CN107208036A

CN107208036A - 用于生产乙醇和酵母的方法

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Publication number: CN107208036A
Application number: CN201580014505.6A
Authority: CN
Inventors: J·黑德曼; K·谢哈德; J·桑德斯; J·克雷格; M·史蒂文斯; B·小维达尔; J·马修斯; S·克拉克; M·阿克曼; P·V·阿特菲尔德; P·J·L·贝尔
Original assignee: Microbiogen Pty Ltd; Novozymes AS
Current assignee: Microbiogen Pty Ltd; Novozymes AS
Priority date: 2014-03-21
Filing date: 2015-03-20
Publication date: 2017-09-26
Also published as: BR112016021704A2; WO2015143324A1; US20170145443A1; CA2938150A1; US10036043B2; EP3126531A1; AU2015231037B2; WO2015143317A1; US20170166934A1; AU2015231037A1; MX2016011984A

Abstract

本发明涉及通过如下步骤从含淀粉材料生产乙醇的方法：在高于初始糊化温度的温度下，使用α‑淀粉酶液化该含淀粉材料；使用葡糖淀粉酶进行糖化并且使用酿酒酵母酵母菌株(在澳大利亚维多利亚州国家计量研究所登录号V14/004037下保藏)或具有与该酿酒酵母菌株或具有菌株V14/004037的定义特性的酵母菌属菌株V14/004037的衍生物大致一样的性质的发酵生物菌株进行发酵。本发明还涉及在布达佩斯条约下保藏的并且具有NMI登录号V14/004037的酵母菌属酵母菌株或表现出菌株V14/004037的一种或多种定义特性的菌株V14/004037的衍生物。本发明还涉及使用本发明的酵母菌属菌株和包括本发明酵母菌属酵母菌株和天然发生的和/或非天然发生的组分的组合物，从本发明的乙醇方法中回收/提取油的方法。

Description

用于生产乙醇和酵母的方法

发明领域

本发明涉及多种方法，这些方法包括液化步骤，用于从含淀粉材料产生乙醇，使用酵母将可发酵糖转化为乙醇。本发明还涉及具有改进的将糖发酵为乙醇能力的酵母菌属菌株，涉及用于生产具有改进的将糖发酵为乙醇能力的酵母菌属菌株的方法，以及具有改进的将糖发酵为乙醇能力的酵母菌属酵母菌株在乙醇生产中的用途。本发明还涉及用于从乙醇生产方法的后段使用本发明的酵母菌属菌株回收/提取油的方法。最后，本发明涉及包括本发明的酵母菌属酵母菌株和天然发生的和/或非天然发生的组分的组合物。

对序列表的引用

本申请包含一个计算机可读形式的序列表。该计算机可读形式通过引用结合在此。

发明背景

从含淀粉材料生产乙醇是本领域中熟知的。生产作为生物燃料的乙醇已经成为了一大产业，其中2012年全世界生产了超过210亿加仑的乙醇。

工业上最常使用的商业方法，通常被称作“传统方法”，包括在高温(约85℃)下典型地使用一种细菌α-淀粉酶液化糊化淀粉，随后在葡糖淀粉酶和酿酒酵母的存在下厌氧进行同时糖化发酵。

用于生产用作燃料的乙醇的酵母，如在玉米乙醇工业中，要求若干特性，以确保乙醇有效生产的成本。这些特性包括乙醇耐受性、低副产品产量、快速发酵、和限制残留在发酵中的剩余糖量的能力。这些特性对工业方法的可行性具有明显的作用。

酵母菌属的酵母表现出生产乙醇所需的许多特性。具体而言，酿酒酵母菌株在燃料乙醇工业中广泛用于乙醇生产。酿酒酵母的菌株被广泛用于燃料乙醇工业，具有在发现于，例如，玉米醪发酵中的发酵条件下生产高产量乙醇的能力。这种菌株的实例是在称为Ethanol Red^TM的可商购乙醇酵母产品中使用的酵母。

将酿酒酵母的菌株用于燃料乙醇工业中来发酵糖如葡萄糖、果糖、蔗糖和麦芽糖，以通过糖酵解途径来生产乙醇。这些糖从如下来源中获得，如：玉米和其他谷物、糖汁、糖蜜、葡萄汁、果汁、和淀粉根菜类，并且可以包括将纤维素材料分解成葡萄糖。

尽管目前用于燃料乙醇工业中的酿酒酵母的菌株非常适合乙醇生产，但是由于作为燃料的乙醇的需求量增加，和玉米的新菌株中可用性的增加，对乙醇生产的效率的改进存在越来越多的需求。

因此，需要能够改进工业规模发酵中乙醇生产的效率的酵母菌属的新的菌株。与当前商业菌株(如，ETHANOL RED^TM)相比，还需要在发酵后减少乙醛水平的酵母菌属的新菌株。

此外，尽管在过去数十年乙醇生产方法有显著的改进，但是仍然希望并需要提供可以提供更高乙醇产量的从含淀粉材料生产乙醇的方法。

发明内容

本发明涉及使用酵母从含淀粉材料生产乙醇。

在第一方面，本发明涉及从含淀粉材料来生产乙醇的方法，这些方法包括以下步骤：

i)在高于初始糊化温度的温度下，使用α-淀粉酶液化该含淀粉材料；

ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；

iii)使用发酵生物进行发酵；

其中该发酵生物是酿酒酵母MBG4851(在澳大利亚维多利亚州国家计量研究所登录号V14/004037下保藏)或发酵生物菌株，该发酵生物菌株具有与酿酒酵母MBG4851或具有菌株V14/004037的定义特性的酵母菌属菌株V14/004037的衍生物大致一样的性质。

根据本发明的方法，具有与酿酒酵母MBG4851或具有菌株V14/004037的定义特性的酵母菌属菌株V14/004037(即，酿酒酵母MBG4851)的衍生物大致一样的性质的发酵生物菌株，尤其是酿酒酵母，具有以下性质和定义特性中的一种或多种，如所有：

-在相同方法条件下，与Ethanol Red^TM相比，增加乙醇产量；

-在相同方法条件下，与Ethanol Red^TM相比，产生降低水平的乳酸；

-在相同方法条件下，与Ethanol Red^TM相比，产生降低水平的甘油；

-在相同方法条件下，与Ethanol Red^TM相比，降低了发酵中乙醛水平；

-在相同方法条件下，与Ethanol Red^TM相比，增加油产量；

-在相同方法条件下，与Ethanol Red^TM相比，具有更快的发酵动力学。

在一个实施例中以及在本发明的一方面中，油是从发酵下游回收/提取的。该油回收/提取可以在本发明方法的后段进行，例如，在乙醇回收后，如从酒糟水和/或糖浆/蒸发的分离液中。回收可以，例如，通过提取，如己烷提取，或通过使用本领域中熟知的另外的油回收/提取技术进行。

在一方面，本发明涉及用于从本发明乙醇生产方法中回收/提取油的方法，该方法包括以下步骤：

ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；

iii使用发酵生物进行发酵。

iv)回收该发酵产物以形成全酒糟；

v)将该全酒糟分离为酒糟水和湿饼；

vi)任选地将该酒糟水浓缩为浆料；

其中油是从发酵步骤iii)下游回收/提取并且其中该发酵生物是酿酒酵母MBG4851(在澳大利亚维多利亚州国家计量研究所登录号V14/004037下保藏)或发酵生物菌株，该发酵生物菌株具有与酿酒酵母MBG4851或具有菌株V14/004037的定义特性的酵母菌属菌株V14/004037的衍生物大致一样的性质。

在一个实施例中，在糖化和/或发酵或SSF中添加蛋白酶。如实例40中所示，使用MBG4851增加油回收/提取并且当蛋白酶，具体而言金属蛋白酶，存在或添加时，油回收/提取会进一步增加。步骤ii)和iii)可以依序或同时进行。在一个优选实施例中，同时进行步骤ii)和iii)，即同时糖化发酵(SSF)。

根据本发明的乙醇生产方法，步骤i)中的液化是通过使含淀粉材料处于高于初始糊化温度的温度下，典型地在80℃-90℃之间，使用α-淀粉酶来进行的。液化的pH优选地是在4.5和6.0之间，如在4.8和5.8之间。α-淀粉酶的实例可以发现于下文的“液化过程中存在的和/或添加的α-淀粉酶”-部分中。在一个实施例中，该a-淀粉酶是热稳定性细菌α-淀粉酶。在一个优选的实施例中，该α-淀粉酶来自芽胞杆菌属，如嗜热脂肪芽孢杆菌菌株，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的一种变体，如WO 99/019467中的SEQ ID NO:3或在此的SEQID NO:1中所示的一种。适合的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体的实例可以在下文“热稳定性α-淀粉酶”部分中发现，并且包括来自具有以下突变的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体的下组中的一种：

-I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E；

-

I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；

-I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；

-I181*+G182*+N193F+V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；及

-

I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(使用SEQID NO:1进行编号)。

在pH 4.5和5.5，0.12mM CaCl₂下，与参照α-淀粉酶(被截断至约491个氨基酸的具有突变I181*+G182*+N193F的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶)相比，具有增加耐热性的其他适合的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的实例可以在通过引用结合在此的WO 2011/082425中发现。(还参见如下的实例1)

步骤i)中的液化可以使用α-淀粉酶和蛋白酶的组合来进行。该蛋白酶可以是这样一种蛋白酶，该蛋白酶具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的、超过20％的热稳定性值。适合的蛋白酶的实例描述于下文“液化过程中存在的和/或添加的蛋白酶”部分中。

该蛋白酶可以是真菌来源的，如丝状真菌来源的。适合的真菌蛋白酶的具体实例是从嗜热子嚢菌属的菌株衍生的金属蛋白酶，优选地金黄色嗜热子囊菌的菌株，尤其是菌株金黄色嗜热子囊菌CGMCC No.0670，其被披露为WO 2003/048353中披露为SEQ ID NO.2的成熟部分或WO 2010/008841中SEQ ID NO:1的成熟部分或在此具有以下突变的SEQ ID NO:3：

-D79L+S87P+A112P+D142L；

-D79L+S87P+D142L；或

-A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L。

其他适合的蛋白酶变体的实例可以发现于通过引用结合在此的WO 2011/072191中(还参见以下实例2)。

适合的蛋白酶还包括细菌蛋白酶。适合的细菌蛋白酶可以是从火球菌属菌株，优选地强烈火球菌菌株衍生。在一个优选实施例中，蛋白酶是US 6,358,726中的SEQ ID NO:1或在此的SEQ ID NO:13中示出的蛋白酶。

在一个优选的实施例中，在液化步骤i)中存在或添加0.5-50微克强烈火球菌蛋白酶/克DS，如1-5微克强烈火球菌蛋白酶/克DS，如约1.5或3微克强烈火球菌蛋白酶/克DS。

在本发明的实施例中，将液化步骤i)中添加的α-淀粉酶和/或蛋白酶进一步与葡糖淀粉酶组合。因此，在液化步骤i)期间，还可以存在和/或添加葡糖淀粉酶。该葡糖淀粉酶优选地是热稳定性的。这意味着在85℃，pH 5.3下，该葡糖淀粉酶具有至少20％，如至少30％，优选地至少35％的热稳定性，如在实例4(热稳定性)中描述进行测定。在一个实施例中，液化中存在的和/或添加的葡糖淀粉酶在pH 5.0下具有至少90％，优选地至少95％，优选地至少97％的相对活性pH最佳值。在一个实施例中，该葡糖淀粉酶在pH 5.0下具有至少80％、至少85％、至少90％的pH稳定性，如在实例4(pH最佳值)中描述进行测定。

根据本发明，液化步骤i)中存在的和/或添加的适合的葡糖淀粉酶可以衍生自青霉属菌株，尤其是披露为WO 2011/127802中SEQ ID NO:2或在此的SEQ ID NO:9或14的草酸青霉菌的菌株。在一个优选的实施例中，该葡糖淀粉酶是WO 2011/127802中SEQ ID NO:2所示的、具有K79V取代(使用SEQ ID NO:14中所示成熟序列进行编号)的草酸青霉菌葡糖淀粉酶，如WO 2013/053801中所披露的变体。在一个优选的实施例中，该草酸青霉菌葡糖淀粉酶具有K79V取代(使用SEQ ID NO:14进行编号)，并且进一步具有以下各项之一：

-P11F+T65A+Q327F；

-P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F(使用SEQ ID NO:14进行编号)。

其他适合的草酸青霉菌葡糖淀粉酶变体的实例可以发现于通过引用结合的WO2013/053801中(还参见以下实例15)。

在一个实施例中，在液化中使用的葡糖淀粉酶，如草酸青霉菌葡糖淀粉酶变体，具有在pH 4.0下如实例15中所描述的确定为DSC Td的至少70℃，优选地至少75℃、如至少80℃、如至少81℃、如至少82℃、如至少83℃、如至少84℃、如至少85℃、如至少86℃、如至少87％、如至少88℃、如至少89℃、如至少90℃的耐热性。在一个实施例中，该葡糖淀粉酶(如草酸青霉菌葡糖淀粉酶变体)具有在pH4.0下如实例15中所描述的确定为DSC Td的在70℃和95℃之间范围内的(如在80℃和90℃之间)耐热性。

在一个实施例中，在液化中使用的葡糖淀粉酶，如草酸青霉菌葡糖淀粉酶变体，具有在pH 4.8下如实例15中所描述的确定为DSC Td的至少70℃，优选地至少75℃、如至少80℃、如至少81℃、如至少82℃、如至少83℃、如至少84℃、如至少85℃、如至少86℃、如至少87％、如至少88℃、如至少89℃、如至少90℃、如至少91℃的耐热性。在一个实施例中，该葡糖淀粉酶(如草酸青霉菌葡糖淀粉酶变体)具有在pH 4.8下如实例15中所描述的确定为DSCTd的在70℃和95℃之间范围内的(如在80℃和90℃之间)耐热性。

在一个实施例中，液化中使用的葡糖淀粉酶，如草酸青霉菌葡糖淀粉酶变体，具有如实例16中描述所确定的至少100％，如至少105％、如至少110％、如至少115％、如至少120％、如至少125％的残余活性。在一个实施例中，该葡糖淀粉酶(如草酸青霉菌葡糖淀粉酶变体)具有如实例16中所描述的确定为残余活性的在100％和130％之间范围内的耐热性。

此外，根据本发明的方法，在液化期间，与α-淀粉酶、蛋白酶和/或葡糖淀粉酶组合，还可以存在支链淀粉酶。

根据本发明的方法，在糖化和/或发酵或同时糖化发酵中存在和/或添加葡糖淀粉酶。该葡糖淀粉酶可以与液化中使用的热稳定性葡糖淀粉酶相同。

在一个实施例中，在糖化和/或发酵中存在和/或添加的葡糖淀粉酶是真菌来源的，如丝状真菌来源的。在一个优选实施例中，葡糖淀粉酶源自曲霉属的菌株，优选黑曲霉、泡盛曲霉、或米曲霉；或木霉属的菌株，优选里氏木霉；或篮状菌属的菌株，优选埃默森篮状菌；或密孔菌属的菌株；或粘褶菌属的菌株，例如篱边粘褶菌或密粘褶菌，或黑层孔属的菌株。

在一个实施例中，该葡糖淀粉酶源自埃默森篮状菌，如在此的SEQ ID NO:19所示的那种。在另一个实施例中，糖化和/或发酵中存在和/或添加的葡糖淀粉酶源自篱边粘褶菌，如在此的SEQ ID NO:15所示的那种。在另一个实施例中，糖化和/或发酵中存在和/或添加的葡糖淀粉酶源自密粘褶菌，如在此的SEQ ID NO:17所示的那种。

在实施例中，该葡糖淀粉酶是WO 2014/177546(通过引用结合于此)中所披露的密粘褶菌葡糖淀粉酶的变体，尤其是具有以下取代之一的变体：V59A；S95P；A121P；T119W；S95P+A121P；V59A+S95P；S95P+T119W；V59A+S95P+A121P；或S95P+T119W+A121P，尤其是S95P+A121P(使用在此的SEQ ID NO:17进行编号)。

在一个优选的实施例中，在糖化和/或发酵中，与α-淀粉酶和任选地蛋白酶组合，存在和/或添加葡糖淀粉酶。该α-淀粉酶可以是真菌或细菌来源。

在糖化和/或发酵中，与葡糖淀粉酶组合，存在的和/或添加的α-淀粉酶可以源自根毛霉属菌株，优选地是微小根毛霉菌株，如WO 2013/006756中SEQ ID NO:3所示的一种，如具有黑曲霉接头和淀粉结合结构域的微小根毛霉α-淀粉酶杂合体，如在此的SEQ ID NO:16所示的那种。

在一个优选的实施例中，该α-淀粉酶源自微小根毛霉的菌株，优选地是具有黑曲霉葡糖淀粉酶连接子和淀粉结合域(SBD)的，优选地是披露为在此的SEQ ID NO:16的那种，优选具有以下取代中的一个或多个：G128D、D143N，优选G128D+D143N(使用SEQ ID NO:16进行编号)。

在一个实施例中，在糖化和/或发酵或SSF中存在和/或添加蛋白酶。这导致了增加的乙醇产量。如，例如，在美国专利号5,231,017(通过引用结合于此)中所描述的，该蛋白酶可以，例如，是酸性真菌蛋白酶。根据本发明的方法，在糖化和/或发酵或SSF中还可以存在和/或添加蛋白酶，以改进油产量。可以如实例40中所见，当添加蛋白酶(例如，实例40中所使用的蛋白酶X)时，该油产量增加。还可以使用其他蛋白酶。在一个实施例中，该蛋白酶时金属蛋白酶，如源自嗜热子嚢菌属菌株的那种，如金黄色嗜热子囊菌的菌株。当使用本发明的酵母菌株时，与使用Ethanol Red^TM的相应的方法相比，该油产量甚至增加更多。这描述于实例40中。可商购蛋白酶产品包括来自丹麦诺维信公司(Novozymes A/S,Denmark)的Olexa^TM。

在一个实施例中，本发明涉及用于从含淀粉材料来生产乙醇的方法，这些方法包括以下步骤：

i)在高于初始糊化温度的温度下，使用源自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶液化该含淀粉材料；

ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；

iii)使用发酵生物进行发酵；

其中该发酵生物具有以下性质中的一种或多种，如所有：

-在相同方法条件下，与Ethanol Red^TM相比，增加乙醇产量；

-在相同方法条件下，与Ethanol Red^TM相比，增加油产量；

在一个实施例中，该发酵生物是酿酒酵母MBG4851(在澳大利亚维多利亚州国家计量研究所登录号V14/004037下保藏)。

在一个实施例中，该发酵生物是具有与酿酒酵母MBG4851或具有菌株V14/004037的定义特性的酵母菌属菌株V14/004037的衍生物大致一样的性质的菌株。

在本发明的实施例中，在糖化、发酵或同时糖化发酵(SSF)中存在和/或添加纤维素分解组合物。此类组合物的实例可以发现于以下“在糖化和/或发酵期间存在和/或添加的纤维素分解组合物”部分中。在一个优选的实施例中，该纤维素分解组合物与葡糖淀粉酶一起存在和/或添加，如以下“在糖化和/或发酵中存在的和/或添加的葡糖淀粉酶”部分中所披露的一种葡糖淀粉酶。

第二方面提供了在布达佩斯条约下保藏的并且具有NMI登录号V14/004037的酵母菌属酵母菌株(酿酒酵母MBG4851)或具有与酿酒酵母MBG4851或具有菌株V14/004037的定义特性的酵母菌属菌株V14/004037的衍生物大致一样的性质的菌株。

第三方面提供了生产具有菌株V14/004037的定义特性的酵母属菌株的方法，该方法包括：

(a)提供：(i)第一酵母菌株；和(ii)第二酵母菌株，其中该第二酵母菌株是菌株V14/004037或菌株V14/004037的衍生物；

(b)在允许组合第一酵母菌株和第二酵母菌株之间的DNA的条件下，培养第一酵母菌株和第二酵母菌株；

(c)筛选或选择菌株V14/004037的衍生物；

(d)任选地用从步骤(c)筛选或选择的菌株作为第一和/或第二菌株重复步骤(b)和(c)，直到获得显示出菌株V14/004037的定义特性的衍生物。

第四方面提供了由第三方面的方法产生的酵母菌属菌株。

第五方面提供了生产乙醇的方法，该方法包括用包括可发酵糖的底物在促进可发酵糖发酵生成乙醇的条件下孵育第二或第四方面的菌株。

第六方面提供了第二或第四方面的菌株在乙醇生产中的用途。

第七方面提供了生产蒸馏酒糟的方法，该方法包括：

(a)用包括可发酵糖的底物在允许可发酵糖发酵生成乙醇和蒸馏酒糟的条件下，孵育第二或第四方面的酵母菌属菌株；

(b)分离该蒸馏酒糟。

第八方面提供了由第七方面的方法产生的蒸馏酒糟。

第九方面提供了第二或第四方面的菌株在蒸馏酒糟生产中的用途。

第十方面提供了第二或第四方面的菌株在生产显示出菌株V14/004037的一种或多种定义特性的酵母菌属菌株中的用途。

第十一方面提供了包括第二或第四方面的酵母菌属菌株的组合物。

第十二方面提供了在第一方面的方法中使用第二或第四方面的酵母菌属菌株的方法。

在第十三方面中，本发明涉及菌株V14/004037(酿酒酵母MBG4851)或菌株V14/004037的衍生物在相同的方法条件下，与Ethanol Red^TM相比，用于减少发酵中乙醛水平的用途。

最后，本发明还涉及包括本发明的酵母菌属酵母菌株(例如，MBG4851或其衍生物)和天然发生的和/或非天然发生的组分的组合物。

附图简述

图1示出在用α-淀粉酶A液化的1L玉米醪发酵期间的乳酸滴度水平。

图2示出在用α-淀粉酶(2.1μg EP AA369/gDS)、葡糖淀粉酶(4.5μg EP PoAMG498/g DS)和0.0385μg EP Pfu/g Ds的共混物液化的1L玉米醪发酵期间的乳酸水平。

图3示出在发酵中甘油水平，在工业制备的α-淀粉酶A液化的玉米醪中比较MBG4851与Ethanol Red^TM(ER)。

图4示出在发酵中甘油水平，在工业制备的用α-淀粉酶(2.1μg EP AA369/gDS)、葡糖淀粉酶(4.5μg EP PoAMG498/g DS)和0.0385μg EP Pfu/g Ds的共混物液化的玉米醪中比较MBG4851与Ethanol Red(ER)。

图5和6示出在玉米醪发酵20小时、44小时和50小时后，通过菌株V14/004037(黑色)和Ethanol Red^TM(灰色)的乙醇生产(顶部)和葡萄糖消耗(底部)的图。

发明详述

本发明的方法

在此方面，本发明涉及在包括液化、糖化和发酵的过程中从含淀粉材料生产乙醇。在发酵期间，通过酵母将在糖化期间产生的可发酵糖转化为乙醇。

ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；

iii)使用发酵生物进行发酵；

其中该发酵生物是酿酒酵母MBG4851(在澳大利亚维多利亚州国家计量研究所登录号V14/004037下保藏)或一种发酵生物菌株，该发酵生物菌株具有与酿酒酵母MBG4851或具有菌株V14/004037的定义特性的酵母菌属菌株V14/004037的衍生物大致一样的性质。

步骤ii)和iii)可以依序或同时(SSF)进行。在一个优选的实施例中，步骤ii)和iii)同时(SSF)进行。

在发酵期间添加的氮源

一般，发酵生物体如酵母(包括酿酒酵母)需要充分的氮源用于增殖和发酵。可使用许多氮源，且这些氮源是本领域熟知的。根据本发明，该氮源可以是有机的，如尿素、DDG、湿滤饼(wet cake)或玉米醪(corn mash)，或无机的，如氨或氢氧化铵。在一个优选的实施例中，该氮源是尿素。

在本发明的一个实施例中，在糖化和/或发酵或SSF中可以添加少于3,000ppm，如少于2,000ppm、如少于1,000ppm、如少于800ppm、如少于600ppm、如少于500ppm、如少于400ppm、如少于300ppm、如少于200ppm、如少于100ppm氮源，尤其是尿素。

在一个优选的实施例中，在糖化和/或发酵或同时糖化发酵(SSF)中可以添加从100至600ppm的氮源，如尿素。

在本发明的一个实施例中，在糖化和/或发酵或SSF中，没有添加氮源，如尿素。

诸位发明人令人惊讶地发现，当使用酵母菌属MBG4851酵母时，与使用工业标准酵母Ethanol Red^TM(ER)相比，在发酵或SSF中，减少了添加补充的氮源(如尿素)的需要。例如，当在添加3μg PfuS/g Ds液化的醪液中使用MBG4851时，不需要添加的尿素来发酵至干燥。此外，该MBG4851酵母比Ethanol Red^TM酵母提供了乙醇产量的至少1％的增加。这点在以下实例中进行了描述。

减少的所产生的乳酸

诸位发明人还发现，当在液化的醪液中使用酵母菌属MBG4851酵母时，在发酵期间获得乳酸累积减少约15％-20％。这将帮助减少乙醇工厂经历的一些问题并且将增加乙醇产量。以下工作实例显示出，当使用MBG4851酵母时，与使用工业标准酵母Ethanol Red^TM(ER)的发酵相比，不同α-淀粉酶液化的醪液的发酵在发酵结束时给出了较低乳酸。

减少的甘油

诸位发明人还出人意料地发现，与Ethanol Red^TM(ER)相比，用MBG4851酵母发酵导致减少的甘油水平。例如，当发酵中存在0至3,000ppm之间尿素时，在用α-淀粉酶液化的玉米醪54小时发酵后，将MBG4851与Ethanol Red^TM(ER)进行比较时，甘油水平减少了至少10％(参见实例31)。通常，以下工作实例显示出，当使用MBG4851酵母时，与使用工业标准酵母Ethanol Red^TM(ER)的发酵相比，用不同α-淀粉酶制备的醪液的发酵在发酵结束时给出了较低的甘油水平。

降低的乙醛水平

诸位发明人令人惊讶地发现，与当在相同条件下用Ethanol Red^TM(ER)发酵时相比，用MBG4851酵母的发酵导致发酵中减少的乙醛水平。这使得降低高乙醛水平所需要的添加的化学品减少。以下实例39显示出，与Ethanol Red^TM(ER)相比，当使用MBG4851时，在使用α-淀粉酶、葡糖淀粉酶和蛋白酶液化的醪液中发现减少的乙醛累积。具体地，与EthanolRed^TM(ER)相比，当使用MBG4851时，实例39显示出乙醛水平下降52％。

增加的油产量

诸位发明人出人意料地发现，当与Ethanol Red^TM(ER)相比时，用MBG4851酵母发酵导致油产量的增加。当额外向发酵添加蛋白酶(如衍生自嗜热子嚢菌属菌株的金属蛋白酶)时，产量甚至增加更多。因此，在本发明的一个实施例中，在糖化和/或发酵或SSF中添加蛋白酶。实例40显示出，在玉米醪发酵期间，该油产量增加近20％。当添加蛋白酶时，与使用Ethanol Red^TM的发酵(即，无蛋白酶)相比，观察到了超过45％的增加。如果蛋白酶已经存在，那么可以获得多出约20％的油。

液化步骤i)

根据本发明的方法，步骤i)中的液化是通过使含淀粉材料处于高于初始糊化温度的温度下，经受α-淀粉酶和任选地蛋白酶、和/或葡糖淀粉酶来进行。液化中还可以存在和/或添加其他酶如支链淀粉酶和植酸酶。

液化步骤i)可以进行0.5-5小时，例如1-3小时，例如典型地约2小时。

术语“初始糊化温度”表示含淀粉材料糊化开始的最低温度。通常，在水中加热的淀粉在约50℃与75℃之间开始糊化；糊化的准确温度依赖于具体的淀粉，并能够由本领域的技术人员容易地确定。因此，初始糊化温度可根据植物种类、植物种类的具体品种、以及生长条件而变化。在本发明的上下文中，给定的含淀粉材料的初始糊化温度是使用古林斯坦(Gorinstein)和李(Lii)，1992，淀粉(Starch/)44(12):461-466所描述的方法，使5％的淀粉颗粒丧失双折射的温度。

根据本发明，液化典型地是在从70℃-100℃范围内的温度下进行。在一个实施例中，液化中的温度是在75℃-95℃之间，如在75℃-90℃之间，优选地在80℃-90℃之间，如82℃-88℃，如约85℃。

根据本发明，在步骤i)中的液化之前，可以进行蒸汽加压蒸煮步骤。该喷射蒸煮可以在110℃-145℃之间，优选120℃-140℃，例如125℃-135℃，优选约130℃的温度下进行约1-15分钟，优选进行约3-10分钟，尤其是约5分钟左右。

液化期间pH可以是在4-7之间，如在pH 4.5-6.5之间、如在pH5.0-6.5之间、如在pH5.0-6.0之间、如在pH 5.2-6.2之间、如在5.2之间、如约5.4、如约5.6、如约5.8。

在一个实施例中，本发明的方法在步骤i)之前进一步包括以下步骤：

a)优选地通过干式碾磨来减小含淀粉材料的粒度；

b)形成一种包含该含淀粉材料和水的浆料。

该含淀粉起始材料(如全谷物)可以例如经过碾磨减少粒度，以便展开结构、增大表面积并且允许进一步加工。通常，存在以下两种类型的方法：湿式和干式碾磨。在干式碾磨中，整个谷粒被碾磨并且使用。湿式碾磨使胚芽与粗粉(淀粉颗粒和蛋白质)良好分离。湿式碾磨时常应用于在例如糖浆的生产中使用淀粉水解产物的，场所。干磨和湿磨在淀粉加工领域都是众所周知的。根据本发明，优选干式碾磨。

在一个实施例中，该粒度被减小至0.05至3.0mm、优选0.1-0.5mm之间，或使得至少30％、优选至少50％、更优选至少70％、甚至更优选至少90％的含淀粉材料适合通过一个具有0.05至3.0mm筛网、优选0.1-0.5mm筛网的筛子。在另一个实施例中，至少50％，优选至少70％，更优选至少80％，尤其是至少90％的含淀粉材料适合通过一个具有#6筛网的筛子。

该水性浆料可以包含含淀粉材料的从10w/w-％-55w/w-％干固体(DS)，优选25w/w-％-45w/w-％干固体(DS)，更优选30w/w-％-40w/w-％干固体(DS)。

最初，可以将α-淀粉酶，任选地蛋白酶，任选地葡糖淀粉酶添加到水性浆料中来开始液化(稀释)。在一个实施例中，这些酶中仅有一部分(例如，约1/3)被添加到该水性浆料中，而这些酶中的剩余部分(例如，约2/3)在液化步骤i)过程中添加。

α-淀粉酶的实例的非穷尽列表可以发现于下文的“液化期间存在的和/或添加的α-淀粉酶”-部分中。在一个实施例中，该a-淀粉酶是细菌α-淀粉酶。细菌α-淀粉酶典型地是热稳定性的。在一个优选的实施例中，该α-淀粉酶来自芽胞杆菌属，如嗜热脂肪芽孢杆菌菌株，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的一种变体，如WO 99/019467中的SEQ ID NO:3或在此的SEQ ID NO:1中所示的那种。

在一个实施例中，与参照α-淀粉酶(具有突变I181*+G182*、任选地具有N193F取代、截短至约491个氨基酸，即，从480-495个氨基酸的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(使用在此的SEQ ID NO:1进行编号))相比，通过在pH 4.5和5.5下以及在温度75℃和85℃下用0.12mM CaCl₂进行参照α-淀粉酶和变体孵育，随后使用底物(超级淀粉酶测定试剂盒，E33651，分子探针公司(Molecular Probes))进行残余活性确定所确定的，该α-淀粉酶具有改进的稳定性。这描述于实例1中。

适合的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体的实例可以在下文“热稳定性α-淀粉酶”部分中发现，并且包括来自具有以下突变的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体的下组中的一种：

-I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E；

-

I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；

-I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；

-I181*+G182*+N193F+V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；及

-

在pH 4.5和5.5，0.12mM CaCl₂下，与参照α-淀粉酶(被截断至491个氨基酸的具有突变I181*+G182*+N193F的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶)相比，具有增加耐热性的其他适合的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的实例可以在通过引用结合在此的WO 2011/082425中。(还参见如下的实例1)

根据本发明的方法，步骤i)中的液化可以使用α-淀粉酶和蛋白酶的组合来进行。该蛋白酶可以是一种蛋白酶，该蛋白酶具有如实例1中描述所确定的(相对活性)确定为在80℃/70℃下的相对活性的、超过20％的热稳定性值。适合的蛋白酶的实例描述于下文“液化过程中存在的和/或添加的蛋白酶”部分中。

-D79L+S87P+A112P+D142L；

-D79L+S87P+D142L；或

-A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L。

金黄色嗜热子囊菌蛋白酶的适合变体的更多实例可以发现于通过引用结合于此的WO 2011/072191中(还参见以下实例2)。

在本发明的实施例中，将液化步骤i)中添加的α-淀粉酶和/或蛋白酶进一步与葡糖淀粉酶组合。因此，在液化步骤i)期间，还可以存在或添加葡糖淀粉酶。该葡糖淀粉酶优选地是热稳定性的。这意味着在85℃，pH 5.3下，该葡糖淀粉酶具有至少20％，如至少30％，优选地至少35％的热稳定性，如在实例4(热稳定性)中描述进行测定。在一个实施例中，液化中存在的和/或添加的葡糖淀粉酶在pH 5.0下具有至少90％，优选地至少95％，优选地至少97％的相对活性pH最佳值。在一个实施例中，该葡糖淀粉酶在pH 5.0下具有至少80％、至少85％、至少90％的pH稳定性，如在实例4(pH稳定性)中描述进行测定。

