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CN106456811B - 肽组合物的灭菌和过滤 - Google Patents

肽组合物的灭菌和过滤 Download PDF

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CN106456811B
CN106456811B CN201580024216.4A CN201580024216A CN106456811B CN 106456811 B CN106456811 B CN 106456811B CN 201580024216 A CN201580024216 A CN 201580024216A CN 106456811 B CN106456811 B CN 106456811B
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Abstract

本申请涉及用于灭菌粘性肽组合物的方法和装置，所述粘性肽组合物在高浓度时具有剪切稀化的流变性质。

Description

肽组合物的灭菌和过滤
相关申请的交叉引用
根据35U.S.C.§119(e)的规定本申请要求于2014年3月10日提交的美国临时专利申请序号61/950,536的优先权，该申请的全部内容通过引用并入本申请。
序列表
本申请引用以电子ASCII.txt文件形式提交的命名为“2004837-0044_Sequences.txt”的序列表。该.txt文件于2015年3月9日创建，大小为1Kb。
背景
具有自组装成凝胶结构能力的肽试剂在治疗和研究背景下具有多种多样的用途。此类肽试剂的一种，例如合成的，具有精氨酸、丙氨酸和天冬氨酸重复序列的16个氨基酸的多肽(即RADARADARADARADA[SEQ ID NO:1]，也称为“RADA16”)是可以购买获得的，其来自三维矩阵医药技术公司(3-D Matrix Medical Technology)，商品名为
Figure BDA0001148023440000011
Figure BDA0001148023440000012
和PuraMatrix
Figure BDA0001148023440000013
并且已证实其在实验室和临床上具有广泛应用，包括细胞培养，药物递送，加速软骨和骨生长，以及CNS、软组织和心肌的再生并且还能作为能够与一种或多种检测试剂、生物活性剂、细胞和/或细胞成分结合的基质、支架或系链。
概述
除了其他以外，本发明提供了用于处理肽组合物的方法及相关技术。本申请提供的教导可以特别地用于高粘度的肽组合物和/或自组装肽的组合物。
除了其他以外，本申请显示了某些肽组合物(例如特定浓度和/或具有特定流变性质的特定肽组合物)具有某些特性和/或其可能不适于某些操作和/或处理步骤，例如过滤(例如灭菌过滤)。
本申请还显示了某些特定的肽组合物对能够破坏多种肽组合物的一种或多种处理(例如在高压灭菌程序中应用的热处理)具有令人吃惊的稳定性。
因此，本申请提供了与对肽组合物的处理特别是灭菌相关的多种技术。
在一些实施方式中，本申请显示了特定的肽组合物可能具有一种或多种有用的和/或令人吃惊的特性(例如对热处理的破坏具有抗性，对剪切力具有流变学响应性和/或从剪切力的应用中恢复等)。
除了其他以外，本申请提供了用于灭菌肽组合物的系统，和/或用于确定应用于特定肽组合物的适宜的此类系统的系统。
在一些实施方式中，可以例如通过一个或多个选自下组的特征定义特定的肽组合物：肽序列、肽浓度、粘度、硬度、对热处理的敏感性、对应用剪切力的流变学响应性、从剪切力的应用中流变学恢复等。
除了其他以外，本申请提供了可以通过高压处理灭菌的某些肽组合物。
