CN106834454B - 一种检测男性感染hbv后能否自然清除的试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种检测男性感染HBV后能否自然清除的试剂盒及方法，涉及生物检测领域，包括用于扩增样本中含有SNP位点的DNA的特异性引物的扩增反应液；包括用于纯化所述DNA的SAP酶的纯化反应液；用于检测TLR3基因的rs5743313位点的基因型的单碱基延伸引物的延伸反应液，当得到所述TLR3基因的rs5743313位点的检测结果表现为C/T时，则感染HBV男性不能自然清除HBV，易发展为HBV慢性携带者、慢乙肝甚至肝硬化、肝细胞癌。本发明提供的特异性引物及延伸引物灵敏度高，特异性好，本发明提供的方法可以预测男性感染HBV能否自然清除，操作简单，有利于预后目标的监测。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测领域，尤其涉及一种检测男性感染HBV后能否自然清除的试剂盒及方法。
背景技术
目前，乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染是世界性公共卫生问题。据世界卫生组织统计表明，全世界有4亿HBV感染者，而中国的HBV携带者就占全世界的1/3。其中，10％的成年人和约80％-90％的儿童感染后会发展为慢乙肝，而慢乙肝患者死于慢乙肝并发的肝硬化、原发性肝细胞癌的占有很大一部分，这种现象是由多因素及各种因素相互作用决定的，影响HBV感染结局的因素有病毒方面的因素，(如病毒基因型、病毒载量及病毒变异情况)；宿主免疫状态(如感染时年龄、是否有其他病毒合并感染)和宿主的遗传因素。尤其是，宿主抗病毒免疫相关基因的多态性在很大程度上决定了HBV感染后的临床结局。
TLR(toll like receptor)是模式识别受体(pattern recognition receptor，PRR)家族的成员，是一类古老的序列高度保守的天然免疫受体家族存在于人类的细胞表面，并且作为主要的模式识别受体，参与机体先天性免疫应答反应。TLRs在人类获得性免疫反应(T、B细胞反应)中也起到重要作用，它是连接固有免疫和获得性免疫的桥梁。TLR介导特异的信号通路，形成一个复杂的、联合性的网络，特异地识别大量病原体及组织代谢产物，通过一系列的信号转导，激活固有和获得性免疫。TLRs在多种肝脏组织细胞中均有表达，人体感染肝炎病毒后,TLRs通过识别病毒双链DNA、单链RNA或非甲基化酸胞苷酰等病原相关分子模式,激活细胞内信号转导通路,活化免疫相关细胞,产生促炎因子和抗病毒的细胞因子,清除病毒的同时引发肝细胞炎症反应。目前已有13种TLRs(TLR1～TLR13)在哺乳动物中被鉴定出来,其中有11种TLRs(TLR1～TLR11)存在人体内。
TLR3、TLR9是主要的病毒核酸模式识别受体,TLR3主要识别病毒dsDNA,TLR9主要识别细菌或病毒DNA中非甲基化CpG DNA基因序列,发挥抗病毒感染作用。研究表明TLR3和TLR9的异常表达与乙型肝炎和HBV相关性肝癌有关，但TLR3和TLR9基因多态性与慢性乙型肝炎背景下的肝硬化、肝癌的遗传易感性研究尚未见报道。
发明内容
为了在感染初期提早发现，协助治疗患者，避免肝病进程加速转为严重肝病甚至肝癌，本发明提供一种检测男性感染HBV后能否自然清除的方法，该方法主要依赖于TLR3基因的rs5743313位点作为检测标准实现男性感染HBV后能否自然清除的检测。本发明方法操作简单，有利于预后目标的监测。
为实现本发明的目的，本发明一方面提供一种男性感染HBV后能否自然清除的试剂盒，包括：
包括用于扩增样本中含有SNP位点的DNA的特异性引物的扩增反应液；
包括用于纯化所述DNA的SAP酶的纯化反应液；
用于得到TLR3基因的rs5743313位点的碱基检测结果的单碱基延伸引物的延伸反应液。
其中，当得到所述TLR3基因的rs5743313位点的检测结果表现为C/T时，则感染HBV男性不能自然清除，易发展为HBV慢性携带者、慢乙肝甚至肝硬化、肝细胞癌。
特别是，所述TLR3基因的rs5743313位点的检测包括：
