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CN106963946A - 抗tie2抗体及其用途 - Google Patents

抗tie2抗体及其用途 Download PDF

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CN106963946A
CN106963946A CN201611002573.3A CN201611002573A CN106963946A CN 106963946 A CN106963946 A CN 106963946A CN 201611002573 A CN201611002573 A CN 201611002573A CN 106963946 A CN106963946 A CN 106963946A
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G·瑟斯顿
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Original Assignee
Regeneron Pharmaceuticals Inc
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Publication date
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Abstract

本发明提供结合Tie2的抗体及使用所述抗体的方法。根据本发明的某些实施方案，所述抗体是结合人Tie2并且阻断Tie2与一个或多个Tie2配体诸如血管生成素1(Ang1)、血管生成素2(Ang2)、血管生成素3(Ang3)和/或血管生成素4(Ang4)之间的相互作用的完整人抗体。本发明的抗体尤其用于治疗与一种或多种Tie2生物学活性(包括血管发生)相关的疾病或病症。

Description

抗TIE2抗体及其用途
本申请是申请日为2012年8月16日、发明名称为“抗TIE2抗体及其用途”的中国专利申请201280040426.9(国际申请号PCT/US2012/051038)的分案申请。
发明领域
本发明涉及抗体及其抗原结合片段，所述抗体对于人Tie2是特异性的。
背景
血管发生是由此形成新血管的生物学过程。异常的血管发生与严重的疾病包括例如增殖性视网膜病、类风湿关节炎和牛皮癣相关。此外，充分确定血管发生对于肿瘤生长和维持是关键性的。Tie2是单跨膜酪氨酸激酶受体，其已经被定位于形成血管的内皮细胞上并且已经显示出在血管发生中起作用。Tie2配体包括血管生成素(例如Ang1、Ang2、Ang3和Ang4)。在有利于限制或阻断血管发生的环境下，预期阻断Tie2和其配体中的一种或多种之间的相互作用具有有益的治疗作用。
针对Tie2的抗体例如在美国专利号6,365,154和6,376,653中提及。尽管如此，本领域中存在这样的新分子的需要，所述新分子能够结合Tie2，尤其所述新分子是能够阻断Tie2与一种或多种Tie2配体诸如Ang2的相互作用的抗Tie2抗体。此类分子将用于多种治疗和诊断目的。
发明简述
本发明提供结合人Tie2的抗体。本发明的抗体尤其用于抑制Tie2介导的信号传递并用于治疗由Tie2活性和/或信号传递引起的或者与Tie2活性和/或信号传递相关的疾病和病症。根据某些实施方案，本发明的抗体阻断Tie2和Tie2配体中的一种或多种诸如Ang1、Ang2、Ang3和/或Ang4之间的相互作用。
本发明的抗体可以是全长的(例如，IgG1或IgG4抗体)或者可以仅包含抗原结合部分(例如，Fab、F(ab’)2或scFv片段)，并且可以被修饰以影响功能性，例如以消除残留的效应子功能(Reddy等,2000,J.Immunol.164:1925-1933)。
本发明提供与如本文所述的任一示例性抗Tie2抗体具有基本上相同结合特征的抗Tie2抗体。本发明包括产生本文所述的抗Tie2抗体的细胞系。作为非限制性实例，产生示例性抗体H1M2055N和H2aM2760N的细胞系在2011年12月2日在按照布达佩斯条约的条款下保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC),10801University Blvd.,Manassas,Va.20110-2209。已为保藏的细胞系指定以下保藏号：PTA-12295(H1M2055N)和PTA-12296(H2aM2760N)。
本发明提供编码本文所述的示例性抗Tie2抗体的核酸分子。携带本发明的核酸的重组表达载体以及已引入此类载体的宿主细胞也包含在本发明中，所述载体和宿主细胞作为在允许产生抗体的条件下通过培养所述宿主细胞来产生抗体并且回收所产生的抗体的方法。
本发明包括抗体及其抗原结合片段，其包含在任何本文所述的示例性抗Tie2抗体(包括由保藏的细胞系PTA-12295和PTA-12296产生的抗体)内发现的重链和轻链CDR氨基酸序列(HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3)。本发明还包括抗体及其抗原结合片段，其包含在本文所述的任意示例性抗Tie2抗体(包括由保藏的细胞系PTA-12295和PTA-12296产生的抗体)内发现的重链和轻链可变域氨基酸序列(HCVR和LCVR)。
本发明包括本文所述的具有修饰的糖基化模式的任何示例性抗Tie2抗体。在一些应用中，去除不需要的糖基化位点的修饰、或者抗体缺少寡糖链中存在的岩藻糖部分例如以增加抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)功能可以是有用的(见Shield等(2002)JBC 277:26733)。在其他应用中，可以进行半乳糖基化修饰以修饰依赖补体的细胞毒性(CDC)。
在另一方面，本发明提供包含如本文所述的抗Tie2抗体和可药用的载体的药物组合物。在相关方面，本发明描述了组合物，其包含抗Tie2抗体和第二治疗剂的组合。可以有利地与抗Tie2抗体组合的示例性试剂包括但不限于抑制抗Tie2活性的其他试剂(包括其他抗体或其他抗体的抗原结合片段、肽抑制剂、小分子拮抗剂等)和/或干扰Tie2上游或下游信号传递的试剂。
在另一方面，本发明提供使用本发明的抗Tie2抗体或抗体的抗原结合部分来抑制Tie2活性的方法，其中治疗方法包括施用治疗有效量的包含本发明的抗体或抗体的抗原结合片段的药物组合物。所治疗的病症是通过去除、抑制或降低Tie2活性而好转、减轻、抑制或预防的任何疾病或病症。本发明的抗Tie2抗体或抗体片段可以行使阻断Tie2和Tie2结合配偶体(例如，Ang1、Ang2、Ang3和/或Ang4)之间的相互作用或另外行使抑制Tie2的信号传递活性的功能。
本发明还包括本发明的抗Tie2抗体或抗体的抗原结合部分在制造用于在患者中治疗与Tie2活性相关或由Tie2活性引起的疾病或病症的药物中的用途。
在下面详细描述的综述中，其他实施方案将变得显而易见。
附图简述
图1.全长人Tie2和用于定位本发明的抗Tie2抗体的表位的多种缺失构建体的线性描述。构建体上的数字表明与全长Tie2分子(SEQ ID NO:1)相关的构建体的氨基酸边界。
图2.显示血管生成素(hAng1、hAng2、mAng3或hAng4)与用抗Tie2抗体H4H2055N或对照I预处理的包被有hTie2的传感器尖端结合的程度的柱状图。
图3.显示抗Tie2抗体(H4H2055N或对照I)与用100nM的血管生成素(hAng1、hAng2、mAng3或hAng4)预处理的包被有hTie2的传感器尖端结合的程度的柱状图。
图4.图A显示施用抗Tie2抗体H2M2055N(■)或Fc对照(●)后小鼠中的H29肿瘤生长曲线。向下箭头指示处理起始日期。图B显示用抗Tie2抗体H2M2055N或Fc对照处理的小鼠中从处理起始时的肿瘤生长。星号(*)表示p<0.05Mann Whitney非参数双尾t-检验。
图5.在实验结束时在用抗Tie2抗体H2M2055N或Fc对照处理的小鼠中测量的H29肿瘤血管密度。星号(*)表示p<0.05Mann Whitney非参数双尾t-检验。
图6.图A显示施用抗Tie2抗体H2M2055N(■)或Fc对照(●)后小鼠中的Colo305肿瘤生长曲线。向下箭头指示处理起始日期。图B显示用抗Tie2抗体H2M2055N或Fc对照处理的小鼠中从处理起始时的肿瘤生长。星号(*)表示p<0.05Mann Whitney非参数双尾t-检验。
图7.在实验结束时在用抗Tie2抗体H2M2055N或Fc对照处理的小鼠中测量的Colo205肿瘤血管密度。星号(*)表示p<0.05Mann Whitney非参数双尾t-检验。
发明详述
在描述本发明之前，应该理解本发明并不限于所述的具体方法和实验条件，这是由于此类方法和条件可以变化。还应理解本文所用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，并不用于限制，这是由于本发明的范围仅由所附的权利要求来限定。
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有如本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，当用于指具体描述的数值时，术语“约”表示该值与所述值的不同可以不超过1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101以及之间的所有值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
尽管与本文所述的那些方法和材料相似或等同的任何方法和材料均可用于本发明的实施或检测中，但现在描述优选的方法和材料。
定义
除非指定为来自非人物种(例如，“小鼠Tie2”、“小鼠Tie2片段”、“猴Tie2”、“猴Tie2片段”等)，否则如本文所用的表述“Tie2”和“Tie2片段”指人Tie2蛋白或片段。“Tie2片段”是比全长Tie2分子具有更少氨基酸的Tie2的任一部分，并且其能够结合Tie2配体。人Tie2具有SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列。来自非人物种(例如，小鼠、猴、兔、狗、猪等)的Tie2分子的氨基酸序列可获自公共来源诸如GenBank(例如,GenBank保藏号NP_038718.2(小鼠)；NP_001099207.1(大鼠)；等)。
如本文所用，术语“Tie2配体”表示与Tie2蛋白相互作用以在体内传递生物学信号的蛋白质。术语“Tie2配体”包括任何血管生成素，包括例如Ang1、Ang2、Ang3和/或Ang4。如本文所用，术语“Ang1”表示包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的蛋白质、或者能够与Tie2相互作用的所述蛋白质的部分。如本文所用，术语“Ang2”表示包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的蛋白质、或者能够与Tie2相互作用的所述蛋白质的部分。如本文所用，术语“Ang3”表示包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的蛋白质、或者能够与Tie2相互作用的部分。如本文所用，术语“Ang4”表示包含如SEQ ID NO:18所述的氨基酸序列的蛋白质、或者能够与Tie2相互作用的所述蛋白质的部分。
如本文所用，术语“抗体”意指包含四条多肽链，即由二硫键相互连接的两条重(H)链和两条轻(L)链的免疫球蛋白分子，以及其多聚体(例如IgM)。每一重链包含重链可变区(本文缩写为HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域CH1、CH2和CH3。每一轻链包含轻链可变区(本文缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域(CL1)。VH和VL区可以进一步细分为称为互补决定区(CDR)的高变区，其散布于更保守的称为构架区(FR)的区域中。每个VH和VL由三个CDR和四个FR构成，从氨基端向羧基端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本发明的不同实施方案中，抗Tie2抗体(或其抗原结合部分)的FR可以与人种系序列相同，或者可以是经天然或人工修饰的序列。氨基酸共有序列可以基于两个或多个CDR的并行分析来确定。
如本文所用，术语“抗体”还包括完整抗体分子的抗原结合片段。如本文所用，术语抗体的“抗原结合部分”、抗体的“抗原结合片段”等包括任何天然存在的、酶促获得的、合成的、或基因工程多肽或糖蛋白，其特异地结合抗原以形成复合体。例如可以使用合适的标准技术诸如蛋白酶解消化或重组基因工程技术(涉及编码抗体可变域及任选恒定域的DNA的操作和表达)从完整抗体分子中产生抗体的抗原结合片段。此类DNA是已知的和/或者容易地从例如商业来源、DNA文库(包括例如，噬菌体抗体文库)获得，或者可以合成。DNA是可以测序的并使用化学方法来操作或者通过使用分子生物学技术例如，以将一个或多个可变域和/或恒定域排列成合适的构型，或者引入密码子、产生半胱氨酸残基、修饰、增加或删除氨基酸等。
抗原结合片段的非限制性实例包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab')2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)单链Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；和(vii)由氨基酸残基组成的最小识别单位，其模拟抗体的高变区(例如，分离的互补决定区(CDR)诸如CDR3肽)、或受限的FR3-CDR3-FR4肽。其他经改造的分子诸如结构域特异性抗体、单结构域抗体、结构域缺失的抗体、嵌合抗体、CDR移植抗体、双抗体、三抗体、四抗体、微体、纳米抗体(nanobody)(例如单价纳米抗体、二价纳米抗体等)、小模块免疫药物(SMIPs)和鲨鱼可变IgNAR结构域，也包含于如本文所用的表述“抗原结合片段”中。
抗体的抗原结合片段将通常包含至少一个可变域。可变域可以是任意大小或者氨基酸组成，并且将通常包含至少一个CDR，其与一个或多个构架区序列相邻或与其处在框内。在具有结合VL结构域的VH结构域的抗原结合片段中，VH和VL结构域可以以任何合适的排列方式彼此排列。例如，可变区可以是二聚的并且含有VH-VH、VH-VL或VL-VL二聚体。或者，抗体的抗原结合片段可以含有单体VH或VL结构域。
在某些实施方案中，抗体的抗原结合片段可以含有与至少一个恒定域共价连接的至少一个可变域。可以在本发明的抗体的抗原结合片段内发现的可变域和恒定域的非限制性、示例性构型包括：(i)VH-CH1；(ii)VH-CH2；(iii)VH-CH3；(iv)VH-CH1-CH2；(v)VH-CH1-CH2-CH3；(vi)VH-CH2-CH3；(vii)VH-CL；(viii)VL-CH1；(ix)VL-CH2；(x)VL-CH3；(xi)VL-CH1-CH2；(xii)VL-CH1-CH2-CH3；(xiii)VL-CH2-CH3；和(xiv)VL-CL。在可变域和恒定域的任一构型中，包括上文列出的任一示例性构型中，可变域和恒定域可以彼此直接连接或者可以通过完整的或部分的铰链区或接头区来连接。铰链区可以由至少2个(例如，5、10、15、20、40、60或更多个)氨基酸组成，所述氨基酸在单个多肽分子内的邻近的可变域和/或恒定域之间产生柔性的或半柔性的连接。此外，本发明的抗体的抗原结合片段可以包含上文列出的任一可变域和恒定域构型的同型二聚体或异二聚体(或其他多聚体)，其中所述可变域和恒定域彼此之间非共价连接和/或与一个或多个单体VH或VL结构域(例如通过一个或多个二硫键)非共价连接。
关于完整的抗体分子，抗原结合片段可以是单特异性的或多特异性的(例如，双特异性的)。抗体的多特异性抗原结合片段通常将包含至少两个不同的可变域，其中每一可变域能够特异地结合单独的抗原或同一抗原上的不同表位。可以使用本领域中可用的常规技术，使任何多特异性抗体形式(包括本文所公开的示例性双特异性抗体形式)适用于本发明的抗体的抗原结合片段的背景中。
本发明的抗体可以通过依赖补体的细胞毒性(CDC)或依赖抗体的细胞毒性(ADCC)行使功能。“依赖补体的细胞毒性”(CDC)指在补体存在的情况下，本发明的抗体裂解抗原表达细胞。“依赖抗体的细胞毒性”(ADCC)指细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如,天然杀伤(NK)细胞、中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上结合的抗体并由此导致靶细胞的裂解。可以使用本领域熟知并可用的测定法来测量CDC和ADCC。(参见例如,U.S.5,500,362和5,821,337,和Clynes等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)95:652-656)。抗体的恒定区对抗体固定补体并介导依赖细胞的细胞毒性的能力是重要的。因此，可以基于抗体的同种型是否对于抗体介导细胞毒性是需要的来选择所述同种型。
如本文所用，术语“人抗体”意在包括具有源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明的人抗体可以包括例如在CDR中尤其在CDR3中且不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机诱变或定点诱变或通过体内体细胞突变引入突变)。然而，如本文所用，术语“人抗体”并不意在包括这样的抗体，其中来源于另一哺乳动物物种诸如小鼠的种系的CDR序列已经移植至人构架序列上。
如本文所用，术语“重组人抗体”意在包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的所有的人抗体，诸如使用转染入宿主细胞内的重组表达载体表达的抗体(下文进一步描述)，从重组、组合的人抗体文库分离的抗体(下文进一步描述)，从用人免疫球蛋白基因转基因的动物(例如，小鼠)分离的抗体(例如参见Taylor等(1992)Nucl.Acids Res.20:6287-6295)或通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪切为其他DNA序列的任何其他方法制备、表达、产生或分离的抗体。此类重组人抗体具有源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。在某些实施方案中，然而，将此类重组人抗体进行体外诱变(或者，当使用了用人Ig序列进行转基因的动物时，为体内体细胞诱变)，因此该重组抗体的VH和VL区域的氨基酸序列是这样的序列，尽管来源于人种系VH和VL序列或与人种系VH和VL序列相关，但所述氨基酸序列并不天然存在于体内人抗体种系所有组成成分中。
人抗体可以以与铰链异质性(hinge heterogeneity)相关的两种形式存在。在一种形式中，免疫球蛋白分子包含大约150-160kDa的稳定的四链构建体，其中二聚体通过链间重链二硫键结合在一起。在第二种形式中，二聚体并不经链间的二硫键连接，而是形成由共价偶联的轻链和重链构成的约75-80kDa的分子(半抗体)。这些形式即使在亲和纯化后仍极难进行分离。
在多种完整IgG同种型中出现第二种形式的概率是由于但不限于与抗体的铰链区同种型相关的结构差异。在人IgG4铰链的铰链区内的单个氨基酸取代能够将第二种形式的出现(Angal等(1993)Molecular Immunology 30:105)显著减少至使用人IgG1铰链通常观察到的水平。本发明包括在铰链区、CH2或CH3区内具有一个或多个突变的抗体，所述突变可以是所希望的，例如在生产中用于提高想要的抗体形式的产量。
