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CN107002141A - 使用fgfr突变基因组鉴定将对用fgfr抑制剂进行治疗有反应的癌症患者 - Google Patents

使用fgfr突变基因组鉴定将对用fgfr抑制剂进行治疗有反应的癌症患者 Download PDF

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CN107002141A CN201580064601.1A CN201580064601A CN107002141A CN 107002141 A CN107002141 A CN 107002141A CN 201580064601 A CN201580064601 A CN 201580064601A CN 107002141 A CN107002141 A CN 107002141A
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fgfr3
fgfr2
fgfr
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Abstract

本文公开了鉴定将对用成纤维细胞生长因子受体(FGFR)抑制剂进行治疗有反应的癌症患者的方法以及治疗癌症患者的方法。所述方法包括评估来自所述患者的生物样品中来自FGFR突变基因组的一种或多种FGFR突变体的存在。本文还公开了用于鉴定生物样品中一种或多种FGFR突变基因的存在的试剂盒和引物。

Description

使用FGFR突变基因组鉴定将对用FGFR抑制剂进行治疗有反应 的癌症患者
相关申请的交叉引用
本申请要求2014年9月26日提交的美国临时申请No.62/056,159的优先权，该申请的公开内容据此全文以引用方式并入。
序列表
本申请包含已经以ASCII格式电子提交的序列表，所述序列表据此全文以引用方式并入。所述ASCII副本创建于2015年8月6日，命名为103693.000782_SL.txt，大小为66,185字节。
技术领域
本文提供了鉴定将对用成纤维细胞生长因子受体抑制剂进行治疗有反应的癌症患者的方法以及治疗所述癌症患者的方法。
背景技术
鉴定遗传异常可用于为癌症患者选择一种或多种适当的治疗方法。这对于无法用主治疗方案(一线治疗)治疗其癌症类型的癌症患者来说也是有用的，尤其是在没有二线和后续治疗的公认护理标准的情况下更是如此。成纤维细胞生长因子受体(FGFR)属于受体酪氨酸激酶家族，其参与调节细胞存活、增殖、迁移和分化。在某些癌症中观察到FGFR发生了变化。目前还没有能够有效治疗FGFR发生变化的患者的批准疗法。
发明内容
本文公开了鉴定将对用成纤维细胞生长因子受体(FGFR)抑制剂进行治疗有反应的癌症患者的方法，该方法包括：评估来自患者的生物样品中来自FGFR突变基因组的FGFR突变体，其中该FGFR突变体是FGFR融合基因或FGFR单核苷酸多态性，并且其中所述评估包括用与来自FGFR突变基因组的一种或多种FGFR突变体结合并对其进行扩增的引物对扩增cDNA；以及确定样品中是否存在来自基因组的一种或多种FGFR突变体，其中存在一种或多种FGFR突变体表示患者将对用FGFR抑制剂进行治疗有反应。
本文还公开了治疗患者的癌症的方法，该方法包括：评估来自患者的生物样品中来自FGFR突变基因组的一个或个FGFR突变体的存在；以及如果样品中存在一种或多种FGFR突变体，则用FGFR抑制剂治疗该患者。
本文还提供了用于鉴定生物样品中一种或多种FGFR突变基因的存在的试剂盒和引物。
附图说明
当结合附图阅读时，可进一步理解发明内容以及下文的具体实施方式。为了说明所公开的方法、试剂盒和引物，在附图中示出了该方法、试剂盒和引物的示例性实施方案，但是该方法、试剂盒和引物并不限于所公开的具体实施方案。在附图中：
图1是示例性FGFR融合基因的图示，存在其中至少一个基因则表示患者将对用FGFR抑制剂进行治疗有反应。图中还示出了(细箭头)用于扩增融合基因的示例性引物位置。
图2(包括图2A至图2I)表示对以下FFPET样品进行Sanger测序的阳性结果：A)FGFR3:TACC3 v1；B)FGFR3:TACC3 v3；C)FGFR3:TACC3内含子；D)FGFR3:BAIAP2L1；E)FGFR2:AFF3；F)FGFR2:BICC1；G)FGFR2:CASP7；H)FGFR2:CCDC6和I)FGFR2:OFD1。
图3示出了使用3′双脱氧野生型(WT)阻断剂寡核苷酸来进行SNP特异性qRT-PCR的示例性策略。
图4示出了用于检测FGFR SNP的示例性分析验证策略。实验在经过工程改造的RK3E细胞系中进行，该细胞系表达FGFR融合体并且被稀释成不含FGFR3/FGFR2融合体的野生型细胞系。
图5(包括图5A至图5D)示出了(a)G370C、(B)Y373C、(C)S249C和(D)R248C的双脱氧WT阻断剂的SNP特异性PCR。
图6(包括图6A至图6I)表示以下各组的FGFR融合基因测定的效率标准曲线：A)FGFR3:TACC3 v1；B)FGFR3:TACC3 v3；C)FGFR3:TACC3内含子；D)FGFR3:BAIAP2L1；E)FGFR2:AFF3；F)FGFR2:BICC1；G)FGFR2:CASP7；H)FGFR2:CCDC6和I)FGFR2:OFD1。
图7是膀胱癌(原发性和转移性)、NSCLC(腺癌和鳞状细胞癌)、卵巢癌、食管癌(原发性和转移性)、头颈癌(H&N，原发性和转移性)、子宫内膜癌(转移性)、乳腺癌和前列腺癌中FGFR融合基因状态的示例性表示。
图8是NSCLC腺癌和鳞状细胞癌中FGFR融合基因和突变状态的示例性表示。
图9(包括图9A至图9D)表示I期患者的样品的示例性结果。使用合成模板测定对照(ST)、GAPDH(质量对照样品)引物或者以下各组的特异性引物进行测定：A)FGFR2:BICC1融合体；B)FGFR3:TACC3(外显子18：外显子1)融合体；C)FGFR2:CCDC6融合体；或者D)FGFR3:TACC3 v1、FGFR3:TACC3 v3或FGFR2:CCDC6融合体。患者样品为以下样品：A-尿路上皮癌；B-膀胱癌；C-胆管癌；和D-肾上腺癌。
图10表示对患有晚期实体瘤的患者用JNJ-42756493进行首次人体研究的示例性I期研究设计。
图11表示用大于或等于6mg的剂量水平来自基线减少的目标病变直径总和的最大抑制百分比。按照每日方案或间歇给药方案(7天给药/7天停药)用不同施用剂量的FGFR抑制剂JNJ-42756493治疗实体瘤患者。该图示出了剂量和肿瘤类型。根据RECIST标准测量肿瘤减少。肿瘤中携带FGFR基因易位和突变的患者似乎对FGFR抑制剂JNJ-42756493更敏感。
图12示出了用所示的FGFR融合体稳定转染的RK3E细胞中各种FGFR融合体的表达。
图13(包括图13A至图13B)示出了用所示的FGFR融合体稳定转染的RK3E细胞中的菌落形成测定结果。(A)用0.1％的甲苯基结晶紫在6孔板中进行染色以及(B)示出每100个接种细胞中的菌落数的柱状图。结果表示两次独立实验的结果。
图14(包括图14A至图14H)示出了用所示的FGFR融合体稳定转染的RK3E细胞中示例性下游靶标的表达。
具体实施方式
结合对构成本公开一部分的附图，并参考下文的具体实施方式，可更容易地理解所公开的方法、试剂盒和引物。应当理解，所公开的方法、试剂盒和引物并不限于本文所述和/或所示的具体方法、试剂盒和引物，并且本文所用的术语仅用于以举例方式描述具体实施方案，不旨在限制受权利要求保护的方法、试剂盒和引物。
提及具体数值至少包括该具体值，除非上下文另有明确规定。当表示值的范围时，另一个实施例包括从一个具体的值和/或到其他具体的值。此外，提及以范围形式表述的值时，包括该范围内的每个值。所有范围都是指闭区间并且可以组合。
应当理解，为清楚起见，所公开的方法、试剂盒和引物的某些特征在单独实施方案的上下文中进行描述，但也可以组合形式在单个实施方案中提供。相反地，为简明起见，所公开的方法、试剂盒和引物的各种特征在单个实施例的上下文中进行描述，但也可单独提供或以任何子组合形式提供。
如本文所用，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数形式。
在整个说明书中使用以下缩写：FGFR(成纤维细胞生长因子受体)；LLOQ(定量下限)、FGFR3:TACC3(编码FGFR3的基因与含转化酸性卷曲螺旋的蛋白3之间的融合体)、FGFR3:BAIAP2L1(编码FGFR3的基因与脑特异性血管生成抑制剂1相关类蛋白2蛋白1之间的融合体)、FGFR2:AFF3(编码FGFR2的基因与AF4/FMR2家族成员3之间的融合体)、FGFR2:BICC1(编码FGFR2的基因与二尾C同系物之间1的融合体)、FGFR2:CASP7(编码FGFR2的基因与半胱天冬酶7之间的融合体)、FGFR2:CCDC6(编码FGFR2的基因与含卷曲螺旋结构域的蛋白6之间的融合体)、FGFR2:OFD1(编码FGFR2的基因与口面指综合征1之间的融合体)、FFPET(福尔马林固定石蜡包埋组织)、SNP(单核苷酸多态性)、NSCLC(非小细胞肺癌)、ct(循环阈值)。
如本文所用，“治疗”及类似的术语是指降低癌症症状的严重性和/或频率、消除癌症症状和/或所述症状的根本原因、降低癌症症状的频率或可能性和/或其根本原因，以及改善或补救由癌症直接或间接造成的损害。
“生物样品”是指来自可从其中获得癌细胞并分离RNA的患者的任何样品。合适的生物样品包括但不限于血液、淋巴液、骨髓、实体肿瘤样品，或它们的任何组合。在一些实施方案中，生物样品可以是FFPET。
如本文所用，“预扩增”是指在扩增步骤之前进行的PCR程序，其目的是增加用于扩增步骤的模板cDNA的量。预扩增步骤可例如使用预扩增主混合物(LifeTechnologies/Applied 产品号4391128)进行。
如本文所用，“扩增”及类似的术语是指产生核酸样品的许多相同拷贝。用于扩增核酸样品的合适技术包括但不限于聚合酶链反应(PCR)和实时聚合酶链反应(RT-PCR)。在一些实施方案中，扩增步骤包括RT-PCR。
FGFR突变体
如本文所用，短语“FGFR突变体”是指FGFR融合基因、FGFR单核苷酸多态性或它们两者。
“FGFR融合体”或“FGFR融合基因”是指通过编码FGFR(例如，FGRF2或FGFR3)的基因或其部分与本文所公开的融合伴侣之一或其部分之间发生易位而形成的这两种基因。可使用所公开的方法来确定来自患者的生物样品中是否存在一种或多种以下FGFR融合基因：FGFR3:TACC3 v1、FGFR3:TACC3 v3、FGFR3:TACC3内含子、FGFR3:BAIAP2L1、FGFR2:BICC1、FGFR2:AFF3、FGFR2:CASP7、FGFR2:CCDC6、FGFR2:OFD1，或它们的任何组合。表1提供了FGFR融合基因以及融合的FGFR和融合伴侣的外显子。图1提供了各种FGFR融合基因的图示。各个FGFR融合基因的序列在表16中公开。
表1
融合基因 FGFR外显子 伴侣外显子
FGFR3:TACC3 v1 18 11
FCFR3:TACC3 v3 18 10
FGFR3:TACC3内含子 18 4
FGFR3:BAIAP2L1 18 2
FGFR2:AFF3 19 8
FGFR2:BICC1 19 3
FGFR2:CASP7 19 4
FGFR2:CCDC6 19 2
FGFR2:OFD1 19 3
“FGFR单核苷酸多态性”(SNP)是指个体中单个核苷酸有差异的FGFR2或FGFR3基因。具体地讲，FGFR单核苷酸多态性(SNP)是指个体中单个核苷酸有差异的FGFR3基因。可使用所公开的方法来确定来自患者的生物样品中是否存在一种或多种以下FGFR SNP：FGFR3R248C、FGFR3 S249C、FGFR3 G370C、FGFR3 Y373C，或它们的任何组合。FGFR SNP的序列在表2中提供。
表2
序列对应于FGFR3(Genebank ID#NM_0001424)的第920-1510位核苷酸。
粗体下划线标出的核苷酸表示SNP。
*有时在文献中被误认为是Y375C。
如本文所用，“FGFR突变基因组”包括一种或多种以上所列的FGFR突变体。在一些实施方案中，FGFR突变基因组取决于患者的癌症类型。
在所公开方法的评估步骤中使用的FGFR突变体组在一定程度上基于患者的癌症类型。对于膀胱癌患者，合适的FGFR突变基因组可包括FGFR3:TACC3 v1、FGFR3:TACC3 v3、FGFR3:BAIAP2L1、FGFR2:BICC1、FGFR2:AFF3、FGFR2:CASP7、FGFR3 R248C、FGFR3 S249C、FGFR3 G370C或FGFR3 Y373C，或它们的任何组合。
对于转移性膀胱癌患者，合适的FGFR突变基因组可包括FGFR3:TACC3 v1、FGFR3:TACC3 v3、FGFR3:BAIAP2L1、FGFR2:BICC1、FGFR2:AFF3、FGFR2:CASP7、FGFR3 R248C、FGFR3S249C、FGFR3 G370C或FGFR3 Y373C，或它们的任何组合。
对于卵巢癌患者，合适的FGFR突变基因组可包括FGFR3:TACC3 v1、FGFR3:TACC3v3、FGFR3:BAIAP2L1、FGFR2:BICC1、FGFR2:AFF3、FGFR2:CASP7、FGFR3 R248C、FGFR3 S249C、FGFR3 G370C或FGFR3 Y373C，或它们的任何组合。
对于头颈癌患者，合适的FGFR突变基因组可包括FGFR3:BAIAP2L1、FGFR2:CASP7、FGFR3 R248C、FGFR3 S249C、FGFR3 G370C或FGFR3 Y373C，或它们的任何组合。
对于转移性头颈癌患者，合适的FGFR突变基因组可包括FGFR3:BAIAP2L1、FGFR2:CASP7或FGFR2:OFD1，或它们的任何组合。
对于食管癌患者，合适的FGFR突变基因组可包括FGFR3:TACC3 v1、FGFR3:TACC3v3、FGFR2:BICC1、FGFR2:CASP7、FGFR3 R248C、FGFR3 S249C、FGFR3 G370C或FGFR3 Y373C，或它们的任何组合。
对于转移性食管癌患者，合适的FGFR突变基因组可包括FGFR3:TACC3 v1、FGFR3:TACC3 v3、FGFR3:TACC3内含子、FGFR3:BAIAP2L1、FGFR2:BICC1、FGFR2:AFF3、FGFR2:CASP7、FGFR2:CCD6或FGFR2:OFD1，或它们的任何组合。
对于非小细胞肺腺癌患者，合适的FGFR突变基因组可包括FGFR3:TACC3 v1、FGFR3:TACC3 v3、FGFR3:TACC3内含子、FGFR3:BAIAP2L1、FGFR2:AFF3、FGFR2:CASP7、FGFR3R248C、FGFR3 S249C、FGFR3 G370C或FGFR3 Y373C，或它们的任何组合。
对于非小细胞肺鳞状细胞癌患者，合适的FGFR突变基因组可包括FGFR3:TACC3v1、FGFR3:TACC3 v3、FGFR3:BAIAP2L1、FGFR2:BICC1、FGFR2:AFF3、FGFR2:CASP7、FGFR2:CCDC6、FGFR3 R248C、FGFR3 S249C、FGFR3 G370C或FGFR3 Y373C，或它们的任何组合。
对于转移性子宫内膜癌患者，合适的FGFR突变基因组可包括FGFR3:TACC3 v1、FGFR3:TACC3 v3、FGFR3:TACC3内含子、FGFR3:BAIAP2L1、FGFR2:CASP7、FGFR2:CCDC6或FGFR2:OFD1，或它们的任何组合。
对于乳腺癌患者，合适的FGFR突变基因组可包括FGFR3:TACC3 v1、FGFR3:TACC3v3、FGFR3:TACC3内含子、FGFR3:BAIAP2L1、FGFR2:BICC1、FGFR2:AFF3、FGFR2:CASP7、FGFR2:CCD6或FGFR2:OFD1，或它们的任何组合。
用于扩增FGFR突变体的引物
本领域技术人员知道，核酸的扩增需要引物，所述引物与要扩增区域两侧的核酸链的5′和3′区互补并结合。如本文所用，“引物对”是指在扩增步骤中使用的正向和反向引物。适于执行所公开方法的引物对在表3中列出。
表3
本文公开了具有以下核酸序列的引物：SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ IDNO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ IDNO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ IDNO：37、SEQ ID NO：38，或它们的任何组合。
本文还公开了具有以下序列的引物组：SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18、SEQ IDNO：19和SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24、SEQID NO：25和SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35和SEQ IDNO：36、SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38，或它们的任何组合。
在一些实施方案中，引物组可具有SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6的序列。在一些实施方案中，引物组可具有SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8的序列。在一些实施方案中，引物组可具有SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10的序列。在一些实施方案中，引物组可具有SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12的序列。在一些实施方案中，引物组可具有SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14的序列。在一些实施方案中，引物组可具有SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16的序列。在一些实施方案中，引物组可具有SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18的序列。在一些实施方案中，引物组可具有SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20的序列。在一些实施方案中，引物组可具有SEQ IDNO：21和SEQ ID NO：22的序列。在一些实施方案中，引物组可具有SEQ ID NO：23和SEQ IDNO：24的序列。在一些实施方案中，引物组可具有SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26的序列。在一些实施方案中，引物组可具有SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28的序列。在一些实施方案中，引物组可具有SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30的序列。在一些实施方案中，引物组可具有SEQID NO：31和SEQ ID NO：32的序列。在一些实施方案中，引物组可具有SEQ ID NO：33和SEQID NO：34的序列。在一些实施方案中，引物组可具有SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36的序列。在一些实施方案中，引物组可具有SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38的序列。在一些实施方案中，引物组可具有上述引物组的任何组合的序列。
用于所公开方法的FGFR抑制剂
本文提供了用于所公开方法的合适FGFR抑制剂。
在一些实施方案中，如果患者样品中存在一种或多种FGFR突变体，则可用美国公开No.2013/0072457 A1(以引用方式并入本文)中公开的FGFR抑制剂来治疗该患者，所述FGFR抑制剂包括其任何互变异构形式或立体化学异构形式及其N-氧化物、其药学上可接受的盐或其溶剂化物(合适的R基团在美国公开No.2013/0072457 A1中公开)。在一些方面，例如可用N-(3，5-二甲氧基苯基)-N′-(1-甲基乙基)-N-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)喹喔啉-6-基1乙烷-1，2-二胺(在本文中称为“JNJ-42756493”或“JNJ493”)治疗患者：
包括其N-氧化物、其药学上可接受的盐或其溶剂化物。在一些方面，药学上可接受的盐是HCl盐。在一些方面，可用JNJ493碱治疗患者。
在一些实施方案中，如果患者样品中存在一种或多种FGFR突变体，则可用FGFR抑制剂治疗该患者，其中FGFR抑制剂是N-[5-[2-(3，5-二甲氧基苯基)乙基]-2H-吡唑-3-基]-4-(3，5-二甲基哌嗪-1-基)苯甲酰胺(AZD4547)，如Gavine，P.R.等人在“AZD4547：AnOrally Bioavailable，Potent，and Selective Inhibitor of the Fibroblast GrowthFactor Receptor Tyrosine Kinase Family，Cancer Res，2012年4月15日，第72卷，第2045页”中所述：
在化学上可能的情况下，包括其任何互变异构形式或立体化学异构形式及其N-氧化物、其药学上可接受的盐或其溶剂化物。