利用特异性引物和PCR扩增反应液对样本扩增出含有SNP位点的一段DNA，并使用SAP酶去除掉PCR体系中剩余的脱氧核糖核苷三磷酸和引物，得到样本DNA片段；
向加入单碱基延伸引物，并采用单碱基延伸终止反应液对样本DNA进行单碱基延伸终止反应，得到用于SNP分析的目的基因；
应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测延伸产物与未延伸引物间的分子量差异，确定TLR3基因的rs5743313位点的碱基；
根据TLR3基因的rs5743313位点碱基结果，得到男性感染HBV者的是否能够自然清除的判断结果。
特别是，所述特异性引物包括：
正向引物：5’-ACGTTGGATGTTCCACCCAGTGCTGCAGG-3’；
反向引物：5’-ACGTTGGATGTGGTGTCATCCTCCTGAGAG-3’。
尤其是，所述单碱基延伸引物为：5’-AGCCCCAGGAGAGGT-3’。
尤其是，使用所述扩增反应液进行扩增的反应条件是：95℃预变性15min；94℃变性20s，56℃退火30s，72℃延伸60s，45个循环，72℃6延伸3min，10℃保存。
其中，所述PCR扩增反应体系还包括：10*buffer 0.625ul，Mg2+0.325ul，dNTP0.25ul，Forward Primer 1ul,Reverse Primer 1ul，DNA 1ul(10ng-20ng)，Hotstartaq酶0.2ul。
尤其是，使用纯化反应液的反应条件是：37℃40min，85℃5min，10℃保存。
其中，所述SAP酶包括：三蒸水1.53ul，Buffer 0.17ul，SAP 0.3ul。
尤其是，使用所述单碱基延伸终止反应液的反应条件是：94℃30s，94℃5s,52℃5s，80℃5s，4个内部循环(52℃5s，80℃5s)，39个外部循环(94℃5s,52℃5s，80℃5s)，72℃3min，10℃保存。
其中，所述单碱基延伸终止反应液包括：三蒸水1.36，10*iplex buffer 0.2ul，Terminator mix 0.1ul，Primer 0.02，Thermo sequence 0.02ul。
为实现本发明的技术目的，本发明再一方面提供一种检测男性感染HBV后能否自然清除的方法，其通过对TLR3基因的rs5743313位点进行判断，当TLR3基因的rs5743313位表现为C/T时，则感染HBV男性不能自然清除，易发展为HBV慢性携带者、慢乙肝甚至肝硬化、肝细胞癌。
其中，所述通过对TLR3基因的rs5743313位点进行判断包括：
利用特异性引物和PCR扩增反应液对样本扩增出含有SNP位点的一段DNA，并使用SAP酶去除掉PCR体系中剩余的脱氧核糖核苷三磷酸和引物，得到样本DNA片段；
向加入单碱基延伸引物，并采用单碱基延伸终止反应液对样本DNA进行单碱基延伸终止反应，得到用于SNP分析的目的基因；
应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测延伸产物与未延伸引物间的分子量差异，确定TLR3基因的rs5743313位点的碱基；
根据TLR3基因的rs5743313位点碱基结果，得到男性感染HBV者是否能够自然清除的判断结果。
其中，所述特异性引物包括：
正向引物：5’-ACGTTGGATGTTCCACCCAGTGCTGCAGG-3’；
反向引物：5’-ACGTTGGATGTGGTGTCATCCTCCTGAGAG-3’。
其中，所述特异性单碱基延伸引物为：5’-AGCCCCAGGAGAGGT-3’。
本发明的有益效果：
1、本发明提供的特异性引物及延伸引物可以准确的扩增和延伸目的基因，灵敏度高，特异性好。
2、本发明提供的试剂盒可以准确检测TLR3基因的rs5743313位点的基因型，从为判断男性感染HBV后是否能够自然自愈，是否会发展为HBV慢性携带者、慢乙肝甚至肝硬化、肝细胞癌提供准确的依据。
