量分析图，其显示在不含谷氨酰胺的培养基中用乳酸钙处理的癌细胞系中α-KG的浓度变化。正如可以从图14a和14b中看出的，证实如果用乳酸钙处理用正常培养基或无谷氨酰胺培养基中培养的癌细胞系，则细胞中的α-KG水平急剧增加。
总结实施例6-1至6-4的结果，可以看出，在用乳酸钙处理的癌细胞中，用于将乳酸根转化为丙酮酸根的LDH-B、由LDH-B产生的丙酮酸根、用于将丙酮酸根转化为TCA循环的PDH(丙酮酸脱氢酶)和由PDH激活的TCA循环产生的α-KG的水平均增加。
实施例7：乳酸钙对癌细胞转移、侵袭和血管发生因子的表达水平的影响
根据实施例6的结果，证实了在用乳酸钙处理的癌细胞中，α-KG水平升高。然后，检查乳酸钙对影响癌细胞的转移、侵袭和血管发生的因子的表达水平的影响，其中蛋白表达水平由α-KG调节。
实施例7-1：乳酸钙对HIF-1α(缺氧诱导因子1α)的蛋白表达水平的影响
检查乳酸钙对称为癌细胞转移因子的HIF-1α(缺氧诱导因子1α)的蛋白表达水平的影响。
将用2.5mM乳酸钙处理或未用其处理的人结肠直肠癌细胞系(HCT-116和HT-29)在常氧或缺氧条件下培养24小时。然后，对每种培养的癌细胞系进行使用抗-HIF-1α抗体的蛋白质印迹(图15的上部分)。
图15的上部分提供了蛋白质印迹图像，其显示了在常氧或缺氧条件下在使用或不使用2.5mM乳酸钙处理培养24小时的人结肠直肠癌细胞系(HCT-116和HT-29)中表达的HIF-1α的蛋白表达水平。正如可以从图15的上部分看出的，证实HIF-1α在缺氧条件下表达，但如果用乳酸钙处理癌细胞系，即使在缺氧条件下也不表达HIF-1α。
然后，在缺氧条件下，用多种浓度(0.5mM、1.5mM和2.5mM)乳酸钙处理人结肠直肠癌细胞系(HCT-116和HT-29)，并且培养并且测定癌细胞核中的HIF-1α的表达水平的变化(图15的下部分)。
图15的下部分提供了蛋白质印迹图像，其显示了在缺氧条件下在用0.5mM、1.5mM和2.5mM乳酸钙处理的培养24小时的人结肠直肠癌细胞系(HCT-116和HT-29)中表达的HIF-1α的蛋白表达水平。正如可以从图15的下部分看出的，证实乳酸钙独立地抑制HIF-1α浓度的表达水平。
实施例7-2：乳酸钙对VEGF(血管内皮生长因子)的表达水平的影响
根据实施例7-1的结果，证实了乳酸钙独立地抑制HIF-1α浓度的表达水平。然后，检查乳酸钙对称作癌细胞侵袭因子(其表达受HIF-1α调节)的VEGF(血管内皮生长因子)的表达水平的影响。
在缺氧条件下用2.5mM乳酸钙处理人结肠直肠癌细胞系(HCT-116和HT-29)并且培养24小时。然后，分析每种培养的癌细胞系中VEGF的mRNA表达水平和蛋白表达水平(图16a和16b)。在这种情况下，使用在常氧或缺氧条件下未用乳酸钙处理的人结肠直肠癌细胞系作为对照组。
图16a提供了显示在常氧或缺氧条件下在用或不用2.5mM乳酸钙处理的培养24小时的人结肠直肠癌细胞系(HCT-116和HT-29)中表达的VEGF的mRNA表达水平和蛋白表达水平(图16b)的测量结果的图。正如从图16a和16b图中可以看出的，证实在缺氧条件下VEGF水平急剧增加，但是如果用乳酸钙处理癌细胞系，则增加的VEGF水平下降。
实施例7-3：乳酸钙对导致人血管内皮细胞(HUVEC)管形成的癌细胞衍生因子的影 响
为了证实乳酸钙对血管发生的影响，检查了乳酸钙对从可诱导人血管内皮细胞(HUVEC)的管形成的癌细胞分泌的因子的影响。
用0.5mM、1mM、1.5mM和2.5mM乳酸钙将加入1％FBS的RPMI-1640培养基中培养的癌细胞系处理24小时，由此获得培养上清液。将人血管内皮细胞(HUVEC)接种到获得的每种培养上清液中并且进行培养以分析细胞的构象变化(图17)。在这种情况下，使用不用乳酸钙处理而培养的癌细胞系的培养基培养的HUVEC作为对照组，并且使用用作为HUVEC生长抑制剂的莱菔硫烷处理培养的HUVEC作为比较组。
图17是显示用多种浓度的乳酸钙处理的人血管内皮细胞(HUVEC)中的管形成水平的荧光图像。使用培养的具有不同浓度的乳酸钙的癌细胞系的培养基培养HUVEC。正如从图17中可以看出的，证实与显示出极佳管形成能力的对照组相比，使用用乳酸钙处理的癌细胞系的培养上清液培养的HUVECs随着乳酸钙浓度的增加而降低管形成能力，并且用2.5mM乳酸钙处理的癌细胞系的培养上清液中培养的HUVEC显示与用莱菔硫烷处理的比较组相似的管形成能力降低。证实由于HUVEC的血管发生是由癌细胞分泌的因子诱导的，所以乳酸钙具有诱导血管发生的因子的浓度依赖性抑制活性。
总结实施例7-1至7-3的结果，可以看出乳酸钙具有抑制被称为癌细胞转移因子的HIF-1α和被称为癌细胞侵袭因子的VEGF的表达的作用并且还具有减少血管发生的作用。
实施例8：乳酸钙对癌细胞系转移和侵袭的作用
根据实施例7的结果，证实了乳酸钙具有抑制被称为癌细胞转移因子的HIF-1α和被称为癌细胞侵袭因子的VEGF的表达的作用，并且还具有抑制诱导血管发生的因子的活性的作用。然后，通过分析癌细胞的迁移来检查乳酸钙对癌细胞转移和侵袭的实际影响。
实施例8-1：乳酸钙对结肠直肠癌细胞系转移和侵袭的作用
