CN106834181B - 一种乳酸片球菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种乳酸片球菌及其在制备调味品中的用途，还涉及应用该乳酸片球菌制备调味品的方法。该菌株为乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)ZF559，其保藏编号为CCTCC M 2016690。在制备调味品时应用该菌株，够显著抑制芽孢杆菌的生长，显著降低产品中的芽孢杆菌数。

Description

一种乳酸片球菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种乳酸片球菌及其在制备调味品中的用途，还涉及应用该乳酸片球菌制备调味品的方法。

背景技术

酱或酱油等传统发酵型调味品的生产过程中，会繁殖大量的芽孢杆菌。制曲过程中，芽孢杆菌的生长会消耗原料中的碳水化合物、有机酸和氨基酸，产生不良气味，还会产生抗真菌性物质且迅速消耗氧气，从而抑制曲霉生长，降低曲霉的蛋白酶活，严重影响后续发酵质量。研究人员还发现，芽孢杆菌还是造成酱油涨袋变质的主要微生物。芽孢杆菌产生的芽孢，其耐热性非常强，在产品灭菌包装前需要采用高温长时间灭活，这会造成产品风味和营养的损失，以及生产能耗的增加，还可能带来产品菌落总数超标的风险。因此，在制曲阶段控制芽孢杆菌的增殖，对于提升制曲和发酵质量显得特别重要。

在制曲阶段，微球菌和链球菌的增殖产酸，可以使pH值下降，从而对芽孢杆菌的生长起到抑制作用，但是，微球菌的大量增值可能会导致pH值下降过快而对发酵醪产生不利影响(参见包启安，酱油科学与酿造技术，中国轻工业出版社，2011)。

CN105524905A公开了一种含酸性蛋白酶的酱油复合酶，该复合酶中含有能够抑制枯草芽孢杆菌的香辛料提取物，香辛料提取物可防止酱油发酵过程杂菌污染，保证发酵正常进行。

在酱或酱油等传统发酵型调味品的生产过程中，如何控制芽孢杆菌的增殖，促进曲霉菌株的生长，提升曲霉的蛋白酶活力，一直是本领域致力解决的问题。

发明内容

发明人从佛山市海天(高明)调味食品有限公司发酵酱醪中意外获得一株乳酸片球菌。在制曲时加入该菌株，能够显著抑制芽孢杆菌的生长，不会造成pH值的下降，不会对后续发酵带来负面影响，能够确保多菌种的协调生长，促进曲霉菌株的生长，提升曲霉的蛋白酶活力，改善发酵指标和风味口感质量，显著降低产品中的芽孢杆菌数。

本发明的第一方面涉及一种乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)ZF559，其保藏编号为CCTCC M 2016690。

该菌株已于2016年11月28日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为武汉市武汉大学，邮编：430072)，保藏编号为CCTCC M 2016690，分类命名为乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)，菌株名称为ZF559。

发明人从佛山市海天(高明)调味食品有限公司发酵酱醪中分离获得一株菌株，将其命名为ZF559，筛选流程参见图1。根据细胞形态、生理生化特征、16S rRNA基因测序、pheS基因测序等实验数据综合分析，该菌株被鉴定为乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)。鉴定结果见《中国科学院微生物研究所检验鉴定报告(2015)微检字第127号》。该菌株的细胞形态和理化实验结果如表1所示。

表1细胞形态和理化实验结果

本发明所述的乳酸片球菌ZF559来源于传统发酵体系，属于传统上用于食品生产加工的菌种。根据欧洲食品安全局(EFSA)针对食品用微生物菌种(MFC)2013年版发布的通过安全资格认证(QPS)的微生物列表，乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)无使用限制条件，属于安全性高的微生物菌种。

利用培养乳酸菌的常规方法培养本发明所述的乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)ZF559，能够得到活力高，菌浓度达到10⁸CFU/mL以上的菌种培养液。优选的培养温度为30℃～35℃，优选的培养时间为16小时～48小时，

本发明的第二方面涉及一种复合菌，其中包含本发明第一方面所述的乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)ZF559，以及任选的其他菌种。

在一个实施方式中，本发明所述的复合菌，其中所述的其他菌种为可以用于制备发酵型调味品的菌种，例如米曲霉(Aspergillus oryzae)或酱油曲霉(Aspergillussojae)。本发明所述的复合菌中，所述乳酸片球菌ZF559和所述其他菌种的质量比优选为1:10～1:2(例如1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8或1:9)。