根据本发明，液化步骤i)中存在的和/或添加的适合的葡糖淀粉酶可以衍生自青霉属菌株，尤其是披露为WO 2011/127802中SEQ ID NO:2或在此的SEQ ID NO:9或14的草酸青霉菌的菌株。在一个优选的实施例中，该葡糖淀粉酶是WO 2011/127802中SEQ ID NO:2所示的、具有K79V取代(使用在此的SEQ ID NO:14中所示成熟序列进行编号)的草酸青霉菌葡糖淀粉酶，如WO 2013/053801中所披露的变体。在一个优选的实施例中，该草酸青霉菌葡糖淀粉酶具有K79V取代(使用SEQ ID NO:14进行编号)，并且进一步具有以下各项之一：

-P11F+T65A+Q327F；

-P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F(使用SEQ ID NO:14进行编号)。

其他适合的草酸青霉菌葡糖淀粉酶变体的实例可以发现于通过引用结合的WO2013/053801中(还参见以下实例10-16，如表15中的草酸青霉菌葡糖淀粉酶变体)。

糖化与发酵

在糖化步骤ii)和/或发酵步骤iii)或同时糖化发酵(SSF)中存在和/或添加葡糖淀粉酶。在糖化步骤ii)和/或发酵步骤iii)或同时糖化发酵(SSF)中添加的葡糖淀粉酶典型地不同于任选地在液化步骤i)中添加的葡糖淀粉酶。在一个优选的实施例中，葡糖淀粉酶是与真菌α-淀粉酶一起添加的。葡糖淀粉酶的实例可以发现于下文的“在糖化和/或发酵中存在的和/或添加的葡糖淀粉酶”-部分中。

当依序进行糖化和发酵时，糖化步骤ii)可以在本领域中熟知的条件下进行。例如，糖化步骤ii)可以持续达从约24至约72小时。在一个实施例中，进行预糖化。预糖化在30℃-65℃之间，典型地是约60℃的温度下典型地持续40-90分钟。在一个实施例中，在同时糖化发酵(SSF)中，预糖化之后是发酵过程中的糖化。糖化典型地在从20℃-75℃、优选地从40℃-70℃，典型地约60℃的温度下并且在4与5之间的pH下、一般在约pH 4.5下进行。

同时糖化发酵(“SSF”)广泛地用于工业规模的发酵产物生产方法中，尤其是乙醇生产方法中。当进行SSF时，同时进行糖化步骤ii)和发酵步骤iii)。不存在针对糖化的保持阶段，意指一起添加发酵生物(例如酵母)以及一种或多种酶。然而，还考虑了分开添加发酵生物以及一种或多种酶。根据本发明，SSF可典型地在从25℃至40℃、如从28℃至35℃、如从30℃至34℃、优选地约32℃的一个温度下进行。在一个实施例中，发酵进行6至120小时，尤其是24至96小时。在一个实施例中，pH是在4-5之间。

在本发明的实施例中，在糖化、发酵或同时糖化发酵(SSF)中存在和/或添加纤维素分解组合物。此类组合物的实例可以发现于以下“在糖化和/或发酵期间存在和/或添加的纤维素分解组合物”部分中。该纤维素分解组合物与葡糖淀粉酶一起存在和/或添加，如以下“在糖化和/或发酵中存在的和/或添加的葡糖淀粉酶”部分中所披露的一种葡糖淀粉酶。

含淀粉材料

根据本发明，可使用任何合适的含淀粉材料。通常基于期望的发酵产物(在此是乙醇)来选择起始材料。适合用于本发明的方法的含淀粉起始材料的实例包括谷类、块茎或谷物。确切地，含淀粉材料可以是玉米、小麦、大麦、黑麦、买罗高粱、西米、木薯、木薯粉、高粱、燕麦、水稻、豌豆、豆类、或甘薯、或它们的混合物。还考虑了糯与非糯类型的玉米与大麦。

在一个优选实施例中，含淀粉起始材料是玉米。

在一个优选实施例中，含淀粉起始材料是小麦。

在一个优选实施例中，含淀粉起始材料是大麦。

在一个优选实施例中，含淀粉起始材料是黑麦。

在一个优选实施例中，含淀粉起始材料是买罗高粱。

在一个优选实施例中，含淀粉起始材料是西米。

在一个优选实施例中，含淀粉起始材料是木薯。

在一个优选实施例中，含淀粉起始材料是木薯粉。

在一个优选实施例中，含淀粉起始材料是高粱。

在一个优选实施例中，含淀粉起始材料是水稻，

在一个优选实施例中，含淀粉起始材料是豌豆。

在一个优选实施例中，含淀粉起始材料是豆类。

在一个优选实施例中，含淀粉起始材料是甘薯。

在一个优选实施例中，含淀粉起始材料是燕麦。

发酵

在发酵培养基中进行发酵。发酵培养基包括发酵底物，即被发酵生物代谢的碳水化合物源。根据本发明，发酵培养基可以包括针对发酵生物的营养素和生长刺激剂。营养物和生长刺激物在发酵领域中广泛使用，且包括氮源如氨；尿素，维生素和矿物质，或其组合。

发酵生物体

在本发明的方法中使用酿酒酵母MBG4851(在澳大利亚维多利亚州国家计量研究所登录号V14/004037下保藏)或一种发酵生物菌株，该发酵生物菌株具有与酿酒酵母MBG4851的大致一样的性质或酿酒酵母MBG4851的定义特性。

在一个实施例中，该发酵生物菌株具有与酿酒酵母MBG4851大致一样的性质，在相同方法条件下，与Ethanol Red^TM(ER)相比，因为它提供了增加的乙醇产量。

在一个实施例中，该发酵生物菌株具有与酿酒酵母MBG4851大致一样的性质，在同时糖化发酵(SSF)中不存在和/或添加尿素的相同条件下，与Ethanol Red^TM(ER)相比，因为它提供了增加的乙醇产量。

在一个实施例中，具有与酿酒酵母MBG4851的大致一样的性质的发酵生物菌株，在相同方法条件下，与Ethanol Red^TM相比，因为它产生了减少的乳酸水平。

在一个实施例中，具有与酿酒酵母MBG4851的大致一样的性质的发酵生物菌株，在相同方法条件下，与Ethanol Red^TM相比，因为它产生了减少的甘油水平。

在一个实施例中，具有与酿酒酵母MBG4851的大致一样的性质的发酵生物菌株，在相同方法条件下，与Ethanol Red^TM相比，减少了发酵中乙醛水平。

在一个实施例中，具有与酿酒酵母MBG4851的大致一样的性质的发酵生物菌株，在相同方法条件下，与Ethanol Red^TM相比，增加了油产量。

在一个实施例中，具有与酿酒酵母MBG4851的大致一样的性质的发酵生物菌株，在相同方法条件下，与Ethanol Red^TM相比，具有更快的发酵动力学。

在一个实施例中，具有与酿酒酵母MBG4851的大致一样的性质的发酵生物菌株具有以下性质和定义特性中的一种或多种，如所有：

-在相同方法条件下，与Ethanol Red^TM相比，增加乙醇产量；

-在相同方法条件下，与Ethanol Red^TM相比，增加油产量；

在本发明的一个实施例中，当使用实例19中所使用的方法设置和条件来确定时，具有与酿酒酵母MBG4851的大致一样的性质的发酵生物菌株，在0ppm尿素下并且在3μg EP/gDS的蛋白酶Pfu剂量(液化中添加的)下，提供了超过Ethanol Red^TM(ER)大于1.0％的乙醇产量提升，如在0ppm尿素下并且在1.5μg EP/gDS的Pfu剂量下大于1.5％，如在0ppm尿素下并且在0.0385μg EP/gDS的蛋白酶Pfu剂量下大于4.0％。

在本发明的一个实施例中，当使用实例21中所使用的方法设置和条件来确定时，具有与酿酒酵母MBG4851的大致一样的性质的发酵生物菌株，在300ppm的尿素水平下提供了超过Ethanol Red^TM大于1.0％的乙醇产量提升，如在150ppm的尿素水平下大于3.0％，如在0ppm的尿素水平下大于10.0％。

在本发明的一个实施例中，当使用实例23中所使用的方法设置和条件来确定时，具有与酿酒酵母MBG4851的大致一样的性质的发酵生物菌株，在0ppm的尿素水平下并且在0.0385μg/g Ds的蛋白酶Pfu剂量(液化中添加的)下，在54小时发酵中提供了超过EthanolRed大于50％的乳酸减少，如在0ppm的尿素水平下并且在3μg/g Ds的蛋白酶Pfu剂量下大于50％。

在本发明的一个实施例中，当使用实例34中所使用的方法设置和条件来确定时，具有与酿酒酵母MBG4851的大致一样的性质的发酵生物菌株在60小时发酵中提供了超过Ethanol Red^TM(ER)大于2.0％的甘油水平减少，如大于3.0％、如大于4.0％。

在本发明的一个实施例中，当使用实例39中所使用的方法设置和条件来确定时，具有与酿酒酵母MBG4851的大致一样的性质的发酵生物菌株，在54小时发酵中，提供了超过Ethanol Red^TM(ER)大于30％的乙醛水平减少，如大于40％、如大于50％。

在本发明的一个实施例中，当使用实例40中所使用的方法设置和条件来确定时，具有与酿酒酵母MBG4851的性质或其定义特性大致一样的性质的发酵生物菌株，在64小时发酵后，提供超过Ethanol Red^TM(ER)大于10％的油产量的增加，如大于12％、如大于14％、如大于16％、如大于18％、如大于20％、如在10％-20％之间、如在10％-15％之间、如在15％-20％之间。

回收

在发酵(例如，SSF)后，可以将乙醇从发酵培养基中分离。可以蒸馏该浆料以回收/提取所希望的发酵产物(即，乙醇)。可替代地，可以通过微滤或膜过滤技术从发酵培养基中提取希望的发酵产物(即，乙醇)。还可以通过汽提或本领域中熟知的其他方法来回收发酵产物(即，乙醇)。

在一个实施例中，本发明涉及从本发明乙醇生产方法中回收/提取油的方法，该方法包括以下步骤：

ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；

iii使用发酵生物进行发酵。

iv)回收该发酵产物以形成全酒糟；

v)将该全酒糟分离为酒糟水和湿饼；

vi)任选地将该酒糟水浓缩为浆料；

在一个优选的实施例中，从酒糟水中回收/提取该油。在一个优选的实施例中，从浆体/蒸发的分离液中回收/提取该油。

在一个实施例中，在糖化和/或发酵或SSF中添加蛋白酶。

在一个实施例中，本发明涉及从乙醇生产方法中回收/提取油的方法，该方法包括以下步骤：

i)在高于初始糊化温度的温度下，使用以下项液化该含淀粉材料：

-嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶；

-任选地强烈火球菌蛋白酶；

-任选地草酸青霉菌葡糖淀粉酶；

ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；

iii)使用发酵生物进行发酵。

iv)回收该发酵产物以形成全酒糟；

v)将该全酒糟分离为酒糟水和湿饼；

vi)任选地将该酒糟水浓缩为浆料；

在一个实施例中，在糖化和/或发酵或SSF中添加蛋白酶。

液化中存在的和/或添加的α-淀粉酶

根据本发明，在液化中存在和/或添加α-淀粉酶，任选地与蛋白酶和/或葡糖淀粉酶、和/或任选的支链淀粉酶一起。

在液化步骤i)中添加的α-淀粉酶可以是任何α-淀粉酶。优选地是细菌α-淀粉酶，其在液化过程中使用的温度下典型地是稳定的。

细菌α-淀粉酶

术语“细菌α-淀粉酶”意指在EC 3.2.1.1项下分类的任何细菌α-淀粉酶。根据本发明使用的细菌α-淀粉酶可以例如来源于芽孢杆菌属的菌株，芽孢杆菌属有时也称作土芽孢杆菌属。在一个实施例中，该芽孢杆菌属α-淀粉酶来源于解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌的菌株，但是也可以来源于其他芽孢杆菌属物种。

细菌α-淀粉酶的具体实例包括WO 99/19467中的SEQ ID NO:3的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，WO 99/1946中的SEQ ID NO:5的解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶，以及WO 99/19467中的SEQ ID NO:4的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶或在此的SEQ ID NO:21(所有序列都通过引用结合于此)。在实施例中，该α-淀粉酶可以是与WO 99/19467中的SEQ ID NO:3、4或5所示的任何序列分别具有至少60％，例如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致性程度的酶。

在一个实施例中，该α-淀粉酶可以是一种与WO 99/19467中的SEQ ID NO:3、或在此的SEQ ID NO:1所示的任何序列具有至少60％，例如至少70％、至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致性程度的酶。

在优选的实施例中，该α-淀粉酶来源自嗜热脂肪芽孢杆菌。该嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶可以是成熟野生型或其成熟变体。该成熟嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶可以是在重组产生过程中天然地截短的。例如，该嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶可以是截短的，因此它具有约491个氨基酸，例如，因此它缺乏功能性淀粉结合结构域(与WO 99/19467中的SEQ IDNO:3比较)或在此的SEQ ID NO:1。

该芽孢杆菌α-淀粉酶还可以是一种变体和/或杂合体。这样一种变体的实例可以发现于以下任一项中：WO 96/23873、WO 96/23874、WO 97/41213、WO 99/19467、WO 00/60059、以及WO 02/10355(所有文献都通过引用而特此结合)。具体的α-淀粉酶变体披露于美国专利号6,093,562、6,187,576、6,297,038和7,713,723中(通过引用而特此结合)并且包括具有以下改变的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(通常称作BSGα-淀粉酶)变体：在位置R179、G180、I181和/或G182处的一个或两个氨基酸的缺失，优选披露于WO 96/23873中的一种双缺失–参见例如第20页，第1-10行(通过引用而特此结合)，优选与披露于WO 99/19467的SEQ ID NO:3阐述的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的氨基酸序列相比对应于位置I181和G182的缺失，或使用WO 99/19467(该参考文献通过引用而特此结合)中的SEQ ID NO:3或在此的SEQ ID NO:1进行编号的氨基酸R179和G180的缺失。甚至更优选的是芽孢杆菌α-淀粉酶，尤其是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，它与披露于WO 99/19467中的SEQ ID NO:3或在此的SEQ ID NO:1阐述的野生型BSGα-淀粉酶氨基酸序列相比具有对应于位置181和182的缺失的一种双缺失并且进一步包括N193F取代(也被表示为I181*+G182*+N193F)。细菌α-淀粉酶还可以在对应于WO 99/19467中的SEQ ID NO:4所示的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶或在此的SEQ ID NO:21、或WO 99/19467中的SEQ ID NO:3的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的S242和/或E188P变体或在此的SEQ ID NO:1中的S239的位置处具有取代。

在一个实施例中，该变体是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的S242A、E或Q变体，优选S242Q变体(使用在此的SEQ ID NO:1进行编号)。

在一个实施例中，该变体是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的E188变体，优选E188P变体(使用在此的SEQ ID NO:1进行编号)。

在一个实施例中，细菌α-淀粉酶可以是截短的芽胞杆菌属α-淀粉酶。尤其地，截短是这样的，例如，以使得WO 99/19467中的SEQ ID NO:3或在此的SEQ ID NO:1中所示的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶是约491个氨基酸长，例如从480至495个氨基酸长，或者因此其缺乏功能性淀粉结合结构域。

细菌杂合α-淀粉酶

该细菌α-淀粉酶可以是一种杂合细菌α-淀粉酶，例如一种包括地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(示于WO 99/19467的SEQ ID NO:4中)的445个C末端氨基酸残基和来源于解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶(示于WO 99/19467的SEQ ID NO:5中)的37个N末端氨基酸残基的α-淀粉酶。在一个优选的实施例中，该杂合体具有下列取代中的一个或多个，尤其是全部：

G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S(使用WO 99/19467的SEQ ID NO:4中的地衣芽孢杆菌进行编号)或在此的SEQ ID NO:21。还优选的是具有以下突变(或在其他芽孢杆菌α-淀粉酶中的对应突变)中的一个或多个的变体：H154Y、A181T、N190F、A209V以及Q264S和/或在位置176与179之间的两个残基的缺失，优选E178和G179的缺失(使用WO 99/19467的SEQ ID NO:5进行位置编号)。

在一个实施例中，该细菌α-淀粉酶是嵌合α-淀粉酶的成熟部分，披露于理查森(Richardson)等人(2002)，生化杂志(The Journal of Biological Chemistry)，277卷，29期，7月19日发表，267501-26507页中，称作BD5088或其变体。这种α-淀粉酶与WO2007134207的SEQ ID NO:2所述的相同。成熟酶序列在位置1处的起始“Met”氨基酸之后开始。

热稳定性a-淀粉酶

根据本发明，α-淀粉酶可以是一种热稳定性α-淀粉酶，例如一种热稳定性细菌α-淀粉酶，优选来自嗜热脂肪芽孢杆菌。在一个实施例中，如实例1中描述所确定的，根据本发明使用的α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl₂下具有至少10的T¹/₂(min)。

在一个实施例中，该热稳定性α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl₂下具有至少15的T¹/₂(min)。

在一个实施例中，该热稳定性α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl₂下具有至少20的T¹/₂(min)。

在一个实施例中，该热稳定性α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl₂下具有至少25的T¹/₂(min)。

在一个实施例中，该热稳定性α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl₂下具有至少30的T¹/₂(min)。

在一个实施例中，该热稳定性α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl₂下具有至少40的T¹/₂(min)。

在一个实施例中，该热稳定性α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl₂下具有至少50的T¹/₂(min)。

在一个实施例中，该热稳定性α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl₂下具有至少60的T¹/₂(min)。

在一个实施例中，该热稳定性α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl₂下具有在10-70之间的T¹/₂(min)。

在一个实施例中，该热稳定性α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl₂下具有在15-70之间的T¹/₂(min)。

在一个实施例中，该热稳定性α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl₂下具有在20-70之间的T¹/₂(min)。

在一个实施例中，该热稳定性α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl₂下具有在25-70之间的T¹/₂(min)。

在一个实施例中，该热稳定性α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl₂下具有在30-70之间的T¹/₂(min)。

在一个实施例中，该热稳定性α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl₂下具有在40-70之间的T¹/₂(min)。

在一个实施例中，该热稳定性α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl₂下具有在50-70之间的T¹/₂(min)。

在一个实施例中，该热稳定性α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl₂下具有在60-70之间的T¹/₂(min)。

在本发明的一个实施例中，α-淀粉酶是一种细菌α-淀粉酶，优选来源于芽胞杆菌属，尤其是嗜热脂肪芽孢杆菌的一种菌株，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌，如在WO 99/019467中披露为SEQ ID NO:3(在此的SEQ ID NO:1)，其中在位置R179、G180、I181和/或G182处缺失一个或两个氨基酸，特别是R179和G180缺失、或I181和G182缺失，具有如下突变列表中的突变。

在优选的实施例中，嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶具有双缺失I181+G182，以及任选的取代N193F，进一步包括选自以下列表的突变：

在一个优选的实施例中，该α-淀粉酶选自嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体的组：

-I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E；

-

I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；

-I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；

-I181*+G182*+N193F+V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；及

-

I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(使用在此的SEQ ID NO:1进行编号)。

应理解当提及嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶及其变体时，它们是以截短形式正常地生产的。特别地，截短是这样的以使得WO 99/19467中的SEQ ID NO:3或在此的SEQ ID NO:1中所示的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶或其变体在C-末端截短并且典型地是约491个氨基酸长，例如从480至495个氨基酸长，或这样使得其缺乏功能性淀粉结合结构域。

在一个优选的实施例中，该α-淀粉酶变体可以是一种与WO 99/19467中的SEQ IDNO:3、或在此的SEQ ID NO:1所示的序列具有至少60％，例如，至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，但小于100％一致性程度的酶。

在一个实施例中，将该细菌α-淀粉酶，例如，芽胞杆菌属α-淀粉酶，如尤其是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，或其变体，以在0.01-10KNU-A/g Ds之间的浓度给出到液化中，例如，在0.02和5KNU-A/g Ds之间，如0.03和3KNU-A，优选地0.04和2KNU-A/g Ds，如尤其是0.01和2KNU-A/g DS。在一个实施例中，将该细菌α-淀粉酶，例如，芽胞杆菌属α-淀粉酶，如尤其是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，或其变体，以在0.0001-1mg EP(酶蛋白)/g DS之间的浓度给出到液化中，例如，0.0005-0.5mg EP/g DS，如0.001-0.1mg EP/g DS。

液化中存在的和/或添加的蛋白酶

根据本发明，蛋白酶任选地与α-淀粉酶、和任选的葡糖淀粉酶、和/或支链淀粉酶一起存在和/或添加到液化中。

蛋白酶根据其催化机制分为以下几类：丝氨酸蛋白酶(S)、半胱氨酸蛋白酶(C)、天冬氨酸蛋白酶(A)、金属蛋白酶(M)以及未知或还未分类的蛋白酶(U)，参见催化酶手册(Handbook of Proteolytic Enzymes)，巴雷特(A.J.Barrett)，罗林斯(N.D.Rawlings)，沃森纳(J.F.Woessner)(编)，学术出版社(1998)，尤其是概述部分。

在一个优选的实施例中，根据本发明使用的热稳定性蛋白酶是“金属蛋白酶”，其被定义为属于EC 3.4.24(金属内肽酶)的蛋白酶；优选EC 3.4.24.39(酸性金属蛋白酶)。

为了确定给定的蛋白酶是否是金属蛋白酶，参照上述“催化酶手册”以及其中指定的原则。可以对所有类型的蛋白酶进行这样的测定，而不论其是天然存在的或野生型蛋白酶；还是基因工程化的或合成的蛋白酶。

可以使用任何适合的测定来测量蛋白酶活性，其中采用一种底物，该底物包括与所讨论的蛋白酶的特异性相关的肽键。pH测定和温度测定同样适用于所讨论的蛋白酶。测定PH值的实例是pH 6、7、8、9、10或11。测定温度的实例是30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、或80℃。

蛋白酶底物的实例为酪蛋白，如Azurine-Crosslinked Casein(AZCL-酪蛋白)。在下文的“材料与方法”-部分中描述了两种蛋白酶测定法，其中所谓的“AZCL-酪蛋白测定法”是优选的测定法。

在一个实施例中，通过在“材料与方法”部分中描述的AZCL-酪蛋白测定法确定的，该热稳定性蛋白酶具有蛋白酶196变体或蛋白酶Pfu的至少20％，例如至少30％，例如至少40％，例如至少50％，例如至少60％，例如至少70％，例如至少80％，例如至少90％，例如至少95％，例如至少100％的蛋白酶活性。

对于在本发明的方法中使用的蛋白酶的来源没有限制，只要其满足下文定义的热稳定性特性。

在一个实施例中，该蛋白酶是真菌来源。

该蛋白酶可以是，例如，野生型蛋白酶的一种变体，只要该蛋白酶具有在此定义的热稳定性特性。在一个优选的实施例中，该热稳定性蛋白酶是如上定义的金属蛋白酶的一种变体。在一个实施例中，在本发明的方法中使用的热稳定性蛋白酶是真菌来源，例如真菌金属蛋白酶，例如来源于嗜热子囊菌属的菌株，优选金黄色嗜热子囊菌的菌株，尤其是金黄色嗜热子囊菌CGMCC No.0670(分类为EC 3.4.24.39)。

在一个实施例中，该热稳定性蛋白酶是披露于WO 2003/048353中的SEQ ID NO:2所示的金属蛋白酶的成熟部分的或WO 2010/008841的SEQ ID NO:1以及在此的SEQ ID NO:3所示的成熟部分的变体，进一步具有选自以下列表的突变：

-S5*+D79L+S87P+A112P+D142L；

-D79L+S87P+A112P+T124V+D142L；

-S5*+N26R+D79L+S87P+A112P+D142L；

-N26R+T46R+D79L+S87P+A112P+D142L；

-T46R+D79L+S87P+T116V+D142L；

-D79L+P81R+S87P+A112P+D142L；

-A27K+D79L+S87P+A112P+T124V+D142L；

-D79L+Y82F+S87P+A112P+T124V+D142L；

-D79L+S87P+A112P+T124V+A126V+D142L；

-D79L+S87P+A112P+D142L；

-D79L+Y82F+S87P+A112P+D142L；

-S38T+D79L+S87P+A112P+A126V+D142L；

-D79L+Y82F+S87P+A112P+A126V+D142L；

-A27K+D79L+S87P+A112P+A126V+D142L；

-D79L+S87P+N98C+A112P+G135C+D142L；

-D79L+S87P+A112P+D142L+T141C+M161C；

-S36P+D79L+S87P+A112P+D142L；

-A37P+D79L+S87P+A112P+D142L；

-S49P+D79L+S87P+A112P+D142L；

-S50P+D79L+S87P+A112P+D142L；

-D79L+S87P+D104P+A112P+D142L；

-D79L+Y82F+S87G+A112P+D142L；

-S70V+D79L+Y82F+S87G+Y97W+A112P+D142L；

-D79L+Y82F+S87G+Y97W+D104P+A112P+D142L；

-S70V+D79L+Y82F+S87G+A112P+D142L；

-D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+D142L；

-D79L+Y82F+S87G+A112P+A126V+D142L；

-Y82F+S87G+S70V+D79L+D104P+A112P+D142L；

-Y82F+S87G+D79L+D104P+A112P+A126V+D142L；

-A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L；

-A27K+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L；

-A27K+D79L+Y82F+D104P+A112P+A126V+D142L；

-A27K+Y82F+D104P+A112P+A126V+D142L；

-A27K+D79L+S87P+A112P+D142L；

-D79L+S87P+D142L。

在一个优选的实施例中，热稳定性蛋白酶是披露为以下的金属蛋白酶的变体:WO2003/048353中披露的SEQ ID NO:2的成熟部分或WO 2010/008841中SEQ ID NO:1的成熟部分或在此的SEQ ID NO:3，具有以下突变：

D79L+S87P+A112P+D142L；

D79L+S87P+D142L；或

A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L。

在一个实施例中，该蛋白酶变体与WO 2003/048353中披露的SEQ ID NO:2的多肽的成熟部分或WO 2010/008841中SEQ ID NO:1的成熟部分或在此的SEQ ID NO:3具有至少75％一致性，优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，并且甚至最优选至少95％，例如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，但小于100％一致性。

该热稳定性蛋白酶还可以来源于任何细菌，只要该蛋白酶具有根据本发明定义的热稳定性特性。

在一个实施例中，该热稳定性蛋白酶来源于火球菌属的一种细菌菌株，例如强烈火球菌的一种菌株(pfu蛋白酶)。

在一个实施例中，该蛋白酶是如美国专利号6,358,726-B1(宝酒造公司(TakaraShuzo Company))的SEQ ID NO:1、或在此的SEQ ID NO:13所示的一种。

在另一个实施例中，该热稳定性蛋白酶是披露于此的SEQ ID NO:13或是与美国专利号6,358,726-B1中的SEQ ID NO:1或在此的SEQ ID NO:13具有至少80％一致性，例如至少85％，例如至少90％，例如至少95％，例如至少96％，例如至少97％，例如至少98％，例如至少99％一致性的一种蛋白酶。激烈热球菌蛋白酶可以购买自日本宝酒造生物公司(Takara Bio,Japan)。

强烈火球菌蛋白酶是一种根据本发明的热稳定性蛋白酶。发现商用产品强烈火球菌蛋白酶(Pfu S)在pH 4.5下具有110％(80℃/70℃)和103％(90℃/70℃)的热稳定性，如实例2中所述的进行测定。

在一个实施例中，在本发明方法中使用的热稳定性蛋白酶具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的、超过20％的热稳定性值，如实例2中所述的进行测定。

在一个实施例中，蛋白酶具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的，超过30％、超过40％、超过50％、超过60％、超过70％、超过80％、超过90％、超过100％，例如超过105％，例如超过110％，例如超过115％，例如超过120％的热稳定性。

在一个实施例中，蛋白酶具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的，在20％与50％之间，例如在20％与40％之间，例如20％与30％的热稳定性。

在一个实施例中，蛋白酶具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的，在50％与115％之间，例如在50％与70％之间，例如在50％与60％之间，例如在100％与120％之间，例如在105％与115％之间的热稳定性。

在一个实施例中，蛋白酶具有确定为在85℃/70℃下的相对活性的、超过10％的热稳定性值，如实例2中所述的进行测定。

在一个实施例中，蛋白酶具有确定为在85℃/70℃下的相对活性的，超过10％，例如超过12％、超过14％、超过16％、超过18％、超过20％、超过30％、超过40％、超过50％、超过60％、超过70％、超过80％、超过90％、超过100％、超过110％的热稳定性。

在一个实施例中，蛋白酶具有确定为在85℃/70℃下的相对活性的，在10％与50％之间，例如在10％与30％之间，例如在10％与25％之间的热稳定性。

在一个实施例中，蛋白酶具有超过20％、超过30％、超过40％、超过50％、超过60％、超过70％、超过80％、超过90％的测定为在80℃下的残余活性；和/或

在一个实施例中，蛋白酶具有超过20％、超过30％、超过40％、超过50％、超过60％、超过70％、超过80％、超过90％的测定为在84℃下的残余活性。

“相对活性”以及“残余活性”的测定是如在实例2中描述的进行的。

在一个实施例中，蛋白酶在85℃下可以具有高于90，例如高于100的热稳定性，如使用实例3中披露的Zein-BCA测定法确定的。

在一个实施例中，蛋白酶在85℃下具有高于60％，例如高于90％，例如高于100％，例如高于110％的热稳定性，如使用Zein-BCA测定法确定的。

在一个实施例中，蛋白酶在85℃下具有在60-120之间，例如在70％-120％之间，例如在80％-120％之间，例如在90％-120％之间，例如在100％-120％之间，例如110％-120％的热稳定性，如使用Zein-BCA测定法确定的。

在一个实施例中，通过AZCL-酪蛋白测定法确定的，该热稳定性蛋白酶具有JTP196蛋白酶变体或蛋白酶Pfu的至少20％，例如至少30％，例如至少40％，例如至少50％，例如至少60％，例如至少70％，例如至少80％，例如至少90％，例如至少95％，例如至少100％的活性。

液化步骤i)中存在的和/或添加的葡糖淀粉酶

根据本发明，葡糖淀粉酶可任选地存在于和/或添加到液化步骤i)中。在一个优选的实施例中，该葡糖淀粉酶与α-淀粉酶和/或蛋白酶和/或支链淀粉酶一起或单独添加。

在一个实施例中，该葡糖淀粉酶在85℃下具有至少20％、至少30％，优选至少35％的相对活性热稳定性，如实例4(热稳定性)中描述的进行测定。

在一个实施例中，该葡糖淀粉酶，在pH 5.0的pH最佳值下具有至少90％，优选至少95％，优选至少97％，例如100％的相对活性，如实例4(pH最佳值)中描述的进行测定。

在一个实施例中，该葡糖淀粉酶在pH 5.0下具有至少80％、至少85％、至少90％的pH稳定性，如在实例4(pH稳定性)中描述进行测定。

在一个具体并优选的实施例中，该葡糖淀粉酶，优选真菌来源，优选丝状真菌，是来自青霉属的一种菌株，尤其是草酸青霉菌的一种菌株，特别是在WO 2011/127802(特此将其通过引用结合)中披露为SEQ ID NO:2的以及显示于在此的SEQ ID NO:9或14中的草酸青霉菌葡糖淀粉酶。

在一个实施例中，该葡糖淀粉酶与WO 2011/127802的SEQ ID NO:2中所示的成熟多肽或在此的SEQ ID NO:9或14具有至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，并且甚至最优选至少95％，例如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致性。

在一个优选的实施例中，该葡糖淀粉酶是WO 2011/127802中披露为SEQ ID NO:2以及显示于在此的SEQ ID NO:9或14中的草酸青霉菌葡糖淀粉酶的一种变体，具有K79V取代(使用在此的SEQ ID NO:14中所示的成熟序列进行编号)。如披露WO 2013/036526(将其特此通过引用结合)中的，该K79V葡糖淀粉酶变体相对于亲本对蛋白酶降解具有降低的敏感度。

在一个实施例中，该葡糖淀粉酶源自草酸青霉菌。

在一个实施例中，该葡糖淀粉酶是WO 2011/127802中披露为SEQ ID NO:2以及显示于在此的SEQ ID NO:9或14中的草酸青霉菌葡糖淀粉酶的一种变体。在一个优选的实施例中，该草酸青霉菌葡糖淀粉酶是WO 2011/127802中披露为SEQ ID NO:2以及显示于在此的SEQ ID NO:9或14中的，在位置79处具有Val(V)(使用在此的SEQ ID NO:14进行编号)。

考虑的草酸青霉菌葡糖淀粉酶变体披露于WO 2013/053801(特此将其通过引用结合)中。

在一个实施例中，这些变体具有对蛋白酶降解的降低的敏感度。

在一个实施例中，这些变体与亲本相比具有改进的热稳定性。

更具体地，在一个实施例中，该葡糖淀粉酶具有对应于PE001变体的K79V取代(使用在此的SEQ ID NO:14进行编号)，并且进一步包括至少一种以下取代或取代的组合：

