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WO2024140709A1 - 靶向b7-h3的抗体或抗体片段、以及其在嵌合抗原受体免疫细胞疗法领域的应用 - Google Patents

靶向b7-h3的抗体或抗体片段、以及其在嵌合抗原受体免疫细胞疗法领域的应用 Download PDF

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WO2024140709A1
WO2024140709A1 PCT/CN2023/142028 CN2023142028W WO2024140709A1 WO 2024140709 A1 WO2024140709 A1 WO 2024140709A1 CN 2023142028 W CN2023142028 W CN 2023142028W WO 2024140709 A1 WO2024140709 A1 WO 2024140709A1
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WO
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antibody
cancer
cells
seq
antibody fragment
Prior art date
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PCT/CN2023/142028
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English (en)
French (fr)
Inventor
马伟伟
隋银强
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Unicet Biotech Co LLC
Original Assignee
Unicet Biotech Co LLC
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Publication date
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Priority to AU2023415250A priority patent/AU2023415250A1/en
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    • G01N2333/70503—Immunoglobulin superfamily, e.g. VCAMs, PECAM, LFA-3
    • G01N2333/70532—B7 molecules, e.g. CD80, CD86

Definitions

  • B7-H3 belongs to the B7 protein family, and normal tissues do not express or express low levels of B7-H3.
  • B7-H3 is expressed in a variety of tumor tissues (more than 60% of tumors express B7-H3), including pancreatic cancer (positive rate 77.8%), colorectal cancer (positive rate 63.8%), gastric cancer (positive rate 69.2%), lung cancer (positive rate 69.5%), prostate cancer (positive rate 93%), ovarian cancer (positive rate 73.1%), etc. It is also highly expressed in a variety of rare tumors. Therefore, it has also been called a "tumor-associated antigen" and is a pan-tumor universal drug target with great potential [1] .
  • B7-H3 is widely expressed in tumor tissues and low in healthy tissues, as well as the function of B7-H3 in the tumor microenvironment, the clinical therapeutic potential of B7-H3 has attracted much attention.
  • mAbs including neutralizing antibodies, antibody-drug conjugates (ADCs), bispecific antibodies, antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC), NK cell adapter-linked antibodies, etc.
  • Neutralizing antibodies can be used to block the binding of ligands and receptors, blocking signal transduction and thus affecting related cell functions. Blocking B7-H3 signals with neutralizing antibodies can release the functions of immune cells affected by B7-H3 signals and enhance their anti-tumor ability. Its therapeutic potential has been demonstrated in a variety of solid tumors, including ovarian cancer, melanoma, and colorectal cancer [3-5] .
  • ADCs are drugs that are conjugated with antibodies that specifically recognize antigens and small molecule drugs with cytotoxicity. They have the characteristics of good specificity, good safety, and high efficiency in killing tumor cells.
  • a research team has demonstrated the effectiveness of ADC drugs targeting B7-H3 in multiple solid tumor models and its safety in primates [6] .
  • Bispecific antibodies combine two antibodies targeting different targets.
  • Bispecific antibodies targeting both B7-H3 and CD3 have been clinically approved for the treatment of solid tumors (clinical trial No: NCT03406949). This bispecific antibody can recruit activated T cells to B7-H3-positive tumor tissues, helping T cells to recognize and kill tumor cells.
  • Linking an antibody targeting B7-H3 with an NK cell receptor (CD16) antibody can promote NK cells’ recognition and killing of B7-H3-positive tumor cells.
  • Some teams have also made further modifications, linking an interleukin-15 (IL15) protein to the CD16 antibody and the B7-H3 antibody.
  • IL15 can further promote the activity of NK cells. This antibody-protein complex has achieved very good results in the treatment of solid tumors in vitro and in model animals [8] .
  • the ninth aspect of the present invention provides a chimeric antigen receptor as described in the eighth aspect of the present invention, comprising: the antibody or antibody fragment of the seventh aspect, and a transmembrane region fused to the carboxyl terminus of the antibody or antibody fragment.
  • variable region of heavy chain in this specification refers to the approximately 110 amino acid residues near the amino terminus (N-terminus) of the heavy chain.
  • the composition and arrangement of the amino acid residues in this section vary greatly.
  • Homology in this specification refers to the high ratio of amino acid or nucleotide matching shown by comparing the target amino acid sequence or target nucleotide sequence with the reference sequence. Homology in this specification can be determined using standard software such as BLAST or FASTA.
  • the “constant region” in this specification refers to the region of the antibody near the C-terminal amino acid sequence that is relatively stable. It includes the "light chain constant region” and the “heavy chain constant region”, which respectively refer to the region of the antibody light chain near the C-terminal amino acid sequence that is relatively stable and the region of the antibody heavy chain near the C-terminal amino acid sequence that is relatively stable.
  • hinge region refers to the hydrophilic region between the antigen recognition domain and the transmembrane domain.
  • the hinge region can use the hinge region of various antibodies or antigen receptors, in particular the hinge region of CD molecules.
  • the hinge region can be selected from, for example, CD4, CD8 ⁇ , CD28, IgG1, IgG4.
  • the CD8 ⁇ hinge region is used.
  • sequence of the hinge region examples include:
  • CD3z SEQ ID NO: 26 :
  • membrane protein refers to a protein that is fully or partially inserted into various membrane structures (including cell membrane, mitochondrial membrane, endoplasmic reticulum membrane, nuclear membrane and other membrane structures); secretory protein refers to a protein that is secreted outside the cell after protein synthesis; intracellular protein refers to all proteins present inside the cell membrane, including free proteins in the cytoplasm, and also membrane proteins on the membranes of various intracellular organelles; small molecule drugs refer to chemically synthesized drugs with a molecular weight of less than 1000, which can be connected to other proteins or molecular drugs through connecting arms; cytotoxic drugs refer to drugs that have toxic effects on cells or specific cells, including but not limited to alkaloid drugs (such as paclitaxel), metabolic drugs (such as decitabine), antibiotics (such as idarubicin), alkylating agents (such as ifosfamide) and platinum agents (such as
  • examples include CD40L, CXCR5, CXCR3, 4-1BB, ICOS, OX40, CD27, NKG2D, etc.; as secretory proteins, examples include IL2, IL15, IL4, IL7, IL10, IL18, IFN ⁇ , IL1 ⁇ , antibodies (such as anti-PD1 antibodies, anti-CTLA4 antibodies, etc.); as small molecule drugs, examples include FITC/folic acid, rapamycin, Rimiducid, PROTAC compounds, Dasatinib, etc.; as cytotoxic drugs, examples include paclitaxel, vinorelbine, doxetine, etc.
  • Tasai hydroxycamptothecin, gemcitabine, cytarabine, tegafur, methotrexate, epirubicin, pirarubicin, idarubicin, mitomycin, mitoxantrone, ifosfamide, dacarbazine, cisplatin, oxaliplatin, etc.
  • nucleic acid molecule refers to a biomolecule compound formed by the polymerization of deoxyribonucleic acid (DNA) or ribonucleic acid (RNA). Its constituent unit is a nucleotide, and a nucleotide monomer is composed of a pentose, a phosphate group, and a nitrogenous base.
  • encoding as used herein when applied to a nucleic acid sequence means that a polynucleotide "encoding" a polypeptide can be transcribed and/or translated to produce mRNA for the polypeptide and/or its fragments in its natural state or when manipulated by methods well known to those skilled in the art.
  • autologous or allogeneic refers to “autologous cells” or “allogeneic cells”.
  • autologous cells refer to cells derived from the same individual and then re-administered to the individual;
  • allogeneic cells refer to cells derived from outside the autologous body.
  • the cells in the present invention include T cells, B cells, NK cells, macrophages, monocytes, dendritic cells, neutrophils, basophils, eosinophils, mast cells, NK-T cells, MAIT cells, hematopoietic stem cells, embryonic stem cells, induced pluripotent stem cells, and erythrocytes, and T cells include ⁇ T cells, ⁇ T cells, and regulatory T cells. In a preferred embodiment of the present invention, ⁇ T cells are used.
  • the pharmaceutically acceptable carrier in the pharmaceutical composition can be any conventionally used pharmaceutically acceptable carrier, and those skilled in the art can select a suitable pharmaceutically acceptable carrier according to chemical-physical conditions and administration routes.
  • the pharmaceutically acceptable carrier described in this specification may be, for example, a vehicle, an adjuvant, an excipient, and a diluent.
  • the pharmaceutically acceptable carrier is preferably a carrier that is chemically inert to the active agent and has no harmful side effects or toxicity under the conditions of use.
  • the "subject" in this specification refers to a mammal.
  • the subject of the present invention refers to any subject afflicted with cancer or at risk of being afflicted with cancer, preferably a human being.
  • therapeutically effective amount refers to a sufficient amount of the antibody or antibody fragment, chimeric antigen receptor, nucleic acid molecule, vector, cell, or pharmaceutical composition of the invention to treat a B7-H3 positive disease (e.g., to limit growth or slow or block tumor metastasis) at a reasonable benefit/risk ratio applicable to any medical treatment.
  • a B7-H3 positive disease e.g., to limit growth or slow or block tumor metastasis
  • the total daily dosage of the antibody or antibody fragment, chimeric antigen receptor, nucleic acid molecule, vector, cell, or pharmaceutical composition of the invention will be determined by the attending physician within the scope of reasonable medical judgment.
  • the specific therapeutically effective dosage level for any particular subject will depend on a variety of factors, including the condition being treated and the severity of the condition, the activity of the specific agent used, the specific combination used, the age, weight, general health, sex and diet of the subject, the time of administration, the route of administration and the excretion rate of the specific agent used, the duration of treatment, drugs used in combination or concurrently with the specific agent used, and similar factors known in the medical field.
  • the detection kit of the present invention is a kit for detecting B7-H3, and the kit generally contains components commonly used in such a kit, such as a pH buffer, a stabilizer, and operating instructions, instructions for detecting B7-H3 and other ancillary materials.
  • EGFRt EGFRt
  • EGFRt domain III and domain IV of wild-type EGFR.
  • the truncated EGFR has no intracellular signal and will not transmit other signals to T cells.
  • these two domains are the recognition epitopes of cetuximab. After expressing this epitope on T cells, it can be used as a screening marker for CAR-T and also add a safety switch for clinical research.
  • Inducers (such as cetuximab) can specifically bind to EGFRt, and cause apoptosis of CAR-T cells by antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, so that CAR-T cells in the body can be cleared at any time.
  • the "flexible linker peptide chain” in this specification refers to an oligopeptide or polypeptide region of about 1 to 100 amino acids in length, which connects any domain/region of the CAR of the present invention together.
  • the linker can be composed of flexible residues (such as The linker is composed of amino acids and serines) so that adjacent protein domains can move freely relative to each other. When it is desired to ensure that two adjacent domains do not interfere with each other in space, a longer linker can be used. In a preferred embodiment of the present invention, (GGGGS) 3 is used.
  • transduction positive rate in this specification refers to the transduction ratio of exogenous genes on T cells, including the transduction rate of CAR on T cells, which reflects the proportion of CAR-positive T cells in total T cells.
  • 293T cells are human renal epithelial cell lines, which are often used to study the expression of exogenous genes and virus preparation.
  • U87, HTB15, and TJ905 are all human glioma cell lines
  • RKO is a human colon cancer cell line
  • SKOV3 is a human ovarian cancer cell line.
  • other tumor cells were cultured in DMEM complete medium (DMEM medium + 10% FBS + 1% double antibody).
  • SKOV3 was cultured in McCoy's 5a complete medium (McCoy's 5a medium + 20% FBS + 1% double antibody).
  • Jurkat T cells are human T lymphocyte leukemia cell lines, and the cells were cultured in RPMI-1640 complete medium (RPMI-1640 medium + 10% FBS + 1% double antibody).
  • PBMC cells Prepare PBMC cells, wash them twice with PBS, count the cells with AO/PI cell counter, and detect the viability.
  • PBMC cells were cultured in RPMI1640 medium + 10% FBS + 1% double antibody + 200U/mL rhIL-2 culture system, with an initial cell density of 2 ⁇ 10 6 cells/mL.
  • RPMI1640 medium 10% FBS + 1% double antibody + 200U/mL rhIL-2 culture system
  • ZOL zoledronic acid
  • PBMC cells Prepare PBMC cells, wash twice with PBS, count cells using AO/PI cell counter, and detect viability.
  • Antibody coating was performed on the 6-well plate: CD3 and CD28 antibodies were diluted to 200 ng/mL with opti-MEM medium, 2 mL of antibody dilution was added to each well of the 6-well plate, and the plates were incubated at 4°C overnight or at 37°C for 2 h.
  • PBMC PBMC
  • RPMI1640 medium + 10% FBS + 1% double antibody + 200U/mL rhIL-2 culture system RPMI1640 medium + 10% FBS + 1% double antibody + 200U/mL rhIL-2 culture system
  • cell density 2 ⁇ 10 6 cells/mL.
  • adjust the cell density (adjusted to 1 ⁇ 10 6 cells/mL) every 48 hours using RPMI1640 medium + 10% FBS + 1% double antibody + 200U/mL rhIL-2 culture system.
  • ⁇ T or ⁇ T cells count the ⁇ T or ⁇ T cells after in vitro activation and culture for 24 hours, resuspend 1 ⁇ 10 6 total cells in 1mL RPMI1640 medium + 10% FBS + 1% double antibody + 200U/mL rhIL-2 culture system, and add them to the virus-treated 24-well plate. Centrifuge at 800g and 32°C for 10min and place in a cell culture incubator for culture. Count the cells every two to three days and adjust the density to 1 ⁇ 10 6 cells/mL.
  • the staining system is configured as follows: 50 ⁇ L flow buffer + antibody.
  • the flow cytometry buffer formula is: PBS + 1% FBS + 2.5mM EDTA.
  • the amount of antibody used is determined by the antibody concentration and actual conditions. For most antibodies (concentration of 0.5-1 mg/mL), a 1:50-1:100 dilution is sufficient.
  • the flow cytometry staining system is: anti-human EGFR, anti-human CD69.
  • the flow cytometry staining system is: anti-human CD3, anti-human ⁇ TCR, anti-human EGFR, anti-human CD69.
  • the antigens to be detected were diluted with PBS to 5 gradient concentrations of 0.5 mg/mL, 1 mg/mL, 1.5 mg/mL, 2 mg/mL, and 4 mg/mL, respectively, and spread on the ELISA plate (96-well plate), adding 100 ⁇ L to each well and leaving it at room temperature for 1 hour. Wash twice with PBST, 100 ⁇ L to each well, and let it stand for 5 minutes after adding. Then add 0 ⁇ g/mL, 2 ⁇ g/mL, or 4 ⁇ g/mL B7-H3 antibody, dilute with PBS, and add 100 ⁇ L to each well.
  • the B7-H3 antigen protein was diluted into 7 concentrations of 100nM, 50nM, 25nM, 12.5nM, 6.25nM, 3.13nM and 1.56nM, and loaded on a 96-well plate.
  • the human Protein G probe was selected, the stationary phase was the antigen, the mobile phase was 1B4, the binding time was set to 180s, and the dissociation time was set to 300s.
  • the binding constant and dissociation constant of the human monoclonal antibody were detected, and the affinity was calculated.
  • m2Y31 can block the binding of hu2Y31 to the antigen molecule, which also suggests that hu2Y31 and m2Y31 recognize the same site, but a different site from 8H9.
  • the antigens to be detected including B7-H1, B7-H3, B7-H4, and B7-H5, were diluted with PBS to 5 gradient concentrations of 0.5mg/mL, 1mg/mL, 1.5mg/mL, 2mg/mL, and 0.5mg/mL, respectively, and spread on the ELISA plate (96-well plate), adding 100 ⁇ L to each well and leaving it at room temperature for 1h. Wash twice with PBST, 100 ⁇ L per well, and let it stand for 5min after adding.
  • Example 6 Experiment on the binding ability of Jurkat T cells expressing CAR-B7-H3 to B7-H3 protein
  • the CD69 signal activation level of CAR-B7-H3 was further detected.
  • Effector cells including JurkatT-control cells that do not express CAR-B7-H3 and CAR-B7-H3-JurkatT cells that express CAR-B7-H3
  • tumor cells RKO WT and RKO B7-H3 KO
  • the specific operation was to incubate in a 24-well plate, add 0.5 ⁇ 10 6 effector cells and 0.5 ⁇ 10 6 tumor cells.
  • Flow cytometry analysis was performed after 24 hours of incubation.
  • the flow cytometry staining system was: anti-human EGFR, anti-human CD69.
  • CAR-B7-H3- ⁇ T cells for RKO tumor cells knocked out by B7-H3 is comparable to that of ⁇ T cells that do not express CAR-B7-H3 ( Figure 15B). This further verifies that CAR-B7-H3- ⁇ T cells and CAR-B7-H3- ⁇ T cells enhance the killing of RKO tumor cells by recognizing B7-H3.