在另一个实施方式中，本发明所述的复合菌由由本发明所述的乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)ZF559和米曲霉(Aspergillus oryzae)组成，乳酸片球菌ZF559和米曲霉的质量比优选为1:10～1:2(例如1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8或1:9)。

在另一个实施方式中，本发明所述的复合菌由由本发明所述的乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)ZF559和酱油曲霉(Aspergillus sojae)组成，乳酸片球菌ZF559和酱油曲霉的质量比优选为1:10～1:2(例如1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8或1:9)。

在另一个实施方式中，本发明所述的复合菌由由本发明所述的乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)ZF559、米曲霉(Aspergillus oryzae)和酱油曲霉(Aspergillus sojae)组成，其中米曲霉和酱油曲霉的质量比优选为1:9～9:1，乳酸片球菌ZF559和混合曲霉(米曲霉和酱油曲霉混合物)的质量比优选为1:10～1:2(例如1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8或1:9)。

本发明的第三方面涉及本发明第一方面所述乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)ZF559或所述的复合菌在制备调味品中的用途。

本发明的第四方面涉及一种制备调味品的方法，包括使用本发明所述乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)ZF559或所述的复合菌制备调味品的步骤。

在一个实施方式中，本发明第四方面所述的制备方法，其中所述的乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)ZF559或复合菌在制曲步骤中使用。

在前述本发明第四方面任一实施方式中，所述的制备方法包括以下步骤：

1)将所述的乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)ZF559以及其他制曲所需菌种接种至制曲原料中，或者将所述复合菌接种至制曲原料中，培养得到成曲；

2)向成曲中加入盐水后发酵。

在前述本发明第四方面任一实施方式中，所述制备方法的步骤1)中所述的乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)ZF559的接种量为1×10³～1×10⁷CFU/g制曲原料，优选为1×10³～9.9×10⁶CFU/g制曲原料，进一步优选为1×10³～9.9×10⁵CFU/g制曲原料。

前述本发明第四方面任一实施方式中所述的制备方法，步骤1)中的培养可以在本领域领域常用的制曲条件下进行培养。培养温度优选为：28℃～38℃。培养时间优选为24小时～60小时，例如48小时。

前述本发明第四方面任一实施方式中所述的制备方法，步骤2)中可以采用本领域常用的发酵方法进行发酵，例如高盐稀态发酵、高盐稀态天然晒制发酵、低盐固态发酵、低盐保温发酵。发酵方法的工艺参数可以根据实际生产情况进行调整。

前述本发明第四方面任一实施方式中所述的制备方法，其中所述的制曲原料选自大豆、脱脂大豆、小麦和麸皮。所述小麦优选为小麦粉。

本发明所述的调味品主要是指利用微生物及其酶进行发酵而产生风味的发酵型调味品，例如酱油、酱、醋、豆豉或腐乳等。

在一个具体的实施方式中，本发明利用所述的乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)ZF559制备酱油或酱。在制曲时，将大豆/脱脂大豆和小麦/小麦粉按常规方法进行蒸煮处理后，接种本发明乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)ZF559和其他制曲所需菌种(例如米曲霉和/或酱油曲霉)，乳酸片球菌ZF559的接种浓度为10³CFU/g曲料～10⁷CFU/g曲料，米曲霉或酱油曲霉的接种量为原料重量的0.01％～5％。制曲时间为24～60小时。得到的成曲，芽孢杆菌少、pH值不下降、蛋白酶活力高，而且芽孢杆菌数降低一个数量级以上，中性蛋白酶活力提高30％以上，成曲pH值在6.0～6.4之间，在合理范围内。

将上述成曲采用晒池或发酵罐进行发酵，盐分管理、温度管理和发酵周期管理按照常规方法进行，发酵终止时的酱醪芽孢杆菌数降低了1～2个数量级以上，氨基酸态氮提高5％以上，酱醪风味得到改善。

本发明的有益技术效果

本发明提供的乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)ZF559易于培养，安全性高。利用该菌种制备调味品，具有以下一个或多个优点：

1)能够显著降低成曲中的芽孢杆菌数量；

2)显著提升成曲中的中性蛋白酶活力；

3)成曲的pH值不降低；

4)所得调味品中芽孢杆菌数量显著降低；

5)所得调味品中氨基酸态氮含量显著提升；

6)所得调味品的风味得到明显改善；

7)所得调味品的产品质量得到提升。

附图说明

图1乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)ZF559的筛选流程图；

图2实施例2制备的高盐稀态发酵原油的感官鉴评结果；

图3实施例3制备的低盐保温发酵原油的感官鉴评结果；

图4实施例4制备的发酵豆醅的感官鉴评结果。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。除非特别说明，实施例中采用的试剂、方法和设备均为本技术领域常规试剂、方法和设备。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用材料、试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