在一些实施方案中，如果患者样品中存在一种或多种FGFR突变体，则可用FGFR抑制剂治疗该患者，其中FGFR抑制剂是3-(2，6-二氯-3，5-二甲氧基-苯基)-1-{6-[4-(4-乙基-哌嗪-1-基)-苯基氨基]-嘧啶-4-基}-1-甲基-脲(NVP-BGJ398)，如在国际公布No.WO2006/000420中所述：
在化学上可能的情况下，包括其任何互变异构形式或立体化学异构形式及其N-氧化物、其药学上可接受的盐或其溶剂化物。
在一些实施方案中，如果患者样品中存在一种或多种FGFR突变体，则可用FGFR抑制剂治疗该患者，其中FGFR抑制剂是4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]-1H-喹啉-2-酮(多韦替尼)，如在国际公布No.WO2006/127926中所述：
在化学上可能的情况下，包括其任何互变异构形式或立体化学异构形式及其N-氧化物、其药学上可接受的盐或其溶剂化物。
在一些实施方案中，如果患者样品中存在一种或多种FGFR突变体，则可用FGFR抑制剂治疗该患者，其中FGFR抑制剂是6-(7-((1-氨基环丙基)-甲氧基)-6-甲氧基喹啉-4-基氧基)-N-甲基-1-萘甲酰胺(AL3810)(德立替尼，E-3810)，如Bello，E.等人在“E-3810Is aPotent Dual Inhibitor of VEGFR and FGFR that Exerts Antitumor Activity inMultiple Preclinical Models，Cancer Res，2011年2月15日，第71(A)卷，第1396-1405页”和国际公布No.WO2008/112408中所述：
在化学上可能的情况下，包括其任何互变异构形式或立体化学异构形式及其N-氧化物、其药学上可接受的盐或其溶剂化物。
在一些实施方案中，如果患者样品中存在一种或多种FGFR突变体，则可用FGFR抑制剂治疗该患者，其中FGFR抑制剂是抗FGFR2抗体，诸如在WO2013/076186中所述。
其他合适的FGFR抑制剂包括BAY1163877(Bayer)、BAY1179470(Bayer)、TAS-120(Taiho)、ARQ087(ArQule)、ASP5878(Astellas)、FF284(Chugai)、FP-1039(GSK/FivePrime)、Blueprint、LY-2874455(Lilly)、RG-7444(Roche)或它们的任何组合，在化学上可能的情况下，包括其任何互变异构形式或立体化学异构形式、其N-氧化物、其药学上可接受的盐或其溶剂化物。
在一些实施方案中，如果患者样品中存在一种或多种FGFR突变体，则可用FGFR抑制剂治疗该患者，其中FGFR抑制剂是BAY1163877(Bayer)，在化学上可能的情况下，包括其任何互变异构形式或立体化学异构形式、其N-氧化物、其药学上可接受的盐或其溶剂化物。
在一些实施方案中，如果患者样品中存在一种或多种FGFR突变体，则可用FGFR抑制剂治疗该患者，其中FGFR抑制剂是BAY1179470(Bayer)，在化学上可能的情况下，包括其任何互变异构形式或立体化学异构形式、其N-氧化物、其药学上可接受的盐或其溶剂化物。
在一些实施方案中，如果患者样品中存在一种或多种FGFR突变体，则可用FGFR抑制剂治疗该患者，其中FGFR抑制剂是TAS-120(Taiho)，在化学上可能的情况下，包括其任何互变异构形式或立体化学异构形式、其N-氧化物、其药学上可接受的盐或其溶剂化物。
在一些实施方案中，如果患者样品中存在一种或多种FGFR突变体，则可用FGFR抑制剂治疗该患者，其中FGFR抑制剂是ARQ087(ArQule)，在化学上可能的情况下，包括其任何互变异构形式或立体化学异构形式、其N-氧化物、其药学上可接受的盐或其溶剂化物。
在一些实施方案中，如果患者样品中存在一种或多种FGFR突变体，则可用FGFR抑制剂治疗该患者，其中FGFR抑制剂是ASP5878(Astellas)，在化学上可能的情况下，包括其任何互变异构形式或立体化学异构形式、其N-氧化物、其药学上可接受的盐或其溶剂化物。
在一些实施方案中，如果患者样品中存在一种或多种FGFR突变体，则可用FGFR抑制剂治疗该患者，其中FGFR抑制剂是FF284(Chugai)，在化学上可能的情况下，包括其任何互变异构形式或立体化学异构形式及、N-氧化物、其药学上可接受的盐或其溶剂化物。
在一些实施方案中，如果患者样品中存在一种或多种FGFR突变体，则可用FGFR抑制剂治疗该患者，其中FGFR抑制剂是FP-1039(GSK/FivePrime)，在化学上可能的情况下，包括其任何互变异构形式或立体化学异构形式、其N-氧化物、其药学上可接受的盐或其溶剂化物。
在一些实施方案中，如果患者样品中存在一种或多种FGFR突变体，则可用FGFR抑制剂治疗该患者，其中FGFR抑制剂是Blueprint，在化学上可能的情况下，包括其任何互变异构形式或立体化学异构形式、其N-氧化物、其药学上可接受的盐或其溶剂化物。
在一些实施方案中，如果患者样品中存在一种或多种FGFR突变体，则可用FGFR抑制剂治疗该患者，其中FGFR抑制剂是LY-2874455(Lilly)，在化学上可能的情况下，包括其任何互变异构形式或立体化学异构形式、其N-氧化物、其药学上可接受的盐或其溶剂化物。
在一些实施方案中，如果患者样品中存在一种或多种FGFR突变体，则可用FGFR抑制剂治疗该患者，其中FGFR抑制剂是RG-7444(Roche)，在化学上可能的情况下，包括其任何互变异构形式或立体化学异构形式、其N-氧化物、其药学上可接受的盐或其溶剂化物。
盐可通过常规化学方法由含有碱性或酸性部分的母体化合物合成，诸如通过“Pharmaceutical Salts：Properties，Selection，and Use，P.Heinrich Stahl编辑、Camille G.Wermuth编辑，ISBN：3-90639-026-8，精装版，第388页，2002年8月”中所述的方法合成，该文献以引用并入本文。通常，这些盐可通过以下过程制备：使这些化合物的游离酸或碱形式与合适的碱或酸在水中或在有机溶剂中或者在这两者的混合物中反应，一般使用非水性介质，诸如乙醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈。根据形成盐的酸的pKa，用于所公开方法的FGFR抑制剂可以单盐或二盐形式存在。
酸加成盐可用各种无机酸和有机酸形成。酸加成盐的示例包括由酸形成的盐，所述酸包括但不限于：乙酸、2，2-二氯乙酸、己二酸、藻酸、抗坏血酸(例如，L-抗坏血酸)、L-天冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、4-乙酰胺基苯甲酸、丁酸、(+)樟脑酸、樟脑磺酸、(+)-(1S)-樟脑-10-磺酸、癸酸、己酸、辛酸、肉桂酸、柠檬酸、环拉酸、十二烷基硫酸、乙烷-1，2-二磺酸、乙磺酸、2-羟基乙磺酸、甲酸、富马酸、半乳糖酸、龙胆酸、葡庚糖酸、D-葡萄糖酸、葡糖醛酸(例如，D-葡糖醛酸)、谷氨酸(例如，L-谷氨酸)、α-氧代戊二酸、乙醇酸、马尿酸、氢溴酸、盐酸、氢碘酸、羟乙磺酸、乳酸(例如，(+)-L-乳酸、(±)-DL-乳酸)、乳糖酸、马来酸、苹果酸、(-)-L-苹果酸、丙二酸、(±)-DL-扁桃酸、甲磺酸、萘磺酸(例如，萘-2-磺酸)、萘-1，5-二磺酸、1-羟基-2-萘甲酸、烟酸、硝酸、油酸、乳清酸、草酸、棕榈酸、双羟萘酸、磷酸、丙酸、L-焦谷氨酸、丙酮酸、水杨酸、4-氨基水杨酸、癸二酸、硬脂酸、琥珀酸、硫酸、鞣酸、(+)-L-酒石酸、硫氰酸、甲苯磺酸(例如，对甲苯磺酸)、十一碳烯酸和戊酸，以及乙酰化的氨基酸和阳离子交换树脂。
一组特殊的盐的组成是由乙酸、盐酸、氢碘酸、磷酸、硝酸、硫酸、柠檬酸、乳酸、琥珀酸、马来酸、苹果酸、羟乙磺酸、富马酸、苯磺酸、甲苯磺酸、甲磺酸(甲磺酸酯)、乙磺酸、萘磺酸、戊酸、丙酸、丁酸、丙二酸、葡糖醛酸和乳糖酸形成的盐。另一组酸加成盐包括由乙酸、己二酸、抗坏血酸、天冬氨酸、柠檬酸、DL-乳酸、富马酸、葡萄糖酸、葡糖醛酸、马尿酸、盐酸、谷氨酸、DL-苹果酸、甲磺酸、癸二酸、硬脂酸、琥珀酸和酒石酸形成的盐。
如果化合物为阴离子型的或具有可以为阴离子型的官能团(例如，-COOH可以是-COO-)，则盐可用合适的阳离子形成。合适的无机阳离子的示例包括但不限于碱金属离子诸如Na+和K+、碱土金属阳离子诸如Ca2+和Mg2+，以及其他阳离子诸如Al3+。合适的有机阳离子的示例包括但不限于铵离子(即NH4 +)和取代的铵离子(例如，NH3R+、NH2R2 +、NHR3 +、NR4 +)。
一些合适的取代的铵离子的示例为衍生自以下的那些：乙胺、二乙胺、二环己基胺、三乙胺、丁胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪、苄胺、苯基苄胺、胆碱、葡甲胺、氨基丁三醇，以及氨基酸诸如赖氨酸和精氨酸。常见的季铵离子的示例为N(CH3)4 +。
当化合物含有胺官能团时，它们可形成季铵盐，例如通过根据本领域技术人员所熟知的方法与烷基化剂反应。这种季铵化合物在本发明所公开的化合物的范围内。含有胺官能团的化合物还可形成N-氧化物。在本文中提及的含有胺官能团的化合物还包括N-氧化物。在化合物含有若干胺官能团的情况下，可将一个或不止一个氮原子氧化形成N-氧化物。N-氧化物的具体示例是叔胺的N-氧化物或含氮杂环的氮原子的N-氧化物。N-氧化物可通过用氧化剂诸如过氧化氢或过酸(例如，过氧羧酸)处理对应的胺来形成，参见例如AdvancedOrganic Chemistry，Jerry，第4版，Wiley Interscience，数页。更具体地讲，N-氧化物可通过L.W.Deady的程序制备(Syn.Comm.(1977)，7，509-514)，其中胺化合物与间氯过氧苯甲酸(MCPBA)反应，例如在惰性溶剂诸如二氯甲烷中。
如本文所用，术语“溶剂化物”是指化合物与一种或多种溶剂分子的物理缔合。这种物理缔合涉及不同程度的离子和共价键，包括氢键。在某些情况下，溶剂化物将能够分离，例如当一个或多个溶剂分子被掺入结晶固体的晶格中时。术语“溶剂化物”旨在涵盖溶液相和可分离的溶剂化物两者。合适的溶剂化物的非限制性示例包括本发明所公开的化合物与水、异丙醇、乙醇、甲醇、DMSO、乙酸乙酯、乙酸、乙醇胺等的组合。该化合物在溶液中可发挥其生物学作用。
溶剂化物在制药化学中是熟知的。它们对于制备物质的过程(例如，与其纯化有关)、物质的储存(例如，其稳定性)和易于处理物质可能是重要的，并且通常被形成为隔离的一部分或化学合成的纯化阶段。本领域技术人员可通过标准和长期使用的技术来确定水合物或其他溶剂化物是否通过用于制备给定化合物的分离条件或纯化条件形成。这些技术的示例包括热重分析(TGA)、差示扫描量热法(DSC)、X射线晶体学(例如，单晶X射线晶体学或X射线粉末衍射)和固态核磁共振(SS-NMR，也称为魔角旋转核磁共振或MAS-NMR)。这些技术如NMR、IR、HPLC和MS同样是熟练化学家的标准分析工具包的一部分。或者，本领域技术人员可利用结晶条件故意形成溶剂化物，该结晶条件包括特定溶剂化物所需的溶剂量。此后，可使用上述标准方法确定溶剂化物是否形成。还包括FGFR抑制剂的任何复合物(例如，包合配合物或与化合物诸如环糊精的包合物，或与金属的复合物)。
此外，化合物可具有一种或多种多晶型物(结晶)或无定形形式。
该化合物包括具有一个或多个同位素取代的化合物，并且提及特定元素时包括在其范围内的该元素的所有同位素。例如，提及氢时在其范围内包括1H、2H(D)和3H(T)。相似地，提及碳和氧时，在其范围内分别包括：12C、13C和14C以及16O和18O。同位素可为放射性的或非放射性的。在一个实施方案中，化合物不含放射性同位素。这些化合物优选用于治疗用途。然而，在另一个实施方案中，化合物可含有一种或多种放射性同位素。含有这种放射性同位素的化合物在诊断情况下可能是有用的。
在一些实施方案中，如果患者样品中存在一种或多种FGFR突变体，则使用FGFR抑制剂治疗患者，其中该FGFR抑制剂是N-(3，5-二甲氧基苯基)-N′-(1-甲基乙基)-N-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)喹喔啉-6-基]乙烷-1，2-二胺(在本文中称为“JNJ-42756493”)，或其药学上可接受的盐或其溶剂化物。
治疗患者癌症的方法
本文公开了治疗患者癌症的方法，该方法包括：评估来自患者的生物样品中来自FGFR突变基因组的一种或多种FGFR突变体的存在；以及如果样品中存在一种或多种FGFR突变体，则使用FGFR抑制剂治疗患者。
所公开的方法可用于治疗各种癌症类型，包括但不限于膀胱癌、转移性膀胱癌、卵巢癌、头颈癌、转移性头颈癌、食管癌、转移性食管癌、非小细胞肺腺癌、非小细胞肺鳞状细胞癌、前列腺癌、肺癌、胃癌、尿路上皮癌、小细胞肺癌、乳腺癌、子宫内膜癌、转移性子宫内膜癌、胆管癌、肝细胞癌、成胶质细胞瘤、神经胶质瘤、结肠癌、肉瘤、原发性鳞状实体瘤和多发性骨髓瘤。
在评估步骤中使用的FGFR突变体组在一定程度上基于患者的癌症类型。例如，对于膀胱癌患者，合适的FGFR突变基因组可包括FGFR3:TACC3 v1、FGFR3:TACC3 v3、FGFR3:BAIAP2L1、FGFR2:BICC1、FGFR2:AFF3、FGFR2:CASP7、FGFR3 R248C、FGFR3 S249C、FGFR3G370C或FGFR3 Y373C，或它们的任何组合。因此，在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR3:TACC3 v1，则用FGFR抑制剂治疗膀胱癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR3:TACC3 v3，则用FGFR抑制剂治疗膀胱癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR3:BAIAP2L1，则用FGFR抑制剂治疗膀胱癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR2:BICC1，则用FGFR抑制剂治疗膀胱癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR2:AFF3，则用FGFR抑制剂治疗膀胱癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR2:CASP7，则用FGFR抑制剂治疗膀胱癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR3R248C，则用FGFR抑制剂治疗膀胱癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR3S249C，则用FGFR抑制剂治疗膀胱癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR3G370C，则用FGFR抑制剂治疗膀胱癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR3Y373C，则用FGFR抑制剂治疗膀胱癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在上述FGFR突变体的任何组合，则用FGFR抑制剂治疗膀胱癌患者。
例如，对于转移性膀胱癌患者，合适的FGFR突变基因组可包括FGFR3:TACC3 v1、FGFR3:TACC3 v3、FGFR3:BAIAP2L1、FGFR2:BICC1、FGFR2:AFF3、FGFR2:CASP7、FGFR3 R248C、FGFR3 S249C、FGFR3 G370C或FGFR3 Y373C，或它们的任何组合。因此，在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR3:TACC3 v1，则用FGFR抑制剂治疗转移性膀胱癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR3:TACC3 v3，则用FGFR抑制剂治疗转移性膀胱癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR3:BAIAP2L1，则用FGFR抑制剂治疗转移性膀胱癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR2:BICC1，则用FGFR抑制剂治疗转移性膀胱癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR2:AFF3，则用FGFR抑制剂治疗转移性膀胱癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR2:CASP7，则用FGFR抑制剂治疗转移性膀胱癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR3 R248C，则用FGFR抑制剂治疗转移性膀胱癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR3 S249C，则用FGFR抑制剂治疗转移性膀胱癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR3 G370C，则用FGFR抑制剂治疗转移性膀胱癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR3 Y373C，则用FGFR抑制剂治疗转移性膀胱癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在上述FGFR突变体的任何组合，则用FGFR抑制剂治疗转移性膀胱癌患者。
例如，对于卵巢癌患者，合适的FGFR突变基因组可包括FGFR3:TACC3 v1、FGFR3:TACC3 v3、FGFR3:BAIAP2L1、FGFR2:BICC1、FGFR2:AFF3、FGFR2:CASP7、FGFR3 R248C、FGFR3S249C、FGFR3 G370C或FGFR3 Y373C，或它们的任何组合。因此，在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR3:TACC3 v1，则用FGFR抑制剂治疗卵巢癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR3:TACC3 v3，则用FGFR抑制剂治疗卵巢癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR3:BAIAP2L1，则用FGFR抑制剂治疗卵巢癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR2:BICC1，则用FGFR抑制剂治疗卵巢癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR2:AFF3，则用FGFR抑制剂治疗卵巢癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR2:CASP7，则用FGFR抑制剂治疗卵巢癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR3R248C，则用FGFR抑制剂治疗卵巢癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR3S249C，则用FGFR抑制剂治疗卵巢癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR3G370C，则用FGFR抑制剂治疗卵巢癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR3Y373C，则用FGFR抑制剂治疗卵巢癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在上述FGFR突变体的任何组合，则用FGFR抑制剂治疗卵巢癌患者。
例如，对于头颈癌患者，合适的FGFR突变基因组可包括FGFR3:BAIAP2L1、FGFR2:CASP7、FGFR3 R248C、FGFR3 S249C、FGFR3 G370C或FGFR3 Y373C，或它们的任何组合。因此，在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR3:BAIAP2L1，则用FGFR抑制剂治疗头颈癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR2:CASP7，则用FGFR抑制剂治疗头颈癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR3 R248C，则用FGFR抑制剂治疗头颈癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR3 S249C，则用FGFR抑制剂治疗头颈癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR3 G370C，则用FGFR抑制剂治疗头颈癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR3 Y373C，则用FGFR抑制剂治疗头颈癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在上述FGFR突变体的任何组合，则用FGFR抑制剂治疗头颈癌患者。
例如，对于转移性头颈癌患者，合适的FGFR突变基因组可包括FGFR3:BAIAP2L1、FGFR2:CASP7或FGFR2:OFD1，或它们的任何组合。因此，在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR3:BAIAP2L1，则用FGFR抑制剂治疗转移性头颈癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR2:CASP7，则用FGFR抑制剂治疗转移性头颈癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR2:OFD1，则用FGFR抑制剂治疗转移性头颈癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在上述FGFR突变体的任何组合，则用FGFR抑制剂治疗转移性头颈癌患者。
