CN107003508B - 选择性平面照明显微镜学仪器 - Google Patents

Abstract

所公开的是提供选择性平面照明的光学布置，其包含安装在样本支承下的在样本支承处提供光线或平面的使用中的反向照明物镜，以及安装在支承上的至少一个图像收集物镜，所述反向照明物镜具有照明物镜光轴线，以及所述图像收集物镜具有图像收集物镜光学轴线，其中，照明光布置成向照明物镜横向偏移于照明物镜光学轴线地传播，使得离开照明物镜的照明光以相对于照明物镜光学轴线的倾斜角度向样本支承传播，以及其中图像物镜光学轴线具有角度α，其对于照明物镜光学轴线是钝角以及通常垂直于在样本支承处传播的光。

Description

选择性平面照明显微镜学仪器

技术领域

本发明涉及选择性平面照明显微镜学（SPIM）以及具体地，但不专门地涉及对可适配于采用包含SPIM的多于一个显微镜学技术的显微镜学仪器。

背景技术

SPIM是荧光显微镜学成像技术，与更传统的显微镜学技术相比,该SPIM实现因光毒性和光褪色中显著的降低而引起的有效动态样本（live dynamic sample）的扩展成像。SPIM采用例如由柱面透镜生成的激励照明的线或平面（通常称为光片（light sheet）），以及采用垂直检测几何结构以允许样本的光学分段检验。另外，SPIM照明生成焦点背景信号的降低输出，其极大增强三维试样（specimen）的图像质量。在US7554725中示出SPIM的示例。

在SPIM的大多数实现中，SPIM系统围绕试样来设计，从而要求新颖的样本制备，例如将样本嵌入在琼脂糖胶中，这排除使用例如玻璃盖片的传统样本支架（sample mount），其与很多传统显微镜一起使用。虽然显微镜学的其它类型，例如倾斜平面显微镜学（OPM），使用相同的物镜来照亮以及检测试样并且能够适应上述新颖的样本制备，但这样的显微镜学系统遭受相对于其它方法学低的数值孔径，以及因此要求大量的光学器件来校正由相对于显微镜的检测平面所倾斜的光片引起的像差。因此，能够容易地将现有传统显微镜转换成适应SPIM将会是期望的。在WO2012122027中示出这样的转换.

利用SPIM的先前的仪器的不利特征（包含在WO2012122027中示出的转换）是物镜的非传统定位，其导致两个关键劣势。第一，样本制备、样本装载和样本卸载是繁重的和有挑战性的。先前的尝试对于适配传统仪器以便维护其它强大的显微镜学成像模式（包含但不限于SIM（结构化照明显微镜学）和TIRF（全内角反射荧光显微镜学））的成像功能性未能经得起检验。这样做的一个方式是要重新布置照明和成像物镜的光轴线。在US8472113中示出这样的重新布置的一个尝试。然而，在US8472113和WO2012122027中示出的布置使用来自上述的照明，这妨碍样本装载和卸载，因为操控空间因此是非常受限的。

发明内容

根据一个方面，本发明提供了光学布置，其提供选择性平面照明，光学布置包含安装在样本支承下的在样本支承处提供光线或平面的使用中的反向照明物镜，以及安装在支承上的至少一个图像收集物镜，所述反向照明物镜具有照明物镜光学轴线，以及所述图像收集物镜具有图像收集物镜光学轴线，其中，照明光布置成向照明物镜横向偏移于照明物镜光学轴线地传播，使得离开照明物镜的照明光以相对于照明物镜光学轴线的倾斜角度而向样本支承传播，以及其中图像物镜光学轴线具有角度α，其对于照明物镜光学轴线是钝角的以及通常垂直于在样本支承处传播的光。

因此，光学布置是这样的以至于照明来自下面，这允许其它高分辨率显微镜学仪器的方便适配。本文所述实施例的关键进步是对使用定位在反向配置（其可易于适配于附加荧光显微镜学成像模式）中的传统油或水浸液物镜的SPIM的提供。而且，为了方便的样本制备或者更简单的准备样本装载/卸载，成像光学器件能够不恰当地提高。

在改进中，能够采用一对成像物镜，在照明物镜光学轴线每侧上各一个，以提供整个三维样本体积的等向性高分辨率成像。

根据第二方面，本发明提供SPIM显微镜学仪器，其包含具有照明物镜光学轴线的照明物镜以及包含在垂直于照明物镜光学轴线的方向上相对于所述轴线可移动的以及优选地在连续动作中如此可移动的样本支承。