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Abstract

一种靶向B7-H3的抗体或抗体片段、基于该抗体或抗体片段的嵌合抗原受体和嵌合抗原受体-免疫细胞以及它们用于治疗肿瘤的用途。具体而言，该抗体或抗体片段包含重链可变区VH和轻链可变区VL，VH包括：如SEQ ID NO:9的VH-CDR1、如SEQ ID NO:10的VH-CDR2和如SEQ ID NO:11VH-CDR3，并且，VL包括：如SEQ ID NO:12的VL-CDR1，如SEQ ID NO:13的VL-CDR2和如SEQ ID NO:14的VL-CDR3；或者VH包括如SEQ ID NO:15的VH-CDR1、如SEQ ID NO:16的VH-CDR2和如SEQ ID NO:17VH-CDR3，并且，VL包括：如SEQ ID NO:18的VL-CDR1、如SEQ ID NO:19的VL-CDR2和如SEQ ID NO:20的VL-CDR3。

Description

靶向B7-H3的抗体或抗体片段、以及其在嵌合抗原受体免疫细胞疗法领域的应用
本申请要求2022年12月26日向中国国家知识产权局提交的专利申请号为202211681398.0、发明名称为“靶向B7-H3的抗体或抗体片段、以及其在嵌合抗原受体免疫细胞疗法领域的应用”的在先申请的优先权。该件在先申请的全文通过引用的方式结合于本发明中。
技术领域
本发明涉及一种靶向B7-H3的抗体或抗体片段、基于该抗体或抗体片段的嵌合抗原受体(CAR)和CAR-免疫细胞以及它们用于治疗肿瘤的用途等。
背景技术
作为一种免疫疗法，单克隆抗体在治疗恶性疾病方面表现出巨大的治疗潜力，受到广泛关注。诸如靶向B7-H1(PD-L1)/PD-1信号通路的抗PD-1、抗PD-L1的抗体疗法，已经在肿瘤治疗领域取得了突破性的应用。决定一个单克隆抗体疗法成败的关键是选择合适的靶点或者免疫检查点，再激活以及加强受试者的自身免疫反应。
B7-H3(也被称为CD276)是一个由316个氨基酸组成的I型跨膜蛋白。在人体中，根据膜外结构域的差异，B7-H3可以分成2Ig-B7-H3以及4Ig-B7-H3这两种不同的形式。对于2Ig-B7-H3而言，其膜外端含有一对免疫球蛋白V区结构域(immunoglobulin variable(IgV)-like domain，IgV-结构域)和免疫球蛋白C区结构域(immunoglobulin constant(IgC)-like domain，IgC-结构域)。4Ig-B7-H3的膜外段则含有两对IgV-及IgC-结构域。B7-H3属于B7蛋白家族，正常组织都不表达或低表达B7-H3。但B7-H3却在多种肿瘤组织表达(多达60％以上肿瘤表达B7-H3)，其中包括胰腺癌(阳性率77.8％)、结直肠癌(阳性率63.8％)、胃癌(阳性率69.2％)、肺癌(阳性率69.5％)、前列腺癌(阳性率93％)、卵巢癌(阳性率73.1％)等，在多种罕见肿瘤中也高表达，因此也曾被称之为“肿瘤相关抗原”，是一个具有巨大潜力的泛肿瘤通用型药物靶点[1]。
像B7蛋白家族的其它成员例如PD-L1等一样，B7-H3也具有免疫检查抑制分子的功能。利用中和性单克隆抗体(mAbs)阻断B7-H3的结合能够提高包括 NK细胞以及CD8杀伤型T细胞的杀伤功能，促进其在肿瘤细胞的浸润，降低肿瘤负荷，提高荷瘤小鼠的生存期[2]。
因此，鉴于B7-H3在肿瘤组织中广泛高表达而在健康组织中低表达以及B7-H3在肿瘤微环境中的功能，B7-H3的临床治疗潜力吸引了诸多的目光。已经有多个靶向B7-H3的临床试验开展。其中，有20多个临床试验是基于mAbs展开的，包括中和性抗体、抗体药物偶联物(antibody-drug conjugates，ADCs)、双特异性抗体、抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)、NK细胞衔接器连接抗体等。
中和性抗体能够被用来阻断配体和受体的结合，阻断信号的转导进而影响相关细胞功能。通过中和性抗体阻断B7-H3的信号能够释放受B7-H3信号影响的免疫细胞的功能，提高其抗肿瘤能力，在多种实体肿瘤，包括卵巢癌、黑色素瘤以及结直肠癌中均证明了其治疗潜力[3-5]。
ADCs偶联抗体为特异性识别抗原的抗体与具有细胞毒性的小分子药物偶联在一起的药物，具有特异性好、安全性好、杀伤肿瘤细胞高效的特点。有研究团队在多种实体肿瘤模型中证明了靶向B7-H3的ADC药物的有效性，并在灵长类动物中证明了其安全性[6]。
双特异性抗体为将两个靶向不同靶点的抗体结合在一起，临床上已经批准了同时靶向B7-H3和CD3的双特异性抗体治疗实体肿瘤(clinical trial No：NCT03406949)。此双特异性抗体能够将激活的T细胞招募到B7-H3阳性的肿瘤组织处，帮助T细胞识别和杀伤肿瘤细胞。
靶向B7-H3的ADCC在实体肿瘤中也取得了进展。有研究团队设计了一个靶向B7-H3，并将Fc进行了工程化的单克隆抗体，能够提高杀伤性免疫细胞通过Fc受体完成对B7-H3阳性肿瘤细胞的杀伤作用。其安全性在灵长类动物中也得到了验证[7]。
将靶向B7-H3的抗体与NK细胞受体(CD16)抗体连接在一起能够促进NK细胞对B7-H3阳性肿瘤细胞的识别和杀伤功能。也有团队进一步进行了改造，在CD16抗体与B7-H3抗体的基础上，又连接了一个白介素-15(IL15)蛋白，IL15能够进一步促进NK细胞的活性。这种抗体-蛋白复合物在体外和模型动物实体肿瘤治疗中取得了非常好的效果[8]。
除此之外，靶向B7-H3的嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(CAR-T)也在实 体肿瘤中取得了一定进展，诸如脑胶质瘤[9]、非典型畸胎瘤样横纹肌瘤[10]、间变性脑膜瘤[11]。
尽管目前全球已经开展了多个靶向B7-H3的免疫疗法(包括B7-H3单克隆抗体和CAR-B7-H3-T疗法等)，也取得了一些早期积极的治疗效果。但是该靶点免疫疗法仍然存在抗体选择范围小，临床治疗效果有限等问题。仍需要进一步探索新抗体和新治疗手段。
另外，CAR-T是一种在αβT细胞基础上进行基因修饰的革命性的免疫疗法，在过去10年取得了巨大的临床进展。截止目前已经有6款CAR-T治疗药物通过FDA批准上市，在中国也有2款CAR-T药物获批上市。这8款CAR-T药物均是靶向CD19或者BCMA，治疗B细胞相关的恶性血液肿瘤，具有高响应率和疾病缓解率。然而，CAR-T疗法也存在诸多弊端，比如在实体肿瘤中疗效甚微，无法进行异体治疗及现货式供应，价格昂贵等等。
γδT细胞则能在一定程度上解决这些问题。从细胞类型上来分，γδT细胞是一种表达γδT细胞受体(T cell receptor，TCR)的T细胞，其是一类特殊的免疫细胞，同时具有先天免疫和获得性免疫的特征，其识别抗原和病原体不依赖于主要组织相容性复合体(MHC)，因此可以在未经任何修饰的前提下实现异体治疗，而不会引发GvHD等反应。已经有很多研究报道γδT细胞具有广谱抗肿瘤能力，且在实体肿瘤中具有更强的浸润和抗肿瘤效果。CAR修饰的γδT细胞则能进一步提高γδT细胞的靶向性和肿瘤杀伤作用[12，13]，但尚未有将B7-H3抗体应用于CAR-γδT的相关研究和报道。
引用文献1.Kontos，F.，etal.，B7-H3：An Attractive Target for Antibody-based Immunotherapy.Clin Cancer Res，2021.27(5)：p.1227-1235.
引用文献2.Lee，Y.-H.，etal.，Inhibition of the B7-H3 immune checkpoint limits tumor growth by enhancing cytotoxic lymphocyte function.Cell research，2017.27(8)：p.1034-1045.
引用文献3.Cai，D.，etal.，Tumor-expressed B7-H3 mediates the inhibition of antitumor T-cell functions in ovarian cancer insensitive to PD-1 blockade therapy.Cell Mol Immunol，2020.17(3)：p.227-236.
引用文献4.Lee，Y.H.，etal.，Inhibition of the B7-H3 immune checkpoint limits tumor growth by enhancing cytotoxic lymphocyte function.Cell Res，2017. 27(8)：p.1034-1045.
引用文献5.Lu，H.，et al.，B7-H3 inhibits the IFN-gamma-dependent cytotoxicity of Vgamma9Vdelta2 T cells against colon cancer cells.Oncoimmunology，2020.9(1)：p.1748991.
引用文献6.Scribner，J.A.，etal.，Preclinical Development of MGC018，a Duocarmycin-based Antibody-drug Conjugate Targeting B7-H3 for Solid Cancer.Mol Cancer Ther，2020.19(11)：p.2235-2244.
引用文献7.Loo，D.，etal.，Development of an Fc-enhanced anti-B7-H3 monoclonal antibody with potent antitumor activity.Clin Cancer Res，2012.18(14)：p.3834-45.
引用文献8.Vallera，D.A.，etal.，NK-Cell-Mediated Targeting of Various Solid Tumors Using a B7-H3 Tri-Specific Killer Engager In Vitro and In Vivo.Cancers，2020.12(9).
引用文献9.Tang，X.，etal.，Administration of B7-H3 targeted chimeric antigen receptor-T cells induce regression of glioblastoma.Signal Transduct Target Ther，2021.6(1)：p.125.
引用文献10.Theruvath，J.，etal.，Locoregionally administered B7-H3-targeted CAR T cells for treatment of atyPical teratoid/rhabdoid tumors.Nat Med，2020.26(5)：p.712-719.
引用文献11.Tang，X.，etal.，Bioactivity and safety of B7-H3-targeted chimeric antigen receptor T cells against anaplastic meningioma.Clinical & Translational Immunology，2020.9(6)：p.e1137.
引用文献12.Ang，W.X.，et al.，Electroporation of NKG2D RNA CAR Improves Vγ9Vδ2 T Cell Responses against Human Solid Tumor Xenografts.Molecular Therapy-Oncolytics，2020.17：p.421-430.
引用文献13.Rozenbaum，M.，etal.，Gamma-Delta CAR-T Cells Show CAR-Directed and Independent Activity Against Leukemia.Frontiers in Immunology，2020.11.
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了新的B7-H3抗体或抗体片段，并将其成功用于CAR-αβT/CAR-γδT治疗领域。为B7-H3靶点的临床治疗以及检测带来了新的选择和可行性，进一步本发明还解决了CAR免疫细胞疗法中对实体肿瘤疗效甚微、无法进行异体治疗和现货式供应、以及价格昂贵等问题。
本发明第一方面提供了一种特异性结合B7-H3的分离的抗体或抗体片段，其包含重链可变区VH和轻链可变区VL，上述重链可变区VH包括：如SEQ ID NO：9的氨基酸序列所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO：10的氨基酸序列所示的VH-CDR2和如SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列VH-CDR3；上述轻链可变区VL包括：如SEQ ID NO：12的氨基酸序列所示的VL-CDR1，如SEQ ID NO：13的氨基酸序列所示的VL-CDR2和如SEQ ID NO：14的氨基酸序列所示的VL-CDR3。
SEQ ID NO：9：NYWIN
SEQ ID NO：10：RIAPGTISTYYNEKFKG
SEQ ID NO：11：QDNYFIN
SEQ ID NO：12：SASSSISSSDLH
SEQ ID NO：13：GTSNLAS
SEQ ID NO：14：QQWFSYPFT
本发明第二方面提供了一种特异性结合B7-H3的分离的抗体或抗体片段，其包含重链可变区VH和轻链可变区VL，上述重链可变区VH包括如SEQ ID NO：15的氨基酸序列所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO：16的氨基酸序列所示的VH-CDR2和如SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列VH-CDR3；上述轻链可变区VL包括：如SEQ ID NO：18的氨基酸序列所示的VL-CDR1，如SEQ ID NO：19的氨基酸序列所示的VL-CDR2和如SEQ ID NO：20的氨基酸序列所示的VL-CDR3。
SEQ ID NO：15：RYDMS
SEQ ID NO：16：TISDDGRHTYDRDSVKG
SEQ ID NO：17：HRAITTARFDY
SEQ ID NO：18：KASQDIYSNIG
SEQ ID NO：19：HGTNLED
SEQ ID NO：20：LQYVQFPYT
本发明第三方面提供了如第一方面和第二方面所述的特异性结合B7-H3的分离的抗体或抗体片段，其中，上述重链可变区VH选自SEQ ID NO：1所示氨基酸序列、在CDR区之外与SEQ ID NO：1所示氨基酸序列具有80％以上、或85％以上、或88％以上、或90％以上、或93％以上、或95％以上、或98％以上同源性的氨基酸序列、SEQ ID NO：2所示氨基酸序列、在CDR区之外与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列具有80％以上、或85％以上、或88％以上、或90％以上、或93％以上、或95％以上、或98％以上同源性的氨基酸序列中的任一种。
SEQ ID NO：1
SEQ ID NO：2
本发明第四方面提供了如第一方面或第二方面所述的特异性结合B7-H3的分离的抗体或抗体片段，其中，上述轻链可变区VL选自SEQ ID NO：3所示氨基酸序列、在CDR区之外与SEQ ID NO：3所示氨基酸序列具有80％以上、或85％以上、或88％以上、或90％以上、或93％以上、或95％以上、或98％以上同源性的氨基酸序列、SEQ ID NO：4所示氨基酸序列、在CDR区之外与SEQ ID NO：4所示氨基酸序列具有80％以上、或85％以上、或88％以上、或90％以上、或93％以上、或95％以上、或98％以上同源性的氨基酸序列中的任一种。
SEQ ID NO：3
SEQ ID NO：4
本发明第五方面提供了一种特异性结合B7-H3的分离的抗体或抗体片段， 其包括：(i)SEQ ID NO：1所示的重链可变区VH和SEQ ID NO：3所示的轻链可变区VL，或者(ii)SEQ ID NO：2所示的重链可变区VH和SEQ ID NO：4所示轻链可变区VL。
本发明第六方面提供了如上述第一至第五方面中任一方面所述的特异性结合B7-H3的分离的抗体或抗体片段，其中，上述抗体或抗体片段为基因工程化改造的抗体或抗体片段。
本发明第七方面提供了如上述第一至第六方面中任一方面所述的特异性结合B7-H3的分离的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段为scFv。
本发明第八方面提供了一种嵌合抗原受体，其包含：上述第七方面所述的特异性结合B7-H3的抗体或抗体片段。
本发明第九方面提供了一种如本发明第八方面所述的嵌合抗原受体，其包含：上述第七方面的抗体或抗体片段、融合于所述抗体或抗体片段的羧基末端的跨膜区。
本发明第十方面提供了如上述第八或第九方面的嵌合抗原受体，其包含：上述第七方面所述的抗体或抗体片段、融合于所述抗体或抗体片段的羧基末端的跨膜区和融合于所述跨膜区的羧基末端的免疫活性细胞活化信号转导区。
本发明第十一方面提供了如上述第八至第十方面中任一方面所述的嵌合抗原受体，其还包含有膜蛋白、分泌蛋白、胞内蛋白、小分子药物、细胞毒性药物中的一种或两种以上。
本发明第十二方面提供了一种核酸分子，其包含：编码上述第一至第七方面中任一方面所述的抗体或抗体片段或上述第八至第十一方面中任一方面所述的嵌合抗原受体的核苷酸序列。
本发明第十三方面提供了如上述第十二方面所述的核酸分子，其包含：(i)如SEQ ID NO：5所示的编码重链可变区的核苷酸序列，以及如SEQ ID NO：7所示的编码轻链可变区的核苷酸序列，或者，(ii)如SEQ ID NO：6所示的编码重链可变区的核苷酸序列，以及如SEQ ID NO：8所示的编码轻链可变区的核苷酸序列。
SEO ID NO：5