3、为了在感染初期提早发现，协助治疗患者，避免感染后的男性治疗时机被延误，本发明提供的方法可以预测男性感染HBV的进程趋势，从而判断该男性感染者是否能够自然自愈，是否会发展为HBV慢性携带者、慢乙肝甚至肝硬化、肝细胞癌，该方法主要依赖于TLR3基因的rs5743313位点作为标准实现疾病进程趋势，操作简单，有利于预后目标的监测。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面结合和具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述。
在下面的描述中阐述了很多具体的细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用其他不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本发明并不限于下面公开的具体实施例的限制。
本实施例所用的主要实验仪器：
高速离心机，美国Beckman Coulter有限公司；
SEQUENOM MassARRAY matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight(MALDITOF)mass spectrometry platform基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(美国Sequenom公司生产)；
-20℃和-80℃低温冰箱；电子秤；超净工作台；水平离心机；电泳仪，电泳槽；电热恒温水浴箱。
实施例1试剂盒
1、扩增反应液
用于扩增样本中含有SNP位点的DNA，包括：10*buffer 0.625ul，Mg2+0.325ul，dNTP0.25ul，Forward Primer 1ul,Reverse Primer 1ul，DNA 1ul(10ng-20ng)，Hotstar taq酶0.2ul。
其中，所述Forward Primer(即正向引物)为：
5’-ACGTTGGATGTTCCACCCAGTGCTGCAGG-3’；
其中，所述Reverse Primer(即反向引物)为：
5’-ACGTTGGATGTGGTGTCATCCTCCTGAGAG-3’。
进一步，使用扩增反应液的反应条件是：95℃15min；94℃20s，56℃30s，72℃60s45个循环，72℃3min，10℃保存。
2、纯化反应液
用于纯化扩增后的DNA片段，其主要成分为SAP酶，具体为：三蒸水1.53ul，Buffer0.17ul，SAP 0.3ul。
进一步，使用纯化反应液的反应条件是：37℃40min，85℃5min，10℃保存。
3、延伸反应液
用于得到TLR3基因的rs5743313位点的碱基检测结果，具体包括：三蒸水1.36，10*iplex buffer 0.2ul，Terminator mix 0.1ul，Primer 0.02，Thermo sequence 0.02ul。
其中，所述Primer(即单碱基延伸引物)为：5’-AGCCCCAGGAGAGGT-3’。
进一步地，使用延伸反应液的进行单碱基延伸反应的反应条件是：94℃30s，94℃5s,52℃5s，80℃5s，4个内部循环(52℃5s，80℃5s)，39个外部循环(94℃5s,52℃5s，80℃5s)，72℃3min，10℃保存。
实施例2男性感染HBV是否能够自然清除的检测
1、标本采集及DNA的提取
取被检者血凝块200μl(血凝块溶于TES液中)，使用QIAGEN QIAampDNABlood MiniKit按照操作说明抽提取全基因组DNA。
具体操作步骤如下:
1)首先在1.5ml离心管中加入200μl AL缓冲液。然后将患者的标本轻轻吹打混匀，吸取200μl标本加入含有裂解缓冲液(AL缓冲液)的离心管中。
2)向步骤1)的离心管中加入20μl QIAGEN蛋白酶或蛋白酶K，震荡混匀15秒，离心8000rpm/min，10秒，然后放入56℃电热恒温水浴箱中水浴10分钟。
3)低速离心，以使离心管盖中的液体进入离心管。
4)向离心管中加200μl无水乙醇，充分混匀，震荡混匀15秒后再次离心8000rpm/min，10秒。
