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CN106467576B - 一种抗体融合蛋白及其制备方法与应用 - Google Patents

一种抗体融合蛋白及其制备方法与应用 Download PDF

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CN106467576B CN201610499349.3A CN201610499349A CN106467576B CN 106467576 B CN106467576 B CN 106467576B CN 201610499349 A CN201610499349 A CN 201610499349A CN 106467576 B CN106467576 B CN 106467576B
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Abstract

本发明提供了一种抗体融合蛋白，包括抗肿瘤抗原特异性抗体或所述抗肿瘤抗原特异性抗体的Fab片段、单域抗体或单链抗体，还包括人源NKG2D配体或配体片段；所述人源NKG2D配体或配体片段与所述抗肿瘤抗原特异性抗体或所述抗肿瘤抗原特异性抗体的Fab片段、所述单域抗体或所述单链抗体通过连接肽相连。本发明通过以抗肿瘤抗原特异性抗体靶向肿瘤细胞，以NKG2D的天然配体而非其抗体来活化NK细胞杀伤肿瘤细胞的功能。该途径避免了广泛活化FcγR表达细胞所带来的毒副作用，高效、特异性激活NK细胞杀伤肿瘤细胞，可发展成为新型的抗肿瘤生物治疗药物。

Description

一种抗体融合蛋白及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及免疫技术领域，具体来说，涉及一种抗体融合蛋白及其制备方法与应用。
背景技术
抗体药物是以细胞工程技术和基因工程技术为主体的抗体工程技术制备的药物，具有特异性高、性质均一及针对特定靶点定向制备等优点。目前，抗体药物已经成为治疗血液恶性肿瘤和实体瘤最成功与最重要的策略之一。
按抗肿瘤抗体药物的结构可将其分为4类：1.抗体或抗体片段；2.双特异性抗体或三功能抗体；3.抗体偶联物；4.抗体融合蛋白。
其中，抗体融合蛋白是将抗体(或抗体片段)与其他效应蛋白基因融合，构建融合表达载体，然后在合适的表达系统生产融合蛋白。
目前，在肿瘤靶向治疗中，激活T细胞作为免疫效应细胞很为常见，原因为：(1)T细胞群存在免疫记忆细胞；(2)肿瘤组织中存在肿瘤特异的侵润性T淋巴细胞；(3)体内外实验表明抗CD3抗体活化的杀伤细胞(CD3AK)比IL-2激活的杀伤细胞(LAK)具有更强的细胞毒效应。靶向TCR/CD3复合物或CD2的双特异性抗体具有靶向所有T细胞的能力，并不受MHC的限制。然而，T细胞的充分活化还需要共刺激信号，CD28/B7的相互作用在增强IL-2的产生和高亲和力IL-2受体的上调中起重要的作用，除了CD28外,CD2、LFA-1、CD5、ICAM-1、CD40以及细胞因子如IL-2、肿瘤坏死因子(TNF)等对T细胞的活化也起作用，因此临床上用药时还要全面考虑到T细胞充分活化所需要的共刺激信号，应用细胞因子或共刺激信号通路途径联合用药，并要将联合用药的毒副作用降到最低的程度。
NK细胞作为肿瘤靶向治疗的免疫效应细胞已有多项报道，NK细胞是天然的、非MHC限制的细胞毒性淋巴细胞，NK细胞的活性是由NK细胞表面表达的一系列抑制性和活化性受体所介导的信号平衡所决定的。目前激活NK细胞所使用的分子多为FcγRⅢ(CD16)，然而，CD16除了在NK细胞表面表达，在单核/巨噬细胞和树突状细胞上均有表达，广泛地活化这些细胞会带来很强的毒副作用。
发明内容
本发明提供了一种抗体融合蛋白及其制备方法与应用,不仅可以达到高效、特异性杀伤肿瘤细胞的效果，而且避免了毒副作用、降低了抗体的异源性。
本发明提供一种抗体融合蛋白，包括抗肿瘤抗原特异性抗体或所述抗肿瘤抗原特异性抗体的Fab片段、单域抗体或单链抗体，还包括人源NKG2D配体或配体片段；
所述人源NKG2D配体或配体片段与所述抗肿瘤抗原特异性抗体或所述抗肿瘤抗原特异性抗体的Fab片段、所述单域抗体或所述单链抗体通过连接肽相连。
以上所述的抗体融合蛋白，所述人源NKG2D配体的氨基酸序列如SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6所示。
以上所述的抗体融合蛋白，所述人源NKG2D配体的编码基因序列如SEQ ID NO：7至SEQ ID NO：12所示。
以上所述的抗体融合蛋白，所述抗肿瘤抗原特异性抗体为靶向于人肿瘤的特异性抗体。
本发明的另一个方面，还提供了含有以上任一所述的抗体融合蛋白的编码基因的重组载体、重组细胞、重组菌或表达盒。
本发明的再一个方面，还提供以上任一所述的抗体融合蛋白的制备方法，包括如下步骤：
(a)将所述抗体融合蛋白的重链编码基因、NKG2D配体编码基因和连接肽编码基因插入pBluescript ⅡSK(+)载体，构建pBS-SK-H质粒