SEQ ID NO：6
SEQ ID NO：7
SEO ID NO：8

本发明第十四方面提供一种载体，其包含上述第十二或第十三方面所述的核酸分子。
本发明第十五方面提供如第十四方面所述的载体，其为慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体等。
本发明第十六方面提供一种细胞，其包含上述第十二或第十三方面所述的核酸分子或者第十四方面或第十五方面所述的载体。
本发明第十七方面提供如第十六方面所述的细胞，其包括自体或异体的T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、NK-T细胞、MAIT细胞、造血干细胞、胚胎干细胞、诱导多能干细胞、红细胞，其中，上述T细胞包括αβT细胞、γδT细胞、调节性T细胞。
本发明第十八方面提供一种药物组合物，其包含：选自上述第一至第七方面中任一方面所述的抗体或抗体片段、第八至第十一方面中任一方面所述的嵌合抗原受体、第十二或第十三方面所述的核酸分子、第十四或第十五方面所述的载体、第十六或第十七方面所述的细胞中的任一种以上；或者，其包含：选自上述第一至第七方面中任一方面所述的抗体或抗体片段、第八至第十一方面中任一方面所述的嵌合抗原受体、第十二或第十三方面所述的核酸分子、第十四或第十五方面所述的载体、第十六或第十七方面所述的细胞中的任意一种以上，以及可药用载剂；或者，其包含：选自上述第一至第七方面中任一方面所述的抗体或抗体片段、第八至第十一方面中任一方面所述的嵌合抗原受体、第十二或第十三方面所述的核酸分子、第十四或第十五方面所述的载体、第十六或第十七方面所述的细胞中的任意一种以上，以及其他药物活性试剂或药物。
本发明第十九方面提供一种治疗或预防B7-H3阳性疾病方法，其中，包括给与受试者治疗有效量的上述第一至第七方面中任一方面所述的抗体或抗体片段、第八至第十一方面中任一方面所述的嵌合抗原受体、第十二或第十三方面所述的核酸分子、第十四或第十五方面所述的载体、第十六或第十七所述的细胞或者第十八方面所述的药物组合物。
本发明第二十方面提供如第十九方面所述的方法，其中，上述B7-H3阳性疾病包括恶性/良性血液肿瘤、恶性/良性实体肿瘤、自身免疫病、细菌感染、病 毒感染、寄生虫感染、骨生长异常、同种异体移植、移植排斥等，所述自身免疫病包括系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、多发性硬化、干燥综合征、强直性脊柱炎等。
本发明第二十一方面提供如第二十方面所述的方法，其中，所述疾病包括急性骨髓白血病、慢性骨髓白血病、急性淋巴细胞白血病、非霍金性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、肺癌、结肠直肠癌、肾肿瘤、膀胱癌、胃肠道癌、前列腺癌、肝癌、卵巢癌、胰腺癌、子宫内膜癌、胃癌、前列腺癌、肾癌、宫颈癌、甲状腺癌、子宫癌、神经内分泌癌、头颈癌、鼻咽癌、睾丸癌、基底细胞皮肤癌、鳞状细胞皮肤癌、皮肤纤维肉瘤突出症、梅克尔细胞癌、胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、肉瘤、间皮瘤或骨髓发育不良综合征等。
本发明第二十二方面提供一种用于治疗或预防B7-H3阳性疾病的上述第一至第七方面中任一方面所述的抗体或抗体片段、上述第八至第十一方面中任一方面所述的嵌合抗原受体、或者上述第十二或第十三方面所述的核酸分子、上述第十四或十五方面所述的载体、上述第十六或十七方面所述的细胞或者上述第十八方面所述的药物组合物。
本发明第二十三方面提供如第二十二方面所述的用于治疗或预防B7-H3阳性疾病的抗体或抗体片段、嵌合抗原受体、核酸分子、载体、细胞或者药物组合物，所述B7-H3阳性疾病包括恶性/良性血液肿瘤、恶性/良性实体肿瘤、自身免疫病、细菌感染、病毒感染、寄生虫感染、骨生长异常、同种异体移植、移植排斥，所述自身免疫病包括系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、多发性硬化、干燥综合征、强直性脊柱炎。
本发明第二十四方面提供如第二十三方面所述的用于治疗或预防B7-H3阳性疾病的抗体或抗体片段、嵌合抗原受体、核酸分子、载体、细胞或者药物组合物，所述B7-H3阳性疾病包括急性骨髓白血病、慢性骨髓白血病、急性淋巴细胞白血病、非霍金性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、肺癌、结肠直肠癌、肾肿瘤、膀胱癌、胃肠道癌、前列腺癌、肝癌、卵巢癌、胰腺癌、子宫内膜癌、胃癌、前列腺癌、肾癌、宫颈癌、甲状腺癌、子宫癌、神经内分泌癌、头颈癌、鼻咽癌、睾丸癌、基底细胞皮肤癌、鳞状细胞皮肤癌、皮肤纤维肉瘤突出症、梅克尔细胞癌、胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、肉瘤、间皮瘤或骨髓发育不良综合征。
本发明第二十五方面提供一种B7-H3的检测方法，其包括：使用上述第一至第七方面中任一方面所述的抗体或抗体片段、上述第八至第十一方面中任一方面所述的嵌合抗原受体、或者上述第十二或第十三方面所述的核酸分子，来检测B7-H3的步骤。
本发明第二十六方面提供一种B7-H3的检测用试剂盒，其含有上述第一至第七方面中任一方面所述的抗体或抗体片段或其标记物、上述第八至第十一方面中任一方面所述的嵌合抗原受体或其标记物、或者上述第十二或第十三方面所述的核酸分子或其标记物。
本发明第二十七方面提供一种分离B7-H3阳性细胞的分离试剂盒，其含有上述第一至第七方面中任一方面所述的抗体或抗体片段或其标记物、上述第八至第十一方面中任一方面所述的嵌合抗原受体或其标记物、或者上述第十二或第十三方面所述的核酸分子或其标记物。
本发明第二十八方面提供一种体外增强细胞功能的方法，其包括：使细胞与上述第一至第七方面中任一方面所述的抗体或抗体片段或其标记物、上述第八至第十一方面中任一方面所述的嵌合抗原受体或其标记物、或者上述第十二或第十三方面所述的核酸分子或其标记物，相接触的步骤。
本发明第二十九方面提供上述第一至第七方面中任一方面所述抗体或抗体片段在制备用于检测B7-H3蛋白的制品中的应用。
本发明第三十方面提供上述第一至第七方面中任一方面所述的抗体或抗体片段在制备用于阻断B7-H3蛋白的制品中的应用。
附图说明
图1展示了1B4和2Y31抗体重链可变区的碱基序列，其中，图1A为1B4抗体重链可变区的碱基序列(SEQ ID NO：5)，图1B为2Y31抗体重链可变区的碱基序列(SEQ ID NO：6)。
图2展示了1B4和2Y31抗体轻链可变区的碱基序列，其中，图2A为1B4抗体轻链可变区的碱基序列(SEQ ID NO：7)，图2B为2Y31抗体轻链可变区的碱基序列(SEQ ID NO：8)。
图3展示了1B4和2Y31抗体重链可变区的氨基酸序列，其中，图3A为1B4抗体重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)，图3B为2Y31抗体重链可变 区的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。
图4展示了1B4和2Y31抗体轻链可变区的氨基酸序列，其中，图4A为1B4抗体轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)，图4B为2Y31抗体轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)。
图5显示了人源化1B4抗体亲和力检测结果。
图6显示了人源化改造后的抗体在胶质瘤细胞株U87以及B7-H3敲除的U87细胞株上的结合结果，其中，对于图6A来说，灰色峰代表阴性对照，实线峰代表母本鼠源抗体1B4在肿瘤细胞株上的结合，虚线峰代表人源化改造后的1B4抗体在肿瘤细胞株上的结合。对于图6B来说，m2Y31代表母本鼠源抗体2Y31与肿瘤细胞株的结合，hu2Y31代表人源化抗体2Y31与肿瘤细胞株的结合。8H9为识别不同B7-H3抗原表位的抗体与肿瘤细胞的结合，NC为阴性对照。
图7为CAR结构示意图，其中，从胞外到胞内段分别是scFv(VH-(G4S)3-VL)、CD8铰链区(CD8 Hinge)、跨膜区(CD8 TM)、共刺激信号CD28和4-1BB以及CD3z信号激活结构域。其中，scFv包括一个重链的可变区和一个轻链的可变区，两者之间由一个(GGGGS)3连接肽连接在一起。除此之外，在CAR结构区域的C端，通过P2A切割肽连接了一个截短型EGFR结构，该截短型EGFR结构可以作为CAR阳性细胞的筛选标记，同时为临床研究增加一个安全开关。
图8显示了表达CAR-B7-H3的Jurkat T细胞与B7-H3蛋白的结合能力。
图9显示了利用1B4抗体检测野生型结肠癌肿瘤细胞RKO(深色峰，RKO WT)表达高水平的B7-H3，而B7-H3敲除的RKO肿瘤细胞(浅色峰，RKO B7-H3 KO)不表达B7-H3。
图10显示了利用1B4抗体构建的CAR-Jurkat T细胞经过RKO WT或者RKO(B7-H3 KO)肿瘤细胞刺激后的CD69的表达水平。
图11A显示了表达CAR-B7-H3的αβT细胞的转导阳性率(scFv为1B4抗体的轻链和重链序列)。
图11B显示了αβT或者CAR-B7-H3-αβT细胞经过RKO WT或者RKO(B7-H3 KO)肿瘤细胞刺激后的CD69的表达水平。
图12显示了CAR-B7-H3-αβT细胞(scFv为1B4抗体的轻链和重链序列)对RKO肿瘤细胞的体外杀伤能力。
图13显示了CAR-B7-H3-αβT细胞(scFv为1B4抗体的轻链和重链序列)对胶质瘤细胞的体外杀伤能力。
图14显示了表达CAR-B7-H3的γδT细胞的转导阳性率(scFv为1B4抗体的轻链和重链序列)。
图15A显示了表达CAR-B7-H3的CAR-αβT以及CAR-γδT对RKO WT肿瘤细胞的杀伤效果(scFv为1B4抗体的轻链和重链序列)。
图15B显示了表达CAR-B7-H3的CAR-αβT以及CAR-γδT对敲除B7-H3的RKO肿瘤细胞的杀伤效果(scFv为1B4抗体的轻链和重链序列)。
图16显示了表达CAR-B7-H3的CAR-γδT对B7-H3阳性肿瘤细胞SKOV3的体外杀伤能力(scFv分别为1B4抗体或2Y31抗体的轻链和重链序列)。
图17显示了表达CAR-B7-H3的CAR-γδT(scFv为1B4抗体轻链和重链序列)对SKOV3的体内抗肿瘤效果。
图18显示了SKOV3肿瘤在模型小鼠体内生长变化曲线。
图19显示了SKOV3肿瘤模型小鼠的生存曲线变化。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述并参照附图，对本发明进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
需要说明的是，除非另外定义，本说明书的技术术语或者科学术语应当为所属领域的技术人员所理解的通常意义。另外，也应理解本申请书使用的术语仅是为了描述具体实施方式的目的，并不意欲是限制性的。
本说明书中的“特异性结合”意指本发明的抗原识别区不与或基本上不与目标抗原以外的任意多肽交叉反应。其特异性的程度可以通过免疫学技术来判断，包括但不限于免疫印迹、免疫亲和层析、流式细胞分析等。
本说明书中的“抗体”，指的是与抗原特异性结合的免疫球蛋白分子。抗体可为源于自然源或源于重组源的完整的免疫球蛋白，并可为完整免疫球蛋白的免疫反应部分。抗体通常为免疫球蛋白分子的四聚物。本发明中的抗体可以以多种形式存在，包括例如，Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv片段、由抗体片段形成的线性抗体、scFv抗体、ADCs偶联抗体、多特异性抗体、单链抗体和人源化抗体。
本说明书中的“抗体片段”指的是完整抗体结构或序列中的一部分。
本说明书中的“重链”，指的是以自然发生构象存在于所有抗体分子的两种类型的多肽链中较大的链。
本说明书中的“轻链”，指的是以自然发生构象存在于所有抗体分子的两种类型的多肽链中较小的链。
本说明书中的“重链可变区(variable region ofheavy chain，VH)”，指的是重链上靠近氨基端(N端)约110个氨基酸残基，此段氨基酸残基的组成和排列变化很大。
本说明书中的“轻链可变区(variable region oflight chain，VL)”，指的是轻链上靠近氨基端(N端)约110个氨基酸残基，此段氨基酸残基的组成和排列变化很大。
本发明所述的“CDR”为互补决定区或互补决定簇，指在重链和轻链多肽的可变区内发现的非连续抗原结合位点。本发明使用Kabat编号规则对抗体可变区进行CDR和FR区域进行标注。
本说明书中的“同源性”指目标氨基序列或目标核苷酸序列与参考序列比较所显示的氨基酸或核苷酸的高比例匹配性。本说明书中的同源性可使用标准软件如BLAST或FASTA确定。
本说明书中，“80％以上同源性”是指同源性为80％以上，是指优选为85％以上、更优选为88％以上、进一步优选为90％以上、进一步更优选为93％以上、特别优选为95％以上、特别更优选为98％以上、最优选为100％的同源性。
本说明书中的“基因工程化改造的抗体或抗体片段”指的是通过基因工程化改造方式改造和修饰后的抗体或抗体片段。在本术语中提到的“基因工程化改造”，指的是利用基因拼接和DNA重组技术等方法，将不同来源的基因整合到一起并表达的技术。具体实例包括在抗体或抗体片段中插入其他蛋白或蛋白片段，或者将抗体或抗体片段的某部分替换为其他蛋白或蛋白片段，或者将不同抗体或抗体片段与其他蛋白或蛋白片段连接在一起形成一个更大的蛋白复合物。“人源化抗体”也是一种“基因工程化改造的抗体或抗体片段”，其指的是对非人源(诸如鼠源、兔源等)单克隆抗体用基因克隆以及DNA重组技术进行改造后重新表达的抗体。其特点是降低了对应鼠源抗体的免疫原性，但是保留了鼠源抗体的亲和力和抗原结合的特异性。基本的实现方式是非人源抗体的恒定区部分或抗 体的所有部分均采用人类抗体基因编码。根据改造方式不同，人源化抗体包括嵌合抗体、改造型抗体和全人源化抗体等类型。
本说明书中的“恒定区”指的是抗体上靠近C端氨基酸序列相对稳定的区域。包括“轻链恒定区”和“重链恒定区”，分别指的是抗体轻链上靠近C端氨基酸序列相对稳定的区域和抗体重链上靠近C端氨基酸序列相对稳定的区域。
本说明书中的“scFv”是指这样的抗体片段，即是包含通过接头(linker)连接的重链可变区和轻链可变区的重组蛋白，接头使得这两个结构域相关联，以最终形成抗原结合位点。scFv的大小一般是一个完整抗体的1/6。scFv优选是由一条核苷酸链编码的氨基酸序列。本发明使用的scFv可通过单独或联合使用本领域已知的常规技术，例如氨基酸缺失、插入、取代、增加、和/或重组以及/或其他修饰方法作进一步修饰。根据一种抗体的氨基酸序列在其DNA序列中引入这种修饰的方法对本领域技术人员来说是公知的(参见例如，Sambrook分子克隆：实验手册，Cold Spring Harbor Laboratory(1989)N.Y.)。所述修饰优选在核酸水平上进行。上述scFv还可以包括其衍生物。scFv能够表达为单链多肽。scFv保留了其所源自的完整抗体的特异性。轻链和重链可以为任何顺序，例如，VH-接头-VL或VL-接头-VH，只要保留scFv对靶抗原的特异性即可。在本说明书中，接头可例举如一段富含甘氨酸和丝氨酸的柔性接头肽链。
本说明书中的“嵌合抗原受体”(CAR)是人工改造受体，能够将识别肿瘤细胞表面抗原的特异性分子(如抗体)锚定在免疫细胞(如T细胞)上，使免疫细胞识别肿瘤抗原或病毒抗原和杀死肿瘤细胞或病毒感染的细胞。CAR通常依次包含任选的信号肽、结合肿瘤细胞膜抗原的多肽(如单链抗体)、铰链区、跨膜区和免疫活性细胞活化信号转导区，其中免疫活性细胞活化信号转导区又包括共刺激结构域和信号转导结构域。
其中，“铰链区”是指介于抗原识别域和跨膜结构域之间的亲水区。所述铰链区可以使用各种不同抗体或抗原受体的铰链区，特别是CD分子的铰链区。在一个具体的实施方案中，所述铰链区可以选自例如CD4、CD8α、CD28、IgG1、IgG4。在本发明的一个优选实施方案中，采用了CD8α铰链区。作为铰链区的序列，可例举如：
CD8铰链区(SEQ ID NO：21)：