本发明提供根据权利要求1的光学布置，其具有由从属于权利要求1的权利要求所限定的优选特征。本发明还提供如由权利要求5限定的照亮样本的方法，以及根据权利要求6到9的显微镜学仪器。本发明还提供根据权利要求10的SPIM仪器。

本发明扩展至本文所公开的特征的任何组合，无论这样的组合是否明确在本文中提及。此外，在两个或多个特征在组合中提及的情况下，意图在没有扩展本发明范围的情况下，这样的特征可单独地被要求。

附图说明

本发明能够以多个方式实行，其示意性实施例在下文参考附图来描述，其中：

图1a示出SPIM的光学布置的示意性表示；

图1b示出采用图1a光学布置的显微镜学仪器；

图2示出图1a中所示的光学布置的第一光束路径模型；

图3示出图1a中所示的光学布置的第二光束路径模型；以及

图4示出采用移动样本支承的示意性表示。

具体实施方式

本发明与它的目的和它的优势一起参考与附图结合所进行的下面的描述可被更好地理解，其中相似的参考数字在图中识别相似的元件。

参考图1a，光学布置100以横截面示意性地示出，以及SPIM仪器10示出在合并图1a的光学布置的图1b中。图示SPIM仪器物镜透镜110，其提供光线或平面/片（本文被称为线），线在垂直于纸以及进入纸中的方向上延伸。照明物镜透镜110在反向配置中定位在样本支承120下，以便与高分辨率与超分辨率的荧光显微镜的典型配置相兼容。照明物镜透镜110具有照明物镜光学轴线111。两个单独的图像收集物镜透镜130和140定位在样本支承120上，每个分别具有图像收集物镜光学轴线131和141。在照明物镜光学轴线和图像收集物镜光学轴线131和141之间的角度α是大约135度。因此，图像收集物镜的光学轴线131和141相对于反向照明物镜透镜的光学轴线111处于+135度和-135度。

在使用中，采取光线的形式的相干激光光束132和142交替地指向照明物镜透镜110。每个束是平行的但横向偏移光学轴线111距离x，使得每个束在物镜透镜110处折射以在样本支承120的样本保持区域122处相对于光学轴线111倾斜地传播。

样本S能够在样本区域122处通过束132和142的倾斜相（oblique phase）来照亮。照明线用来通过样本选择性地照亮部分（section），以及漫射图像光（diffuse imagelight）通过通常垂直于束132和142的光线的传播方向上安装的相应的图像收集物镜130和140来收集，使得光线通常停留在图像收集物镜的焦平面处。

双图像收集物镜130和140的目的是要提供整个三维样本体积的各向同性的高分辨率成像。结构化图像能够从来自左和右照明的一系列图像来制定。

上文所述的光学布置提供照明的细线，其向上通过反向物镜透镜110，但以相对于透镜的光学轴线111稍微横向偏移x来传播，使得离开透镜的束精准地转向为图像搜集物镜130或140的焦平面的角度。即，正交于图像收集物镜的光学轴线131和141。以这种方式，只有相对于成像透镜焦点对准的样本的薄部分由照明束132或142来激励。为了对两个图像收集物镜透镜130和140提供照明，照明束的上述横向偏移x将交替在两个离散横向偏移位置之间，其位于反向照明物镜透镜110的光学轴线111的同等和相对侧上。在两个离散横向偏移位置之间的束切换能够通过例如光电子-机械切换机制（包含但不限于检流计反射镜、压电反射镜或者鳍状反射镜）的各种光操纵器来实现。同样地，跨样本平面的整个视野的束扫描能够通过各种光电子-机械的扫描机制（包含但不限于检流计反射镜、压电反射镜或者旋转多面体反射镜）来实现。在照明模式（SPIM、SIM、TIRF、PK等）之间的切换能够通过利用以对每个支持的模式关联的束迂回路径的从检流计反射镜的多个反射来实现，例如如先前在WO2013074033A1中所述，其内容通过引用合并在本文中。