将细胞数为4×105个细胞的结肠直肠癌细胞系HCT-116接种到其中心放置有厚度为500μM的ibidi培养插入物的培养容器中，并且用2.5mM乳酸钙处理，然后培养24小时。然后，取出插入物并且进一步培养12小时以分析使用JuLi Br活细胞分析仪(NanoEnTekInc.，South Korea)将癌细胞迁移至移除插入物的部位(图18)。在这种情况下，使用未用乳酸钙处理培养的结肠直肠癌细胞系作为对照组。
图18提供了显示证实细胞迁移的结果的照片，其显示取决于是否用乳酸钙处理的结肠直肠癌细胞系的转移能力。正如可以从图18中看出的，证实在用乳酸钙处理的结肠直肠癌细胞系中，细胞迁移减少，而在未用乳酸钙处理的对照组的结肠直肠癌细胞系中，维持细胞迁移。
实施例8-2：乳酸钙对乳癌细胞系转移和侵袭的作用
使用与实施例8-1相同的方法，用乳癌细胞系(MCF-7和MDA-MB231)代替结肠直肠癌细胞系，检查乳酸钙对乳癌细胞系迁移的作用(图19)。
图19提供了显示证实细胞迁移的结果的照片，其显示取决于是否用乳酸钙处理的乳癌细胞系的转移能力。正如可以从图19中看出的，证实与未用乳酸钙处理的对照组的乳癌细胞系相比，用乳酸钙处理的乳癌细胞系显示相对低的转移水平。
实施例8-3：乳酸钙对黑素瘤细胞系转移和侵袭的作用
使用与实施例8-1相同的方法，使用黑素瘤细胞系(SKMEL-02和SKMEL-28)代替结肠直肠癌细胞系，并且在除去插入物后进一步培养24小时，检查了乳酸钙对黑素瘤细胞系迁移的作用(图20)。
图20提供了显示证实细胞迁移的结果的照片，其显示取决于是否用乳酸钙处理的黑素瘤细胞系的转移能力。正如可以从图20中看出的，证实与未用乳酸钙处理的对照组的黑素瘤细胞系相比，用乳酸钙处理的黑素瘤细胞系显示相对低的转移水平。
总结实施例8-1至8-3的结果，可以看出，乳酸钙可以抑制所有癌细胞例如结肠直肠癌、乳癌和黑素瘤细胞的转移。
实施例9：乳酸钙对癌细胞系活力的影响
检查乳酸钙对乳癌细胞系、结肠直肠癌细胞系和黑素瘤细胞系的活力的影响。
实施例9-1：乳酸钙对乳癌细胞系活力的影响
将乳癌细胞系(MCF-7和MDA-MB231)在用或不用2.5mM乳酸钙处理的情况下培养24小时。用5μL FITC膜联蛋白V和5μL PI处理每种乳癌细胞系，并且在室温反应15分钟，然后使用FACS Calibur(BD Bioscience，USA)进行流式细胞术分析以评价其染色，并且由此测定癌细胞凋亡率(图21a-21f)。
图21a和21d提供了显示证实细胞迁移的结果的照片，其分别显示了取决于是否用乳酸钙处理的乳癌细胞系MCL-7细胞系和MDA-MB231细胞系的转移能力。图21b、21c、21e和21f提供了显示存活率变化的流式细胞术分析结果。正如可以从图21b和21c中看出的，证实在用乳酸钙处理之前，MCF-7细胞系显示9.63％的细胞凋亡率，但在用乳酸钙处理后显示出33.8％的细胞凋亡率，并且MDA-MB231细胞系(图21e和21f)在用乳酸钙处理之前显示10.17％的细胞凋亡率，但在用乳酸钙处理后显示出13.05％的细胞凋亡率。
因此，可以看出，如果用乳酸钙处理乳癌细胞系，则细胞凋亡率增加。
实施例9-2：乳酸钙对结肠直肠癌干细胞系构象变化的影响
将人结肠直肠癌干细胞系接种到干细胞培养基(包含1％青霉素/链霉素和50倍B27并且包含和以1:1混合的DMEM培养基和F12培养基的培养基)并且在37℃与5％CO2下培养。用乳酸钙处理培养的结肠直肠癌干细胞系，然后检查是否存在由干细胞形成的球体的构象变化(图22)。在这种情况下，使用用DMSO代替乳酸钙处理的癌细胞作为对照组。
图22提供了显示球体的构象变化的显微图像，这取决于用乳酸钙对构成球体的结肠直肠癌干细胞系的处理。正如从图22中可以看出的，证实在不用乳酸钙处理的对照组中，球体得以维持，但是用乳酸钙处理后，球体的构象被破坏，从而证实降低了结肠直肠癌干细胞的活力。
实施例9-3：乳酸钙对癌细胞系集落形成能力的影响
首先，将人结肠直肠癌细胞系(HCT-116、HT-29和DLD-1)接种到包含多种浓度(0mM，0.5mM、1.5mM或2.5mM)乳酸钙的固体培养基中，并且培养10天。培养完成后，将细胞固定并且用苏木素染色。然后，计数形成集落的癌细胞数(图23)。
图23提供了照片和图(左：HCT-116，中间：HT-29，右：DLD-1)，其显示了取决于用乳酸钙处理的结肠直肠癌细胞系的集落形成能力的比较结果。正如从图23中可以看出的，证实未用乳酸钙处理的所有结肠直肠癌细胞系形成260-360个集落，但随着乳酸钙浓度的增加，集落数量减少，而在用2.5mM乳酸钙处理结肠直肠癌细胞系的情况下，仅形成100-120个集落。
然后，使用与上述相同的方法，将人黑素瘤细胞系(SKMEL-02和SKMEL-28)接种到包含多种浓度(1mM、2.5mM或5mM)乳酸钙的固体培养基中，并且进行培养，并且计数形成集落的癌细胞数(图24a和24b)。
图24a和24b提供了显示取决于用乳酸钙处理的黑素瘤细胞系的集落形成能力的比较结果的图和表。正如可以从图24a和24b中看出的，证实未用乳酸钙处理的人黑素瘤细胞系形成105-168个集落，但是随着乳酸钙浓度的增加，集落数量减少，而在用5mM乳酸钙处理SKMEL-28细胞系的情况下，未形成集落，并且在用5mM的乳酸钙处理SKMEL-02细胞系的情况下，形成约49个集落。