在一些实施方式中，本申请提供了实现对某些肽组合物过滤的某些技术，特别是用于改变肽组合物的流变性质(如由肽的特性和序列所定义的)以使得其适于过滤。例如，在一些实施方式中，可以在过滤前降低待过滤的肽组合物的粘度。在一些实施方式中，可以向肽组合物应用剪切力，以使得其流变性质改变。例如，可以在过滤前降低肽组合物的粘度和/或硬度；在一些实施方式中，这种降低是暂时性的。
在一些实施方式中，所提供的技术能够过滤比使用常规的过滤技术可过滤的更高浓度的肽组合物。例如，本申请所述的技术能够过滤RADA16，并且特别是在其浓度高于2.5％时通过过滤灭菌。
在一些特定的实施方式中，本申请提供了一种用于灭菌液体肽组合物的方法，所述液体肽组合物的序列包含一系列重复的IEIK单元，所述方法包括对组合物进行高压灭菌处理。在一些实施方式中，方法不包括灭菌过滤。
在一些实施方式中，本申请提供了一种用于灭菌液体肽组合物的方法，所述液体肽组合物的序列包含一系列重复的IEIK单元，所述方法包括对组合物进行加热处理。在一些实施方式中，加热处理在约121℃下进行约25min。
在一些实施方式中，本申请提供了一种用于灭菌液体肽组合物的方法，所述液体肽组合物在振荡应力为在1Pa的条件下具有范围在约300至约5,000Pa内的初始储能模量，所述方法包括步骤：向液体肽组合物施加高剪切应力，以使得组合物的储能模量暂时降至所述初始储能模量约0.01％至80％范围内的水平，和当其粘度处于该降低的水平时将组合物过滤。
在一些实施方式中，向所述组合物施加高剪切应力的步骤利用至少一个剪切稀化部件。
在一些实施方式中，至少一个剪切稀化部件是或者包括至少一个针。在一些实施方式，至少一个针的长度至少为10mm。在一些实施方式中，至少一个针的规格在约25号至约35号的范围内。
在一些实施方式中，至少一个剪切稀化部件是或者包括至少一个具有微米或纳米级孔的筛网。在一些实施方式中，微米或纳米级孔具有范围在约0.5μm至约200μm内的最大尺寸。在一些实施方式中，孔之间的夹点为约5μm至约10mm。在一些实施方式中，筛网至少部分地由选自下组的材料制成：不锈钢、钨、钛、硅、陶瓷、塑料及其组合。在一些实施方式中，筛网的厚度为约10μm至约10mm。
在一些实施方式中，至少一个剪切稀化部件是或者包括至少一个具有微米或纳米级孔的膜。在一些实施方式中，孔具有范围从约0.45μm至约120μm的尺寸。
在一些实施方式中，用于灭菌的高剪切力的范围从约30至约200Pa。
在一些实施方式中，液体肽组合物包括RADA16、IEIK13或KLD12。
在一些实施方式中，液体肽组合物在过滤前加压。在一些实施方式中，进一步在真空下贮存液体肽组合物。
附图详述
图1A和1B显示了高压灭菌处理前后对RADA16进行的用以评估其热敏感性的质谱分析的示例。图1A为高压灭菌处理前的质谱图。图1B为高压灭菌处理后的质谱图。图 1C显示了示例性RADA16的分子结构；在所分析的特定肽组合物中，蛋白由 RADARADARADARADA组成，其中N末端和C末端被乙酰基和氨基保护。
图2A和2B显示了高压灭菌处理前后对IEIK13进行的用以评估其热敏感性的质谱分析的示例。图2A为高压灭菌处理前的质谱图。图2B为高压灭菌处理后的质谱图。图2C 显示了示例性IEIK13的分子结构；在所分析的特定肽组合物中，蛋白由IEIKIEIKIEIKI 组成，其中N末端和C末端被乙酰基和氨基保护。
图3A和3B显示了高压灭菌处理前后对KLD12进行的用以评估其热敏感性的质谱分析的示例。图3A为高压灭菌处理前的质谱图。图3B为高压灭菌处理后的质谱图。图3C 显示了示例性KLD12的分子结构；在所分析的特定肽组合物中，蛋白由KLDLKLDKKLDL 组成，其中N末端和C末端被乙酰基和氨基保护。
图4显示了示例性的在高压灭菌处理前后对RADA16和IEIK13进行的时间扫描测试。
图5提供了肽和过滤粘稠的肽溶液所需的装置的照片，例如RADA16、KLD12和IEIK13。通过30号针向肽溶液施加剪切力(中间)，以便将肽溶液过滤(右侧)。