如本文所用，“分离的抗体”表示已经从它的天然环境的至少一种组分中鉴定并分离和/或回收的抗体。例如，已经与生物的至少一种组分分离或将生物的至少一种组分除去的抗体、或者从抗体天然存在或天然产生的组织或细胞中分离或除去的抗体是用于本发明的目的的“分离的抗体”。分离的抗体还包括在重组细胞内的原位抗体。分离的抗体是已经进行至少一个纯化或分离步骤的抗体。根据某些实施方案，分离的抗体可以基本上不含其他细胞物质和/或化学品。
术语“特异地结合”等表示抗体或其抗原结合片段与抗原形成在生理条件下相对稳定的复合体。用于确定抗体是否特异地结合抗原的方法是本领域众所周知的，并且包括例如平衡透析、表面等离振子共振等等。例如，如在本发明的上下文中所用，“特异地结合”人Tie2的抗体包括以如在表面等离振子共振测定中测量的以以下KD结合人Tie2或其部分的抗体：少于约1000nM、少于约500nM、少于约300nM、少于约200nM、少于约100nM、少于约90nM、少于约80nM、少于约70nM、少于约60nM、少于约50nM、少于约40nM、少于约30nM、少于约20nM、少于约10nM、少于约5nM、少于约4nM、少于约3nM、少于约2nM、少于约1nM或少于约0.5nM。(参见，例如实施例2，本文)。然而，特异地结合人Tie2的分离的抗体可以与其他抗原诸如来自其他(非人)物种的Tie2分子具有交叉反应性。
如本文所用，“中和性”或“抑制性”抗体意指这样的抗体，其与Tie2的结合：(i)干扰Tie2或Tie2片段和Tie2配体(例如，血管生成素)之间的相互作用，和/或(ii)导致抑制Tie2的至少一种生物学功能。由Tie2中和性抗体或抑制性抗体引起的抑制并不需要是完全的，只要它使用合适的测定法能检测到即可。在本文描述了用于检测TIE2抑制的示例性测定。
与抗体来源的所对应的种系序列相比，本文公开的抗Tie2抗体可以包含在重链和轻链可变域的构架区和/或CDR区中的一个或多个氨基酸取代、插入和/或缺失。通过比较本文公开的氨基酸序列与例如从自公共抗体序列数据库中获得的种系序列可以容易地确定此类突变。本发明包括抗体及所述抗体的抗原结合片段，其来源于本文公开的任一氨基酸序列，其中将一个或多个构架区和/或CDR区内的一个或多个氨基酸突变至抗体来源的种系序列的对应残基、或者突变至另一人种系序列的对应残基、或者突变至对应种系残基的保守氨基酸取代物(此类序列改变在本文中共同称为“种系突变”)。本领域的普通技术人员从本文公开的重链和轻链可变区序列开始，能够容易地产生包含一个或多个单个种系突变或其组合的大量抗体和抗原结合片段。在某些实施方案中，将在VH和/或VL结构域内的所有构架和/或CDR残基突变回在抗体来源的原始种系序列中发现的残基。在其他实施方案中，仅将某些残基突变回原始种系序列，例如，仅突变在FR1的前8个氨基酸内或在FR4的最后8个氨基酸内发现的突变残基，或者仅突变在CDR1、CDR2或CDR3内发现的突变残基。在其他实施方案中，将一个或多个构架和/或CDR残基突变为不同种系序列(即，与抗体原始来源的种系序列不同的种系序列)所对应的残基。此外，本发明的抗体可以含有在构架区和/或CDR区内的两个或多个种系突变的任意组合，例如，其中将某些单独的残基突变为特定种系序列的对应残基，而将与原始种系序列不同的某些其他残基保持或突变为不同种系序列的对应残基。一旦获得后，由于一种或多种想要的特性，诸如，提高的结合特异性、增加的结合亲和力、提高的或增强的拮抗或对抗生物学特性(由于可能是该情况)、降低的免疫原性等，就能够容易地检测含有一个或多个种系突变的抗体和抗原结合片段。以这种一般方式获得的抗体和抗原结合片段包含于本发明中。
本发明还包括这样的抗Tie2抗体，相比于本文公开的示例性抗Tie2抗体内发现的HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列，所述抗Tie2抗体包含具有一个或多个保守性取代的变体。例如，本发明包括这样的抗Tie2抗体，相对于本文公开的抗Tie2抗体的任一HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列，所述抗Tie2抗体具有例如10个或更少、8个或更少、6个或更少、4个或更少等保守氨基酸取代的HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列。
如本文所用，术语“表面等离振子共振”指通过例如使用BIAcoreTM系统(GEHealthcare的Biacore Life Sciences部门,Piscataway,NJ)来检测生物传感器基质内的蛋白质浓度改变从而允许分析实时相互作用的光学现象。
如本文所用，术语“KD”意指特定抗体-抗原相互作用的平衡解离常数。
术语“表位”指与抗体分子可变区内的特定抗原结合位点(称为互补位)相互作用的抗原决定簇。单一抗原可以具有多于一个表位。因此，不同抗体可以结合抗原上的不同区域并且可以具有不同的生物效应。表位可以是构象性的或线性的。构象表位由来自线性多肽链不同区段的且在空间上并列的氨基酸产生。线性表位是由多肽链中相邻的氨基酸残基产生的表位。在某些情况下，表位可以包括抗原上的糖、磷酰基或磺酰基部分。
当指核酸或其片段时，术语“基本同一性”或“基本上相同的”表示当与另一核酸(或它的互补链)最优比对适合的核苷酸插入或缺失时，如通过下文所讨论的任一众所周知的序列同一性算法诸如FASTA、BLAST或Gap所测量的，在至少约95％、并且更优选至少约96％、97％、98％或99％的核苷酸碱基中存在核苷酸序列同一性。在某些情况下，与参考核酸分子具有基本上相同的核酸分子可以编码与由参考核酸分子编码的多肽具有相同或基本上相似的氨基酸序列的多肽。
当应用于多肽时，术语“基本相似性”或“基本上相似的”表示当通过诸如程序GAP或BESTFIT使用默认空位权重进行最优比对时，两条肽序列具有至少95％的序列同一性，甚至更优选至少98％或99％的序列同一性。优选地，不相同的残基位置通过保守氨基酸取代而不同。“保守氨基酸取代”是这样的取代，其中一个氨基酸残基由具有相似化学性质(例如，电荷或疏水性)的侧链(R基团)的另一个氨基酸残基所取代。一般而言，保守氨基酸取代将基本上不会改变蛋白质的功能性质。在两条或多条氨基酸序列由于保守取代而彼此不同的情况下，百分比序列同一性或相似度可以向上调整以校正取代的保守性质。进行这种调整的方法对于本领域技术人员是熟知的。参见例如,Pearson(1994)Methods Mol.Biol.24:307-331。具有相似化学性质的氨基酸组的实例包括(1)脂肪族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；(2)脂肪族-羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；(3)含酰胺的侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；(4)芳族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；(5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；(6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸以及(7)含硫的侧链：半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸取代组为：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸以及天冬酰胺-谷氨酰胺。备选地，保守替换是在Gonnet等(1992)Science 256:1443-1445中公开的PAM250log可能性矩阵中具有正值的任何改变。“适度保守的”替换是在PAM250log可能性矩阵中具有非负值的任何改变。
多肽的序列相似性，也称为序列同一性，一般使用序列分析软件来测量。蛋白质分析软件使用分配至多种取代、缺失和其他修饰(包括保守氨基酸取代)的相似性测量匹配相似的序列。例如，GCG软件含有程序诸如Gap和Bestfit，其可以使用默认参数来确定紧密相关的多肽诸如来自不同生物物种的同源多肽之间或者野生型蛋白质与其突变蛋白质之间的序列同源性或序列同一性。例如，参见GCG版本6.1。还可以使用FASTA(GCG版本6.1中的程序)并使用默认或推荐参数比较多肽序列。FASTA(例如,FASTA2和FASTA3)提供了在查询和搜索序列之间最佳重叠区域的比对和百分比序列同一性(Pearson(2000)，上文)。当比较本发明的序列与含有来自不同生物的大量序列的数据库时，另一个优选算法是计算机程序BLAST，尤其是BLASTP或TBLASTN，同时使用默认参数。参见，例如Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403-410和Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-402。
抗体的生物学特征
本发明包括阻断Tie2和Tie2配体之间的相互作用的抗体。如本文所用，表述“阻断Tie2和Tie2配体之间的相互作用”表示在可以检测和/或定量Tie2和Tie2配体之间的物理相互作用的测定中，加入本发明的抗体使Tie2和Tie2配体(例如，Ang1、Ang2、Ang3和/或Ang4)之间的相互作用减弱了至少50％。在本文实施例5中说明了可以用于确定抗体是否阻断人Tie2和Tie2配体之间的相互作用的非限制性、示例性测定。在该测定形式的一个示例性实施方案中，将抗体与Tie2蛋白混合，并随后将抗体/Tie2混合物应用到包被有Tie2配体(在这种情况下为Ang2蛋白)的表面上。洗去未结合的分子后，测量结合到包被有Ang2的表面上的Tie2的量。通过在该测定形式中使用不同量的抗体，可以计算出阻断50％的Tie2与Ang2结合所需的抗体量并且将其表示为IC50值。该测定形式可以反过来，以便将Tie2包被到表面上，将抗体加入到包被有Tie2的表面上，洗去未结合的抗体，随后将Tie2配体加入到经抗体处理的Tie2表面上。本发明包括这样的抗Tie2抗体，当在如实施例5中所示的Tie2/Tie2配体结合测定中或基本上相似的测定中测试时，所述抗Tie2抗体显示出低于约100nM的IC50。例如，本发明包括这样的抗Tie2抗体，当在如实施例5中所示的Tie2/Tie2配体结合测定中或基本上相似的测定中测试时，所述抗Tie2抗体显示出低于约100、90、80、70、60、50、40、30、20、19、18、17、16、15、14、12、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.5、0.4、0.3或0.2nM的IC50。
在本文实施例6中说明了可以用于确定抗体是否阻断人Tie2和Tie2配体之间的相互作用的另一测定形式。在该测定形式中，使用这样的细胞系，其被改造以在其表面上表达人Tie2，并且所述细胞系还包括报道基因构建体，当Tie2与Tie2配体相互作用时所述报道基因构建体产生待表达的可检测信号。用抗Tie2抗体并用Tie2配体处理被改造的细胞，并且测量报道基因信号。在该测定形式中通过使用不同量的抗体，可以计算出抑制50％的报道基因信号(在不存在抗体的情况下观察到的)所需的抗体量并且表示为IC50值。本发明包括这样的抗Tie2抗体，当在如实施例6中所示的Tie2/Tie2配体结合测定中或基本上相似的测定中测试时，所述抗Tie2抗体显示出低于约20nM的IC50。例如，本发明包括这样的抗Tie2抗体，当在如实施例6中所示的Tie2/Tie2配体结合测定中或基本上相似的测定中测试时，所述抗Tie2抗体显示出低于约20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.5、0.4、0.3、0.2或0.1nM的IC50。
表位定位和相关技术
人Tie2蛋白含有以下结构域：Ig1结构域、Ig2结构域、EGF重复结构域、Ig3结构域、纤连蛋白重复(FN)结构域(包括FN1、FN2和FN3)。这些结构域图示地显示于图1中。本发明包括特异地结合一个或多个以下区域内的表位的抗Tie2抗体：(a)Ig1-Ig2-EGF结构域(SEQID NO:7)；(b)Ig2-EGF结构域(SEQ ID NO:8)；(c)EGF结构域(SEQ ID NO:9)；(d)Ig3-FN结构域(SEQ ID NO:10)；和/或(e)FN结构域(SEQ ID NO:11)。(参见实施例3和4)。
根据某些实施方案，本发明提供与Tie2的Ig1和/或Ig2结构域内发现的一个或多个氨基酸相互作用的抗Tie2抗体。表位可以由一条或多条3个或更多个(例如，3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个)氨基酸的连续序列组成，所述氨基酸位于Tie2的Ig1和/或Ig2结构域内。备选地，表位可以由位于Tie2的Ig1和/或Ig2结构域内的多个非连续氨基酸(或氨基酸序列)组成。根据本发明的某些实施方案，提供与位于一个或多个氨基酸区段内的一个或多个氨基酸相互作用的抗Tie2抗体，所述氨基酸区段选自：SEQ ID NO:7的氨基酸96-106，SEQ ID NO:7的氨基酸139-152以及SEQ ID NO:7的氨基酸166-175。例如，本发明包括与前述区段的每一个(即，在SEQ ID NO:7的氨基酸96-106、139-152和166-175内的每一个)内的至少一个氨基酸相互作用的抗Tie2抗体。根据本发明的某些实施方案，与SEQ ID NO:7的氨基酸139-152和/或166-175相互作用的抗体能够阻断Tie2和一个或多个Tie2配体诸如例如Ang2之间的相互作用(参见实施例4-6，本文)。
可以使用本领域普通技术人员已知的多种技术来确定抗体是否与多肽或蛋白质内的“一个或多个氨基酸相互作用”。示例性技术包括例如常规交叉阻断测定诸如Antibodies,Harlow和Lane(Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harb.,NY)描述的，丙氨酸扫描突变分析，肽印记分析(Reineke,2004,Methods Mol Biol 248:443-463)和肽切割分析。此外，可以使用方法诸如表位切除、表位提取和抗原的化学修饰(Tomer,2000,Protein Science 9:487-496)。可用于鉴定与抗体相互作用的多肽内的氨基酸的另一种方法是由质谱分析法检测氢/氘交换。(参见，例如实施例4，本文)。在一般术语中，氢/氘交换方法涉及用氘标记目标蛋白，随后使抗体结合到氘标记的蛋白质上。随后，将蛋白质/抗体复合体转移到水中，以允许除由抗体保护的残基(其保持为氘标记的)之外的所有残基上发生氢-氘交换。抗体解离后，对目标蛋白进行蛋白酶切割和质谱分析，由此揭示氘标记的残基，其对应于与抗体相互作用的特异性氨基酸。参见，例如,Ehring(1999)AnalyticalBiochemistry 267(2):252-259；Engen和Smith(2001)Anal.Chem.73:256A-265A。
本发明包括与本文所述的任何特异示例性抗体(例如，抗体H1M2055N和H2aM2760N，分别从保藏的细胞系PTA-12295和PTA-12296中产生)结合相同表位的抗Tie2抗体。同样，本发明还包括与本文所述的任何特异示例性抗体(例如，抗体H1M2055N和H2aM2760N，分别从保藏的细胞系PTA-12295和PTA-12296中产生)竞争结合Tie2或Tie2片段的抗Tie2抗体。
技术人员可以通过使用本领域已知的常规方法容易地确定抗体结合的表位是否与参考抗Tie2抗体结合的表位相同或与参考抗Tie2抗体结合的表位竞争结合。例如，为了确定检测抗体结合的表位是否与参考抗Tie2抗体结合的表位相同，允许参考抗体在饱和条件下结合Tie2蛋白或肽。随后，评估检测抗体结合Tie2分子的能力。如果在参考抗Tie2抗体饱和结合Tie2后，检测抗体能够结合Tie2，则可以推定该检测抗体结合的表位不同与参考抗Tie2抗体结合的表位。另一方面，如果在参考抗Tie2抗体饱和结合Tie2后，检测抗体不能够结合Tie2分子，那么有可能该检测抗体结合的表位与本发明的参考抗Tie2抗体所结合的表位相同。随后可以进行额外的常规实验法(例如肽突变和结合分析)来证实没有观察到检测抗体的结合是否实际上是由于所述检测抗体与参考抗体结合相同表位，或者是否是由于空间位阻(steric blocking)(或另一现象)导致没有观察到结合。这类实验可以使用ELISA、RIA、Biacore、流式细胞术或本领域中可用的任何其他定量或定性抗体结合测定法来进行。根据本发明的某些实施方案，如在竞争性结合测定中测量到的，如果例如1、5、10、20、或100倍过量的一种抗体抑制了另一种抗体的至少50％，但优选75％、90％或甚至99％的结合，则两种抗体结合相同(或重叠)的表位(参见，例如,Junghans等,Cancer Res.1990:50:1495-1502)。备选地，如果抗原中降低或消除一种抗体的结合的基本上所有氨基酸突变降低或消除了另一种抗体的结合，则认为两种抗体结合相同的表位。如果仅仅降低或消除一种抗体的结合的一组氨基酸突变降低或消除了另一种抗体的结合，则认为两种抗体具有“重叠的表位”。
为了确定抗体是否与参考抗Tie2抗体竞争结合，在两个方向上进行上述的结合方法：在第一方向上，允许参考抗体在饱和条件下结合Tie2分子，随后评估检测抗体与Tie2分子的结合。在第二方向上，允许检测抗体在饱和条件下结合Tie2分子，随后评估参考抗体与Tie2分子的结合。如果在两个方向上仅有第一(饱和)抗体能够结合Tie2分子，那么推定检测抗体和参考抗体竞争结合Tie2。如本领域普通技术人员将理解的，与参考抗体竞争结合的抗体可以不必结合与参考抗体相同的表位，但可以通过结合重叠的表位或邻近的表位而在空间上阻断参考抗体的结合。
人抗体的制备
用于产生单克隆抗体包括完全人单克隆抗体的方法是本领域已知的。任何此类已知方法可以用于本发明的上下文中，以产生特异地结合人Tie2的人抗体。
使用VELOCIMMUNETM技术或用于产生单克隆抗体的任何其他已知方法，最初分离具有人可变区和小鼠恒定区的高亲和力抗Tie2嵌合抗体。如同在下文的实验部分中，表征抗体并选择所需的特征，包括亲和力、选择性、表位等。用想要的人恒定区替换小鼠恒定区，以产生本发明的完全人抗体，例如野生型或经修饰的IgG1或IgG4。尽管选择的恒定区可以根据特定的用途而变化，但高亲和力抗原结合及靶特异性特征存在于可变区中。
生物等效性本发明的抗Tie2抗体和抗体片段包括具有这样的氨基酸序列的蛋白质，所述氨基酸序列与所描述的抗体的氨基酸序列不同但保留结合人Tie2能力。当与亲本序列比较时，此类变异抗体和抗体片段包含一个或多个氨基酸的添加、缺失或取代，但显示出与所述抗体的生物学活性基本上等同的生物学活性。同样，本发明的编码抗Tie2抗体的DNA序列包括这样的序列，当与公开的序列比较时，所述序列包含一个或多个核苷酸的添加、缺失或取代，但编码与本发明的抗Tie2抗体或抗体片段基本上生物等效的抗Tie2抗体或抗体片段。
如果例如两种抗原结合蛋白或抗体是药物等同物或者药物替代品，当在相似实验条件(单一剂量或多次剂量)下以相同摩尔剂量施用时，所述两种结合抗原蛋白质或抗体的吸收率和程度没有显示出显著差异，认为它们具有生物等效性。如果一些抗体在吸收程度而非吸收率上等同，那么它们将被认为是等同物或者药物替代品，并且仍可以认为是生物等效的，这是由于在吸收率中的此类差异是有意为之的并且反映在标签中，所述差异对于例如在长期使用上达到有效机体药物浓度并不是必需的，并且认为在医学上对所研究的特定药品并不重要。