总结结果可以看出，乳酸钙具有抑制结肠直肠癌和黑素瘤细胞系的集落形成能力的作用。
实施例9-4：乳酸钙与具有抗癌活性的材料的组合对癌细胞系的活力的影响
制备单独或组合的包含5mM乳酸钙或已知具有抗癌活性的材料(1mM IS(5-茚满磺酰胺)或5mM CA(肉桂酸))的基于半药物琼脂糖的板。然后，将人结肠直肠癌细胞系HCT116接种到每个制备的板中并且培养10天。然后比较细胞存活率(图25a&25b)。
图25a和25b提供了比较单独或与乳酸钙、作为碳酸酐酶抑制剂的5-茚满磺酰胺(IS)或作为是乳酸盐流出途径的MCT-4抑制剂的肉桂酸(CA)组合处理的结肠直肠癌细胞系的存活率的比较结果的图。正如从图25a和25b中可以看出的，证实用乳酸钙或已知具有抗癌活性的材料(IS或CA)分别处理的结肠直肠癌细胞系的存活率降低至约60％，并且用乳酸钙与IS或CA或两者组合处理的结肠直肠癌细胞的存活率进一步降低至约10％至30％。
实施例9-5：乳酸钙对具有细胞粘附性降低的癌细胞系的活力的影响
将人结肠直肠癌细胞系(HCT-116、HT-29和DLD-1)接种到具有低粘合性的6孔板中，然后用多种浓度(0mM、1.5mM或2.5mM)乳酸钙处理进行培养。然后比较细胞存活率(图26)。
图26提供了显示乳酸钙对于在粘附性低的培养容器中培养的结肠直肠癌细胞系的存活率的影响的比较结果的图。正如可以从图26中看出的，证实如果在粘附性低的培养基中未用乳酸钙处理培养的结肠直肠癌细胞系，则细胞凋亡率极低(约5％)，但是如果用乳酸钙处理，则细胞凋亡率急剧增加(约90％)。
总结实施例9-1至9-5的结果，可以看出，乳酸钙可以降低所有癌细胞如结肠直肠癌和黑素瘤细胞的存活率。
实施例10：使用动物模型验证乳酸钙的作用
实施例10-1：使用动物模型设定试验组
将在RPMI1640培养基中培养然后用PBS稀释的结肠直肠癌细胞(HT-29)皮下植入Balb/c小鼠的胁腹。饲养小鼠直至结肠直肠癌细胞生长至约5mm。然后，设置4个组：未用乳酸钙处理30天的对照组；通过口服施用而施用2.5mM乳酸钙的试验组1(口服，P.O.)；肿瘤周围注射了2.5mM乳酸钙的试验组2(肿瘤内部，I.T.)；以及皮下注射25mM乳酸钙的试验组3(皮下，S.C.)(图27)。
图27是使用动物模型的乳酸钙处理的试验方案的流程示例。
实施例10-2：PARP的表达水平的变化
从实施例10-1中设置的对照组、试验组1或试验组2的小鼠中提取结肠直肠癌组织，并且比较促成在其中表达的癌细胞的稳定化的PARP和截短的PARP的表达水平(图28)。
图28是显示取决于乳酸钙的处理方法以及是否用乳酸钙处理的从异种移植动物模型的肿瘤组织提取的PARP蛋白的表达水平的变化的图片。正如可以从图28中看出的，证实与未用乳酸钙处理的对照组相比，在以不同的方式用乳酸钙处理的试验组中PARP降解活性增加。
实施例10-3：通过口服施用来施用乳酸钙的动物模型中HIF-1α和VEGF的表达水平 的变化
从实施例10-1中设置的对照组或试验组1的小鼠中提取结肠直肠癌组织，并且比较涉及其中表达的肿瘤的转移、侵袭和血管发生的HIF-1α和VEGF的表达水平(图29)。在这种情况下，GAPDH被用作内部对照组。
图29提供了照片，其显示了在其中口服施用乳酸钙的动物模型的肿瘤组织中提取的蛋白质中，取决于是否用乳酸钙处理的HIF-1α或GAPDH的表达水平的变化。正如可以从图29中看出的，证实与未用乳酸钙处理的对照组相比，用乳酸钙处理的试验组1中HIF-1α和VEGF的表达被抑制。
实施例10-4：通过口服施用来施用乳酸钙的动物模型中肿瘤大小的变化
测量随时间变化的从实施例10-1中设置的对照组或试验组1的小鼠中提取的结肠直肠癌组织的体积，并且相互比较(图30)。
图30是显示在其中口服施用2.5mg乳酸钙的动物模型中取决于是否用乳酸钙处理的肿瘤体积变化的图。正如可以从图30中看出的，未用乳酸钙处理的对照组的最终肿瘤体积为约1200mm3×103，而用乳酸钙处理的试验组1的最终肿瘤体积为约480mm3×103。因此，可以看出，乳酸钙具有抑制肿瘤生长的作用。
实施例10-5：注射乳酸钙的动物模型中HIF-1α和VEGF的表达水平的变化
从实施例10-1设置的对照组或试验组2的小鼠中提取结肠直肠癌组织，并且比较其中涉及的肿瘤转移、侵袭和血管发生的HIF-1α和VEGF的表达水平(图31)。在这种情况下，GAPDH被用作内部对照组。
图31提供了蛋白质印迹，其显示了取决于是否在肿瘤周围用乳酸钙处理的从异种移植动物模型的肿瘤组织中提取的蛋白质中HIF-1α或GAPDH的表达水平的变化。正如可以从图31中看出的，证实与未用乳酸钙处理的对照组相比，在用乳酸钙处理的试验组2中，HIF-1α和VEGF的表达被抑制。
实施例10-6：注射乳酸钙的动物模型中肿瘤大小的变化
测量随时间的推移从实施例10-1中设置的对照组或试验组2的小鼠中提取的结肠直肠癌组织的体积，并且相互比较(图32)。
图32提供了显示肿瘤体积变化的图，这取决于是否在肿瘤周围用2.5mM乳酸钙处理。正如可以从图32中看出的，证实未用乳酸钙处理的对照组的最终肿瘤体积为约1200mm3×103，而用乳酸钙处理的试验组2的最终肿瘤体积为约490mm3×103。因此，可以看出乳酸钙具有抑制肿瘤生长的作用。