5)将步骤4)的离心管中物质(即包括絮状物质的液体)转移到QIAamp离心柱并将其置于2ml集合管中，尽量不要沾到管壁。盖紧管盖，8000转高速离心1分钟。将离心柱置于另一个集合管中，用过的集合管可以丢弃。
6)打开离心柱，向步骤5)所述的另一个集合管中加500μl洗涤缓冲液(AW1缓冲液)，不要沾湿管壁。盖好盖，8000转高速离心1分钟，丢弃集合管。将离心柱置于另一干净的集合管中。
7)打开离心柱，向步骤6)所述的另一干净的集合管中加500μl洗涤缓冲液(AW2缓冲液)。盖好盖，14000转/min进行高速离心3分钟(如果离心机最高转速只有13000，可用13000转高速离心5分钟)。
8)倒掉步骤7)所述的集合管中的废液，继续把离心柱放在再一个集合管上，空离13000转或14000转1分钟。尽量去除残留的AW2缓冲液。
9)将离心柱置于另外干净的1.5ml离心管中，丢弃集合管。小心打开管盖，小心加入50-100μl溶解DNA的溶液(AE缓冲液)。室温下放置10分钟，然后8000转离心1分钟。
10)DNA提取后，标明序号置于-20℃或-4℃冰箱中保存备用。
2、位点基因多态性的检测
该步骤是先扩增出含有SNP位点的一段DNA(SNP位点前后各50bp左右)，然后用SAP酶去除掉PCR体系中剩余的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)和引物，然后加入一单碱基延伸引物，其3’末端碱基紧挨SNP位点，采用四种ddNTP替代dNTP，这样，探针在SNP位点处仅延伸一个碱基，连接上的ddNTP与SNP位点的等位基因对应。用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)检测延伸产物与未延伸引物间的分子量差异,确定该点处碱基，具体步骤如下：
2.1PCR扩增
利用特异性引物及得到的DNA样本进行PCR扩增反应，其中，总反应体系为(即扩增反应液)：
其中，Forward Primer(即正向引物)是：
5’-ACGTTGGATGTTCCACCCAGTGCTGCAGG-3’；
Reverse Primer(即反向引物)是：
5’-ACGTTGGATGTGGTGTCATCCTCCTGAGAG-3’。
上述扩增反应体系按照下述的程序进行设置：
95℃15min；
94℃20s，
56℃30s，
72℃60s 45个循环，
72℃3min，
10℃保存。
得到PCR扩增后的目的基因产物。
2.2纯化反应
利用SAP酶去除掉PCR体系中剩余的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)和引物，具体操作方法如下：
将步骤3.1获得的PCR扩增后的目的基因产物放入离心机中3000转/min离心3min，在1.5ml Tube管中按照下述顺序配制SAP酶Mix(即纯化反应液)：
将Mix平均分布于12孔连排管。轻轻揭开胶皮盖，用12排枪取2ul的Mix加入到每个孔中，并来回抽打，保证混匀，将胶皮盖盖紧，并用圆形物体压紧。在离心机中3000转/min离心3min，离心完毕，重新用圆形物体将胶皮盖盖紧。按照下述程序，在PCR仪中进行SAP酶消化：37℃40min，85℃5min，10℃保存。
得到纯化后的目的基因。
2.3单碱基延伸终止反应
将纯化后的目的基因放入离心机中3000转离心3min；在1.5mlTube管中按照下述顺序配制单碱基延伸反应Mix(即延伸反应液)：
将Mix平均分布于12孔连排管，轻轻揭开胶皮盖；用12排枪取2ul的Mix加入到每个孔中，并来回抽打，保证混匀，将胶皮盖盖紧，并用圆形物体压紧；在离心机中3000转离心3min，离心完毕，重新用圆形物体将胶皮盖盖紧；按照下述程序，在PCR仪中进行单碱基延伸反应：
3树脂纯化
将步骤3.3得到的反应产物(共9ul)稀释3倍，使用树脂进行脱盐；将脱盐处理后的样品点在样品靶上，自然结晶，上机进行质谱检测，并收集数据。
4数据分析
当男性HBV感染者的质谱检测结果显示TLR3基因的rs5743313位点不是C/T时，则判断该男性被检者会自然消除HBV感染，当质谱检测结果显示TLR3基因的rs5743313位点为C/T时，则判断该男性会发展为HBV慢性携带者、慢乙肝、甚至肝硬化、肝细胞癌。