图6显示了在1Pa和10rad/s下对1％和2.5％RADA16进行的时间扫描测试的示例。将RADA16注射通过30号针，以便应用剪切力降低肽的刚性。从注射后1分钟开始测定。
图7显示了在1Pa和10rad/s下对1％和2.5％KLD12进行的时间扫描测试的示例。将KLD12注射通过30号针，以便应用剪切力降低肽的刚性。从注射后1分钟开始测定。
图8显示了在1Pa和10rad/s下对2.5％IEIK13进行的时间扫描测试的示例。将IEIK13 注射通过30号针，以便应用剪切力降低肽的刚性。从注射后1分钟开始测定。
图9显示了对2.5％RADA16溶液从剪切速率0.003至1000 1/sec进行的流动粘度测试的示例。
图10显示了对1.5％IEIK13溶液从剪切速率0.003至1000 1/sec进行的流动粘度测试的示例。
图11显示了以时间函数表示的对2.5％RADA16进行的用以显示粘度恢复情况的粘度检测的示例。在时间＝0时，向肽施加剪切力，以使得粘度降低。水平线表示2.5％RADA16的原始粘度。
图12显示了以时间函数表示的对1.5％IEIK13进行的用以显示粘度恢复情况的粘度检测的示例。在时间＝0时，向肽施加剪切力，以使得粘度降低。水平线表示1.5％IEIK13的原始粘度。
图13显示了用于过滤粘性肽溶液的装置的示例，所述粘性肽溶液例如RADA16、KLD12和IEIK13。通过具有多个孔的剪切稀化部件施加剪切力。使用顶部(i)上的注射器分散肽溶液。使肽溶液通过第一剪切稀化室(25mm滤器支架，密理博(ii))，其中插入了具有孔或洞的剪切稀化部件以暂时降低肽溶液的粘度。然后使肽溶液通过第二过滤室(25mm滤器支架，密理博(iii))，其中插入了滤膜以便对肽溶液灭菌或从肽溶液中除去微粒。在用于输出的瓶(iv)中接收过滤后的溶液。高压分散器与分散注射器(v)连接。高压氮气与高压分散器(vii)连接。
图14显示了向2.5％KLD12溶液和1.5％IEIK13溶液施加剪切力后粘度的目测观察结果。上面一行包括了2.5％KLD的照片。下面一行包括了1.5％IEIK13的照片。最左边一列的溶液在小瓶上部。最右边一列的溶液(施加剪切力后)具有较低粘度，这样大部分材料处于小瓶的底部。
图15A、15B、15C和15D显示了用于过滤粘性肽溶液的材料和装置(具有微米或纳米级孔的筛网)，所述粘性肽溶液如RADA16、KLD12和IEIK13。图15A、15B和15C 显示了示例性剪切稀化部件具有微米级孔的筛网的性质，可以将其用于图13所示的装置中。孔通过激光钻孔技术产生。可以将这种筛网插入第一室中以便在实际过滤通过第二室的膜之前降低肽溶液的粘度。图15D显示了使用具有微米或纳米级孔的筛网向2.5％ KLD12施加剪切力后粘度的目测观察结果。
定义
在本申请中使用的术语“试剂”可以指任意化学类别的化合物或实体，包括例如多肽、核酸、糖类、脂质、小分子、金属或其组合。在一些实施方式中，试剂是或者包含自然界发现和/或从自然界获得的天然产物。在一些实施方式中，试剂是或者包含一种或多种人造的实体，其是由人工设计、工程改造和/或生产的和/或在自然界中未被发现。在一些实施方式中，试剂可以以分离的或纯的形式使用；在一些实施方式中，试剂可以以粗品形式使用。在一些实施方式中，以集合或试剂库形式提供潜在的试剂，例如可以对其进行筛选以鉴定或表征其中的活性剂。可以根据本发明使用的试剂的一些特定的实施方式包括小分子、抗体、抗体片段、适体、核酸(例如siRNA、shRNA、DNA/RNA杂交体、反义寡核苷酸、核酶)、肽、肽模拟物等。在一些实施方式中，试剂是或包括聚合物。在一些实施方式中，试剂不是聚合物和/或基本上无任何聚合物。在一些实施方式中，试剂含有至少一个聚合物部分。在一些实施方式中，试剂缺乏或基本上无任何聚合物部分。