实施例10-7：取决于用乳酸钙处理的动物模型的肿瘤形态的变化
相互比较实施例10-1中设置的对照组或试验组2的小鼠的肿瘤形态(图33)。
图33提供了显示动物模型的肿瘤形态变化的照片，这取决于在肿瘤周围注射2.5mM乳酸钙。正如可以从图33中看出的，证实来自未用乳酸钙处理的对照组拍摄的肿瘤的表面具有较大的血管发生增加尺寸，而来自试验组拍摄的肿瘤尺寸随血管发生减少而减小。
实施例10-8：皮下注射乳酸钙的动物模型中肿瘤大小的变化
测量随时间的推移从实施例10-1中设置的对照组或试验组3的小鼠中提取的结肠直肠癌组织的体积，并且相互比较(图34)。
图34是显示取决于在动物模型中是否用乳酸钙处理的肿瘤体积变化的图，其中将25mM乳酸钙皮下注射在颈项周围。正如可以从图34中看到的，证实未用乳酸钙处理的对照组的最终肿瘤体积为约2300mm3，而用乳酸钙处理的试验组3的最终肿瘤体积为约80mm3。因此，可以看出，25mM乳酸钙具有抑制肿瘤生长的作用。
实施例10-9：取决于用乳酸钙处理的动物模型的肿瘤形态的变化
将实施例10-1中对照组或试验组3的小鼠的肿瘤形态进行相互比较(图35)。
图35提供了照片，其显示动物模型中肿瘤形态的变化，这取决于用25mM乳酸钙处理。正如可以从图35中看出的，证实来自未用25mM乳酸钙处理的对照组拍摄的肿瘤的表面具有较大的血管发生增加尺寸，而来自试验组3拍摄的肿瘤尺寸大大降低，并且血管发生也减少。因此，总结实施例10-1至10-9的结果，浓度为2.5mM-25mM的乳酸钙在动物模型中显示出极佳的抗癌活性。
实施例11：通过放射与施用乳酸钙组合治疗结肠直肠癌的效果
在实施例10-2、10-3和10-5中，证实了通过用乳酸钙处理，PARP、HIF-1α和VEGF的表达降低。此处，这些因子产生了耐放射。因此，如果由于乳酸钙而降低所述因子，则可以提高放射效率，这是经过验证的。
实施例11-1：使用动物模型的试验组设定
将结肠直肠癌细胞(HT-29或HCT-116)皮下植入小鼠的胁腹。饲养小鼠直至结肠直肠癌细胞生长至约5mm。然后，设定4个组；未用乳酸钙处理30天的对照组，用2.5mM乳酸钙注射的试验组11(肿瘤内，I.T)，使用安装2.0mM铝过滤器的X-RAD 320X-射线放射器(300kVp)以2Gy的放射照射5次的试验组12(IR)，和用2Gy放射照射5次并且同时注射2.5mM乳酸钙的试验组13(CaLa+IR)(图36)。
图36是使用动物模型的用放射和乳酸钙处理的试验方案的流程示例。
实施例11-2：用放射与乳酸钙组合处理的动物模型中肿瘤大小的变化
测量随时间的推移从实施例11-1中设置的对照组或每个试验组的小鼠中提取的结肠直肠癌组织的体积，并且相互比较(图37a和37b)。
图37a提供了显示取决于单独或组合用放射和乳酸钙处理的在动物癌症模型中肿瘤体积随时间的变化的图，所述动物癌症模型通过将HT-29结肠直肠癌细胞系植入到胁腹制备；并且图37b提供了显示取决于单独或组合用放射和乳酸钙处理的在动物癌症模型中肿瘤体积随时间的变化的图，所述动物癌症模型通过将HCT-116结肠直肠癌细胞系植入胁腹制备。
正如可以从图37a和37b中看出的，证实与未用放射和乳酸钙处理的对照组相比，在单独或组合使用放射和乳酸钙处理的试验组中，肿瘤生长得到抑制，与植入的结肠直肠癌细胞系的类型无关，并且特别是在用放射与乳酸钙组合处理的试验组13中，肿瘤的生长被抑制到最低水平。
该结果证实，用乳酸钙处理可以抑制耐放射因子的表达，并且经分析，在用乳酸钙与放射组合处理的情况下，抗癌治疗的效能可以得到改善，即使用更小剂量的放射也是如此。因此，乳酸钙可以单独用于治疗癌症。然而，可以看出，如果乳酸钙与放射照射组合施用，则可以获得增强的抗癌治疗效果。
实施例12：用众所周知的抗癌药与乳酸钙组合处理
通过实施例9-4，证实使用乳酸钙与显示抗癌活性的材料组合的处理与单独的乳酸钙或材料的处理相比降低了癌细胞的活力。基于此结果，验证了众所周知的抗癌药与乳酸钙组合对多种癌细胞系的治疗作用。
实施例12-1：用伊马替尼与乳酸钙组合处理
将细胞数为1×103个细胞的人结肠直肠癌细胞系(HT-29和HCT-116)接种到6孔板中的每个孔的RPMI1640培养基中。1天后，用新鲜培养基替换该培养基，并且用单独的2.5mM乳酸钙或1μM、2.5μM和5μM伊马替尼或用多种浓度(1μM、2.5μM和5μM)的伊马替尼与2.5mM乳酸钙组合处理细胞。然后比较细胞的集落形成能力。在这种情况下，未用任何药物处理的人结肠直肠癌细胞系(HT-29和HCT-116)用作对照组(图38a、38b、39a和39b)。
图38a显示了当用2.5mM乳酸钙和1μM、2.5μM和5μM的伊马替尼单独或组合处理人结肠直肠癌细胞系(HT-29)时，集落数减少的比较结果。图38b显示了当用2.5mM乳酸钙和1μM、2.5μM和5μM伊马替尼单独或组合处理人结肠直肠癌细胞系(HT 29)时，各集落形成抑制的比较结果。