T65A；或

Q327F；或

E501V；或

Y504T；或

Y504*；或

T65A+Q327F；或

T65A+E501V；或

T65A+Y504T；或

T65A+Y504*；或

Q327F+E501V；或

Q327F+Y504T；或

Q327F+Y504*；或

E501V+Y504T；或

E501V+Y504*；或

T65A+Q327F+E501V；或

T65A+Q327F+Y504T；或

T65A+E501V+Y504T；或

Q327F+E501V+Y504T；或

T65A+Q327F+Y504*；或

T65A+E501V+Y504*；或

Q327F+E501V+Y504*；或

T65A+Q327F+E501V+Y504T；或

T65A+Q327F+E501V+Y504*；

E501V+Y504T；或

T65A+K161S；或

T65A+Q405T；或

T65A+Q327W；或

T65A+Q327F；或

T65A+Q327Y；或

P11F+T65A+Q327F；或

R1K+D3W+K5Q+G7V+N8S+T10K+P11S+T65A+Q327F；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；或

P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；或

R1E+D3N+P4G+G6R+G7A+N8A+T10D+P11D+T65A+Q327F；或

P11F+T65A+Q327W；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或

P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；或

T65A+Q327F+E501V+Y504T；或

T65A+S105P+Q327W；或

T65A+S105P+Q327F；或

T65A+Q327W+S364P；或

T65A+Q327F+S364P；或

T65A+S103N+Q327F；或

P2N+P4S+P11F+K34Y+T65A+Q327F；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+D445N+V447S；或

P2N+P4S+P11F+T65A+I172V+Q327F；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+N502*；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+N502T+P563S+K571E；或

P2N+P4S+P11F+R31S+K33V+T65A+Q327F+N564D+K571S；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+S377T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+V325T+Q327W；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+D445N+V447S+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+I172V+Q327F+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+S377T+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+D26N+K34Y+T65A+Q327F；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+I375A+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+K218A+K221D+Q327F+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+S103N+Q327F+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+T10D+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+F12Y+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或

K5A+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+T10E+E18N+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或

P2N+T10E+E18N+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T+T568N；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T+K524T+G526A；或

P2N+P4S+P11F+K34Y+T65A+Q327F+D445N+V447S+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+R31S+K33V+T65A+Q327F+D445N+V447S+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+D26N+K34Y+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+F80*+Q327F+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+K112S+Q327F+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T+T516P+K524T+G526A；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+N502T+Y504*；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+S103N+Q327F+E501V+Y504T；或

K5A+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T+T516P+K524T+G526A；或

P2N+P4S+P11F+T65A+V79A+Q327F+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+V79G+Q327F+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+V79I+Q327F+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+V79L+Q327F+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+V79S+Q327F+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+L72V+Q327F+E501V+Y504T；或

S255N+Q327F+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+E74N+V79K+Q327F+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+G220N+Q327F+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Y245N+Q327F+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q253N+Q327F+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+D279N+Q327F+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+S359N+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+D370N+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+V460S+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+V460T+P468T+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+T463N+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+S465N+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+T477N+E501V+Y504T。

在一个优选的实施例中，该草酸青霉菌葡糖淀粉酶变体具有对应于PE001变体的K79V取代(使用在此的SEQ ID NO:14进行编号)，并且进一步包括以下突变中的一种：

P11F+T65A+Q327F；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；或

P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或

P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T。

该葡糖淀粉酶能以从0.1-100微克EP/g，例如0.5-50微克EP/g，例如1-25微克EP/g，例如2-12微克EP/g DS的量添加。

液化步骤i)中存在的和/或添加的支链淀粉酶

任选地支链淀粉酶，连同α-淀粉酶和/或蛋白酶和/或葡糖淀粉酶可以是液化步骤i)期间存在的和/或添加的。如以上提及的，在液化步骤i)期间，还可以存在或添加葡糖淀粉酶。

支链淀粉酶可以是在液化步骤i)和/或糖化步骤ii)或同时糖化发酵(SSF)中存在的和/或添加的。

支链淀粉酶(E.C.3.2.1.41，支链淀粉6-葡聚糖-水解酶)是去分支酶，其特征在于它们在例如分支淀粉和支链淀粉中水解α-1,6-糖苷键的能力。

根据本发明考虑的支链淀粉酶包括来自美国专利号4,560,651(特此通过引用结合)中披露的淀粉脱支芽孢杆菌(Bacillus amyloderamificans)的支链淀粉酶、WO 01/151620(特此通过引用结合)中披露为SEQ ID NO:2的支链淀粉酶、WO 01/151620(特此通过引用结合)中披露为SEQ ID NO:4的脱支芽孢杆菌(Bacillus deramificans)的支链淀粉酶，以及来自WO 01/151620(特此通过引用结合)中披露为SEQ ID NO:6的嗜酸性普鲁兰芽孢杆菌的支链淀粉酶，以及还有描述于FEMS微生物学通讯(FEMS Mic.Let.)(1994)115,97-106中的支链淀粉酶。

根据本发明考虑的另外的支链淀粉酶包括来自沃斯氏热球菌、特别是来自WO 92/02614中披露的沃斯氏热球菌DSM No.3773的支链淀粉酶。

在一个实施例中，该支链淀粉酶是GH57家族支链淀粉酶。在一个实施例中，该支链淀粉酶包括X47结构域，如披露于作为WO 2011/087836公开的US 61/289,040(将其特此通过引用结合)中。更具体地该支链淀粉酶可以来源于热球菌属的菌株，包括嗜热高温球菌(Thermococcus litoralis)和热水高温球菌，例如热水高温球菌支链淀粉酶，示于SEQ IDNO:11中，刚好在X47结构域之后的X4位点截短(即，在此的SEQ ID NO:11和12中的氨基酸1-782)。该支链淀粉酶还可以是嗜热高温球菌和热水高温球菌支链淀粉酶杂合体或具有截短位点X4的、披露于作为WO 2011/087836公开的US 61/289,040(特此将其通过引用结合)中的以及披露于在此的SEQ ID NO:12中的热水高温球菌/嗜热高温球菌杂合酶。

在另一个实施例中，该支链淀粉酶是包括披露于WO 2011/076123(诺维信公司)中的X46结构域的一种支链淀粉酶。

根据本发明，该支链淀粉酶能以有效量添加，包括约0.0001-10mg酶蛋白/克DS的优选量，优选0.0001-0.10mg酶蛋白/克DS，更优选0.0001-0.010mg酶蛋白/克DS。支链淀粉酶活性可以确定为NPUN。用于确定NPUN的测定法描述于下文的“材料与方法”-部分中。

适合的可商购支链淀粉酶产品包括PROMOZYME D、PROMOZYME^TM D2(诺维信公司，丹麦)、OPTIMAX L-300(杜邦-丹尼斯克(DuPont-Danisco)，美国)、以及AMANO 8安能满公司，日本)。

在糖化和/或发酵中存在的和/或添加的葡糖淀粉酶

糖化、发酵或同时糖化发酵(SSF)中存在和/或添加的葡糖淀粉酶可以源自任何适合的来源，例如，源自微生物或植物。优选的葡糖淀粉酶是真菌或细菌来源的，选自下组，该组由以下各项组成：曲霉属葡糖淀粉酶，特别是黑曲霉G1或G2葡糖淀粉酶(博埃尔(Boel)等人，1984，欧洲分子生物学学会杂志3(5):1097-1102)，或其变体，例如披露于WO 92/00381、WO 00/04136和WO 01/04273中的那些(来自诺维信，丹麦)；披露于WO 84/02921中的泡盛曲霉葡糖淀粉酶，米曲霉葡糖淀粉酶(农业、生物学与化学(Agric.Biol.Chem.)(1991)，55(4)，p.941-949)，或其变体或片段。其他曲霉属葡糖淀粉酶变体包括具有增强热稳定性的变体：G137A和G139A(陈(Chen)等人(1996)，蛋白质工程(Prot.Eng.)9，499-505)；D257E和D293E/Q(陈等人(1995)，蛋白质工程8，575-582)；N182(陈等人(1994)，生物化学杂志(Biochem.J)301，275-281)；二硫键、A246C(费艾洛伯(Fierobe)等人(1996)，生物化学(Biochemistry)，35，8698-8704)；以及在A435和S436位置导入Pro残基(李(Li)等人(1997)，蛋白质工程(Protein Eng.)10，1199-1204)。

其他葡糖淀粉酶包括罗耳阿太菌(以前命名为罗尔伏革菌)葡糖淀粉酶(参见美国专利号4,727,026和长坂(Nagasaka)等人，(1998)，“来自罗尔伏革菌的生淀粉降解葡糖淀粉酶的纯化和特性”(“Purification and properties of the raw-starch-degradingglucoamylases from Corticium rolfsii”)应用微生物学与生物技术(Appl.Microbiol.Biotechnol.)50:323-330)，篮状菌属葡糖淀粉酶，特别是来源于埃默森篮状菌(WO 99/28448)、Talaromyces leycettanus(美国专利登记号32,153)、Talaromycesduponti、以及嗜热篮状菌(美国专利号4,587,215)。在一个优选的实施例中，糖化和/或发酵过程中使用的葡糖淀粉酶是披露于WO 99/28448中的埃默森篮状菌葡糖淀粉酶。

考虑的细菌葡糖淀粉酶包括来自梭状芽孢杆菌属，具体地是嗜热解淀粉梭状芽孢杆菌(C.thermoamylolyticum)(EP 135,138)和嗜热硫化氢梭状芽孢杆菌(C.thermohydrosulfuricum)(WO 86/01831)的葡糖淀粉酶。

考虑的真菌葡糖淀粉酶包括都披露于WO 2006/069289中的瓣环栓菌(SEQ ID NO:20)、纸质厚孢孔菌、和大白桩菇；或披露于WO 2007/124285中的红边隔孢伏革菌(Peniophora rufomarginata)；或其混合物。根据本发明，还考虑了杂合葡糖淀粉酶。实例包括披露于WO 2005/045018中的杂合体葡糖淀粉酶。具体实例包括披露于实例1的表1和4中的杂合葡糖淀粉酶(这些杂合体通过引用而特此结合)。

在一个实施例中，该葡糖淀粉酶来源于密孔菌属的一种菌株，特别是来源于如描述于WO 2011/066576中的密孔菌属的一种菌株(SEQ ID NO 2、4或6)，例如在此的SEQ IDNO:18，或来自粘褶菌属的一种菌株，例如篱边粘褶菌或密粘褶菌的菌株，特别是来源于如描述于WO 2011/068803中的粘褶菌属的一种菌株(SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14或16)。在一个优选实施例中，该葡糖淀粉酶是WO 2011/068803中的SEQ ID NO:2或在此的SEQ IDNO:15(即，篱边粘褶菌葡糖淀粉酶)。在一个优选实施例中，该葡糖淀粉酶是在此的SEQ IDNO:17(即，WO 2014/177546中披露为SEQ ID NO:3的密粘褶菌葡糖淀粉酶)。在一个实施例中，该葡糖淀粉酶来源自黑层孔属的菌株，特别是披露于WO 2012/064351中的黑层孔属的菌株(SEQ ID NO:2)(全部参考文献特此通过引用结合)。

还考虑了如下葡糖淀粉酶，该葡糖淀粉酶展现与上述葡糖淀粉酶中的任一种的高一致性，即，分别与上述酶序列的成熟部分中的任一个，例如在此的SEQ ID NO:15、17、18或19中的任一个，优选在此的SEQ ID NO:15或在此的SEQ ID NO:17具有至少60％，如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％一致性。

在一个实施例中，葡糖淀粉酶能以如下量添加到糖化和/或发酵中：0.0001-20AGU/g DS，优选0.001-10AGU/g DS，尤其是0.01-5AGU/g DS之间，例如0.1-2AGU/g DS。

在一个实施例中，葡糖淀粉酶能以如下量添加到糖化和/或发酵中：1-1,000μgEP/g DS，优选地10-500μg/g DS，尤其是在25-250μg/g DS之间。

在一个实施例中，该葡糖淀粉酶作为进一步包含α-淀粉酶的共混物添加。在一个优选的实施例中，该α-淀粉酶是一种真菌α-淀粉酶，尤其是一种酸性真菌α-淀粉酶。该α-淀粉酶典型地是副活性的。

在一个实施例中，该葡糖淀粉酶是一种共混物，包括WO 99/28448中披露为SEQ IDNO:7的埃默森篮状菌葡糖淀粉酶和在WO 06/069289中披露为SEQ ID NO:2的瓣环栓菌葡糖淀粉酶以及在此的SEQ ID NO:20。

在一个实施例中，该葡糖淀粉酶是一种共混物，包括披露于WO 99/28448中的埃默森篮状菌葡糖淀粉酶、在WO 06/69289中披露为SEQ ID NO:2的瓣环栓菌葡糖淀粉酶和在此的SEQ ID NO:20、以及在WO 2006/069290的表5中披露为V039的具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和SBD的微小根毛霉α-淀粉酶或在此的SEQ ID NO:16。

在一个实施例中，该葡糖淀粉酶是一种共混物，包括披露于WO 99/28448中的埃默森篮状菌葡糖淀粉酶、披露于WO 06/69289中的瓣环栓菌葡糖淀粉酶、以及在WO 2006/069290的表5中披露为V039的具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和SBD的微小根毛霉α-淀粉酶或在此的SEQ ID NO:16。

在一个实施例中，该葡糖淀粉酶是一种共混物，包括如在WO 2011/068803中的SEQID NO:2所示的篱边粘褶菌葡糖淀粉酶以及WO 2013/006756的SEQ ID NO:3披露的、具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的微小根毛霉(具有以下取代：G128D+D143N)。

在一个实施例中，该α-淀粉酶可以是来源于根毛霉属的一种菌株，优选微小根毛霉的一种菌株，例如WO 2013/006756的SEQ ID NO:3中所示的，或是来源于亚灰树花菌属，优选大型亚灰树花菌的一种菌株。在一个优选实施例中，该α-淀粉酶源自具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的微小根毛霉，披露为WO 2006/069290的表5中的V039或在此的SEQ ID NO:16。

在一个实施例中，微小根毛霉α-淀粉酶或具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的微小根毛霉具有以下取代或取代组合中的至少一种：D165M；Y141W；Y141R；K136F；K192R；P224A；P224R；S123H+Y141W；G20S+Y141W；A76G+Y141W；G128D+Y141W；G128D+D143N；P219C+Y141W；N142D+D143N；Y141W+K192R；Y141W+D143N；Y141W+N383R；Y141W+P219C+A265C；Y141W+N142D+D143N；Y141W+K192R V410A；G128D+Y141W+D143N；Y141W+D143N+P219C；Y141W+D143N+K192R；G128D+D143N+K192R；Y141W+D143N+K192R+P219C；G128D+Y141W+D143N+K192R；或G128D+Y141W+D143N+K192R+P219C(使用WO 2013/006756中的SEQ ID NO:3或在此的SEQ ID NO:16进行编号)。

在一个优选的实施例中，该葡糖淀粉酶共混物包括篱边粘褶菌葡糖淀粉酶(例如，WO 2011/068803中的SEQ ID NO:2或在此的SEQ ID NO:15)和微小根毛霉α-淀粉酶。

在一个优选的实施例中，该葡糖淀粉酶共混物包括如在WO 2011/068803中的SEQID NO:2所示的篱边粘褶菌葡糖淀粉酶或在此的SEQ ID NO:15，以及WO 2013/006756的SEQID NO:3披露的、具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的微小根毛霉和在此的SEQ ID NO:16(具有以下取代：G128D+D143N)。

可商购获得的包括葡糖淀粉酶的组合物包括AMG 200L；AMG 300L；SAN^TM SUPER、SAN^TM EXTRA L、SPIRIZYME^TM PLUS、SPIRIZYME^TM FUEL、SPIRIZYME^TM B4U、SPIRIZYME^TMULTRA、SPIRIZYME^TM EXCEL、SPIRIZYME ACHIEVE^TM、和AMG^TM E(来自诺维信公司(NovozymesA/S))；OPTIDEX^TM 300、GC480、GC417(来自杜邦-丹尼斯克公司)；AMIGASE^TM和AMIGASE^TMPLUS(来自帝斯曼公司(DSM))；G-ZYME^TM G900、G-ZYME^TM和G990ZR(来自杜邦-丹尼斯克公司)。

糖化和/或发酵过程中存在的和/或添加的纤维素分解组合物

根据本发明，在糖化、发酵或同时糖化发酵(SSF)中可以存在纤维素分解组合物。

该纤维素分解组合物包括β-葡糖苷酶、纤维二糖水解酶、和内切葡聚糖酶。

适合的纤维素分解组合物的实例可以发现于WO 2008/151079和WO 2013/028928中，将其通过引用结合。

在优选的实施例中，纤维素分解组合物来源于木霉属、腐质霉属、或金孢子菌属的菌株。

在一个实施例中，该纤维素分解组合物来源于里氏木霉、特异腐质霉、和/或卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)。

在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括一种β-葡糖苷酶，优选源自以下各项的β-葡糖苷酶：曲霉属的菌株，如米曲霉，如披露于WO 2002/095014中的β-葡糖苷酶或披露于WO 2008/057637中具有β-葡糖苷酶活性的融合蛋白，或烟曲霉，如披露于WO 2005/047499中的β-葡糖苷酶或在WO 2012/044915中所披露的烟曲霉β-葡糖苷酶变体(诺维信公司)，如具有以下取代的β-葡糖苷酶：F100D、S283G、N456E、F512Y；或青霉属的菌株，如披露于WO 2007/019442中的巴西青霉菌株，或木霉属的菌株，如里氏木霉菌株。

在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，例如来源于嗜热子囊菌属，如金黄色嗜热子囊菌菌株，例如，在WO 2005/074656中描述为SEQ ID NO:2的GH61多肽；或源自梭孢壳属例如土生梭孢壳菌株的GH61多肽，例如在WO2005/074647中描述为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的GH61多肽；或源自曲霉属的菌株例如烟曲霉菌株的GH61多肽，例如在WO 2010/138754中描述为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的GH61多肽；或源自青霉属的菌株例如埃默森青霉菌菌株的GH61多肽，例如在WO 2011/041397中披露的GH61多肽。

在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括一种纤维二糖水解酶I(CBH I)，例如来源于曲霉属的菌株的纤维二糖水解酶I，例如烟曲霉的菌株，例如披露于WO 2011/057140的SEQ ID NO:2中的Cel7a CBHI，或来源于木霉属的菌株，例如里氏木霉的菌株。

在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括纤维二糖水解酶II(CBHII)，例如来源于曲霉属的菌株的纤维二糖水解酶II，例如烟曲霉的菌株；或木霉属的菌株，例如里氏木霉，或梭孢壳属的菌株，例如土生梭孢壳霉的菌株，例如来自土生梭孢壳霉的纤维二糖水解酶II CEL6A。

在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括一种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽以及一种β-葡糖苷酶。

在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括一种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、一种β-葡糖苷酶、以及一种CBH I。

在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括一种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、一种β-葡糖苷酶、一种CBH I、以及一种CBH II。

在一个实施例中，该纤维素分解组合物是一种里氏木霉纤维素分解酶组合物，进一步包括具有纤维素分解增强活性的金黄色嗜热子囊菌GH61A多肽(WO 2005/074656中的SEQ ID NO:2)、以及米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白(WO 2008/057637)。

在一个实施例中，该纤维素分解组合物是一种里氏木霉纤维素分解酶组合物，进一步包括具有纤维素分解增强活性的金黄色嗜热子囊菌GH61A多肽(WO 2005/074656中的SEQ ID NO:2)、以及烟曲霉β-葡糖苷酶(WO 2005/047499的SEQ ID NO:2)。

在一个实施例中，该纤维素分解组合物是一种里氏木霉纤维素分解酶组合物，进一步包括在WO 2011/041397中披露的具有纤维素分解增强活性的埃默森青霉菌GH61A多肽、和烟曲霉β-葡糖苷酶(WO 2005/047499的SEQ ID NO:2)或其具有以下取代的变体：F100D、S283G、N456E、F512Y。

在一个优选的实施例中，该纤维素分解组合物包括一种或多种以下组分：

(i)烟曲霉纤维二糖水解酶I；

(ii)烟曲霉纤维二糖水解酶II；

(iii)烟曲霉β-葡糖苷酶或其变体；及

(iv)一种具有纤维素分解增强活性的青霉属GH61多肽；或其同系物。

在一个优选实施例中，该纤维素分解组合物源自里氏木霉，其包括具有纤维素分解增强活性、源自WO 2012/044915中所披露的埃默森青霉菌菌株(WO 2011/041397中的SEQID NO:2，具有以下取代的烟曲霉β-葡糖苷酶(WO 2005/047499中的SEQ ID NO:2)变体：F100D、S283G、N456E、F512Y)的GH61A多肽；在WO 2011/057140中披露为SEQ ID NO:6的烟曲霉Cel7A CBH1和WO 2011/057140中披露为SEQ ID NO:18的烟曲霉CBH II。

在一个实施例中，该纤维素分解组合物按以下量给予：从0.0001-3mg EP/g DS，优选地，0.0005-2mg EP/g DS，优选0.001-1mg/g DS，更优选0.005-0.5mg EP/g DS，并且甚至更优选0.01-0.1mg EP/g DS。

本发明优选方法的实例

在一个优选的实施例中，本发明涉及用于从含淀粉材料来生产乙醇的方法，这些方法包括以下步骤：

ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；

iii)使用发酵生物进行发酵；

其中该发酵生物是酿酒酵母MBG4851(在澳大利亚维多利亚州国家计量研究所登录号V14/004037下保藏)或一种菌株，该菌株具有与酿酒酵母MBG4851或具有菌株V14/004037的定义特性的酵母菌属菌株V14/004037的衍生物大致一样的性质。

在一个实施例中，在糖化和/或发酵或SSF中添加蛋白酶。

-源自嗜热脂肪芽孢杆菌的一种α-淀粉酶，其包括在位置I181+G182处的双缺失、以及任选的N193F取代；(使用SEQ ID NO:1进行编号)；

ii)使用源自粘褶菌属菌株(如篱边粘褶菌或密粘褶菌)的葡糖淀粉酶进行糖化；

iii)使用发酵生物进行发酵；

-一种源自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶；

-一种蛋白酶，该蛋白酶具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的、超过20％的热稳定性值，优选来源于强烈火球菌和/或金黄色嗜热子囊菌；及

-任选地一种草酸青霉菌葡糖淀粉酶；

ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；

iii)使用发酵生物进行发酵；

-一种α-淀粉酶，优选地源自嗜热脂肪芽孢杆菌，其包括在位置I181+G182处的双缺失，和任选地N193F取代(使用SEQ ID NO:1进行编号)并且具有在pH 4.5、85℃、0.12mMCaCl₂下的至少10的T¹/₂(min)；

ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；

iii)使用发酵生物进行发酵；

i)在80℃-90℃之间的温度下液化该含淀粉材料：

-一种α-淀粉酶，优选源自嗜热脂肪芽孢杆菌，在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl₂下具有至少10的T¹/₂(min)；

-一种蛋白酶，优选来源于强烈火球菌和/或金黄色嗜热子囊菌，具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的、超过20％的热稳定性值；

-任选地一种草酸青霉菌葡糖淀粉酶；

ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；

iii)使用发酵生物进行发酵；

-源自嗜热脂肪芽孢杆菌的一种α-淀粉酶，具有在位置I181+G182处的双缺失、以及任选的取代N193F；以及任选地以下取代集合中的另一种：

-E129V+K177L+R179E；

-

V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；

-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；

-V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；

-E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(使用在此的SEQ ID NO:1进行编号)；

ii)使用葡糖淀粉酶，如来自粘褶菌属菌株(如篱边粘褶菌菌株)的葡糖淀粉酶进行糖化；

iii)使用发酵生物进行发酵；

-源自嗜热脂肪芽孢杆菌的一种α-淀粉酶，具有在位置I181+G182处的双缺失、和任选的取代N193F、以及任选地以下取代集合中的另一种；

-E129V+K177L+R179E；

-

V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；

-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；

-V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；

-E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(使用在此的SEQ ID NO:1进行编号)。

-任选地一种如在SEQ ID NO:14中所示的草酸青霉菌葡糖淀粉酶，具有选自下组的取代：

-K79V；

-K79V+P11F+T65A+Q327F；或

-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；或

-K79V+P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；或

-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；或

-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或

-K79V+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T(使用SEQ ID NO:14进行编号)；

ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；

iii)使用发酵生物进行发酵；

i)在80℃-90℃之间的温度下，使用以下项液化该含淀粉材料：

-源自嗜热脂肪芽孢杆菌的一种α-淀粉酶，其具有在位置I181+G182处的双缺失、和任选的取代N193F、以及进一步任选地以下取代集合中的一种；

-E129V+K177L+R179E；

-

V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；

-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；

-V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；

-E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(使用在此的SEQ ID NO:1进行编号)，

-一种蛋白酶，该蛋白酶具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的、超过20％的热稳定性值，优选来源于强烈火球菌和/或金黄色嗜热子囊菌；

-一种如在SEQ ID NO:14中所示的草酸青霉菌葡糖淀粉酶，具有选自下组的取代：

-K79V；

-K79V+P11F+T65A+Q327F；或

-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；或

-K79V+P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；或

-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；或

-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或

-K79V+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T(使用SEQ ID NO:14进行编号)；

ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；

iii)使用发酵生物进行发酵；其中该发酵生物是酿酒酵母MBG4851(在澳大利亚维多利亚州国家计量研究所登录号V14/004037下保藏)或一种菌株，该菌株具有与酿酒酵母MBG4851或具有菌株V14/004037的定义特性的酵母菌属菌株V14/004037的衍生物大致一样的性质。

-源自嗜热脂肪芽孢杆菌的一种α-淀粉酶，其具有在位置I181+G182处的双缺失、以及任选的取代N193F；

-任选地一种支链淀粉酶；

-具有K79V取代的草酸青霉菌葡糖淀粉酶(使用SEQ ID NO:14进行编号)；

ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；

-在0.5和10微克之间的强烈火球菌蛋白酶/g DS；

ii)使用选自下组的葡糖淀粉酶进行糖化，该组是以下各项：源自曲霉属菌株的葡糖淀粉酶，优选地黑曲霉、泡盛曲霉、或米曲霉；或木霉属的菌株，优选里氏木霉；或篮状菌属的菌株，优选埃默森篮状菌；或密孔菌属的菌株；或粘褶菌属的菌株，例如篱边粘褶菌或密粘褶菌，或黑层孔属的菌株；

i)在80℃-90℃之间的温度下，使用以下项液化该含淀粉材料；

-一种α-淀粉酶，优选地源自嗜热脂肪芽孢杆菌，其具有在位置I181+G182处的双缺失，和任选地取代N193F，并且在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl₂下具有至少10的T¹/₂(min)；

-在0.5和10微克之间的强烈火球菌蛋白酶/g DS；

-任选地一种支链淀粉酶；

-一种草酸青霉菌葡糖淀粉酶；

ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；

i)在80℃-90℃之间的温度下，使用以下项液化该含淀粉材料；

-源自嗜热脂肪芽孢杆菌的一种α-淀粉酶，其具有双缺失I181+G182、以任选的取代N193F；以及任选地以下取代集合中的另一种：

-E129V+K177L+R179E；

-

V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；

-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；

-V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V

-在0.5和10微克之间的强烈火球菌蛋白酶/g DS；及

-任选地一种支链淀粉酶；

-K79V；

-K79V+P11F+T65A+Q327F；或

-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；或

-K79V+P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；或

-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；或

-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或

-K79V+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T(使用SEQ ID NO:14进行编号)；

ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；

iii)使用发酵生物进行发酵；

i)在80℃-90℃之间的温度下，使用以下项液化该含淀粉材料：

-源自嗜热脂肪芽孢杆菌的一种α-淀粉酶，其具有双缺失I181+G182、以任选的取代N193F；以及另外地以下取代集合中的一种：

-E129V+K177L+R179E；

-

V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；

-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；

-V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V

-任选地一种支链淀粉酶；

-K79V；

-K79V+P11F+T65A+Q327F；或

-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；或

-K79V+P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；或

-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；或

-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或

-K79V+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T(使用SEQ ID NO:14进行编号)；

ii)使用选自下组的葡糖淀粉酶进行糖化，该组是以下各项：源自曲霉属菌株的葡糖淀粉酶；或木霉属菌株；篮状菌属菌株、密孔菌属菌株；粘褶菌属菌株；以及黑层孔属菌株；

i)在80℃-90℃之间的温度下，在5.0和6.5之间的pH下，使用以下项液化该含淀粉材料：

-E129V+K177L+R179E；

-

V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；

-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；

-V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V

-一种来源于强烈火球菌的蛋白酶，优选在此的SEQ ID NO:13中所示的蛋白酶；

-K79V；

-K79V+P11F+T65A+Q327F；或

-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；或

-K79V+P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；或

-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；或

-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或

-K79V+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T(使用SEQ ID NO:14进行编号)；

ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；

在一个优选实施例中，本发明的方法包括以下步骤：

-源自嗜热脂肪芽孢杆菌的一种α-淀粉酶，其具有双缺失I181+G182、以及任选的取代N193F；以及任选地以下取代集合中的另一种：

-E129V+K177L+R179E；

-

V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；

-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；

-V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V

-源自强烈火球菌的蛋白酶，优选地在此的SEQ ID NO:13中所示的蛋白酶，其以1-5微克蛋白酶/克DS(如约1.5或3微克蛋白酶/克DS)的剂量存在和/或添加；

-K79V；

-K79V+P11F+T65A+Q327F；或

-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；或

-K79V+P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；或

-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；或

-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或

-K79V+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T(使用SEQ ID NO:14进行编号)；

ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；

iii)使用发酵生物进行发酵；

其中该发酵生物具有以下性质和定义特性中的一种或多种，如所有：

-在相同方法条件下，与Ethanol Red^TM相比，增加乙醇产量；

-在相同方法条件下，与Ethanol Red^TM相比，增加油产量；

i)在80℃-90℃之间的温度下，使用以下项液化该含淀粉材料；

-源自嗜热脂肪芽孢杆菌的一种α-淀粉酶，任选地具有双缺失I181+G182、和任选的取代N193F、以及任选地以下取代集合中的另一种；

-E129V+K177L+R179E；

-

V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；

-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；

-V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V

-任选地强烈火球菌蛋白酶；及

-任选地一种草酸青霉菌葡糖淀粉酶，任选地具有SEQ ID NO:14中所示的序列，该序列具有选自下组的取代：

-K79V；

-K79V+P11F+T65A+Q327F；或

-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；或

-K79V+P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；或

-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；或

-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或

-K79V+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T(使用SEQ ID NO:14进行编号)；

ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；

iii)使用发酵生物进行发酵；

iv)回收该发酵产物以形成全酒糟；

v)将该全酒糟分离为酒糟水和湿饼；

vi)任选地将该酒糟水浓缩为浆料；

其中油是从发酵步骤iii)下游回收/提取并且其中该发酵生物是酿酒酵母MBG4851(在澳大利亚维多利亚州国家计量研究所登录号V14/004037下保藏)或一种发酵生物菌株，该发酵生物菌株具有与酿酒酵母MBG4851或具有菌株V14/004037的定义特性的酵母菌属菌株V14/004037的衍生物大致一样的性质。

在一个实施例中，该发酵生物是一种非重组酵母菌属菌株，优选非重组酿酒酵母菌株。在一个优选的实施例中，该发酵生物是一种非重组酵母菌属菌株，优选地是使用美国专利号8,257,959-BB中所描述和涉及的方法产生的非重组酿酒酵母菌株。

菌株V14/004037(酿酒酵母MBG4851)或菌株V14/004037衍生物的用途

根据本发明，可以将菌株V14/004037(酿酒酵母MBG4851)或菌株V14/004037的衍生物用于增加发酵中乙醇产量。

根据本发明，可以使用菌株V14/004037(酿酒酵母MBG4851)或菌株V14/004037的衍生物以在相同方法条件下，与Ethanol Red^TM相比，产生降低水平的乳酸。

根据本发明，可以使用菌株V14/004037(酿酒酵母MBG4851)或菌株V14/004037的衍生物以在相同方法条件下，与Ethanol Red^TM相比，产生降低水平的甘油；

根据本发明，可以将菌株V14/004037(酿酒酵母MBG4851)或菌株V14/004037的衍生物用于降低发酵中乙醛水平。

在一个实施例中，本发明涉及菌株V14/004037(酿酒酵母MBG4851)或菌株V14/004037的衍生物在相同的方法条件下，与Ethanol Red^TM相比，用于减少发酵中乙醛水平的用途。

已经使待发酵的液化醪液经受α-淀粉酶和从0.5-50微克蛋白酶/克DS，如1-5微克蛋白酶/克DS、如约1.5或3微克蛋白酶/克DS。

该蛋白酶可以是细菌蛋白酶。该蛋白酶可以源自细菌火球菌属菌株，如强烈火球菌菌株(pfu蛋白酶)，如或在此的SEQ ID NO:13。该蛋白酶可以是在此的SEQ ID NO:13中所披露的蛋白酶或是与在此的SEQ ID NO:13具有至少80％一致性，例如至少85％，例如至少90％，例如至少95％，例如至少96％，例如至少97％，例如至少98％，例如至少99％一致性的一种蛋白酶。

用于液化的α-淀粉酶可以是细菌来源的，如来自芽胞杆菌属，如嗜热脂肪芽孢杆菌菌株，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的一种变体，如在此的SEQ ID NO:1中所示的α-淀粉酶。在一个优选实施例中，该嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体选自具有以下突变的组：