除非特别说明，本发明实施例所用培养基和试验条件为本领域常规培养基和试验条件。

下面实施例中：

菌落总数的检测方法参照GB 4789.2-2010。

芽孢杆菌数的检测方法中，常规操作参照GB 4789.2-2010，特殊操作是在稀释后选择2～3个适宜的稀释度，水浴92℃±1℃维持15min，然后按GB 4789.2-2010中的方法进行接种培养和计数。

乳酸菌数的检测方法中，常规操作参照GB 4789.2-2010，特殊操作是培养基选择MRS培养基，接种后采用厌氧培养箱进行培养。

中性蛋白酶活力的检测方法参照《发酵调味品生产技术》(上海酿造科学研究所编著修订版)第一章第六节。

总酸的检测方法参照GB/T 12456-2008。

氨基酸态氮的检测方法参照GB/T 5009.39-2003中的第一法和GB/T 5009.40-2003。

还原糖的检测方法参照GB 5009.7-2008。

谷氨酸的检测方法参照GB/T 5009.124-2003

酱油原油和豆醅的感官鉴评方法：召集10名具有丰富感官鉴评经验的鉴评人员，设计2～5个样品进行鉴评，鉴评内容包括鲜味、甜味、酸味、苦涩味、咸味和浓厚感共5个方面，对各个维度进行评分，以5分为满分，分数越高喜好度越好。鉴评中的注意事项参照GB/T12315-2008。

下面实施例中用到的米曲霉来自公司自有菌种资源库。

实施例一

称取MRS肉汤商品培养基，按产品说明书加入蒸馏水溶解，121℃灭菌15min后冷却备用。取出保藏的乳酸片球菌(ZF559)和植物乳杆菌冻存管菌种(沪酿1.08)，分别将这两种菌株于40℃水浴迅速解冻1min，然后在无菌条件下按1v/v％接种量将乳酸片球菌(ZF559)和植物乳杆菌冻存管菌种(沪酿1.08)分别接种到MRS肉汤培养基中，30℃～35℃静置培养24小时，即分别获得浓度为10⁸CFU/mL以上的乳酸片球菌培养液和植物乳杆菌培养液，放于4℃冰箱备用。

实施例二 乳酸片球菌ZF559在制备高盐稀态发酵酱油中的应用

1.制曲

采用脱脂大豆和小麦粉为原料制曲，其中脱脂大豆和小麦粉的质量比为6.5:3.5。分别设置空白对照例和实验例，空白对照例只接种米曲霉，实验例同时接种米曲霉和本发明所述的乳酸片球菌ZF559。空白对照例和实验例中米曲霉的接种量相同，均为0.5wt％。实验例中乳酸片球菌ZF559的接种量参见表2。

制曲的方法为：先将脱脂大豆加入1倍重量的水，拌匀后润水1小时，0.1Mpa下高压蒸煮30min，冷却至40℃时，加入小麦粉、米曲霉和乳酸片球菌ZF559(空白对照例不加)，进行通风制曲，整个制曲过程中控制曲料温度在28℃～38℃之间，培养48小时时得到成曲。

检测成曲中的菌落总数、芽孢杆菌数、乳酸菌数和中性蛋白酶活力，结果见表2。结果显示，与空白对照例相比，添加了本发明的乳酸片球菌ZF559后未造成成曲乳酸菌总数的升高和pH值的显著降低，菌落总数处于同一数量级，芽孢杆菌降低1～2个数量级，中性蛋白酶活力提升显著。同时，在一定范围内乳酸片球菌ZF559接种量越高芽孢杆菌数越低，但接种量过高可能对成曲pH值和蛋白酶活力带来负面影响。其中，10⁵CFU/g曲料的接种量对应的芽孢杆菌降低两个数量级，中性蛋白酶活力提升32％以上，pH值在6.0～6.4之间，处于正常范围。

表2酱油成曲质量对比分析结果

2.发酵

向成曲分别加入2倍重量浓度为19wt％的盐水，混匀后进行高盐稀态天然晒制发酵，发酵过程中第2、5天搅拌均匀，后面每隔1周搅拌一次，发酵60天结束，过滤酱油原油。

检测所得酱油原油的总酸、氨基酸态氮、还原糖和谷氨酸，结果见表3。并对酱油原油进行感官鉴评，结果见图2。

结果显示，与空白对照例相比，添加了本发明的乳酸片球菌ZF559以后，酱油原油的总酸、氨基氮都有一定幅度的提升，还原糖和谷氨酸指标变化不大。其中，10⁵CFU/g曲料的接种量发酵得到的酱油原油的氨基酸态氮指标最高，提升7％以上。