在一个实施方案中，如果两种抗原结合蛋白在其安全性、纯度和潜能中没有临床上有意义的差异，那么它们具有生物等效性。
在一个实施方案中，如果患者可以在参考制品和生物制品之间转换一次或多次，与不进行此类转换的持续治疗相比，所述转换不存在副作用(包括免疫原性中的临床上显著变化或降低的有效性)风险的预期增加，那么所述参考制品和生物制品具有生物等效性。
在一个实施方案中，如果两种抗原结合蛋白均在条件或使用条件下通过共同的机制或作用机制起作用至此类机制已知的程度，那么它们具有生物等效性。
生物等效性可以通过体内和体外方法来证明。生物等效性测量包括例如(a)人或其他哺乳动物中的体内检测，其中将血液、血浆、血清或其他生物流体中的抗体或其代谢物的浓度测量为时间函数；(b)体外检测，其已经与人体内生物利用率数据相关并且合理地预测人体内生物利用率数据；(c)人或其他哺乳动物中的体内检测，其中将抗体(或其靶标)的合适的急性药理作用测量为时间函数；和(d)在完全受控的临床试验中，所述临床试验建立抗体的安全性、效力、生物利用率或生物等效性。
本发明的抗Tie2抗体的生物等效变体可以通过例如进行残基或序列的多种取代或者缺失对于生物学活性非必需的末端或内部残基或序列来构建。例如，对于生物学活性非必需的半胱氨酸残基可以被缺失或用其他氨基酸替换，来防止在复性后形成非必要的或不正确的分子内二硫键。在其他上下文中，生物等效抗体可以包括这样的抗Tie2抗体变体，其包含修饰了抗体的糖基化特征的氨基酸改变，例如消除或去除糖基化的突变。
物种选择性和物种交叉反应性
根据本发明的某些实施方案，抗Tie2抗体结合人Tie2但不结合来自其他物种的Tie2。本发明还包括结合人Tie2和来自一种或多种非人物种的Tie2的抗Tie2抗体。例如，本发明的抗Tie2抗体可以特异地结合人Tie2以及结合啮齿动物Tie2(例如，来自小鼠或大鼠的Tie2)。可以用于确定抗体是否特异地结合小鼠Tie2的示例性构建体是具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的构建体；可以用于确定抗体是否特异地结合大鼠Tie2的示例性构建体是具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的构建体。使用这些构建体来评估抗Tie2抗体的结合显示于本文实施例2中。
免疫连接物
本发明包括缀合有治疗部分(“免疫连接物”)诸如细胞毒素、化疗药物、免疫抑制剂或放射性同位素的抗Tie2单克隆抗体。细胞毒性剂包括对细胞有害的任何试剂。用于形成免疫连接物的合适的细胞毒性剂和化学治疗剂的实例是本领域已知的(例如参见WO 05/103081)。
多特异性抗体
本发明的抗体可以是单特异性的、双特异性的或多特异性的。多特异性抗体可以对一种目标多肽的不同表位是特异的，或者可以含有对多于一种目标多肽特异的抗原结合域。参见，例如，Tutt等,1991,J.Immunol.147:60-69；Kufer等,2004,TrendsBiotechnol.22:238-244。本发明的抗Tie2抗体可以与另一种功能分子，例如另一种肽或蛋白质连接或共表达。例如，抗体或其片段可以与一种或多种其他分子实体，诸如另一种抗体或抗体片段功能性连接(例如，通过化学偶联、基因融合、非共价连接或其他方式)，以产生具有第二结合特异性的双特异性或多特异性抗体。例如，本发明包括双特异性抗体，其中免疫球蛋白的一条臂对于人Tie2或其片段是特异性的，并且该免疫球蛋白的另一条臂对于第二治疗靶标是特异性的或者连接到治疗部分诸如胰蛋白酶抑制剂上。
可以用于本发明的上下文中的示例性双特异性抗体形式涉及使用第一免疫球蛋白(Ig)CH3结构域和第二Ig CH3结构域，其中第一和第二Ig CH3结构域由于至少一个氨基酸而彼此不同，并且其中与缺少氨基酸差异的双特异性抗体相比，至少一个氨基酸差异减弱了双特异性抗体与蛋白A的结合。在一个实施方案中，第一Ig CH3结构域结合蛋白A，并且第二Ig CH3结构域含有减弱或消除蛋白A结合的突变，诸如H95R修饰(由IMGT外显子编号；由EU编号为H435R)。第二CH3可以进一步包含Y96F修饰(由IMGT外显子编号；由EU编号为Y436F)。可以在第二CH3中发现的其他修饰包括：在IgG1抗体的情况下，D16E、L18M、N44S、K52N、V57M和V82I(由IMGT外显子编号；由EU编号为D356E、L358M、N384S、K392N、V397M和V422I)；在IgG2抗体的情况下，N44S、K52N和V82I(IMGT；由EU编号为N384S、K392N和V422I)；并且在IgG4抗体的情况下，Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q和V82I(由IMGT外显子编号；由EU编号为Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q和V422I)。考虑上文描述的双特异性抗体形式中的变异在本发明的范围内。
治疗制剂和施用
本发明提供包含本发明的抗Tie2抗体或其抗原结合片段的药物组合物。将本发明的药物组合物与合适的载体、赋形剂及提供改善的转移、递送、耐受等的其他试剂一起配制。多种适合的制剂可以在所有药剂师已知的处方中发现：Remington's PharmaceuticalSciences,Mack Publishing Company,Easton,PA。这些制剂包括例如粉剂、糊剂、软膏、凝胶剂、蜡、油、脂质、含有小泡(诸如LIPOFECTINTM)的脂质(阳离子的或阴离子的)、DNA缀合物、无水吸收糊剂、水包油和油包水乳剂、乳剂碳蜡(多种分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶、和含有碳蜡的半固体混合物。还参见Powell等"Compendium of excipients forparenteral formulations"PDA(1998)J Pharm Sci Technol 52:238-311。
向患者施用的抗体剂量可以根据患者的年龄和尺寸、目标疾病、状况、施用途径等而变化。通常根据体重或体表面积计算优选的剂量。当将本发明的抗体用于在成年患者中治疗与Tie2活性相关的病症或疾病时，以下可能是有利的：一般以约0.01至约20mg/kg体重，更优选约0.02至约7mg/kg，约0.03至约5mg/kg或约0.05至约3mg/kg体重的单次剂量静脉内施用本发明的抗体。根据病症的严重性，可以调整治疗的频率和持续时间。施用Tie2抗体的有效剂量和时间表可以根据经验来确定；例如，可以通过定期评估监测患者病程，并相应地调整剂量。此外，可以使用本领域中众所周知的方法进行剂量的种间类推(例如,Mordenti等,1991,Pharmaceut.Res.8:1351)。
多种递送系统是已知的并且可用于施用本发明的药物组合物，例如，脂质体中封装、微粒、微胶囊、能够表达突变病毒的重组细胞、受体介导的内吞作用(参见，例如,Wu等,1987,J.Biol.Chem.262:4429-4432)。导入的方法包括但不限于真皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和口服途径。组合物可以通过任何常规途径施用，例如通过输注或团注、通过上皮或皮肤粘膜(例如，口腔粘膜、直肠粘膜和肠粘膜等)施用，并可以与其他生物学上有活性的试剂一同施用。施用可以是全身性的或局部的。
本发明的药物组合物可以用标准针和注射器经皮下或静脉内递送。此外，在皮下递送方面，笔式递送(pen delivery)设备容易地应用于递送本发明的药物组合物。此类笔式递送设备可以是重复使用的或一次性的。重复使用的笔式递送设备一般利用含有药物组合物的可更换药筒。一旦药筒内的所有药物组合物已施用并且药筒排空，则可以将空药筒容易地丢弃并替换为含有药物组合物的新药筒。随后笔式递送设备可以再次使用。在一次性笔式递送设备中，不存在可替换的药筒。相反，一次性笔式递送设备预先装填有保存在设备内的储存器中的药物组合物。一旦储存器排空药物组合物，则将整个设备丢弃。
大量的重复使用的笔式递送设备和自动注射器递送设备应用于本发明的药物组合物的皮下递送中。这样的实例包括但不限于AUTOPENTM(Owen Mumford,Inc.,Woodstock,UK)、DISETRONICTM笔(Disetronic Medical Systems,Bergdorf,Switzerland)、HUMALOGMIX 75/25TM笔、HUMALOGTM笔、HUMALIN 70/30TM笔(Eli Lilly and Co.,Indianapolis,IN)、NOVOPENTM I、II和III(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)、NOVOPEN JUNIORTM(NovoNordisk,Copenhagen,Denmark)、BDTM笔(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)、OPTIPENTM、OPTIPEN PROTM、OPTIPEN STARLETTM和OPTICLIKTM(sanofi-aventis,Frankfurt,Germany)，仅举几例。应用于本发明的药物组合物的皮下递送的一次性笔式递送设备的实例包括但不限于SOLOSTARTM笔(sanofi-aventis)、FLEXPENTM(Novo Nordisk)、KWIKPENTM(Eli Lilly)、SURECLICKTM Autoinjector(Amgen,Thousand Oaks,CA)、PENLETTM(Haselmeier,Stuttgart,Germany)、EPIPEN(Dey,L.P.)和HUMIRATM Pen(Abbott Labs,Abbott Park IL)，仅举几例。
在某些情况下，药物组合物可以在控释系统中递送。在一个实施方案中，可以使用泵(参见Langer,上文；Sefton,1987,CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201)。在另一个实施方案中，可以使用聚合材料；参见Medical Applications of Controlled Release,Langer和Wise(eds.),1974,CRC Pres.,Boca Raton,Florida。在另一个实施方案中，可以将控释系统置于组合物靶标的附近，因而仅需要全身剂量的一部分(参见，例如，Goodson,1984,inMedical Applications of Controlled Release,上文,vol.2,pp.115-138)。其他控释系统在Langer,1990,Science 249:1527-1533的综述中进行了讨论。
注射剂可以包括用于静脉内、皮下、皮内和肌内注射、滴注等的剂量形式。这些注射剂可以通过公众已知的方法来制备。例如，注射剂可以这样制备：例如，通过上文描述的抗体或其盐在常规用于注射的无菌水介质或油介质中溶解、悬浮或乳化。作为注射用的水介质，例如，包含生理盐水、含有葡萄糖和其他助剂的等渗溶液等，所述水介质可以与适合的增溶剂诸如醇(例如，乙醇)、多元醇(例如，丙二醇、聚乙二醇)、非离子型表面活性剂[例如,聚山梨酯80,HCO-50(氢化蓖麻油的聚氧乙烯(50mol)加合物)]等组合使用。作为油介质，可以使用例如芝麻油、大豆油等，所述油介质可以与增溶剂诸如苯甲酸苄酯、苯甲醇等组合使用。如此制备的注射剂优选装入适合的安瓿中。
有利地，将上述用于口服或肠胃外使用的药物组合物制备为在适合于满足活性成分的剂量的单位剂量中的剂量形式。在单位剂量中的此类剂量形式包括例如片剂、丸剂、胶囊剂、注射剂(安瓿)、栓剂等。所含有的上述抗体的量一般在单位剂量中为约5至约500mg/剂量形式；尤其在注射剂形式时，优选含有约5至约100mg的上述抗体，并且对于其他剂量形式含有约10至约250mg的上述抗体。
抗体的治疗用途
本发明的抗体尤其用于治疗、预防和/或减轻任何与Tie2活性相关的疾病或病症，包括与血管发生有关的疾病或病症。本发明的抗体和抗原结合片段可以用于治疗例如在脑和脑膜、口咽、肺和支气管树、胃肠道、雄性及雌性生殖道、肌肉、骨骼、皮肤及附属物、结缔组织、脾、免疫系统、造血细胞和骨髓、肝和泌尿道、和特定的感觉器官诸如眼中产生的原发性肿瘤和/或转移瘤。在某些实施方案中，本发明的抗体和抗原结合片段用于治疗一种或多种以下癌：肾细胞癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、恶性胶质瘤(malignant gliomas)、骨肉瘤、结直肠癌、恶性间皮瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、滑膜肉瘤、甲状腺癌、或黑素瘤。
组合疗法
本发明包括治疗施用方案，其包括施用与至少一种额外的治疗活性成分组合的本发明的抗Tie2抗体。此类额外的治疗活性成分的非限制性实例包括，例如另一种Tie2拮抗剂(例如，抗Tie2抗体)、表皮生长因子受体(EGFR)的拮抗剂(例如，抗EGFR抗体[例如,西妥昔单抗或帕尼单抗]或EGFR活性的小分子抑制剂[例如,吉非替尼或埃罗替尼])、另一个EGFR家族成员诸如Her2/ErbB2、ErbB3或ErbB4的拮抗剂(例如，抗ErbB2抗体、抗ErbB3抗体或抗ErbB4抗体或ErbB2、ErbB3或ErbB4活性的小分子抑制剂)、EGFRvIII的拮抗剂(例如，特异地结合EGFRvIII的抗体)、cMET拮抗剂(例如，抗cMET抗体)、IGF1R拮抗剂(例如，抗IGF1R抗体)、B-raf抑制剂(例如，威罗菲尼(vemurafenib)、索拉非尼、GDC-0879、PLX-4720)、PDGFR-α抑制剂(例如，抗PDGFR-α抗体)、PDGFR-β抑制剂(例如，抗PDGFR-β抗体)、VEGF拮抗剂(例如，VEGF-Trap，参见例如，US 7,087,411(本文中也称为"抑制VEGF的融合蛋白")、抗VEGF抗体(例如，贝伐单抗)、VEGF受体的小分子激酶抑制剂(例如，舒尼替尼、索拉非尼或帕唑帕尼(pazopanib)))、DLL4拮抗剂(例如，US 2009/0142354中公开的抗DLL4抗体诸如REGN421)、Ang2拮抗剂(例如，US 2011/0027286中公开的抗Ang2抗体，诸如H1H685P)等。可以与本发明的抗Tie2抗体有利地组合施用的其他试剂包括细胞因子抑制剂，其包括小分子细胞因子抑制剂和结合细胞因子诸如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-13、IL-17、IL-18或结合它们各自受体的抗体。
本发明还包括治疗组合，其包含本文提及的任意抗Tie2抗体和VEGF、Ang2、DLL4、ErbB2、ErbB3、ErbB4、EGFRvIII、cMet、IGF1R、B-raf、PDGFR-α、PDGFR-β中的一种或多种或任何前述细胞因子的抑制剂，其中所述抑制剂是适体、反义分子、核酶、siRNA、肽体(peptibody)、纳米抗体或抗体片段(例如，Fab片段；F(ab')2片段；Fd片段；Fv片段；scFv；dAb片段；或其他改造的分子，诸如双抗体、三抗体、四抗体、微体和最小识别单元)。本发明的抗Tie2抗体还与抗病毒剂、抗生素、镇痛药、糖皮质激素和/或NSAID组合施用。本发明的抗Tie2抗体还可以作为治疗方案的部分来施用，所述治疗方案还包括辐射治疗和/或常规化学疗法。
额外的治疗活性成分可以在施用本发明的抗Tie2抗体之前、同时或者之后不久进行施用(对于本公开的目的，认为此类施用方案为抗Tie2抗体与额外的治疗活性成分的“组合”施用)。本发明包括这样的药物组合物，其中将本发明的抗Tie2抗体与如本文别处描述的一种或多种额外的治疗活性成分共同配制。
抗体的诊断用途
本发明的抗Tie2抗体还可以例如为了诊断目的而用于检测和/或测量样品中的Tie2。例如，可以使用抗Tie2抗体或其片段来诊断表征为Tie2的异常表达(例如，过表达、过低表达、不表达等)的病症或疾病。用于Tie2的示例性诊断测定可以包括例如使获自患者的样品接触本发明的抗Tie2抗体，其中用可检测标记或报道基因分子标记抗Tie2抗体。备选地，未标记的抗Tie2抗体可以与二级抗体(自身被可检测地标记)组合用于诊断应用中。可检测标记或报道基因分子可以是放射性同位素，诸如3H、14C、32P、35S或125I；荧光或化学发光部分诸如异硫氰酸荧光素或罗丹明；或者酶诸如碱性磷酸酶、β半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶或萤光素酶。可以用于检测或测量样品中的Tie2的特定的示例性测定法包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)和荧光激活细胞分选术(FACS)。
可以用于根据本发明的Tie2诊断测定中的样品包括在正常或病理条件下可从患者中获得的任何组织或液体样品，其含有可检测量的Tie2蛋白或其片段。一般地，将测量从健康患者(例如，未患有与异常Tie2水平或活性相关的疾病或病症的患者)获得的特定样品中的Tie2水平，以开始确立Tie2的基线或标准水平。随后，可以将Tie2的基线水平与从怀疑患有Tie2相关疾病或病症的个体获得的样品中测量的Tie2水平相比较。
实施例
提出以下实施例，以向本领域普通技术人员提供关于如何进行并使用本发明的方法和组合物的完整公开及描述，且并不意在限制发明人所认为的本发明的范围。已经进行了努力以确保所用数字(例如，量、温度等)的准确性，但应说明有一些试验误差和偏差。除非另有说明，否则份均为以重量计的份，分子量均为平均分子量，温度均为摄氏度，并且压力均为处于或接近大气压。
用于以下实施例中的对照构建体
为了比较目的，将示例性对照构建体(抗Tie2抗体)包括在下文描述的几个实验中。称为对照I的抗体是具有小鼠重链和轻链可变域的嵌合抗Tie2抗体，其具有如美国专利6,376,653中所述的“12H8”的对应结构域的氨基酸序列。该抗体的恒定域是人IgG4。
实施例1.针对人Tie2的人抗体的产生
根据标准方法通过用人Tie2抗原免疫小鼠来产生几种人抗Tie2抗体(参见，例如美国专利号6,596,541)。使用该技术，获得了几种抗Tie2抗体；以该方式产生的示例性抗体及其对应的生物学特征在以下实施例中详细描述，并且所述示例性抗体包括命名为H2aM2760N、H2aM2761N、H1M2055N、H1H2304B、H1H2317B、H1H2322B、H1H2324B、H1H2331B、H1H2332B、H1H2333S、H1H2337B、H1H2338B、H1H2339B、H1H2340B和H4H2055N的抗体。本文所用的抗体命名中的H1M、H2M、H1H等前缀表明抗体的特定Fc区。例如，“H2M”抗体具有小鼠IgG2Fc，然而“H1H”抗体具有人IgG1Fc。如同本领域普通技术人员所将理解的，抗体的Fc区可以被修饰或用不同的Fc区替换，但可变域(包括CDR)将保持不变。
在2011年12月2日在按照布达佩斯条约的条款下将产生抗Tie2抗体H1M2055N和H2aM2760N的杂交瘤保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC),10801University Blvd.,Manassas,Va.20110-2209，保藏号为PTA-12295(H1M2055N)和PTA-12296(H2aM2760N)。
实施例2.表面等离振子共振衍生的人单克隆抗Tie2抗体的结合亲和力和动力学常数
在25℃和37℃下通过表面等离振子共振测定人单克隆抗Tie2抗体的结合亲和力和动力学常数(表1-4)。在Biacore 2000或T200仪器上进行测量。