图39a显示了当用2.5mM乳酸钙和1μM、2.5μM和5μM的伊马替尼单独或组合处理人结肠直肠癌细胞系(HCT-116)时，集落数减少的比较结果。图39b显示了当用2.5mM乳酸钙和1μM、2.5μM和5μM伊马替尼单独或组合处理人结肠直肠癌细胞系(HCT-116)时，各集落形成抑制的比较结果。正如可以从图38a、38b、39a和39b中看出的，证实与对照组相比，在单独用乳酸钙处理的组和单独用低浓度(1μM、2.5μM和5μM)伊马替尼处理的组中，癌细胞的集落形成能力被抑制，并且与单独用伊马替尼处理的组相比，在伊马替尼与乳酸钙组合处理的组中，集落形成能力被进一步抑制。
实施例12-2：用5-FU(5-氟尿嘧啶)与乳酸钙组合处理
将细胞数为1×103个细胞的人结肠直肠癌细胞系(HT-29和HCT-116)接种到6孔板中的每个孔的RPMI1640培养基中。1天后，用新鲜培养基替换该培养基，并且用2.5mM乳酸钙或2.5μM、5μM和10μM 5-FU单独处理或用多种浓度(2.5μM、5μM和10μM)的5-FU与2.5mM乳酸钙组合处理细胞。然后比较细胞的集落形成能力。在这种情况下，未用任何药物处理的人结肠直肠癌细胞系(HT-29和HCT-116)用作对照组(图40a、40b、41a和41b)。
图40a显示了当用2.5mM乳酸钙和2.5μM、5μM和10μM 5-FU单独或组合处理人结肠直肠癌细胞系(HT-29)时，集落数减少的比较结果。图40b显示了当用2.5mM乳酸钙和2.5μM、5μM和10μM 5-FU单独或组合处理人结肠直肠癌细胞系(HT-29)时，各集落形成抑制的比较结果。图41a显示了当用2.5mM乳酸钙和2.5μM、5μM和10μM 5-FU单独或组合处理人结肠直肠癌细胞系(HCT-116)时，集落数减少的比较结果。图41b显示了当用2.5mM乳酸钙和2.5μM、5μM和10μM 5-FU单独或组合处理人结肠直肠癌细胞系(HCT-116)时，各集落形成抑制的比较结果。正如可以从图40a、40b、41a和41b中看出的，证实与对照组相比，在单独用乳酸钙处理的组和单独用低浓度(2.5μM、5μM、10μM)5-FU处理的组中癌细胞的集落形成能力被抑制，并且与单独用5-FU处理的组相比，在用5-FU与乳酸钙组合处理的组中，集落形成能力被进一步抑制。
实施例12-3：用紫杉醇与乳酸钙组合处理
将细胞数为1×103个细胞的人乳癌细胞系(MCF-7)和人肺癌细胞系(A549)接种到6孔板中的每个孔的RPMI1640培养基中。1天后，用新鲜培养基替换该培养基，并且用单独的2.5mM乳酸钙或0.63nM、1.3nM和2.5nM紫杉醇处理或用多种浓度(0.63nM、1.3nM和2.5nM)的紫杉醇与2.5mM乳酸钙组合处理细胞。然后比较细胞的集落形成能力。在这种情况下，未用任何药物处理的人乳癌细胞系(MCF-7)和人肺癌细胞系(A549)用作对照组(图42a、42b、43a和43b)。
图42a显示了当用2.5mM乳酸钙和0.63nM、1.3nM和2.5nM紫杉醇单独或组合处理人乳癌细胞系(MCF-7)时，集落数减少的比较结果。图42b显示了当用2.5mM乳酸钙和0.63nM、1.3nM和2.5nM紫杉醇单独或组合处理人乳癌细胞系(MCF-7)时，各集落形成抑制的比较结果。正如可以从图42a和42b中看出的，证实与对照组相比，在用单独的乳酸钙处理的组和单独用低浓度(0.63nM、1.3nM和2.5nM)的紫杉醇处理的组中，癌细胞的集落形成能力被抑制，并且与单独用紫杉醇处理的组相比，在用紫杉醇与乳酸钙组合处理的组中，集落形成能力被进一步抑制。
图43a显示了当用2.5mM乳酸钙和0.63nM、1.3nM和2.5nM紫杉醇单独或组合处理人肺癌细胞系(A549)时，集落数减少的比较结果。图43b显示了当用2.5mM乳酸钙和0.63nM、1.3nM和2.5nM紫杉醇单独或组合处理人肺癌细胞系(A549)时，各集落形成抑制的比较结果。正如可以从图43a和43b中看出的，证实与对照组相比，在用单独的乳酸钙处理的组和单独用低浓度(0.63nM、1.3nM和2.5nM)的紫杉醇处理的组中，癌细胞的集落形成能力被抑制，并且与用紫杉醇单独处理的组相比，在用紫杉醇与乳酸钙组合处理的组中，集落形成能力被进一步抑制。
实施例12-4：用吉非替尼与乳酸钙组合处理
将细胞数为1×103个细胞的人肺癌细胞系(A549)接种到6孔板的每个孔的RPMI1640培养基中。1天后，用新鲜培养基替换该培养基，并且用单独的2.5mM乳酸钙或1.3μM、2.5μM和5μM吉非替尼或用多种浓度(1.3μM、2.5μM和5μM)的吉非替尼与2.5mM乳酸钙组合处理细胞。然后比较细胞的集落形成能力。在这种情况下，未用任何药物处理的人肺癌细胞系(A549)用作对照组(图44a和44b)。
图44a显示了当用2.5mM乳酸钙和1.3μM、2.5μM和5μM吉非替尼单独或组合处理人肺癌细胞系(A549)时，集落数减少的比较结果。图44b显示了当用2.5mM乳酸钙和1.3μM、2.5μM和5μM吉非替尼单独或组合处理人肺癌细胞系(A549)时，各集落形成抑制的比较结果。正如可以从图44a和44b中看出的，证实与对照组相比，在单独用乳酸钙处理的组和单独用低浓度(1.3μM、2.5μM、5μM)吉非替尼处理的组中，癌细胞的集落形成能力被抑制，并且与单独用吉非替尼处理的组相比，在用吉非替尼与乳酸钙组合处理的组中，集落形成能力被进一步抑制。
实施例12-5：用索拉非尼与乳酸钙组合处理