应用实施例
本实施例是应用实施例1提供的试剂盒及实施例2提供的方法对686例样本进行检测和分析，从而判断HBV男性感染者是否会自然消除，具体如下：
1研究对象
本研究中所有病例均符合2009年慢性乙型肝炎指南的诊断标准，入组和排除标准如下：
1.1正常对照组
入选标准为汉族，年龄≥40岁；HBsAg、anti-HBs、HBeAg、anti-HBe均阴性，未接种过乙肝疫苗。未感染其他肝炎病毒；无全身系统性疾病(如肾脏疾病、心脏病、自身免疫性疾病等对结果判断有影响者)。
1.2HBV自然痊愈组
入选标准为汉族，年龄≥40岁；anti-HBs、anti-HBc阳性或anti-HBs阳性但未接种过乙肝疫苗；HBV DNA、anti-HAV、anti-HCV或anti-HDV、anti-HEV阴性；无全身系统性疾病(如肾脏疾病、心脏病、自身免疫性疾病等对结果判断有影响者)
1.3HBV携带者
入选标准为汉族，年龄≥40岁；HBsAg阳性至少半年，anti-HAV、anti-HCV或anti-HDV、anti-HEV阴性；ALT及AST检测正常范围。
1.4慢性乙型肝炎组
入选标准为汉族，年龄≥40岁；HBsAg阳性至少半年，anti-HAV、anti-HCV或anti-HDV、anti-HEV阴性；ALT或AST≥60IU/L或2倍正常值上限或肝、脾肿大；或肝组织病理证实为慢性肝炎者；临床上无肝硬化表现(如门脉高压、脾功能亢进等)；无全身系统性疾病(如肾脏疾病、心脏病、自身免疫性疾病等对结果判断有影响者)。
由于乙肝肝硬化及肝细胞癌多在40岁之后发生，因此，我们选择正常对照组、HBV自然痊愈组、HBV携带者和慢性乙型肝炎组均选择年龄≥40岁。
1.5肝硬化组
入选标准为汉族，年龄不限，HBsAg阳性；anti-HAV、anti-HCV或anti-HDV、anti-HEV阴性；临床上有肝硬化表现(如影像学诊断、胃食道静脉曲张或出血、出现腹水或两下肢浮肿或出现肝性脑病等)；无全身系统性疾病(如肾脏病疾、心脏病、自身免疫性疾病等对结果判断有影响者)。
1.6肝细胞癌组
入选标准为汉族，年龄不限；HBsAg阳性；anti-HAV、anti-HCV或anti-HDV、anti-HEV阴性；肝细胞癌被肝组织病理检查证实或AFP和超声、CT、或MRI证实；无全身系统性疾病(如肾脏病疾、心脏病、自身免疫性疾病等对结果判断有影响者)。
将样本以及进行HBV DNA定量及HBsAg、anti-HBs、HBeAg、Anti-HBe、anti-HAV、anti-HCV、anti-HDV和anti-HEV的检测，排除其他类型肝炎，并明确病人感染状态，得到如表1所示的人口学特征和临床特征表：
从表可以看出，正常对照、自然痊愈组、HBV携带者、慢性乙型肝炎组、肝硬化组和肝癌组年龄均数分别为49.87岁、50.11岁、49.28岁、48.37岁、48.96岁和49.31岁(P＝0.425)。慢性乙型肝炎组、肝硬化组和肝细胞癌组的男性明显较健康对照组多(72.4％，76.8％，82.7％vs 48.8％，P＝0.000)。慢性乙型肝炎组中HBeAg阳性者67例，Anti-HBe阳性者64例；肝硬化组中HBeAg阳性者45例，Anti-HBe阳性者48例；肝细胞癌组中HBeAg阳性者32例，Anti-HBe阳性者66例；自然痊愈组中Anti-HBe阳性者28例；慢性乙型肝炎组、肝硬化组和肝癌组HBeAg阳性率分别为46.2％、40.5％和29.4％；Anti-HBe阳性率在自然痊愈组、携带者、慢性乙型肝炎组、肝硬化组和肝细胞癌组中分别为19.3％、69.8％、44.1％、43.2％和60.6％。慢性乙型肝炎组HBV DNA阳性者94例，肝硬化组HBV DNA阳性者57例，肝细胞癌组HBV DNA阳性者80例，其阳性率分别为72.3％、65.5％、76.2％。
2、应用实施例1的试剂盒及实施例2提供的方法对686例样本进行检测和分析
2.1不同性别HBV感染结局与TLRs通路单个位点多态性关系