对于具有小鼠恒定区(命名为H1M或H2M)的抗体，将抗体固定于抗小鼠Fc传感器表面上，并将不同浓度的人、小鼠或大鼠Tie2构建体(hTie2-His、mTie2-hFc和rTie2-hFc)注射到捕获有抗体的表面上。对于人IgG形式(命名为H1H或H4H)的抗体，根据应用至捕获有抗体的表面上的Tie2构建体来使用抗人Fc感受器表面(hTie2-His和hTie2-mFc)或抗人Fab传感器表面(mTie2-hFc和rTie2-hFc)。用于该实施例中的构建体的氨基酸序列如下：hTie2-His(SEQ ID NO:2)；hTie2-hFc(SEQ ID NO:3)；hTie2-mFc(SEQ ID NO:4)；rTie2-hFc(SEQID NO:5)以及mTie2-hFc(SEQ ID NO:6)。
通过使用Scrubber 2.0曲线拟合软件将实时结合传感图拟合成具有质量传输限制(mass transport limitation)的1:1结合模型来测定动力学速率常数－结合速率(ka)和解离速率(kd)。从动力学速率常数计算的平衡解离常数(KD)和解离半寿期(T1/2)如下：KD(M)＝kd/ka、T1/2(分钟)＝(ln2/(60*kd))。如表1-2中所示，几种抗体证明了在两种检测温度下对hTie2的高亲和力结合。此外，H1M2055N、H1H2332B、H1H2337B、H1H2340B和H4H2055N显示出对小鼠和大鼠Tie2的明显结合(表3-4)。
表1：25℃下人mAb对hTie2的Biacore结合亲和力
NB＝在检测条件下无结合
NT＝未检测
表2：37℃下人mAb对hTie2的Biacore结合亲和力
NB＝在检测条件下无结合
NT＝未检测
表3：25℃下人mAb对mTie2的Biacore结合亲和力
NB＝在检测条件下无结合
表4：25℃下人mAb对rTie2的Biacore结合亲和力
NB＝在检测条件下无结合
实施例3.使用Luminex珠表位定位Tie2mAb
为了确定结合抗Tie2抗体的结构域，将几种hTie2受体胞外结构域缺失构建体与luminex xMAP珠共价连接(10μg/ml每种蛋白质/107珠)。构建体描述于图1中并且命名如下：hTie2(Ig1-Ig2-EGF)(SEQ ID NO:7)、hTie2(Ig2-EGF)(SEQ ID NO:8)、hTie2(EGF)(SEQID NO:9)、hTie2(Ig3-FN)(SEQ ID NO:10)和hTie2(FN)(SEQ ID NO:11)。在该实施例中也检测了全长hTie2-mFc(SEQ ID NO:4)和hTie1-hFc(SEQ ID NO:12)胞外结构域构建体。
对于结合，将25μl的抗Tie2抗体(25μg/ml)加入到75μl如上产生的Luminex珠混合物中(3x103珠/构建体)，所述Luminex珠混合物在96孔滤板(Millipore)中的结合缓冲液(PBS,0.05％Tween 20,1mg/ml BSA,0.05％叠氮化钠)中。在室温(RT)下摇动温育90分钟或在4℃下摇动温育过夜。用洗涤缓冲液(PBS+0.05％Tween 20)洗涤珠3次，并将珠重悬于含有经PE(藻红蛋白)标记的抗人kappa或经PE标记的抗鼠Fab第二抗体的100μl结合缓冲液中，并在RT下摇动温育45分钟。将样品洗涤2次以上，并使用Luminex L200或FLEXMAP3D仪器测定每一珠的结合信号(MFI)。使用连接人Tie2的珠作为阳性对照，并使用连接人Tie1的珠测量家族交叉反应性。一般而言，大于500单位的MFI信号代表显著结合。结果总结在表5中。
表5
ND＝未测定
从以上结果中，可以推断H2aM2760N和H1M2055N结合Tie2的Ig1/Ig2结构域；H2aM2761N结合Tie2的EGF和Ig3结构域；H1H2304B、H1H2317B、H1H2322B和H1H2324B结合Tie2的EGF结构域；并且H1H2331B、H1H2332B、H1H2337B、H1H2339B、H1H2340B和对照I结合Tie2的FN结构域。
实施例4.通过H/D交换表位定位H4H2055N与Tie2的结合
进行实验以更准确地限定Tie2上与H4H2055N相互作用的氨基酸残基。(H4H2055N是从杂交瘤PTA-12295产生的抗体H1M2055N的完整人IgG4形式。)为此目的，实施H/D交换表位定位。H/D交换方法的一般性描述阐述于例如Ehring(1999)Analytical Biochemistry267(2):252-259；及Engen和Smith(2001)Anal.Chem.73:256A-265A。
为了通过H/D交换定位抗体H4H2055N在Tie2上的结合表位，使用由人Tie2的Ig1、Ig2和EGF胞外结构域组成的重组构建体(hTie2(Ig1-Ig2-EGF)；SEQ ID NO:7)。将抗体H4H2055N共价连接到N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)琼脂糖珠(GE Lifescience)上。
在‘溶液-开启/珠-关闭(on-solution/off-bead)’实验(在溶液中开启交换随后在珠上关闭交换)中，使配体(hTie2Ig1-Ig2-EGF)在用D2O制备的PBS缓冲液中氘化5分钟或10分钟，随后通过2分钟的温育使所述配体结合H4H2055N珠。用PBS水性缓冲液(用H2O制备)洗涤结合Tie2的珠，并在PBS缓冲液中温育开启交换时间的一半。交换关闭后，用冰冷的低pH TFA溶液将结合的Tie2从珠上洗脱下来。随后用固定的胃蛋白酶(Thermo Scientific)消化洗脱的Tie2 5分钟。用层析吸管端(pipette tip)使所获的肽脱盐，并立即通过UltrafleXtreme基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱法(MS)来分析。
在‘珠-开启/珠-关闭(on-bead/off-bead)’实验(在珠上开启交换，随后在珠上关闭交换)中，首先使Tie2结合到H4H2055N珠上，随后在D2O中温育5分钟或10分钟以开启交换。如‘溶液-开启/珠-关闭’程序所述来实施以下步骤(关闭交换、胃蛋白酶消化和MS分析)。计算所有检测的肽的图心值(centroid value)或平均质量与电荷比(m/z)并在这两组实验之间进行比较。
结果总结于表6中，表6提供了在H/D交换及胃蛋白酶消化程序后通过液相层析-基质辅助激光解吸电离(LC-MALDI)MS鉴定的所有经检测的肽的图心值(m/z)的比较。可能是由于二硫键，从单一MALDI-TOF谱中检测到的Tie2序列覆盖(sequence coverage)是相对低的。尽管如此，超过半数的所检测的胃酶解肽(peptic peptide)在溶液-开启/珠-关闭和珠-开启/珠-关闭方案中给出了相似的图心值。具有相应残基88-106、139-152和166-175的三个区段在两个实验中均具有δ图心值≥0.20m/z的图心值。对于本实施例的目的，在两个实验中至少0.20m/z的正差异(Δ)表明氨基酸是由抗体结合所保护的。满足这一标准的区段在表6中由粗体文字和星号(*)所标明。
表6：H4H2055N结合Tie2
由于对应于残基88-95的肽片段(m/z为1049.4)在交换关闭后没有显示出氘核保留(Δ＝0)，可以将第一保护区段(88-106)减少至仅包括残基96-106。因此通过在交换开启后H4H2055N与Tie2的结合保护SEQ ID NO:7的三个区段96-106、139-152和166-175免于完全地关闭交换。
Tie2的Ig1结构域由SEQ ID NO:7的氨基酸1-97组成；Tie2的Ig2结构域由SEQ IDNO:7的氨基酸98-186组成；而EGF重复结构域由SEQ ID NO:7的氨基酸187-321组成。因此，第一结合区(SEQ ID NO:7的氨基酸96-106)包括Ig1结构域的最后两个氨基酸以及Ig2结构域的前9个氨基酸。第二和第三结合区(SEQ ID NO:7的氨基酸139-153和166-175)完全位于Ig2结构域内。
还应该注意，基于Barton等(2006,Nat Struct Mol Biol 13(6)524-532)的共结晶结构，第二和第三结合区(SEQ ID NO:7的氨基酸139-153和166-175)位于Tie2的氨基酸区域内，所述区域直接接触Tie2的同族配体血管生成素-2。因此，该实施例提示，抗体H4H2055N结合主要在人Tie2的Ig2结构域内的不连续表位(在Ig1结构域的C末端部分内的一个或两个潜在的氨基酸进行接触)，并且如本文实施例5和6中所示，H4H2055N与这些区域的结合关联着H4H2055N阻断Tie2与Ang2之间的相互作用的能力。
实施例5.抗Tie2抗体阻断Tie2与血管生成素之间的相互作用的能力的评估
已知Tie2与血管生成素(Ang1、Ang2、Ang3和Ang4)相互作用。因此进行初步设定的实验来评价抗Tie2抗体阻断Tie2结合Ang2的能力。在第一组实验中，利用定量阻断免疫测定法。简述之，将0.8nM生物素化的融合有6xHis(SEQ ID NO:2)的外部Tie2(ecto-Tie2)的溶液与从～50nM连续稀释至0nM的抗Tie2抗体预混合。在室温下温育1小时后，通过夹层ELISA测量结合到包被有Bow-Ang2的平板上的Tie2-His的量。Bow-Ang2(SEQ ID NO:13)是包含hlgG1的Fc结构域的Ang2构建体，在所述Fc结构域的两个末端的侧翼为Ang2的一个FD结构域。将Bow-Ang2以2μg/ml包被于96孔微量滴定板上，并用BSA封闭。使用缀合HRP的链霉亲和素检测结合生物素-Tie2-His的平板，并使用BD OptEIATM(BD BiosciencesPharmingen,San Diego,CA)显色。记录OD450nm的信号并使用GraphPad Prism分析数据以计算IC50值。结果总结在表7中。将IC50定义为使可检测的生物素-Tie2-His与结合有Bow-Ang2配体的平板的结合降低50％所需的抗体的量。在表7中，相对于无抗体对照时结合到包被有Bow-Ang2的表面上的Tie2-His量，如果抗体的加入增加了结合到包被有Bow-Ang2的表面上的Tie2-His量，则将该抗体命名为“增强子”。
表7：抗Tie2MAb阻断hTie2与结合了Bow-Ang2的平板的结合的IC50值
第一组实验证明，抗Tie2抗体H1H2339B、H1H2340B和H4H2055N能够阻断ELISA形式中Ang2与Tie2之间的相互作用。
进行另一组实验以评价H4H2055N阻断Tie2结合Ang2和血管生成素家族的其他成员(Ang1、Ang3和Ang4)的能力。在这一组实验中，使用两种实验形式采用Octet Red生物传感器。在第一种形式中，在抗mFc Octet传感器尖端上捕获hTie2.mFc(SEQ ID NO:4；10μg/ml)或阴性对照5分钟。随后通过将H4H2055N或对照I抗体滴入孔(其中含有300nM的各个单克隆抗体)内10分钟使捕获的传感器尖端表面饱和。最后，将传感器尖端置于含有100nM的hAng1(R&D Systems,Inc.,Minneapolis,MN,Cat 923-AN/CF；Accession#Q5HYA0)、hAng2(R&D Systems,Inc.,Minneapolis,MN,Cat 623-AN/CF；Accession#O15123)、mAng3(R&DSystems,Inc.,Minneapolis,MN,Cat 738-AN/CF；Accession#Q9WVH6)或hAng4(R&DSystems,Inc.,Minneapolis,MN,Cat 964-AN/CF；Accession Q9Y264)的孔内5分钟。监测实验每一步的结合反应，并将不同的血管生成素与经单克隆抗体饱和的受体表面的结合作图(图2)。如图2所示，H4H2055N阻断所有四种血管生成素与hTie2.mFc表面的结合。对照I抗体并未阻断任一种血管生成素与包被有Tie2的表面的结合。
在第二种测定形式中，在抗mFc包被的Octet传感器尖端上捕获hTie2.mFc(10μg/ml)或阴性对照(5分钟)，随后将尖端置于含有100nM的血管生成素(hAng1、hAng2、mAng3或hAng4)的不同孔内10分钟。最后，将传感器尖端置于含有300nM的H4H2055N或对照I的孔内(5分钟)。如在形式1中所述，监测每一步中的结合反应，并将结合反应作图(图3)。这种形式证明，与对照I不同，在包被有Tie2的表面上已经结合的血管生成素减弱了H4H2055N的结合。因此，H4H2055N与血管生成素(Ang1、Ang2、Ang3和Ang4)竞争结合Tie2。
实施例6.抗Tie2抗体阻断血管生成素介导的Tie2信号传递的能力的评估
为了进一步表征本发明的抗hTie2mAb，探究了抗体阻断Tie2诱导的萤光素酶活性的能力。简述之，用hTie2稳定转染HEK293细胞，并通过FACS分离前10％的Tie2表达细胞。随后用血清应答元件(SRE)依赖性萤光素酶报道基因慢病毒(SA Biosciences)转导这些细胞，分离对血管生成素-1(Bow-Ang1,SEQ ID NO:14)和血管生成素-2(Bow-Ang2,SEQ IDNO:13)的四聚体形式有强应答的克隆群(293-TIE2/SRE-Luc)。
对于测定，处理前一天将293-Tie2/SRE-Luc细胞接种于(30,000细胞/孔)96孔板中。在萤光素酶活性测量前，用与细胞温育4小时的Bow-Ang1(BA1)或Bow-Ang2(BA2)的连续稀释液产生剂量反应曲线。对于Tie2抑制，在1nM恒定剂量的BA1或BA2存在的情况下，用连续稀释的Tie2mAb处理细胞4小时。在与One-GloTM(Promega)试剂一起温育后，在Victor发光计上测量萤光素酶活性。观察了三类抗体：阻断剂，定义为加入抗体后降低了Tie2依赖性萤光素酶活性；激活剂，定义为加入抗体后增强了Tie2依赖性萤光素酶活性；以及无活性的，定义为加入后信号没有明显改变。对于“无活性的”抗体，没有计算EC50或IC50值。结果总结在表8中。
表8：抗Tie2抗体的IC50值
对阻断剂报道的是IC50值，并且对激活剂报道的是EC50值。
在该实验系统中将抗Tie2抗体H2aM2760N、H2aM2761N和H4H2055N鉴定为阻断剂。
实施例7.抗Tie2抗体体内的抗肿瘤活性的评估
检测了示例性抗Tie2抗体(H2M2055N)在免疫受损的小鼠中抑制人肿瘤异种移植物生长的能力。简述之，人结直肠HT29或Colo205肿瘤在SCID小鼠中生长。当肿瘤明显时(HT29为100mm3并且Colo205为400mm3)，用Fc蛋白(10mg/kg)或抗Tie2抗体(H1M2055N；10mg/kg)一周两次处理动物。在处理结束时(对于HT29处理31天，并且对Colo205处理14天)，确定肿瘤生长抑制百分比(％TGI)(表9)，并收集肿瘤以用于血管密度分析。通过CD31免疫组织化学在30μm厚的OCT肿瘤切片中评估血管密度。利用NIH Image软件确定肿瘤组织切片中的％区域血管密度(area vessel density)。结果图示于图4-7中。
表9：用抗Tie2Mab处理的肿瘤在生长中的减慢百分比
如本实施例中所示，抗Tie2Ab H1M2055N不仅仅使肿瘤生长减慢(表9)，而且还显著降低了HT29(25％,图5)和Colo205(40％,图7)异种移植模型中的血管密度。
本发明的范围不受本文所述的具体实施方案的限定。实际上，除了本文所述的那些之外，根据前述的说明书及伴随的附图对本发明进行多种修改对于本领域技术人员而言是显而易见的。此类修改意在落入所附权利要求的范围之内。
序列表
<110> 瑞泽恩制药公司
<120> 抗Tie2抗体及其用途
<130> 7100A-WO
<140> To be assigned
<141> Filed herewith
<150> 61/525,308
<151> 2011-08-19
<150> 61/587,213
<151> 2012-01-17
<150> 61/674,405
<151> 2012-07-23
<160> 18
<170> FastSEQ for Windows 版本 4.0
<210> 1
<211> 1124
<212> PRT
<213> 人类
<400> 1
Met Asp Ser Leu Ala Ser Leu Val Leu Cys Gly Val Ser Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Gly Thr Val Glu Gly Ala Met Asp Leu Ile Leu Ile Asn Ser Leu
20 25 30
Pro Leu Val Ser Asp Ala Glu Thr Ser Leu Thr Cys Ile Ala Ser Gly
35 40 45
Trp Arg Pro His Glu Pro Ile Thr Ile Gly Arg Asp Phe Glu Ala Leu
50 55 60
Met Asn Gln His Gln Asp Pro Leu Glu Val Thr Gln Asp Val Thr Arg
65 70 75 80
Glu Trp Ala Lys Lys Val Val Trp Lys Arg Glu Lys Ala Ser Lys Ile
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Asn Gly Ala Tyr Phe Cys Glu Gly Arg Val Arg Gly Glu Ala Ile Arg
100 105 110
Ile Arg Thr Met Lys Met Arg Gln Gln Ala Ser Phe Leu Pro Ala Thr
115 120 125
Leu Thr Met Thr Val Asp Lys Gly Asp Asn Val Asn Ile Ser Phe Lys
130 135 140
Lys Val Leu Ile Lys Glu Glu Asp Ala Val Ile Tyr Lys Asn Gly Ser
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Phe Ile His Ser Val Pro Arg His Glu Val Pro Asp Ile Leu Glu Val
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His Leu Pro His Ala Gln Pro Gln Asp Ala Gly Val Tyr Ser Ala Arg
180 185 190
Tyr Ile Gly Gly Asn Leu Phe Thr Ser Ala Phe Thr Arg Leu Ile Val
195 200 205
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245 250 255
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275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
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325 330 335
Gly Leu Gln Cys Glu Arg Glu Gly Ile Pro Arg Met Thr Pro Lys Ile
340 345 350
Val Asp Leu Pro Asp His Ile Glu Val Asn Ser Gly Lys Phe Asn Pro