在本申请中使用的术语“氨基酸”从最广义讲是指能够例如通过形成一个或多个肽键掺入多肽链的任何化合物和/或物质。在一些实施方式中，氨基酸具有通式结构H2N– C(H)(R)–COOH。在一些实施方式中，氨基酸是天然存在的氨基酸。在一些实施方式中，氨基酸是合成的氨基酸；在一些实施方式中，氨基酸是D-氨基酸；在一些实施方式中，氨基酸是L-氨基酸。“标准氨基酸”指在天然存在的肽中常见的20个标准L-氨基酸中的任意一个。“非标准氨基酸”指标准氨基酸以外的任意氨基酸，无论其是否是合成制备的或由天然来源获得的。在一些实施方式中，与上述通式结构相比氨基酸(包括在多肽中的羧基和/或氨基末端氨基酸)可以含有结构修饰。例如，在一些实施方式中，与通式结构相比，可以通过甲基化、酰胺化、乙酰化和/或取代对氨基酸进行修饰。在一些实施方式中，与含有在其他方面相同的未经修饰氨基酸的多肽相比，此类修饰可能例如改变含有经修饰氨基酸的多肽的循环半衰期。在一些实施方式中，与含有在其他方面相同的未经修饰氨基酸的多肽相比，此类修饰不会显著改变含有经修饰氨基酸的多肽的相对活性。从上下文中将明确，在一些实施方式中，使用术语“氨基酸”指代游离氨基酸；在一些实施方式中，其用于指代多肽的氨基酸残基。
在本申请中使用的术语“大约”或“约”当用于一个或多个目标值时指的是与所陈述的基准值相似的值。在某些实施方式中，除非另有规定或从上下文中可以明显看出(除非这些数目将超出可能值的100％)，术语“大约”或“约”指落入陈述的基准值两个方向 (大于或小于)25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、 9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或以下之内的值的范围。
作为在本申请中使用的术语，如果一个事件或实体的存在、水平和/或形式与另一个的是相关联的，则两个事件或实体彼此之间是“相关的”。例如，如果特定的实体的存在、水平和/或形式与疾病、病症或状况的发病率和/或易感性(例如在相关人群中)是相关联的，则认为该特定的实体(例如多肽、基因特征、代谢物等)与特定疾病、病症或状况具有相关性。在一些实施方式中，如果两个或多个实体直接或间接地相互作用，以使得其是且/或保持物理上彼此接近，则其彼此之间在物理上是“相关的”。在一些实施方式中，物理上彼此相关的两种或多种实体彼此之间共价连接；在一些实施方式中，物理上彼此相关的两种或多种实体彼此之间不是共价连接的，而是非共价结合的，例如通过氢键、范德华相互作用、疏水性相互作用、磁性及其组合的方法。
在本申请中使用术语“可比较的”描述两个(或多个)条件、情况、个体或群体的集合彼此之间是非常相似的以使得能够对获得的结果或观察到的现象进行比较。在一些实施方式中，可比较的条件、情况、个体或群体的集合的特征为具有多个基本上相同的特征以及一个或少数不同的特征。本领域的普通技术人员将理解，当通过足够数量和种类的相同特征来表征以确保得到“在不同情况、个体或人群下或使用不同情况、个体或人群获得的结果或观察到的现象中的差别是由上述变化的特征的改变引起的或表明了上述变化的特征的改变”的合理结论时，多组情况、个体或人群彼此之间是可比较的。本领域技术人员将理解本申请中使用的相对用语(例如增强、活化、减少、抑制等)将通常指在可比较的条件下进行的比较。
本申请描述的某些方法包括“确定”步骤。本领域的普通技术人员在阅读本说明书时将理解这些“确定”可以利用或通过使用本领域技术人员能够获得的各种技术中的任意一种完成，包括例如本申请中明确提及的特定技术。在一些实施方式中，确定包括对物理样品的操作。在一些实施方式中，确定包括对数据或信息的考虑和/或操作，例如利用计算机或适于进行相关分析的其他处理单元。在一些实施方式中，确定包括从来源接收相关信息和/或材料。在一些实施方式中，确定包括将样品或实体的一个或多个特征与可比较的对照进行比较。