(b)将所述抗体融合蛋白的轻链编码基因插入pBluescript ⅡSK(+)载体，构建pBS-SK-L质粒；
(c)酶切所述pBS-SK-H质粒，获得含有所述抗体融合蛋白的重链编码基因、NKG2D配体编码基因和连接肽编码基因的载体片段；
(d)酶切所述pBS-SK-L质粒，获得含有所述抗体融合蛋白的轻链编码基因的载体片段；
(e)将所述步骤(c)和步骤(d)获得的载体片段插入表达载体，获得重组表达载体；
(f)将步骤(e)中获得的重组表达载体转化受体细胞，表达所述抗体融合蛋白。
以上所述的制备方法，所述步骤(e)中的表达载体为pcDNA3.0-FLAG。
以上所述的制备方法，所述步骤(f)中的受体细胞为293T细胞。
以上所述的抗体融合蛋白的制备方法仅为举例说明，所述表达载体以及受体细胞可进行适当选择，任何能实现本发明目的的表达载体以及受体细胞均可。
本发明的又一个方面，提供如以上任一所述的抗体融合蛋白在制备用于抗肿瘤药物中的用途。
本发明的再一个方面，提供含有以上任一所述的抗体融合蛋白的药物。
本发明的优势如下：
本发明主要利用了NK细胞活化受体NKG2D的配体(NKG2DL)与靶向肿瘤相关抗原的抗体形成融合蛋白，利用肿瘤相关抗原的抗体作为靶向，通过NKG2DL激活NK细胞，NK细胞活化受体NKG2D表达于所有的NK细胞表面，NKG2D的表达具有很强的特异性，通过NKG2DL与NK细胞活化受体NKG2D结合，激活NK细胞，促进NK细胞的细胞毒功能，使NK细胞特异性杀伤肿瘤细胞。
本发明利用NKG2D的天然配体而非其抗体来活化相关信号通路，该途径避免了广泛活化FcγR表达细胞所带来的毒副作用，高效、特异性激活NK细胞杀伤肿瘤细胞的功能。
本发明的的融合蛋白使用NKG2D的配体为人源，避免了使用鼠源蛋白会产生的人抗鼠抗体(HAMA)问题，降低了抗体的异源性。
附图说明
图1为本发明实施例中的抗体融合蛋白的结构示意图；
图2为本发明实施例中使用的pBluescript Ⅱ SK(+)载体结构示意图；
图3为本发明实施例中抗体融合蛋白的重链及轻链的结构示意图；
图4为本发明实施例中使用的表达载体pcDNA3.1-FLAG的结构示意图；
图5为本发明实施例中轻链pBS-SK-L构建成功的鉴定图；
图6为本发明实施例中重链中pBS-SK-Linker构建成功的鉴定图；
图7为本发明实施例中重链中pBS-SK-VH-CH1-linker构建成功的鉴定图；
图8为本发明实施例中重链中pBS-SK-H构建成功的鉴定图(以MICA为例)；
图9为本发明实施例中轻链pcDNA3.1-FLAG-L构建成功的鉴定图；
图10为本发明实施例中重链pcDNA3.1-FLAG-H构建成功的鉴定图(以MICA为例)；
图11为本发明实施例中轻链pcDNA3.1-FLAG-L蛋白表达鉴定图；
图12为本发明实施例中重链pcDNA3.1-FLAG-H蛋白表达鉴定图(以MICA为例)；
图13为本发明实施例中检测Hep3B细胞株表面EGFR的表达鉴定图；
图14为本发明实施例中检测Hep3B细胞株表面MICA的表达鉴定图；
图15为本发明实施例中检测在抗体融合蛋白存在时NK细胞对肿瘤细胞Hep3B的杀伤效率(以抗EGFR抗体-MICA融合蛋白为例)。
具体实施方式
以下结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式进行更加详细的说明，以便能够更好地理解本发明的方案以及其各个方面的优点。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1 pBS-SK-L质粒的构建
合成含有KpnI酶切位点、EcoRV酶切位点、抗体轻链可变区序列VL(氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示)、XhoI酶切位点、HindIII酶切位点、抗体轻链恒定区CL(氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示)、酶切位点PacI和酶切位点SpeI的核苷酸序列KpnI-EcoRV-VL-XhoI-HINDIII-CL-PacI-SpeI(核苷酸序列如SEQ ID NO：19所示)，全长747bp。用KpnI和SpeI双酶切后连入采用同样的酶进行双酶切后的载体pBluescriptⅡSK(+)中，构建成pBS-SK-L，通过PCR进行验证(图5)。
实施例2 pBS-SK-H质粒的构建
a.将连接肽(linker)核苷酸序列片段插入pBluescriptⅡSK(+)(购自Stratagen公司)载体的HindIII和SpeI酶切位点之间(linker的核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示)，构建成载体pBS-SK-Linker，通过PCR进行验证(图6)。