355 360 365
Ile Cys Lys Ala Ser Gly Trp Pro Leu Pro Thr Asn Glu Glu Met Thr
370 375 380
Leu Val Lys Pro Asp Gly Thr Val Leu His Pro Lys Asp Phe Asn His
385 390 395 400
Thr Asp His Phe Ser Val Ala Ile Phe Thr Ile His Arg Ile Leu Pro
405 410 415
Pro Asp Ser Gly Val Trp Val Cys Ser Val Asn Thr Val Ala Gly Met
420 425 430
Val Glu Lys Pro Phe Asn Ile Ser Val Lys Val Leu Pro Lys Pro Leu
435 440 445
Asn Ala Pro Asn Val Ile Asp Thr Gly His Asn Phe Ala Val Ile Asn
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Ile Ser Ser Glu Pro Tyr Phe Gly Asp Gly Pro Ile Lys Ser Lys Lys
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Leu Leu Tyr Lys Pro Val Asn His Tyr Glu Ala Trp Gln His Ile Gln
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Leu Thr Trp Gln Pro Ile Phe Pro Ser Ser Glu Asp Asp Phe Tyr Val
565 570 575
Glu Val Glu Arg Arg Ser Val Gln Lys Ser Asp Gln Gln Asn Ile Lys
580 585 590
Val Pro Gly Asn Leu Thr Ser Val Leu Leu Asn Asn Leu His Pro Arg
595 600 605
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610 615 620
Trp Ser Glu Asp Leu Thr Ala Trp Thr Leu Ser Asp Ile Leu Pro Pro
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Gln Pro Glu Asn Ile Lys Ile Ser Asn Ile Thr His Ser Ser Ala Val
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Ile Ser Trp Thr Ile Leu Asp Gly Tyr Ser Ile Ser Ser Ile Thr Ile
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Arg Tyr Lys Val Gln Gly Lys Asn Glu Asp Gln His Val Asp Val Lys
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Arg Met Asp Ala Ala Ile Lys Arg Met Lys Glu Tyr Ala Ser Lys Asp
850 855 860
Asp His Arg Asp Phe Ala Gly Glu Leu Glu Val Leu Cys Lys Leu Gly
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915 920 925
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Val Ala Lys Ile Ala Asp Phe Gly Leu Ser Arg Gly Gln Glu Val Tyr
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<210> 2
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 2
Thr Val Glu Gly Ala Met Asp Leu Ile Leu Ile Asn Ser Leu Pro Leu
1 5 10 15
Val Ser Asp Ala Glu Thr Ser Leu Thr Cys Ile Ala Ser Gly Trp Arg
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Pro His Glu Pro Ile Thr Ile Gly Arg Asp Phe Glu Ala Leu Met Asn
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Gln His Gln Asp Pro Leu Glu Val Thr Gln Asp Val Thr Arg Glu Trp
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Ala Lys Lys Val Val Trp Lys Arg Glu Lys Ala Ser Lys Ile Asn Gly
65 70 75 80
Ala Tyr Phe Cys Glu Gly Arg Val Arg Gly Glu Ala Ile Arg Ile Arg
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Thr Phe Gly Arg Thr Cys Lys Glu Arg Cys Ser Gly Gln Glu Gly Cys
245 250 255
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275 280 285
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Cys Asp Arg Phe Gln Gly Cys Leu Cys Ser Pro Gly Trp Gln Gly Leu
305 310 315 320
Gln Cys Glu Arg Glu Gly Ile Pro Arg Met Thr Pro Lys Ile Val Asp
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Tyr Lys Pro Val Asn His Tyr Glu Ala Trp Gln His Ile Gln Val Thr
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Asn Glu Ile Val Thr Leu Asn Tyr Leu Glu Pro Arg Thr Glu Tyr Glu
485 490 495
Leu Cys Val Gln Leu Val Arg Arg Gly Glu Gly Gly Glu Gly His Pro
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Gly Pro Val Arg Arg Phe Thr Thr Ala Ser Ile Gly Leu Pro Pro Pro
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Arg Gly Leu Asn Leu Leu Pro Lys Ser Gln Thr Thr Leu Asn Leu Thr
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Trp Gln Pro Ile Phe Pro Ser Ser Glu Asp Asp Phe Tyr Val Glu Val
545 550 555 560
Glu Arg Arg Ser Val Gln Lys Ser Asp Gln Gln Asn Ile Lys Val Pro
565 570 575
Gly Asn Leu Thr Ser Val Leu Leu Asn Asn Leu His Pro Arg Glu Gln
580 585 590
Tyr Val Val Arg Ala Arg Val Asn Thr Lys Ala Gln Gly Glu Trp Ser
595 600 605
Glu Asp Leu Thr Ala Trp Thr Leu Ser Asp Ile Leu Pro Pro Gln Pro
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Glu Asn Ile Lys Ile Ser Asn Ile Thr His Ser Ser Ala Val Ile Ser
625 630 635 640
Trp Thr Ile Leu Asp Gly Tyr Ser Ile Ser Ser Ile Thr Ile Arg Tyr
645 650 655
Lys Val Gln Gly Lys Asn Glu Asp Gln His Val Asp Val Lys Ile Lys
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Asn Ala Thr Ile Thr Gln Tyr Gln Leu Lys Gly Leu Glu Pro Glu Thr
675 680 685
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<210> 3
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 3
Ala Met Asp Leu Ile Leu Ile Asn Ser Leu Pro Leu Val Ser Asp Ala
1 5 10 15
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Glu Gly Arg Val Arg Gly Glu Ala Ile Arg Ile Arg Thr Met Lys Met
85 90 95
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100 105 110
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Glu Asp Ala Val Ile Tyr Lys Asn Gly Ser Phe Ile His Ser Val Pro
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Arg His Glu Val Pro Asp Ile Leu Glu Val His Leu Pro His Ala Gln
145 150 155 160
Pro Gln Asp Ala Gly Val Tyr Ser Ala Arg Tyr Ile Gly Gly Asn Leu
165 170 175
Phe Thr Ser Ala Phe Thr Arg Leu Ile Val Arg Arg Cys Glu Ala Gln
180 185 190
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Gly Val Cys His Glu Asp Thr Gly Glu Cys Ile Cys Pro Pro Gly Phe
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Met Gly Arg Thr Cys Glu Lys Ala Cys Glu Leu His Thr Phe Gly Arg
225 230 235 240
Thr Cys Lys Glu Arg Cys Ser Gly Gln Glu Gly Cys Lys Ser Tyr Val
245 250 255
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260 265 270
Gly Leu Gln Cys Asn Glu Ala Cys His Pro Gly Phe Tyr Gly Pro Asp
275 280 285
Cys Lys Leu Arg Cys Ser Cys Asn Asn Gly Glu Met Cys Asp Arg Phe
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Gln Gly Cys Leu Cys Ser Pro Gly Trp Gln Gly Leu Gln Cys Glu Arg
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325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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Leu Leu Pro Lys Ser Gln Thr Thr Leu Asn Leu Thr Trp Gln Pro Ile
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Ser Val Leu Leu Asn Asn Leu His Pro Arg Glu Gln Tyr Val Val Arg
580 585 590
Ala Arg Val Asn Thr Lys Ala Gln Gly Glu Trp Ser Glu Asp Leu Thr
595 600 605
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610 615 620
Ile Ser Asn Ile Thr His Ser Ser Ala Val Ile Ser Trp Thr Ile Leu
625 630 635 640
Asp Gly Tyr Ser Ile Ser Ser Ile Thr Ile Arg Tyr Lys Val Gln Gly
645 650 655
Lys Asn Glu Asp Gln His Val Asp Val Lys Ile Lys Asn Ala Thr Ile
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Asp Ile Phe Ala Glu Asn Asn Ile Gly Ser Ser Asn Pro Ala Phe Ser
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His Glu Leu Val Thr Leu Pro Glu Ser Gln Ala Pro Ala Asp Leu Gly
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Gly Gly Lys Gly Pro Gly Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
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Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
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Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
755 760 765
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
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Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
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Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
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Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
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Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
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Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
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Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
885 890 895
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
900 905 910
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
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Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
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Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
945 950 955
<210> 4
<211> 981
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 4
Met Asp Ser Leu Ala Ser Leu Val Leu Cys Gly Val Ser Leu Leu Leu
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Ser Gly Thr Val Glu Gly Ala Met Asp Leu Ile Leu Ile Asn Ser Leu
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Phe Ile His Ser Val Pro Arg His Glu Val Pro Asp Ile Leu Glu Val
165 170 175
His Leu Pro His Ala Gln Pro Gln Asp Ala Gly Val Tyr Ser Ala Arg
180 185 190
Tyr Ile Gly Gly Asn Leu Phe Thr Ser Ala Phe Thr Arg Leu Ile Val