将细胞数为1×103个细胞的人肝癌细胞系(Hep3B)接种到6孔板的每个孔的RPMI1640培养基中。1天后，用新鲜培养基替换该培养基，并且用单独的2.5mM乳酸钙或1μM、2.5μM和5μM索拉非尼处理或用多种浓度(1μM、2.5μM和5μM)的索拉非尼与2.5mM乳酸钙组合处理细胞。然后比较细胞的集落形成能力。在这种情况下，未用任何药物处理的人肝癌细胞系(Hep3B)用作对照组(图45a和45b)。
图45a显示了当用2.5mM乳酸钙和1μM、2.5μM和5μM索拉非尼单独或组合处理人肝细胞癌细胞系(Hep3B)时，集落数减少的比较结果。图45b显示了当用2.5mM乳酸钙和1μM、2.5μM和5μM索拉非尼单独或组合处理人肝细胞癌细胞系(Hep3B)时，抑制各集落形成的比较结果。正如可以从图45a和45b中看出的，证实与对照组相比，在单独用乳酸钙处理的组和单独用低浓度(1μM、2.5μM、5μM)索拉非尼的组中，癌细胞的集落形成能力被抑制，并且与单独用索拉非尼处理的组相比，在用索拉非尼与乳酸钙组合处理的组中，集落形成能力被进一步抑制。
实施例12-6：用伊立替康与乳酸钙组合处理
将细胞数为1×103个细胞的人结肠直肠癌细胞系(HT-29)接种到6孔板的每个孔的RPMI1640培养基中。1天后，用新鲜培养基替换该培养基，并且用单独的2.5mM乳酸钙或0.5μM、1μM和2μM伊立替康或多种浓度(0.5μM、1μM和2μM)的伊立替康与2.5mM乳酸钙组合处理细胞。然后比较细胞的集落形成能力。在这种情况下，未用任何药物处理的人结肠直肠癌细胞系(HT-29)用作对照组(图46a和46b)。
图46a显示了当用2.5mM乳酸钙和0.5μM、1μM和2μM的伊立替康单独或组合处理人结肠直肠癌细胞系(HT-29)时，集落数减少的比较结果。图46b显示了当用2.5mM乳酸钙和0.5μM、1μM和2μM伊立替康单独或组合处理人结肠直肠癌细胞系(HT-29)时，各集落形成抑制的比较结果。正如可以从图46a和46b中看出的，证实与对照组相比，在单独用乳酸钙处理的组和单独用低浓度(0.5μM、1μM和2μM)的伊立替康处理的组中，癌细胞的集落形成能力被抑制，并且与单独用伊立替康处理的组相比，伊立替康与乳酸钙组合处理的组中，集落形成能力被进一步抑制。
实施例12-7：用厄洛替尼与乳酸钙组合处理
将细胞数为1×103个细胞的人肺癌细胞系(A549)接种到6孔板的每个孔的RPMI1640培养基中。1天后，用新鲜培养基替换该培养基，并且用单独的2.5mM乳酸钙或0.5μM、1μM和2μM的厄洛替尼处理或用多种浓度(0.5μM、1μM和2μM)的厄洛替尼与2.5mM乳酸钙组合处理细胞。然后比较细胞的集落形成能力。在这种情况下，未用任何药物处理的人肺癌细胞系(A549)用作对照组(图47a和47b)。
图47a显示了当用2.5mM乳酸钙和0.5μM、1μM和2μM厄洛替尼单独或组合处理人肺癌细胞系(A549)时，集落数减少的比较结果。图47b显示了当用2.5mM乳酸钙和0.5μM、1μM和2μM厄洛替尼单独或组合处理人肺癌细胞系(A549)时，各集落形成抑制的比较结果。正如可以从图47a和47b中看出的，证实与对照组相比，在单独用乳酸钙处理的组和单独用低浓度(0.5μM、1μM、2μM)厄洛替尼处理的组中，癌细胞的集落形成能力被抑制，并且与单独用厄洛替尼处理的组相比，使用厄洛替尼与乳酸钙组合处理的组中，集落形成能力被进一步抑制。
实施例12-8：用舒尼替尼与乳酸钙组合处理
将细胞数为1×103个细胞的人结肠直肠癌细胞系(HT-29)接种到6孔板的每个孔的RPMI1640培养基中。1天后，用新鲜培养基替换该培养基，并且用单独的2.5mM乳酸钙或0.5μM、1μM和2μM舒尼替尼处理或用多种浓度(0.5μM、1μM和2μM)的舒尼替尼与2.5mM乳酸钙组合处理细胞。然后比较细胞的集落形成能力。在这种情况下，未用任何药物处理的人结肠直肠癌细胞系(HT-29)用作对照组(图48a和48b)。
图48a显示了当用2.5mM乳酸钙和0.5μM、1μM和2μM舒尼替尼单独或组合处理人结肠直肠癌细胞系(HT-29)时，集落数减少的比较结果。图48b显示了当用2.5mM乳酸钙和0.5μM、1μM和2μM舒尼替尼单独或组合处理人结肠直肠癌细胞系(HT-29)时，各集落形成抑制的比较结果。正如可以从图48a和48b中看出的，证实了与对照组相比，在单独用乳酸钙处理的组和单独用低浓度(0.5μM、1μM和2μM)的舒尼替尼处理的组中，癌细胞的集落形成能力被抑制，并且与单独用舒尼替尼处理的组相比，在舒尼替尼与乳酸钙组合处理的组中，集落形成能力被进一步抑制。
实施例12-9：用甲氨蝶呤与乳酸钙组合处理
将细胞数为1×103个细胞的人肺癌细胞系(A549)接种到每个6孔板的每个孔的RPMI1640培养基中。1天后，用新鲜的培养基替换该培养基，并且用2.5mM乳酸钙或5nM、10nM和20nM甲氨蝶呤单独处理或用多种浓度(5nM、10nM和20nM)的甲氨蝶呤与2.5mM乳酸钙组合处理细胞。然后比较细胞的集落形成能力。在这种情况下，未用任何药物处理的人肺癌细胞系(A549)用作对照组(图49a和49b)。