b.合成含有KpnI酶切位点、AvrII酶切位点、抗体重链可变区序列VH(氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示)、BglI酶切位点、抗体重链恒定区CH1(氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示)和XhoI酶切位点的核苷酸序列KpnI-AvrII-VH-BglI-CH1-XhoI(核苷酸序列如SEQ IDNO：18所示)，全长745bp。用KpnI和XhoI双酶切后连入采用同样的酶进行双酶切的pBS-SK-Linker载体中，构建成pBS-SK-VH-CH1-linker，通过PCR进行验证(图7)。
c.将NKG2D的6种配体的编码基因序列(NKG2D的6种配体的编码基因序列如SEQ IDNO：7至SEQ ID NO：12所示)分别克隆至载体BS-SK-VH-CH1-linke的XbaI与SacII两个酶切位点中间，构建成6种不同的pBS-SK-H，通过PCR进行验证(图8)。
实施例3抗体融合蛋白的表达载体构建
a.将实施例1中获得的pBS-SK-L质粒用PCR克隆法将KpnI-EcoRV-VL-XhoI-HINDIII-CL-PacI-SpeI(核苷酸序列如SEQ ID NO：19所示)，克隆到pcDNA3.1-FLAG(购自赛默飞世尔公司)载体中，酶切位点为KpnI和NotI，全长747bp，构建轻链表达质粒pcDNA3.1-FLAG-L，PCR验证结果(图9)。
b.将实施例2中获得的6种pBS-SK-H质粒分别用PCR克隆法将VH-CH1-linker-NKG2DL(6种)分别克隆到pcDNA3.1-FLAG(购自赛默飞世尔公司)载体中，酶切位点为NheI和NotI，构建重链表达质粒pcDNA3.1-FLAG-H，PCR验证结果(图10)。
实施例4在293T细胞中表达抗体融合蛋白
a.将轻链表达质粒pcDNA3.1-FLAG-L用lipofectamine 2000转染293T细胞(购自美国ATCC细胞库)。转染24小时后收集细胞总蛋白，免疫印迹方法检测目的蛋白的表达(图11)；
b.将重链表达质粒pcDNA3.1-FLAG-H用lipofectamine 2000转染293T细胞(购自美国ATCC细胞库)。转染24小时后收集细胞总蛋白，免疫印迹方法检测目的蛋白的表达(图12)；
实施例5抗体融合蛋白活性检测；
融合蛋白活性体外鉴定：
a.实施例4所获得的抗体融合蛋白能够靶向EGFR(表皮生长因子受体)高表达的肿瘤细胞株，因此我们应用FACS(流式细胞分析仪)检测Hep3B细胞株(人肝癌细胞株,购自美国ATCC细胞库)表面EGFR(表皮生长因子受体)的表达,结果显示在人肝癌细胞株Hep3B的表面EGFR的表达率高达98.7％(图13)；
b.实施例4所获得的抗体融合蛋白能够表达NKG2D的配体，从而提高NK细胞对肿瘤细胞的识别和杀伤，因此我们应用FACS(流式细胞分析仪)检测Hep3B细胞株表面MICA(对应的编码基因序列是SEQ ID NO：7)的表达，结果显示在人肝癌细胞株Hep3B表面MICA的表达率仅有8.28％(图14)；
c.NK-92细胞(人NK细胞系,购自美国ATCC细胞库)和Hep3B肿瘤细胞在多孔细胞培养板中共培养，设对照组和加抗体融合蛋白组(其中每组重复三次，每孔靶细胞Hep3B细胞数为1×105,效应细胞NK-92细胞数为5×105)。将靶细胞Hep3B用TFL-4标记，终浓度为5μM，37℃孵育20min，PBS洗3次后计数分组。对照组加效应细胞(NK-92细胞)，加抗体融合蛋白组则同时加入本发明实施例4中制备的抗体融合蛋白(抗体融合蛋白加入量为12ng/孔)与效应细胞，37℃共孵育2小时。Washing buffer洗2次后用100ul重悬，5μlAnnexin V-FITC室温避光染色10min后加200μl PBS,流式检测Annexin V的阳性率。Annexin V是一种检测细胞凋亡的试剂，在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸只分布在细胞膜脂质双层的内侧，细胞发生凋亡早期，膜磷脂酰丝氨酸(PS)由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V作为一种磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，它通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V是检测细胞早期凋亡的灵敏指标。Annexin V的阳性率即为NK-92细胞对肿瘤细胞的杀伤效率，我们从图中可以看到加抗体融合蛋白组相对于对照组杀伤率几乎提高一倍(图15)。
最后应说明的是：显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。
Figure IDA0001034743440000011
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Claims (8)