例如，对于食管癌患者，合适的FGFR突变基因组可包括FGFR3:TACC3 v1、FGFR3:TACC3 v3、FGFR2:BICC1、FGFR2:CASP7、FGFR3 R248C、FGFR3 S249C、FGFR3 G370C或FGFR3Y373C，或它们的任何组合。因此，在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR3:TACC3 v1，则用FGFR抑制剂治疗食管癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR3:TACC3 v3，则用FGFR抑制剂治疗食管癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR2:BICC1，则用FGFR抑制剂治疗食管癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR2:CASP7，则用FGFR抑制剂治疗食管癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR3 R248C，则用FGFR抑制剂治疗食管癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR3 S249C，则用FGFR抑制剂治疗食管癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR3 G370C，则用FGFR抑制剂治疗食管癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR3 Y373C，则用FGFR抑制剂治疗食管癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在上述FGFR突变体的任何组合，则用FGFR抑制剂治疗食管癌患者。
例如，对于转移性食管癌患者，合适的FGFR突变基因组可包括FGFR3:TACC3 v1、FGFR3:TACC3 v3、FGFR3:TACC3内含子、FGFR3:BAIAP2L1、FGFR2:BICC1、FGFR2:AFF3、FGFR2:CASP7、FGFR2:CCD6或FGFR2:OFD1，或它们的任何组合。因此，在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR3:TACC3 v1，则用FGFR抑制剂治疗转移性食管癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR3:TACC3 v3，则用FGFR抑制剂治疗转移性食管癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR3:TACC3内含子，则用FGFR抑制剂治疗转移性食管癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR3:BAIAP2L1，则用FGFR抑制剂治疗转移性食管癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR2:BICC1，则用FGFR抑制剂治疗转移性食管癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR2:AFF3，则用FGFR抑制剂治疗转移性食管癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR2:CASP7，则用FGFR抑制剂治疗转移性食管癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR2:CCD6，则用FGFR抑制剂治疗转移性食管癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR2:OFD1，则用FGFR抑制剂治疗转移性食管癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在上述FGFR突变体的任何组合，则用FGFR抑制剂治疗转移性食管癌患者。
例如，对于非小细胞肺(NSCL)腺癌患者，合适的FGFR突变基因组可包括FGFR3:TACC3 v1、FGFR3:TACC3 v3、FGFR3:TACC3内含子、FGFR3:BAIAP2L1、FGFR2:AFF3、FGFR2:CASP7、FGFR3 R248C、FGFR3 S249C、FGFR3 G370C或FGFR3 Y373C，或它们的任何组合。因此，在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR3:TACC3 v1，则用FGFR抑制剂治疗NSCL腺癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR3:TACC3 v3，则用FGFR抑制剂治疗NSCL腺癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR3:TACC3内含子，则用FGFR抑制剂治疗NSCL腺癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR3:BAIAP2L1，则用FGFR抑制剂治疗NSCL腺癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR2:AFF3，则用FGFR抑制剂治疗NSCL腺癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR2:CASP7，则用FGFR抑制剂治疗NSCL腺癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR3 R248C，则用FGFR抑制剂治疗NSCL腺癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR3 S249C，则用FGFR抑制剂治疗NSCL腺癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR3 G370C，则用FGFR抑制剂治疗NSCL腺癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR3 Y373C，则用FGFR抑制剂治疗NSCL腺癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在上述FGFR突变体的任何组合，则用FGFR抑制剂治疗NSCL腺癌患者。
例如，对于非小细胞肺(NSCL)鳞状细胞癌患者，合适的FGFR突变基因组可包括FGFR3:TACC3 v1、FGFR3:TACC3 v3、FGFR3:BAIAP2L1、FGFR2:BICC1、FGFR2:AFF3、FGFR2:CASP7、FGFR2:CCDC6、FGFR3 R248C、FGFR3 S249C、FGFR3 G370C或FGFR3 Y373C，或它们的任何组合。因此，在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR3:TACC3 v1，则用FGFR抑制剂治疗NSCL鳞状细胞癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR3:TACC3 v3，则用FGFR抑制剂治疗NSCL鳞状细胞癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR3:BAIAP2L1，则用FGFR抑制剂治疗NSCL鳞状细胞癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR2:BICC1，则用FGFR抑制剂治疗NSCL鳞状细胞癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR2:AFF3，则用FGFR抑制剂治疗NSCL鳞状细胞癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR2:CASP7，则用FGFR抑制剂治疗NSCL鳞状细胞癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR2:CCDC6，则用FGFR抑制剂治疗NSCL鳞状细胞癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR3 R248C，则用FGFR抑制剂治疗NSCL鳞状细胞癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR3 S249C，则用FGFR抑制剂治疗NSCL鳞状细胞癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR3 G370C，则用FGFR抑制剂治疗NSCL鳞状细胞癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR3 Y373C，则用FGFR抑制剂治疗NSCL鳞状细胞癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在上述FGFR突变体的任何组合，则用FGFR抑制剂治疗NSCL鳞状细胞癌患者。
例如，对于转移性子宫内膜癌患者，合适的FGFR突变基因组可包括FGFR3:TACC3v1、FGFR3:TACC3 v3、FGFR3:TACC3内含子、FGFR3:BAIAP2L1、FGFR2:CASP7、FGFR2:CCDC6或FGFR2:OFD1，或它们的任何组合。因此，在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR3:TACC3v1，则用FGFR抑制剂治疗转移性子宫内膜癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR3:TACC3 v3，则用FGFR抑制剂治疗转移性子宫内膜癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR3:TACC3内含子，则用FGFR抑制剂治疗转移性子宫内膜癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR3:BAIAP2L1，则用FGFR抑制剂治疗转移性子宫内膜癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR2:CASP7，则用FGFR抑制剂治疗转移性子宫内膜癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR2:CCDC6，则用FGFR抑制剂治疗转移性子宫内膜癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR2:OFD1，则用FGFR抑制剂治疗转移性子宫内膜癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在上述FGFR突变体的任何组合，则用FGFR抑制剂治疗转移性子宫内膜癌患者。
例如，对于乳腺癌患者，合适的FGFR突变基因组可包括FGFR3:TACC3 v1、FGFR3:TACC3 v3、FGFR3:TACC3内含子、FGFR3:BAIAP2L1、FGFR2:BICC1、FGFR2:AFF3、FGFR2:CASP7、FGFR2:CCD6或FGFR2:OFD1，或它们的任何组合。因此，在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR3:TACC3 v1，则用FGFR抑制剂治疗乳腺癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR3:TACC3 v3，则用FGFR抑制剂治疗乳腺癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR3:TACC3内含子，则用FGFR抑制剂治疗乳腺癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR3:BAIAP2L1，则用FGFR抑制剂治疗乳腺癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR2:BICC1，则用FGFR抑制剂治疗乳腺癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR2:AFF3，则用FGFR抑制剂治疗乳腺癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR2:CASP7，则用FGFR抑制剂治疗乳腺癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR2:CCD6，则用FGFR抑制剂治疗乳腺癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR2:OFD1，则用FGFR抑制剂治疗乳腺癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在上述FGFR突变体的任何组合，则用FGFR抑制剂治疗乳腺癌患者。
例如，对于肝细胞癌患者，合适的FGFR突变基因组可包括FGFR3:TACC3 v1、FGFR3:TACC3 v3、FGFR3:TACC3内含子、FGFR3:BAIAP2L1、FGFR2:BICC1、FGFR2:AFF3、FGFR2:CASP7、FGFR2:CCDC6、FGFR2:OFD1、FGFR3 R248C、FGFR3 S249C、FGFR3 G370C或FGFR3 Y373C，或它们的任何组合。因此，在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR3:TACC3 v1，则用FGFR抑制剂治疗肝细胞癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR3:TACC3 v3，则用FGFR抑制剂治疗肝细胞癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR3:TACC3内含子，则用FGFR抑制剂治疗肝细胞癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR3:BAIAP2L1，则用FGFR抑制剂治疗肝细胞癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR2:BICC1，则用FGFR抑制剂治疗肝细胞癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR2:AFF3，则用FGFR抑制剂治疗肝细胞癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR2:CASP7，则用FGFR抑制剂治疗肝细胞癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR2:CCDC6，则用FGFR抑制剂治疗肝细胞癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR2:OFD1，则用FGFR抑制剂治疗肝细胞癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR3 R248C，则用FGFR抑制剂治疗肝细胞癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR3 S249C，则用FGFR抑制剂治疗肝细胞癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR3 G370C，则用FGFR抑制剂治疗肝细胞癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR3 Y373C，则用FGFR抑制剂治疗肝细胞癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在上述FGFR突变体的任何组合，则用FGFR抑制剂治疗肝细胞癌患者。
在一些实施方案中，评估步骤包括：从生物样品中分离RNA；从分离的RNA合成cDNA；预扩增cDNA；以及用引物对扩增所述预扩增的cDNA，所述引物对与来自FGFR突变基因组的一种或多种FGFR突变体结合并对其进行扩增。
可通过本领域技术人员已知的多个程序来从生物样品分离RNA。在一个实施方案中，可使用来自Qiagen的AllPrep DNA/RNA FFPE试剂盒(产品号80234)从生物样品中分离RNA。
从分离的RNA合成cDNA可通过本领域技术人员已知的多个程序进行。在一个实施方案中，可使用具有来自ABI的RNase抑制剂的高容量cDNA逆转录酶试剂盒(产品号4374966)从分离的RNA合成cDNA。
cDNA的预扩增可通过本领域技术人员已知的多个程序进行。扩增程序在本领域中是熟知的。在一个实施方案中，可使用预扩增主混合物(Life Technologies/Applied产品号4391128)预扩增cDNA。
在一些实施方案中，扩增步骤可包括进行实时PCR(qRT-PCR)。在本文的实施例部分中讨论了示例性qRT-PCR程序。在一些方面，qRT-PCR可以是Real-Time PCR测定。qRT-PCR程序可涉及使用探针来增加测定的特异性。用于qRT-PCR测定的合适的探针包括本文所公开的任何探针，例如在表15中公开的探针。在一些实施方案中，例如实时PCR可用一种或多种探针进行，所述探针包括：SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54和/或SEQ ID NO：55。在其他实施方案中，实时PCR可用一种或多种探针进行，所述探针基本上由下列项组成：SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ IDNO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54和/或SEQ ID NO：55。在其他实施方案中，实时PCR可用一种或多种探针进行，所述探针由下列项组成：SEQ ID NO：43、SEQID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54和/或SEQ ID NO：55。在其他实施方案中，实时PCR可用一种或多种探针进行，所述探针具有：SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54和/或SEQID NO：55。
qRT-PCR可用一种或多种3′阻断寡核苷酸进行。在本文的实施例部分中公开了使用3′阻断寡核苷酸的示例性qRT-PCR程序。合适的3′阻断寡核苷酸包括例如在表8中公开的寡核苷酸。在一些实施方案中，qRT-PCR可用一种或多种3′阻断寡核苷酸进行，所述3’阻断寡核苷酸包括SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41和/或SEQ ID NO：42。在一些实施方案中，qRT-PCR可用一种或多种3′阻断寡核苷酸进行，所3’述阻断寡核苷酸基本上由SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41和/或SEQ ID NO：42组成。在一些实施方案中，qRT-PCR可用一种或多种3′阻断寡核苷酸进行，所述3’阻断寡核苷酸由SEQ ID NO：39、SEQID NO：40、SEQ ID NO：41和/或SEQ ID NO：42组成。在一些实施方案中，qRT-PCR可用一种或多种3′阻断寡核苷酸进行，所述3’阻断寡核苷酸具有SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ IDNO：41和/或SEQ ID NO：42。