图2和图3示出两个照明束路径132和142的束路径模型，以及具体地图示图像收集物镜收集从通常垂直于照明路径的样本区域122传播的光。

图4更详细示出光学布置，以及更清楚地图示本发明的第二方面。在该实施例中，样本支承120在由3个物镜透镜110、130和140的光学轴线限定的X平面中是可移动的。该移动在无需对跨多个相邻图像平面扫描照明束的要求的情况下提供通过三维样本体积分段的方法。本技术涉及样本支承120的移动，其优选地通过线性滑道或者两个正交相对滑道和电马达传动或多个传动。通过移动样本来水平地进行扫描。理想地，扫描将会是连续的而不是以不连续的阶段，以便使样本介质（其对于离散横向扰动将会是敏感的）的振动最小化。该方法具有三个截然不同的优势。第一，它减少对照明束的扫描控制机制的数量。第二，它消除在扫描时提供图像收集物镜的光电子-机械深度控制的需要。这前两个优势极大简化光电子-机械系统设计，同时还提高系统稳定性和可对准性。第三个优势是功能的优势，其中样本的所提议的水平扫描允许沿一个横向轴线的无限制视野以适应加长型的试样，例如秀丽隐杆线虫。为了使该SPIM光学布置与其它已知的高分辨率显微镜学技术相兼容，在样本支承120和照明物镜110之间的空间由液体（在该情况中是浸油124）桥接。

虽然两个实施例已经被描述和图示，对本领域技术人员将显而易见的是，在没有偏离所要求的本发明范围的情况下，对那些实施例的增加、省略和修改是可能的。例如，在光学轴线111和131之间或者在轴线111和141之间的角度α在原则上能够处于在大约100度和大约170度之间的范围中任何位置，然而，135度支持最大的聚光容量并且因此被认为是最佳的，以及125至145度是满意的。

Claims (14)

1.一种提供选择性平面照明的光学布置，其包含安装在样本支承下的反向照明物镜，以及安装在所述支承上的至少一个图像收集物镜，所述反向照明物镜在使用中在所述样本支承处提供光线或光平面，所述反向照明物镜具有照明物镜光学轴线，以及所述图像收集物镜具有图像收集物镜光学轴线，其中，照明光布置成向所述照明物镜平行地横向偏移于所述照明物镜光学轴线地传播，使得离开所述照明物镜的所述照明光以相对于所述照明物镜光学轴线的倾斜角度而向所述样本支承传播，以及其中所述图像物镜光学轴线具有角度α，其对于所述照明物镜光学轴线是钝角的以及通常垂直于在所述样本支承处传播的光。

2.如权利要求1所述的光学布置，其中，所述角度α在100和170度之间。

3.如权利要求2所述的光学布置，其中，所述角度α在125和145度之间。

4.如权利要求3所述的光学布置，其中，所述角度α为大约135度。

5.如权利要求1或2所述的光学布置，其中，所述至少一个图像收集物镜包括第一和第二图像收集物镜，每个安装在所述照明物镜轴线的相对侧上，以及其中所述照明光布置成在所述照明物镜轴线的相对侧上交替地沿相应的第一和第二路径传播，以交替地提供图像光至所述第一或所述第二图像收集物镜。

6.如权利要求1或2所述的光学布置，其中，所述照明光是相干光，以及所述光学布置还包含光学操纵器，其用来提供聚焦至光线的所述照明光或者采取准直光的平面或片的形式的所述照明光。

7.如权利要求6所述的光学布置，其中，所述照明光是激光。

8.一种照亮样本以便提供SPIM的方法，所述方法包括以下步骤：

a) 提供如权利要求5所述的光学布置；

b) 促使相干光以在照明的方向上传播；

c) 捕捉由所述第一和第二图像收集物镜收集的一个或多个图像；

d) 从由两个图像收集物镜捕捉的所述图像来制定结构化图像。

9.一种SPIM仪器，其包含如权利要求1至7任一项所述的光学布置。

10.如权利要求9所述的SPIM仪器，可适配于还执行SIM、TIRF和PK显微镜学技术中的任何一个或多个。

11.如权利要求9或10所述的SPIM仪器，其中，在所述照明物镜和所述样本支承之间存在空间，以及所述空间由液体桥接。

12.如权利要求9或10所述的SPIM仪器，其中，所述样本支承垂直于所述照明物镜光学轴线是可移动的。

13.如权利要求12所述的SPIM仪器，其中，所述样本支承垂直于所述照明物镜光学轴线在连续动作中是可移动的。

14.一种SPIM显微镜学仪器，其包含具有照明物镜光学轴线的照明物镜以及包含在垂直于所述照明物镜光学轴线的方向上相对于所述轴线并且在连续动作中可移动的样本支承，

其中所述SPIM显微镜学仪器还包括第一和第二图像收集物镜，每个安装在所述照明物镜光学轴线的相对侧上，以及其中照明光布置成在所述照明物镜光学轴线的相对侧上交替地沿相应的第一和第二路径传播，以交替地提供图像光至所述第一或所述第二图像收集物镜。

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