-I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E；

-

I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；

-I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；

-I181*+G182*+N193F+V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；及

-

在一个实施例中，已经使待发酵的液化醪液经受α-淀粉酶、葡糖淀粉酶和从0.5-50微克蛋白酶/克DS，如1-5微克蛋白酶/克DS、如约1.5或3微克蛋白酶/克DS。

该葡糖淀粉酶可以源自青霉属菌株，尤其是在此的SEQ ID NO:9或14中所披露的草酸青霉菌菌株。

该葡糖淀粉酶可以是具有K79V取代的草酸青霉菌葡糖淀粉酶变体(使用SEQ IDNO:14中所示的成熟序列进行编号)。

在一个优选的实施例中，该草酸青霉菌葡糖淀粉酶具有K79V取代(使用SEQ IDNO:14进行编号)，并且进一步具有以下各项之一：

-P11F+T65A+Q327F；

-P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F(使用SEQ ID NO:14进行编号)。

本发明的酵母

在一个实施例中，本发明涉及在国家计量研究所(NMI)布达佩斯条约下保藏的、具有保藏登录号V14/004037的酿酒酵母菌株。

世界燃料乙醇的大部分是在底物(如玉米醪)中通过工业规模发酵基于淀粉的糖来生产。在工业规模发酵期间，酵母遇到各种各样的生理挑战，这些挑战包括可变浓度的糖，高浓度的酵母代谢产物如乙醇、甘油、有机酸、渗透胁迫、连同来自污染微生物(如酵母和细菌)的潜在竞争。其结果是，许多酵母菌属菌株不适合用于工业发酵。酵母菌属的最广泛使用的可商购的工业菌株(即，用于工业规模发酵)是，例如，在产品Ethanol Red中所使用的酿酒酵母菌株。该菌株非常适合于工业乙醇生产，然而需要改进的酿酒酵母的菌株。

WO 2011/035392描述了菌株NMI V09/024011，其是一种酿酒酵母菌株，该菌株从玉米醪中比在燃料乙醇工业中使用的酿酒酵母菌株(如Ethanol Red^TM)产生更高水平乙醇。然而，菌株NMI V09/024011的限制是其发酵动力学比Ethanol Red的那些更慢。此外，相对于Ethanol Red，仅当玉米醪大量补充外源糖源如糊精时发现V09/024011产生较高水平的乙醇。在这种条件下，醪液发酵需要进行持续延长时间段，超出了在工业方法中通常遇到的。如此，高浓度糖补充并不一定是工业关联的，并且可能不会大规模遭遇。诸位发明人现在已经生产了菌株号V14/004037，相比于V09/024011或乙醇工业中所使用的可商购的工业酿酒酵母菌株，其能够从在工业规模发酵中遇到的条件(如发酵玉米醪期间遇到的那些)下所消耗的内源性发生的玉米糖产生甚至更高乙醇产量。相比于菌株号V09/024011，菌株号V14/004037还表现出更快的发酵动力学。如在此描述的，在玉米醪的工业发酵期间遇到的条件下由菌株号V14/004037产生的乙醇水平比可商购酵母菌株(如Ethanol Red)产生的乙醇水平以及菌株V09/024011产生的乙醇水平更高。因此，菌株号V14/004037具有用于从底物(如玉米醪)工业生产乙醇的必须特性。

菌株号V14/004037是通过育种形成的非重组酿酒酵母菌株，其：

(a)在玉米醪发酵的相同条件下，在50hr发酵时，比菌株V09/024011和EthanolRed产生更高滴度乙醇；

(b)在玉米醪发酵的相同条件下，在20h时，比V09/024011产生更大量的乙醇；

(c)在玉米醪发酵的相同条件下，比Ethanol Red和V09/024011产生更少甘油。

(d)在玉米醪发酵的相同条件下，在发酵后比Ethanol Red和V09/024011留下更少的葡萄糖剩余；

(e)在玉米醪发酵的相同条件下，在发酵后比Ethanol Red和V09/024011留下更少的麦芽糖剩余。

在此使用的，菌株号V14/004037的定义特性是以下特性中任一种或多种：

(a)在32℃下，在玉米醪发酵的44小时中，产生了从13.0％w/v至14.0％w/v范围内的量的乙醇；

(b)在32℃下，在玉米醪发酵的44小时中，产生了从1.300％w/v至1.400％w/v范围内的量的甘油；

(c)在32℃下，玉米醪发酵50小时后，产生从9至11范围内的所产生的％w/v乙醇与所产生的％w/v甘油的比率；

(d)在32℃下，玉米醪发酵50小时后，产生从100至900、200至850、300至850、400至850范围内的所产生的％w/v乙醇与％w/v葡萄糖剩余的比率；

(e)在32℃下，玉米醪发酵50小时后，产生从30至50范围内的所产生的％w/v乙醇与％w/v麦芽糖剩余的比率。

典型地，从玉米醪发酵产生的乙醇是从与玉米醪同源的糖发酵产生的。与玉米醪同源的糖是源自玉米的糖，而不是从外源性来源添加的糖。

菌株V14/004037还能够在木糖是唯一碳源的介质中生长。在此方面，当在测试T1中所指定的条件下生长时，菌株V14/004037产生约7倍增加的生物质。其结果是，菌株V14/004037可以很容易与以下各项区分：

(a)酵母菌属的天然发生菌株；

(b)不利用木糖的酵母菌属的污染菌株；及

(c)用于乙醇工业中的其他菌株，这些其他菌株不具有菌株V14/004037的乙醇生产能力和/或没有表现出测试T1中约7倍增加的生物质。

因为酵母菌属的当前野生型和工业菌株不能够以菌株V14/004037在木糖上生长的比率在木糖上生长，菌株V14/004037很容易区别于酵母菌属的当前野生型菌株和在本发明之前在乙醇工业中使用的酵母菌属菌株(如Ethanol Red)。

本发明还涉及酵母菌属菌株V14/004037的衍生物。在此使用的，“菌株V14/004037的衍生物”是源自菌株V14/004037的菌株，包括通过诱变、重组DNA技术、交配、细胞融合、或在酵母菌株之间的胞导。源自菌株V14/004037的菌株可以是直接后代(即，在菌株V14/004037和另一种菌株或自身之间交配的产物)、或遥远的后代(其由V14/004037和另一种菌株或自身之间初始交配，随后大量后续交配产生)。

在一个实施例中，菌株V14/004037的衍生物是通过在允许第一酵母菌株和菌株V14/004037之间的DNA组合的条件下用菌株V14/004037培养第一酵母菌株产生的杂合菌株。

在一个实施例中，菌株V14/004037的衍生物可以通过以下各项来制备：

(a)在允许第一酵母菌株和第二酵母菌株之间DNA组合的条件下，用第二酵母菌株培养第一酵母菌株，其中该第二酵母菌株是菌株V14/004037或菌株V14/004037的衍生物；及

(b)分离杂合菌株；并且

(c)任选地使用步骤(b)中分离的杂合菌株作为第一酵母菌株和/或菌株V14/004037的衍生物来重复步骤(a)和(b)。

在一个实施例中，菌株V14/004037的衍生物表现出菌株V14/004037的一种或多种定义特性。使用菌株V14/004037生产表现出菌株V14/004037的一种或多种定义特性的酵母菌属衍生物。在此方面，菌株V14/004037形成了用于制备具有菌株V14/004037定义特性的其他菌株的基础。例如，表现出菌株V14/004037的一种或多种定义特性的酵母菌属菌株可以源自菌株V14/004037，使用如下方法，如：经典交配、细胞融合、或在酵母菌株之间的胞导、诱变或重组DNA技术。

在一个实施例中，表现出菌株V14/004037的一种或多种定义特性的菌株V14/004037的衍生物可以通过如下来产生：

(a)在允许第一酵母菌株和第二酵母菌株之间DNA组合的条件下，用第二酵母菌株培养第一酵母菌株，其中该第二酵母菌株是菌株V14/004037或菌株V14/004037的衍生物；

(b)筛选或选择菌株V14/004037的衍生物，如筛选或选择与第一菌株相比在玉米醪中具有增加的乙醇生产的衍生物、和/或筛选或选择与第一菌株相比在玉米醪中产生较少甘油的杂合体；

(c)任选地用筛选的或选择的菌株作为第一酵母菌株和/或第二酵母菌株重复步骤(a)和(b)，直到获得表现出菌株V14/004037的一种或多种定义特性的菌株V14/004037的衍生物。

如果可以使用方法(如经典交配、细胞融合或胞导)将菌株DNA与第二酵母菌株组合，该第一酵母菌株可以是酵母的任何菌株。典型地，该第一酵母菌株是酵母菌属菌株。更典型地，该第一酵母菌株是酿酒酵母菌株。酿酒酵母是如由库兹曼(Kurtzman)(2003)FEMS酵母研究(FEMS Yeast Research)第4卷，第233-245页所定义的。第一酵母菌株可以具有所希望的性质，这些性质旨在与菌株V14/004037的定义特性结合。该第一酵母菌株可以是，例如，任何酿酒酵母菌株，像例如Ethanol Red、V09/024011。还应当理解的是，第一酵母菌株可以是菌株V14/004037或表现出菌株V14/004037的一种或多种定义特性的菌株。

在允许酵母菌株之间DNA组合的条件下，培养该第一和第二酵母菌株。在此使用的，在酵母菌株之间的“DNA的组合”是指酵母菌株的所有或部分基因组的组合。酵母菌株之间DNA组合可以通过适用于组合至少两个酵母细胞的DNA的任何方法来进行，并且可以包括，例如，交配方法，该交配方法包括酵母菌株的孢子形成以产生单倍体细胞，并且随后将兼容单倍体细胞进行杂交；胞导；或细胞融合如原生质体融合。

在一个实施例中，在允许组合第一酵母菌株和第二酵母菌株之间的DNA的条件下，培养第一酵母菌株与第二酵母，该培养包括：

(i)使该第一酵母菌株和该第二酵母菌株形成孢子；

(ii)用由该第二酵母菌株产生的孢子萌发并且杂交由第一酵母菌株产生的孢子。

在一个实施例中，生产表现菌株V14/004037的一种或多种定义特性的菌株V14/004037的衍生物的方法包括：

(b)使该第一酵母菌株和该第二酵母菌株形成孢子；

(c)用该第二酵母菌株萌发的孢子来萌发并且杂交该第一酵母菌株的孢子；

(d)筛选或选择菌株V14/004037的衍生物，如筛选或选择与第一菌株相比在玉米醪中具有增加的乙醇生产的衍生物、和/或筛选或选择与第一菌株相比在玉米醪中产生较少甘油的杂合体；

(e)任选地用筛选或选择的菌株作为第一和/或第二酵母菌株来重复步骤(b)至(d)。

用于将酵母菌株，并且具体地是酵母菌属菌株形成孢子、萌发和杂交的方法是本领域中已知的，并且描述于，例如，奥苏贝尔(Ausubel)，F.M.等人，(1997)当代分子生物学实验手册(Current Protocols in Molecular Biology)，第2卷，第13.2.1至13.2.5页约翰&威利父子公司(John Willey&Sons Inc)；第7章，“酵母的孢子形成和杂交(Sporulationand Hybridisation of yeast)”由R.R.福韦尔(Fowell)，在“酵母(The Yeasts)”第1卷，A.H.罗斯(Rose)和J.S.哈里森(Harrison)(编辑)，1969，学术出版社。

在一个实施例中，该酵母菌株可以在允许细胞融合的条件下进行培养。使用细胞融合技术用于产生种内或种间杂合体的方法描述于，例如，斯潘塞(Spencer)等人，(1990)，酵母技术(Yeast Technology)，斯潘塞JFT和斯潘塞DM(编辑)，施普林格出版公司，纽约。

在另一个实施例中，该酵母菌株可以在允许胞导的条件下进行培养。用于胞导的方法描述于，例如，英格-雅克摩夫(Inge-Vechymov)等人，(1986)遗传学(Genetika)22:2625-2636；约翰斯顿(Johnston)(1990)，酵母技术(Yeast technology)，斯潘塞JFT和斯潘塞DM(编辑)，施普林格出版公司，纽约。

在一个实施例中，筛选或选择菌株V14/004037的衍生物包括筛选或选择与第一菌株相比在玉米醪中具有增加的乙醇生产的衍生物、和/或筛选或选择与第一菌株相比在玉米醪中产生较少甘油的杂合体。

在另一个实施例中，可以针对具有以下特性中的一种或多种的菌株筛选或选择这些酵母细胞：

(a)在相同条件下，在玉米醪发酵中，生产一定量的乙醇，该量处于从高于由菌株Ethanol Red所产生的量至由菌株V14/004037所产生的量的范围内；

(b)在相同条件下，在玉米醪发酵中，生产一定量的甘油，该量少于由Ethanol Red产生的量至由菌株V14/004037产生的量

(c)在相同条件下，在玉米醪发酵中，生产一定比率的乙醇与甘油，该比率是在从高于Ethanol Red的乙醇与甘油比率的比率至与菌株V14/004037的乙醇与甘油比率大致一样比率的范围内。

(d)在相同条件下，在玉米醪发酵中，生产一定比率的乙醇与葡萄糖，该比率是在从高于Ethanol Red的乙醇与葡萄糖比率的比率至与菌株V14/004037的乙醇与葡萄糖比率大致一样比率的范围内。

(e)在相同条件下，在玉米醪发酵中，生产一定比率的乙醇与麦芽糖，该比率是在从高于Ethanol Red的乙醇与麦芽糖比率的比率至与菌株V14/004037的乙醇与麦芽糖比率大致一样比率的范围内。

用于确定有菌株产生乙醇和甘油的量的方法在本领域中是已知的。例如，测试来确定在发酵玉米醪期间由菌株产生的乙醇和甘油的量的方法描述于，例如，WO 2011/035392中。一旦所产生的乙醇和甘油的量是已知的，那么乙醇/甘油的比率可以很容易确定。因此，使用已知的方法，可以很容易地针对乙醇和/或甘油的生产水平来筛选菌株。

在一个实施例中，表现出菌株V14/004037的一种或多种定义特性的菌株V14/004037的衍生物可以是菌株V14/004037的突变体。用于生产酵母菌属酵母突变体，并且尤其是酿酒酵母突变体的方法在本领域中是已知的，并且描述于，例如，劳伦斯(Lawrence)C.W.(1991)酶学方法(Methods in Enzymology)，194:273-281中。

在另一个实施例中，表现出菌株V14/004037的一种或多种定义特性的菌株V14/004037的衍生物可以是菌株V14/004037的重组衍生物。菌株V14/004037的重组衍生物是通过使用重组DNA技术将核酸引入菌株V14/004037产生的菌株。用于将核酸引入酵母菌属酵母细胞、并且具体地是酵母菌属菌株的方法是本领域中已知的并且描述于，例如，奥苏贝尔(Ausubel)，F.M.等人(1997)，当代分子生物学实验手册(Current Protocols inMolecular Biology)，第2卷，第13.7.1至13.7.7页中，其由约翰&威利父子公司(JohnWiley&Sons Inc)出版。

本发明还涉及使用在此描述的菌株用于生产乙醇的方法。在一个形式中，将菌株V14/004037或表现出菌株V14/004037的定义特性的衍生菌株，在允许发酵可发酵糖的条件下，使用包括可发酵糖的底物进行孵育。该可发酵糖可以是葡萄糖、半乳糖、麦芽糖、果糖和蔗糖中的一种或多种。典型地，该可发酵糖是葡萄糖。当菌株V14/004037非常适合于在玉米醪中的发酵时，可以设想该菌株还可以适用于其他发酵方法。因此，底物中可发酵糖的来源可以是，例如，水解淀粉、水解纤维素、糖蜜、蔗汁、葡萄汁、果汁、葡萄糖、麦芽糊精、原糖汁、半乳糖、蔗糖、或任何其他形式的可发酵糖。在一个形式中，底物中的可发酵糖的来源是水解淀粉。典型地，该淀粉获得自底物如玉米醪。在制备底物中，典型地研磨谷物，并且在导致淀粉水解和释放可发酵糖(如葡萄糖)的条件下，将水和一种或多种水解酶混合。用于水解淀粉的典型的酶包括α-淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、支链淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶、或其混合物。适用于水解的酶可以从，例如，诺维信或杰能科公司获得。在一个形式中，以玉米醪形式提供底物。玉米醪典型地通过以下各项来生产：(a)研磨玉米以形成粉；(b)将该粉与水混合；和(c)水解玉米粉中的淀粉。用于制备玉米醪的方法在本领域中是已知的，并且描述于，例如，托马斯(Thomas)，K.C.等人，(2001)应用生物学杂志(Journal of AppliedMicrobiology)，第90卷，第819-828页。用于制备其他基于淀粉的底物(包括高粱、淀粉流及其组合)的方法在本领域中也是已知的，并且描述于，例如，克维亚特科夫斯基(Kwiatkowski)J.R.等人，(2003)工业作物和产物(Industrial Crops and Products)23:288-296和布萨斯特(Bothast)R.J.和施利澈(Schlicher)M.A.(2005)应用微生物技术(Applied Microbial Biotechnology)67:19-25

在允许可发酵糖发酵的温度下进行发酵。典型地，进行发酵的温度是从25℃-34℃。

该发酵产生在溶液中包括乙醇和剩余糖的酒精醪液和包括残余固体(包括酵母)的颗粒部分。使用本领域中已知的方法(如蒸馏或过滤)将乙醇从醪液中分离。

用于发酵和蒸馏的方法在本领域中是已知的，并且描述于，例如，克维亚特科夫斯基(Kwiatkowski)J.R.等人，(2003)工业作物和产物(Industrial Crops and Products)23:288-296和布萨斯特(Bothast)R.J.和施利澈(Schlicher)M.A.(2005)应用微生物技术(Applied Microbial Biotechnology)67:19-25

本发明进一步涉及生产蒸馏酒糟的方法。蒸馏酒糟可以从发酵中所产生的残余固体使用本领域中已知的并且描述于，例如，美国专利7,572,353中的方法来生产。因为酵母菌属菌株V14/004037减少了发酵后残余的剩余糖的水平，因此使用菌株V14/004037从发酵产生的蒸馏酒糟具有降低的葡萄糖含量，并且因此更稳定其不易发生炭化、焦糖化或被不想要的微生物污染。

此外，蒸馏酒糟中的较低甘油含量是一种方法优势，因为需要较少时间干燥蒸馏酒糟。此外，蒸馏酒糟中较少甘油导致改进的可流动性，并且进一步导致具有较高营养含量(例如，较高蛋白)的蒸馏酒糟。

如在此使用的，单数形式“一种(a)”、“一种(an)”以及“该”包括复数个指示物，除非上下文中另外明确指明。因此，例如，提及“细胞”包括多种此类细胞。除非另外定义，否则在此使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。

如在此使用的，除了由于表达语言或必需含义情况下另有要求外，词语“包含(comprise)”或变形如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”以包容性意义使用，即指定所述特征的存在，但不排除本发明各种实施方式中存在或加入了其他特征。

测试T1

步骤1：使用标准微生物学技术，将酵母菌株划线到使用2％琼脂固化的2％w/v D-葡萄糖、1％细菌蛋白胨和0.5％酵母膏培养基上。

步骤2：在30℃下孵育72小时后，使用无菌微生物环将酵母细胞从板中取出并且接种于50ml的肉汤中至介于0.1和0.2单位(处于T₀的OD₆₀₀)之间的OD₆₀₀(处于600nm的光密度)，该肉汤在250ml埃伦迈尔(Erlenmeyer)烧瓶中包含在蒸馏水中的木糖(5％w/v)、Difco酵母氮源w/o氨基酸(0.67％)、柠檬酸(0.3％)和柠檬酸三钠(0.7％)。0.1单位的OD₆₀₀等于约9x 10⁵酵母细胞/mL。D-(+)-木糖(最低99％)可从西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich)公司获得。

步骤3：在30℃下，在220rpm(10cm轨道直径)的震荡下，将培养物孵育48小时。

步骤4：在48小时孵育后，测量培养物的OD₆₀₀(在T₄₈处的OD₆₀₀)。

步骤5：通过以下公式确定生物质的倍数增加：

在T₄₈处的OD₆₀₀/在T₀处的OD₆₀₀。

本发明的组合物

在此方面中，本发明涉及一种配制的酵母菌属酵母组合物，该酵母菌属酵母组合物包括本发明的酵母菌株和天然发生的和/或非天然发生的组分。

如以上提及的，根据本发明，本发明的酵母菌属酵母菌株，具体地酿酒酵母菌株可以是任何活力形式，包括粉碎、干燥，包括活性干燥和即食、压缩、膏状(液体)形式等。在一个优选的实施例中，本发明的酿酒酵母菌株是干酵母，如活性干酵母或即食酵母。在一个优选的实施例中，本发明的酿酒酵母菌株是粉碎的酵母。在一个优选的实施例中，酿酒酵母菌株是压缩的酵母。在一个实施例中，本发明的酿酒酵母菌株是膏状酵母。

在一个实施例中，本发明涉及一种组合物，该组合物包括本发明的酵母菌属酵母(具体地酵母菌属MBG4851)和选自下组的一种或多种组分，该组由以下各项组成：表面活性剂、乳化剂、树胶、溶胀剂、和抗氧化剂及其他加工助剂。

表面活性剂

根据本发明，该组合物可以包括本发明的酵母菌属酵母(具体地酵母菌属MBG4851)和任何适合的表面活性剂。在一个实施例中，该一种或多种表面活性剂是阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、和/或非离子表面活性剂。

乳化剂

根据本发明，该组合物可以包括本发明的酵母菌属酵母(具体地酵母菌属MBG4851)和任何适合的乳化剂。在一个实施例中，该乳化剂是山梨聚糖的脂肪酸酯。在一个实施例中，该乳化剂选自下组：脱水山梨糖醇单硬脂酸酯(SMS)、单双甘酯的柠檬酸酯、聚甘油酯、丙二醇的脂肪酸酯。

在一个实施例中，本发明的组合物包括本发明的酵母菌属酵母(具体地酵母菌属MBG4851)、和Olindronal SMS、Olindronal SK、或Olindronal SPL，包括欧洲专利号1,724,336(特此通过引用结合)中涉及的组合物。针对活性干酵母，这些产品可以从布塞蒂，奥地利商购获得。

树胶

根据本发明，该组合物可以包括本发明的酵母菌属酵母(具体地酵母菌属MBG4851)和任何适合的树胶。在一个实施例中，树胶选自下组：槐树豆胶、瓜尔胶、黄芪胶、阿拉伯胶、黄原胶和阿拉伯树胶，具体地针对膏状、压缩和干酵母。

溶胀剂

根据本发明，该组合物可以包括本发明的酵母菌属酵母(具体地酵母菌属MBG4851)和任何适合的溶胀剂。在一个实施例中，该溶胀剂是甲基纤维素或羧甲基纤维素。

抗氧化剂

根据本发明，该组合物可以包括本发明的酵母菌属酵母(具体地酵母菌属MBG4851)和任何适合的抗氧化剂。在一个实施例中，该抗氧化剂是丁羟茴醚(BHA)和/或丁羟甲苯(BHT)、或抗坏血酸(维生素C)，具体地针对活性干酵母。

如在此使用的，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”以及“该(the)”包括复数个指示物，除非上下文中另外明确指明。因此，例如，提及“细胞”包括多种此类细胞。除非另外定义，否则在此使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。

在此引用了不同的参考，其披露通过引用以其全部内部结合在此。

材料与方法

材料：

α-淀粉酶A(“AAA”)：嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，具有突变I181*+G182*+N193F，截短至491个氨基酸(使用在此的SEQ ID NO:1进行编号)

α-淀粉酶F：在商品名Fuelzyme^TM下由美国Verenium公司销售的商业α-淀粉酶。

α-淀粉酶369(“AA369”)：嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，具有突变：I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V，截短至491个氨基酸(使用在此的SEQID NO:1进行编号)；

草酸青霉菌葡糖淀粉酶变体PE498(“PoAMG498”)：草酸青霉菌葡糖淀粉酶变体具有以下突变：K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F(使用在此的SEQ ID NO:14进行编号)：

蛋白酶Pfu(“PFU”)：在此的SEQ ID NO:13中示出的源自强烈火球菌的蛋白酶。

蛋白酶X：源自金黄色嗜热子囊菌CGMCC No.0670的、披露为在此的SEQ ID NO:3中的氨基酸1-177以及WO 2003/048353的SEQ ID NO:2中的氨基酸1至177的金属蛋白酶。

葡糖淀粉酶SA(“GSA”)包括一种共混物，该共混物包括WO99/28448中所披露的埃默森篮状菌葡糖淀粉酶(在此的SEQ ID NO:19)、WO 06/69289中披露为SEQ ID NO:2和在此的SEQ ID NO:20的瓣环栓菌葡糖淀粉酶、和具有黑曲霉葡糖淀粉酶连接体的微小根毛霉α-淀粉酶和披露为在此的SEQ ID NO:16、具有以下突变的SBD：G128D+D143N(活度比AGU:AGU:FAU(F)：约30:7:1)。

纤维素酶VD(“CVD”)：纤维分解组合物源自里氏木霉，包括具有纤维素分解增强活性的GH61A多肽(该多肽源自埃默森青霉菌菌株(WO 2011/041397中的SEQ ID NO:2))，WO2012/044915中所披露的、具有以下取代的烟曲霉β-葡糖苷酶变体(WO 2005/047499中的SEQ ID NO:2)：F100D、S283G、N456E、F512Y；在WO2011/057140中披露为SEQ ID NO:6的烟曲霉Cel7A CBH1和WO 2011/057140中披露为SEQ ID NO:18的烟曲霉CBH II。

酵母：

ETHANOL RED^TM(“ER”)：可从美国富酶泰斯公司/乐斯福公司(Fermentis/Lesaffre)获得的酿酒酵母。

MBG4851：由微生物基因(Microbiogen)私人公司，E2单元，巷湾商务园，火星路16号，巷湾，NSW 2066，澳大利亚，依据布达佩斯条约的条款，在澳大利亚维多利亚计量研究所下保藏的以及给出的以下登录号的酿酒酵母(非重组)：

保藏物登录号保藏日期

MBG4851 V14/004037 2014年2月17日

该菌株于下述条件下保藏：确保在本专利申请未决期间，由专利与商标委员依据37C.F.R.§1.14和35U.S.C.§122授权的人能够获得该培养物。所述保藏物代表所保藏菌株的基本上纯的培养物。需要按一些国家的国外专利法要求提供保藏物，在这些国家提交该主题申请的副本，或其后续文本。然而应理解，保藏物的可用性不构成将本发明主题用于由政府行为批准的专利权的实践的许可。

在此描述并且要求保护的本发明不限于在此披露的特定方面的范围，因为这些方面旨在作为本发明若干方面的说明。预期任何等效方面都处于本发明的范围内。实际上，除在此所示和描述的那些之外，本发明的不同修改对于本领域普通技术人员而言从前述描述将变得清楚。此类修改也旨在落入所附权利要求书的范围内。在有冲突的情况下，以包括定义的本披露为准。

方法

一致性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性由参数“一致性”描述。

出于本发明的目的，可以通过程序“比对”确定两个氨基酸序列之间的一致性程度以及两个核苷酸序列之间的一致性程度，所述程序是尼德尔曼-翁施比对(Needleman-Wunsch alignment)(即总体对比)。使用该程序进行多肽以及核苷酸序列的比对。使用缺省评分矩阵BLOSUM50进行多肽比对，使用缺省一致性矩阵进行核苷酸比对。对多肽而言，缺口第一个残基的罚分为-12，对核苷酸而言该罚分为-16。对多肽而言，缺口另外残基的罚分为-2，对核苷酸而言该罚分为-4。

“比对”是FASTA包版本v20u6的一部分(参见皮尔逊(W.R.Pearson)和利普曼(D.J.Lipman)(1988)，用于生物序列分析的改进的工具(“Improved Tools forBiological Sequence Analysis”)，PNAS 85:2444-2448，和皮尔逊(1990)使用FASTP和FASTA进行的快速且灵敏的序列比较(“Rapid and Sensitive Sequence Comparison withFASTP and FASTA”)酶学方法(Methods in Enzymology)183:63-98)。FASTA蛋白比对使用史密斯-沃特曼算法(Smith-Waterman algorithm)进行，对缺口大小没有限制(参见史密斯-沃特曼算法(“Smith-Waterman algorithm”)，史密斯(T.F.Smith)和沃特曼(M.S.Waterman)(1981)分子与生物学杂志(J.Mol.Biol.)147:195-197)。

蛋白酶测定

AZCL-酪蛋白测定

边搅拌边将蓝色底物AZCL-酪蛋白的0.2％溶液悬浮于pH 9的Borax/NaH₂PO₄缓冲液中。边搅拌边将该溶液分散在微量滴定板(每孔100微升)上，添加30微升酶样品并且将这些板在艾本德热混器(Eppendorf Thermomixer)中在45℃和600rpm下孵育30分钟。使用变性的酶样品(100℃煮沸20min)用作空白对照。孵育之后通过将微量滴定板转移到冰上来终止该反应并且通过在4℃下以3000rpm离心5分钟将着色的溶液与固体分离。将60微升的上清液转移到微量滴定板并且使用伯乐酶标仪(BioRad Microplate Reader)测量在595nm处的吸光度。

pNA测定

将50微升含蛋白酶样品添加到微量滴定板并且通过添加100微升1mM pNA底物(5mg溶解于100微升DMSO中并进一步用pH 9.0的Borax/NaH₂PO₄缓冲液稀释至10mL)开始该测定。OD₄₀₅在室温下的增加被监测为蛋白酶活性的一个量度。

葡糖淀粉酶活性(AGU)可以按葡糖淀粉酶单位(AGU)来测量葡糖淀粉酶活性。

Novo葡糖淀粉酶单位(AGU)定义为在以下标准条件下每分钟水解1微摩尔麦芽糖的酶量：37℃，pH 4.3，底物：麦芽糖23.2mM，缓冲液：乙酸盐0.1M，反应时间5分钟。

可以使用自动分析仪系统。将变旋酶添加到葡萄糖脱氢酶试剂中，这样使得存在的任何α-D-葡萄糖变为β-D-葡萄糖。葡萄糖脱氢酶在以上提到的反应中与β-D-葡萄糖特异性反应，形成NADH，在340nm下使用光度计测定该NADH作为原始葡萄糖浓度的量度。

AMG孵育：
		底物：	麦芽糖23.2mM
缓冲液：	乙酸盐0.1M
		pH：	4.30±0.05
孵育温度：	37℃±1℃
		反应时间：	5分钟
酶工作范围：	0.5-4.0AGU/mL

颜色反应：
		GlucDH：	430U/L
变旋酶：	9U/L
		NAD：	0.21mM
缓冲液：	磷酸盐0.12M；0.15M NaCl
		pH：	7.60±0.05
孵育温度：	37℃±1℃
		反应时间：	5分钟
波长：	340nm

更详细描述这种分析方法的文件(EB-SM-0131.02/01)可从丹麦的诺维信公司索取得到，通过引用将该文件结合在此。

酸性α-淀粉酶活性(AFAU)

能以AFAU(酸性真菌α-淀粉酶单位)测量酸性α-淀粉酶活性，相对于酶标准品而确定AFAU。1AFAU被定义为在下述标准条件下每小时降解5.260mg淀粉干物质的酶量。

酸性α-淀粉酶是内-α-淀粉酶(1,4-α-D-葡聚糖-葡糖水解酶，E.C.3.2.1.1)，它水解在淀粉分子的内部区域中的α-1,4-糖苷键以形成具有不同链长度的糊精和寡糖。与碘形成的颜色的强度跟淀粉的浓度成正比。使用反向比色法将酶活性测定为在指定的分析条件下淀粉浓度的减小。

蓝色/紫色 t＝23秒脱色

标准条件/反应条件：

更详细地描述这种分析方法的文件夹EB-SM-0259.02/01可以从丹麦的诺维信公司索取得到，通过引用将该文件夹包括在此。

α-淀粉酶活性(KNU)

可釆用马铃薯淀粉作为底物来测定α-淀粉酶活性。此方法是基于由酶分解改性的马铃薯淀粉，并且该反应随后是将淀粉/酶溶液的样品与碘溶液混合。最初形成微黑蓝色，但淀粉分解过程中蓝色变弱并且逐渐变为红褐色，将其与有色玻璃标准品比较。

1个Kilo Novoα-淀粉酶单位(KNU)定义为在标准条件(即，在37℃+/-0.05℃；0.0003M Ca²⁺；和pH 5.6下)下，糊精化5260mg淀粉干物质默克公司(Merck)可溶性淀粉的酶量。

更详细地描述这种分析方法的文件夹EB-SM-0009.02/01可以从丹麦的诺维信公司索取得到，通过引用将该文件夹包括在此。

α-淀粉酶活性(KNU-A)

相对于所声明强度的酶标准，以KNU(A)Kilo Novozymes单位(A)测量α淀粉酶活性。

样品中的α淀粉酶和试剂盒中的α-葡糖苷酶将底物(4,6-亚乙基(G₇)-对硝基苯基(G₁)-α、D-麦芽七糖苷(亚乙基-G₇PNP)水解成葡萄糖和黄色对硝基苯酚。

通过Konelab 30观察对硝基酚的形成速率。这是反应速率及其酶活性的表达。

该酶是具有酶分类号EC 3.2.1.1的α-淀粉酶。

关于确定KNU-A活性的文件夹EB-SM-5091.02-D可以从丹麦的诺维信公司索取得到，通过引用将该文件夹包括在此。

α-淀粉酶活性KNU(S)