用于扩增步骤的合适的引物对包括在表3中公开的那些引物对。例如，在一些实施方案中，FGFR突变体和引物对可以是FGFR3:TACC3 v1和具有SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6的氨基酸序列的引物。在一些实施方案中，FGFR突变体和引物对可以是FGFR3:TACC3 v3和具有SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8的氨基酸序列的引物。在一些实施方案中，FGFR突变体和引物对可以是FGFR3:TACC3内含子和具有SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10的氨基酸序列的引物。在一些实施方案中，FGFR突变体和引物对可以是FGFR3:BAIAP2L1和具有SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12的氨基酸序列的引物。在一些实施方案中，FGFR突变体和引物对可以是FGFR2：BICC1和具有SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14的氨基酸序列的引物。在一些实施方案中，FGFR突变体和引物对可以是FGFR2:AFF3和具有SEQ ID NO:15和SEQ ID NO：16的氨基酸序列的引物。在一些实施方案中，FGFR突变体和引物对可以是FGFR2:CASP7和具有SEQ IDNO：17和SEQ ID NO：18的氨基酸序列的引物。在一些实施方案中，FGFR突变体和引物对可以是FGFR2:CCDC6和具有SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20的氨基酸序列的引物。在一些实施方案中，FGFR突变体和引物对可以是FGFR2:OFD1和具有SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22的氨基酸序列的引物。在一些实施方案中，FGFR突变体和引物对可以是R248C和具有SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24，或SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32的氨基酸序列的引物。在一些实施方案中，FGFR突变体和引物对可以是S249C和具有SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26，或SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34的氨基酸序列的引物。在一些实施方案中，FGFR突变体和引物对可以是G370C和具有SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28，或SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36的氨基酸序列的引物。在一些实施方案中，FGFR突变体和引物对可以是Y373C和具有SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30，或SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38的氨基酸序列的引物。在一些实施方案中，FGFR突变体和引物对可以是上文所公开的FGFR突变体和对应的引物对的任何组合。
在一些实施方案中，扩增步骤可利用以下方式进行：
a.引物对具有SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6的序列，并且探针具有SEQ ID NO：43的序列；
b.引物对具有SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8的序列，并且探针具有SEQ ID NO：44的序列；
c.引物对具有SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10的序列，并且探针具有SEQ ID NO：46的序列；
d.引物对具有SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12的序列，并且探针具有SEQ ID NO：47的序列；
e.引物对具有SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14的序列，并且探针具有SEQ ID NO：45的序列；
f.引物对具有SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16的序列，并且探针具有SEQ ID NO：48的序列；
g.引物对具有SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18的序列，并且探针具有SEQ ID NO：49的序列；
h.引物对具有SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20的序列，并且探针具有SEQ ID NO：50的序列；
i.引物对具有SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22的序列，并且探针具有SEQ ID NO：51的序列：
j.引物对具有SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24的序列，并且探针具有SEQ ID NO：52的序列；
k.引物对具有SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26的序列，并且探针具有SEQ ID NO：53的序列；
l.引物对具有SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28的序列，并且探针具有SEQ ID NO：54的序列；
m.引物对具有SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30的序列，并且探针具有SEQ ID NO：55的序列；
n.引物对具有SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32的序列，探针具有SEQ ID NO：52的序列，并且3′阻断寡核苷酸具有SEQ ID NO：39的序列；
o.引物对具有SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34的序列，探针具有SEQ ID NO：53的序列，并且3′阻断寡核苷酸具有SEQ ID NO：40的序列；
p.引物对具有SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36的序列，探针具有SEQ ID NO：54的序列，并且3′阻断寡核苷酸具有SEQ ID NO：41的序列；
q.引物对具有SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38的序列，探针具有SEQ ID NO：55的序列，并且3′阻断寡核苷酸具有SEQ ID NO：42的序列；或者
r.它们的任何组合。
所公开的方法包括在样品中存在一种或多种FGFR突变体时治疗患者。样品中存在一种或多种FGFR突变体可通过例如对所扩增的cDNA测序来确定。
用于治疗方法的合适FGFR抑制剂包括本文先前所述的那些。
本文还公开了用于治疗患者癌症的FGFR抑制剂，其中通过评估从患者获得的生物样品中来自FGFR突变基因组的一种或多种FGFR突变体的存在，鉴定患者对用FGFR抑制剂进行治疗有反应，其中检测到样品中存在一种或多种FGFR突变体。
本文还公开了用于治疗患者癌症的FGFR抑制剂，其中通过评估从患者获得的生物样品中来自FGFR突变基因组的一种或多种FGFR突变体的存在，鉴定患者对用FGFR抑制剂进行治疗有反应，其中所述一种或多种FGFR突变体是FGFR融合基因或FGFR SNP，其中检测到样品中存在一种或多种FGFR突变体，并且其中所述评估包括用与来自FGFR突变基因组的一种或多种FGFR突变体结合并对其进行扩增的引物对扩增cDNA。
本文还公开了用于治疗患者癌症的FGFR抑制剂，其中通过评估从患者获得的生物样品中来自FGFR突变基因组的一种或多种FGFR突变体的存在，鉴定患者对用FGFR抑制剂进行治疗有反应，其中FGFR突变体是FGFR融合基因或FGFR SNP，其中检测到样品中存在一种或多种FGFR突变体，并且其中所述评估包括用与来自FGFR突变基因组的一种或多种FGFR突变体结合并对其进行扩增的引物对扩增预扩增的cDNA。
鉴定将对用成纤维细胞生长因子受体(FGFR)抑制剂进行治疗有反应的癌症患者 的方法
本文公开了鉴定将对用成纤维细胞生长因子受体(FGFR)抑制剂进行治疗有反应的癌症患者的方法，所述方法包括：评估来自患者的生物样品中来自FGFR突变基因组的FGFR突变体，其中该FGFR突变体是FGFR融合基因或FGFR单核苷酸多态性，并且其中所述评估包括用与来自FGFR突变基因组的一种或多种FGFR突变体结合并对其进行扩增的引物对扩增cDNA，以及确定样品中是否存在来自基因组的一种或多种FGFR突变体，其中存在一种或多种FGFR突变体表示患者将对用FGFR抑制剂进行治疗有反应。
本文还提供了鉴定对用成纤维细胞生长因子受体(FGFR)抑制剂进行治疗有反应的癌症患者的方法，所述方法包括：评估来自患者的生物样品中来自FGFR突变基因组的FGFR突变体，其中该FGFR突变体是FGFR融合基因或FGFR单核苷酸多态性，并且其中所述评估包括用与来自FGFR突变基因组的一种或多种FGFR突变体结合并对其进行扩增的引物对扩增cDNA，并确定样品中是否存在来自基因组的一种或多种FGFR突变体，其中存在一种或多种FGFR突变体表示患者对用FGFR抑制剂进行治疗有反应。
还提供了鉴定对用成纤维细胞生长因子受体(FGFR)抑制剂进行治疗有反应的癌症患者的方法，所述方法包括：评估来自患者的生物样品中来自FGFR突变基因组的一种或多种FGFR突变体的存在，其中所述FGFR突变体是FGFR融合基因或FGFR单核苷酸多态性，其中存在一种或多种FGFR突变体表示患者对用FGFR抑制剂进行治疗有反应。
在一些实施方案中，评估可包括用与来自FGFR突变基因组的一种或多种FGFR突变体结合并对其进行扩增的引物对扩增cDNA。在一些实施方案中，cDNA可以是预扩增的cDNA。
在一些实施方案中，评估步骤包括：从生物样品中分离RNA并由分离的RNA合成cDNA。在一些方面，可对预扩增的cDNA进行评估步骤。因此，评估步骤还可包括在所述扩增步骤之前预扩增cDNA。可通过本领域技术人员已知的多个程序来从生物样品分离RNA。在一个实施方案中，可使用来自Qiagen的AllPrep DNA/RNA FFPE试剂盒(例如，产品号80234)从生物样品中分离RNA。从分离的RNA合成cDNA可通过本领域技术人员已知的多个程序进行。在一个实施方案中，可使用具有来自ABI的RNase抑制剂的高容量cDNA逆转录酶试剂盒(例如，产品号4374966)从分离的RNA合成cDNA。cDNA的预扩增可通过本领域技术人员已知的多个程序进行。扩增程序在本领域中是熟知的。在一个实施方案中，可使用预扩增主混合物(Life Technologies/Applied 产品号4391128)预扩增cDNA。
所公开的方法可用于鉴定将对用成纤维细胞生长因子受体(FGFR)抑制剂进行治疗有反应的多种不同类型癌症的患者，所述多种不同类型癌症包括但不限于膀胱癌、转移性膀胱癌、卵巢癌、头颈癌、食管癌、非小细胞肺腺癌、非小细胞肺鳞状细胞癌、前列腺癌、肺癌、胃癌、尿路上皮癌、小细胞肺癌、乳腺癌、子宫内膜癌、胆管癌、肝细胞癌、成胶质细胞瘤、神经胶质瘤、结肠癌、肉瘤、原发性鳞状实体瘤和多发性骨髓瘤。
在评估步骤中使用的FGFR突变体组在一定程度上基于患者的癌症类型。例如，对于膀胱癌患者，合适的FGFR突变基因组可包括FGFR3:TACC3 v1、FGFR3:TACC3 v3、FGFR3:BAIAP2L1、FGFR2:BICC1、FGFR2:AFF3、FGFR2:CASP7、FGFR3 R248C、FGFR3 S249C、FGFR3G370C或FGFR3 Y373C，或它们的任何组合。因此，在一些实施方案中，评估步骤包括确定来自膀胱癌患者的生物样品中是否存在FGFR3:TACC3 v1。在一些实施方案中，评估步骤包括确定来自膀胱癌患者的生物样品中是否存在FGFR3:TACC3 v3。在一些实施方案中，评估步骤包括确定来自膀胱癌患者的生物样品中是否存在FGFR3:BAIAP2L1。在一些实施方案中，评估步骤包括确定来自膀胱癌患者的生物样品中是否存在FGFR2:BICC1。在一些实施方案中，评估步骤包括确定来自膀胱癌患者的生物样品中是否存在FGFR2:AFF3。在一些实施方案中，评估步骤包括确定来自膀胱癌患者的生物样品中是否存在FGFR2:CASP7。在一些实施方案中，评估步骤包括确定来自膀胱癌患者的生物样品中是否存在FGFR3 R248C。在一些实施方案中，评估步骤包括确定来自膀胱癌患者的生物样品中是否存在FGFR3 S249C。在一些实施方案中，评估步骤包括确定来自膀胱癌患者的生物样品中是否存在FGFR3 G370C。在一些实施方案中，评估步骤包括确定来自膀胱癌患者的生物样品中是否存在FGFR3 Y373C。在一些实施方案中，评估步骤包括确定来自膀胱癌患者的生物样品中是否存在上述FGFR突变体的任何组合。
例如，对于转移性膀胱癌患者，合适的FGFR突变基因组可包括FGFR3:TACC3 v1、FGFR3:TACC3 v3、FGFR3:BAIAP2L1、FGFR2:BICC1、FGFR2:AFF3、FGFR2:CASP7、FGFR3 R248C、FGFR3 S249C、FGFR3 G370C或FGFR3 Y373C，或它们的任何组合。因此，在一些实施方案中，评估步骤包括确定来自转移性膀胱癌患者的生物样品中是否存在FGFR3:TACC3 v1。在一些实施方案中，评估步骤包括确定来自转移性膀胱癌患者的生物样品中是否存在FGFR3:TACC3 v3。在一些实施方案中，评估步骤包括确定来自转移性膀胱癌患者的生物样品中是否存在FGFR3:BAIAP2L1。在一些实施方案中，评估步骤包括确定来自转移性膀胱癌患者的生物样品中是否存在FGFR2:BICC1。在一些实施方案中，评估步骤包括确定来自转移性膀胱癌患者的生物样品中是否存在FGFR2:AFF3。在一些实施方案中，评估步骤包括确定来自转移性膀胱癌患者的生物样品中是否存在FGFR2:CASP7。在一些实施方案中，评估步骤包括确定来自转移性膀胱癌患者的生物样品中是否存在FGFR3 R248C。在一些实施方案中，评估步骤包括确定来自转移性膀胱癌患者的生物样品中是否存在FGFR3 S249C。在一些实施方案中，评估步骤包括确定来自转移性膀胱癌患者的生物样品中是否存在FGFR3 G370C。在一些实施方案中，评估步骤包括确定来自转移性膀胱癌患者的生物样品中是否存在FGFR3Y373C。在一些实施方案中，评估步骤包括确定来自转移性膀胱癌患者的生物样品中是否存在上述FGFR突变体的任何组合。
例如，对于卵巢癌患者，合适的FGFR突变基因组可包括FGFR3:TACC3 v1、FGFR3:TACC3 v3、FGFR3:BAIAP2L1、FGFR2:BICC1、FGFR2:AFF3、FGFR2:CASP7、FGFR3 R248C、FGFR3S249C、FGFR3 G370C或FGFR3 Y373C，或它们的任何组合。因此，在一些实施方案中，评估步骤包括确定来自卵巢癌患者的生物样品中是否存在FGFR3:TACC3 v1。在一些实施方案中，评估步骤包括确定来自卵巢癌患者的生物样品中是否存在FGFR3:TACC3 v3。在一些实施方案中，评估步骤包括确定来自卵巢癌患者的生物样品中是否存在FGFR3:BAIAP2L1。在一些实施方案中，评估步骤包括确定来自卵巢癌患者的生物样品中是否存在FGFR2:BICC1。在一些实施方案中，评估步骤包括确定来自卵巢癌患者的生物样品中是否存在FGFR2:AFF3。在一些实施方案中，评估步骤包括确定来自卵巢癌患者的生物样品中是否存在FGFR2:CASP7。在一些实施方案中，评估步骤包括确定来自卵巢癌患者的生物样品中是否存在FGFR3R248C。在一些实施方案中，评估步骤包括确定来自卵巢癌患者的生物样品中是否存在FGFR3 S249C。在一些实施方案中，评估步骤包括确定来自卵巢癌患者的生物样品中是否存在FGFR3 G370C。在一些实施方案中，评估步骤包括确定来自卵巢癌患者的生物样品中是否存在FGFR3 Y373C。在一些实施方案中，评估步骤包括确定来自卵巢癌患者的生物样品中是否存在上述FGFR突变体的任何组合。
例如，对于头颈癌患者，合适的FGFR突变基因组可包括FGFR3:BAIAP2L1、FGFR2:CASP7、FGFR3 R248C、FGFR3 S249C、FGFR3 G370C或FGFR3 Y373C，或它们的任何组合。因此，在一些实施方案中，评估步骤包括确定来自头颈癌患者的生物样品中是否存在FGFR3:BAIAP2L1。在一些实施方案中，评估步骤包括确定来自头颈癌患者的生物样品中是否存在FGFR2:CASP7。在一些实施方案中，评估步骤包括确定来自头颈癌患者的生物样品中是否存在FGFR3 R248C。在一些实施方案中，评估步骤包括确定来自头颈癌患者的生物样品中是否存在FGFR3 S249C。在一些实施方案中，评估步骤包括确定来自头颈癌患者的生物样品中是否存在FGFR3 G370C。在一些实施方案中，评估步骤包括确定来自头颈癌患者的生物样品中是否存在FGFR3 Y373C。在一些实施方案中，评估步骤包括确定来自头颈癌患者的生物样品中是否存在上述FGFR突变体的任何组合。
例如，对于转移性头颈癌患者，合适的FGFR突变基因组可包括FGFR3:BAIAP2L1、FGFR2:CASP7或FGFR2:OFD1，或它们的任何组合。因此，在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR3:BAIAP2L1，则用FGFR抑制剂治疗转移性头颈癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR2:CASP7，则用FGFR抑制剂治疗转移性头颈癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR2:OFD1，则用FGFR抑制剂治疗转移性头颈癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在上述FGFR突变体的任何组合，则用FGFR抑制剂治疗转移性头颈癌患者。
例如，对于食管癌患者，合适的FGFR突变基因组可包括FGFR3:TACC3 v1、FGFR3:TACC3 v3、FGFR2:BICC1、FGFR2:CASP7、FGFR3 R248C、FGFR3 S249C、FGFR3 G370C或FGFR3Y373C，或它们的任何组合。因此，在一些实施方案中，评估步骤包括确定来自食管癌患者的生物样品中是否存在FGFR3:TACC3 v1。在一些实施方案中，评估步骤包括确定来自食管癌患者的生物样品中是否存在FGFR3:TACC3 v3。在一些实施方案中，评估步骤包括确定来自食管癌患者的生物样品中是否存在FGFR2:BICC1。在一些实施方案中，评估步骤包括确定来自食管癌患者的生物样品中是否存在FGFR2:CASP7。在一些实施方案中，评估步骤包括确定来自食管癌患者的生物样品中是否存在FGFR3 R248C。在一些实施方案中，评估步骤包括确定来自食管癌患者的生物样品中是否存在FGFR3 S249C。在一些实施方案中，评估步骤包括确定来自食管癌患者的生物样品中是否存在FGFR3 G370C。在一些实施方案中，评估步骤包括确定来自食管癌患者的生物样品中是否存在FGFR3 Y373C。在一些实施方案中，评估步骤包括确定来自食管癌患者的生物样品中是否存在上述FGFR突变体的任何组合。
例如，对于转移性食管癌患者，合适的FGFR突变基因组可包括FGFR3:TACC3 v1、FGFR3:TACC3 v3、FGFR3:TACC3内含子、FGFR3:BAIAP2L1、FGFR2:BICC1、FGFR2:AFF3、FGFR2:CASP7、FGFR2:CCD6或FGFR2:OFD1，或它们的任何组合。因此，在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR3:TACC3 v1，则用FGFR抑制剂治疗转移性食管癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR3:TACC3 v3，则用FGFR抑制剂治疗转移性食管癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR3:TACC3内含子，则用FGFR抑制剂治疗转移性食管癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR3:BAIAP2L1，则用FGFR抑制剂治疗转移性食管癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR2:BICC1，则用FGFR抑制剂治疗转移性食管癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR2:AFF3，则用FGFR抑制剂治疗转移性食管癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR2:CASP7，则用FGFR抑制剂治疗转移性食管癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR2:CCD6，则用FGFR抑制剂治疗转移性食管癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR2:OFD1，则用FGFR抑制剂治疗转移性食管癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在上述FGFR突变体的任何组合，则用FGFR抑制剂治疗转移性食管癌患者。
对于非小细胞肺(NSCL)腺癌患者，例如，合适的FGFR突变基因组可包括FGFR3:TACC3 v1、FGFR3:TACC3 v3、FGFR3:TACC3内含子、FGFR3:BAIAP2L1、FGFR2:AFF3、FGFR2:CASP7、FGFR3 R248C、FGFR3 S249C、FGFR3 G370C或FGFR3 Y373C，或它们的任何组合。因此，在一些实施方案中，评估步骤包括确定来自NSCL腺癌患者的生物样品中是否存在FGFR3:TACC3 v1。在一些实施方案中，评估步骤包括确定来自NSCL腺癌患者的生物样品中是否存在FGFR3:TACC3 v3。在一些实施方案中，评估步骤包括确定来自NSCL腺癌患者的生物样品中是否存在FGFR3:TACC3内含子。在一些实施方案中，评估步骤包括确定来自NSCL腺癌患者的生物样品中是否存在FGFR3:BAIAP2L1。在一些实施方案中，评估步骤包括确定来自NSCL腺癌患者的生物样品中是否存在FGFR2:AFF3。在一些实施方案中，评估步骤包括确定来自NSCL腺癌患者的生物样品中是否存在FGFR2:CASP7。在一些实施方案中，评估步骤包括确定来自NSCL腺癌患者的生物样品中是否存在FGFR3 R248C。在一些实施方案中，评估步骤包括确定来自NSCL腺癌患者的生物样品中是否存在FGFR3 S249C。在一些实施方案中，评估步骤包括确定来自NSCL腺癌患者的生物样品中是否存在FGFR3 G370C。在一些实施方案中，评估步骤包括确定来自NSCL腺癌患者的生物样品中是否存在FGFR3 Y373C。在一些实施方案中，评估步骤包括确定来自NSCL腺癌患者的生物样品中是否存在上述FGFR突变体的任何组合。