195 200 205
Arg Arg Cys Glu Ala Gln Lys Trp Gly Pro Glu Cys Asn His Leu Cys
210 215 220
Thr Ala Cys Met Asn Asn Gly Val Cys His Glu Asp Thr Gly Glu Cys
225 230 235 240
Ile Cys Pro Pro Gly Phe Met Gly Arg Thr Cys Glu Lys Ala Cys Glu
245 250 255
Leu His Thr Phe Gly Arg Thr Cys Lys Glu Arg Cys Ser Gly Gln Glu
260 265 270
Gly Cys Lys Ser Tyr Val Phe Cys Leu Pro Asp Pro Tyr Gly Cys Ser
275 280 285
Cys Ala Thr Gly Trp Lys Gly Leu Gln Cys Asn Glu Ala Cys His Pro
290 295 300
Gly Phe Tyr Gly Pro Asp Cys Lys Leu Arg Cys Ser Cys Asn Asn Gly
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Glu Met Cys Asp Arg Phe Gln Gly Cys Leu Cys Ser Pro Gly Trp Gln
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Gly Leu Gln Cys Glu Arg Glu Gly Ile Pro Arg Met Thr Pro Lys Ile
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Val Asp Leu Pro Asp His Ile Glu Val Asn Ser Gly Lys Phe Asn Pro
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Ile Cys Lys Ala Ser Gly Trp Pro Leu Pro Thr Asn Glu Glu Met Thr
370 375 380
Leu Val Lys Pro Asp Gly Thr Val Leu His Pro Lys Asp Phe Asn His
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Thr Asp His Phe Ser Val Ala Ile Phe Thr Ile His Arg Ile Leu Pro
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Pro Asp Ser Gly Val Trp Val Cys Ser Val Asn Thr Val Ala Gly Met
420 425 430
Val Glu Lys Pro Phe Asn Ile Ser Val Lys Val Leu Pro Lys Pro Leu
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Asn Ala Pro Asn Val Ile Asp Thr Gly His Asn Phe Ala Val Ile Asn
450 455 460
Ile Ser Ser Glu Pro Tyr Phe Gly Asp Gly Pro Ile Lys Ser Lys Lys
465 470 475 480
Leu Leu Tyr Lys Pro Val Asn His Tyr Glu Ala Trp Gln His Ile Gln
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530 535 540
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545 550 555 560
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Gln Pro Glu Asn Ile Lys Ile Ser Asn Ile Thr His Ser Ser Ala Val
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770 775 780
Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
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980
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<211> 957
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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<220>
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<220>
<223> 合成的
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Pro Lys Pro Leu Asn Ala Pro Asn Val Ile Asp Thr Gly His Asn Phe
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35 40 45
Gln His Ile Gln Val Thr Asn Glu Ile Val Thr Leu Asn Tyr Leu Glu
50 55 60
Pro Arg Thr Glu Tyr Glu Leu Cys Val Gln Leu Val Arg Arg Gly Glu
65 70 75 80
Gly Gly Glu Gly His Pro Gly Pro Val Arg Arg Phe Thr Thr Ala Ser
85 90 95
Ile Gly Leu Pro Pro Pro Arg Gly Leu Asn Leu Leu Pro Lys Ser Gln
100 105 110
Thr Thr Leu Asn Leu Thr Trp Gln Pro Ile Phe Pro Ser Ser Glu Asp
115 120 125
Asp Phe Tyr Val Glu Val Glu Arg Arg Ser Val Gln Lys Ser Asp Gln
130 135 140
Gln Asn Ile Lys Val Pro Gly Asn Leu Thr Ser Val Leu Leu Asn Asn
145 150 155 160
Leu His Pro Arg Glu Gln Tyr Val Val Arg Ala Arg Val Asn Thr Lys
165 170 175
Ala Gln Gly Glu Trp Ser Glu Asp Leu Thr Ala Trp Thr Leu Ser Asp
180 185 190
Ile Leu Pro Pro Gln Pro Glu Asn Ile Lys Ile Ser Asn Ile Thr His
195 200 205
Ser Ser Ala Val Ile Ser Trp Thr Ile Leu Asp Gly Tyr Ser Ile Ser
210 215 220
Ser Ile Thr Ile Arg Tyr Lys Val Gln Gly Lys Asn Glu Asp Gln His
225 230 235 240
Val Asp Val Lys Ile Lys Asn Ala Thr Ile Thr Gln Tyr Gln Leu Lys
245 250 255
Gly Leu Glu Pro Glu Thr Ala Tyr Gln Val Asp Ile Phe Ala Glu Asn
260 265 270
Asn Ile Gly Ser Ser Asn Pro Ala Phe Ser His Glu Leu Val
275 280 285
<210> 12
<211> 995
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 12
Met Val Trp Arg Val Pro Pro Phe Leu Leu Pro Ile Leu Phe Leu Ala
1 5 10 15
Ser His Val Gly Ala Ala Val Asp Leu Thr Leu Leu Ala Asn Leu Arg
20 25 30
Leu Thr Asp Pro Gln Arg Phe Phe Leu Thr Cys Val Ser Gly Glu Ala
35 40 45
Gly Ala Gly Arg Gly Ser Asp Ala Trp Gly Pro Pro Leu Leu Leu Glu
50 55 60
Lys Asp Asp Arg Ile Val Arg Thr Pro Pro Gly Pro Pro Leu Arg Leu
65 70 75 80
Ala Arg Asn Gly Ser His Gln Val Thr Leu Arg Gly Phe Ser Lys Pro
85 90 95
Ser Asp Leu Val Gly Val Phe Ser Cys Val Gly Gly Ala Gly Ala Arg
100 105 110
Arg Thr Arg Val Ile Tyr Val His Asn Ser Pro Gly Ala His Leu Leu
115 120 125
Pro Asp Lys Val Thr His Thr Val Asn Lys Gly Asp Thr Ala Val Leu
130 135 140
Ser Ala Arg Val His Lys Glu Lys Gln Thr Asp Val Ile Trp Lys Ser
145 150 155 160
Asn Gly Ser Tyr Phe Tyr Thr Leu Asp Trp His Glu Ala Gln Asp Gly
165 170 175
Arg Phe Leu Leu Gln Leu Pro Asn Val Gln Pro Pro Ser Ser Gly Ile
180 185 190
Tyr Ser Ala Thr Tyr Leu Glu Ala Ser Pro Leu Gly Ser Ala Phe Phe
195 200 205
Arg Leu Ile Val Arg Gly Cys Gly Ala Gly Arg Trp Gly Pro Gly Cys
210 215 220
Thr Lys Glu Cys Pro Gly Cys Leu His Gly Gly Val Cys His Asp His
225 230 235 240
Asp Gly Glu Cys Val Cys Pro Pro Gly Phe Thr Gly Thr Arg Cys Glu
245 250 255
Gln Ala Cys Arg Glu Gly Arg Phe Gly Gln Ser Cys Gln Glu Gln Cys
260 265 270
Pro Gly Ile Ser Gly Cys Arg Gly Leu Thr Phe Cys Leu Pro Asp Pro
275 280 285
Tyr Gly Cys Ser Cys Gly Ser Gly Trp Arg Gly Ser Gln Cys Gln Glu
290 295 300
Ala Cys Ala Pro Gly His Phe Gly Ala Asp Cys Arg Leu Gln Cys Gln
305 310 315 320
Cys Gln Asn Gly Gly Thr Cys Asp Arg Phe Ser Gly Cys Val Cys Pro
325 330 335
Ser Gly Trp His Gly Val His Cys Glu Lys Ser Asp Arg Ile Pro Gln
340 345 350
Ile Leu Asn Met Ala Ser Glu Leu Glu Phe Asn Leu Glu Thr Met Pro
355 360 365
Arg Ile Asn Cys Ala Ala Ala Gly Asn Pro Phe Pro Val Arg Gly Ser
370 375 380
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385 390 395 400
Ile Val Glu Pro Glu Lys Thr Thr Ala Glu Phe Glu Val Pro Arg Leu
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Val Leu Ala Asp Ser Gly Phe Trp Glu Cys Arg Val Ser Thr Ser Gly
420 425 430
Gly Gln Asp Ser Arg Arg Phe Lys Val Asn Val Lys Val Pro Pro Val
435 440 445
Pro Leu Ala Ala Pro Arg Leu Leu Thr Lys Gln Ser Arg Gln Leu Val
450 455 460
Val Ser Pro Leu Val Ser Phe Ser Gly Asp Gly Pro Ile Ser Thr Val
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485 490 495
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515 520 525
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530 535 540
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545 550 555 560
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Gly Asp Gly Phe Leu Leu Arg Leu Trp Asp Gly Thr Arg Gly Gln Glu
580 585 590
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595 600 605
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850 855 860
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995
<210> 13
<211> 657
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 13
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100 105 110
Ser Glu Glu Leu Asn Tyr Arg Ile His Leu Lys Gly Leu Thr Gly Thr
115 120 125
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645 650 655
Phe
<210> 14
<211> 674
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 14
Arg Asp Cys Ala Asp Val Tyr Gln Ala Gly Phe Asn Lys Ser Gly Ile
1 5 10 15
Tyr Thr Ile Tyr Ile Asn Asn Met Pro Glu Pro Lys Lys Val Phe Cys
20 25 30
Asn Met Asp Val Asn Gly Gly Gly Trp Thr Val Ile Gln His Arg Glu
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Ala Ile Thr Ser Gln Arg Gln Tyr Met Leu Arg Ile Glu Leu Met Asp
85 90 95
Trp Glu Gly Asn Arg Ala Tyr Ser Gln Tyr Asp Arg Phe His Ile Gly
100 105 110
Asn Glu Lys Gln Asn Tyr Arg Leu Tyr Leu Lys Gly His Thr Gly Thr
115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
Thr Gly Gly Trp Trp Phe Asp Ala Cys Gly Pro Ser Asn Leu Asn Gly
165 170 175
Met Phe Tyr Thr Ala Gly Gln Asn His Gly Lys Leu Asn Gly Ile Lys
180 185 190
Trp His Tyr Phe Lys Gly Pro Ser Tyr Ser Leu Arg Ser Thr Thr Met
195 200 205
Met Ile Arg Pro Leu Asp Phe Gly Pro Gly Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
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405 410 415
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420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ala Pro Phe Arg Asp Cys Ala Asp
450 455 460
Val Tyr Gln Ala Gly Phe Asn Lys Ser Gly Ile Tyr Thr Ile Tyr Ile
465 470 475 480
Asn Asn Met Pro Glu Pro Lys Lys Val Phe Cys Asn Met Asp Val Asn
485 490 495
Gly Gly Gly Trp Thr Val Ile Gln His Arg Glu Asp Gly Ser Leu Asp
500 505 510
Phe Gln Arg Gly Trp Lys Glu Tyr Lys Met Gly Phe Gly Asn Pro Ser
515 520 525
Gly Glu Tyr Trp Leu Gly Asn Glu Phe Ile Phe Ala Ile Thr Ser Gln
530 535 540
Arg Gln Tyr Met Leu Arg Ile Glu Leu Met Asp Trp Glu Gly Asn Arg
545 550 555 560
Ala Tyr Ser Gln Tyr Asp Arg Phe His Ile Gly Asn Glu Lys Gln Asn
565 570 575