样品中的BS-淀粉酶和试剂盒中的酶α-葡糖苷酶将底物(4,6-亚乙基(G7)-对硝基苯基(G1)-α-D-麦芽七糖苷(亚乙基-G7PNP))水解成葡萄糖和黄色对硝基苯酚。

反应条件

反应：

pH：7.15

温度：37℃

反应时间：180秒

检测

波长：405nm

测量时间：120秒

单位定义

相对于具有声明强度的酶标准品，以KNU(S)Kilo Novo单位(嗜热脂肪(sterarothermophilus))测量嗜热脂肪芽孢杆菌淀粉酶(BS-淀粉酶)活性。

这种分析方法更详细的描述于可从丹麦的诺维信公司索取得到的EB-SM-0221.02(通过引用结合)中。

FAU(F)确定

相对于具有声明强度的酶标准品，测量FAU(F)真菌α-淀粉酶单位(真菌淀粉(Fungamyl))。

更详细地描述这种标准方法的文件夹(EB-SM-0216.02)可以从丹麦的诺维信公司索取得到，通过引用将该文件夹包括在此。

支链淀粉酶活性(NPUN)的确定

相对于诺维信支链淀粉酶标准品测量NPUN中的内切-支链淀粉酶活性。一个支链淀粉酶单位(NPUN)定义为在标准条件下(0.7％红色支链淀粉(red pullulan)(麦格酶公司(Megazyme)，pH 5，40℃，20分钟)每分钟释放1微摩尔葡萄糖的酶量。使用红色普鲁兰以NPUN/ml测量该活性。

将1mL稀释的样品或标准品在40℃下孵育2分钟。添加0.5mL2％红色普鲁兰、0.5MKCl、50mM柠檬酸，pH 5并混合。将这些管在40℃下孵育20分钟并且通过添加2.5ml 80％乙醇终止。将这些管在室温下静置10-60分钟，随后以4000rpm离心10分钟。然后在510nm处测量上清液OD并且使用标准品曲线计算活性。

本发明将在以下实例中进行更详细的描述，这些实例被提供用以说明本发明而决不意图限制本发明要求的范围。在此引用的所有参考文献针对在本文中进行的描述通过引用具体结合。

实例

实例1

α-淀粉酶变体的稳定性

通过将参比α-淀粉酶(具有突变I181*+G182*+N193F的、截短至491个氨基酸的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(以SEQ ID NO:1进行编号))及其α-淀粉酶变体在pH 4.5和5.5下以及在温度75℃和85℃下用0.12mM CaCl₂进行孵育，随后使用底物(超级淀粉酶测定试剂盒(Ultra Amylase assay kit)，E33651，分子探针公司(Molecular Probes))进行残余活性测量来测量该参比α-淀粉酶及变体的稳定性。

使纯化的酶样品在酶稀释缓冲液(10mM乙酸盐、0.01％Triton X100、0.12mMCaCl₂，pH 5.0)中稀释至0.5和1或5和10ppm(微克/毫升)的工作浓度。将二十微升酶样品转移至48孔PCR MTP并且将180微升稳定性缓冲液(150mM乙酸盐、150mM MES、0.01％TritonX100、0.12mM CaCl₂，pH 4.5或5.5)添加至每个孔并且混合。测定使用两种浓度的酶来重复两次执行。在75℃或85℃孵育之前，取出20微升并且储存在冰上作为对照样品。在PCR仪(在75℃和85℃下)中进行孵育。孵育之后，将样品在残余活性缓冲液(100mM乙酸盐、0.01％Triton X100、0.12mM CaCl₂，pH 5.5)中稀释至15ng/ml并且将25微升稀释酶转移至黑色384-MTP。使用EnzChek底物通过将25微升底物溶液(100微克/毫升)添加至每个孔来测量残余活性。使用485-P nm下的激发滤光器以及555nm下的发射滤光器(荧光读取器是Polarstar，BMG)每分钟测量荧光持续15分钟。对于每个设置，将残余活性相对于对照样品标准化。

假定对数式衰减，那么使用方程T¹/₂(min)＝T(min)*LN(0.5)/LN(％RA/100)来计算半衰期时间(T¹/₂(min))，其中T是以分钟为单位的测定孵育时间，并且％RA是在测定中确定的％残余活性。

使用此测定设置，针对参比α-淀粉酶及其变体确定半衰期时间，如表1中所示。

表1

ND未检测到

这些结果证明α-淀粉酶变体比参比α-淀粉酶具有显著更高的半衰期和稳定性。

实例2

蛋白酶变体的制备以及热稳定性测试

菌株与质粒

使用大肠杆菌DH12S(可获得自吉博科公司(Gibco BRL))用于酵母质粒拯救。pJTP000是一种在TPI启动子的控制之下的酿酒酵母和大肠杆菌穿梭载体，构建自描述于WO01/92502中的pJC039，其中已经插入了金黄色嗜热子囊菌M35蛋白酶基因(WO 03048353)。

将酿酒酵母YNG318感受态细胞：MATa Dpep4[cir+]ura3-52、leu2-D2、his 4-539用于蛋白酶变体表达。这被描述于生物化学杂志272(15)，第9720-9727页，1997中。

培养基与底物

10X基础溶液：酵母氮基w/o氨基酸(DIFCO)66.8g/l，琥珀酸盐100g/l，NaOH 60g/l。

SC-葡萄糖：20％葡萄糖(即，终浓度为2％＝2g/100ml)100ml/l，5％苏氨酸4ml/l，1％色氨酸10ml/l，20％酪蛋白氨基酸25ml/l，10X基础溶液100ml/l。使用孔径大小为0.20微米的过滤器将溶液灭菌。将琼脂(2％)和H₂O(大约761ml)一起热压处理，并且向琼脂溶液中添加分开灭菌的SC-葡萄糖溶液。

YPD：细菌蛋白胨20g/l，酵母提取物10g/l，20％葡萄糖100ml/l。

YPD+Zn：YPD+0.25mM ZnSO₄。

PEG/LiAc溶液：40％PEG4000 50ml，5M乙酸锂1ml。

96孔玉米素微滴度板：

每个孔包含200微升的0.05％-0.1％的玉米素(西格玛公司(Sigma))，0.25mMZnSO₄以及1％的琼脂于20mM乙酸钠缓冲液中，pH 4.5。

DNA操纵

除非另外说明，否则使用如以下所述的分子生物学标准方法来进行DNA操纵和转化：萨拉布鲁克等人(1989)，分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港，纽约；奥苏贝尔·F·M(Ausubel,F.M.)等人(编辑)“分子生物学实验指南(Current protocols inMolecular Biology)”，约翰威立父子公司，1995；哈伍德·C·R(Harwood,C.R.)&卡廷·S·M(Cutting,S.M.)(编辑)。

酵母转化

使用乙酸锂法进行酵母转化。混合0.5微升载体(由限制性内切核酸酶消化)以及1微升的PCR片段。将DNA混合物、100微升的YNG318感受态细胞、以及10微升的酵母标记载体DNA(YEAST MAKER carrier DNA)(克罗泰克公司(Clontech))添加到12ml聚丙烯管(猎鹰(Falcon)2059)中。添加0.6ml PEG/LiAc溶液并温和混合。在30℃下并且200rpm孵育30min，并且随后在42℃下30min(热休克)。转移至埃彭道夫管中并且离心5秒。移去上清液并且溶解于3ml的YPD中。在30℃以200rpm孵育该细胞悬浮液45min。将悬浮液倾倒在SC-葡萄糖板上并在30℃孵育3天以生长菌落。通过Zymoprep酵母质粒小提试剂盒提取酵母总DNA(ZYMO研究公司(ZYMO research))。

DNA测序

通过电穿孔(伯乐基因脉冲发生器(BIO-RAD Gene Pulser))进行用于DNA测序的大肠杆菌转化。通过碱法(分子克隆，冷泉港)或使用质粒试剂盒制备DNA质粒。通过凯杰凝胶提取试剂盒从琼脂糖凝胶中回收DNA片段。使用PTC-200DNA引擎(PTC-200DNAEngine)进行PCR。使用ABI PRISMTM 310基因分析器来测定所有的DNA序列。

蛋白酶表达载体的构建

使用引物对Prot F(SEQ ID NO:4)和Prot R(SEQ ID NO:5)扩增嗜热子囊菌属M35蛋白酶基因。将所得PCR片段连同pJC039载体引入酿酒酵母YNG318(描述于WO 2001/92502中)，用限制性内切酶消化以去除特异腐质霉角质酶基因。

回收在SC-葡萄糖板上的酵母克隆中的质粒以确认内部序列并称作pJTP001。

酵母文库和定点变体的构建

通过SOE PCR法(重叠延伸剪接(Splicing by Overlap Extension)，参见“PCR：一种实用方法(PCR:Apractical approach)”，第207-209页，牛津大学出版社(OxfordUniversity press)，编辑麦克弗森(McPherson)、夸克(Quirke)、泰勒(Taylor))构建酵母文库和定点变体，随后进行酵母体内重组。

用于扩增和测序的通用引物

使用引物AM34(SEQ ID NO:6)和AM35(SEQ ID NO:7)通过SOE法与简并引物(AM34+反向引物和AM35+正向引物)一起制备包含任何突变的片段的DNA片段或仅仅扩增整个蛋白酶基因(AM34+AM35)。

通过凯杰凝胶提取试剂盒从琼脂糖凝胶中回收DNA片段。将所得纯化的片段与载体消化物混合。将混合溶液引入酿酒酵母中，以通过体内重组构建文库或定点变体。

相对活性测定

将SC-葡萄糖上的酵母克隆接种进包含YPD+Zn培养基的96孔微滴度板的孔中并在28℃下培养3天。将培养物上清液施加到96孔玉米素微滴定板并在至少2个温度(例如，60℃和65℃、70℃和75℃、70℃和80℃)下孵育超过4小时或过夜。玉米素在板中的浊度被测量为A630并且相对活性(较高/较低温度)被确定为热稳定性改进的一个指示。选择比亲本变体具有更高相对活性的克隆并确定该序列。

残余活性测定

将SC-葡萄糖上的酵母克隆接种进96孔微滴度板的孔中并在28℃下培养3天。将该培养物上清液在特定温度(80℃或84℃，4℃作为一个参考)下于20mM乙酸钠缓冲液、pH 4.5中孵育10min之后，使用偶氮-酪蛋白(麦格酶公司)在65℃下测定蛋白酶活性，从而确定残余活性。选择比亲本变体具有更高残余活性的克隆并确定这些序列。

偶氮-酪蛋白测定

将20微升样品与150微升底物溶液(4ml的在乙醇中的12.5％偶氮-酪蛋白，在96ml的20mM乙酸钠(pH 4.5)中，包含0.01％曲通-100和0.25mM ZnSO₄)混合并孵育4小时或更久。

添加20微升/孔的100％三氯乙酸(TCA)溶液之后，将该板离心并且吸取100微升的上清液以测量A440。

蛋白酶变体在米曲霉中的表达

使用包括蛋白酶变体基因的构建体来构建用于曲霉属的表达载体。曲霉属表达载体由一个表达盒组成，该表达盒是基于融合至构巢曲霉磷酸丙糖异构酶的非翻译前导序列的黑曲霉中性淀粉酶II启动子(Pna2/tpi)和黑曲霉淀粉糖苷酶终止子(Tamg)。质粒上还存在使得可以在作为唯一氮源的乙酰胺上生长的来自构巢曲霉的曲霉属选择性标记amdS。如描述于拉森(Lassen)等人(2001)，应用与环境微生物学(Applied and EnvironmentalMicorbiology)，67，4701-4707中，将蛋白酶变体的表达质粒转化进曲霉属中。用于每个构建体，分离、纯化并在摇瓶中培养10-20个菌株。

所表达的变体的纯化

1.调节0.22μm经过滤的发酵样品的pH至4.0。

2.将样品置于冰浴中，伴随磁力搅拌。以小量的等分部分添加(NH4)2SO4(对应于大约2.0-2.2M(NH4)2SO4，当添加该化合物时未考虑体积增加)。

3.(NH4)2SO4的最终添加之后，将该样品于冰浴中伴随轻柔的磁力搅拌孵育min.45min。

4.离心：日立(Hitachi)himac CR20G高速冷冻离心机，配备有R20A2转头，5℃，20,000rpm，30min。

5.将形成的沉淀溶解于200ml 50mM乙酸钠(pH 4.0)中。

6.通过真空吸引器(易威奇公司(IWAKI))使用0.22μm PES PLUS膜过滤该样品。

7.在冷室中，使用超滤法(来自赛多利斯公司(Vivascience)的Vivacell 250，配备有5kDa MWCO PES膜)将样品脱盐/缓冲液-过夜交换到50mM乙酸钠(pH 4.0)中。使用50mM乙酸钠(pH 4.0)将残余样品稀释至200ml。样品的导电性优选地小于5mS/cm。

8.将样品加载到用50mM乙酸钠(pH 4.0)平衡的阳离子交换柱上。使用3倍柱体积的结合缓冲液(50mM乙酸钠pH 4.0)将未结合样品从该柱洗出，并且使用线性梯度(0-100％洗脱缓冲液(50mM乙酸钠+1M NaCl，pH 4.0))，以10倍柱体积对样品进行洗脱。

9.通过内切-蛋白酶测定(参见下文)测定所收集的级分，随后对所选择的级分进行标准SDS-PAGE(还原条件)。基于内切-蛋白酶测定和SDS-PAGE汇集多个级分。

内切-蛋白酶测定

1.通过磁力搅拌溶解Protazyme OL片/5ml 250mM乙酸钠(pH5.0)(底物：来自麦格酶公司的、目录号PRAK 11/08的内切-蛋白酶Protazyme AK片)。

2.边搅拌边将250微升的底物溶液转移到1.5ml的艾本德管。

3.向每个管中添加25微升的样品(空白对照是样品缓冲液)。

4.将这些管在50℃下在热混器中振荡(1000rpm)孵育15分钟。

5.向每个管中添加250微升的1M NaOH，随后进行涡旋。

6.以16,100×G并且在25℃下离心3min。

7.将200微升的上清液转移到MTP，并且记录590nm处的吸光度。

结果

实例3

使用纯化的酶，所选择变体的温度特征曲线

纯化所选择的显示良好热稳定性的变体并且将经纯化的酶用于如下所述的玉米素-BCA测定中。将该酶在如所指出的升高的温度下孵育60min之后，在60℃确定残余蛋白酶活性。

玉米素-BCA测定：

在不同温度下通过变体蛋白酶进行玉米素-BCA测定以检测释放自玉米素的可溶性蛋白的定量。

方案：

1)混合10ul的10ug/ml酶溶液和100ul的0.025％玉米素溶液于微滴定板(MTP)中。

2)在不同温度下孵育60min。

3)添加10ul的100％三氯乙酸(TCA)溶液。

4)以3500rpm离心MTP 5min。

5)取15ul至一个新的包含100ul BCA测定溶液的MTP中(皮尔斯公司(Pierce)目录号：23225,BCA蛋白测定试剂盒)。

6)在60℃下孵育30min。

7)测量A562。

结果示于表6中。与野生型蛋白酶相比较，所有的经测试的变体均显示改进的热稳定性。

表6.玉米素-BCA测定

实例4

草酸青霉菌葡糖淀粉酶的表征

该草酸青霉菌葡糖淀粉酶披露于在此的SEQ ID NO:9中。

底物。底物：1％可溶性淀粉(西格玛(Sigma)S-9765)于去离子水中

反应缓冲液：0.1M乙酸盐缓冲液，pH 5.3

葡萄糖浓度测定试剂盒：和光葡萄糖测定试剂盒(LabAssay葡萄糖，和光株式会社，目录号298-65701)。

反应条件。将20微升的可溶性淀粉与50微升的乙酸盐缓冲液(pH5.3)混合。添加30微升的酶溶液(50μg酶蛋白质/ml)达到100微升最终体积，随后在37℃下孵育15分钟。

葡萄糖浓度是通过和光试剂盒(Wako kits)测定。

所有这些工作都平行进行。

最适温度。为了评估草酸青霉菌葡糖淀粉酶的最适温度，以上描述的“反应条件”-测定是在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、85℃、90℃以及95℃下进行的。结果示于表7中。

表7最适温度

从这些结果可知草酸青霉菌葡糖淀粉酶在给定条件下的最适温度是在50℃与70℃之间并且该葡糖淀粉酶在95℃维持超过80％活性。

热稳定性。为了评估草酸青霉菌葡糖淀粉酶的热稳定性，对反应条件测定进行修改，其中将酶溶液和乙酸缓冲液在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃和95℃下预孵育15min。孵育之后，向该溶液中添加20微升淀粉并且如上所述进行该测定。

结果示于表8中。

表8热稳定性

从这些结果可知草酸青霉菌葡糖淀粉酶在预孵育15min后在高达70℃下是稳定的，因为它维持超过80％活性。

pH最佳值。为了评估草酸青霉菌葡糖淀粉酶的pH最佳值，在如下pH下进行上述反应条件测定：pH 2.0、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.07.0、8.0、9.0、10.0和11.0。使用以下缓冲液来代替在该反应条件测定中所描述的乙酸盐缓冲液：100mM的琥珀酸、HEPES、CHES、CAPSO、1mM CaCl₂、150mM KCl、0.01％Triton X-100，pH用HCl或NaOH调整到2.0、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0或11.0。

结果示于表9中。

表9 pH最佳值

从这些结果可知在给定条件下草酸青霉菌葡糖淀粉酶在pH 5.0下具有最高活性。该草酸青霉菌葡糖淀粉酶在宽泛的pH范围内是有活性的，因为它在从pH 2至7维持超过50％活性。

pH稳定性。为了评估草酸青霉菌葡糖淀粉酶的热稳定性，将反应条件测定进行修改，其中使用上述pH最佳值下的缓冲液，在具有pH2.0、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.0 7.0、8.0、9.0、10.0和11.0的缓冲液中将酶溶液(50微克/mL)预孵育20小时。预孵育之后，向该溶液中添加20微升可溶性淀粉至100微升的最终体积并且如上所述进行该测定。

结果示于表10中。

表10 pH稳定性

从这些结果可知草酸青霉菌葡糖淀粉酶在预孵育20小时后从pH 3至pH 7是稳定的并且其在pH 8下降低活性。

实例5

蛋白酶Pfu的热稳定性

购买自日本宝酒造生物公司的强烈火球菌蛋白酶(Pfu S)的热稳定性使用如与实例2中相同的方法进行检测。发现热稳定性(相对活性)在pH 4.5下是110％(80℃/70℃)和103％(90℃/70℃)。

实例6

草酸青霉菌菌株的葡糖淀粉酶基因的克隆

草酸青霉菌菌株cDNA的制备。

通过按照cDNA末端系统(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德市的英杰公司(Invitrogen Corp.))的3’快速扩增技术的说明来合成cDNA。

草酸青霉菌菌株的葡糖淀粉酶基因的克隆。

使用下文所示的、被设计成用来从5’端放大葡糖淀粉酶基因的寡核苷酸引物来克隆草酸青霉菌葡糖淀粉酶基因。

正义引物：5’-atgcgtctcactctattatcaggtg-3’(SEQ ID NO:22)

通过PCR用正义引物和AUAP(由cDNA末端系统的3’快速扩增技术提供)、通过使用Platinum HIFI Taq DNA聚合酶(美国加利福尼亚州卡尔斯巴市的英杰公司)来扩增全长基因。扩增反应是由5μl的10x PCR缓冲液、2μl的25mM MgCl₂、1μl的10mM dNTP、1μl的10uM正义引物、1μl的10uM AUAP、2μl的第一链cDNA、0.5μl的HIFI Taq、以及37.5μl的去离子水构成的。PCR程序是：94℃，3min；10个循环：94℃持续40sec，60℃40sec、每循环降低1℃，68℃持续2min；25个循环：94℃持续40sec，50℃40sec，68℃持续2min；在68℃下进行最终延伸持续10分钟。

使用一个pGEM-T载体系统(美国威斯康星州麦迪逊市的普洛麦格公司(PromegaCorporation))将获得的PCR片段克隆到pGEM-T载体(美国威斯康星州麦迪的逊市普洛麦格公司)中以产生质粒AMG 1。对插入到质粒AMG 1中的葡糖淀粉酶基因进行测序确认。将含有质粒AMG 1(表示为NN059173)的大肠杆菌菌株TOP10于2009年11月23日保藏在德国微生物与菌种保藏中心(DSMZ)并且指定保藏号为DSM 23123。

实例7

克隆的草酸青霉菌葡糖淀粉酶的表达

通过PCR使用以下所示的两种克隆引物F和引物R将草酸青霉菌葡糖淀粉酶基因重新从质粒AMG 1克隆到曲霉菌表达载体中，这两种克隆引物是基于已知的序列和添加的标志来设计以用于通过IN-FUSION^TM策略直接克隆。

引物F:5’ACACAACTGGGGATCCACCATGCGTCTCACTCTATTATC(SEQ ID NO:23)

引物R:5’AGATCTCGAGAAGCTTAAAACTGCCACACGTCGTTGG(SEQ ID NO:24)

用质粒AMG 1来进行PCR反应以便扩增全长基因。PCR反应是由40μg的质粒AMG1DNA、1μl的每种引物(100μM)、12.5μl的2x扩展剂高保真主体混合物(Extensor Hi-Fidelity Master Mix，英国拜力公司(ABgene))、以及9.5μl的PCR级水组成。使用DYAD PCR仪(美国加利福尼亚州赫拉克勒斯的伯乐实验室有限公司(Bio-Rad Laboratories,Inc.))进行PCR反应，该仪器的程序为：在94℃下持续2分钟，随后进行94℃持续15秒、50℃持续30秒、以及72℃持续1分钟的25次循环；并且然后在72℃下10分钟。

通过1.0％琼脂糖凝胶电泳使用1×TAE缓冲液来分离反应产物，其中将约1.9kb的PCR产物带从该凝胶中切除并根据制造商的说明使用PCR DNA和凝胶带纯化试剂盒(通用电气医疗集团(GE Healthcare)，英国)进行纯化。根据制造商的说明，使用IN-FUSION^TM Dry-Down PCR克隆试剂盒(美国加利福尼亚州帕洛阿尔托(Palo Alto)的BD生物科学公司(BD Biosciences))将与草酸青霉菌葡糖淀粉酶基因对应的DNA克隆到用BamHI和HindIII线性化的曲霉菌表达载体中。这一线性化的载体构建是如WO 2005/042735 A1所述的。

将2μl体积的连接混合物用于转化25μl的融合蓝色(Fusion Blue)大肠杆菌细胞(包括在N-FUSION^TM Dry-Down PCR克隆试剂盒中)。在42℃下热休克45秒并在冰中冷却之后，添加250μl的SOC培养基，并且将这些细胞在225rpm下在37℃下孵育90分钟，随后铺在每ml含50μg氨苄西林的LB琼脂板上，并在37℃下培养过夜。在每毫升补充有50μg氨苄西林的3ml LB培养基中接种所选择的菌落，并在225rpm下在37℃下孵育过夜。根据制造商的说明使用微型JETSTAR(德国Genomed公司)纯化来自所选择的菌落的质粒DNA。在异源表达之前通过桑格测序(Sanger sequencing)来验证草酸青霉菌葡糖淀粉酶基因序列。选择这些质粒之一用于进一步表达，并将其命名为XYZ XYZ1471-4。

如WO 95/02043所述地制备黑曲霉MBin118的原生质体。将一百μl的原生质体悬浮液与2.5μg的XYZ1471-4质粒相混合，并且添加250微升的60％PEG 4000(艾普利公司(Applichem))(聚乙二醇，分子量4,000)、10mM CaCl₂、以及10mM Tris-HCl(pH 7.5)并轻轻混合。在37℃下孵育该混合物30分钟并且在补充有10mM乙酰胺和15mM CsCl的COVE蔗糖(Cove(科夫)，1996，Biochim.Biophys.Acta(生物化学与生物物理学报)133:51-56)(1M)板上将原生质体与6％的低熔琼脂糖(惠泰克生物分子应用公司(Biowhittaker MolecularApplications))相混合，并将其作为一个顶层添加在补充有10mM乙酰胺和15mM CsCl的COVE蔗糖(1M)板以用于转化株选择(每板4ml顶层琼脂)。在37℃下孵育5天之后，挑取十六个转化株的孢子并将其接种在96深孔MT板中的750μl YP-2％麦芽糖培养基上。在30℃下静止培养5天之后，在SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)凝胶，即Griton XTPrecast凝胶(伯乐公司(BioRad)，美国加利福尼亚州)上分析来自每个孔的10μl培养液，以便基于产生大量葡糖淀粉酶的能力鉴别最好的转化株。在原始转化板上鉴别所选择的转化株并将其作为孢子保存在20％甘油贮备物中并冷冻保存(-80℃)。

培养。在100ml的MLC培养基中接种所选择的转化株并在30℃下在旋转振荡器上的500ml摇瓶中培养2天。将3ml的培养液接种到100ml的M410培养基中并在30℃下培养3天。将培养液离心并使用0.2μm的膜滤器过滤上清液。

α-环糊精亲和凝胶。使10克环氧基活化的琼脂糖6B(英国查尔方特圣吉尔斯(Chalfont St.Giles)的通用电气医疗集团)粉末悬浮在蒸馏水中并在烧结玻璃过滤器上用蒸馏水进行洗涤。使凝胶悬浮于偶合溶液(100ml的12.5mg/mlα-环糊精，0.5M NaOH)并在室温下孵育一天，同时轻轻振荡。在烧结玻璃过滤器上使用蒸馏水洗涤该凝胶，并使其悬浮在pH 10的100ml 1M乙醇胺中，并在50℃下孵育4小时以进行封闭。随后使用pH 8的50mMTris-HCl和可替代地pH 4.0的50mM NaOAc洗涤该凝胶若干次。最后使用平衡缓冲液(50mMNaOAc，150mM NaCl，pH 4.5)将该凝胶装填在35-40ml的柱中。

从培养液纯化葡糖淀粉酶。通过0.22μm PES过滤器过滤来自具有葡糖淀粉酶基因的黑曲霉MBin118的发酵的培养液，并施加在之前在50mM NaOAc、150mM NaCl、pH 4.5缓冲液中平衡的α-环糊精亲和凝胶柱上。使用平衡缓冲液将未结合的材料从该柱中洗出，并且使用3倍柱体积以上的含有10mMβ-环糊精的相同缓冲液洗脱葡糖淀粉酶。

检查洗脱液的葡糖淀粉酶活性以查看葡糖淀粉酶是否已结合至α-环糊精亲和凝胶。然后相对于pH 5.0的20mM NaOAc透析纯化的葡糖淀粉酶样品。最后通过SDS-PAGE检查纯度并且仅发现一条单独的带。

实例8

草酸青霉菌葡糖淀粉酶的定点变体的构建和表达

用实例7所述的质粒XYZ1471-4、使用以下所示的引物K79VF和K79VR(这些引物被设计成用于将成熟序列的位置79处的赖氨酸(K)取代为缬氨酸(V))以及以下所示的引物F-NP003940和R-NP003940(这两个引物基于已知的序列和添加的标志来设计以用于通过IN-FUSION^TM策略直接克隆)进行两个PCR反应。

引物K79V F 18mer GCAGTCTTTCCAATTGAC(SEQ ID NO:25)

引物K79V R 18mer AATTGGAAAGACTGCCCG(SEQ ID NO:26)

引物F-NP003940:5’ACACAACTGGGGATCCACCATGCGTCTCACTCTATTATC(SEQ ID NO:27)

引物R-NP003940:5’AGATCTCGAGAAGCTTAAAACTGCCACACGTCGTTGG(SEQ ID NO:28)

在以下所述的条件下使用PTC-200DNA引擎进行PCR。

根据制造商的说明通过凯杰凝胶提取试剂盒从琼脂糖凝胶中回收DNA片段。根据制造商的说明，使用N-FUSIONTM Dry-Down PCR克隆试剂盒(美国加利福尼亚州帕洛阿尔托的BD生物科学公司)将所得的纯化的两个片段克隆到用BamHI和HindIII线性化的曲霉菌表达载体中。这一线性化的载体构建是如WO 2005/042735 A1所述的。

使用连接混合物来转化大肠杆菌DH5α细胞(东洋公司(TOYOBO))。在每毫升补充有50μg氨苄西林的3ml LB培养基中接种所选择的菌落，并在225rpm下在37℃下孵育过夜。根据制造商的说明使用凯杰质粒微型试剂盒(凯杰公司)从所选择的菌落纯化质粒DNA。在异源表达之前验证草酸青霉菌葡糖淀粉酶定点变体基因序列的序列，并选择这些质粒之一来用于进一步表达并且将其命名为pPoPE001。

如WO 95/02043所述地制备黑曲霉MBin118的原生质体。将一百μl的原生质体悬浮液与2.5μg的pPoPE001质粒相混合，并且添加250微升的60％PEG 4000(艾普利公司(Applichem))(聚乙二醇，分子量4,000)、10mM CaCl₂、以及10mM Tris-HCl(pH 7.5)并轻轻混合。在37℃下孵育该混合物30分钟，并且在补充有10mM乙酰胺和15mM CsCl的COVE蔗糖(科夫，1996，生物化学与生物物理学报133:51-56)中将原生质体与1％的琼脂糖L(日本基因公司(Nippon Gene))相混合，并将其作为一个顶层添加在补充有10mM乙酰胺和15mMCsCl的COVE蔗糖板上以用于转化株选择(每板4ml顶层琼脂)。在37℃下孵育5天之后，挑取十六个转化株的孢子并将其接种在96深孔MT板中的750μl YP-2％麦芽糖培养基上。在30℃下静止培养5天之后，在SDS-PAGE凝胶上分析来自每个孔的10μl培养液以便基于产生大量葡糖淀粉酶的能力来鉴别最好的转化株。

实例9

定点Po AMG变体PE001的纯化

将所选择的变体转化株和表达实例6所述的野生型草酸青霉菌葡糖淀粉酶的菌株培养在100ml的YP-2％麦芽糖培养基中，并且培养物通过0.22μm PES过滤器过滤，并施加在之前于50mM NaOAc、150mM NaCl、pH 4.5缓冲液中平衡的α-环糊精亲和凝胶柱上。使用平衡缓冲液将未结合的材料从该柱中洗出，并且使用3倍柱体积以上的含有10mMβ-环糊精的相同缓冲液洗脱葡糖淀粉酶。

检查洗脱液的葡糖淀粉酶活性以查看葡糖淀粉酶是否已结合至α-环糊精亲和凝胶。随后相对于pH 5.0的20mM NaOAc透析纯化的葡糖淀粉酶样品。

实例10

PE001蛋白酶稳定性的表征

将40μl在50mM乙酸钠缓冲液(pH 4.5)中的酶溶液(1mg/ml)与1/10体积的1mg/ml蛋白酶溶液相混合，该蛋白酶是例如在生物化学杂志(Biochem J.)1975年4月；147(1):45-53中所述的曲霉酸性蛋白酶I(aspergillopepsin I)、或从西格玛公司(Sigma)可商购的产品以及在生物化学杂志(Biochemical journal)[0264-6021]八幡町市岛(Ichishima)2003年第371卷iss:Pt 2第541页中所述的奥瑞素(aorsin)，并且在4℃或32℃下孵育过夜。作为对照实验，将H₂O而不是蛋白酶添加到样品之中。将样品装载在SDS-PAGE上以查看葡糖淀粉酶是否被蛋白酶切割。

在SDS-PAGE中，PE001仅示出与完整分子相对应的一条带，而野生型葡糖淀粉酶被蛋白酶降解并且示出60kCa的更低分子大小的一条带。

表11蛋白酶处理之后的SDS-PAGE结果

N.D.：未检测到。

实例11

培养过程中更少切割

在32℃下将变体和野生型草酸青霉菌葡糖淀粉酶的曲霉菌转化株在含有4X稀释的、补充有10mM乙酸钠缓冲液的YP-2％麦芽糖培养基(pH 4.5)的6孔MT板中培养1周。

将培养物上清液装载在SDS-PAGE上。

表12培养物上清液的SDS-PAGE结果

N.D.：未检测到。

在发酵过程中野生型葡糖淀粉酶被宿主蛋白酶切割，而变体则仅产生完整的分子。

实例12

变体与亲本相比的葡糖淀粉酶活性

针对野生型草酸青霉菌的纯化的酶和变体葡糖淀粉酶检查如上文所述作为AGU测量的葡糖淀粉酶活性。

葡糖淀粉酶单位(AGU)被定义为在标准条件下(37℃，pH 4.3，底物：100mM麦芽糖，缓冲液：0.1M醋酸盐，反应时间：6分钟)每分钟水解1微摩尔麦芽糖的酶的量。

表13

实例13

具有增强的热稳定性的葡糖淀粉酶变体的纯化

可以类似于实例8中描述的程序构建并表达显示出增加的热稳定性的变体。所有变体菌来源于PE001。在YPM培养基中表达以后，将包括T65A或Q327F取代的变体如下进行微纯化：

通过经由0.22μm过滤器过滤除去菌丝体。向滤板(华特曼(Whatman)，UNI过滤器(Unifilter)800μl，25-30μm MBPP)的孔中添加50μl柱材料(根据制造商的推荐，与Mini-Leak二乙烯砜-活化的琼脂糖培养基偶联的α-环糊精)。通过两次添加200μl缓冲液用结合缓冲液(200mM乙酸钠，pH 4.5)平衡该柱材料，剧烈震荡10min(海道夫(Heidolph)，Titramax 101摇床，1000rpm)并且通过真空除去缓冲液(华特曼，UniVac 3)。随后，添加400μl培养上清液和100μl结合缓冲液，并且在剧烈振荡下将板孵育30min。通过真空除去未结合的材料并且重复结合步骤。通常地，每个变体使用4个孔。然后通过添加200μl具有减少的离子强度的缓冲液(50/10/5mM乙酸钠，pH 4.5)进行三个洗涤步骤，振荡15min并且通过真空除去缓冲液。通过两次添加100μl洗脱缓冲液(250mM乙酸钠，0.1％α-环糊精，pH 6.0)洗脱结合的AMG，振荡15min并且通过真空收集在微量滴定板中的洗脱材料。将合并的洗脱物浓缩并且使用具有10kDa截留单位的离心过滤器(Millipore Microcon Ultracel YM-10)将缓冲液变为50mM乙酸钠，pH 4.5。将微纯化的样品保存在-18℃下直到热稳定性测试。

实例14

蛋白质热解折叠分析(TSA，热转变测定(Thermal shift assay))。

使用宝石橙(Sypro Orange)(英杰公司，S-6650)监测T65A和Q327F变体的蛋白质热解折叠并且使用实时PCR仪(应用生物系统公司(Applied Biosystems)；一步一加(Step-One-Plus))进行。

在一个96孔板中，将25微升微纯化的、处于约100微克/ml的50mM乙酸盐(pH 4,5)中的样品与宝石橙(5:1)相混合(所得浓度＝5X；来自供应商的母液＝5000X)。用光学PCR密封件密封该平板。将PCR仪的扫描速率设置为每小时76℃，起始于25℃并且结束于96℃。

使用宝石橙(Sypro Orange)(英杰公司，S-6650)监测E501V+Y504T变体的蛋白质热解折叠并且使用实时PCR仪(应用生物系统公司(Applied Biosystems)；一步一加(Step-One-Plus))进行。

在一个96孔板中，在具有或不具有200ppm阿卡波糖(Acarbose)(西格玛公司A8980)的情况下，将15微升纯化的、处于约50微克/ml的50mM乙酸盐(pH 4,5)中的样品与宝石橙(1:1)相混合(所得浓度＝5X；来自供应商的母液＝5000X)。用光学PCR密封件密封该平板。将PCR仪的扫描速率设置为每小时76℃，起始于25℃并且结束于96℃。

使用用于激发的内置(in-built)LED蓝光和ROX-滤波器(610nm，发射)每20秒监测荧光。

将Tm值计算为第一衍生物的最大值(dF/dK)(参考：格雷戈里(Gregory)等人；生物分子筛选杂志(J Biomol Screen)2009 14:700)。

表14a.