在本申请中使用的术语“凝胶”指其流变性质不同于液体、固体等的粘弹性材料。在一些实施方式中，如果组合物的储能模量(G′)大于其模量(G″)则认为其是凝胶。在一些实施方式中，如果在溶液中具有化学或物理交联的网络，则认为组合物是凝胶，其不同于粘稠溶液中缠结的分子。
在本申请中使用的术语“体外”指在人工环境中(例如在试管或反应容器中，在细胞培养基中等)而非多细胞生物体内发生的事件。
在本申请中使用的术语“体内”指在多细胞生物体(如人和非人动物)体内发生的事件。在基于细胞系统的背景下，该术语可以用于指在活细胞中发生的事件(相对于例如在体外系统中)。
在本申请中使用的术语“肽”通常指相对较短的多肽，例如长度小于约100个氨基酸、小于约50个氨基酸、小于20个氨基酸或者小于10个氨基酸。
在本申请中使用的术语“多肽”指氨基酸的任意聚合链。在一些实施方式中，多肽具有在自然界中存在的氨基酸序列。在一些实施方式中，多肽具有在自然界中不存在的氨基酸序列。在一些实施方式中，多肽具有经过工程改造的氨基酸序列，所述氨基酸序列由人工设计和/或生产。在一些实施方式中，多肽可以包含天然氨基酸、非天然氨基酸或两者或由天然氨基酸、非天然氨基酸或两者组成。在一些实施方式中，多肽可以仅包含天然氨基酸或仅包含非天然氨基酸或者仅由天然氨基酸组成或仅由非天然氨基酸组成。在一些实施方式中，多肽可以包含D-氨基酸、L-氨基酸或者两者。在一些实施方式中，多肽可以仅包含D-氨基酸。在一些实施方式中，多肽可以仅包含L-氨基酸。在一些实施方式中，多肽在其N末端、其C末端或任意组合可以包括一个或多个侧基或其他修饰，例如修饰或连接至一个或多个氨基酸侧链。在一些实施方式中，此类侧基或修饰可以选自下组：乙酰化、酰胺化、脂化、甲基化、聚乙二醇化等，包括其组合。在一些实施方式中，多肽可以是环状的，和/或可以包含环状部分。在一些实施方式中，多肽不是环状的和/或不包含任何环状部分。在一些实施方式中，多肽是线型的。在一些实施方式中，多肽可以是或包括装订肽。在一些实施方式中，可以将术语“多肽”附加在参照多肽的名称、活性或结构之后；在这种情况下，其在本申请中指共享相关活性或结构的多肽，并且因此可以将其认为是相同的多肽分类或家族的成员。对于每个这种分类而言，本说明书提供了和/或本领域技术人员将意识到在该分类中的氨基酸序列和/或功能已知的示例性多肽；在一些实施方式中，此类示例性多肽是该多肽分类或家族的参照多肽。在一些实施方式中，多肽分类或家族的成员与该分类中的参照多肽(在一些实施方式中是与该分类中的所有多肽)显示出显著的序列同源性或同一性、与其共享共有序列基序(例如特征性序列元件)和/或与其共享共同的活性(在一些实施方式中在可比较的水平或在指定范围内)。例如，在一些实施方式中，一个多肽成员与参照多肽显示出至少约30-40％，并且通常超过约50％、60％、70％、80％、 90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的总的序列同源性或同一性程度且/或包括至少一个显示出非常高的序列同一性(通常超过90％或者甚至95％、 96％、97％、98％或99％)的区域(例如保守区，其在一些实施方式中可能是或者包括特征性序列元件)。此类保守区通常包括至少3-4个和通常可达20个或更多的氨基酸；在一些实施方式中，保守区包括至少一个具有至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、 14、15个或更多个连续氨基酸的延展。在一些实施方式中，有用的多肽可以包含亲本多肽的片段或由亲本多肽的片段组成。在一些实施方式中，有用的多肽可以包含多个片段或由多个片段组成，其中的每个片段均以相对于目标多肽中存在的彼此之间不同的空间排列方式存在于相同亲本多肽中(例如在亲本中直接连接的片段在目标多肽中可以是空间上分隔的，或者反之亦然，和/或片段可以以与亲本不同的顺序存在于目标多肽中)，以使得目标多肽是其亲本多肽的衍生物。