在男性中，rs5743313CC基因型在自然痊愈组明显多于HBV携带者+慢乙肝(87.1％vs 74.2％，p＝0.033，OR＝0.425，95％CI 0.190-0.949)。rs5743313CC基因型在自然痊愈组明显多于HBV携带者+慢乙肝+肝硬化+肝癌(87.1％vs 74.4％，p＝0.023，OR＝0.429，95％CI 0.204-0.905)。可见，rs5743313CC基因型与HBV感染后自然清除有密切关系。其余位点与男性HBV感染后结局无关(p>0.05)。Logistic回归结果显示，rs5743313CT基因型是HBV感染后不能自然清除，而发生HBV慢性携带者、慢乙肝甚至肝硬化、肝细胞癌的独立危险因素(p＝0.041，OR＝2.180，95％CI1.032-4.605)。
在女性中，未发现以上位点与HBV不同结局相关。
表4：男性患者中单个位点基因型和等位基因分布情况
其中，h表示慢乙肝与肝硬化+肝癌CT+TT与CC比较，i表示慢乙肝与肝癌CT+TT与CC比较，j表示HBV携带者+慢乙肝与肝癌CT+TT与CC比较k表示慢乙肝比肝硬化CT+TT与CC比较，l表示HBV携带者与慢乙肝CT+TT与CC比较，m表示HBV携带者+慢乙肝与肝硬化CT+TT与CC比较，n表示HBV携带者+慢乙肝+肝硬化+肝癌与自然痊愈组CT+TT与CC比较，o表示慢乙肝+HBV携带者与自然痊愈组CT+TT与CC比较。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之类。
序列表
<110>北京大学第一医院
<120>一种检测男性感染HBV后能否自然清除的试剂盒及方法
<160> 1
<170>PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 31
<212> DNA
<213>人工序列
ACGTTGGATGTTCCACCCAGTGCTGCAGG 31
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213>人工序列
ACGTTGGATGTGGTGTCATCCTCCTGAGAG 30
<210> 3
<211> 15
<212> DNA
<213>人工序列
AGCCCCAGGAGAGGT 15
Claims (3)
1.检测TLR3基因的rs5743313位点的试剂用于制备检测男性感染HBV后能否自然清除的试剂盒的用途，其特征在于，所述试剂盒包括：
包括用于扩增样本中含有rs5743313位点的DNA的特异性引物的扩增反应液；
包括用于纯化所述DNA的SAP酶的纯化反应液；
用于得到TLR3基因的rs5743313位点的碱基检测结果的单碱基延伸引物的延伸反应液。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述特异性引物包括：
正向引物：5’-ACGTTGGATGTTCCACCCAGTGCTGCAGG-3’；
反向引物：5’-ACGTTGGATGTGGTGTCATCCTCCTGAGAG-3’。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述单碱基延伸引物为：5’-AGCCCCAGGAGAGGT-3’。
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Non-Patent Citations (1)
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| "Toll-Like Receptor 3 Polymorphism and Its Association With Hepatitis B Virus Infection in Saudi Arabian Patients";Ahmed Al-Qahtani等;《Journal of Medical Virology》;20120930;第84卷(第9期);第1354页，第4段，17-34行，第1358页，表5，两组患者的TRL3基因型比较 * |
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