其中，“跨膜区”只要包括能够贯穿细胞膜的肽即可。优选使用的跨膜区是CD分子的跨膜区。在一个实施方案中，所述跨膜区可以选择例如CD4、CD8、CD28、CD3ζ、T细胞受体的α、β链、CD3ζ、CD3ε、CD45、CD5、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、ICOS、CD154、EGFR(epidermal growth factor receptor，表皮生长因子受体)、NKG2D或GITR的跨膜区。在本发明的一个优选实施方案中，采用了CD8α跨膜区。作为跨膜区的序列，可例举如：
CD8跨膜区(SEO ID NO：22)：
CD4跨膜(SEQ ID NO：23)：
其中“共刺激结构域”是指CAR增强记忆细胞的增殖、存活和/或发育的部分。本发明的CAR可包含一个或多个共刺激结构域。每个共刺激结构域包含例如以下任何一种或多种的共刺激结构域：CD28、4-1BB、ICOS、OX40、CD27、CD40、Myd88、HVEM、GITR、Fc受体相关γ链(Fc Receptor-associatedγchain)等等。在本发明的一个优选实施方案中，采用了CD28和4-1BB的组合。作为共刺激结构域的序列，可例举如：
4-1BB(SEO ID NO：24)：
CD28(SEQ ID NO：25)：