实例15

通过差示扫描量热法(DSC)分析热稳定性

基本如在实例8中所描述构建在特定位置处具有取代和/或缺失的额外的位点特异性变体并且如在实例11中所描述进行纯化。

使用VP-毛细管差示扫描量热器(美国新泽西州的皮斯卡塔韦的米克罗卡公司(MicroCal Inc.))，通过差示扫描量热法(DSC)在pH 4.0或4.8处(50mM乙酸钠)测定纯化的Po-AMG PE001衍生的变体的热稳定性。在以200K/hr的恒定的程序化加热速率下，在选择的缓冲液(50mM乙酸钠，pH 4.0或4.8)中加热酶溶液后获得的热分析图(Cp对T)中，将热变性温度Td(℃)当作变性峰(主要的吸热峰)的顶端。

将样品和参比溶液(约0.3ml)从10℃下的储存条件装载到量热仪中(参考：不具有酶的缓冲液)，并且在20℃下热预平衡10分钟，随后从20℃到110℃进行DSC扫描。以约+/-1℃的精确度测定变性温度。

分离的变体以及DSC数据披露于下表15中。

表15

实例16

通过热应激测试和pNPG测定分析热稳定性

从来自实例15的经鉴别的取代变体之一(被鉴别为GA008)开始，通过热应激测定测试额外的变体，在该热应激测定中在83℃下热休克5min后，测定来自生长培养物的上清液的葡糖淀粉酶(AMG)活性。

在热休克以后，测量变体连同在非应激样品中的变体的残余活性。

Po-AMGpNPG活性测定的说明：

草酸青霉菌葡糖淀粉酶pNPG活性测定是一种光谱端点测定(spectrometricendpoint assay)，其中将样品一分为二并且进行热应激地和非热应激地测量。所以，数据输出是应激样品中的残余活性的量度。

生长：

向无菌微量滴定板(MTP)的每个孔中添加200μL富生长培养基(没有Dowfax的FTX-14)。将来自冻存物的感兴趣的菌株一式三份地直接接种在MTP中。在20个孔中接种基准物。将具有培养基的未接种的孔用作测定空白。将MTP放在包含湿巾的塑料箱中，以阻止孵育过程中这些孔的蒸发。将塑料箱在34℃下放置4天。

测定：

将50μL上清液转移至50μL 0.5M NaAc(pH 4.8)中，以获得的准确的样品pH。

将50μL稀释物转移至PCR板上并且在PCR仪中在83℃下热应激5分钟。将剩余的一半稀释物保持在室温下。

将20μL的应激的和非应激的样品转移至标准MTP中。添加20μL pNPG-底物，以起始该反应。将该板在室温下孵育1小时。

终止该反应并且通过添加50μL 0.5M Na₂CO₃进行显色。在405nm处，在酶标仪(分子设备公司(Molecular Devices))上测量黄色。

缓冲液：

0.5M NaAc pH 4.8

0.25M NaAc pH 4.8

底物，6mM pNPG：

15mg在10mL 0.25NaAc(pH 4.8)中的4-硝基苯基D-吡喃葡萄糖苷

终止/显色溶液：

0.5M Na₂CO₃

数据处理：

在Excel中，来自应激和非应激样品两者的原始Abs405数据是用其对应的空白进行空白消减的。计算残余活性(％残余活性＝(Abs_非应激-(Abs_非应激-Abs_应激))/Abs_非应激*100％)并且相对于基准Po-amg0008绘图。

表16

表17

实例17

热稳定性变体的葡糖淀粉酶活性测试

已经使用在实例16中描述的pNPG测定证实了在表15、16、和17中披露的所有以上描述的变体在培养上清液上的葡糖淀粉酶活性。

实例18

在用不同的水平的Pfu蛋白酶产生的醪液中改进的乙醇生产。

与Ethanol Red^TM相比，评估MBG4851在用一种共混物液化的液化物中的性能，该共混物具有α-淀粉酶(2.1μg EP AA369/g DS)、葡糖淀粉酶(4.5μg EP PoAMG498/g Ds)和增加水平的Pfu蛋白酶(0.0385、1.5、和3.0μg EP Pfu/g DS)。

液化

通过将研磨的玉米、逆流与自来水组合，至160g的总目标重量，干固体(DS)为32.50％，来制备液化；将逆流以30％w/w(逆流重量/醪液总重量)共混。将在2012年12月12日接收的来自林肯道能源(Lincolnway Energy)的逆流和研磨的玉米用于所有液化。初始浆料pH为5.0，并且因此无需进一步调整。然后，添加水和酶，随后密封所有Labomat罐并且开始200ml程序：5℃/min。渐变，15分钟渐变至80℃，保持1min，以1℃/min渐变至85℃并且保持103min，40rpm向左转30秒并且向右转30秒。将所有醪液罐在冰浴中冷却并且根据以下描述的SSF程序制备用于发酵。添加2.1μg EP AA369/g DS和4.5μg EP PoAMG498/g DS。在液化中测试三个Pfu剂量：0.0385、1.5、和3.0μg EP/g DS。

酵母菌株和制剂

该实验中所测试的两种酵母菌株是Ethanol Red^TM(富酶泰斯公司)和MBG4851。将酵母在过滤器消毒的液体培养基(2％w/v D-葡萄糖、1％蛋白胨、和0.5％酵母提取物)中进行增殖。在UV防护罩下使用无菌环，将来自菌苔的细胞转移到50mL顶部钻有一个孔的无菌离心管中的25mL的液体培养基中，并且在150rpm下，在30℃空气震荡器中进行孵育。将管倾斜约30度以增加通气。在18小时处，通过在3000rpm下旋转10分钟获得细胞，并且倾析上清液。将细胞在25ml水中洗涤一次，并且将得到的细胞沉淀再悬浮于1.5ml自来水中。重复使用YC-100确定总酵母浓度。

同时糖化发酵(SSF)

将青霉素添加到各醪液中至3ppm的终浓度。液化后的pH为5.1并且不用针对SSF进一步调节。将尿素添加到各醪液中至500ppm的终浓度。将约5克的各醪液转移至试管中，这些试管具有在顶部钻的1/64洞，以允许CO₂释放。将葡糖淀粉酶SA和纤维素酶VD的共混物以110μg EP GSA/g DS和30μg EP CVD/g DS给予到各醪液管中。将酵母以10e6细胞/g醪液给出。将milli-Q水添加到各管中，这样使得添加到各管的液体(酶+Mq水)的总体积与醪液重量是等比例的。在32℃水浴中进行发酵54小时。在整个发酵中，将样品进行定期涡旋(在早上和在晚上)。

HPLC分析

在发酵54小时后通过每个处理舍弃3个管进行发酵取样。每个管通过用50μL的40％v/v H₂SO₄失活、涡旋、以1460×g离心10分钟，并且通过0.45μm沃特曼PP过滤器(Whatman PP filter)过滤进行处理用于HPLC分析。无需进一步稀释，处理所有54小时样品。在HPLC分析之前和过程中将样品储存在4℃下。

表18：HPLC系统

针对糖(DP4+、DP3、DP2、葡萄糖、和果糖)、有机酸(乳酸和乙酸)、甘油、和乙醇分析样品。在结果的基础上，使用JMP软件(SAS公司，卡里(Cary)，北卡罗来纳州)进行图基-克雷默(Tukey-Kramer)分析。

结果

下表2显示出在三个制备的醪液中的每个在发酵54小时处针对两种酵母的滴度。图基-克雷默分析指示出所有三个醪液中的最终乙醇滴度针对MBG4851无统计学差异。然而，当发酵生物是Ethanol Red时，随着液化期间Pfu增加，可见统计学显著改善。

表19：乙醇滴度和图基-克雷默分析

^*不是由相同字母连接的水平是显著不同的

在所测试的条件下，MBG4851具有比Ethanol Red更高的乙醇滴度。与Ethanol Red相比，当MBG4851是发酵生物时可见乙醇提升，参见下表20。在液化期间用MBG4851看到的最终乙醇滴度的提升下降为Pfu，并且因此醪液中可用的氮增加。

表20：在不同水平的Pfu下乙醇提升超过Ethanol Red

当发酵生物是MBG4851时，Pfu剂量对乙醇产量没有显著影响。当Ethanol Red是发酵生物时，增加的Pfu剂量和因此可用的氮增加乙醇至少2％。

实例19

在用不同水平的Pfu蛋白酶产生的醪液中改进的乙醇生产和减少的Pfu需求。

与Ethanol Red^TM相比，评估MBG4851在用一种共混物液化的液化物中的性能，该共混物具有α-淀粉酶(2.1μg EP AA369/gDS)、葡糖淀粉酶(4.5μg EP PoAMG498/g Ds)和增加水平的Pfu蛋白酶(0.0385、1.5、和3.0μg EP Pfu/g DS)。

将与Ethanol Red相比的MBG4851性能在液化物中与增加水平的Pfu蛋白相比。本实验用两个水平的N、0和500ppm尿素进行，以确定在较低水平的所添加的尿素下，不同Pfu水平是否具有作用。

液化

通过将研磨的玉米、逆流与自来水组合，至160g的总目标重量，干固体(DS)为32.50％，来制备液化；将逆流以30％w/w(逆流重量/醪液总重量)共混。将在2012年12月12日接收的来自林肯道能源(Lincolnway Energy)的逆流和来自奥罗拉(Aurora)的研磨的玉米用于所有液化。初始浆料pH为5.0，并且因此无需进一步调整。然后，添加水和酶，随后密封所有Labomat罐并且开始200ml程序：5℃/min。渐变，15分钟渐变至80℃，保持1min，以1℃/min渐变至85℃并且保持103min，40rpm向左转30秒并且向右转30秒。将所有醪液罐在冰浴中冷却并且根据以下描述的SSF程序制备用于发酵。添加2.1μg EP AA369/g DS和4.5μgEP PoAMG498/g DS。在液化中测试三个Pfu剂量：0.0385、1.5、和3.0μg EP/g DS。

酵母菌株和制剂

该实验中所测试的两种酵母菌株是Ethanol Red(富酶泰斯公司)和MBG4851。将酵母在过滤器消毒的液体培养基(2％w/v D-葡萄糖、1％蛋白胨、和0.5％酵母提取物)中进行增殖。在UV防护罩下使用无菌环，将来自菌苔的细胞转移到50mL顶部钻有一个孔的无菌离心管中的25mL的液体培养基中，并且在150rpm下，在30℃空气震荡器中进行孵育。将管倾斜约30度以增加通气。在18小时处，通过在3000rpm下旋转10分钟获得细胞，并且倾析上清液。将细胞在25ml水中洗涤一次，并且将得到的细胞沉淀再悬浮于1.5ml自来水中。重复使用YC-100确定总酵母浓度。

同时糖化发酵(SSF)

将青霉素添加到各醪液中至3ppm的终浓度。液化后的pH为5.1并且不用针对SSF进一步调节。将尿素添加到各醪液的一半中至0ppm的终浓度，并且添加到各醪液的另一半中至500ppm的终浓度。将约5克的得到的6个醪液中的每个转移至试管中，这些试管具有在顶部钻的1/64洞，以允许CO2释放。将葡糖淀粉酶SA(GSA)和纤维素酶VD(CVD)的共混物以110μg EP GSA/g DS和30μg EP CVD/g DS给予到各醪液管中。将酵母以10e6细胞/g醪液给出。将milli-Q水添加到各管中，这样使得添加到各管的液体(酶+Mq水)的总体积与醪液重量是等比例的。在32℃水浴中进行发酵54小时。在整个发酵中，将样品进行定期涡旋(在早上和在晚上)。

HPLC分析

表21：HPLC系统

针对糖(DP4+、DP3、DP2、葡萄糖、和果糖)、有机酸(乳酸和乙酸)、甘油、和乙醇分析样品。在结果的基础上，使用JMP软件(SAS公司，卡里(Cary)，北卡罗来纳州)进行图基-克雷默分析

结果

分析54小时乙醇滴度并且下表22示出了结果。

表22：54小时乙醇滴度

^*不是由相同字母连接的水平是显著不同的

在所测试的条件下，MBG4851具有比Ethanol Red更高的乙醇滴度。与Ethanol Red相比，当MBG4851是发酵生物时可见乙醇提升，参见下表23。在液化期间用MBG4851看到的最终乙醇滴度的提升下降为Pfu，并且因此醪液中可用的氮增加。

表23：在不同N和Pfu水平下超过Ethanol Red的乙醇提升

当使用500ppm尿素时，MBG4851再一次不需要更高的Pfu剂量以达到最大乙醇。当不添加尿素时，MBG4851性能随着Pfu剂量增加，但是通过1.5μg EP/g Ds达到最大限度。在两种水平的氮下，当Ethanol Red是发酵生物时，更高剂量Pfu增加乙醇产量。

实例20

在用不同水平的Pfu蛋白酶产生的无逆流的醪液中改进的乙醇生产和减少的氮需求。

与Ethanol Red相比，评估MBG4851在用一种共混物液化的液化物中的性能，该共混物具有α-淀粉酶(2.1μg EP AA369/g DS)、葡糖淀粉酶(4.5μg EP PoAMG498/g Ds)和增加水平的Pfu蛋白酶(0.0385和3.0μg EP Pfu/g DS)。

实例19显示出MBG4851酵母比Ethanol Red酵母具有更低的氮需求。当将3μg Pfu/g Ds用于液化中时，MBG4851不需要任何添加的尿素；然而，针对ER，添加500ppm尿素增加了乙醇产量。当在液化中使用0.0385μg Pfu/g DS时，在发酵中MBG4851需要在0和500ppm之间的某个量的添加的尿素。此前实例在液化中使用了工厂逆流，这可能贡献了一些尿素(连同肽和氨基酸)。因此，这不是一个真正的无尿素测试；如果工厂消除了尿素使用，那么在逆流中将不存在尿素。此实例在无逆流液化物中测试了5种不同尿素水平(0、200、300、500、和1000ppm)。

液化

通过将研磨的玉米和自来水合并至160g的目标总重量，干固体(DS)为32.50％，来制备液化。使用来自奥罗拉的研磨的玉米用于所有液化。使用40％v/v硫酸和50％w/w氢氧化钾调节pH至5.1。然后，添加酶，随后密封所有Labomat罐并且开始200ml程序：5℃/min。渐变，15分钟渐变至80℃，保持1min，以1℃/min渐变至85℃并且保持103min，40rpm向左转30秒并且向右转30秒。将所有醪液罐在冰浴中冷却并且根据以下描述的SSF程序制备用于发酵。添加2.1μg EP AA369/g DS和4.5μg EP DS PoAMG498。在液化中测试两个Pfu剂量：0.0385和3.0μg EP/g DS。

酵母菌株和制剂

该实验中所测试的两种酵母菌株是Ethanol Red(富酶泰斯公司)和MBG4851。通过将2.75g的干酵母称重到在125mL埃伦迈尔烧瓶中50ml的32℃自来水中，来将酵母再水化。然后将烧瓶用封口膜覆盖，并且允许在32℃水浴中进行孵育。在15分钟后，涡旋这些烧瓶，但是不进行其他搅动。在总计30分钟后，将这些烧瓶从水浴中去除。重复使用YC-100确定总酵母浓度。

同时糖化发酵(SSF)

将青霉素添加到各醪液中至3ppm的终浓度。液化后的pH为5.1并且不用针对SSF进一步调节。将尿素调节到所希望的水平，并且添加水以保持醪液之间一致的固体水平。将约5克的得到的醪液中的每个转移至试管中，这些试管具有在顶部钻的1/64洞，以允许CO₂释放。将葡糖淀粉酶SA(GSA)和纤维素酶VD(CVD)的共混物以110μg EP GSA/g DS和30μg EPCVD/g DS给予到各醪液管中。将酵母以10e6细胞/g醪液给出。将milli-Q水添加到各管中，这样使得添加到各管的液体(酶+Mq水)的总体积与醪液重量是等比例的。在32℃水浴中进行发酵54小时。在整个发酵中，将样品进行定期涡旋(在早上和在晚上)。

HPLC分析

在发酵54小时后通过每个处理舍弃3个管进行发酵取样。每个管通过用50μL的40％v/v H2SO4失活、涡旋、以1460×g离心10分钟，并且通过0.45μm沃特曼PP过滤器(Whatman PP filter)过滤进行处理用于HPLC分析。无需进一步稀释，处理所有54小时样品。在HPLC分析之前和过程中将样品储存在4℃下。

表24：HPLC系统

结果

分析54小时乙醇滴度，并且所观察到的结果和乙醇提升示于下表8中。当使用较低水平的Pfu时，针对两种酵母、直到高达500ppm所添加的尿素，所添加的尿素增加了乙醇滴度，在500ppm所添加的尿素这一点，MBG4851乙醇滴度保持一致。当添加1000ppm尿素时，Ethanol Red滴度继续增加。当在液化期间使用更高水平Pfu时，所添加的尿素对MBG4851发酵没有作用。在该水平下，针对这种酵母，所发酵的0ppm添加的尿素与1000ppm添加的尿素处于相同水平。在更高的Pfu醪液中，Ethanol Red需要至少500ppm尿素来发酵至最大乙醇量。

表25：在54个小时下的乙醇滴度和所观察到的提升

实例21

在工业生产的玉米醪中减少氮(尿素)需求来发酵至最大乙醇量

在具有不同尿素补充水平的工业生产的、α-淀粉酶(α-淀粉酶A)液化的玉米醪中，与Ethanol Red相比，评估MBG4851的性能。

玉米醪

从Lincolnland获得工业制备的玉米醪。通过105℃干燥箱，测量醪液的固体为31.5％。

酵母菌株和制剂

该实验中所测试的两种酵母菌株是Ethanol Red(富酶泰斯公司)和MBG4851。通过将2.75g的干酵母称重到在125mL埃伦迈尔烧瓶中50ml的32℃自来水中，来将酵母再水化。然后将烧瓶用封口膜覆盖，并且允许在36.5℃水浴中进行孵育。在15分钟后，涡旋这些烧瓶，但是不进行其他搅动。在总计30分钟后，将这些烧瓶从水浴中去除。重复使用YC-100确定总酵母浓度。

同时糖化发酵(SSF)

HPLC分析

表26：HPLC系统

结果

54小时结果示于下表27中。

表27：54小时乙醇滴度

^*不是由相同字母连接的水平是显著不同的

当没有向发酵中添加尿素时，两种酵母发酵成最低乙醇滴度。当向发酵中添加极高水平的尿素(3000ppm)时，在两种酵母之间另一个相似点是乙醇滴度的下降。MBG4851示出，其需要150ppm或更少添加的尿素来发酵这种玉米醪至最大乙醇。Ethanol Red^TM并没有达到其顶峰，直到添加在300和600ppm之间某个量的尿素。这意味着用这种酵母，尿素添加减少至少2倍是可能的。

下表28示出，在各种水平的氮补充下，MBG4851性能超过Ethanol Red最少1.25％。

表28：在各种水平的氮补充下，当MBG4851与Ethanol Red相比时，乙醇提升。

实例22

在用不同水平Pfu蛋白酶产生的醪液的发酵中的乳酸减少。

当使用MBG4851时，与Ethanol Red^TM相比，评估在用一种共混物液化的液化物中的乳酸水平，该共混物具有α-淀粉酶(2.1μg EP AA369/g DS)、葡糖淀粉酶(4.5μg EPPoAMG498/g Ds)和增加水平的Pfu蛋白酶(0.0385、1.5、和3.0μg EP Pfu/g DS)。

液化

通过将研磨的玉米、逆流与自来水组合至160g的总目标重量，干固体(DS)为32.50％，来制备实验1液化；逆流以30％w/w(逆流重量/醪液总重量)共混。将在2012年12月12日接收的来自林肯道能源(Lincolnway Energy)的逆流和研磨的玉米用于所有液化。初始浆料pH为5.0，并且因此无需进一步调整。然后，添加水和酶，随后密封所有Labomat罐并且开始200ml程序：5℃/min。渐变，15分钟渐变至80℃，保持1min，以1℃/min渐变至85℃并且保持103min，40rpm向左转30秒并且向右转30秒。将所有醪液罐在冰浴中冷却并且根据以下描述的SSF程序制备用于发酵。添加2.1μg EP AA369/g DS和4.5μg EP DS PoAMG498。在液化中测试三个Pfu剂量：0.0385、1.5、和3.0μg EP/g DS。

通过将研磨的玉米、逆流与自来水组合至160g的总目标重量，干固体(DS)为32.50％，来制备实验2液化；逆流以30％w/w(逆流重量/醪液总重量)共混。将在2012年12月12日接收的来自林肯道能源(Lincolnway Energy)的逆流和来自奥罗拉(Aurora)的研磨的玉米用于所有液化。初始浆料pH为5.0，并且因此无需进一步调整。然后，添加水和酶，随后密封所有Labomat罐并且开始200ml程序：5℃/min。渐变，15分钟渐变至80℃，保持1min，以1℃/min渐变至85℃并且保持103min，40rpm向左转30秒并且向右转30秒。将所有醪液罐在冰浴中冷却并且根据以下描述的SSF程序制备用于发酵。在液化中测试三个Pfu剂量：0.0385、1.5、和3.0μg EP/g Ds。

酵母菌株和制剂

同时糖化发酵(SSF)

将青霉素添加到各醪液中至3ppm的终浓度。液化后的pH为5.1并且不用针对SSF进一步调节。在实验1中，将尿素添加到各醪液中至500ppm的终浓度。在实验2中，将各醪液的一半调节至500ppm尿素，并且另一半用水调节以维持一致的固体。将约5克的各醪液转移至试管中，这些试管具有在顶部钻的1/64洞，以允许CO₂释放。将葡糖淀粉酶SA(GSA)和纤维素酶VD(CVD)的共混物以110μg EP GSA/gDS和30μg EP CVD/gDS给予到各醪液管中。将酵母以10e6细胞/g醪液给出。将milli-Q水添加到各管中，这样使得添加到各管的液体(酶+Mq水)的总体积与醪液重量是等比例的。在32℃水浴中进行发酵54小时。在整个发酵中，将样品进行定期涡旋(在早上和在晚上)。

HPLC分析

表29：HPLC系统

针对糖(DP4+、DP3、DP2、葡萄糖、和果糖)、有机酸(乳酸和乙酸)、甘油、和乙醇分析样品。

结果

下表30示出在发酵54小时处，针对实验1中的两种酵母的乳酸滴度和减少百分比。

表30：54小时乳酸结果

下表31示出在发酵54小时处，针对实验2中的两种酵母的乳酸滴度和减少百分比。

表31：54小时乳酸结果

实例23

在用不同水平Pfu蛋白酶产生的无逆流醪液的发酵中的乳酸减少

当使用MBG4851时，与Ethanol Red^TM相比，评估在用一种共混物液化的无逆流液化物中的乳酸水平，该共混物具有α-淀粉酶(2.1μg EP AA369/g DS)、葡糖淀粉酶(4.5μg EPPoAMG498/g Ds)和增加水平的Pfu蛋白酶(0.0385和3.0μg EP Pfu/g DS)。

液化

酵母菌株和制剂

同时糖化发酵(SSF)

将青霉素添加到各醪液中至3ppm的终浓度。液化后的pH为5.1并且不用针对SSF进一步调节。将尿素调节到所希望的水平，并且添加水以保持醪液之间一致的固体水平。将约5克的得到的醪液中的每个转移至试管中，这些试管具有在顶部钻的1/64洞，以允许CO₂释放。将葡糖淀粉酶SA(GSA)和纤维素酶VD(CVD)的共混物以110μg EP GSA/gDS和30μg EPCVD/g DS给予到各醪液管中。将酵母以10e6细胞/g醪液给出。将milli-Q水添加到各管中，这样使得添加到各管的液体(酶+Mq水)的总体积与醪液重量是等比例的。在32℃水浴中进行发酵54小时。在整个发酵中，将样品进行定期涡旋(在早上和在晚上)。

HPLC分析

表32：HPLC系统

结果

下表33示出针对该实验的乳酸结果。在所有醪液中可见显著的减少。

表33：54小时乳酸结果

实例24

在用α-淀粉酶A作为液化酶工业生产的玉米醪的发酵中的乳酸减少

当使用MBG4851时，在具有不同尿素补充水平的工业生产的、α-淀粉酶(α-淀粉酶A)液化的玉米醪中，与Ethanol Red相比，评估乳酸水平。

玉米醪

酵母菌株和制剂

该实验中所测试的两种酵母菌株是Ethanol Red^TM(富酶泰斯公司)和MBG4851。通过将2.75g的干酵母称重到在125mL埃伦迈尔烧瓶中50ml的32℃自来水中，来将酵母再水化。然后将烧瓶用封口膜覆盖，并且允许在36.5℃水浴中进行孵育。在15分钟后，涡旋这些烧瓶，但是不进行其他搅动。在总计30分钟后，将这些烧瓶从水浴中去除。重复使用YC-100确定总酵母浓度。

同时糖化发酵(SSF)

将青霉素添加到各醪液中至3ppm的终浓度。液化后的pH为5.1并且不用针对SSF进一步调节。将尿素调节到所希望的水平，并且添加水以保持醪液之间一致的固体水平。将约5克的得到的醪液中的每个转移至试管中，这些试管具有在顶部钻的1/64洞，以允许CO₂释放。将葡糖淀粉酶SA(GSA)和纤维素酶VD(CVD)的共混物以110μg EP GSA/gDS和30μg EPCVD/gDS给予到各醪液管中。将酵母以10e6细胞/g醪液给出。将milli-Q水添加到各管中，这样使得添加到各管的液体(酶+Mq水)的总体积与醪液重量是等比例的。在32℃水浴中进行发酵54小时。在整个发酵中，将样品进行定期涡旋(在早上和在晚上)。

HPLC分析

表34：HPLC系统

结果

下表35示出了54小时乳酸结果。

表35：54小时乳酸结果

实例25

在用α-淀粉酶F(Fuelzyme^TM)作为液化酶工业生产的玉米醪的发酵中的乳酸减少

当使用MBG4851时，与Ethanol Red^TM相比，在工业制备的α-淀粉酶F(Fuelzyme^TM)液化的玉米醪中，评估乳酸水平。

玉米醪

从松湖获得工业制备的玉米醪。通过105℃干燥箱，测量醪液的固体为31.5％。

酵母菌株和制剂

该实验中所测试的两种酵母菌株是Ethanol Red(富酶泰斯公司)和MBG4851。通过将2.75g的干酵母称重到在125mL埃伦迈尔烧瓶中50ml的36.5℃自来水中，来将酵母再水化。然后将烧瓶用封口膜覆盖，并且允许在36.5℃水浴中进行孵育。在15分钟后，涡旋这些烧瓶，但是不进行其他搅动。在总计30分钟后，将这些烧瓶从水浴中去除。重复使用YC-100确定总酵母浓度。

同时糖化发酵(SSF)

将青霉素添加到各醪液中至3ppm的终浓度。将尿素调节至762ppm，并且使用硫酸调节pH至5.0。将约5克的醪液转移至试管中，这些试管具有在顶部钻的1/64洞，以允许CO2释放。将葡糖淀粉酶SA(GSA)和纤维素酶VD(CVD)的共混物以110μg EP GSA/gDS和30μg EPCVD/g DS给予到各醪液管中。将酵母以10e6细胞/g醪液给出。将milli-Q水添加到各管中，这样使得添加到各管的液体(酶+Mq水)的总体积与醪液重量是等比例的。在32℃水浴中进行发酵52小时。在整个发酵中，将样品进行定期涡旋(在早上和在晚上)。

HPLC分析

在发酵52小时后通过每个处理舍弃3个管进行发酵取样。每个管通过用50μL的40％v/v H₂SO₄失活、涡旋、以1460×g离心10分钟，并且通过0.45μm沃特曼PP过滤器(Whatman PP filter)过滤进行处理用于HPLC分析。无需进一步稀释，处理所有52小时样品。在HPLC分析之前和过程中将样品储存在4℃下。

表36：HPLC系统

结果

下表37示出了52小时结果。

表37：52小时乳酸结果

实例26

在用液化酶共混物的工业生产的玉米醪的发酵中乳酸的减少

当使用MBG4851时，与Ethanol Red^TM相比，在工业制备的用(2.1μg EP AA369/gDS)、葡糖淀粉酶(4.5μg EP PoAMG498/g DS)和0.0385μg EP Pfu/g DS的共混物液化的玉米醪中，评估乳酸水平。

玉米醪

实验1-从Flint Hills Shell Rock获得工业制备的玉米醪。通过105℃干燥箱，测量醪液的固体为32.8％。

实验2-从One Earth Energy获得工业制备的玉米醪。通过105℃干燥箱，测量醪液的固体为33.95％。

酵母菌株和制剂

这些实验中所测试的两种酵母菌株是Ethanol Red(富酶泰斯公司)和MBG4851。将酵母在过滤器消毒的液体培养基(2％w/v D-葡萄糖、1％蛋白胨、和0.5％酵母提取物)中进行增殖。在UV防护罩下使用无菌环，将来自菌苔的细胞转移到50mL顶部钻有一个孔的无菌离心管中的25mL的液体培养基中，并且在150rpm下，在30℃空气震荡器中进行孵育。将管倾斜约30度以增加通气。在18小时处，通过在3000rpm下旋转10分钟获得细胞，并且倾析上清液。将细胞在25ml水中洗涤一次，并且将得到的细胞沉淀再悬浮于1.5ml自来水中。重复使用YC-100确定总酵母浓度。

同时糖化发酵(SSF)

将青霉素添加到各醪液中至3ppm的终浓度。在实验1中，将尿素调节至275ppm，并且使用氢氧化钾调节pH至5.0。在实验2中，将尿素调节至644ppm，并且使用硫酸调节pH至5.0。将约5克的醪液转移至试管中，这些试管具有在顶部钻的1/64洞，以允许CO2释放。将葡糖淀粉酶SA(GSA)和纤维素酶VD(CVD)(110μg EP GSA/gDS和30μg EP CVD/gDS)的共混物和单独的葡糖淀粉酶SA(110μg EP GSA/gDS)给出到各醪液管中。将酵母以10e6细胞/g醪液给出。将milli-Q水添加到各管中，这样使得添加到各管的液体(酶+Mq水)的总体积与醪液重量是等比例的。在32℃水浴中进行发酵52小时。在整个发酵中，将样品进行定期涡旋(在早上和在晚上)。

HPLC分析

在发酵54小时后通过每个处理舍弃3个管进行发酵取样。每个管通过用50μL的40％v/v H₂SO₄失活、涡旋、以1460×g离心10分钟，并且通过0.45μm沃特曼PP过滤器(Whatman PP filter)过滤进行处理用于HPLC分析。无需进一步稀释，处理所有52小时样品。在HPLC分析之前和过程中将样品储存在4℃下。