例如，对于非小细胞肺(NSCL)鳞状细胞癌患者，合适的FGFR突变基因组可包括FGFR3:TACC3 v1、FGFR3:TACC3 v3、FGFR3:BAIAP2L1、FGFR2:BICC1、FGFR2:AFF3、FGFR2:CASP7、FGFR2:CCDC6、FGFR3 R248C、FGFR3 S249C、FGFR3 G370C或FGFR3 Y373C，或它们的任何组合。因此，在一些实施方案中，评估步骤包括确定来自NSCL鳞状细胞癌患者的生物样品中是否存在FGFR3:TACC3 v1。在一些实施方案中，评估步骤包括确定来自NSCL鳞状细胞癌患者的生物样品中是否存在FGFR3:TACC3 v3。在一些实施方案中，评估步骤包括确定来自NSCL鳞状细胞癌患者的生物样品中是否存在FGFR3:BAIAP2L1。在一些实施方案中，评估步骤包括确定来自NSCL鳞状细胞癌患者的生物样品中是否存在FGFR2:BICC1。在一些实施方案中，评估步骤包括确定来自NSCL鳞状细胞癌患者的生物样品中是否存在FGFR2:AFF3。在一些实施方案中，评估步骤包括确定来自NSCL鳞状细胞癌患者的生物样品中是否存在FGFR2:CASP7。在一些实施方案中，评估步骤包括确定来自NSCL鳞状细胞癌患者的生物样品中是否存在FGFR2:CCDC6。在一些实施方案中，评估步骤包括确定来自NSCL鳞状细胞癌患者的生物样品中是否存在FGFR3 R248C。在一些实施方案中，评估步骤包括确定来自NSCL鳞状细胞癌患者的生物样品中是否存在FGFR3 S249C。在一些实施方案中，评估步骤包括确定来自NSCL鳞状细胞癌患者的生物样品中是否存在FGFR3 G370C。在一些实施方案中，评估步骤包括确定来自NSCL鳞状细胞癌患者的生物样品中是否存在FGFR3 Y373C。在一些实施方案中，评估步骤包括确定来自NSCL鳞状细胞癌患者的生物样品中是否存在上述FGFR突变体的任何组合。
例如，对于转移性子宫内膜癌患者，合适的FGFR突变基因组可包括FGFR3:TACC3v1、FGFR3:TACC3 v3、FGFR3:TACC3内含子、FGFR3:BAIAP2L1、FGFR2:CASP7、FGFR2:CCDC6或FGFR2:OFD1，或它们的任何组合。因此，在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR3:TACC3v1，则用FGFR抑制剂治疗转移性子宫内膜癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR3:TACC3 v3，则用FGFR抑制剂治疗转移性子宫内膜癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR3:TACC3内含子，则用FGFR抑制剂治疗转移性子宫内膜癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR3:BAIAP2L1，则用FGFR抑制剂治疗转移性子宫内膜癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR2:CASP7，则用FGFR抑制剂治疗转移性子宫内膜癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR2:CCDC6，则用FGFR抑制剂治疗转移性子宫内膜癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR2:OFD1，则用FGFR抑制剂治疗转移性子宫内膜癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在上述FGFR突变体的任何组合，则用FGFR抑制剂治疗转移性子宫内膜癌患者。
例如，对于乳腺癌患者，合适的FGFR突变基因组可包括FGFR3:TACC3 v1、FGFR3:TACC3 v3、FGFR3:TACC3内含子、FGFR3:BAIAP2L1、FGFR2:BICC1、FGFR2:AFF3、FGFR2:CASP7、FGFR2:CCD6或FGFR2:OFD1，或它们的任何组合。因此，在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR3:TACC3 v1，则用FGFR抑制剂治疗乳腺癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR3:TACC3 v3，则用FGFR抑制剂治疗乳腺癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR3:TACC3内含子，则用FGFR抑制剂治疗乳腺癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR3:BAIAP2L1，则用FGFR抑制剂治疗乳腺癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR2:BICC1，则用FGFR抑制剂治疗乳腺癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR2:AFF3，则用FGFR抑制剂治疗乳腺癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR2:CASP7，则用FGFR抑制剂治疗乳腺癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR2:CCD6，则用FGFR抑制剂治疗乳腺癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR2:OFD1，则用FGFR抑制剂治疗乳腺癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在上述FGFR突变体的任何组合，则用FGFR抑制剂治疗乳腺癌患者。
例如，对于肝细胞癌患者，合适的FGFR突变基因组可包括FGFR3:TACC3 v1、FGFR3:TACC3 v3、FGFR3:TACC3内含子、FGFR3:BAIAP2L1、FGFR2:BICC1、FGFR2:AFF3、FGFR2:CASP7、FGFR2:CCDC6、FGFR2:OFD1、FGFR3 R248C、FGFR3 S249C、FGFR3 G370C或FGFR3 Y373C，或它们的任何组合。因此，在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR3:TACC3 v1，则用FGFR抑制剂治疗肝细胞癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR3:TACC3 v3，则用FGFR抑制剂治疗肝细胞癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR3:TACC3内含子，则用FGFR抑制剂治疗肝细胞癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR3:BAIAP2L1，则用FGFR抑制剂治疗肝细胞癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR2:BICC1，则用FGFR抑制剂治疗肝细胞癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR2:AFF3，则用FGFR抑制剂治疗肝细胞癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR2:CASP7，则用FGFR抑制剂治疗肝细胞癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR2:CCDC6，则用FGFR抑制剂治疗肝细胞癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR2:OFD1，则用FGFR抑制剂治疗肝细胞癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR3 R248C，则用FGFR抑制剂治疗肝细胞癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR3 S249C，则用FGFR抑制剂治疗肝细胞癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR3 G370C，则用FGFR抑制剂治疗肝细胞癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在FGFR3 Y373C，则用FGFR抑制剂治疗肝细胞癌患者。在一些实施方案中，如果样品中存在上述FGFR突变体的任何组合，则用FGFR抑制剂治疗肝细胞癌患者。
用于扩增步骤的合适的引物对包括在表3中公开的那些引物对。例如，在一些实施方案中，FGFR突变体和引物对可以是FGFR3:TACC3 v1和具有SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6的氨基酸序列的引物。在一些实施方案中，FGFR突变体和引物对可以是FGFR3:TACC3 v3和具有SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8的氨基酸序列的引物。在一些实施方案中，FGFR突变体和引物对可以是FGFR3:TACC3内含子和具有SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10的氨基酸序列的引物。在一些实施方案中，FGFR突变体和引物对可以是FGFR3:BAIAP2L1和具有SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12的氨基酸序列的引物。在一些实施方案中，FGFR突变体和引物对可以是FGFR2:BICC1和具有SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14的氨基酸序列的引物。在一些实施方案中，FGFR突变体和引物对可以是FGFR2:AFF3和具有SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16的氨基酸序列的引物。在一些实施方案中，FGFR突变体和引物对可以是FGFR2:CASP7和具有SEQ IDNO：17和SEQ ID NO：18的氨基酸序列的引物。在一些实施方案中，FGFR突变体和引物对可以是FGFR2:CCDC6和具有SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20的氨基酸序列的引物。在一些实施方案中，FGFR突变体和引物对可以是FGFR2:OFD1和具有SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22的氨基酸序列的引物。在一些实施方案中，FGFR突变体和引物对可以是R248C和具有SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24，或SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32的氨基酸序列的引物。在一些实施方案中，FGFR突变体和引物对可以是S249C和具有SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26，或SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34的氨基酸序列的引物。在一些实施方案中，FGFR突变体和引物对可以是G370C和具有SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28，或SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36的氨基酸序列的引物。在一些实施方案中，FGFR突变体和引物对可以是Y373C和具有SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30，或SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38的氨基酸序列的引物。在一些实施方案中，FGFR突变体和引物对可以是上文所公开的FGFR突变体和对应的引物对的任何组合。
所公开的方法包括确定样品中是否存在来自基因组的一种或多种FGFR突变体。在一些实施方案中，确定步骤包括测序扩增的cDNA。
在一些实施方案中，如果样品中存在来自基因组的一种或多种FGFR突变体，那么该方法还包括用FGFR抑制剂治疗患者。适用于治疗方法的FGFR抑制剂包括本文先前所述的那些，特别是JNJ-42756493。
用于鉴定FGFR突变基因的存在的试剂盒
本文还公开了用于鉴定生物样品中一种或多种FGFR突变基因的存在的试剂盒，所述试剂盒包括具有以下序列的引物对：SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ IDNO：8、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13和SEQID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30、SEQ IDNO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ IDNO：37、SEQ ID NO：38或它们的任何组合；以及用于进行测定以检测一种或多种FGFR突变基因的说明书。
该试剂盒还可包括一种或多种探针、一种或多种3′阻断寡核苷酸，或两者。在一些实施方案中，试剂盒还可包括一种或多种探针，例如表15中公开的探针中的任何一种或多种。在一些实施方案中，试剂盒还可包括一种或多种3′阻断寡核苷酸，例如表8中公开的3′阻断寡核苷酸中的任何一种或多种。在一些实施方案中，该试剂盒还可包括一种或多种探针和一种或多种3′阻断寡核苷酸。例如，在一些实施方案中，该试剂盒还可包括：
a.引物对具有SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6的序列，并且探针具有SEQ ID NO：43的序列；
b.引物对具有SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8的序列，并且探针具有SEQ ID NO：44的序列；
c.引物对具有SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10的序列，并且探针具有SEQ ID NO：46的序列；
d.引物对具有SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12的序列，并且探针具有SEQ ID NO：47的序列；
e.引物对具有SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14的序列，并且探针具有SEQ ID NO：45的序列；
f.引物对具有SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16的序列，并且探针具有SEQ ID NO：48的序列；
g.引物对具有SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18的序列，并且探针具有SEQ ID NO：49的序列；
h.引物对具有SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20的序列，并且探针具有SEQ ID NO：50的序列；
i.引物对具有SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22的序列，并且探针具有SEQ ID NO：51的序列；
j.引物对具有SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24的序列，并且探针具有SEQ ID NO：52的序列；
k.引物对具有SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26的序列，并且探针具有SEQ ID NO：53的序列；
l.引物对具有SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28的序列，并且探针具有SEQ ID NO：54的序列；
m.引物对具有SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30的序列，并且探针具有SEQ ID NO：55的序列；
n.引物对具有SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32的序列，探针具有SEQ ID NO：52的序列，并且3′阻断寡核苷酸具有SEQ ID NO：39的序列；
o.引物对具有SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34的序列，探针具有SEQ ID NO：53的序列，并且3′阻断寡核苷酸具有SEQ ID NO：40的序列；
p.引物对具有SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36的序列，探针具有SEQ ID NO：54的序列，并且3′阻断寡核苷酸具有SEQ ID NO：41的序列；
q.引物对具有SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38的序列，探针具有SEQ ID NO：55的序列，并且3′阻断寡核苷酸具有SEQ ID NO：42的序列；或者
r.它们的任何组合。
寡核苷酸探针
本文还公开了具有SEQ ID NO：43-55中任一者的序列的寡核苷酸探针。在一些实施方案中，寡核苷酸探针可具有SEQ ID NO：43的序列。在一些实施方案中，寡核苷酸探针可具有SEQ ID NO：44的序列。在一些实施方案中，寡核苷酸探针可具有SEQ ID NO：45的序列。在一些实施方案中，寡核苷酸探针可具有SEQ ID NO：46的序列。在一些实施方案中，寡核苷酸探针可具有SEQ ID NO：47的序列。在一些实施方案中，寡核苷酸探针可具有SEQ ID NO：48的序列。在一些实施方案中，寡核苷酸探针可具有SEQ ID NO：49的序列。在一些实施方案中，寡核苷酸探针可具有SEQ ID NO：50的序列。在一些实施方案中，寡核苷酸探针可具有SEQ ID NO：51的序列。在一些实施方案中，寡核苷酸探针可具有SEQ ID NO：52的序列。在一些实施方案中，寡核苷酸探针可具有SEQ ID NO：53的序列。在一些实施方案中，寡核苷酸探针可具有SEQ ID NO：54的序列。在一些实施方案中，寡核苷酸探针可具有SEQ ID NO：55的序列。
3′阻断寡核苷酸
本文还公开了具有SEQ ID NO：39-42中任一者的序列的寡核苷酸。在一些实施方案中，3′阻断寡核苷酸可具有SEQ ID NO：39的序列。在一些实施方案中，3′阻断寡核苷酸可具有SEQ ID NO：40的序列。在一些实施方案中，3′阻断寡核苷酸可具有SEQ ID NO：41的序列。在一些实施方案中，3′阻断寡核苷酸可具有SEQ ID NO：42的序列。
实施例
实施例1-质粒DNA分离和纯化
以下是用于制备FGFR融合质粒DNA的示例性过程。
所需设备：离心机，能够实现1500×g；微量离心机；移液器，容积式或排气式；涡旋器；nanodtop分光光度计；37℃摇动器/培养箱；以及设定为37℃的烘箱。
所需材料：含有质粒DNA的冷冻甘油细菌贮液；卡那霉素LB琼脂平板(Teknova #L1155)；LB液体培养基(Life Technologies #10855-021)；卡那霉素(Sigma #K0254)；质粒纯化试剂盒(Qiagen# 12123)；纯乙醇(Sigma Aldrich # E7023)；异丙醇(Sigma Aldrich#W292907)；无核酸酶纯水(未经DEPC处理)(来自IDT或Ambion # AM9932)；无RNA酶屏障(过滤器)枪头；无RNA酶微管(1.5至2mL VWR# 10011-724)；血清移液器；以及14ml圆底管(VWR#352057)。
为了从甘油贮液中回收细菌，使用无菌吸移管的顶端将冷冻细菌从甘油贮液管的顶部刮下，划线到LB琼脂平板上，并将其倒置在37℃的烘箱中过夜。
使用Qiagen质粒DNA纯化方案纯化DNA质粒。简而言之，从划线平板中挑取单菌落，并在37℃的振荡器中以约300rpm在含有50μg/ml卡那霉素的5ml-LB培养基的培养物中温育过夜。通过在4℃下以6000×g离心15分钟收集细菌细胞，并将沉淀物重悬于300μl缓冲液P1中。加入300μl缓冲液P2，通过倒置管4-6次混合，并在RT(室温)下温育5分钟。加入300μl冷却缓冲液P3，通过倒置4-6次立即混合，在冰上温育5分钟，并以最大速度离心10分钟。迅速除去含有质粒DNA的上清液。通过施加1ml缓冲液QBT使Qiagen-tip 20平衡，并通过重力流将其排空。将上清液施加到Qiagen-tip 20，并通过重力流加入树脂。Qiagen-tip 20用2×2ml缓冲液QC洗涤，DNA用800μl缓冲液QF洗脱，并在1.5ml Eppendorf管中收集洗脱液。通过加入0.7体积异丙醇、混合并在微量离心机中立即以15000×g离心30分钟来沉淀DNA。倾析上清液，将DNA沉淀物在1ml 70％乙醇中洗涤，并以15000×g离心10分钟。倾析上清液。将沉淀物空气干燥5-10分钟，将DNA重新溶解于100μl或适当体积的无核酸酶纯水中。通过Nanodrop定量质粒DNA并将其储存在-20℃直至进一步使用。