其中“信号转导结构域”是指CAR转导效应子功能信号并指导细胞执行其特化功能的部分。转导效应子功能信号的结构域的示例包括但不限于CD3ζ、FcεRIγ。在本发明的一个优选实施方案中，采用了CD3ζ结构域。作为信号转导结构域的序列，可例举如
CD3z(SEQ ID NO：26)：
本说明书的“膜蛋白、分泌蛋白、胞内蛋白、小分子药物、细胞毒性药物”中，膜蛋白指的是蛋白全部或者某一部分插入在各种膜结构(包括细胞膜、线粒体膜、内质网膜、核膜等膜结构)中的蛋白；分泌蛋白指的是蛋白合成后，分泌到细胞外的蛋白；胞内蛋白指的是存在于细胞膜内部的所有蛋白，包括游离在细胞质中的游离蛋白，也包括各种胞内细胞器膜上的膜蛋白；小分子药物指的是化学合成的药物，其分子量小于1000，其可以通过连接臂和其他蛋白或者分子药物连接在一起；细胞毒性药物指的是对细胞或者特定细胞具有毒性作用的药物，包括但不限于生物碱性药物(如紫杉醇)、代谢类药物(如地西他滨)、抗生素类药物(比如伊达比星)、烷化剂类药物(如异环磷酰胺)以及铂剂类(如顺铂)等，其也可以通过连接臂和其他蛋白或者分子药物连接在一起。
本发明的嵌合抗原受体中，作为膜蛋白，可例举如CD40L、CXCR5、CXCR3、4-1BB、ICOS、OX40、CD27、NKG2D等；作为分泌蛋白，可例举如IL2、IL15、IL4、IL7、IL10、IL18、IFNγ、IL1β、抗体(如anti-PD1抗体，anti-CTLA4抗体等)；作为小分子药物，可例举如FITC/叶酸、雷帕霉素、Rimiducid、PROTAC化合物、Dasatinib等；作为细胞毒性药物，可例举如紫杉醇、长春瑞宾、多西 他塞、羟基喜树碱、吉西他宾、阿糖胞苷、替加氟、甲氨蝶呤、表柔比星、吡柔比星、伊达比星、丝裂霉素、米托蒽醌、异环磷酰胺、达卡巴嗪、顺铂、奥沙利铂等。
本说明书中的“核酸分子”指的是由脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)聚合而成的生物分子化合物。其组成单元为核苷酸，核苷酸单体由五碳糖、磷酸基和含氮碱基组成。
本说明书中的“编码”在被应用至核酸序列时是指，“编码”多肽的多核苷酸，以其天然状态或者在通过本领域技术人员熟知的方法操纵时，可以被转录和/或翻译来产生用于该多肽和/或其片段的mRNA。
本说明书中的“载体”是指重组载体，其保留了感染和转导不分裂和/或缓慢分裂的细胞并整合到靶细胞的基因组中的能力。在一些优选实施方案中，所述载体衍生自或基于野生型病毒。在另一些进一步优选的实施方案中，所述载体衍生自或基于野生型慢病毒。作为其示例，可例举如逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、单纯孢疹病毒载体等。更具体而言，在本发明的一个优选实施方案中，载体为慢病毒载体；在本发明的另一个优选实施方案中，载体为逆转录病毒载体。
本说明书中的“自体或异体的”指的是“自体的细胞”或者“异体的细胞”。其中，“自体的细胞”是指源自于相同个体的细胞，该细胞随后被重新施用到该个体；“异体的细胞”是指源自自体之外的细胞。
本发明中的细胞，可例举如T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、NK-T细胞、MAIT细胞、造血干细胞、胚胎干细胞、诱导多能干细胞、红细胞，其中的T细胞，可例举如αβT细胞、γδT细胞、调节性T细胞。在本发明的一个优选实施方案中，采用了γδT细胞。
本发明的药物组合物中含有本发明的抗体、CAR、核酸分子、载体、和细胞中任意一种，还可以进一步含有可药用载剂。另外，本发明的药物组合物也可以含有本发明的抗体、CAR、核酸分子、载体和细胞中任意两种以上，例如，CAR和核酸分子，还可以进一步含有可药用载剂。另外，本发明的药物组合物也可以包含其他药物活性试剂或药物，如化疗剂，可例举如天冬酰胺酶、白消安(busulfan)、卡铂(carboplatin)、顺铂、柔红霉素(daunorubicin)、阿霉素 (doxorubicin)、氟尿嘧啶、吉西他滨(gemcitabine)、羟基脲、甲胺蝶呤、紫杉醇(paclitaxel)、利妥昔单抗(rituximab)、长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)等。在一个优选的实施方案中，所述药物组合物包含本发明的细胞。
另外，药物组合物中的可药用载剂可以是任何常规使用的药学上可接受的载剂，本领域技术人员可以根据化学-物理条件以及给药路径等条件，选择合适的可药用载剂。本说明书所述的可药用载剂，可例举如，运载剂(vehicle)、佐剂、赋形剂和稀释剂等。可药用载剂优选是在化学上对活性试剂为惰性的载体和在使用条件下没有有害副作用或毒性的载剂。
本说明书中的“治疗或预防”指的是某种疾病发生后，通过某些手段能够使疾病去除的方式或者通过某些手段避免疾病发生的方式。本说明书中的“治疗”和“预防”不一定意味100％或完全的治疗或预防。而是，有不同程度的治疗或预防，本领域技术人员承认其具有潜在的有利或治疗效果。此外，本发明的方法提供的治疗或预防可以包括治疗或预防被治疗或预防的疾病(例如癌症)的一种或多种病症或症状。同样，当用于本发明的目的时，“预防”可以包括延迟疾病或其症状或病症的发作。
本说明书中的“受试者”表示哺乳动物。通常，本发明的受试者是指受癌症折磨或处于受癌症折磨的风险中的任何受试者，优选人类。
本说明书中的“治疗有效量”是指本发明的抗体或抗体片段、嵌合抗原受体、核酸分子、载体、细胞、或者药物组合物以适用于任何医学治疗的合理效益/风险比治疗B7-H3阳性疾病(例如，限制生长或减缓或阻断肿瘤转移)的足够量。然而，应当理解，本发明的抗体或抗体片段、嵌合抗原受体、核酸分子、载体、细胞、或者药物组合物的总的每日用量将由主治医师在合理的医学判断范围内决定。对于任何特定受试者的具体治疗有效剂量水平将取决于多种因素，包括治疗的病症和病症的严重程度、所用具体施用物的活性、所用具体组合、受试者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食、施用时间、施用途径和所用具体施用物的排泄速率、治疗持续时间、与所用具体施用物组合或同时使用的药物以及医学领域中公知的类似因素。
本说明书中的“B7-H3阳性疾病”是指与B7-H3高表达相关的疾病，包括恶性/良性血液肿瘤、恶性/良性实体肿瘤、自身免疫病、细菌感染、病毒感染、寄生虫感染、骨生长异常、同种异体移植、移植排斥等，包括急性骨髓白血病、 慢性骨髓白血病、急性淋巴细胞白血病、非霍金性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、肺癌、结肠直肠癌、肾肿瘤、膀胱癌、胃肠道癌、前列腺癌、肝癌、卵巢癌、胰腺癌、子宫内膜癌、胃癌、前列腺癌、肾癌、宫颈癌、甲状腺癌、子宫癌、神经内分泌癌、头颈癌、鼻咽癌、睾丸癌、基底细胞皮肤癌、鳞状细胞皮肤癌、皮肤纤维肉瘤突出症、梅克尔细胞癌、胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、肉瘤、间皮瘤或骨髓发育不良综合征等，其中，所述自身免疫病包括系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、多发性硬化、干燥综合征、强直性脊柱炎等。本发明的检测用试剂盒为用于检测B7-H3的试剂盒，在该试剂盒中，通常含有这种试剂盒中通常使用的成分、例如pH缓冲剂、稳定剂以及操作说明书、用于检测B7-H3的说明书等附属资料。
本发明的分离试剂盒为用于分离B7-H3阳性细胞的分离试剂盒，在该试剂盒中，通常含有这种试剂盒中通常使用的成分、例如pH缓冲剂、稳定剂以及操作说明书、用于分离B7-H3阳性细胞的说明书等附属资料。
另外，本说明书中的“P2A切割肽”指的是一种来源于病毒的短肽(长度为18-25个氨基酸)，通过被称为“自我剪切”的肽，能使一条转录产物产生多种蛋白。其基本原理是通过使核糖体跳过2A原件C末端的甘氨酸和脯氨酸肽键的合成发挥作用，导致2A序列末端和下游产物分离。P2A多肽是其中一个多肽，其他多肽包括T2A、E2A和F2A，这4种2A肽来源于不同的病毒。
本说明书中的“截短型EGFR”简写为“EGFRt”，指的是截取了野生型EGFR的domain III及domain IV，该截短型EGFR无胞内信号，不会向T细胞内传递其他的信号，同时这两个domain为西妥昔单抗的识别表位，在T细胞上表达该表位后，除了可以作为CAR-T的筛选标记之外，还同时为临床研究增加一个安全开关。通过诱导剂(如西妥昔单抗)可以特异性结合EGFRt，借助抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用使CAR-T细胞发生凋亡，从而可以随时清除体内的CAR-T细胞。
上文中的“抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用”，英文简写为ADCC，指的是抗体的Fab段结合肿瘤细胞的抗原表位，其Fc段与杀伤细胞(NK细胞、巨噬细胞等)表面的FcR结合，介导杀伤细胞直接杀伤靶细胞。
本说明书中的“柔性接头肽链”是指长度为约1至100个氨基酸的寡肽或多肽区，其将本发明的CAR的任何结构域/区连接在一起。接头可由柔性残基(如甘 氨酸和丝氨酸)组成，以便相邻的蛋白质结构域相对于彼此自由移动，当期望确保两个相邻结构域在空间上不相互干扰时，可使用较长的接头。本发明的一个优选的实施方案中，采用了(GGGGS)3。
本说明书中的“转导阳性率”指的是检测外源基因在T细胞上的转导比例，包括CAR在T细胞上的转导率，体现CAR阳性T细胞占总T细胞的比例。
在本说明书中，“亲和力”或“结合亲和力”或“KD”通过测量平衡缔合常数(ka)和平衡解离常数(kd)并计算kd与ka的商(KD＝kd/ka)来确定。KD值越小说明亲和力越强，KD值越大说明亲和力越弱。
实验材料与方法
1.肿瘤细胞系培养
本研究中用到六种贴壁肿瘤细胞，分别是293T、U87、HTB15、TJ905、RKO以及SKOV3细胞。其中293T细胞是人肾上皮细胞系，常被用来研究外源基因的表达以及病毒制备等。U87、HTB15、TJ905均为人脑胶质瘤细胞系，RKO为人结肠癌细胞系，SKOV3为人卵巢癌细胞系。除SKOV3之外，其他肿瘤细胞培养在DMEM完全培养基(DMEM培养基+10％FBS+1％双抗)中。SKOV3培养在McCoy′s 5a完全培养基(McCoy′s 5a培养基+20％FBS+1％双抗)中。
JurkatT细胞为人T淋巴细胞白血病细胞系，细胞培养在RPMI-1640完全培养基(RPMI-1640培养基+10％FBS+1％双抗)中。
2.慢病毒生产
将1×107293T细胞接种到多聚赖氨酸包被的10cm细胞培养皿中，培养基体积为10mL。第二天将表达质粒(骨架来自pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP plasmid(Addgene，Plasmid #72263))、辅助质粒pspAx2(Addgene，#12260)以及辅助质粒pCMV-VSV-G(Addgene，Plasmid #8454)按照6μg、4μg、2μg的量混匀在300μL opti-MEM培养基中，制成含有质粒的培养基；另外，在300μL opti-MEM培养基中加入30μg PEI，充分混匀后，将该PEI溶液加入上述含有质粒的培养基中，立刻混匀，室温静置15min，均匀加入至293T细胞培养皿中(此时为0h)。8h后，更换新的10mL DMEM完全培养基。分别在48h以及72h收集培养基上清，其中48h收集上清后再补加8mL新鲜DMEM完全培养基。用Lenti-XTMConcentrator(Takara)对上清液进行浓缩得到病毒液，并用293T细胞对病毒液进 行病毒滴度检测。将病毒液分装，至于-80℃条件长期保存。
3.原代细胞培养
(1)γδT细胞
准备PBMC细胞，利用PBS进行两次清洗。利用AO/PI细胞计数仪对细胞进行计数，活率检测。
将PBMC细胞培养在RPMI1640培养基+10％FBS+1％双抗+200U/mL rhIL-2培养体系中，初始细胞密度为2×106cells/mL。与此同时，加入5μM唑来膦酸(ZOL)。48h后进行一次等体积补液(不再加入ZOL)，之后每隔48h进行一次细胞密度调整(1×106cells/mL)。
(2)αβT细胞