图49a显示了当用2.5mM乳酸钙和5nM、10nM和20nM甲氨蝶呤单独或组合处理人肺癌细胞系(A549)时，集落数减少的比较结果。图49b显示了当用2.5mM乳酸钙和5nM、10nM和20nM甲氨蝶呤单独或组合处理人肺癌细胞系(A549)时，各集落形成抑制的比较结果。正如可以从图49a和49b中看出的，证实与对照组相比，在单独用乳酸钙处理的组和单独用低浓度(5nM、10nM和20nM)的甲氨蝶呤处理的组中，癌细胞的集落形成能力被抑制，并且与单独的甲氨蝶呤处理的组相比，用甲氨蝶呤与乳酸钙组合处理的组中，集落形成能力被进一步抑制。
实施例12-10：用卡铂与乳酸钙组合处理
将细胞数为1×103个细胞的人肺癌细胞系(A549)接种到6孔板的每个孔中的RPMI1640培养基中。1天后，用新鲜培养基替换该培养基，并且单独用2.5mM乳酸钙或2.5μM、5μM和10μM卡铂处理或用多种浓度(2.5μM、5μM和10μM)的卡铂与2.5mM乳酸钙组合处理细胞。然后比较细胞的集落形成能力。在这种情况下，未用任何药物处理的人肺癌细胞系(A549)用作对照组(图50a和50b)。
图50a显示了当用2.5mM乳酸钙和2.5μM、5μM和10μM卡铂单独或组合处理人肺癌细胞系(A549)时，集落数减少的比较结果。图50b显示了当用2.5mM乳酸钙和2.5μM、5μM和10μM卡铂单独或组合处理人肺癌细胞系(A549)时，各集落形成抑制的比较结果。正如可以从图50a和50b中看出的，证实与对照组相比，在单独用乳酸钙处理的组和单独用低浓度(2.5μM、5μM、10μM)卡铂处理的组中，癌细胞的集落形成能力被抑制，并且与单独用卡铂的组相比，在用卡铂和乳酸钙组合处理的组中，集落形成能力被进一步抑制。
实施例12-11：用多西他赛与乳酸钙组合处理
将细胞数为1×103个细胞的人肺癌细胞系(A549)接种到6孔板的每个孔中的RPMI1640培养基中。1天后，用新鲜培养基替换该培养基，并且单独用2.5mM乳酸钙或0.6nM、1.3nM和2.5nM多西他赛处理或用多种浓度(0.6nM、1.3nM和2.5nM)的多西他赛与2.5mM乳酸钙组合处理细胞。然后比较细胞的集落形成能力。在这种情况下，未用任何药物处理的人肺癌细胞系(A549)用作对照组(图51a和51b)。
图51a显示了当用2.5mM乳酸钙和0.6nM、1.3nM和2.5nM多西他赛单独或组合处理人肺癌细胞系(A549)时，集落数减少的比较结果。图51b显示了当用2.5mM乳酸钙和0.6nM、1.3nM和2.5nM多西他赛单独或组合处理人肺癌细胞系(A549)时，各集落形成抑制的比较结果。正如可以从图51a和51b中看出的，证实与对照组相比，在单独用乳酸钙处理的组和单独用低浓度(0.6nM、1.3nM和2.5nM)的多西他赛处理的组中，癌细胞的集落形成能力被抑制，并且与单独用多西他赛处理的组相比，用多西他赛与乳酸钙组合处理的组中，集落形成能力被进一步抑制。
实施例12-12：用拉帕替尼与乳酸钙组合处理
将细胞数为1×103个细胞的人乳癌细胞系(MCF-7)接种到6孔板中的每个孔的RPMI1640培养基中。1天后，用新鲜培养基替换该培养基，并且单独用2.5mM乳酸钙或2μM、4μM和8μM拉帕替尼处理或用多种浓度(2μM、4μM和8μM))的拉帕替尼与2.5mM乳酸钙组合处理细胞。然后比较细胞的集落形成能力。在这种情况下，将未用任何药物处理的人乳癌细胞系(MCF-7)用作对照组(图52a和52b)。
图52a显示了当用2.5mM乳酸钙和2μM、4μM和8μM拉帕替尼单独或组合处理人乳癌细胞系(MCF-7)时，集落数减少的比较结果。图52b显示了当用2.5mM乳酸钙和2μM、4μM和8μM拉帕替尼单独或组合处理人乳癌细胞系(MCF-7)时，各集落形成抑制的比较结果。正如可以从图52a和52b中看出的，证实与对照组相比，在单独用乳酸钙和单独用低浓度(2μM、4μM、8μM)的拉帕替尼处理的组中，癌细胞的集落形成能力被抑制，并且与单独用拉帕替尼处理的组相比，在用拉帕替尼和乳酸钙组合处理的组中，集落形成能力被进一步抑制。
实施例12-13：用依维莫司与乳酸钙组合处理
将细胞数为1×103个细胞的人肾癌细胞系(Caki-1)接种到6孔板中每个孔的RPMI1640培养基中。1天后，用新鲜培养基替换该培养基，并且单独用2.5mM乳酸钙或0.3nM、0.5nM和1nM依维莫司处理或用多种浓度(0.3nM、0.5nM和1nM)的依维莫司与2.5mM乳酸钙组合处理细胞。然后比较细胞的集落形成能力。在这种情况下，未用任何药物处理的人肾癌细胞系(Caki-1)用作对照组(图53a和53b)。
图53a显示了当用2.5mM乳酸钙和0.3nM、0.5nM和1nM依维莫司单独或组合处理人肾癌细胞系(Caki-1)时，集落数减少的比较结果。图53b显示了当用2.5mM乳酸钙和0.3nM、0.5nM和1nM依维莫司单独或组合处理人肾癌细胞系(Caki-1)时，各集落形成抑制的比较结果。正如可以从图53a和53b中看出的，证实与对照组相比，在单独用乳酸钙处理的组和单独用低浓度(0.3nM、0.5nM和1nM)的依维莫司处理的组中，癌细胞的集落形成能力被抑制，并且与单独用依维莫司处理组相比，在依维莫司和乳酸钙组合处理的组中，集落形成能力被进一步抑制。
实施例12-14：用曲妥珠单抗(赫赛汀)与乳酸钙组合处理