与空白对照例相比，不同乳酸片球菌ZF559接种量在鲜味、甜味、咸味、苦涩味和浓厚感方面有不同程度的改善提升，除了10⁶CFU/g曲料的接种量以外，其他酸味无明显差异。其中，10⁵CFU/g曲料的接种量发酵得到的酱油原油综合滋味最优，酱油原油的风味改善效果显著。

表3高盐稀态得到的酱油原油理化指标检测结果

实施例三 乳酸片球菌ZF559在制备低盐保温发酵酱油中的应用

1.制曲

采用脱脂大豆和小麦粉为原料制曲，其中脱脂大豆和小麦粉的质量比为6.5:3.5。分别设置空白对照例和实验例，空白对照例只接种米曲霉，实验例同时接种米曲霉和本发明所述的乳酸片球菌ZF559。空白对照例和实验例中米曲霉的接种量相同，均为0.5wt％。实验例中乳酸片球菌ZF559的接种量为10⁵CFU/g曲料。

制曲的方法同实施例二中所述。

2.发酵

本实施例采用低盐保温发酵工艺对成曲进行发酵。向成曲中分别加入1.6倍重量浓度为15wt％的盐水，混匀后进行50℃保温低盐发酵，发酵第2、5、12、19天进行淋油，每次淋油量为添加盐水量的4wt％，发酵30天结束后过滤获得酱油原油。

检测酱油原油中的总酸、氨基酸态氮、还原糖和谷氨酸，结果见表4。同时，对酱油原油进行感官鉴评，结果见图3。

结果显示，与空白对照例相比，添加了乳酸片球菌ZF559以后，采用低盐保温发酵工艺，得到的酱油原油的总酸、还原糖、谷氨酸变化不大，氨基酸态氮提升5％以上。

如图3所示，与空白对照例相比，接种了乳酸片球菌ZF559的曲料发酵得到的酱油原油在鲜味和浓厚感方面改善明显，其他方面差异不明显。

表4低盐保温发酵得到的酱油原油理化指标检测结果

实施例四 乳酸片球菌ZF559在制备豆酱中的应用

1.制曲

采用大豆和小麦粉为原料制曲，其中大豆和小麦粉的质量比为7:3。分别设置空白对照例、阳性对照例和实验例，空白对照例只接种米曲霉，阳性对照例同时接种植物乳杆菌和米曲霉，实验例同时接种米曲霉和本发明所述的乳酸片球菌ZF559。空白对照例、阳性对照例和实验例中米曲霉的接种量相同，均为0.4wt％。阳性对照例中植物乳杆菌的接种量为10⁵CFU/g曲料。实验例中乳酸片球菌ZF559的接种量为10⁵CFU/g曲料。

制曲的方法为：先将大豆加3倍重量的水40℃浸泡2小时，0.1Mpa下高压蒸煮10min，冷却至40℃时，加入小麦粉、米曲霉、植物乳杆菌或乳酸片球菌ZF559，进行通风制曲，整个制曲过程中控制曲料温度在28℃～38℃之间，培养40小时后得到豆酱成曲。

检测豆酱成曲中的菌落总数、芽孢杆菌数、乳酸菌数和中性蛋白酶活力，结果见表5。

表5豆酱成曲质量对比分析结果

结果显示，与空白对照例相比，添加植物乳杆菌以后，虽然芽孢杆菌数得到了一定程度的抑制，但豆酱成曲的pH值出现了显著降低，菌落总数和乳酸菌数出现了显著升高，中性蛋白酶活力出现小幅度下降。而添加了本发明的乳酸片球菌ZF559以后，豆酱成曲中菌落总数和乳酸菌数差异不大，均处于同一数量级，成曲的pH值未出现显著降低，基本维持在同一水平，芽孢杆菌降低1个数量级以上，中性蛋白酶活力提升41％，pH值在6.0～6.4之间，处于正常范围内。

2.发酵

向成曲中分别加入1.8倍重量浓度为19wt％的盐水，混匀后进行天然晒制发酵，发酵第2、5、15、25、36天搅拌均匀，发酵45天结束后得到豆醅。

检测豆醅的总酸、氨基酸态氮、还原糖和谷氨酸，结果见表6。同时，对所得豆醅进行感官鉴评，结果见图4。

表6发酵豆醅理化指标检测结果

结果显示，与空白对照例相比，添加植物乳杆菌后，虽然芽孢杆菌得到有效抑制，但发酵豆醅的总酸升高，氨基酸态氮呈现下降趋势；而添加了乳酸片球菌ZF559以后，发酵豆醅中的总酸、还原糖、谷氨酸差异不大，氨基酸态氮含量提升10％以上，芽孢杆菌得到有效控制。