准备PBMC细胞，利用PBS进行两次清洗。利用AO/PI细胞计数仪对细胞进行计数，活率检测。
对6孔板进行抗体包被处理：将CD3、CD28抗体用opti-MEM培养基稀释至200ng/mL，6孔板的每个孔均加入2mL抗体稀释液，4℃过夜或者37℃处理2h。
在临向6孔板中加入PBMC细胞之前，将抗体稀释液吸走，用2mL PBS清洗一次。
之后加入PBMC，将PBMC细胞重悬在RPMI1640培养基+10％FBS+1％双抗+200U/mL rhIL-2培养体系中，细胞密度调整为2×106cells/mL。之后每隔48h使用RPMI1640培养基+10％FBS+1％双抗+200U/mL rhIL-2的培养体系进行一次细胞密度调整(调整为1×106cells/mL)。
4.αβT以及γδT的病毒转导
将1×107TU慢病毒稀释在200μL PBS中，加入24孔板中。24孔板提前用RetroNectin进行包被。2000g、32℃条件下离心2h。离心之后，将病毒稀释液吸走，用1mL PBS进行清洗，共清洗3次，待加入细胞。
关于αβT或γδT细胞的转导，对体外激活培养24h后的αβT或γδT细胞进行计数，将1×106总细胞重悬于1mL RPMI1640培养基+10％FBS+1％双抗+200U/mL rhIL-2培养体系之后，将其加入病毒处理的24孔板中。800g、32℃条件下离心10min后置于细胞培养箱中培养。之后每隔两到三天进行一次细胞计数，调整密度为1×106cells/mL。
5.流式细胞染色分析
将待流式分析的细胞用PBS清洗一次。2×105细胞用50μL染色体系进行染色。将细胞重悬于染色体系后，置于4℃环境孵育30min。孵育结束后用流式缓冲液清洗两次，用200μL流式缓冲液重悬，进而进行上机分析。
染色体系配置为：50μL流式缓冲液+抗体。
流式缓冲液配方为：PBS+1％FBS+2.5mM EDTA。
抗体使用量根据抗体浓度和实际情况决定，对于大多数抗体(浓度为0.5-1mg/mL)而言，1∶50-1∶100倍稀释即可。
本实验中用到的抗体主要有：anti-human CD3，anti-humanαβTCR，anti-humanγδTCR以及anti-human EGFR。
6.CD69表达检测
将效应细胞与肿瘤细胞按照效靶比1∶1进行孵育，在24孔板中进行孵育，加入0.5×106效应细胞以及0.5×106肿瘤细胞。孵育24h之后进行流式分析。
对于Jurkat T细胞，流式染色体系为：anti-human EGFR，anti-human CD69。对于αβT细胞，流式染色体系为：anti-human CD3，anti-humanαβTCR，anti-human EGFR，anti-human CD69。
7.体外细胞杀伤实验
体外细胞杀伤实验基于Luciferase荧光检测方法。待检测肿瘤细胞稳定表达Luciferase荧光素酶。在24孔板中进行杀伤测试，根据实验需求设置不同效靶比。若效靶比为1∶1，则对肿瘤细胞和效应细胞分别进行计数，将两种细胞用各自培养基重悬至0.5×106cells/mL。在同一个孔中分别加入500μL肿瘤细胞和500μL效应细胞，充分混匀。另外设一个只有肿瘤细胞的对照孔，加入500μL肿瘤细胞的培养基和500μL培养效应细胞的培养基。置于细胞培养箱中培养，24h后检测Luciferase荧光信号。
8.B7-H3与CAR-B7-H3结合能力检测
B7-H3与CAR-B7-H3结合能力通过流式方式进行检测。具体方法是，将CAR-B7-H3稳定表达在Jurkat T细胞上。在100μL流式缓冲液染色体系中，将不同浓度的biotin-B7-H3抗原(浓度范围为0.03125μg/mL到16μg/mL)与1×105 CAR-B7-H3-Jurkat T细胞进行孵育，4℃孵育45min。孵育完成后，500g离心5min，弃上清，用500μL流式缓冲液进行重悬后500g离心5min，弃上清。用100μL流式缓冲液重悬，同时加入0.5μL荧光标记的streptavidin二抗以及0.5μL荧光标记的anti-human EGFR抗体。4℃孵育30min。孵育完成后，500g离心5min，弃上清，用300μL流式缓冲液进行重悬后，流式分析EGFR阳性群下streptavidin二抗的荧光信号。
9.抗体亲和力检测
将B7-H3抗原蛋白配成100nM、50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、3.13nM和1.56nM梯度稀释的7个浓度，96孔板上样，选择人Protein G探针，固定相为抗原，流动相为B7-H3抗体，将结合时间设定为180s，解离时间设定为300s。检测人源单抗的结合常数及解离常数，计算亲和力。
10.ELISA方法检测B7-H3抗体与抗原的结合能力
将待检测抗原包括B7-H1、B7-H3、B7-H4、B7-H5用PBS均分别稀释成0.5mg/mL、1mg/mL、1.5mg/mL、2mg/mL、4mg/mL这5个梯度浓度，将其铺至酶标板(96孔板)，每孔加入100μL，室温放置1h。PBST进行洗涤两次，每孔100μL，加入后静置5min。之后分别加入0μg/mL、2μg/mL或4μg/mL B7-H3抗体，用PBS稀释，每孔加入100μL。室温放置1h。用PBST洗涤三次，每孔100μL，加入后静置5min。用脱脂牛奶将HRP-anti-human Fc抗体以1∶2000稀释(抗体浓度为0.5mg/mL)稀释，每孔加入100μL，室温放置1h。用PBST洗涤三次，每孔100μL，加入后静置5min。避光加入TMB底物溶液，每孔加入100μL，室温避光放置40min。每孔加入100μL 2M硫酸终止反应，将酶标板置于酶标仪读板，在450nm处测OD值。
11.母本抗体阻断实验
于96孔酶标板加入100μL用PBS稀释的10μg/mL B7-H3蛋白，4℃过夜孵育，用PBST进行洗涤两次，每孔100μL，加入后静置5min。分别加入100μL用PBS稀释的0.625、1.25、2.5、5、10、20和40μg/mL的鼠源母本抗体反应1h，用PBST进行洗涤两次，每孔100μL，加入后静置5min。再加入100μL用PBS稀释的2μg/mL B7-H3抗体和2μg/mL识别不同B7-H3抗原表位的8H9抗体进行孵育，通过ELISA进行检测(参见实验材料与方法第10项)。
实施例
以下具体的实施例对本发明提供的技术方案做进一步的描述，旨在仅仅示例本发明而非限制本发明的范围
另外，实施例中的各种实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。实施例中所用的各种试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
实施例1：经人源化的1B4抗体亲和力实验
为了检测人源化1B4抗体与抗原B7-H3的亲和能力。将B7-H3抗原蛋白配成100nM、50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、3.13nM和1.56nM梯度稀释的7个浓度，96孔板上样，选择人Protein G探针，固定相为抗原，流动相为1B4，将结合时间设定为180s，解离时间设定为300s。检测人源单抗的结合常数及解离常数，计算亲和力。
将结果示于图5，结果显示结合常数ka为2.81E+05，解离常数kd为7.38E-05，平衡解离常数KD为2.625E-10。
实施例2：母本抗体阻断实验
于96孔酶标板加入100μL用PBS稀释的10μg/mL B7-H3蛋白，4℃过夜孵育，用PBST进行洗涤两次，每孔100μL，加入后静置5min。分别加入100μL用PBS稀释的0.625、1.25、2.5、5、10、20和40μg/mL的鼠源母本B7-H3抗体(mlB4或者m2Y31)反应1h，用PBST进行洗涤两次，每孔100μL，加入后静置5min。再加入100μL用PBS稀释的2μg/mL人源化B7-H3抗体(hulB4或者hu2Y31)或100μL用PBS稀释的2μg/mL的识别不同B7-H3抗原表位的8H9抗体进行孵育，通过ELISA进行检测。
将结果示于表1。
表1 母本抗体阻断实验结果
实验显示，无论是加入1B4还是2Y31母本抗体均能够显著降低对应人源化1B4或2Y31抗体与B7-H3抗原的结合能力，而对于识别不同表位的8H9抗体则没有显著影响。从结果可以看出，0.625μg/mL的m1B4就可以阻断hulB4与抗原分子的结合，提示hulB4和m1B4识别同一个位点。无论低浓度还是高浓度的m1B4均不能阻断8H9与抗原分子的结合，进一步验证1B4与8H9识别不同的位点。同样，0.625μg/mL的m2Y31就可以阻断hu2Y31与抗原分子的结合，同样提示hu2Y31和m2Y31识别同一个位点，而与8H9识别不同的位点。
实施例3：野生型U87肿瘤细胞及敲除B7-H3的U87肿瘤细胞(U87-B7-H3CAS9)B7-H3表达水平测定
利用CRISPR-Cas9技术构建了一株敲除B7-H3的U87肿瘤细胞株。取100万个的人胶质瘤细胞U87用PBS清洗一遍后用100μLPBS重悬，之后按组别分别加入1μg的试剂(阴性对照为NC，阳性对照为B7-H3抗体8H9，实验组分别 为人源化1B4抗体、人源化2Y31抗体、母本鼠源1B4抗体、母本鼠源2Y31抗体)，4℃孵育30min，PBS清洗一遍，加入500μL的PBS重悬，上机检测其与B7-H3抗原结合能力。
除了用100万个敲除B7-H3的U87细胞替换上述操作中的100万个人胶质瘤细胞U87之外，其他过程进行上述同样的操作。
将结果示于图6，如图6A所示，人源化1B4抗体结合胶质瘤细胞株U87细胞株的信号(虚线峰)要显著高于母本鼠源的1B4抗体(实线峰)。同时，将U87细胞株的B7-H3敲除之后，两种抗体均没有结合作用。说明1B4抗体对B7-H3抗原的特异性结合。
图6B结果显示，人源化2Y31抗体(hu2Y31)结合U87细胞株的信号显著高于母本鼠源的2Y31抗体(m2Y31)，也要高于8H9抗体。所有抗体与B7-H3敲除U87肿瘤细胞均没有结合信号。说明2Y31抗体对B7-H3抗原具有特异性，且人源化抗体与B7-H3抗原的结合能力高于母本鼠源抗体。
实施例4：1B4抗体与B7-H3同家族其他蛋白的结合能力实验
为了验证1B4抗体与B7-H3蛋白结合的特异性，排除其与B7家族其他成员的结合，本专利利用ELISA方法进行了测试。将待检测抗原包括B7-H1、B7-H3、B7-H4、B7-H5用PBS均分别稀释成0.5mg/mL、1mg/mL、1.5mg/mL、2mg/mL、0.5mg/mL这5个梯度浓度，将其铺在酶标板(96孔板)，每孔加入100μL，室温放置1h。PBST进行洗涤两次，每孔100μL，加入后静置5min。之后分别加入0μg/mL、2μg/mL或4μg/mL B7-H3抗体，用PBS稀释，每孔加入100μL。室温放置1h。用PBST洗涤三次，每孔100μL，加入后静置5min。用脱脂牛奶将HRP-anti-human Fc抗体以1∶2000稀释(抗体浓度为0.5mg/mL)，每孔加入100μL，室温放置1h。用PBST洗涤三次，每孔100μL，加入后静置5min。避光加入TMB底物溶液，每孔加入100μL，室温避光放置40min。每孔加入100μL 2M硫酸终止反应，将酶标板置于酶标仪读板，在450nm处测OD值。将结果示于表2。
如表2所示，2μg/mL的1B4抗体与0.5mg/mL B7-H3抗原就有非常高的结合能力，其OD450值达到3.6以上，达到饱和值，进一步提高1B4抗体或B7-H3抗原均不能进一步提高OD450值。而1B4与B7-H1、B7-H4以及B7-H5则没有结合能力，无论是提高1B4抗体或B7-H3抗原浓度均不能提高OD450值，都处于基础值0.04左右。说明1B4抗体与B7-H3蛋白结合具有特异性，其与B7家族其他成员没有结合能力。
实施例5：CAR结构的构建
本实施例中用到的CAR结构为3代CAR结构，如图7所示，具体结构为5’端为scFv序列，之后依次为CD8铰链区、CD8跨膜区、CD28和4-1BB胞内共刺激结构域和CD3ζ信号转导结构域。其中scFv从5’端开始为抗体的重链可变区、GGGGS GGGGS GGGGS柔性连接多肽和抗体的轻链可变区。在CAR结构之后，通过一个P2A切割肽连接了一个截短型EGFR。
由1B4抗体构建的CAR结构序列(SEQ ID NO：27)：