将细胞数为1×103个细胞的显示出对抗癌药曲妥珠单抗抗性的人乳癌细胞系(MCF-7)接种到6孔板中每个孔的RPMI1640培养基(包含1％胎牛血清+500ng/μL上皮生长因子)中。1天后，用新鲜培养基替换该培养基，并且单独用2.5mM乳酸钙或0.23μg/mL、0.45μg/mL和1.8μg/mL曲妥单抗处理或用多种浓度(0.23μg/mL、0.45μg/mL和1.8μg/mL)的曲妥珠单抗与2.5mM乳酸钙组合处理细胞。然后比较细胞的集落形成能力。在这种情况下，未用任何药物处理的人乳癌细胞系(MCF-7)用作对照组(图54a和54b)。
图54a显示了当用2.5mM乳酸钙和0.23μg/mL、0.45μg/mL和1.8μg/mL曲妥珠单抗单独或组合处理人乳癌细胞系(MCF-7)时，集落数减少的比较结果。图54b显示了当用2.5mM乳酸钙和0.23μg/mL、0.45μg/mL和1.8μg/mL曲妥珠单抗单独或组合处理人乳癌细胞系(MCF-7)时，各集落形成抑制的比较结果。正如可以从图54a和54b中看出的，证实与对照组相比，单独用乳酸钙处理的组中集落形成能力降低，但单独用低浓度(0.23μg/mL、0.45μg/mL、1.8μg/mL)的曲妥珠单抗处理的组与对照组相比集落形成能力几乎无差异。然而，证实与单独用未显示出抗癌作用的曲妥珠单抗处理组相比，在用0.23μg/mL、0.45μg/mL和1.8μg/mL曲妥珠单抗与乳酸钙组合处理的组中，显示出抑制的集落形成能力。
实施例12-15：用奥沙利铂与乳酸钙组合处理
将细胞数为1×103个细胞的人结肠直肠癌细胞系(HT-29)接种到6孔板中每个孔的RPMI1640培养基中。1天后，用新鲜培养基替换该培养基，并且单独用2.5mM乳酸钙或1.3μM、2.5μM和5μM奥沙利铂处理或用多种浓度(1.3μM、2.5μM和5μM)的奥沙利铂与2.5mM乳酸钙组合处理细胞。然后比较细胞的集落形成能力。在这种情况下，使用未用任何药物处理的人结肠直肠癌细胞系(HT-29)作为对照组(图55)。
图55a显示了当用2.5mM乳酸钙和1.3μM、2.5μM和5μM奥沙利铂单独或组合处理人结肠直肠癌细胞系(HT-29)时，集落数减少的比较结果。图55b显示了当用2.5mM乳酸钙和1.3μM、2.5μM和5μM奥沙利铂单独或组合处理人结肠直肠癌细胞系(HT-29)时，各集落形成抑制的比较结果。正如可以从图55a和55b中看出，证实了与对照组相比，在单独用乳酸钙处理的组和单独用低浓度(1.3μM、2.5μM、5μM)的奥沙利铂处理的组中，癌细胞的集落形成能力被抑制，并且与单独用奥沙利铂处理组相比，在用奥沙利铂和乳酸钙组合处理的组中，集落形成能力被进一步抑制。分析该结果表明，在用乳酸钙与众所周知的抗癌药组合处理的情况下，抗癌药处理的效能可以得到改善，即使用较少量的抗癌药。
因此，当用金属乳酸盐与众所周知的抗癌药组合处理癌细胞时，可以显示出增强的抗癌活性，即使当用单独的金属乳酸盐处理癌细胞时，也可以显示出抗癌活性。此外，从曲妥珠单抗的结果可以看出，可以进一步增加癌细胞对众所周知的抗癌药的敏感性。
Figure IDA0001386379190000011

Claims (10)

1.乳酸钙与已知的抗癌药的组合在制备用于治疗癌症的药物中的用途，其中抗癌药包括选自以下的一种或多种抗癌药：伊马替尼、5-氟尿嘧啶、伊立替康、舒尼替尼、奥沙利铂、紫杉醇、拉帕替尼、曲妥珠单抗、吉非替尼、厄洛替尼、甲氨蝶呤、卡铂、多西他赛、依维莫司、索拉非尼、5-茚满磺酰胺和肉桂酸，其中癌症选自肺癌、乳癌、结肠直肠癌、黑素瘤、脑癌、肝细胞癌和肾癌，其中乳酸钙配制用于注射或者作为口服药物包衣或配置用于防止在胃中降解。
2.根据权利要求1的用途，其中癌症选自肺癌、乳癌、结肠直肠癌、肝细胞癌、肾癌和黑素瘤。
3.根据权利要求2的用途，其中癌症是黑素瘤。
4.根据权利要求1-3任一项的用途，其中用于治疗癌症包括抑制癌症转移。
5.包含乳酸钙和药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂的药物组合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途，其中癌症选自肺癌、乳癌、结肠直肠癌、黑素瘤、脑癌、肝细胞癌和肾癌，并且其中将药物组合物配制成液体、粉末、气溶胶、贴剂、胶囊剂、丸剂、片剂、贮库制剂或栓剂，其中药物组合物还包含抗癌药，其中抗癌药包括选自以下的一种或多种抗癌药：伊马替尼、5-氟尿嘧啶、伊立替康、舒尼替尼、奥沙利铂、紫杉醇、拉帕替尼、曲妥珠单抗、吉非替尼、厄洛替尼、甲氨蝶呤、卡铂、多西他赛、依维莫司、索拉非尼、5-茚满磺酰胺和肉桂酸。
6.根据权利要求5的用途，其中将药物组合物配制用于注射，或者用于口服施用，所述用于口服施用的药物组合物是包衣的或配置用于防止在胃中降解的。
7.根据权利要求5或6的用途，其中用于治疗癌症包括抑制癌症转移。
8.根据权利要求7的用途，其抑制一种或多种转移性癌症的发生，所述转移性癌症选自转移性的肺癌、乳癌、结肠直肠癌、肾癌和黑素瘤。
9.根据权利要求6的用途，其中将用于注射的药物组合物配制成输液。
10.根据权利要求6的用途，其中将用于注射的药物组合物配制成静脉内滴注液施用。
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