实施例2-生成NRK细胞系
构建表达各FGFR融合体的表达载体。然后将表达载体转染到正常大鼠肾上皮细胞(NRK)细胞中。转染后，在含有卡那霉素的培养基中选择稳定的细胞系。然后使这些细胞生长，分离mRNA并使其进行FGFR融合测定，以证实特异性FGFR融合mRNA的存在。
实施例3-FGFR融合体细胞系维持
以下方案描述了用于培养和维持NRK FGFR融合体过表达细胞系的示例性方法。细胞系包括但不限于：NRK/FGFR3:TACC3v1、NRK/FGFR3:TACC3 v3、NRK/FGFR3:BAIAP2L1、NRK/FGFR2:BICC1、NRK/FGFR2:CASP7、NRK/FGFR2:CCDC6、NRK/FGFR2:AFF3、NRK/FGFR2:OFD1和NRK/EMPTY VECTOR(质粒对照)。
所需设备：生物安全柜，配有真空吸气系统；CO2培养箱，设定为5％CO2与37℃；-80℃冰箱；液氮罐；水浴，设定为37℃；以及显微镜。
所需材料：血清移液器；组织培养瓶(T75 VWR # BD353136和/或T150 VWR#15705-074)；组织培养0.2μm过滤单元(Thermo Scientific #566-0020)；DMEM(达尔贝科改良伊格尔培养基)细胞培养基(Life Technologies，# 11965-084)；胎牛血清(FBS)，经认证且热灭活(Life Technologies，# 10082147)；PenStrep抗生素溶液(Life Technologies #15140-122)；胰蛋白酶-EDTA 0.25％溶液(Life Technologies，# 25200-056)；DPBS(杜氏磷酸盐缓冲溶液，无钙，无镁)(Life Technologies，# 14190136)；用于低温贮藏的细胞冷冻容器；手持移液器；细胞冷冻培养基(Life Technologies，# 12648-010)；15ml锥形管(VWR # 62406-2)；以及冷冻瓶(VWR # 89094-800)。
为了制备细胞培养基，通过组合445ml DMEM、50ml FBS和5ml PenStrep来制备DMEM培养基。将制备的培养基通过0.2μm过滤器单元并在4℃下储存。
为了解冻冷冻细胞，将制备的DMEM培养基在37℃水浴中加热至少15分钟，并将15ml温热培养基置于T75烧瓶中。将细胞从液氮罐中取出并立即置于37℃水浴中直至解冻。用大量70％乙醇喷洒冷冻瓶，并用纸巾擦拭过量乙醇。将全部内容物分装到含有DMEM的T75烧瓶中。将烧瓶轻轻旋转混合并置于培养箱中24小时。如果细胞未准备好分裂，将培养基更换为新鲜制备的DMEM以除去残留的冷冻培养基。如果细胞准备分裂，一旦烧瓶达到80％汇合，每个细胞系就会增殖(每个细胞系的分裂比取决于实验需要)。
为了冷冻细胞系，将细胞从培养瓶中取出，并在室温下以1500RPM在15ml锥形管中离心5分钟。吸出培养基，并加入6ml细胞冷冻培养基。通过上下移液数次将细胞混合，并将1ml细胞溶液等分到5个冷冻瓶中的每一者中。将装有细胞的冷冻瓶置于冷冻容器中，将其储存在-80℃冷冻器中过夜，然后长期储存在液氮罐中。
实施例4-FFPET SNP测定
以下描述用于进行FFPET SNP测定的示例性工作流程和方案。针对FFPET融合测定进行类似的过程，其结果示于图2中。
FFPET的去边界化
将片子进行增加量的二甲苯处理，然后进行乙醇处理以除去石蜡。
FFPET RNA提取
用于从乳腺癌福尔马林固定石蜡包埋组织样品中提取RNA以用于下游基因表达测定的过程描述如下。
所需设备：带板适配器的离心机，能够实现1500×g；微量离心机；移液器，容积式或排气式；涡旋器；NanoDrop 8000；能够在37℃、56℃和80℃下温育的加热块；以及巴斯德吸管(Pipet Trans EX-FT 1.5ml pk 500，VWR# 14670-329)。
所需材料：AllPrep DNA/RNA FFPE试剂盒(Qiagen# 80234)；纯乙醇(SigmaAldrich # E7023)；异丙醇；二甲苯；无核酸酶纯水(未经DEPC处理)(来自IDT或Ambion #AM9932)；无RNA酶屏障(过滤器)枪头；无RNA酶微管(1.5至2mL VWR# 10011-724)；以及Qiagen AllPrep DNA/RNA FFPE试剂盒手册。
使用AllPrep DNA/RNA FFPE试剂盒提取RNA。简而言之，将一个1-10μm的部分置于1.5ml反应管中，并加入800μl HemoDe或二甲苯。将样品涡旋4秒3次，温育2分钟，涡旋4秒3次并温育5分钟。
将样品以最大速度(12,000-14,000×g)离心2分钟，并通过抽吸弃去上清液。立即盖上管子以避免组织干燥。
重复上述步骤。
将800μl纯乙醇加入试管，轻弹试管以取出沉淀物，涡旋4秒3次，以最大速度(12,000-14,000×g)离心2分钟，并通过抽吸弃去上清液。
将800μl 70％乙醇加入试管，轻弹试管以取出沉淀物，涡旋4秒3次，以最大速度离心2分钟，并通过抽吸弃去上清液。除去70％乙醇之后，将管再旋转10-20秒，并用精细的吸移管小心地除去残留的流体。
将打开的管在加热块中在37℃下温育5-15分钟，以空气干燥组织沉淀物。
通过加入150μl缓冲液PKD将沉淀物重新悬浮，并轻弹试管以使沉淀物松散。加入10μl蛋白酶K，并通过涡旋混合管。
将管在56℃温育15分钟，在冰上温育3分钟，并以20,000×g离心15分钟。
在不扰动沉淀物的前提下，小心将上清液转移到新的1.5ml微量离心管中进行RNA纯化。将上清液在80℃温育15分钟。将管短暂离心以从盖的内部除去液滴。加入320μl缓冲液RLT以调节结合条件，并通过涡旋或移液混合管。加入1120μl乙醇(96-100％)，并通过涡旋或移液将管混合均匀。
将700μl样品(包括任何可能已经形成的沉淀)转移到置于2ml收集管中的RNeasyMinElute旋转柱中，并以≥8000×g(≥10,000rpm)离心15秒。弃去流入部分。重复该步骤，直至整个样品通过RNeasy MinElute旋转柱。
将350μl缓冲液FRN加入到RNeasy MinElute旋转柱中，以≥8000×g(≥10,000rpm)离心15秒。弃去流入部分。
将10μl DNA酶I储备溶液加入到70μl缓冲液RDD中，通过轻轻倒置管混合，并短暂离心以从管侧收集残留液体。
将DNA酶I温育混合物(80μl)直接加入到RNeasy MinElute旋转柱膜中，并置于台面上15分钟(20-30℃)。
将500μl缓冲液FRN加入到RNeasy MinElute旋转柱中，以≥8000×g(≥10,000rpm)离心15秒。保存流入部分用于下一步，因为其含有小RNA。
将RNeasy MinElute旋转柱置于新的2m1收集管中(提供)。将上一步的流入部分应用于旋转柱，并以≥8000×g(≥10,000rpm)离心15秒。弃去流入部分。
将500μl缓冲液RPE加入到RNeasy MinElute旋转柱中，并以≥8000×g(≥10,000rpm)离心15秒以洗涤旋转柱膜。弃去流入部分。
将500μl缓冲液RPE加入到RNeasy MinElute旋转柱中，并以≥8000×g(≥10,000rpm)离心15秒以洗涤旋转柱膜。丢弃带有流入部分的收集管。
将RNeasy MinElute旋转柱置于新的2ml收集管中，并全速离心5分钟。丢弃带有流入部分的收集管。
将RNeasy MinElute旋转柱置于新的1.5ml收集管中，将30μl不含RNA酶的水直接加入旋转柱膜中，在室温下温育1分钟，并全速离心1分钟以洗脱RNA。
将RNA样品立即储存在-80℃冰箱中。
cDNA合成
以下公开了使用实时PCR(RT-PCR)分析进行FFPET SNP测定的cDNA合成过程。
所需设备：配有板适配器的离心机，能够实现1500×g，微量离心机；移液器(优选的单通道和多通道移液器)，容积式或排气式；涡旋器；以及PCR系统9700(ABI#4314879)或等同物。
所需材料：具有RNA酶抑制剂的高容量cDNA逆转录酶试剂盒，200次反应(ABI#4374966)；无核酸酶纯水(未经DEPC处理)(来自IDT)或等同物；无RNA酶屏障(过滤器)枪头；无RNA酶微管(1.5至2mL VWR# 10011-724)；MicroAmpTM光学96孔反应板(LifeTechnologies，#4306736)；以及密封膜(VWR #60941-072)。
RNA提取(上文公开)之后将RNA样品管保持在冰上。
将试剂盒组分用于制备所有反应的2×逆转录(RT)主混合物，包括1个阴性(水)对照。将组分在冰上解冻约15分钟，轻轻倒置混合并短暂离心以降解溶液。将所有试剂都返回到冰上。管未经涡旋。
通过在每次反应中混合以下量的试剂，在1.5ml管中在冰上制备一种主混合物以进行适当数量的反应(反应数目+10％/20μL反应)：2μl 10×常温缓冲混合物；0.8μl 25×dNTP混合物；2μl 10×常温随机引物；1μl 50U/μL MultiScribe逆转录酶；1μl RNA酶抑制剂；以及3.2μl不含H2O的核酸酶/RNA酶。
将主混合物涡旋数次(5至10次)以混合并短暂离心(1500×g，5至10秒)。将10μl反应混合物加入到96孔板的适当孔中。
将RNA样品稀释至浓度为20ng/μl。向96孔板的适当相应孔中加入10μL每个RNA样品，包括水阴性对照，最后反应体积为20μL。通过上下移液3次轻轻混合孔，用板密封件进行密封并短暂离心(1500×g，60秒)。将板保持在冰上，直至准备加载在热循环仪中。
将反应板装载到清洁实验室或工作站中的ABI 9700热循环仪中，并使用以下逆转录程序运行(反应体积为20μl)：
步骤1：25℃10分钟
步骤2：37℃120分钟
步骤3：85℃5秒
步骤4：4℃并保持
将合成的cDNA储存在-20℃下进行预扩增的下一步骤。
预扩增测定池混合物制备
与FFPET SNP测定预扩增方案相关联的预扩增测定池混合物制备如下。
所需设备：微量离心机；移液器，容积式或排气式；以及涡旋器。
所需材料：无核酸酶纯水(未经DEPC处理)(来自IDT)或等同物；IDTE pH 8.0(1×TE溶液)(IDT Technologies)；无RNA酶屏障(过滤器)枪头；以及无RNA酶管(1.5至2mL VWR#10011-724)。
所有TaqMan SNP测定物均订购自Applied Biosystems，Life Technologies，Inc.。
制备100μL 20×SNP测定物。
为了制备0.2×预扩增测定池，所有测定物在冰上融化约15分钟。将以下体积的组分加入1.5ml管中：
表4
注意：以上体积用于制备200μl 0.2×预扩增测定池。可根据被测试样品的数量相应地调整体积。
将0.2×预扩增测定池短暂涡旋混合(5至10秒)并短暂离心(1500×g，5-10秒)。将100μL预扩增引物池等分到1.5ml管中并在-20℃下储存。
使用实时PCR(RT-PCR)分析进行乳腺癌福尔马林固定石蜡包埋组织SNP测定的预 扩增
所需设备：配有板适配器的离心机，能够实现1500×g；微量离心机；移液器，容积式或排气式；涡旋器；PCR系统9700(ABI# 4314879)或等同物。
所需材料：预扩增主混合物(2×)(Life Technologies # 4391128)；0.2×池测定混合物(参见Assay Preparation and Handling Protocol)；1×IDTE缓冲液(10mM Tris/0.1mM EDTA，pH7.5，来自IDT)或等同物；无核酸酶纯水(未经DEPC处理)(来自IDT)或等同物；无RNA酶屏障(过滤器)枪头；无RNA酶微管(1.5至2mL VWR# 10011-724)；MicroAmpTM光学96孔反应板(Life Technologies，#4306736)；光学粘合剂膜(Applied Biosystems PN 4311971)；深孔板(VWR# 47734-788)；箔密封件(VWR#60941-126)。
通过将cDNA和0.2×测定混合物池放置在冰上解冻约5分钟，并将板短暂离心(1500×g 5至10秒)来制备样品。
试剂盒组分用于制备2×预扩增主混合物。将试剂盒组分在冰上解冻约5分钟。解冻所有试剂后，将管轻轻倒置混合并短暂离心以降解溶液。将所有试剂都返回到冰上。管未经涡旋。
在清洁实验室或生物安全罩中，通过组合所需体积的试剂(如下表5所示，反应数目+10％)，在冰上制备适当数量的反应的每种主混合物：
表5
测定池含有引物和探针。
为了防止SNP测定的交叉激活，将所有5次测定分成每个样品3个预扩蹭反应。
将每种主混合物涡旋数次(5至10次)以混合，然后进行短暂离心(1500×g，5至10秒)。将18.75μL每种主混合物等分到96孔反应板的适当孔中。对于每个预扩增反应，将6.25μL的每个cDNA样品(包括水阴性对照孔)转移到主混合物反应板的适当孔中。通过上下移液3次样品使其轻轻混合，并封闭盖。将板短暂离心(1500×g，60秒)，并保持在冰上直至准备加载到热循环仪中。
使用以下程序装载和运行反应板ABI 9700热循环仪：
步骤1：95℃10分钟
步骤2：95℃15秒
步骤3：60℃4分钟
步骤4：设定步骤2-3持续10个循环
如果使用金块或银块，则选择最大模式，并且升温速率设定为77％。如果使用铝块，则选择标准模式(无速率变化)。
步骤5：4℃并保持
将反应体积设定为25μL
预扩增完成后，将预扩增反应板短暂离心(1500×g，60秒)。将100μl IDTE加入到新的深96孔板的适当孔中，并将25μL的每个预扩增产物转移到相应的孔中以使最终稀释体积为125μL。通过上下移液3次混合各孔，用箔粘合剂密封板，将板短暂离心(1500×g，持续5-10秒)，并将预扩增产物储存于-20℃直至进一步使用。
FFPET SNP测定 实时PCR
以下公开了使用实时PCR分析进行福尔马林固定石蜡包埋组织SNP测定的过程。
所需设备：配有板适配器的离心机，能够实现1500×g；微量离心机；移液器(优选的单通道和多通道移液器)，容积式或排气式；涡旋器；以及ABI ViiA 7实时PCR仪(LifeTechnologies)。
所需材料：TaqMan基因分型主混合物(Life Technologies # 4371355)；SNP测定；无核酸酶纯水(未经DEPC处理，来自IDT)或等同物；无RNA酶屏障(过滤器)枪头；无RNA酶微管(1.5至2mL VWR# 10011-724)；光学粘合剂膜(Applied Biosystems PN4311971)；以及MicroAmpTM光学384孔反应板。
表15列出了实时PCR测定中所使用探针的序列。
为了准备样品，在清洁实验室或工作站中将SNP测定置于冰上解冻约5分钟。防止所有试剂接受光照，以保护荧光探针的暴露。将稀释的预扩增板置于冰上，以在制备基因分型主混合物之后在脏实验室或工作站中解冻。
为了制备基因分型主混合物，将基因分型主混合物在冰上解冻约5分钟。将主混合物(MM)在冰上制备成所需数量的管。将所需体积的试剂在合适的标记管中合并，如下表6所示(反应数目+10％)：
表6
组分 一次反应的体积(μL)
2×基因分型主混合物 10
20×SNP测定 1
无RNA酶纯水 4
总体积 15
20×SNP测定混合物包含引物、探针和阻断寡核苷酸。
将主混合物涡旋数次(5至10次)混合，然后短暂离心(1500×g，5至10秒)。将15μl每种主混合物加入MicroAmpTM Optical 384孔反应板的合适孔中。反应板用光学粘合剂膜密封。
将具有1∶5稀释的预扩增产物的板置于冰上约5-10分钟以解冻。使用多通道移液器，将5μL每种稀释的预扩增产物转移到适当的相应孔中。将反应板用光学粘合剂膜密封并短暂离心(1500×g，60秒)。将板保持在冰上，直至准备加载在热循环仪中。
使用体积设定为20μl的viiA 7软件运行以下条件：
表7
FGFR SNP特异性qRT-PCR
在过量野生型等位基因中检测罕见体细胞突变在癌症诊断中越来越重要。当感兴趣的突变彼此接近时，检测变得具有挑战性。为了帮助从FFPET鉴定FGFR SNP，开发了SNP特异性qRT-PCR测定法，其中使用利用Taqman MGB探针与3′双脱氧野生型(WT)等位基因阻断剂组合的SNP特异性扩增。该测定法阻止非特异性结合，改善靶扩增数目，使来自WT等位基因的假阳性信号最小化，并提高测定的灵敏度。这种基于RNA的SNP检测测定与测定中的预扩增步骤相结合，增强了较低或罕见的突变信号。
使用3′双脱氧WT阻断剂寡核苷酸的SNP特异性qRT-PCR的示例性策略示于图3中，并且图4示出了示例性FFPE样品验证策略。简而言之，在3′双脱氧WT阻断剂寡核苷酸存在的情况下，使用FGFR SNP引物进行qRT-PCR，该寡核苷酸与WT等位基因互补并含有侧接WT等位基因的核苷酸短段。阻断剂寡核苷酸与WT等位基因的结合阻止了WT等位基因的应用，而FGFR SNP引物结合至并特异性地扩增FGFR SNP。在FGFR SNP特异性qRT-PCR中使用的3′双脱氧WT阻断剂寡核苷酸示于表8中。用于FGFR SNP特异性qRT-PCR的FGFR SNP引物为：SEQID NO：31和SEQ ID NO：32(FGFR3 R248C)；SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34(FGFR3 S249C)；SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36(FGFR3 G370C)；以及SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38fFGFR3Y373)。表15列出了实时PCR测定中所使用探针的序列。
表8
*R可以是A或G。在合成期间，3′WT阻断寡核苷酸将在该特定位置具有50％A和50％G(由制造商纯化以在该特定位置提供A或G)。
用于验证研究的样品如表9所示制备。使用针对FGFR3 G370C、FGFR3 Y373、FGFR3S249C和FGFR3 R248C的3′双脱氧WT阻断剂寡核苷酸的SNP特异性qRT-PCR的示例性验证数据分别示于图5A至图5D。具有3′双脱氧WT阻断剂寡核苷酸的具有SNP特异性qRT-PCR的FFPE样品的原始Ct(循环阈值)数据示于表10中。使用不同平台/技术从DNA和RNA得到的数据表明，具有3′阻断核苷酸的SNP特异性PCR是一种稳健、可靠且灵敏的测定法。验证数据表明，可在大量过量的携带WT的基因组DNA中检测到一个突变等位基因/SNP，从而强调每次测定的灵敏度和特异性。
表9
样品 突变％
1 100
2 20
3 4
4 0.8
5 0(100％WT)
表达每个FGFR3 SNP(R248C，S249C，G370C，Y373C)和FGFR3WT的稳定细胞系的RNA
表10
*两个Ct的平均值
FMI/NGS＝下一代测序技术，其中将DNA用作模板以鉴定突变(不含3′阻断寡核苷酸)；Janssen R&D＝对RNA模板(不含3′阻断寡核苷酸)进行；SNP特异性PCR＝对含有3′阻断核苷酸的RNA模板进行。
实施例5-定制FGFR融合基因检测测定的验证
FGFR融合分析阳性对照的产生
产生FGFR融合“合成小基因”、编码FGFR融合体的质粒和含有FGFR融合体的稳定细胞系。简而言之，通过将一系列具有约100个碱基对的核苷酸(对应于感兴趣的基因的目标DNA序列)彼此连接，来人工构建合成小基因。通过将编码各个FGFR融合基因的cDNA克隆到表达载体中，来产生编码FGFR融合体的质粒。通过将编码FGFR基因的质粒转染到正常大鼠肾上皮细胞(NRK细胞)中，来产生含有FGFR融合体的稳定细胞系。利用G418抗生素选择稳定的细胞系。对从这些细胞系中分离的总RNA进行FGFR融合体Taqman测定，以确认是否成功产生了表达FGFR融合体的稳定细胞系。将表达FGFR融合体的稳定细胞系用作阳性对照。表15列出了在实时PCR测定中所用的探针的序列。
FGFR融合体测定的定量下限和效率的分析
为了确定FGFR融合基因测定的定量下限(LLOQ)和效率，通过TaqMan PCR(如实施例4所述)产生FGFR融合产物，并通过Sanger测序确认该产物(图2)。将100pg融合阳性DNA与正常人类cDNA(确认的融合阴性)混合，逐级稀释为1∶10，并使用Applied BiosystemsViiA7 Sofftware v1.1进行分析。效率标准曲线在图6中示出。FGFR融合体的LLOQ和效率在表11中示出。
表11
测定 LLOQ 效率
FGFR3:TACC3 V1 1.0fgm 104％
FGFR3:TACC3 V3 10.0fgm 104％
FGFR3:TACC3内含子 0.1fgm 103％
FGFR3:BAIAP2L1 1.0fgm 101％
FGFR2:AFF3 0.1fgm 106％
FGFR2:BICC1 10.0fgm 105％
FGFR2:CASP7 0.1fgm 109％
FGFR2:CCDC6 1.0fgm 106％
FGFR2:OFD1 0.1fgm 96.6％
接下来，在融合基因阳性细胞系中验证FGFR融合基因测定。通过将融合蛋白阳性细胞系掺入融合蛋白阴性细胞系中，制备FGFR融合基因表达逐级稀释物。例如，制备FGFR3:TACC3v1和FGFR3:BAIAP2L1的1∶2的逐级稀释物，并将其掺入100万个BAF细胞中。分离RNA(使用Qiagen Rneasy试剂盒)，然后进行RT-PCR、cDNA的预扩增以及对目标FGFR融合基因进行TaqMan实时PCR。如表12所示，FGFR3:TACC3v1和FGFR3:BAIAP2L1融合基因TaqMan测定两者均能够在100万个融合阴性细胞中检测到31个融合目标(灵敏度为0.003％)。
表12
RT112和SW780＝含有FGFR融合体的市售膀胱癌细胞系(来自美国模式培养物保藏所)。