如图4所示，与空白对照例相比，添加植物乳杆菌后咸味较弱，但口感偏酸，而添加乳酸片球菌ZF559以后，咸味和浓厚感均有显著改善，酸味和其他呈味无明显影响，表现出了对发酵豆醅风味改善的有益效果。

Claims (24)

1.乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)ZF559，其保藏编号为CCTCC NO:M2016690。

2.一种复合菌，其中包含权利要求1所述的乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)ZF559，以及任选的其他菌种。

3.权利要求2所述的复合菌，其中所述的其他菌种为用于制备发酵型调味品的菌种。

4.权利要求3所述的复合菌，其中所述发酵型调味品为酱油、酱、醋、豆豉或腐乳。

5.权利要求3所述的复合菌，其中所述的其他菌种为米曲霉(Aspergillus oryzae)或酱油曲霉(Aspergillus sojae)。

6.权利要求2所述的复合菌，其中所述复合菌由权利要求1所述的乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)ZF559和米曲霉(Aspergillus oryzae)组成，或者

所述复合菌由权利要求1所述的乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)ZF559和酱油曲霉(Aspergillus sojae)组成，或者

所述复合菌由权利要求1所述的乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)ZF559、米曲霉(Aspergillus oryzae)和酱油曲霉(Aspergillus sojae)组成。

7.权利要求6所述的复合菌，其中所述复合菌由权利要求1所述的乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)ZF559和米曲霉(Aspergillus oryzae)组成，乳酸片球菌ZF559和米曲霉的质量比为1:10～1:2。

8.权利要求6所述的复合菌，其中所述复合菌由权利要求1所述的乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)ZF559和酱油曲霉(Aspergillus sojae)组成，乳酸片球菌ZF559和酱油曲霉的质量比为1:10～1:2。

9.权利要求6所述的复合菌，其中所述复合菌由权利要求1所述的乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)ZF559、米曲霉(Aspergillus oryzae)和酱油曲霉(Aspergillus sojae)组成，米曲霉和酱油曲霉的质量比为1:9～9:1，乳酸片球菌ZF559与米曲霉和酱油曲霉的混合物的质量比为1:10～1:2。

10.权利要求1所述乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)ZF559或权利要求2至9任一项所述的复合菌在制备调味品中的用途。

11.权利要求10所述的用途，其中所述调味品为发酵型调味品。

12.权利要求11所述的用途，其中所述发酵型调味品为酱油、酱、醋、豆豉或腐乳。

13.一种制备调味品的方法，包括使用权利要求1所述乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)ZF559或权利要求2至9任一项所述的复合菌制备调味品的步骤。

14.权利要求13所述的制备调味品的方法，其中所述调味品为发酵型调味品。

15.权利要求14所述的制备调味品的方法，其中所述发酵型调味品为酱油、酱、醋、豆豉或腐乳。

16.权利要求13所述的制备调味品的方法，其中所述的乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)ZF559或复合菌在制曲步骤中使用。

17.权利要求13至16任一项所述的制备调味品的方法，包括以下步骤：

1)将所述的乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)ZF559以及其他制曲所需菌种接种至制曲原料中，或者将所述复合菌接种至制曲原料中，培养得到成曲；

2)向成曲中加入盐水后发酵。

18.权利要求17所述的制备调味品的方法，步骤1)中所述的乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)ZF559的接种量为1×10³～1×10⁷CFU/g制曲原料。

19.权利要求18所述的制备调味品的方法，其中步骤1)中所述的乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)ZF559的接种量为1×10³～9.9×10⁶CFU/g制曲原料。

20.权利要求19所述的制备调味品的方法，其中步骤1)中所述的乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)ZF559的接种量为1×10³～9.9×10⁵CFU/g制曲原料。

21.权利要求17所述的制备调味品的方法，其中培养温度为28℃～38℃。

22.权利要求17所述的制备调味品的方法，其中培养时间为24小时～60小时。

23.权利要求17所述的制备调味品的方法，其中步骤2)中发酵的方法选自：高盐稀态发酵、低盐固态发酵和低盐保温发酵。

24.权利要求17所述的制备调味品的方法，其中步骤2)中发酵的方法为高盐稀态天然晒制发酵。