由2Y31抗体构建的CAR结构序列(SEQ ID NO：28)：

实施例6：表达CAR-B7-H3的Jurkat T细胞与B7-H3蛋白的结合能力的实验
B7-H3与CAR-B7-H3结合能力通过流式方式进行检测。具体方法是，将CAR-B7-H3稳定表达在Jurkat T细胞上。在100μL流式缓冲液染色体系中，将不同浓度的biotin-B7-H3抗原(浓度范围为0.03125μg/mL到16μg/mL)与1×105CAR-B7-H3-Jurkat T细胞进行孵育，4℃孵育45min。孵育完成后，500g离心5min，弃上清，用500μL流式缓冲液进行重悬后500g离心5min，弃上清。用100μL流式缓冲液重悬，同时加入0.5μL荧光标记的streptavidin二抗，0.5μL荧光标 记的anti-human EGFR抗体。4℃孵育30min。孵育完成后，500g离心5min，弃上清，用300μL流式缓冲液进行重悬后，流式分析EGFR阳性群下streptavidin二抗的荧光信号。
将结果示于图8，从结果中看出，CAR-B7-H3(1B4)和CAR-B7-H3(2Y31)与B7-H3蛋白均有结合能力，其中CAR-B7-H3(1B4)与B7-H3的结合能力更高。
实施例7：表达CAR-B7-H3(1B4)的Jurkat T细胞的功能测定
利用基因编辑技术构建了一株B7-H3敲除的RKO肿瘤细胞株，利用1B4抗体，通过流式分析技术进行了验证，结果如图9所示，野生型RKO肿瘤细胞(深色峰，RKO WT)表达高水平的B7-H3，B7-H3敲除的RKO肿瘤细胞不表达B7-H3(浅色峰，RKO B7-H3 KO)。
之后进一步检测了CAR-B7-H3的CD69信号活化水平。将效应细胞(包括没有表达CAR-B7-H3的JurkatT-control细胞以及表达了CAR-B7-H3的CAR-B7-H3-JurkatT细胞)与肿瘤细胞(RKO WT和RKO B7-H3 KO)按照效靶比1∶1进行孵育。具体操作为在24孔板中进行孵育，加入0.5×106效应细胞以及0.5×106肿瘤细胞。孵育24h之后进行流式分析。流式染色体系为：anti-human EGFR，anti-human CD69。
结果如图10所示，可以看出，表达CAR-B7-H3(1B4)的Jurkat T(CAR-B7-H3-JurkatT)在受到野生型RKO(RKO WT)肿瘤细胞的刺激后，其CD69信号显著上调，而缺失B7-H3的RKO肿瘤细胞则未见CD69信号的增强。此外，表达CAR-B7-H3(1B4)不会上调CD69的本底信号，排除了其对T细胞的激活毒性作用。
实施例8：表达CAR-B7-H3(1B4)的αβT细胞的CAR转导阳性率以及功能测定
(1)CAR转导阳性率
利用荧光标记的EGFR抗体对CAR-B7-H3(1B4)-αβT细胞进行标记染色，通过流式细胞仪进行检测，结果如图11A所示，可以看到EGFR阳性率为89.4％，也就是CAR转导阳性率为89.4％。
(2)CAR-B7-H3(1B4)-αβT细胞的CD69表达水平
为了分析CAR-B7-H3(1B4)-αβT细胞的CD69表达水平，将效应细胞(包括没有表达CAR-B7-H3的αβT-control细胞以及表达了CAR-B7-H3的CAR-B7-H3-αβT细胞)与肿瘤细胞(RKO WT和RKO B7-H3 KO)按照效靶比1∶1进行孵育。具体操作为在24孔板中进行孵育，加入0.5×106效应细胞以及0.5×106肿瘤细胞。孵育24h之后进行流式分析。流式染色体系为：anti-human CD3，anti-humanαβTCR，anti-human EGFR，anti-human CD 69。
结果如图11B所示，RKO WT肿瘤细胞能够显著提高CAR-B7-H3(1B4)-αβT细胞中CD69的表达，而缺失B7-H3的RKO肿瘤细胞不影响CAR-B7-H3(1B4)-αβT细胞中CD69的表达。同时，αβT细胞表达CAR-B7-H3之后不会引起自身CD69本底信号的上调。
(3)CAR-B7-H3(1B4)-αβT细胞对RKO肿瘤细胞的体外杀伤能力
体外细胞杀伤实验基于Luciferase荧光检测方法。待检测肿瘤细胞(包括RKO WT和敲除B7-H3的RKO细胞(RKO B7-H3 KO))稳定表达Luciferase荧光素酶。在24孔板中进行杀伤测试，本实验中设置不同效靶比，分别为0.5∶1，1∶1和3∶1。对于效靶比0.5∶1，对肿瘤细胞和效应细胞分别进行计数，将两种细胞用各自培养基重悬，效应细胞重悬至0.25×106细胞/mL，肿瘤细胞重悬至0.5×106细胞/mL。对于效靶比为1∶1，效应细胞和肿瘤细胞均重悬至0.5×106细胞/mL。对于效靶比为3∶1，效应细胞重悬至1.5×106细胞/mL，肿瘤细胞重悬至0.5×106细胞/mL。在同一个孔中分别加入500μL肿瘤细胞和500μL效应细胞，充分混匀。另外设一个只有肿瘤细胞的对照孔，加入500μL肿瘤细胞的培养基和500μL培养效应细胞的培养基。置于细胞培养箱中培养，24h后检测Luciferase荧光信号。
结果示于图12，可以看出，相比对照组αβT细胞(αβT)，表达CAR-B7-H3的αβT细胞对于RKO肿瘤细胞具有很好的体外杀伤效果，其杀伤能力随着效靶比增加而逐渐升高，但是对缺失B7-H3的RKO肿瘤细胞没有杀伤作用。由此也可以进一步验证，CAR-B7-H3-αβT细胞对于RKO肿瘤细胞的杀伤效果是通过识别B7-H3进行的。
(4)CAR-B7-H3(1B4)-αβT细胞对胶质瘤细胞的体外杀伤能力
利用与(3)中相同的实验方法，本专利进而检测了表达CAR-B7-H3的αβT细胞对胶质瘤肿瘤细胞(包括HTB15和TJ905)的杀伤能力。
结果如图13所示，可以看出，表达CAR-B7-H3的αβT细胞对胶质瘤肿瘤细胞(包括HTB15和TJ905)也有很强的杀伤效果，其杀伤能力随着效靶比增加而逐渐升高。与之不同的是，不表达CAR-B7-H3的αβT(αβT)则对这两株胶质瘤肿瘤细胞无杀伤能力，由此也可以进一步验证，CAR-B7-H3-αβT细胞对于两株胶质瘤肿瘤细胞的杀伤效果是通过识别B7-H3进行的。
实施例9：表达CAR-B7-H3(1B4)的γδT细胞的CAR转导阳性率以及功能测定
(1)CAR转导阳性率
利用荧光标记的EGFR抗体对CAR-B7-H3(1B4)-γδT细胞进行标记染色，通过流式细胞仪进行检测，结果示于图14，可以看到EGFR阳性率为45.9％，也就是CAR转导阳性率为45.9％。
(2)表达CAR-B7-H3(1B4)的CAR-αβT以及CAR-γδT对RKO WT肿瘤细胞的杀伤效果
利用实施例8中(3)的实验方法，进一步分析比较了表达CAR-B7-H3的CAR-αβT以及CAR-γδT对RKO WT肿瘤细胞的杀伤效果。
将结果示于图15，可以看出，CAR-B7-H3-αβT细胞杀伤能力显著高于未表达CAR-B7-H3的αβT细胞(图15A)，CAR-B7-H3-αβT细胞对于B7-H3敲除的RKO肿瘤细胞的杀伤能力与未表达CAR-B7-H3的αβT细胞相当(图15B)；CAR-B7-H3-γδT细胞对于RKO肿瘤细胞的杀伤能力显著高于未表达CAR-B7-H3的γδT细胞(图15A)，CAR-B7-H3-γδT细胞对于B7-H3敲除的RKO肿瘤细胞的肿瘤杀伤能力与未表达CAR-B7-H3的γδT细胞相当(图15B)。这进一步验证了，CAR-B7-H3-αβT细胞和CAR-B7-H3-γδT细胞通过识别B7-H3来增强对RKO肿瘤细胞的杀伤。
另外，也可以看出，在相同的转导阳性率(通过在CAR-B7-H3-αβT细胞中加入不表达CAR的αβT细胞，从而将其转导阳性率调低至与CAR-B7-H3-γδT的转导阳性率一致)和相同效靶比的条件下，CAR-B7-H3-γδT细胞对于RKO肿瘤细胞的杀伤能力要显著高于CAR-B7-H3-αβT细胞。
而且，未表达CAR-B7-H3的γδT细胞对于RKO肿瘤细胞也有一定的杀伤能力(图15A)，并且显著高于未表达CAR-B7-H3的αβT细胞。进一步说明，γδT细胞的抗肿瘤能力高于αβT细胞。
实施例10：两种不同抗体来源的CAR-γδT的功能差异的考查
利用实施例8中(3)的实验方法，进一步分析比较了表达CAR-B7-H3(1B4)以及CAR-B7-H3(2Y31)的γδT对RKO WT肿瘤细胞的杀伤效果。
结果示于图16，可以看出，无论是1B4还是2Y31抗体来源的scFv，CAR-B7-H3-γδT均对SKOV3具有肿瘤杀伤能力，且杀伤能力显著高于未修饰的γδT。两种不同抗体来源的CAR-B7-H3-γδT对于SKOV3的杀伤能力无显著差异。所有杀伤条件下，两种不同抗体来源的CAR-B7-H3-γδT的抗肿瘤能力均随着效靶比的增加而增大。
实施例11：体内抗肿瘤能力实验
本实验采用腹腔成瘤的动物模型，每只小鼠腹腔接种1×106SKOV3肿瘤细胞(稳定表达Luciferase荧光素酶)，其中，将1×106SKOV3肿瘤细胞重悬于200μL PBS中进行腹腔注射(将接种日作为接种第0天)。SKOV3肿瘤细胞接种第4天进行体重测量和肿瘤活体成像分析，根据体重和肿瘤大小数据随机分成3组，分别为对照组、γδT治疗组以及CAR-B7-H3(1B4)-γδT治疗组。
在接种第5天进行细胞干预治疗，其中，对照组每只小鼠腹腔注射200μL PBS，γδT治疗组每只小鼠腹腔注射1×106γδT细胞(重悬于200μL PBS)，CAR-B7-H3-γδT治疗组每只小鼠腹腔注射1×106CAR-B7-H3(1B4)-γδT细胞(重悬于200μL PBS)。之后定期进行肿瘤活体成像分析，观察小鼠生存情况，统计生存曲线。
对于肿瘤活体成像操作：将小鼠用异氟烷麻醉机进行麻醉，用胰岛素注射器吸取100μL luciferin底物(2mg)后注射至小鼠腹腔。10min后，通过IVIS荧光成像仪进行成像，保存图像，统计荧光值。
实验结果
(1)肿瘤在小鼠体内生长情况
参考图17及图18可知，对于腹腔成瘤的SKOV3肿瘤模型，腹腔回输 CAR-B7-H3-γδT能够显著抑制肿瘤的生长。未修饰的γδT细胞对肿瘤有一定抑制能力，但是效果不显著。
(2)肿瘤模型小鼠的生存情况
参考图19可知，对照组的荷瘤小鼠在85天左右全部死亡；γδT治疗组的小鼠的生存时间能够延长10天左右，至95天；而CAR-B7-H3-γδT治疗组的小鼠的生存时间显著增加，至125天时仍能够维持80％的生存率。