实施例6-定制FGFR SNP检测测定的验证
膀胱癌中FGFR3突变的评估
在所测试的膀胱癌样品中，分别观察到约8％、约61％和约19％的R248C、S249C和Y373C SNP。
实施例7-癌症样品的分析
使用与实施例4中所述程序相同的过程分析样品。结果在表13和图7中示出。表13示出了不同癌症中的FGFR融合体盛行率。使用qRT-PCR方法对来自不同癌症(诸如膀胱癌(原发性和转移性)、NSCLC(腺癌和鳞状细胞癌)、卵巢癌、食管癌(原发性和转移性)、头颈癌(H&N，原发性和转移性)、子宫内膜癌(转移性)、乳腺癌和前列腺癌)的FFPE样品中的FGFR融合体进行检测。所测试的所有FGFR融合体对于前列腺癌样品均为阴性。FGFR3:TACC3内含子融合体在膀胱癌(原发性)、NSCLC(鳞状细胞癌)、卵巢癌和食管癌(原发性)、H&N癌(原发性和转移性)以及乳腺癌中为阴性。FGFR2:OFD1融合体在膀胱癌(原发性和转移性)、NSCLC(腺癌)、卵巢癌以及食管癌(原发性和转移性)中为阴性。FGFR2:CCDC6融合体在膀胱癌(原发性和转移性)、NSCLC(腺癌)、卵巢癌和食管癌(原发性)以及H&N癌(原发性和转移性)中为阴性。
图8是NSCLC腺癌和鳞状细胞癌中FGFR融合基因和突变状态的示例性表示。在FGFR融合阳性NSCLC腺癌样品中，3/17的样品为EGFR突变阳性，3/17的样品为KRAS突变阳性，1/17的样品为cMET突变阳性。然而，在FGFR融合阳性NSCLC鳞状细胞癌样品中未观察到EGFR、KRAS或cMET突变。
实施例8-对晚期实体瘤患者进行治疗
进行临床试验，其中用JNJ-42756493对患有表达FGFR3:TACC3 v1、FGFR3:TACC3v3、FGFR2:CCDC6和FGFR2:BICC1融合基因的各种实体瘤的患者进行治疗。图9示出了I期患者样品的示例性结果，其中使用qRT-PCR测定法检测I期JNJ-427493(EDI10001)试验样品中的FGFR融合体。所有FGFR融合体测定均与阳性对照(ST)和GAPDH同时进行，用于RNA的质量控制评估。A)针对pt#1000081所生成的qRT-PCR数据的图形表示：仅FGFR2:BICC1融合体为阳性(插图示出了FGFR2:BICC1融合体、ST阳性对照和GAPDH的Ct值的细节)。B)针对pt#33000158所生成的qRT-PCR数据的图形表示：仅FGFR3:TACC3v1融合体为阳性(插图示出了FGFR3:TACC3v1融合体、ST阳性对照和GAPDH的Ct值的细节)。C)针对pt#34000123所生成的qRT-PCR数据的图形表示：仅FGFR2:CCDC6融合体为阳性(插图示出了FGFR2:CCDC6融合体、ST阳性对照和GAPDH的Ct值的细节)。D)针对pt#340000115所生成的qRT-PCR数据的图形表示：FGFR3:TACC3v1、FGFR3:TACC#v3和FGFR2:CCDC6融合体为阳性(插图示出了FGFR融合体、ST阳性对照和GAPDH的Ct值的细节)。
图10表示对患有晚期实体瘤的患者进行JNJ-42756493首次人体内研究的示例性I期研究设计。该图示出了I期临床试验中传统3+3设计剂量递增方法的图形描述。剂量递增阶段的目的是确定最大耐受剂量(MTD)和建议的II期剂量(RPD)。使用第1部分来确定间歇给药方案，即7天给药和7天停药(10mg/kg和12mg/kg)。使用第2部分来确定PD生物标记(药效学生物标记；被检查以将药物效果与靶标和生物学肿瘤反应联系起来的标记)，其中对活检样品和血液样品进行了测试。使用第3部分的剂量扩张组并包括以不同资格标准(FGFR畸变：易位/突变/扩增)的具体适应症(NSCLC、SCLC、乳腺癌和实体瘤)的应计额外患者，以进一步表征JNJ493的毒性曲线。
临床活动的评估
在具有FGFR融合基因的患者中，在每天一次9mg给药(QD)，12mgQD和12mg的7天给药/停药的情况下，观察到显著的临床反应(RECIST)。(图11表示所有给药方案)。
实施例9-用FGFR融合体稳定转染的RK3E细胞的产生
FGFR融合体过表达细胞系
RK3E(大鼠肾上皮细胞)细胞购自ATCC(Manassas，VA，USA)，将其在补充有FBS和抗生素的DMEM(Invitrogen，Grand Island，NY，USA)中培养。设计FGFR融合基因构建体，并将其克隆到包含HA标签的pReceiver表达载体(Genecopoeia，Rockville，MD，USA)中。根据制造商的方案，使用Amaxa细胞系核转染(Lonza，Basel，Switzerland)将克隆转染到RK3E细胞中。在具有800ug/ml G418(Invitrogen)的完全培养基中选择稳定转染的细胞。通过使用抗pFGFR抗体的实时PCR和免疫印迹来确认稳定转染的细胞中是否过表达融合体(图12)。如图12所示，稳定的细胞系表明了活性FGFR融合激酶的表达，如FGFR的磷酸化表达所示。
菌落形成测定
测试了用FGFR融合体稳定转染的RK3E细胞的锚定非依赖性生长。首先将含有0.8％低熔点琼脂糖的1ml培养基接种到六孔板的各三个孔中。在琼脂凝固后，向每个孔中加入另外1ml含有0.4％琼脂的培养基，该培养基中含有100个细胞。14天后，固定菌落并用0.1％甲苯基结晶紫染色。通过在显微镜下对每个细胞系的三个孔进行手动计数来确定菌落数。每个融合体过表达细胞系的代表性视图在图13A中示出。可以在用FGFR融合体稳定转染的细胞中检测到软琼脂中的锚定非依赖性生长，但不能在空载体对照中检测到。图13B表示用FGFR融合体稳定转染的RK3E细胞和空载体对照的软琼脂中菌落的定量分析。所有实验均一式两份地进行，结果表示为每100个所接种的细胞中的菌落数。所测试的所有FGFR融合体均诱导了锚定非依赖性生长，表明了其具有转化能力。
下游靶标表达
将用FGFR融合体稳定转染的RK3E细胞接种到完全生长培养基中，血清饥饿过夜，然后用0.5％FBS生长培养基重新喂食。在配体存在的情况下，用1μM的JNJ-42756493、AZD4547或NVP-BGJ398处理细胞1小时。对于免疫印迹，将全细胞裂解物收集在RIPA缓冲液(Thermo Scientific，Waltham，MA，USA)中，并使用BCA蛋白测定(Thermo Scientific)检测样品蛋白浓度。先将等量的蛋白质(30μg/泳道)上样到4-12％Bis-Tris凝胶(Invitrogen)上，然后进行SDS-page。将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上并用抗p-FGFR、总FGFR2、p-MAPK、总MAPK、p-S6、总S6、B-肌动蛋白的抗体(Cell Signaling Technology，Danvers，MA，USA)和抗总FGFR3的抗体(Santa Cruz，Dallas，TX，USA)进行杂交。在室温下用Odyssey封闭缓冲液封闭膜1小时，并在4℃下在用Odyssey封闭缓冲液稀释的一抗溶液(1∶1000)中温育过夜。在0.1％Tween Tris缓冲盐溶液(TBST)中洗涤三次之后，在室温下在Odyssey封闭缓冲液中用山羊抗小鼠或驴抗兔IR-Dye 670或800cw标记的二抗血清杂交膜1小时。在二次标记后重复洗涤，并使用LiCor Odyssey扫描仪和Odyssey 3.0分析软件(LiCor，Lincoln，NE，USA)使膜成像。将JNJ-42756493的效果与AZD4547和NVP-BGJ398的效果进行比较。如图14A至图14H所示，用JNJ-42756493、AZD4547和NVP-BGJ398(每个印迹中的泳道数为2至4)进行处理抑制了FGFR和下游靶标(即MAPK和S6)的磷酸化。
FGFR融合体过表达细胞系的药物反应测试
将用FGFR融合体稳定转染的RK3E细胞一式三份地接种到96孔板(1000个细胞/孔)中，每个孔中含有完全生长培养基和配体FGF-1和FGF-2。24小时后，将细胞血清饥饿过夜，然后用0.5％FBS生长培养基重新喂食。接种72小时后，用18个1∶3逐级稀释物的不同浓度JNJ493、AZD4547(AZD)和NVP-BGJ398(NVS)处理细胞，起始浓度为10μM。然后将微量滴定板温育72小时，并使用Cell Luminescent Cell Viability assay(PromegaCorp.，Madison，WI，USA)根据制造商的说明书测定三磷酸腺苷(ATP，具有代谢活性的细胞的标记)含量，方法稍有改动。简而言之，使细胞平衡至室温，此时按1∶1加入Cell试剂的混合物。然后将细胞置于定轨振荡器上2分钟，并在室温下温育10分钟以稳定发光信号。对发光进行定量分析并使用Envision Multilabel酶标仪(Perkin Elmer；Waltham，MA，USA)进行测量。使用GraphPad Prism 5.0计算IC50的值(如表14所示)。如表14所示，含有FGFR融合体的细胞在体外对FGFR抑制剂JNJ-42756493、AZD4547和NVP-BGJ398表现出敏感性，其中与AZD4547和NVP-BGJ398相比，对JNJ-42756493表现出增强的敏感性(纳摩尔浓度范围)，而空载体对照则没有表现出敏感性。
表14
AZD＝AZD4547；NVS＝NVP-BGJ398
表15
本领域技术人员将理解，可对本发明的优选实施方案作出许多改变和修改，并且在不脱离本发明的实质的前提下可作出此类改变和修改。因此，所附权利要求旨在覆盖落入本发明的真实精神和范围内的所有此类等同变化。
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实施方案
以下所列的实施方案旨在补足而不是取代或代替之前的描述。
实施方案1.一种鉴定对用成纤维细胞生长因子受体(FGFR)抑制剂进行治疗有反应的癌症患者的方法，该方法包括：
评估来自患者的生物样品中来自FGFR突变基因组的FGFR突变体，其中所述FGFR突变体是FGFR融合基因或FGFR单核苷酸多态性，并且其中所述评估包括：
用与来自FGFR突变基因组的一种或多种FGFR突变体结合并对其进行扩增的引物对扩增cDNA；以及
确定样品中是否存在来自FGFR突变基因组的一种或多种FGFR突变体，其中存在一种或多种FGFR突变体表示患者对用FGFR抑制剂进行治疗有反应。
实施方案2.一种鉴定对用成纤维细胞生长因子受体(FGFR)抑制剂进行治疗有反应的癌症患者的方法，该方法包括：
评估来自患者的生物样品中来自FGFR突变基因组的一种或多种FGFR突变体的存在，其中所述FGFR突变体是FGFR融合基因或FGFR单核苷酸多态性，其中存在一种或多种FGFR突变体表示患者对用FGFR抑制剂进行治疗有反应。
实施方案3.根据实施方案1或2所述的方法，其中FGFR融合基因包括FGFR3:TACC3v1、FGFR3:TACC3 v3、FGFR3:TACC3内含子、FGFR3:BAIAP2L1、FGFR2:BICC1、FGFR2:AFF3、FGFR2:CASP7、FGFR2:CCDC6或FGFR2:OFD1，或它们的任何组合。
实施方案4.根据实施方案1或2所述的方法，其中FGFR单核苷酸多态性包括R248C、S249C、G370C或Y373C，或它们的任何组合。
实施方案5.根据实施方案1或2所述的方法，其中该癌症是膀胱癌，并且该FGFR突变基因组包括FGFR3:TACC3 v1、FGFR3:TACC3 v3、FGFR3:BAIAP2L1、FGFR2:BICC1、FGFR2:AFF3、FGFR2:CASP7、FGFR3 R248C、FGFR3 S249C、FGFR3 G370C或FGFR3 Y373C，或它们的任何组合。
实施方案6.根据实施方案1或2所述的方法，其中该癌症是转移性膀胱癌，并且该FGFR突变基因组包括FGFR3:TACC3 v1、FGFR3:TACC3 v3、FGfR3:BAIAP2L1、FGFR2:BICC1、FGFR2:AFF3、FGFR2:CASP7、FGFR3 R248C、FGFR3 S249C、FGFR3 G370C或FGFR3 Y373C，或它们的任何组合。
实施方案7.根据实施方案1或2所述的方法，其中该癌症是卵巢癌，并且该FGFR突变基因组包括FGFR3:TACC3 v1、FGFR3:TACC3 v3、FGFR3:BAIAP2L1、FGFR2:BICC1、FGFR2:AFF3、FGFR2:CASP7、FGFR3 R248C、FGFR3 S249C、FGFR3 G370C或FGFR3 Y373C，或它们的任何组合。
实施方案8.根据实施方案1或2所述的方法，其中该癌症是头颈癌，并且该FGFR突变基因组包括FGFR3:BAIAP2L1、FGFR2:CASP7、FGFR3 R248C、FGFR3 S249C、FGFR3 G370C或FGFR3 Y373C，或它们的任何组合。
实施方案9.根据实施方案1或2所述的方法，其中该癌症是转移性头颈癌，并且该FGFR突变基因组包括FGFR3:BAIAP2L1、FGFR2:CASP7或FGFR2:OFD1，或它们的任何组合。
实施方案10.根据实施方案1或2所述的方法，其中该癌症是食管癌，并且该FGFR突变基因组包括FGFR3:TACC3 v1、FGFR3:TACC3 v3、FGFR2:BICC1、FGFR2:CASP7、FGFR3R248C、FGFR3 S249C、FGFR3 G370C或FGFR3 Y373C，或它们的任何组合。
实施方案11.根据实施方案1或2所述的方法，其中该癌症是转移性食管癌，并且该FGFR突变基因组包括FGFR3:TACC3 v1、FGFR3:TACC3 v3、FGFR3:TACC3内含子、FGFR3:BAIAP2L1、FGFR2:BICC1、FGFR2:AFF3、FGFR2:CASP7、FGFR2:CCD6或FGFR2:OFD1，或它们的任何组合。
实施方案12.根据实施方案1或2所述的方法，其中该癌症是非小细胞肺癌腺癌，并且该FGFR突变基因组包括FGFR3:TACC3 v1、FGFR3:TACC3 v3、FGFR3:TACC3内含子、FGFR3:BAIAP2L1、FGFR2:AFF3、FGFR2:CASP7、FGFR3 R248C、FGFR3 S249C、FGFR3G370C或FGFR3Y373C，或它们的任何组合。
实施方案13.根据实施方案1或2所述的方法，其中该癌症是非小细胞肺癌鳞状细胞癌，并且该FGFR突变基因组包括FGFR3:TACC3 v1、FGFR3:TACC3 v3、FGFR3:BAIAP2L1、FGFR2:BICC1、FGFR2:AFF3、FGFR2:CASP7、FGFR2:CCDC6、FGFR3 R248C、FGFR3 S249C、FGFR3G370C或FGFR3 Y373C，或它们的任何组合。
实施方案14.根据实施方案1或2所述的方法，其中该癌症是转移性子宫内膜癌，并且该FGFR突变基因组包括FGFR3:TACC3 v1、FGFR3:TACC3 v3、FGFR3:TACC3内含子、FGFR3:BAIAP2L1、FGFR2:CASP7、FGFR2:CCDC6或FGFR2:OFD1，或它们的任何组合。
实施方案15.根据实施方案1或2所述的方法，其中该癌症是乳腺癌，并且该FGFR突变基因组包括FGFR3:TACC3 v1、FGFR3:TACC3 v3、FGFR3:TACC3内含子、FGFR3:BAIAP2L1、FGFR2:BICC1、FGFR2:AFF3、FGFR2:CASP7、FGFR2:CCD6或FGFR2:OFD1，或它们的任何组合。
实施方案16.根据实施方案1或2所述的方法，其中该癌症是肝细胞癌，并且该FGFR突变基因组包括FGFR3:TACC3 v1、FGFR3:TACC3 v3、FGFR3:TACC3内含子、FGFR3:BAIAP2L1、FGFR2:BICC1、FGFR2:AFF3、FGFR2:CASP7、FGFR2:CCDC6、FGFR2:OFD1、FGFR3 R248C、FGFR3S249C、FGFR3 G370C或FGFR3 Y373C，或它们的任何组合。
实施方案17.根据实施方案2至16中任一项所述的方法，其中评估包括用与来自FGFR突变基因组的一种或多种FGFR突变体结合并对其进行扩增的引物对扩增cDNA。
实施方案18.根据实施方案17所述的方法，其中cDNA是预扩增的cDNA。
实施方案19.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中FGFR突变体和引物对为：
FGFR3:TACC3 v1和具有SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6的氨基酸序列的引物；
FGFR3:TACC3 v3和具有SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8的氨基酸序列的引物；
FGFR3:TACC3内含子和具有SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10的氨基酸序列的引物；
FGFR3:BAIAP2L1和具有SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12的氨基酸序列的引物；
FGFR2:BICC1和具有SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14的氨基酸序列的引物；
FGFR2:AFF3和具有SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16的氨基酸序列的引物；
FGFR2:CASP7和具有SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18的氨基酸序列的引物；
FGFR2:CCDC6和具有SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20的氨基酸序列的引物；
FGFR2:OFD1和具有SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22的氨基酸序列的引物；
R248C和具有SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24或者SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32的氨基酸序列的引物；
S249C和具有SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26或者SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34的氨基酸序列的引物；
G370C和具有SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28或者SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36的氨基酸序列的引物；
Y373C和具有SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30或者SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38的氨基酸序列的引物；
或它们的任何组合。
实施方案20.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中评估包括：
从生物样品中分离RNA并由分离的RNA合成cDNA。
实施方案21.根据实施方案20所述的方法，还包括在扩增步骤之前预扩增cDNA。
实施方案22.根据实施方案1或3至21中任一项所述的方法，其中对cDNA进行预扩增。
实施方案23.根据实施方案1或3至22中任一项所述的方法，其中扩增步骤包括进行实时PCR。
实施方案24.根据实施方案23所述的方法，其中实时PCR用一种或多种探针进行，所述探针包括SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54和/或SEQ ID NO：55。
实施方案25.根据实施方案23或24所述的方法，其中实时PCR用一种或多种3’阻断寡核苷酸进行，所述3’阻断寡核苷酸包括SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41和/或SEQ ID NO：42。
实施方案26.根据实施方案1或3至25中任一项所述的方法，其中所述测定步骤包括对扩增的cDNA进行测序。
实施方案27.一种用于鉴定生物样品中一种或多种FGFR突变基因的存在的试剂盒，该试剂盒包括：
具有以下序列的引物对：SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13和SEQ IDNO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19和SEQID NO：20、SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36、SEQ IDNO：37和SEQ ID NO：38，或它们的任何组合；以及
用于进行测定以检测一种或多种FGFR突变基因的说明书。
实施方案28.根据实施方案27所述的试剂盒，还包括一种或多种探针、一种或多种3′阻断寡核苷酸或以上两者。
实施方案29.根据实施方案28所述的试剂盒，其中
a.引物对具有SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6的序列，并且探针具有SEQ ID NO：43的序列；
b.引物对具有SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8的序列，并且探针具有SEQ ID NO：44的序列；
c.引物对具有SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10的序列，并且探针具有SEQ ID NO：46的序列；