1.一种抗体融合蛋白，其特征在于，包括靶向EGFR的特异性抗体的F(ab)2片段、Fab片段、单域抗体或单链抗体，还包括人源NKG2D配体或配体片段；所述人源NKG2D配体或配体片段与所述靶向EGFR的特异性抗体的F(ab)2片段、Fab片段、单域抗体或单链抗体通过连接肽相连；
所述靶向EGFR的特异性抗体的F(ab)2片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：13至SEQ ID NO：16所示；
所述人源NKG2D配体的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；
所述连接肽的编码序列如SEQ ID NO：17所示。
2.如权利要求1所述的抗体融合蛋白，其特征在于，所述人源NKG2D配体的编码基因序列如SEQ ID NO：7所示。
3.含有权利要求1或2所述的抗体融合蛋白的编码基因的重组载体、重组细胞、重组菌或表达盒。
4.权利要求1或2所述的抗体融合蛋白的制备方法，其特征在于，当所述抗体融合蛋白包括靶向EGFR的特异性抗体的F(ab)2片段或Fab片段时，包括如下步骤：
(a)将所述抗体融合蛋白的重链编码基因、NKG2D配体编码基因和连接肽编码基因插入pBluescriptⅡSK(+)载体，构建pBS-SK-H质粒
(b)将所述抗体融合蛋白的轻链编码基因插入pBluescriptⅡSK(+)载体，构建pBS-SK-L质粒；
(c)酶切所述pBS-SK-H质粒，获得含有所述抗体融合蛋白的重链编码基因、NKG2D配体编码基因和连接肽编码基因的载体片段；
(d)酶切所述pBS-SK-L质粒，获得含有所述抗体融合蛋白的轻链编码基因的载体片段；
(e)将所述步骤(c)和步骤(d)获得的载体片段插入表达载体，获得重组表达载体；
(f)将步骤(e)中获得的重组表达载体转化受体细胞，表达所述抗体融合蛋白。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(e)中的表达载体为pcDNA3.0-FLAG。
6.如权利要求4中所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(f)中的受体细胞为293T细胞。
7.如权利要求1或2所述的抗体融合蛋白在制备用于抗肿瘤药物中的用途，所述肿瘤的肿瘤细胞为EGFR高表达，且MICA低表达或不表达的肿瘤细胞。
8.含有权利要求1或2所述的抗体融合蛋白的药物。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR20180117116A (ko) 2016-02-05 2018-10-26 워싱턴 유니버시티 표적화된 사이토카인 전달을 위한 조성물 및 방법들
EP3927722A4 (en) * 2019-02-18 2022-11-23 Courier Therapeutics, Inc. BISPECIFIC FUSION PROTEIN USING ORTHOPOXVIRUS MAJOR HISTOCOMPATIBILITY COMPLEX (MHC) CLASS L-LIKE PROTEIN (OMCP) AND TUMOR-SPECIFIC BINDING PARTNER
JP7689744B2 (ja) * 2019-08-23 2025-06-09 ノースウェスタン ユニバーシティ 抗原特異的ｔ細胞応答を活性化するための材料および方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101475957B (zh) * 2009-01-20 2011-09-21 安徽师范大学 一种重组质粒及其构建方法
CN101899445A (zh) * 2010-06-23 2010-12-01 中国医学科学院血液病医院（血液学研究所） 一种转导iASPPsv癌基因在造血系统特异性高表达的小鼠模型及其制备方法和用途
EP2747781B1 (en) * 2011-08-23 2017-11-15 Roche Glycart AG Bispecific antibodies specific for t-cell activating antigens and a tumor antigen and methods of use
CN104628866B (zh) * 2015-01-21 2018-03-27 中国药科大学 一种靶向vegfr2的抗体融合蛋白的制备及其用途

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MICA/B表达差异影响非小细胞肺癌的免疫逃逸;聂运中;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》;20140615;正文第15页 *

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