Claims (30)

  1. 一种特异性结合B7-H3的分离的抗体或抗体片段，其包含重链可变区VH和轻链可变区VL，
    所述重链可变区VH包括：如SEQ ID NO：9的氨基酸序列所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO：10的氨基酸序列所示的VH-CDR2和如SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列VH-CDR3；
    所述轻链可变区VL包括：如SEQ ID NO：12的氨基酸序列所示的VL-CDR1，如SEQ ID NO：13的氨基酸序列所示的VL-CDR2和如SEQ ID NO：14的氨基酸序列所示的VL-CDR3。
  2. 一种特异性结合B7-H3的分离的抗体或抗体片段，其包含重链可变区VH和轻链可变区VL，
    所述重链可变区VH包括如SEQ ID NO：15的氨基酸序列所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO：16的氨基酸序列所示的VH-CDR2和如SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列VH-CDR3；
    所述轻链可变区VL包括：如SEQ ID NO：18的氨基酸序列所示的VL-CDR1，如SEQ ID NO：19的氨基酸序列所示的VL-CDR2和如SEQ ID NO：20的氨基酸序列所示的VL-CDR3。
  3. 如权利要求1或2所述的特异性结合B7-H3的分离的抗体或抗体片段，其中，
    所述重链可变区VH选自SEQ ID NO：1所示氨基酸序列、在CDR区之外与SEQ ID NO：1所示氨基酸序列具有80％以上、或85％以上、或88％以上、或90％以上、或93％以上、或95％以上、或98％以上同源性的氨基酸序列、SEQ ID NO：2所示氨基酸序列、在CDR区之外与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列具有80％以上、或85％以上、或88％以上、或90％以上、或93％以上、或95％以上、或98％以上同源性的氨基酸序列中的任一种。
  4. 如权利要求1或2所述的特异性结合B7-H3的分离的抗体或抗体片段，其中，
    所述轻链可变区VL选自SEQ ID NO：3所示氨基酸序列、在CDR区之外与SEQ ID NO：3所示氨基酸序列具有80％以上、或85％以上、或88％以上、或90％ 以上、或93％以上、或95％以上、或98％以上同源性的氨基酸序列、SEQ ID NO：4所示氨基酸序列、在CDR区之外与SEQ ID NO：4所示氨基酸序列具有80％以上、或85％以上、或88％以上、或90％以上、或93％以上、或95％以上、或98％以上同源性的氨基酸序列中的任一种。
  5. 一种特异性结合B7-H3的分离的抗体或抗体片段，其包括：
    (i)SEQ ID NO：1所示的重链可变区VH和SEQ ID NO：3所示的轻链可变区VL，或者
    (ii)SEQ ID NO：2所示的重链可变区VH和SEQ ID NO：4所示轻链可变区VL。
  6. 如权利要求1～5中任一项所述的特异性结合B7-H3的分离的抗体或抗体片段，其中，所述抗体或抗体片段为基因工程化改造的抗体或抗体片段。
  7. 如权利要求1～6中任一项所述的特异性结合B7-H3的分离的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段为scFv。
  8. 一种嵌合抗原受体，其包含：权利要求7所述的特异性结合B7-H3的抗体或抗体片段。
  9. 如权利要求8所述的嵌合抗原受体，其包含：权利要求7所述的抗体或抗体片段、融合于所述抗体或抗体片段的羧基末端的跨膜区。
  10. 如权利要求8或9所述的嵌合抗原受体，其包含：权利要求7所述的抗体或抗体片段、融合于所述抗体或抗体片段的羧基末端的跨膜区和融合于所述跨膜区的羧基末端的免疫活性细胞活化信号转导区。
  11. 如权利要求8～10中任一项所述的嵌合抗原受体，其还包含有膜蛋白、分泌蛋白、胞内蛋白、小分子药物、细胞毒性药物中的任一种或任两种以上。
  12. 一种核酸分子，其包含：编码权利要求1～7中任一项所述的抗体或抗体片段或权利要求8～11中任一项所述的嵌合抗原受体的核苷酸序列。
  13. 如权利要求12所述的核酸分子，其包含：
    (i)如SEQ ID NO：5所示的编码重链可变区的核苷酸序列，以及如SEQ ID NO：7所示的编码轻链可变区的核苷酸序列，或者，
    (ii)如SEQ ID NO：6所示的编码重链可变区的核苷酸序列，以及如SEQ ID NO：8所示的编码轻链可变区的核苷酸序列。
  14. 一种载体，其包含权利要求12或13所述的核酸分子。
  15. 如权利要求14所述的载体，其为慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体。
  16. 一种细胞，其包含权利要求12或13所述的核酸分子或者权利要求14或15所述的载体。
  17. 如权利要求16所述的细胞，其包括自体或异体的T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、NK-T细胞、MAIT细胞、造血干细胞、胚胎干细胞、诱导多能干细胞、红细胞，所述T细胞包括αβT细胞、γδT细胞、调节性T细胞。
  18. 一种药物组合物，
    其包含：选自权利要求1～7中任一项所述的抗体或抗体片段、权利要求8～11中任一项所述的嵌合抗原受体、权利要求12或13所述的核酸分子、权利要求14或15所述的载体、权利要求16或17所述的细胞中的任意一种以上，或者，
    其包含：选自权利要求1～7中任一项所述的抗体或抗体片段、权利要求8～11中任一项所述的嵌合抗原受体、权利要求12或13所述的核酸分子、权利要求14或15所述的载体、权利要求16或17所述的细胞中的任意一种以上，以及可药用载剂，或者，
    其包含：选自权利要求1～7中任一项所述的抗体或抗体片段、权利要求8～11中任一项所述的嵌合抗原受体、权利要求12或13所述的核酸分子、权利要求14或15所述的载体、权利要求16或17所述的细胞中的任意一种以上，以及其他药物活性试剂或药物。
  19. 一种治疗或预防B7-H3阳性疾病方法，该方法包括给与受试者治疗有效量的权利要求1～7中任一项所述的抗体或抗体片段、权利要求8～11中任一项所述的嵌合抗原受体、权利要求12或13所述的核酸分子、权利要求14或15所述的载体、权利要求16或17所述的细胞、或者权利要求18所述的药物组合物。
  20. 如权利要求19所述的方法，所述B7-H3阳性疾病包括恶性/良性血液肿瘤、恶性/良性实体肿瘤、自身免疫病、细菌感染、病毒感染、寄生虫感染、骨生长异常、同种异体移植、移植排斥，所述自身免疫病包括系统性红斑狼疮、 类风湿性关节炎、多发性硬化、干燥综合征、强直性脊柱炎。
  21. 如权利要求20所述的方法，所述B7-H3阳性疾病包括急性骨髓白血病、慢性骨髓白血病、急性淋巴细胞白血病、非霍金性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、肺癌、结肠直肠癌、肾肿瘤、膀胱癌、胃肠道癌、前列腺癌、肝癌、卵巢癌、胰腺癌、子宫内膜癌、胃癌、前列腺癌、肾癌、宫颈癌、甲状腺癌、子宫癌、神经内分泌癌、头颈癌、鼻咽癌、睾丸癌、基底细胞皮肤癌、鳞状细胞皮肤癌、皮肤纤维肉瘤突出症、梅克尔细胞癌、胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、肉瘤、间皮瘤或骨髓发育不良综合征。
  22. 一种用于治疗或预防B7-H3阳性疾病的权利要求1～7中任一项所述的抗体或抗体片段、权利要求8～11中任一项所述的嵌合抗原受体、权利要求12或13所述的核酸分子、权利要求14或15所述的载体、权利要求16或17所述的细胞或者权利要求18所述的药物组合物。
  23. 如权利要求22所述的用于治疗或预防B7-H3阳性疾病的抗体或抗体片段、嵌合抗原受体、核酸分子、载体、细胞或者药物组合物，所述B7-H3阳性疾病包括恶性/良性血液肿瘤、恶性/良性实体肿瘤、自身免疫病、细菌感染、病毒感染、寄生虫感染、骨生长异常、同种异体移植、移植排斥，所述自身免疫病包括系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、多发性硬化、干燥综合征、强直性脊柱炎。
  24. 如权利要求23所述的用于治疗或预防B7-H3阳性疾病的抗体或抗体片段、嵌合抗原受体、核酸分子、载体、细胞或者药物组合物，所述B7-H3阳性疾病包括急性骨髓白血病、慢性骨髓白血病、急性淋巴细胞白血病、非霍金性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、肺癌、结肠直肠癌、肾肿瘤、膀胱癌、胃肠道癌、前列腺癌、肝癌、卵巢癌、胰腺癌、子宫内膜癌、胃癌、前列腺癌、肾癌、宫颈癌、甲状腺癌、子宫癌、神经内分泌癌、头颈癌、鼻咽癌、睾丸癌、基底细胞皮肤癌、鳞状细胞皮肤癌、皮肤纤维肉瘤突出症、梅克尔细胞癌、胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、肉瘤、间皮瘤或骨髓发育不良综合征。
  25. 一种B7-H3的检测方法，其包括：使用权利要求1～7中任一项所述的抗体或抗体片段、权利要求8～11中任一项所述的嵌合抗原受体、或者权利要求12或13所述的核酸分子，来检测B7-H3的步骤。
  26. 一种B7-H3的检测用试剂盒，其含有权利要求1～7中任一项所述的抗体 或抗体片段或其标记物、权利要求8～11中任一项所述的嵌合抗原受体或其标记物、或者权利要求12或13所述的核酸分子或其标记物。
  27. 一种分离B7-H3阳性细胞的分离试剂盒，其含有权利要求1～7中任一项所述的抗体或抗体片段或其标记物、权利要求8～11中任一项所述的嵌合抗原受体或其标记物、或者权利要求12或13所述的核酸分子或其标记物。
  28. 一种体外增强细胞功能的方法，其包括：使细胞与权利要求1～7中任一项所述的抗体或抗体片段或其标记物、权利要求8～11中任一项所述的嵌合抗原受体或其标记物、或者权利要求12或13所述的核酸分子或其标记物，相接触的步骤。
  29. 权利要求1～7中任一项所述的抗体或抗体片段在制备用于检测B7-H3蛋白的制品中的应用。
  30. 权利要求1～7中任一项所述的抗体或抗体片段在制备用于阻断B7-H3蛋白的制品中的应用。
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