在本申请中使用的术语“参照”描述了进行比较所相对的标准或对照。例如，在一些实施方式中，将目标试剂、动物、个体、群体、样品、序列或值与参照或对照试剂、动物、个体、群体、样品、序列或值进行比较。在一些实施方式中，对参照或对照的检测和/或确定与对目标的检测或确定基本上同时进行。在一些实施方式中，参照或对照是历史参照或对照，任选地存在于有形介质中。通常地，本领域技术人员将理解，在与评估的那些可比较的条件或情况下对参照或对照进行确定或表征。本领域技术人员将理解当存在足够的相似性时才能证明特定可能的参照或对照的可靠性和/或与特定可能的参照或对照比较是合理的。
对某些实施方式的详细描述
本发明提供了用于肽组合物灭菌的技术。在一些实施方式中，所公开的方法特别适于具有较高粘度和/或刚性的肽溶液。在一些实施方式中，本申请定义了可以通过高压灭菌处理对其进行灭菌的特定的肽溶液。在一些实施方式中，本申请定义了特定的肽溶液，除非且直到对其进行处理以改变其流变性质，否则其可能不适于过滤。在一些实施方式中，本申请提供了可以暂时降低肽溶液的粘度和/或刚性至足以使其能够被过滤的技术。在一些实施方式中，本申请教导了便于某些肽溶液的操作、处理和/或过滤的技术，例如通过施加改善其流变性质的高剪切力。
肽和肽组合物
根据一个或多个实施方式，本申请教导的肽组合物可以是具有约6个至约200个氨基酸残基的两亲性肽的组合物。在某些实施方式中，相关的肽可以具有至少约7个氨基酸的长度。在某些实施方式中，肽可以具有约7个至约17个氨基酸的长度。在某些实施方式中，肽可以具有至少8个氨基酸、至少约12个氨基酸或至少约16个氨基酸的长度。
在一些实施方式中，如本领域中所理解的，两亲性多肽是指其序列同时包括亲水性氨基酸和疏水性氨基酸。在一些实施方式中，此类亲水性氨基酸和疏水性氨基酸可以交替键合，以使得该肽具有亲水性和疏水性氨基酸交替的氨基酸序列。在一些实施方式中，此类肽具有是或包含Arg-Ala-Asp-Ala(RADA)重复的氨基酸序列；在一些实施方式中，此类肽具有是或包含Lys-Leu-Asp(KLD)重复的氨基酸序列；在一些实施方式中，此类肽具有是或包含Ile-Glu-Ile-Lys(IEIK)重复的氨基酸序列。
在一些实施方式中，根据本发明使用的肽通常可以是自组装的，且/或在某些条件下可以在水溶液中显示出β片层结构。
在一些实施方式中，根据本发明使用的肽具有如名为
Figure BDA0001148023440000091
的市售产品中的氨基酸序列，即具有氨基酸序列 Arg-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala(即RADA16,又称为 [RADA]4；SEQ ID NO:1)。在一些实施方式中，根据本发明使用的肽具有氨基酸序列： Lys-Leu-Asp-Leu-Lys-Leu-Asp-Leu-Lys-Leu-Asp-Leu(即KLDL12,又称为[KLDL]3,又称为KLD12；SEQ ID NO:2)。根据本发明使用的肽具有氨基酸序列： Ile-Glu-Ile-Lys-Ile-Glu-Ile-Lys-Ile-Glu-Ile-Lys-Ile(即IEIK13,又称为(IEIK)3I；SEQ ID NO:3)。
在一些实施方式中，与本申请可能相关的肽组合物是具有某些流变性质特征的那些。在一些实施方式中，相关的流变性质可以是或包括损耗模量、刚性、流变性恢复时间、储能模量、粘度、屈服应力等。在一些实施方式中，通过测定评估流变性质；在一些实施方式中，可以通过目测观察评估一种或多种流变性质。
在某些实施方式中，储能模量与刚性呈正相关；在通常情况下，本领域的普通技术人员应理解较高的储能模量与较高的刚性具有相关性。
在一些实施方式中，具有较高粘度的肽组合物的特征为在频率为1rad/sec和振荡应力为1Pa条件下储能模量的范围在约300至约5,000Pa内。