Tyr Arg Leu Tyr Leu Lys Gly His Thr Gly Thr Ala Gly Lys Gln Ser
580 585 590
Ser Leu Ile Leu His Gly Ala Asp Phe Ser Thr Lys Asp Ala Asp Asn
595 600 605
Asp Asn Cys Met Cys Lys Cys Ala Leu Met Leu Thr Gly Gly Trp Trp
610 615 620
Phe Asp Ala Cys Gly Pro Ser Asn Leu Asn Gly Met Phe Tyr Thr Ala
625 630 635 640
Gly Gln Asn His Gly Lys Leu Asn Gly Ile Lys Trp His Tyr Phe Lys
645 650 655
Gly Pro Ser Tyr Ser Leu Arg Ser Thr Thr Met Met Ile Arg Pro Leu
660 665 670
Asp Phe
<210> 15
<211> 498
<212> PRT
<213> 人类
<400> 15
Met Thr Val Phe Leu Ser Phe Ala Phe Leu Ala Ala Ile Leu Thr His
1 5 10 15
Ile Gly Cys Ser Asn Gln Arg Arg Ser Pro Glu Asn Ser Gly Arg Arg
20 25 30
Tyr Asn Arg Ile Gln His Gly Gln Cys Ala Tyr Thr Phe Ile Leu Pro
35 40 45
Glu His Asp Gly Asn Cys Arg Glu Ser Thr Thr Asp Gln Tyr Asn Thr
50 55 60
Asn Ala Leu Gln Arg Asp Ala Pro His Val Glu Pro Asp Phe Ser Ser
65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
Glu Ile Gly Thr Ser Leu Leu Ser Gln Thr Ala Glu Gln Thr Arg Lys
130 135 140
Leu Thr Asp Val Glu Thr Gln Val Leu Asn Gln Thr Ser Arg Leu Glu
145 150 155 160
Ile Gln Leu Leu Glu Asn Ser Leu Ser Thr Tyr Lys Leu Glu Lys Gln
165 170 175
Leu Leu Gln Gln Thr Asn Glu Ile Leu Lys Ile His Glu Lys Asn Ser
180 185 190
Leu Leu Glu His Lys Ile Leu Glu Met Glu Gly Lys His Lys Glu Glu
195 200 205
Leu Asp Thr Leu Lys Glu Glu Lys Glu Asn Leu Gln Gly Leu Val Thr
210 215 220
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245 250 255
Thr Val His Asn Leu Val Asn Leu Cys Thr Lys Glu Gly Val Leu Leu
260 265 270
Lys Gly Gly Lys Arg Glu Glu Glu Lys Pro Phe Arg Asp Cys Ala Asp
275 280 285
Val Tyr Gln Ala Gly Phe Asn Lys Ser Gly Ile Tyr Thr Ile Tyr Ile
290 295 300
Asn Asn Met Pro Glu Pro Lys Lys Val Phe Cys Asn Met Asp Val Asn
305 310 315 320
Gly Gly Gly Trp Thr Val Ile Gln His Arg Glu Asp Gly Ser Leu Asp
325 330 335
Phe Gln Arg Gly Trp Lys Glu Tyr Lys Met Gly Phe Gly Asn Pro Ser
340 345 350
Gly Glu Tyr Trp Leu Gly Asn Glu Phe Ile Phe Ala Ile Thr Ser Gln
355 360 365
Arg Gln Tyr Met Leu Arg Ile Glu Leu Met Asp Trp Glu Gly Asn Arg
370 375 380
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385 390 395 400
Tyr Arg Leu Tyr Leu Lys Gly His Thr Gly Thr Ala Gly Lys Gln Ser
405 410 415
Ser Leu Ile Leu His Gly Ala Asp Phe Ser Thr Lys Asp Ala Asp Asn
420 425 430
Asp Asn Cys Met Cys Lys Cys Ala Leu Met Leu Thr Gly Gly Trp Trp
435 440 445
Phe Asp Ala Cys Gly Pro Ser Asn Leu Asn Gly Met Phe Tyr Thr Ala
450 455 460
Gly Gln Asn His Gly Lys Leu Asn Gly Ile Lys Trp His Tyr Phe Lys
465 470 475 480
Gly Pro Ser Tyr Ser Leu Arg Ser Thr Thr Met Met Ile Arg Pro Leu
485 490 495
Asp Phe
<210> 16
<211> 496
<212> PRT
<213> 人类
<400> 16
Met Trp Gln Ile Val Phe Phe Thr Leu Ser Cys Asp Leu Val Leu Ala
1 5 10 15
Ala Ala Tyr Asn Asn Phe Arg Lys Ser Met Asp Ser Ile Gly Lys Lys
20 25 30
Gln Tyr Gln Val Gln His Gly Ser Cys Ser Tyr Thr Phe Leu Leu Pro
35 40 45
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115 120 125
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130 135 140
Val Glu Ala Gln Val Leu Asn Gln Thr Thr Arg Leu Glu Leu Gln Leu
145 150 155 160
Leu Glu His Ser Leu Ser Thr Asn Lys Leu Glu Lys Gln Ile Leu Asp
165 170 175
Gln Thr Ser Glu Ile Asn Lys Leu Gln Asp Lys Asn Ser Phe Leu Glu
180 185 190
Lys Lys Val Leu Ala Met Glu Asp Lys His Ile Ile Gln Leu Gln Ser
195 200 205
Ile Lys Glu Glu Lys Asp Gln Leu Gln Val Leu Val Ser Lys Gln Asn
210 215 220
Ser Ile Ile Glu Glu Leu Glu Lys Lys Ile Val Thr Ala Thr Val Asn
225 230 235 240
Asn Ser Val Leu Gln Lys Gln Gln His Asp Leu Met Glu Thr Val Asn
245 250 255
Asn Leu Leu Thr Met Met Ser Thr Ser Asn Ser Ala Lys Asp Pro Thr
260 265 270
Val Ala Lys Glu Glu Gln Ile Ser Phe Arg Asp Cys Ala Glu Val Phe
275 280 285
Lys Ser Gly His Thr Thr Asn Gly Ile Tyr Thr Leu Thr Phe Pro Asn
290 295 300
Ser Thr Glu Glu Ile Lys Ala Tyr Cys Asp Met Glu Ala Gly Gly Gly
305 310 315 320
Gly Trp Thr Ile Ile Gln Arg Arg Glu Asp Gly Ser Val Asp Phe Gln
325 330 335
Arg Thr Trp Lys Glu Tyr Lys Val Gly Phe Gly Asn Pro Ser Gly Glu
340 345 350
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355 360 365
Tyr Val Leu Lys Ile His Leu Lys Asp Trp Glu Gly Asn Glu Ala Tyr
370 375 380
Ser Leu Tyr Glu His Phe Tyr Leu Ser Ser Glu Glu Leu Asn Tyr Arg
385 390 395 400
Ile His Leu Lys Gly Leu Thr Gly Thr Ala Gly Lys Ile Ser Ser Ile
405 410 415
Ser Gln Pro Gly Asn Asp Phe Ser Thr Lys Asp Gly Asp Asn Asp Lys
420 425 430
Cys Ile Cys Lys Cys Ser Gln Met Leu Thr Gly Gly Trp Trp Phe Asp
435 440 445
Ala Cys Gly Pro Ser Asn Leu Asn Gly Met Tyr Tyr Pro Gln Arg Gln
450 455 460
Asn Thr Asn Lys Phe Asn Gly Ile Lys Trp Tyr Tyr Trp Lys Gly Ser
465 470 475 480
Gly Tyr Ser Leu Lys Ala Thr Thr Met Met Ile Arg Pro Ala Asp Phe
485 490 495
<210> 17
<211> 509
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 17
Met Leu Cys Gln Pro Ala Met Leu Leu Asp Gly Leu Leu Leu Leu Ala
1 5 10 15
Thr Met Ala Ala Ala Gln His Arg Gly Pro Glu Ala Gly Gly His Arg
20 25 30
Gln Ile His Gln Val Arg Arg Gly Gln Cys Ser Tyr Thr Phe Val Val
35 40 45
Pro Glu Pro Asp Ile Cys Gln Leu Ala Pro Thr Ala Ala Pro Glu Ala
50 55 60
Leu Gly Gly Ser Asn Ser Leu Gln Arg Asp Leu Pro Ala Ser Arg Leu
65 70 75 80
His Leu Thr Asp Trp Arg Ala Gln Arg Ala Gln Arg Ala Gln Arg Val
85 90 95
Ser Gln Leu Glu Lys Ile Leu Glu Asn Asn Thr Gln Trp Leu Leu Lys
100 105 110
Leu Glu Gln Ser Ile Lys Val Asn Leu Arg Ser His Leu Val Gln Ala
115 120 125
Gln Gln Asp Thr Ile Gln Asn Gln Thr Thr Thr Met Leu Ala Leu Gly
130 135 140
Ala Asn Leu Met Asn Gln Thr Lys Ala Gln Thr His Lys Leu Thr Ala
145 150 155 160
Val Glu Ala Gln Val Leu Asn Gln Thr Leu His Met Lys Thr Gln Met
165 170 175
Leu Glu Asn Ser Leu Ser Thr Asn Lys Leu Glu Arg Gln Met Leu Met
180 185 190
Gln Ser Arg Glu Leu Gln Arg Leu Gln Gly Arg Asn Arg Ala Leu Glu
195 200 205
Thr Arg Leu Gln Ala Leu Glu Ala Gln His Gln Ala Gln Leu Asn Ser
210 215 220
Leu Gln Glu Lys Arg Glu Gln Leu His Ser Leu Leu Gly His Gln Thr
225 230 235 240
Gly Thr Leu Ala Asn Leu Lys His Asn Leu His Ala Leu Ser Ser Asn
245 250 255
Ser Ser Ser Leu Gln Gln Gln Gln Gln Gln Leu Thr Glu Phe Val Gln
260 265 270
Arg Leu Val Arg Ile Val Ala Gln Asp Gln His Pro Val Ser Leu Lys
275 280 285
Thr Pro Lys Pro Val Phe Gln Asp Cys Ala Glu Ile Lys Arg Ser Gly
290 295 300
Val Asn Thr Ser Gly Val Tyr Thr Ile Tyr Glu Thr Asn Met Thr Lys
305 310 315 320
Pro Leu Lys Val Phe Cys Asp Met Glu Thr Asp Gly Gly Gly Trp Thr
325 330 335
Leu Ile Gln His Arg Glu Asp Gly Ser Val Asn Phe Gln Arg Thr Trp
340 345 350
Glu Glu Tyr Lys Glu Gly Phe Gly Asn Val Ala Arg Glu His Trp Leu
355 360 365
Gly Asn Glu Ala Val His Arg Leu Thr Ser Arg Thr Ala Tyr Leu Leu
370 375 380
Arg Val Glu Leu His Asp Trp Glu Gly Arg Gln Thr Ser Ile Gln Tyr
385 390 395 400
Glu Asn Phe Gln Leu Gly Ser Glu Arg Gln Arg Tyr Ser Leu Ser Val
405 410 415
Asn Asp Ser Ser Ser Ser Ala Gly Arg Lys Asn Ser Leu Ala Pro Gln
420 425 430
Gly Thr Lys Phe Ser Thr Lys Asp Met Asp Asn Asp Asn Cys Met Cys
435 440 445
Lys Cys Ala Gln Met Leu Ser Gly Gly Trp Trp Phe Asp Ala Cys Gly
450 455 460
Leu Ser Asn Leu Asn Gly Ile Tyr Tyr Ser Val His Gln His Leu His
465 470 475 480
Lys Ile Asn Gly Ile Arg Trp His Tyr Phe Arg Gly Pro Ser Tyr Ser
485 490 495
Leu His Gly Thr Arg Met Met Leu Arg Pro Met Gly Ala
500 505
<210> 18
<211> 503
<212> PRT
<213> 人类
<400> 18
Met Leu Ser Gln Leu Ala Met Leu Gln Gly Ser Leu Leu Leu Val Val
1 5 10 15
Ala Thr Met Ser Val Ala Gln Gln Thr Arg Gln Glu Ala Asp Arg Gly
20 25 30
Cys Glu Thr Leu Val Val Gln His Gly His Cys Ser Tyr Thr Phe Leu
35 40 45
Leu Pro Lys Ser Glu Pro Cys Pro Pro Gly Pro Glu Val Ser Arg Asp
50 55 60
Ser Asn Thr Leu Gln Arg Glu Ser Leu Ala Asn Pro Leu His Leu Gly
65 70 75 80
Lys Leu Pro Thr Gln Gln Val Lys Gln Leu Glu Gln Ala Leu Gln Asn
85 90 95
Asn Thr Gln Trp Leu Lys Lys Leu Glu Arg Ala Ile Lys Thr Ile Leu
100 105 110
Arg Ser Lys Leu Glu Gln Val Gln Gln Gln Met Ala Gln Asn Gln Thr
115 120 125
Ala Pro Met Leu Glu Leu Gly Thr Ser Leu Leu Asn Gln Thr Thr Ala
130 135 140
Gln Ile Arg Lys Leu Thr Asp Met Glu Ala Gln Leu Leu Asn Gln Thr
145 150 155 160
Ser Arg Met Asp Ala Gln Met Pro Glu Thr Phe Leu Ser Thr Asn Lys
165 170 175
Leu Glu Asn Gln Leu Leu Leu Gln Arg Gln Lys Leu Gln Gln Leu Gln
180 185 190
Gly Gln Asn Ser Ala Leu Glu Lys Arg Leu Gln Ala Leu Glu Thr Lys
195 200 205
Gln Gln Glu Glu Leu Ala Ser Ile Leu Ser Lys Lys Ala Lys Leu Leu
210 215 220
Asn Thr Leu Ser Arg Gln Ser Ala Ala Leu Thr Asn Ile Glu Arg Gly
225 230 235 240
Leu Arg Gly Val Arg His Asn Ser Ser Leu Leu Gln Asp Gln Gln His
245 250 255
Ser Leu Arg Gln Leu Leu Val Leu Leu Arg His Leu Val Gln Glu Arg
260 265 270
Ala Asn Ala Ser Ala Pro Ala Phe Ile Met Ala Gly Glu Gln Val Phe
275 280 285