表38：HPLC系统

结果

下表39示出来自实验1的结果

表39：Shell Rock乳酸结果

下表40示出来自实验2的结果

表40：One Earth乳酸结果

实例27

在工业生产的α-淀粉酶A玉米醪的生物反应器发酵期间减少的乳酸积累

当使用MBG4851时，与Ethanol Red相比，在工业制备的α-淀粉酶A液化的玉米醪中，评估乳酸水平。

玉米醪

从Lincolnland获得工业制备的玉米醪。通过水分平衡，测量醪液的固体为32.95％。

酵母菌株和增殖

该实验中所测试的两种酵母菌株是Ethanol Red(富酶泰斯公司)和MBG4851。

增殖中目标固体百分比是20％，将607ml的醪液添加到393ml水中以达到20％固体的1000ml增殖体积。以0.024克/升的浓度添加lactrol。通过添加3ml 50％尿素溶液，以1500ppm的浓度添加尿素氮。葡糖淀粉酶剂量被计算为0.075g/1L发酵罐。作为接种物，称出2.08克干酵母，添加到预热至36.5℃的40ml水中，并且允许在15分钟在涡旋的条件下再水合30分钟。然后向该增殖中添加10ml这种再水合物。增殖时间为在33.3℃下8小时，在该时间，将15.2ml的增殖转移至发酵容器中，为约1.6％接种。

所有增殖和发酵是在1L赛多利斯(Sartorius)Q+生物反应器中进行。

同时糖化发酵(SSF)

以0.024克/升的浓度添加lactrol到各发酵罐中。

向600ppm总尿素中添加尿素。将葡糖淀粉酶SA以110μg EP GSA/g DS给出到各醪液反应器中。为了模拟工厂规模的酶添加，将55％的葡糖淀粉酶和50％的发酵尿素在接种时给予。在发酵8小时后，将剩余的45％葡糖淀粉酶和50％尿素添加到发酵罐中。

温度曲线

所有发酵在32℃下开始，并且然后如以下描述启动温度曲线。

表41：温度曲线

HPLC分析

在发酵的0、2、4、6、8、12、16、24、30、48、54、和60小时处，通过将5克醪液取样到15ml管中来进行发酵取样。每个管通过用150μL的40％v/v H₂SO₄失活、涡旋、以1460×g离心10分钟，并且通过0.45μm沃特曼PP过滤器(Whatman PP filter)过滤进行处理用于HPLC分析。在HPLC分析之前和过程中将样品储存在4℃下。

表42：HPLC系统

结果

以下图1中示出了整个发酵过程中乳酸滴度。发酵结束时的水平示于下表26中。

表43示出在用α-淀粉酶A液化的1L发酵期间的乳酸滴度。

表43：在发酵60小时处乳酸结果

实例28

在工业生产的玉米醪的生物反应器发酵期间减少的乳酸积累。

当使用MBG4851时，与Ethanol Red^TM相比，在工业制备的、用α-淀粉酶(2.1μg EPAA369/g DS)、葡糖淀粉酶(4.5μg EP PoAMG498/g DS)和0.0385μg EP Pfu/g DS的共混物液化的玉米醪中，评估乳酸积累。

玉米醪

从Husker AG获得工业制备的玉米醪。通过水分平衡，测量醪液的固体为34.05％。

酵母菌株和增殖

增殖中目标固体百分比是20％，将587ml的醪液添加到413ml水中以达到20％固体的1000ml增殖体积。以0.024克/升的浓度添加lactrol。通过添加3ml 50％尿素溶液，以1500ppm的浓度添加尿素氮。葡糖淀粉酶剂量被计算为0.075g/1L发酵罐。作为接种物，称出2.08克干酵母，添加到预热至36.5℃的40ml水中，并且允许在15分钟在涡旋的条件下再水合30分钟。然后向该增殖中添加10ml这种再水合物。增殖时间为在33.3℃下8小时，在该时间，将15.2ml的增殖转移至发酵容器中，为约1.6％接种。

同时糖化发酵(SSF)

以0.024克/升的浓度添加lactrol到各发酵罐中。

向600ppm总尿素中添加尿素。将葡糖淀粉酶SA以110μg EP GSA/gDS给出到各反应器中。为了模拟工厂规模的酶添加，将30％的葡糖淀粉酶和50％的发酵尿素在接种时给予。在发酵8小时后，将剩余的70％葡糖淀粉酶和50％尿素添加到发酵罐中。

温度曲线

表44：温度曲线

HPLC分析

表45：HPLC系统

结果

以下图2中示出了整个发酵过程中乳酸滴度。发酵结束时的水平示于下表46中。

图3示出在用α-淀粉酶(2.1μg EP AA369/gDS)、葡糖淀粉酶(4.5μg EP PoAMG498/g DS)和0.0385μg EP Pfu/g Ds的共混物液化的1L玉米醪发酵期间的乳酸水平。

表46：60小时乳酸结果。

实例29

在用不同水平Pfu蛋白酶产生的醪液的发酵中的甘油减少。

使用以上实例22中所描述的实验装置进行该实例。

当使用MBG4851时，与Ethanol Red^TM相比，评估在用一种共混物液化的液化物中的甘油水平，该共混物具有α-淀粉酶(2.1μg EP AA369/g DS)、葡糖淀粉酶(4.5μg EPPoAMG498/g Ds)和增加水平的Pfu蛋白酶(0.0385、1.5、和3.0μg EP Pfu/g DS)。

结果

针对实验1，54小时甘油结果示于下表47中，并且针对实验2示于下表48中。MBG4851具有显著的甘油减少，甚至是在最高水平的Pfu补充下。

表47：实验1的54小时甘油结果

表48：实验2的54小时甘油结果

实例30

在用不同水平Pfu蛋白酶产生的无逆流醪液的发酵中的甘油减少

使用以上实例24中所描述的实验装置进行该实例。

当使用MBG4851时，与Ethanol Red^TM相比，评估在用一种共混物液化的、无逆流液化物中的甘油水平，该共混物具有α-淀粉酶(2.1μg EP AA369/gDS)、葡糖淀粉酶(4.5μg EPPoAMG498/g Ds)和增加水平的Pfu蛋白酶(0.0385和3.0μg EP Pfu/g DS)。

54小时甘油结果示于下表49中。与Ethanol Red相比，无论所添加的尿素，MBG4851具有显著的甘油降低。

表49：54小时甘油结果

实例31

在用α-淀粉酶A作为液化酶工业生产的玉米醪的发酵中甘油的减少

使用以上实例23中所描述的实验装置进行该实例。

当使用MBG4851时，在具有不同尿素补充水平的工业生产的、α-淀粉酶(α-淀粉酶A)液化的玉米醪中，与Ethanol Red^TM相比，评估甘油水平。

甘油结果可以在下表50中发现。

表50：54小时甘油结果

实例32

在用α-淀粉酶F(Fuelzyme^TM)作为液化酶工业生产的玉米醪的发酵中甘油减少

使用以上实例25中所描述的实验装置进行该实例。

当使用MBG4851时，与Ethanol Red相比，在工业制备的α-淀粉酶F(Fuelzyme^TM)液化的玉米醪中，评估甘油水平。

52小时甘油结果可以在下表51中发现。

表51：52小时甘油结果

ER	MBG4851	％减少
			10.974	8.518	22.37％

实例33

在用液化酶共混物的工业生产的玉米醪的发酵中的甘油减少

使用以上实例26中所描述的实验装置进行该实例。

当使用MBG4851时，与Ethanol Red相比，在工业制备的、用α-淀粉酶(2.1μg EPAA369/gDS)、葡糖淀粉酶(4.5μg EP PoAMG498/g DS)和0.0385μg EP Pfu/g DS的共混物液化的玉米醪中，评估甘油水平。。

针对实验1和2，54小时甘油结果可以分别发现于表52和53中。

表52：实验1的54小时甘油结果

表53：实验2的54小时甘油结果

GA	ER	MBG4851	％减少
				GSA+CVD	15.0683	13.3075	11.69％
GSA	15.2362	13.4763	11.55％

实例34

在工业生产的α-淀粉酶A玉米醪的生物反应器发酵期间的甘油水平。

使用以上实例27中所描述的实验装置进行该实例。

当使用MBG4851时，与Ethanol Red相比，在工业制备的α-淀粉酶A液化的玉米醪中，评估甘油水平。

在整个发酵中醪液中甘油积累可以见于图3。60小时值可以在表54中发现。

图3示出了发酵期间甘油水平。

表54：60小时甘油值

ER	MBG4851	％减少
			14.429	13.799	4.37％

实例35

在工业生产的玉米醪的生物反应器发酵期间的甘油水平。

使用以上实例28中所描述的实验装置进行该实例。

当使用MBG4851(V14/004037)时，与Ethanol Red相比，在工业制备的、用α-淀粉酶(2.1μg EP AA369/gDS)、葡糖淀粉酶(4.5μg EP PoAMG498/g DS)和0.0385μg EP Pfu/g DS的共混物液化的玉米醪中，评估甘油水平。

在整个发酵中醪液中甘油积累可以见于图4。60小时值可以在表55中发现。

图4示出了发酵期间甘油水平

表55：60小时甘油值

ER	MBG4851	％减少
			16.916	15.643	7.53％

实例36

菌株V14/004037(MBG4851)的生产

使用WO 2005/121337中描述的方法并且通过与酿酒酵母的各种菌株交配，结合以选择包括低甘油和高乙醇产生的特性，来生产菌株V14/004037。

菌株V14/004037，当萌发的孢子与酿酒酵母的标准菌株(包括酿酒酵母的测试菌株)交配时，通过其形成孢子和产生子代的能力被证实是酿酒酵母菌株。一个这样的单倍体测试菌株是W303-1A。确切地，当与测试菌株W303-1A交配时，菌株V14/004037的萌发的孢子能够产生杂合后代。

更详细地，单倍体菌株W303-1A获得自在美国ATCC的酵母遗传库存中心(ATCC#208352)，如奥苏贝尔，F.M.等人，(1997)，(Current Protocols in Molecular Biology)，第2卷，第13.2.1至13.2.5页，由约翰&威利父子公司出版中所描述的，培养菌株V14/004037以形成单倍体酵母菌属酵母。随后，将孢子在固体培养基(如包含1％w/v D-葡萄糖、0.5％酵母提取物、1％w/v细菌蛋白胨和1.5％w/v琼脂的GYP)上进行萌发，并且在30℃下孵育3至5天。然后使用以下方法，将来自菌株V14/004037的分离的、萌发的孢子与单倍体W303-1A一起交配，例如，该方法描述于奥苏贝尔，F.M.等人，(1997)，分子生物学现代方法(CurrentProtocols in molecular Biology)，第2卷，第13.2.1至13.2.5页，由约翰&威利父子公司出版中。杂合合子的形成可以在显微镜下观察到，证实了菌株V14/004037是酿酒酵母菌株。

菌株V14/004037于2014年2月17日在布达佩斯条约下保藏于国家计量研究院，1/153伯蒂街伯蒂街，墨尔本港，维多利亚州3207，澳大利亚，并且被指定登录号为V14/004037。

实例37

在木糖基本培养基上的菌株V14/004037(MBG4851)的生长

使用测试T1来确定菌株V14/004037在为唯一碳源的木糖上的生长。使用标准微生物学技术，将酿酒酵母菌株V14/004037划线到使用2％琼脂固化的2％w/v D-葡萄糖、1％细菌蛋白胨和0.5％酵母膏培养基上。在30℃下孵育72小时后，使用无菌微生物环将酵母细胞从板上取出，并且在50ml肉汤中接种至0.1和0.2单位(在T0下的OD₆₀₀)之间的OD₆₀₀(在600nm下的光密度)。0.1单位的OD₆₀₀等于约9x10⁵酵母细胞/mL。在250ml埃伦迈尔烧瓶中，该肉汤包含在蒸馏水中的木糖(5％w/v)、Difco酵母氮源w/o氨基酸(0.67％)、柠檬酸(0.3％)和柠檬酸三钠(0.7％)。柠檬酸和柠檬酸三钠被提供为不能用作为酵母菌属生长基质的缓冲剂。99％纯的D-(+)-木糖获得自西格玛-奥德里奇公司(目录编号X1500-500G)。在测量OD₆₀₀(在T₄₈hr处的OD₆₀₀)之前在30℃下，在220rpm(10cm轨道直径)的震荡下将培养物孵育48小时。通过以下公式确定生物质的倍数增加：T₄₈hr处的OD₆₀₀除以T₀处的OD₆₀₀。

以0.149的初始OD₆₀₀接种菌株V14/004037，并且在48小时内增加超过7倍。在相同条件下，Ethanol Red酵母的生物质增加少于2倍。

实例38

玉米醪的发酵

玉米醪可以获得自生产乙醇的公司，如描述于德万迪尔(Devantier)等人，应用微生物学和生物技术(Applied Microbiology and Biotechnology)2005，68:622-629。用于制备玉米醪的方法还描述于托马斯(Thomas)等人，应用微生物学杂志(Journal ofApplied Microbiology)2001,90:819-828。

还可以按以下方法制备玉米醪：

取决于所希望的玉米醪干物质靶标，将以下成分置于玻璃烧杯中，并且记录成分加烧杯的总重量。

表56

α-淀粉酶可以是，例如，Liquozyme SC^TM(诺维信，巴格斯瓦德，丹麦)。将该浆料在85℃下继续搅拌3.5小时。然后冷却该醪液，并且称重烧杯的质量并且基于烧杯和成分的原始重量在煮醪液期间考虑蒸发用水进行补偿。将醪液冷却至32℃并且调节至pH 5.2。

添加葡糖淀粉酶。葡糖淀粉酶可以是，例如，Spirizyme Excel^TM(诺维信)并且以0.05％干玉米固体给予。混合该醪液，然后分配于在50mL的塑料螺旋加盖试管中的15g等分试样中。在添加酵母前，在所希望的温度(典型地32℃)下，将醪液样品置于静态孵育器中保持30分钟。通过在37℃下将0.1g活性干酵母悬浮于5mL水中并且静置30min来制备酵母。在涡旋混合以将酵母均匀分散后，每15g如以上所描述的制备的玉米醪接种190微升的悬浮的酵母。

将接种的玉米醪静态孵育50小时，并且如WO 2011/035392中所描述的通过HPLC进行测定。

在发酵20小时(表57)、44hr(表58)和50小时(表59)后，使用WO 2011/035392中所描述的方法确定发酵中的乙醇、甘油、葡萄糖和麦芽糖的水平。

这些结果还图形绘制于图5和6中。

所有酵母是活性干酵母。Ethanol Re是来自富酶泰斯公司，BP3029-137加布里埃尔街，F-59703马尔康巴勒尔，法国(Fermentis,BP3029-137rue Gabriel Péri,F-59703Marcq-en-Baroeul,Cedex France)的商业样本。

如WO 2011/035392中所描述的生长并且干燥V09/024011和V14/004037(MBG4851)。Ethanol Red的代表性样品于2014年3月19日在布达佩斯条约下保藏于国家计量研究院，1/153伯蒂街墨尔本港，维多利亚州3207，并且被指定登录号为V14/007039。值表示百分比重量/体积(％w/v)。

表57：将玉米醪发酵20小时

如可以从表57所见，在玉米醪发酵20小时后，菌株V14/004037比Ethanol Red产生更大量的乙醇，并且菌株V09/024011比Ethanol Red产生更少甘油。针对V14/004037，发酵产物乙醇与甘油的比率也显著更高。

表58：将玉米醪发酵44小时

如可以从表58所见，在玉米醪发酵44小时后，菌株V14/004037比Ethanol Red以及菌株V09/024011产生更大量的乙醇，并且比Ethanol Red和菌株V09/024011产生更少甘油。

表59：将玉米醪发酵50小时

图5和6显示出，在20小时处，菌株V14/004037的乙醇生产比率比Ethanol Red和菌株V09/024011显著更大，指示出在乙醇生产时菌株V14/004037更有效。这可以有利于减少必要的发酵时间。此外，V14/004037的乙醇与甘油的最终比率更高。此外，即使剩余葡萄糖与乙醇的转换处于最大理论水平(0.51g乙醇/g葡萄糖)，指示出菌株V14/004037的乙醇产量比Ethanol Red或V09/024011更好。

实例39

在用Pfu蛋白酶产生的醪液中减少的乙醛积累。

与Ethanol Red^TM(ER)相比，评估MBG4851在用一种共混物液化的液化物中的性能，该共混物具有α-淀粉酶(2.1μg EP AA369/g DS)、葡糖淀粉酶(4.5μg EP PoAMG498/g Ds)和Pfu蛋白酶(3.0μg EP Pfu/g DS)。

液化

通过将研磨的玉米、逆流与自来水组合，至185g的总目标重量，干固体(DS)为32.50％，来制备液化；将逆流以30％w/w(逆流重量/醪液总重量)共混。将在2012年12月12日接收的来自林肯道能源(Lincolnway Energy)的逆流和从中央市，内布拉斯加州，美国的GPRE接收的内部研磨的玉米用于所有液化。初始浆料pH为5.0，并且因此无需进一步调整。然后，添加水和酶，随后密封所有Labomat罐并且开始200ml程序：5℃/min。渐变，15分钟渐变至80℃，保持1min，以1℃/min渐变至85℃并且保持103min，40rpm向左转30秒并且向右转30秒。将所有醪液罐在冰浴中冷却并且根据以下描述的SSF程序制备用于发酵。添加2.1μgEP AA369/g DS、4.5μg EP PoAMG498/g DS、和3.0μg EP Pfu/g DS。

酵母菌株和制剂

该实验中所测试的两种酵母菌株是Ethanol Red^TM(富酶泰斯公司)和MBG4851。通过将3.52g的干酵母称重到在125mL埃伦迈尔烧瓶中40ml的37℃自来水中，来将酵母再水化。然后将烧瓶用封口膜覆盖，涡旋混合，并且允许在32℃水浴中进行孵育。在15分钟后，将烧瓶从水浴中去除，并且再一次涡旋混合。

同时糖化发酵(SSF)

液化后的pH为5.1并且不用针对SSF进一步调节。通过水分平衡，醪液固体被计算为31.6％。

在500ml釜中，针对每种酵母，设置一个350ml增殖。将醪液固体调整为约27％，并且针对细菌对照添加0.024g/L Lactrol。GA剂量被计算为0.018g/350ml增殖。然后添加5ml再水合酵母来开始该增殖。增殖时间为在33.3℃下8小时，在该时间，将18ml的增殖转移至发酵容器中，为约1.8％接种。

在1L赛多利斯Q+反应器中，设置发酵。每个发酵容器用1000ml上述玉米醪进行设置。将醪液保持在12℃下，直到接种前约一小时，在该时间将其加热至32℃。将Lactrol以0.024g/L添加到各发酵罐，来限制细菌污染。

将尿素添加到各醪液中至200ppm的终浓度。将葡糖淀粉酶SA以110μg EP GSA/gDS给出到各醪液反应器中。为了模拟工厂规模的酶添加，将30％的葡糖淀粉酶在接种时给予。在发酵8小时后，将剩余的70％葡糖淀粉酶添加到发酵罐中。两个生物反应器的温度都在32℃下开始，并且然后遵循以下曲线来模拟工业设置中经历的温度。

取样和GC分析

发酵54小时后进行发酵取样。

在发酵期间，反应器没有取样。在最终时间点，从每个反应器取3个样品。将5ml醪液取样到15ml离心管中。在取样后，使用150μl的40％H₂SO₄来停止发酵。涡旋样品进行混合，并且然后在3000rpm下离心5-10分钟来沉淀玉米碎片。然后将上清液通过0.45μM过滤器进行过滤。无需进一步稀释，处理所有54小时样品。在提交之前将样品储存在4℃下以用于分析。

通过焓值分析公司(Enthalpy Analytical Inc.)(达拉谟(Durham)，北卡罗来纳州)分析乙醛水平。

结果

以下示出了乙醛水平的结果。在该实验中，与Ethanol Red^TM(ER)相比，MBG4851发酵显示出了乙醛水平下降52％。

实例40

用MBG4851进行的发酵中增加的油产量。

酵母菌株和制剂

该实验中所测试的两种酵母菌株是Ethanol Red^TM(富酶泰斯公司)和MBG4851。通过将5.5g的干酵母称重到在250mL埃伦迈尔烧瓶中100ml的37℃自来水中，来将酵母再水化。然后将烧瓶用封口膜覆盖，涡旋混合，并且允许在32℃水浴中进行孵育。在15分钟后，将烧瓶从水浴中去除，并且再一次涡旋混合。

同时糖化发酵(SSF)

针对这种实验，使用用α-淀粉酶(2.1μg EP AA369/g DS)、葡糖淀粉酶(4.5μg EPPoAMG498/g DS)和蛋白酶(0.0385μg EP Pfu/g Ds)的共混物液化的工业生产的玉米醪。液化后的pH为5.1并且不用针对SSF进一步调节。通过水分平衡，醪液固体被计算为28.30％。将醪液调节至1000ppm尿素和3mg/L青霉素，并且等分到50mL螺帽离心管中的25g样品中，总计24个样品。在所有管中以0.6AGU/gDS给予葡糖淀粉酶SA(“GSA”)。在管4-6和10-12中，以5μg/gDS给予蛋白酶X。在管1-6中，添加150μL的再水合MBG4851酵母。在管7-12中，添加150μL的再水合Ethanol Red酵母。在32℃震荡水浴中进行发酵64小时。

取样和油分析

油提取：以0.125mL己烷/1g起始材料的剂量将己烷添加至每个样品。将每个管覆盖在封口膜(Dura-seal)中以防止样品漏泄，并且充分混合。在具有JS-5.3转子的AvantiJE系列离心机中，将管在3,000x g下离心10分钟。在离心之后，使用正位移移液管去除油/己烷层(上清液)，转移至预称重的5mL掀盖式管，并且再称重。使用鲁道夫研究分析密度计测量样品密度。然后使用标准曲线等式计算上清液的密度，以发现上清液中油％。从该值衍生出起始材料中油的总％。

结果

油测定的结果列于下表中。

在以下编号的段落中进一步描述本发明：

1.一种用于从含淀粉材料生产乙醇的方法，该方法包括以下步骤：

ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；

iii)使用发酵生物进行发酵；

2.如段落1所述的方法，其中氮源，优选地尿素，添加于糖化、发酵、或同时糖化发酵(SSF)中。

3.如段落1所述的方法，其中在糖化或发酵或SSF中添加少于3,000ppm，如少于2000ppm、如少于1,000ppm、如少于800ppm、如少于600ppm、如少于500ppm、如少于400ppm、如少于300ppm、如少于200ppm、如少于100ppm氮源、如无氮源，尤其是尿素。

4.如段落1所述的方法，其中在糖化或发酵或SSF中添加从100至600ppm尿素。

5.如段落1-4中任一项所述的方法，其中在糖化或发酵或SSF中添加蛋白酶。

6.如段落1-5中任一项所述的方法，在液化步骤i)之前进一步包括以下步骤：

x)优选地通过干磨来减小含淀粉材料的粒度；

y)形成了包含该含淀粉的材料和水的浆液。

7.如段落1-6中任一项所述的方法，其中至少50％，优选至少70％，更优选至少80％，尤其是至少90％的含淀粉材料适合通过一个具有#6筛网的筛子。

8.如段落1-3中任一项所述的方法，其中液化中的pH在4-7之间，如在pH 4.5-6,5之间、如在pH 5.0-6.5之间、如在pH 5.0-6.0之间、如在pH 5.2-6.2之间、如约5.2、如约5.4、如约5.6、如约5.8。

9.如段落1-8中任一项所述的方法，其中在液化中的温度范围是从70℃-100℃，例如在75℃-95℃之间，例如在75℃-90℃之间，优选在80℃-90℃之间，例如在82℃-88℃之间，例如约85℃。

10.如段落1-9中任一项所述的方法，其中在步骤i)中的液化之前进行喷射蒸煮步骤。

11.如段落10所述的方法，其中该喷射蒸煮是在110℃-145℃、优选120℃-140℃、例如125℃-135℃、优选约130℃的温度下进行持续约1-15分钟，优选持续约3-10分钟，尤其是约5分钟左右。

12.如段落1-11中任一项所述的方法，其中糖化和发酵是顺序进行或同时(SSF)进行。

13.如段落1-12中任一项所述的方法，其中糖化是在从20℃-75℃、优选从40℃-70℃、例如约60℃的温度下，并且在4和5之间的pH下进行。

14.如段落1-13中任一项所述的方法，其中发酵或同时糖化发酵(SSF)在从25℃至40℃、例如从28℃至35℃、例如从30℃至34℃，优选约32℃左右的温度下进行。在一个实施例中，发酵进行6至120小时，尤其是24至96小时。

15.如段落1-14中任一项所述的方法，其中发酵产物是在发酵之后，例如通过蒸馏回收的。

16.如段落1-15中任一项所述的方法，其中发酵产物是醇，优选乙醇，尤其是燃料乙醇、饮用乙醇和/或工业乙醇。

17.如段落1-16中任一项所述的方法，其中该含淀粉起始材料是全谷物。

18.如段落1-17中任一项所述的方法，其中该含淀粉材料来源于玉米、小麦、大麦、黑麦、蜀黍、西米、木薯、树薯、木薯淀粉、高粱、燕麦、稻或马铃薯。

19.如段落1-18中任一项所述的方法，其中在液化步骤i)中使用或添加的α-淀粉酶是细菌来源的。

20.如段落1-19中任一项所述的方法，其中该α-淀粉酶来自芽胞杆菌属，例如嗜热脂肪芽孢杆菌菌株，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的一种变体，例如WO 99/019467中的SEQ ID NO:3或在此的SEQ ID NO:1中所示的那种。

21.如段落20所述的方法，其中该嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶或其变体是截短的，优选地截短以具有从485-495个氨基酸，如约491个氨基酸。

22.如段落20或21中任一项所述的方法，其中该嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶具有在位置I181+G182处的双缺失，并且任选地具有N193F取代、或R179+G180缺失(使用SEQ IDNO:1进行编号)。

23.如段落20-22中任一项所述的方法，其中该嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶在位置S242具有取代，优选S242Q取代(使用SEQ ID NO:1进行编号)。

24.如段落20-23中任一项所述的方法，其中该嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶在位置E188具有取代，优选E188P取代(使用SEQ ID NO:1进行编号)。

25.如段落1-24中任一项所述的方法，其中该α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mMCaCl₂下具有至少10的T¹/₂(min)，例如至少15，例如至少20，例如至少25，例如至少30，例如至少40，例如至少50，例如至少60，例如在10-70之间，例如在15-70之间，例如在20-70之间，例如在25-70之间，例如在30-70之间，例如在40-70之间，例如在50-70之间，例如在60-70之间。

26.如段落1-25中任一项所述的方法，其中在液化步骤i)中存在和/或添加的α-淀粉酶选自嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体的组，这些变体除I181*+G182*以及任选地N193F之外具有以下突变：

27.如段落1-26中任一项所述的方法，其中在液化步骤i)中存在和/或添加的α-淀粉酶选自嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体的下组：

-I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E；

-

I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S

-I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；

-I181*+G182*+N193F+V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V以及

-

I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+

Q254S(使用在此的SEQ ID NO:1进行编号)。

28.如段落1-27中任一项所述的方法，其中在糖化和/或发酵过程中存在和/或添加葡糖淀粉酶。

29.如段落28所述的方法，其中在糖化、发酵或同时糖化发酵(SSF)中存在的和/或添加的葡糖淀粉酶是真菌来源的，优选来自曲霉属的菌株，优选黑曲霉、泡盛曲霉、或米曲霉的菌株；或木霉属的菌株，优选里氏木霉；或篮状菌属的菌株，优选埃默森篮状菌；或密孔菌属的菌株；或粘褶菌属的菌株，例如篱边粘褶菌或密粘褶菌，或黑层孔属的菌株。

30.如段落1-29中任一项所述的方法，其中葡糖淀粉酶源自埃默森篮状菌，例如示于在此的SEQ ID NO：19中的那种。

31.如段落1-29中任一项所述的方法，其中该葡糖淀粉酶选自下组，该组由以下各项组成：

(i)一种葡糖淀粉酶，包括在此的SEQ ID NO:19的成熟多肽；

(ii)一种葡糖淀粉酶，包括以下氨基酸序列，该氨基酸序列与在此的SEQ ID NO:19的成熟多肽具有至少60％、至少70％，例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致性。

32.如段落1-29中任一项所述的方法，其中糖化中存在和/或添加的葡糖淀粉酶源自篱边粘褶菌，例如示于在此的SEQ ID NO：15中的那种。

33.如段落1-29中任一项所述的方法，其中在糖化中存在的和/或添加的葡糖淀粉酶选自下组，该组由以下各项组成：

(i)一种葡糖淀粉酶，包括在此的SEQ ID NO:15的成熟多肽；

(ii)一种葡糖淀粉酶，包括以下氨基酸序列，该氨基酸序列与在此的SEQ ID NO:15的成熟多肽具有至少60％、至少70％，例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致性。

34.如段落1-29中任一项所述的方法，其中糖化中存在和/或添加的葡糖淀粉酶源自密粘褶菌，例如示于在此的SEQ ID NO:17中的那种。

35.如段落1-29中任一项所述的方法，其中在糖化中存在的和/或添加的葡糖淀粉酶选自下组，该组由以下各项组成：

(i)一种葡糖淀粉酶，包括在此的SEQ ID NO:17的成熟多肽；

(ii)一种葡糖淀粉酶，包括以下氨基酸序列，该氨基酸序列与在此的SEQ ID NO:17的成熟多肽具有至少60％、至少70％，例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致性。

36.如段落1-29中任一项所述的方法，其中葡糖淀粉酶是在糖化和/或发酵过程中与α-淀粉酶结合存在的和/或添加的。

37.如段落36所述的方法，其中在糖化和/或发酵过程中存在的和/或添加的α-淀粉酶是真菌或细菌来源的。

38.如段落36或37所述的方法，其中在糖化和/或发酵中存在的和/或添加的α-淀粉酶源自根毛霉属菌株，优选的是菌株微小根毛霉，例如示于WO 2013/006756中的SEQ IDNO:3中的那种，例如具有黑曲霉连接子和淀粉结合域的微小根毛霉α-淀粉酶杂合体，例如示于在此的SEQ ID NO:16中的那种。

39.如段落36-38中任一项所述的方法，其中在糖化和/或发酵中存在的和/或添加的α-淀粉酶选自下组，该组由以下各项组成：

(i)一种α-淀粉酶，包括在此的SEQ ID NO:16的成熟多肽；

(ii)一种α-淀粉酶，包括以下氨基酸序列，该氨基酸序列与在此的SEQ ID NO:16的成熟多肽具有至少60％、至少70％，例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致性。

40.如段落36-39中任一项所述的方法，其中该α-淀粉酶是示于SEQ ID NO:16中的具有以下取代或取代组合中的至少一种的α-淀粉酶变体：D165M；Y141W；Y141R；K136F；K192R；P224A；P224R；S123H+Y141W；G20S+Y141W；A76G+Y141W；G128D+Y141W；G128D+D143N；P219C+Y141W；N142D+D143N；Y141W+K192R；Y141W+D143N；Y141W+N383R；Y141W+P219C+A265C；Y141W+N142D+D143N；Y141W+K192R V410A；G128D+Y141W+D143N；Y141W+D143N+P219C；Y141W+D143N+K192R；G128D+D143N+K192R；Y141W+D143N+K192R+P219C；G128D+Y141W+D143N+K192R；或G128D+Y141W+D143N+K192R+P219C(使用SEQ ID NO:16进行编号)。

41.如段落36-40中任一项所述的方法，其中该α-淀粉酶源自具有黑曲霉葡糖淀粉酶连接子和淀粉结合域(SBD)的微小根毛霉，优选披露为在此的SEQ ID NO:16，优选具有以下取代中的一个或多个：G128D、D143N，优选G128D+D143N(使用SEQ ID NO:16进行编号)。

42.如段落36-41中任一项所述的方法，其中该α-淀粉酶变体与在此的SEQ ID NO:16的多肽的成熟部分具有至少75％一致性，优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，并且甚至最优选至少95％，例如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，但小于100％的一致性。

43.如段落1-42中任一项所述的方法，其中使用以下各项进行液化步骤i)：

-α-淀粉酶；

-一种蛋白酶，该蛋白酶具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的、超过20％的热稳定性值；以及

-任选地一种葡糖淀粉酶。

44.如段落43所述的方法，其中该蛋白酶具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的、超过25％的热稳定性值。

45.如段落43-44所述的方法，其中该蛋白酶具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的，超过30％、超过40％、超过50％、超过60％、超过70％、超过80％、超过90％、超过100％，例如超过105％，例如超过110％，例如超过115％，例如超过120％的热稳定性。

46.如段落43-45中任一项所述的方法，其中该蛋白酶具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的，在20％与50％之间，例如在20％与40％之间，例如20％与30％的热稳定性。

47.如段落43-46中任一项所述的方法，其中该蛋白酶具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的，在50％与115％之间，例如在50％与70％之间，例如在50％与60％之间，例如在100％与120％之间，例如在105％与115％之间的热稳定性。

48.如段落43-47中任一项所述的方法，其中该蛋白酶具有确定为在85℃/70℃下的相对活性的，超过10％，例如超过12％、超过14％、超过16％、超过18％、超过20％、超过30％、超过40％、超过50％、超过60％、超过70％、超过80％、超过90％、超过100％、超过110％的热稳定性。

49.如段落43-48中任一项所述的方法，其中该蛋白酶具有确定为在85℃/70℃下的相对活性的，在10％与50％之间，例如在10％与30％之间，例如在10％与25％之间的热稳定性。

50.如段落43-49中任一项所述的方法，其中该蛋白酶在85℃下具有高于60％，例如高于90％，例如高于100％，例如高于110％的热稳定性，如使用Zein-BCA测定法确定的。