d.引物对具有SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12的序列，并且探针具有SEQ ID NO：47的序列；
e.引物对具有SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14的序列，并且探针具有SEQ ID NO：45的序列；
f.引物对具有SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16的序列，并且探针具有SEQ ID NO：48的序列；
g.引物对具有SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18的序列，并且探针具有SEQ ID NO：49的序列；
h.引物对具有SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20的序列，并且探针具有SEQ ID NO：50的序列；
i.引物对具有SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22的序列，并且探针具有SEQ ID NO：51的序列；
j.引物对具有SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24的序列，并且探针具有SEQ ID NO：52的序列；
k.引物对具有SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26的序列，并且探针具有SEQ ID NO：53的序列；
l.引物对具有SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28的序列，并且探针具有SEQ ID NO：54的序列；
m.引物对具有SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30的序列，并且探针具有SEQ ID NO：55的序列；
n.引物对具有SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32的序列，探针具有SEQ ID NO：52的序列，并且3′阻断寡核苷酸具有SEQ ID NO：39的序列；
o.引物对具有SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34的序列，探针具有SEQ ID NO：53的序列，并且3′阻断寡核苷酸具有SEQ ID NO：40的序列；
p.引物对具有SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36的序列，探针具有SEQ ID NO：54的序列，并且3′阻断寡核苷酸具有SEQ ID NO：41的序列；
q.引物对具有SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38的序列，探针具有SEQ ID NO：55的序列，并且3′阻断寡核苷酸具有SEQ ID NO：42的序列；或者
r.它们的任何组合。
实施方案30.一种具有以下氨基酸序列的引物：SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ IDNO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ IDNO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ IDNO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ IDNO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ IDNO：37、SEQ ID NO：38，或它们的任何组合。
实施方案31.一种具有以下序列的引物组：SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：7和SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12、SEQ IDNO：13和SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18、SEQID NO：19和SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29和SEQ IDNO：30、SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35和SEQID NO：36、SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38，或它们的任何组合。
实施方案32.一种具有SEQ ID NO：43至55中任一者或它们的任何组合的序列的寡核苷酸探针。
实施方案33.一种具有SEQ ID NO：39至42中任一者或它们的任何组合的序列的寡核苷酸。

Claims (33)

1.一种鉴定对用成纤维细胞生长因子受体(FGFR)抑制剂进行治疗有反应的癌症患者的方法，所述方法包括：
评估来自所述患者的生物样品中来自FGFR突变基因组的FGFR突变体，其中所述FGFR突变体为FGFR融合基因或FGFR单核苷酸多态性，并且其中所述评估包括：
用与来自所述FGFR突变基因组的一种或多种FGFR突变体结合并对其进行扩增的引物对扩增cDNA；以及
确定所述样品中是否存在来自所述FGFR突变基因组的所述一种或多种FGFR突变体，其中存在所述一种或多种FGFR突变体表示所述患者对用所述FGFR抑制剂进行治疗有反应。
2.一种鉴定对用成纤维细胞生长因子受体(FGFR)抑制剂进行治疗有反应的癌症患者的方法，所述方法包括：
评估来自所述患者的生物样品中来自FGFR突变基因组的一种或多种FGFR突变体的存在，其中所述FGFR突变体为FGFR融合基因或FGFR单核苷酸多态性，其中存在所述一种或多种FGFR突变体表示所述患者对用所述FGFR抑制剂进行治疗有反应。
3. 根据权利要求1或2所述的方法，其中所述FGFR融合基因包括FGFR3:TACC3 v1、FGFR3:TACC3 v3、FGFR3:TACC3内含子、FGFR3:BAIAP2L1、FGFR2:BICC1、FGFR2:AFF3、FGFR2:CASP7、FGFR2:CCDC6或FGFR2:OFD1，或它们的任何组合。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述FGFR单核苷酸多态性包括R248C、S249C、G370C或Y373C，或它们的任何组合。
5. 根据权利要求1或2所述的方法，其中所述癌症为膀胱癌，并且所述FGFR突变基因组包括FGFR3:TACC3 v1、FGFR3:TACC3 v3、FGFR3:BAIAP2L1、FGFR2:BICC1、FGFR2:AFF3、FGFR2:CASP7、FGFR3 R248C、FGFR3 S249C、FGFR3 G370C或FGFR3 Y373C，或它们的任何组合。
6. 根据权利要求1或2所述的方法，其中所述癌症为转移性膀胱癌，并且所述FGFR突变基因组包括FGFR3:TACC3 v1、FGFR3:TACC3 v3、FGFR3:BAIAP2L1、FGFR2:BICC1、FGFR2:AFF3、FGFR2:CASP7、FGFR3 R248C、FGFR3 S249C、FGFR3 G370C或FGFR3 Y373C，或它们的任何组合。
7. 根据权利要求1或2所述的方法，其中所述癌症为卵巢癌，并且所述FGFR突变基因组包括FGFR3:TACC3 v1、FGFR3:TACC3 v3、FGFR3:BAIAP2L1、FGFR2:BICC1、FGFR2:AFF3、FGFR2:CASP7、FGFR3 R248C、FGFR3 S249C、FGFR3 G370C或FGFR3 Y373C，或它们的任何组合。
8. 根据权利要求1或2所述的方法，其中所述癌症为头颈癌，并且所述FGFR突变基因组包括FGFR3:BAIAP2L1、FGFR2:CASP7、FGFR3 R248C、FGFR3 S249C、FGFR3 G370C或FGFR3Y373C，或它们的任何组合。
9.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述癌症为转移性头颈癌，并且所述FGFR突变基因组包括FGFR3:BAIAP2L1、FGFR2:CASP7或FGFR2:OFD1，或它们的任何组合。
10. 根据权利要求1或2所述的方法，其中所述癌症为食管癌，并且所述FGFR突变基因组包括FGFR3:TACC3 v1、FGFR3:TACC3 v3、FGFR2:BICC1、FGFR2:CASP7、FGFR3 R248C、FGFR3S249C、FGFR3 G370C或FGFR3 Y373C，或它们的任何组合。
11. 根据权利要求1或2所述的方法，其中所述癌症为转移性食管癌，并且所述FGFR突变基因组包括FGFR3:TACC3 v1、FGFR3:TACC3 v3、FGFR3:TACC3内含子、FGFR3:BAIAP2L1、FGFR2:BICC1、FGFR2:AFF3、FGFR2:CASP7、FGFR2:CCD6或FGFR2:OFD1，或它们的任何组合。
12. 根据权利要求1或2所述的方法，其中所述癌症为非小细胞肺癌腺癌，并且所述FGFR突变基因组包括FGFR3:TACC3 v1、FGFR3:TACC3 v3、FGFR3:TACC3内含子、FGFR3:BAIAP2L1、FGFR2:AFF3、FGFR2:CASP7、FGFR3 R248C、FGFR3 S249C、FGFR3 G370C或FGFR3Y373C，或它们的任何组合。
13. 根据权利要求1或2所述的方法，其中所述癌症为非小细胞肺癌鳞状细胞癌，并且所述FGFR突变基因组包括FGFR3:TACC3 v1、FGFR3:TACC3 v3、FGFR3:BAIAP2L1、FGFR2:BICC1、FGFR2:AFF3、FGFR2:CASP7、FGFR2:CCDC6、FGFR3 R248C、FGFR3 S249C、FGFR3 G370C或FGFR3 Y373C，或它们的任何组合。
14. 根据权利要求1或2所述的方法，其中所述癌症为转移性子宫内膜癌，并且所述FGFR突变基因组包括FGFR3:TACC3 v1、FGFR3:TACC3 v3、FGFR3:TACC3内含子、FGFR3:BAIAP2L1、FGFR2:CASP7、FGFR2:CCDC6或FGFR2:OFD1，或它们的任何组合。
15. 根据权利要求1或2所述的方法，其中所述癌症为乳腺癌，并且所述FGFR突变基因组包括FGFR3:TACC3 v1、FGFR3:TACC3 v3、FGFR3:TACC3内含子、FGFR3:BAIAP2L1、FGFR2:BICC1、FGFR2:AFF3、FGFR2:CASP7、FGFR2:CCD6或FGFR2:OFD1，或它们的任何组合。
16. 根据权利要求1或2所述的方法，其中所述癌症为肝细胞癌，并且所述FGFR突变基因组包括FGFR3:TACC3 v1、FGFR3:TACC3 v3、FGFR3:TACC3内含子、FGFR3:BAIAP2L1、FGFR2:BICC1、FGFR2:AFF3、FGFR2:CASP7、FGFR2:CCDC6、FGFR2:OFD1、FGFR3 R248C、FGFR3 S249C、FGFR3 G370C或FGFR3 Y373C，或它们的任何组合。
17.根据权利要求2至16中任一项所述的方法，其中所述评估包括用与来自所述FGFR突变基因组的一种或多种FGFR突变体结合并对其进行扩增的引物对扩增cDNA。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述cDNA为预扩增的cDNA。
19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述FGFR突变体和所述引物对为：
FGFR3:TACC3 v1和具有SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的氨基酸序列的引物；
FGFR3:TACC3 v3和具有SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的氨基酸序列的引物；
FGFR3:TACC3内含子和具有SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10的氨基酸序列的引物；
FGFR3:BAIAP2L1和具有SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的氨基酸序列的引物；
FGFR2:BICC1和具有SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14的氨基酸序列的引物；
FGFR2:AFF3和具有SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16的氨基酸序列的引物；
FGFR2:CASP7和具有SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18的氨基酸序列的引物；
FGFR2:CCDC6和具有SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20的氨基酸序列的引物；
FGFR2:OFD1和具有SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22的氨基酸序列的引物；
R248C和具有SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24或者SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32的氨基酸序列的引物；
S249C和具有SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26或者SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34的氨基酸序列的引物；
G370C和具有SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28或者SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36的氨基酸序列的引物；
Y373C和具有SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30或者SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38的氨基酸序列的引物；
或它们的任何组合。
20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述评估包括：
从所述生物样品中分离RNA并由所分离的RNA合成cDNA。
21.根据权利要求20所述的方法，还包括在所述扩增步骤之前预扩增所述cDNA。
22.根据权利要求1或3至21中任一项所述的方法，其中对所述cDNA进行预扩增。
23.根据权利要求1或3至22中任一项所述的方法，其中所述扩增步骤包括进行实时PCR。
24. 根据权利要求23所述的方法，其中所述实时PCR用一种或多种探针进行，所述探针包括SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ IDNO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ IDNO:54和/或SEQ ID NO:55。
25. 根据权利要求23或24所述的方法，其中所述实时PCR用一种或多种3’阻断寡核苷酸进行，所述3’阻断寡核苷酸包括SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41和/或SEQID NO:42。
26.根据权利要求1或3至25中任一项所述的方法，其中所述测定步骤包括对所扩增的cDNA进行测序。
27. 一种用于鉴定生物样品中一种或多种FGFR突变基因的存在的试剂盒，所述试剂盒包括：
具有以下序列的引物对：SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25和SEQID NO:26、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38，或它们的任何组合；以及
用于进行测定以检测一种或多种FGFR突变基因的说明书。
28.根据权利要求27所述的试剂盒，还包括一种或多种探针、一种或多种3'阻断寡核苷酸或以上两者。
29.根据权利要求28所述的试剂盒，其中：
a. 所述引物对具有SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的序列，并且所述探针具有SEQ IDNO:43的序列；
b. 所述引物对具有SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的序列，并且所述探针具有SEQ IDNO:44的序列；
c. 所述引物对具有SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10的序列，并且所述探针具有SEQ IDNO:46的序列；
d. 所述引物对具有SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的序列，并且所述探针具有SEQ IDNO:47的序列；
e. 所述引物对具有SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14的序列，并且所述探针具有SEQ IDNO:45的序列；
f. 所述引物对具有SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16的序列，并且所述探针具有SEQ IDNO:48的序列；
g. 所述引物对具有SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18的序列，并且所述探针具有SEQ IDNO:49的序列；
h. 所述引物对具有SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20的序列，并且所述探针具有SEQ IDNO:50的序列；
i. 所述引物对具有SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22的序列，并且所述探针具有SEQ IDNO:51的序列；
j. 所述引物对具有SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24的序列，并且所述探针具有SEQ IDNO:52的序列；
k. 所述引物对具有SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26的序列，并且所述探针具有SEQ IDNO:53的序列；
l. 所述引物对具有SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28的序列，并且所述探针具有SEQ IDNO:54的序列；
m. 所述引物对具有SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30的序列，并且所述探针具有SEQ IDNO:55的序列；
n. 所述引物对具有SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32的序列，所述探针具有SEQ ID NO:52的序列，并且所述3'阻断寡核苷酸具有SEQ ID NO:39的序列；
o. 所述引物对具有SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34的序列，所述探针具有SEQ ID NO:53的序列，并且所述3'阻断寡核苷酸具有SEQ ID NO:40的序列；
p. 所述引物对具有SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36的序列，所述探针具有SEQ ID NO:54的序列，并且所述3'阻断寡核苷酸具有SEQ ID NO:41的序列；
q. 所述引物对具有SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38的序列，所述探针具有SEQ ID NO:55的序列，并且所述3'阻断寡核苷酸具有SEQ ID NO:42的序列；或者
r. 它们的任何组合。
30. 一种具有以下氨基酸序列的引物：SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQID NO:38，或它们的任何组合。
31. 一种具有以下序列的引物组：SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQID NO:14、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30、SEQ IDNO:31和SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36、SEQID NO:37和SEQ ID NO:38，或它们的任何组合。
32. 一种具有SEQ ID NO:43至55中任一者或它们的任何组合的序列的寡核苷酸探针。
33. 一种具有SEQ ID NO:39至42中任一者或它们的任何组合的序列的寡核苷酸。
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