Gln Asp Cys Ala Glu Ile Gln Arg Ser Gly Ala Ser Ala Ser Gly Val
290 295 300
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305 310 315 320
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325 330 335
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340 345 350
Phe Gly Asp Pro Ala Gly Glu His Trp Leu Gly Asn Glu Val Val His
355 360 365
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385 390 395 400
Ser Glu Asn Gln Leu Tyr Arg Leu Ser Val Val Gly Tyr Ser Gly Ser
405 410 415
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Leu Asp Ser Asp Asn Asp His Cys Leu Cys Lys Cys Ala Gln Val Met
435 440 445
Ser Gly Gly Trp Trp Phe Asp Ala Cys Gly Leu Ser Asn Leu Asn Gly
450 455 460
Val Tyr Tyr His Ala Pro Asp Asn Lys Tyr Lys Met Asp Gly Ile Arg
465 470 475 480
Trp His Tyr Phe Lys Gly Pro Ser Tyr Ser Leu Arg Ala Ser Arg Met
485 490 495
Met Ile Arg Pro Leu Asp Ile
500

Claims (16)

1.分离的抗体或其抗原结合片段在生产用于抑制患者中肿瘤生长的药物中的用途，所述抗体或其抗原结合片段特异地结合人Tie2并阻断血管生成素介导的Tie2信号传递，其中所述抗体或抗原结合片段包含以保藏号PTA-12295或保藏号PTA-12296保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)的细胞系产生的抗体的重链和轻链互补决定区(CDRs)。
2.权利要求1的用途，其中所述抗体或其抗原结合片段包含以保藏号PTA-12295保藏于ATCC的细胞系产生的抗体的CDRs。
3.权利要求1的用途，其中所述抗体或其抗原结合片段包含以保藏号PTA-12296保藏于ATCC的细胞系产生的抗体的CDRs。
4.权利要求2的用途，其中所述抗体或抗原结合片段是具有以保藏号PTA-12295保藏于ATCC的细胞系产生的抗体的可变区的人抗体。
5.权利要求4的用途，其中所述人抗体具有人IgG4恒定区。
6.权利要求4的用途，其中所述人抗体具有人IgG1恒定区。
7.权利要求3的用途，其中所述抗体或抗原结合片段是具有以保藏号PTA-12296保藏于ATCC的细胞系产生的抗体的可变区的人抗体。
8.权利要求7的用途，其中所述人抗体具有人IgG4恒定区。
9.权利要求7的用途，其中所述人抗体具有人IgG1恒定区。
10.药物组合物，其包含分离的抗体或其抗原结合片段和可药用的载体或稀释剂，所述抗体或其抗原结合片段特异地结合人Tie2并阻断血管生成素介导的Tie2信号传递，其中所述抗体或抗原结合片段包含以保藏号PTA-12295或保藏号PTA-12296保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)的细胞系产生的抗体的重链和轻链互补决定区(CDRs)。
11.权利要求10的药物组合物，其中所述抗体或抗原结合片段是具有以保藏号PTA-12295保藏于ATCC的细胞系产生的抗体的可变区的人抗体。
12.权利要求11的药物组合物，其中所述人抗体具有人IgG4恒定区。
13.权利要求11的药物组合物，其中所述人抗体具有人IgG1恒定区。
14.权利要求10的药物组合物，其中所述抗体或抗原结合片段是具有以保藏号PTA-12296保藏于ATCC的细胞系产生的抗体的可变区的人抗体。
15.权利要求14的药物组合物，其中所述人抗体具有人IgG4恒定区。
16.权利要求14的药物组合物，其中所述人抗体具有人IgG1恒定区。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113993897A (zh) * 2019-08-14 2022-01-28 药物抗体公司 抗tie2抗体及其用途
CN114901700A (zh) * 2019-11-21 2022-08-12 尤尼蒂生物技术公司 针对tie-2的抗体及其使用方法

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2744827B1 (en) 2011-08-19 2018-10-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-tie2 antibodies uses thereof
US10316105B2 (en) 2011-08-19 2019-06-11 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-TIE2 antibodies and uses thereof
RS59000B1 (sr) 2013-11-01 2019-08-30 Regeneron Pharma Intervencije zasnovane na angiopoietinu za lečenje cerebralne malarije
RU2702553C2 (ru) * 2014-07-15 2019-10-08 Астеллас Фарма Инк. Новое антитело против tie-2 человека
WO2016115092A1 (en) * 2015-01-12 2016-07-21 La Jolla Institute For Allergy And Immunology Methods for targeting host vascular mechanism for therapeutic protection against hemorrhagic fever
CN109071656B (zh) 2017-01-05 2021-05-18 璟尚生物制药公司 检查点调节物拮抗剂
WO2018148567A1 (en) 2017-02-09 2018-08-16 Fred Hutchinson Cancer Research Center Biomarkers and uses thereof for selecting immunotherapy intervention
WO2019164219A1 (en) * 2018-02-20 2019-08-29 Institute For Basic Science Anti-angiopoietin-2 antibodies and uses thereof
KR102497171B1 (ko) 2018-02-20 2023-02-08 기초과학연구원 항-안지오포이에틴-2(Ang2) 항체 및 그의 용도
WO2019235856A1 (ko) * 2018-06-07 2019-12-12 기초과학연구원 Tie2에 결합하는 항체 및 이의 용도
CA3101506A1 (en) * 2018-06-07 2019-12-12 Institute For Basic Science Anti-tie2 antibodies and use thereof
WO2020006516A1 (en) 2018-06-29 2020-01-02 Gensun Biopharma, Inc. Antitumor immune checkpoint regulator antagonists
EP3990116A1 (en) 2019-06-28 2022-05-04 Gensun Biopharma Inc. ANTITUMOR ANTAGONIST CONSISTING OF A MUTATED TGFß1 - RII EXTRACELLULAR DOMAIN AND AN IMMUNOGLOBULIN SCAFFOLD
MX2022011752A (es) 2020-03-24 2022-10-18 Genentech Inc Agentes de fijacion a tie2 y metodos de uso.
US20250340625A1 (en) * 2021-04-23 2025-11-06 Neortesbio Inc. Antibody specifically binding to angiopoietin-2, or fragment thereof
US20240279324A1 (en) 2021-06-03 2024-08-22 Gensun Biopharma Inc. Multispecific antagonists
CR20240342A (es) * 2022-01-13 2024-09-18 Ingenia Therapeutics Inc Vegf y proteína de fusión de unión a tie2 y sus usos descripción
CN115947818B (zh) * 2022-10-25 2024-08-02 福州大学 一种血管生成素1突变体的设计及其制备方法和应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000075323A1 (en) * 1999-06-07 2000-12-14 Immunex Corporation Tek antagonists
WO2001045730A2 (en) * 1999-12-20 2001-06-28 Immunex Corporation Tweak receptor
US6376653B1 (en) * 1998-09-28 2002-04-23 Smithkline Beecham Plc Tie2 antagonist antibodies
WO2005117980A1 (en) * 2004-06-04 2005-12-15 Pfizer Products Inc. Method for treating abnormal cell growth
WO2006005361A1 (en) * 2004-07-13 2006-01-19 Centre National De La Recherche Scientifique Peptides liable to bind to the tie2 receptor, nucleic acids encoding them, and their uses
WO2006020706A2 (en) * 2004-08-12 2006-02-23 Dyax Corp. Tie complex binding proteins

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
DE69233254T2 (de) 1991-06-14 2004-09-16 Genentech, Inc., South San Francisco Humanisierter Heregulin Antikörper
AU4651893A (en) 1992-06-26 1994-01-24 Immunex Corporation Novel tyrosine kinase
US5681714A (en) 1992-07-30 1997-10-28 Mount Sinai Hospital Corporation Nucleic acid encoding tek receptor tyrosine kinase
WO1995013387A1 (en) 1993-11-12 1995-05-18 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Tie-2, a novel receptor tyrosine kinase
AUPM379494A0 (en) 1994-02-10 1994-03-03 Ludwig Institute For Cancer Research Immunointeractive molecules - ii
US20030040463A1 (en) * 1996-04-05 2003-02-27 Wiegand Stanley J. TIE-2 ligands, methods of making and uses thereof
US6365154B1 (en) 1998-09-28 2002-04-02 Smithkline Beecham Corporation Tie2 agonist antibodies
US6521424B2 (en) 1999-06-07 2003-02-18 Immunex Corporation Recombinant expression of Tek antagonists
US7087411B2 (en) 1999-06-08 2006-08-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Fusion protein capable of binding VEGF
SK542003A3 (en) 2000-06-23 2003-09-11 Schering Ag Combinations and compositions which interfere with VEGF/VEGF and angiopoietin/Tie receptor function and their use
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US20040101920A1 (en) 2002-11-01 2004-05-27 Czeslaw Radziejewski Modification assisted profiling (MAP) methodology
US7485297B2 (en) 2003-08-12 2009-02-03 Dyax Corp. Method of inhibition of vascular development using an antibody
EP1740946B1 (en) 2004-04-20 2013-11-06 Genmab A/S Human monoclonal antibodies against cd20
CN101163675A (zh) 2005-04-19 2008-04-16 协和发酵工业株式会社 含氮杂环化合物
ES2612258T3 (es) 2006-10-27 2017-05-16 Sunnybrook Health Sciences Center Agonistas multiméricos de Tie 2 y usos de los mismos en la estimulación de la angiogénesis
RU2448979C2 (ru) 2006-12-14 2012-04-27 Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. Антитела человека к дельта-подобному лиганду-4 человека
US8685393B2 (en) * 2008-03-24 2014-04-01 Beth Israel Deaconess Medical Center Methods and compositions for the treatment and diagnosis of systemic anthrax infection
JO3182B1 (ar) 2009-07-29 2018-03-08 Regeneron Pharma مضادات حيوية بشرية عالية الالفة مع تولد الاوعية البشرية - 2
US8980268B2 (en) * 2009-07-29 2015-03-17 Regeneron Pharamceuticals, Inc. Methods for treating cancer by administering an anti-Ang-2 antibody
US20130188013A1 (en) * 2011-07-22 2013-07-25 Qualcomm Incorporated Mvc based 3dvc codec supporting inside view motion prediction (ivmp) mode
EP2744827B1 (en) 2011-08-19 2018-10-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-tie2 antibodies uses thereof

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6376653B1 (en) * 1998-09-28 2002-04-23 Smithkline Beecham Plc Tie2 antagonist antibodies
WO2000075323A1 (en) * 1999-06-07 2000-12-14 Immunex Corporation Tek antagonists
WO2001045730A2 (en) * 1999-12-20 2001-06-28 Immunex Corporation Tweak receptor
WO2005117980A1 (en) * 2004-06-04 2005-12-15 Pfizer Products Inc. Method for treating abnormal cell growth
WO2006005361A1 (en) * 2004-07-13 2006-01-19 Centre National De La Recherche Scientifique Peptides liable to bind to the tie2 receptor, nucleic acids encoding them, and their uses
WO2006020706A2 (en) * 2004-08-12 2006-02-23 Dyax Corp. Tie complex binding proteins

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113993897A (zh) * 2019-08-14 2022-01-28 药物抗体公司 抗tie2抗体及其用途
CN113993897B (zh) * 2019-08-14 2024-06-07 药物抗体公司 抗tie2抗体及其用途
CN114901700A (zh) * 2019-11-21 2022-08-12 尤尼蒂生物技术公司 针对tie-2的抗体及其使用方法
CN114901700B (zh) * 2019-11-21 2025-04-22 尤尼蒂生物技术公司 针对tie-2的抗体及其使用方法

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