51.如段落43-50中任一项所述的方法，其中该蛋白酶在85℃下具有在60-120之间，例如在70％-120％之间，例如在80％-120％之间，例如在90％-120％之间，例如在100％-120％之间，例如110％-120％的热稳定性，如使用Zein-BCA测定法确定的。

52.如段落43-51中任一项所述的方法，其中蛋白酶是真菌来源的。

53.如段落43-52中任一项所述的方法，其中蛋白酶是源自嗜热子囊菌属的菌株，优选金黄色嗜热子囊菌的菌株，尤其是金黄色嗜热子囊菌CGMCC No.0670的金属蛋白酶的变体。

54.如段落43-53中任一项所述的方法，其中该蛋白酶是披露为以下的金属蛋白酶的变体：WO 2003/048353中披露的SEQ ID NO:2的成熟部分或WO 2010/008841中SEQ IDNO:1的成熟部分或在此的SEQ ID NO:3，突变选自下组：

-S5*+D79L+S87P+A112P+D142L；

-D79L+S87P+A112P+T124V+D142L；

-S5*+N26R+D79L+S87P+A112P+D142L；

-N26R+T46R+D79L+S87P+A112P+D142L；

-T46R+D79L+S87P+T116V+D142L；

-D79L+P81R+S87P+A112P+D142L；

-A27K+D79L+S87P+A112P+T124V+D142L；

-D79L+Y82F+S87P+A112P+T124V+D142L；

-D79L+S87P+A112P+T124V+A126V+D142L；

-D79L+S87P+A112P+D142L；

-D79L+Y82F+S87P+A112P+D142L；

-S38T+D79L+S87P+A112P+A126V+D142L；

-D79L+Y82F+S87P+A112P+A126V+D142L；

-A27K+D79L+S87P+A112P+A126V+D142L；

-D79L+S87P+N98C+A112P+G135C+D142L；

-D79L+S87P+A112P+D142L+T141C+M161C；

-S36P+D79L+S87P+A112P+D142L；

-A37P+D79L+S87P+A112P+D142L；

-S49P+D79L+S87P+A112P+D142L；

-S50P+D79L+S87P+A112P+D142L；

-D79L+S87P+D104P+A112P+D142L；

-D79L+Y82F+S87G+A112P+D142L；

-S70V+D79L+Y82F+S87G+Y97W+A112P+D142L；

-D79L+Y82F+S87G+Y97W+D104P+A112P+D142L；

-S70V+D79L+Y82F+S87G+A112P+D142L；

-D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+D142L；

-D79L+Y82F+S87G+A112P+A126V+D142L；

-Y82F+S87G+S70V+D79L+D104P+A112P+D142L；

-Y82F+S87G+D79L+D104P+A112P+A126V+D142L；

-A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L；

-A27K+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L；

-A27K+D79L+Y82F+D104P+A112P+A126V+D142L；

-A27K+Y82F+D104P+A112P+A126V+D142L；

-A27K+D79L+S87P+A112P+D142L；以及

-D79L+S87P+D142L。

55.如段落43-54中任一项所述的方法，其中该蛋白酶是披露为以下的金属蛋白酶的变体：WO 2003/048353中披露的SEQ ID NO:2的成熟部分或WO 2010/008841中SEQ IDNO:1的成熟部分或在此的SEQ ID NO:3，具有以下突变：

D79L+S87P+A112P+D142L；

D79L+S87P+D142L；或

A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L。

56.如段落43-55中任一项所述的方法，其中该蛋白酶变体与WO 2003/048353中披露的SEQ ID NO:2的多肽的成熟部分或WO 2010/008841中SEQ ID NO:1的成熟部分或在此的SEQ ID NO:3具有至少75％一致性，优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，并且甚至最优选至少95％，例如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，但小于100％一致性。

57.如段落43-56中任一项所述的方法，其中示于在此的SEQ ID NO:3中的金黄色嗜热子囊菌蛋白酶的蛋白酶变体是以下项中的一种：

-D79L S87P D142L

-D79L S87P A112P D142L

-D79L Y82F S87P A112P D142L

-S38T D79L S87P A112P A126V D142L

-D79L Y82F S87P A112P A126V D142L

-A27K D79L S87P A112P A126V D142L

-S49P D79L S87P A112P D142L

-S50P D79L S87P A112P D142L

-D79L S87P D104P A112P D142L

-D79L Y82F S87G A112P D142L

-S70V D79L Y82F S87G Y97W A112P D142L

-D79L Y82F S87G Y97W D104P A112P D142L

-S70V D79L Y82F S87G A112P D142L

-D79L Y82F S87G D104P A112P D142L

-D79L Y82F S87G A112P A126V D142L

-Y82F S87G S70V D79L D104P A112P D142L

-Y82F S87G D79L D104P A112P A126V D142L

-A27K D79L Y82F S87G D104P A112P A126V D142L

58.如段落43-57中任一项所述的方法，其中蛋白酶是细菌来源的。

59.如段落43-58中任一项所述的方法，其中其中该蛋白酶是来源于火球菌属菌株，优选强烈火球菌菌株。

60.如段落1-41中任一项所述的方法，其中蛋白酶是在US 6,358,726中的SEQ IDNO:1、或在此的SEQ ID NO:13中示出的蛋白酶。

61.如段落43-60中任一项所述的方法，其中该蛋白酶是与US 6,358,726中的SEQID NO:1或在此的SEQ ID NO:13具有至少80％，例如至少85％，例如至少90％，例如至少95％，例如至少96％，例如至少97％，例如至少98％，例如至少99％一致性的蛋白酶。

62.如段落43-61中任一项所述的方法，其中在液化步骤i)中存在和/或添加0.5-100微克强烈火球菌蛋白酶/克DS，例如1-50微克强烈火球菌蛋白酶/克DS、例如1-10微克强烈火球菌蛋白酶/克DS、例如1.5-5微克强烈火球菌蛋白酶/克DS、例如约或大于1.5微克强烈火球菌蛋白酶/克DS。

63.如段落43-62中任一项所述的方法，其中在液化步骤i)中存在和/或添加2-100微克强烈火球菌蛋白酶/克DS，例如2.5-50微克强烈火球菌蛋白酶/克DS、例如2.5-10微克强烈火球菌蛋白酶/克DS、例如2.5-5微克强烈火球菌蛋白酶克DS，尤其约3微克强烈火球菌蛋白酶/克DS。

64.如段落43-63中任一项所述的方法，其中在液化步骤i)期间存在和/或添加葡糖淀粉酶。

65.如段落43-64中任一项所述的方法，其中液化中存在和/或添加的葡糖淀粉酶在85℃、pH 5.3下具有至少20％、例如至少30％，优选至少35％的热稳定性。

66.如段落43-65中任一项所述的方法，其中液化中存在和/或添加的葡糖淀粉酶在pH 5.0的pH最佳值下具有至少90％，优选至少95％，优选至少97％的相对活性。

67.如段落43-66中任一项所述的方法，其中液化中存在和/或添加的葡糖淀粉酶在pH 5.0下具有至少80％、至少85％、至少90％的pH稳定性。

68.如段落43-67中任一项所述的方法，其中液化步骤i)中存在的和/或添加的葡糖淀粉酶源自青霉属菌株，尤其是如WO 2011/127802中披露为SEQ ID NO:2的或在此的SEQID NO:9或14的草酸青霉菌菌株。

69.如段落43-68中所述的方法，其中该葡糖淀粉酶与WO 2011/127802中的SEQ IDNO:2中所示的成熟多肽或在此的SEQ ID NO:9或14具有至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，并且甚至最优选至少95％，例如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致性。

70.如段落43-69中任一项所述的方法，其中该葡糖淀粉酶是示于WO 2011/127802中的SEQ ID NO:2的草酸青霉菌葡糖淀粉酶的、具有K79V取代(使用在此的SEQ ID NO:14中所示的成熟序列进行编号)的一种变体，例如WO 2013/053801中披露的变体。

71.如段落43-70中任一项所述的方法，其中该草酸青霉菌葡糖淀粉酶具有K79V取代(使用SEQ ID NO:14进行编号)，并且进一步具有以下之一：

T65A；或

Q327F；或

E501V；或

Y504T；或

Y504*；或

T65A+Q327F；或

T65A+E501V；或

T65A+Y504T；或

T65A+Y504*；或

Q327F+E501V；或

Q327F+Y504T；或

Q327F+Y504*；或

E501V+Y504T；或

E501V+Y504*；或

T65A+Q327F+E501V；或

T65A+Q327F+Y504T；或

T65A+E501V+Y504T；或

Q327F+E501V+Y504T；或

T65A+Q327F+Y504*；或

T65A+E501V+Y504*；或

Q327F+E501V+Y504*；或

T65A+Q327F+E501V+Y504T；或

T65A+Q327F+E501V+Y504*；

E501V+Y504T；或

T65A+K161S；或

T65A+Q405T；或

T65A+Q327W；或

T65A+Q327F；或

T65A+Q327Y；或

P11F+T65A+Q327F；或

R1K+D3W+K5Q+G7V+N8S+T10K+P11S+T65A+Q327F；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；或

P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；或

R1E+D3N+P4G+G6R+G7A+N8A+T10D+P11D+T65A+Q327F；或

P11F+T65A+Q327W；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或

P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；或

T65A+Q327F+E501V+Y504T；或

T65A+S105P+Q327W；或

T65A+S105P+Q327F；或

T65A+Q327W+S364P；或

T65A+Q327F+S364P；或

T65A+S103N+Q327F；或

P2N+P4S+P11F+K34Y+T65A+Q327F；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+D445N+V447S；或

P2N+P4S+P11F+T65A+I172V+Q327F；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+N502*；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+N502T+P563S+K571E；或

P2N+P4S+P11F+R31S+K33V+T65A+Q327F+N564D+K571S；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+S377T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+V325T+Q327W；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+D445N+V447S+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+I172V+Q327F+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+S377T+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+D26N+K34Y+T65A+Q327F；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+I375A+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+K218A+K221D+Q327F+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+S103N+Q327F+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+T10D+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+F12Y+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或

K5A+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+T10E+E18N+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或

P2N+T10E+E18N+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T+T568N；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T+K524T+G526A；或

P2N+P4S+P11F+K34Y+T65A+Q327F+D445N+V447S+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+R31S+K33V+T65A+Q327F+D445N+V447S+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+D26N+K34Y+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+F80*+Q327F+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+K112S+Q327F+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T+T516P+K524T+G526A；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+N502T+Y504*；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+S103N+Q327F+E501V+Y504T；或

K5A+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T+T516P+K524T+G526A；或

P2N+P4S+P11F+T65A+K79A+Q327F+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+K79G+Q327F+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+K79I+Q327F+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+L72V+Q327F+E501V+Y504T；或

S255N+Q327F+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+E74N+V79K+Q327F+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A-+G220N+Q327F+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Y245N+Q327F+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q253N+Q327F+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+D279N+Q327F+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+S359N+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+D370N+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+V460S+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+V460T+P468T+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+T463N+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+S465N+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+T477N+E501V+Y504T。

72.如段落43-71中任一项所述的方法，其中液化中存在的和/或添加的葡糖淀粉酶是草酸青霉菌葡糖淀粉酶，具有K79V取代(使用SEQ ID NO:14进行编号)，并且进一步具有以下之一：

-P11F+T65A+Q327F；

-P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F(使用在此的SEQ ID NO:14进行编号)。

73.如段落43-72中任一项所述的方法，其中该葡糖淀粉酶变体与在此的SEQ IDNO:14的多肽的成熟部分具有至少75％一致性，优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，并且甚至最优选至少95％，例如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，但小于100％的一致性。

74.如段落1-73中任一项所述的方法，进一步地其中在液化和/或糖化期间存在支链淀粉酶。

75.根据段落1-74中任一项所述的方法，包括以下步骤：

ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；

iii)使用发酵生物进行发酵；

76.根据段落1-74中任一项所述的方法，包括以下步骤：

-源自嗜热脂肪芽孢杆菌的一种α-淀粉酶，包括在位置I181+G182处的双缺失、以及任选的N193F取代；(使用在此的SEQ ID NO:1进行编号)；

ii)使用源自粘褶菌属菌株，如篱边粘褶菌或密粘褶菌的葡糖淀粉酶进行糖化；

iii)使用发酵生物进行发酵；

77.根据段落1-76中任一项所述的方法，包括以下步骤：

-一种源自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶；

-一种蛋白酶，该蛋白酶具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的、超过20％的热稳定性值，优选来源于强烈火球菌和/或金黄色嗜热子囊菌；并且

-任选地一种草酸青霉菌葡糖淀粉酶；

ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；

iii)使用发酵生物进行发酵；

78.如段落1-77所述的方法，包括以下步骤：

-一种α-淀粉酶，优选地源自嗜热脂肪芽孢杆菌，包括在位置I181+G182处的双缺失，和任选地N193F取代(使用SEQ ID NO:1进行编号)并且具有在pH 4.5、85℃、0.12mMCaCl₂下的至少10的T¹/₂(min)；

ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；

iii)使用发酵生物进行发酵；

79.如段落1-78所述的方法，包括以下步骤：

i)在80℃-90℃之间的温度下液化该含淀粉材料：

-任选地一种草酸青霉菌葡糖淀粉酶；

ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；

iii)使用发酵生物进行发酵；

80.如段落1-79所述的方法，包括以下步骤：

-E129V+K177L+R179E；

-

V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；

-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；

-V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；

iii)使用发酵生物进行发酵；

81.如段落1-80所述的方法，包括以下步骤：

-E129V+K177L+R179E；

-

V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；

-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；

-V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；

-一种蛋白酶，该蛋白酶具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的、超过20％的热稳定性值，优选来源于强烈火球菌和/或金黄色嗜热子囊菌；以及

-K79V；

-K79V+P11F+T65A+Q327F；或

-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；或

-K79V+P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；或

-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；或

-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或

-K79V+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T(使用SEQ ID NO:14进行编号)；

ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；

iii)使用发酵生物进行发酵；

82.如段落1-81所述的方法，包括以下步骤：

i)在80℃-90℃之间的温度下，使用以下项液化该含淀粉材料：

-E129V+K177L+R179E；

-

V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；

-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；

-V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；

-K79V；

-K79V+P11F+T65A+Q327F；或

-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；或

-K79V+P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；或

-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；或

-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或

-K79V+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T(使用SEQ ID NO:14进行编号)；

ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；

83.根据段落1-82中任一项所述的方法，包括以下步骤：

-源自嗜热脂肪芽孢杆菌的一种α-淀粉酶，具有在位置I181+G182处的双缺失、以及任选的取代N193F(使用在此的SEQ ID NO:1进行编号)；

-任选地一种支链淀粉酶；

-具有K79V取代的草酸青霉菌葡糖淀粉酶(使用在此的SEQ ID NO:14进行编号)；

ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；

84.如段落1-63所述的方法，包括以下步骤：

-在0.5和10微克之间的强烈火球菌蛋白酶/g DS；

85.如段落1-84所述的方法，包括以下步骤：

i)在80℃-90℃之间的温度下，使用以下项液化该含淀粉材料；

-在0.5和10微克之间的强烈火球菌蛋白酶/g DS；

-任选地一种支链淀粉酶；

-一种草酸青霉菌葡糖淀粉酶；

ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；

86.如段落1-85所述的方法，包括以下步骤：

i)在80℃-90℃之间的温度下，使用以下项液化该含淀粉材料；

-E129V+K177L+R179E；

-

V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；

-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；

-V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V

-在0.5和10微克之间的强烈火球菌蛋白酶/g DS；以及

-任选地一种支链淀粉酶；

-K79V；

-K79V+P11F+T65A+Q327F；或

-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；或

-K79V+P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；或

-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；或

-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或

-K79V+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T(使用SEQ ID NO:14进行编号)；

ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；

iii)使用发酵生物进行发酵；

87.如段落1-86所述的方法，包括以下步骤：

i)在80℃-90℃之间的温度下，使用以下项液化该含淀粉材料：

-E129V+K177L+R179E；

-

V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；

-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；

-V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；

-任选地一种支链淀粉酶；

-K79V；

-K79V+P11F+T65A+Q327F；或

-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；或

-K79V+P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；或

-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；或

-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或

-K79V+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T(使用SEQ ID NO:14进行编号)；

88.根据段落1-87中任一项所述的方法，包括以下步骤：

-E129V+K177L+R179E；

-

V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；

-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；

-V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；

-K79V；

-K79V+P11F+T65A+Q327F；或

-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；或

-K79V+P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；或

-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；或

-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或

-K79V+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T(使用SEQ ID NO:14进行编号)；

ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；

89.如段落1-88中任一项所述的方法，其中在糖化、发酵或同时同时糖化发酵(SSF)中存在纤维分解组合物。

90.如段落1-89中任一项所述的方法，其中该发酵生物菌株具有与酿酒酵母MBG4851或具有菌株V14/004037的定义特性的酵母菌属菌株V14/004037的衍生物大致一样的性质，因为与Ethanol Red^TM相比，在相同方法条件下，它提供了乙醇产量的增加。

91.如段落1-90中任一项所述的方法，其中该发酵生物菌株具有与酿酒酵母MBG4851或具有菌株V14/004037的定义特性的酵母菌属菌株V14/004037的衍生物大致一样的性质，因为与Ethanol Red^TM(ER)相比，在同时糖化发酵(SSF)中没有尿素存在和/或添加的相同条件下，它提供了乙醇产量的增加。

92.如段落1-91中任一项所述的方法，其中该发酵生物菌株具有与酿酒酵母MBG4851或具有菌株V14/004037的定义特性的酵母菌属菌株V14/004037的衍生物大致一样的性质，因为与Ethanol Red^TM相比，在相同方法条件下，它产生了降低水平的乳酸。

93.如段落1-92中任一项所述的方法，其中该发酵生物菌株具有与酿酒酵母MBG4851或具有菌株V14/004037的定义特性的酵母菌属菌株V14/004037的衍生物大致一样的性质，因为与Ethanol Red^TM相比，在相同方法条件下，它产生了降低水平的甘油。

94.如段落1-93中任一项所述的方法，其中该发酵生物菌株具有与酿酒酵母MBG4851或具有菌株V14/004037的定义特性的酵母菌属菌株V14/004037的衍生物大致一样的性质，因为与Ethanol Red^TM相比，在相同方法条件下，它具有较快发酵动力学。

95.如段落1-94中任一项所述的方法，其中该发酵生物菌株具有与酿酒酵母MBG4851或具有菌株V14/004037的定义特性的酵母菌属菌株V14/004037的衍生物大致一样的性质，因为与Ethanol Red^TM相比，在相同方法条件下，它减少了发酵中的乙醛水平。

96.如段落1-95中任一项所述的方法，其中该发酵生物菌株具有与酿酒酵母MBG4851或具有菌株V14/004037的定义特性的酵母菌属菌株V14/004037的衍生物大致一样的性质，因为与Ethanol Red^TM相比，在相同方法条件下，它增加了油回收水平。

97.如段落1-96中任一项所述的方法，其中该具有与酿酒酵母MBG4851或具有菌株V14/004037的定义特性的酵母菌属菌株V14/004037的衍生物大致一样的性质的发酵生物菌株具有以下性质和定义特性中的一种或多种，如所有：

-在相同方法条件下，与Ethanol Red^TM相比，增加乙醇产量；

-在相同方法条件下，与Ethanol Red^TM相比，增加油回收水平；

98.如段落1-97中任一项所述的方法，其中该发酵生物是一种非重组酵母菌属菌株，优选地非重组酿酒酵母菌株。

99.如段落1-98中任一项所述的方法，其中该发酵生物是一种非重组酵母菌属菌株，优选地是使用美国专利号8,257,959-BB中所描述和涉及的方法产生的非重组酿酒酵母菌株。

100.如段落1-99中任一项所述的方法，其中当使用实例19中所使用的方法设置和条件确定时，该具有与酿酒酵母MBG4851或具有菌株V14/004037的定义特性的酵母菌属菌株V14/004037的衍生物大致一样的性质的发酵生物菌株，在0ppm尿素下和在3μg EP/g DS的Pfu剂量下提供了超过Ethanol Red^TM(ER)的大于1.0％的乙醇产量提升，如在0ppm尿素下和在1.5μg EP/gDS的蛋白酶Pfu剂量下大于1.5％，如在0ppm尿素下和在0.0385μg EP/gDS的蛋白酶Pfu剂量下大于4.0％。

101.如段落1-100中任一项所述的方法，其中当使用实例21中所使用的方法设置和条件来确定时，具有与酿酒酵母MBG4851或具有菌株V14/004037的定义特性的酵母菌属菌株V14/004037的衍生物大致一样的性质发酵生物菌株，在300ppm的尿素水平下提供超过Ethanol Red^TM(ER)大于1.0％的乙醇产量提升，如在150ppm的尿素水平下大于3.0％，如在0ppm的尿素水平下大于10.0％。

102.如段落1-101中任一项所述的方法，其中当使用实例23中所使用的方法设置和条件来确定时，具有与酿酒酵母MBG4851或具有菌株V14/004037的定义特性的酵母菌属菌株V14/004037的衍生物大致一样的性质发酵生物菌株，在0ppm的尿素水平下并且在0.0385μg/g Ds的蛋白酶Pfu剂量下提供了超过Ethanol Red^TM(ER)的大于50％的54小时发酵中的乳酸减少，如在0ppm的尿素水平下并且在3μg/g DS的Pfu剂量下大于50％。

103.如段落1-102中任一项所述的方法，其中当使用实例34中所使用的方法设置和条件来确定时，具有与酿酒酵母MBG4851或具有菌株V14/004037的定义特性的酵母菌属菌株V14/004037的衍生物大致一样的性质发酵生物菌株，提供超过Ethanol Red^TM(ER)大于2.0％的60小时发酵中甘油水平的降低，如大于3.0％、如大于4.0％。

104.如段落1-103中任一项所述的方法，其中当使用实例39中所使用的方法设置和条件来确定时，具有与酿酒酵母MBG4851或具有菌株V14/004037的定义特性的酵母菌属菌株V14/004037的衍生物大致一样的性质发酵生物菌株，提供超过Ethanol Red^TM(ER)大于30％的54小时发酵中乙醛水平的降低，如大于40％、如大于50％。

105.一种用于从含淀粉材料生产乙醇的方法，该方法包括以下步骤：

ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；

iii)使用发酵生物进行发酵；

-在相同方法条件下，与Ethanol Red^TM(ER)相比，增加乙醇产量；

-在相同方法条件下，与Ethanol Red^TM相比，增加油回收水平；

106.如段落103所述的方法，其中该发酵生物是酿酒酵母。

107.如段落105或106所述的方法，其中该发酵生物是非重组酿酒酵母。

108.如段落1-107中任一项所述的方法，包括以下步骤：

-E129V+K177L+R179E；

-

V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；

-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；

-V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；

-K79V；

-K79V+P11F+T65A+Q327F；或

-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；或

-K79V+P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；或

-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；或

-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或

-K79V+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T(使用SEQ ID NO:14进行编号)；

ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；

109.如段落105-108中任一项所述的方法，其中该发酵生物是酿酒酵母MBG4851(在澳大利亚维多利亚州国家计量研究所登录号V14/004037下保藏)或一种发酵生物菌株，该发酵生物菌株具有与酿酒酵母MBG4851或具有菌株V14/004037的定义特性的酵母菌属菌株V14/004037的衍生物大致一样的性质。

110.一种从发酵产物生产过程中回收油的方法，该方法包括以下步骤：

ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；

iii使用发酵生物进行发酵。

iv)回收该发酵产物以形成全酒糟；

v)将该全酒糟分离为酒糟水和湿饼；

vi)任选地将该酒糟水浓缩为浆料；

111.如段落110所述的方法，其中在糖化和/或发酵或同时糖化发酵(SSF)中存在或添加蛋白酶。

112.一种在布达佩斯条约下保藏的并且具有NMI登录号V14/004037的酵母菌属酵母菌株(酿酒酵母MBG4851)或一种具有与酿酒酵母MBG4851或菌株V14/004037的衍生物大致一样的性质的菌株，其表现出一种或多种，如所有，菌株V14/004037的定义特性。

113.如段落112所述的菌株，其中该菌株是菌株V14/004037(MBG4851)。

114.一种生产表现出菌株V14/004037的定义特性的菌株V14/004037衍生物的方法，该方法包括：

(a)提供：

(i)第一酵母菌株；并且

(ii)第二酵母菌株，其中该第二酵母菌株是菌株V14/004037或菌株V14/004037的衍生物；

(b)在允许组合第一和第二酵母菌株之间的DNA的条件下，培养该第一酵母菌株和该第二酵母菌株；

(c)筛选或选择菌株V14/004037的衍生物。

115.如段落114所述的方法，其中步骤(c)包括筛选或选择表现出菌株V14/004037的一种或多种定义特性的一种杂合菌株。

116.如段落114所述的方法，该方法包括进一步步骤：

(d)用从步骤(c)筛选或选择的菌株作为该第一和/或第二菌株重复步骤(b)和(c)，直到获得显示出菌株V14/004037的定义特性的衍生物。

117.如段落114或115所述的方法，其中该培养步骤(b)包括：

(i)使该第一酵母菌株和该第二酵母菌株形成孢子；

(ii)将该第一酵母菌株产生的萌发的孢子与该第二酵母菌株产生的萌发的孢子进行杂交。

118.一种通过如段落114所述的方法产生的酵母菌属菌株。

119.一种生产乙醇的方法，该方法包括用包括可发酵糖的底物在允许可发酵糖发酵生成乙醇的条件下孵育如段落112或118所述的菌株。

120.如段落112或118所述的菌株在乙醇生产中的用途。

121.一种生产蒸馏酒糟的方法，该方法包括：

(a)用包括可发酵糖的底物在允许可发酵糖发酵生成乙醇和蒸馏酒糟的条件下，孵育如段落112或118所述的酵母菌属菌株；

(b)分离该蒸馏酒糟。

122.通过如段落121所述的方法产生的蒸馏酒糟。

123.如段落112或118所述的菌株在蒸馏酒糟生产中的用途。

124.菌株V14/004037(酿酒酵母MBG4851)在生产具有与酿酒酵母MBG4851大致一样的性质或表现出菌株V14/004037的一种或多种定义特性的酵母菌属菌株中的用途。

125.菌株V14/004037(酿酒酵母MBG4851)或一种具有与酿酒酵母MBG4851或菌株V14/004037的衍生物大致一样的性质的菌株在根据段落1-111中任一项所述的方法中的用途。

126.菌株V14/004037(酿酒酵母MBG4851)或菌株V14/004037的衍生物在相同的方法条件下，与Ethanol Red^TM相比，用于减少发酵中乙醛水平的用途。

127.根据段落126所述的用途，其中发酵中的醪液已经经受了α-淀粉酶和从0.5-50微克蛋白酶/克DS，如1-5微克蛋白酶/克DS、如约1.5或3微克蛋白酶/克DS。

128.根据段落127所述的用途，其中该蛋白酶是一种细菌蛋白酶。

129.根据段落127-128所述的用途，其中该蛋白酶源自细菌火球菌属菌株，如强烈火球菌菌株(pfu蛋白酶)，如或在此SEQ ID NO:13。

130.根据段落129所述的用途，其中该蛋白酶是在此的SEQ ID NO:13中所披露的蛋白酶或是与在此的SEQ ID NO:13具有至少80％一致性，例如至少85％，例如至少90％，例如至少95％，例如至少96％，例如至少97％，例如至少98％，例如至少99％一致性的一种蛋白酶。

131.根据段落125-128所述的用途，其中该α-淀粉酶是细菌来源的，如来自芽胞杆菌属，例如嗜热脂肪芽孢杆菌菌株，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的一种变体，例如在此的SEQ ID NO:1中所示的α-淀粉酶。

132.根据段落130所述的用途，其中该嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体选自具有以下突变的下组：

-I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E；

-

I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；

-I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；

-I181*+G182*+N193F+V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；以及

-

133.根据段落125-132中任一项所述的用途，其中待发酵的醪液已经经受了α-淀粉酶、葡糖淀粉酶和从0.5-50微克蛋白酶/克DS，如1-5微克蛋白酶/克DS、如约1.5或3微克蛋白酶/克DS。

134.根据段落133所述的用途，其中该葡糖淀粉酶源自青霉属菌株，尤其是在此的SEQ ID NO:9或14中所披露的草酸青霉菌菌株。

135.根据段落134所述的用途，其中该葡糖淀粉酶是具有K79V取代的草酸青霉菌葡糖淀粉酶变体(使用SEQ ID NO:14中所示的成熟序列进行编号)。

136.根据段落135所述的用途，其中该草酸青霉菌葡糖淀粉酶具有K79V取代(使用SEQ ID NO:14进行编号)，并且进一步具有以下之一：

-P11F+T65A+Q327F；

-P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F(使用SEQ ID NO:14进行编号)。

137.菌株V14/004037(酿酒酵母MBG4851)或菌株V14/004037的衍生物在相同的方法条件下，与Ethanol Red^TM相比，在乙醇生产方法中用于增加油回收/提取的用途。

138.一种组合物，包括如段落112或118中任一项所述的酵母菌属酵母菌株和一种或多种天然发生的和/或非天然发生的组分。

139.如段落138所述的组合物，其中该组分选自下组，该组由以下各项组成：表面活性剂、乳化剂、树胶、溶胀剂、和抗氧化剂。

140.如段落138-139所述的组合物，其中该酵母菌属酵母菌株是酵母菌属MBG4851。

141.如段落138-140所述的组合物，其中该酵母菌属酵母菌株是处于活力形式，具体地处于干燥、膏状或压缩形式。

Claims

ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；

iii)使用发酵生物进行发酵；

2.如权利要求1所述的方法，其中在糖化或发酵或SSF中添加少于3,000ppm，如少于2000ppm、如少于1,000ppm、如少于800ppm、如少于600ppm、如少于500ppm、如少于400ppm、如少于300ppm、如少于200ppm、如少于100ppm氮源、如无氮源，尤其是尿素。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中在糖化步骤ii)或发酵步骤iii)或同时糖化发酵(SSF)中添加蛋白酶。

4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中该具有与酿酒酵母MBG4851或具有菌株V14/004037的定义特性的酵母菌属菌株V14/004037的衍生物大致一样的性质的发酵生物菌株具有以下性质和定义特性中的一种或多种，如所有：

-在相同方法条件下，与Ethanol Red^TM相比，增加乙醇产量；

-在相同方法条件下，与Ethanol Red^TM相比，增加油回收水平；

5.一种在布达佩斯条约下保藏的并且具有NMI登录号V14/004037的酵母菌属酵母菌株(酿酒酵母MBG4851)或一种具有与酿酒酵母MBG4851或菌株V14/004037的衍生物大致一样的性质的菌株，其表现出一种或多种，如所有，菌株V14/004037的定义特性。

6.一种生产表现出菌株V14/004037的定义特性的菌株V14/004037衍生物的方法，该方法包括：

(d)提供：

(j)第一酵母菌株；和

(iii)第二酵母菌株，其中该第二酵母菌株是菌株V14/004037或菌株V14/004037的衍生物；

(e)在允许组合第一和第二酵母菌株之间的DNA的条件下，培养该第一酵母菌株和该第二酵母菌株；

(f)筛选或选择菌株V14/004037的衍生物。

7.如权利要求6所述的方法，其中步骤(c)包括筛选或选择表现出菌株V14/004037的一种或多种定义特性的杂合菌株。

8.如权利要求6所述的方法，该方法包括进一步步骤：

9.如权利要求6或7所述的方法，其中该培养步骤(b)包括：

(i)使该第一酵母菌株和该第二酵母菌株形成孢子；

10.一种通过如权利要求6所述的方法产生的酵母菌属菌株。

11.一种生产乙醇的方法，该方法包括用包括可发酵糖的底物在允许可发酵糖发酵生成乙醇的条件下孵育如权利要求5或10所述的菌株。

12.如权利要求5或10所述的菌株在乙醇生产中的用途。

13.一种生产蒸馏酒糟的方法，该方法包括：

(c)用包括可发酵糖的底物在允许可发酵糖发酵生成乙醇和蒸馏酒糟的条件下，孵育如权利要求5或10所述的酵母菌属菌株；

(d)分离该蒸馏酒糟。

14.通过如权利要求13所述的方法产生的蒸馏酒糟。

15.如权利要求5或10所述的菌株在蒸馏酒糟生产中的用途。

16.菌株V14/004037(酿酒酵母MBG4851)在生产表现出菌株V14/004037的一种或多种定义特性的酵母菌属菌株中的用途。

17.菌株V14/004037(酿酒酵母MBG4851)或具有与酿酒酵母MBG4851或菌株V14/004037的衍生物大致一样的性质的菌株在根据权利要求1-4中任一项所述的方法中的用途。

18.菌株V14/004037(酿酒酵母MBG4851)或菌株V14/004037的衍生物在相同的方法条件下，与Ethanol Red^TM相比，用于减少发酵中乙醛水平的用途。

19.一种从乙醇发酵产物生产过程中回收/提取油的方法，该方法包括以下步骤：

ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；

iii)使用发酵生物进行发酵；

iv)回收该发酵产物以形成全酒糟；

v)将该全酒糟分离为酒糟水和湿饼；

vi)任选地将该酒糟水浓缩为浆料；

20.一种包括如权利要求5或10中任一项所述的酵母菌属酵母菌株和一种或多种天然发生的和/或非天然发生的组分的组合物，如这些组分选自下组，该组由以下各项组成：表面活性剂、乳化剂、树胶、溶胀剂、和抗氧化剂。