在一些实施方式中，根据本发明使用的肽组合物的肽浓度在约0.01％至约10％范围内。
在一些实施方式中，向其应用一种或多种本申请所述方法的肽组合物是商业规模量的。
在一些实施方式中，向其应用一种或多种本申请所述方法的肽组合物已经贮存了一段时间。在一些实施方式中，肽组合物已被贮存在加压容器中。
在一些实施方式中，将已向其应用一种或多种本申请所述方法的肽组合物贮存在例如储存容器中，随后进行包装。
对性能进行改善
本申请注意到与例如高粘度和/或刚性相关的困难复杂化了某些肽组合物(例如特别是某些自组装肽组合物和/或肽浓度较高的组合物)的制备和/或处理。本申请特别表明某些肽组合物不适于过滤，特别是通过除菌滤器过滤。
本申请还注意到过滤面临的挑战可能使得对此类肽组合物的灭菌变得复杂或者对其造成阻碍。本申请提供了使得某些肽组合物能够过滤和/或以其他方式灭菌的技术。
高压灭菌处理
高压灭菌处理是一种常规的灭菌方法，其包括在121℃下向材料施加高压饱和蒸汽。根据本领域的通常理解使用高热，如高压灭菌处理中所涉及的高热，能够导致肽降解。
本发明令人吃惊的证明了某些肽组合物对热处理是稳定的，特别是对高压灭菌处理。除了其他以外，本申请证明了此类肽组合物可以使用高压灭菌处理灭菌。在一些实施方式中，可以在约121℃下对此类组合物热处理约25分钟进行灭菌。
在一些实施方式中，可以进行热处理和/或高压灭菌处理的肽组合物是IEIK13组合物。在一些此类实施方式中，IEIK13组合物的浓度在约0.01％至约10％范围内。
在一些实施方式中，可以进行热处理和/或高压灭菌处理的肽组合物是KLD12组合物。在一些实施方式中，然而，不对KLD12组合物进行依据本发明的高压灭菌处理。
在一些实施方式中，不对RADA16组合物进行依据本发明的高压灭菌处理。
不希望受到任何特定理论的束缚，本申请提出了某些IEIK13组合物对热处理如高压灭菌处理是稳定的可能至少部分地是由于在组合物中缺乏天冬氨酸(Asp,D)，而RADA16和KLD12具有天冬氨酸。
在一些实施方式中，能够适于依据本发明进行热处理如高压灭菌处理的肽组合物的特征为当暴露于此类处理时对降解具有抗性和/或当进行此类处理时流变性质(例如粘度和/ 或刚性)具有稳定性。根据本发明，可以将目标肽组合物暴露于热处理如高压灭菌处理，并且例如在处理前后可以对该组合物的一个或多个性质(例如肽的降解和/或一个或多个流变性质)进行评估，以便可以确定是否适合通过高压灭菌处理对此类化合物进行灭菌(参见例如实施例2)。
流变性质的变化
本申请证明了可以通过将其暴露于改变一个或多个流变性质的处理(例如改变粘度和 /或刚性)使某些肽组合物适于过滤。
在某些特定的实施方式中，通过暴露于剪切力实现流变性质的改变。
不希望受到任何特定理论的束缚，本申请提出向本申请所述的肽组合物施加高剪切力能够破坏自组装结构。本申请还提出恢复时间可能为再形成此类结构所需的时间。
在一些实施方式中，向肽溶液施加的剪切力可以是至少约20Pa。在一些实施方式中，向肽溶液施加的剪切力可以是至少约30Pa。在一些实施方式中，向肽溶液施加的剪切力可以是至少约40Pa。在一些实施方式中，向肽溶液施加的剪切力可以是至少约50Pa。在一些实施方式中，向肽溶液施加的剪切力可以是至少约60Pa。在一些实施方式中，向肽溶液施加的剪切力可以是至少约60Pa。在一些实施方式中，向肽溶液施加的剪切力可以是至少约80Pa。在一些实施方式中，向肽溶液施加的剪切力可以是至少约90Pa。在一些实施方式中，向肽溶液施加的剪切力可以是至少约100Pa。在一些实施方式中，例如根据上文所述的RADA16 2.5％、IEIK13 1.5％和2.5％以及KLD12 2.5％的屈服应力，剪切应力的量可以是至少约30-100Pa。
在一些实施方式中，肽溶液的粘度可以随着施加剪切力显著下降。在一些实施方式中，肽溶液的粘度可以随着施加剪切力下降至少10％。在一些实施方式中，肽溶液的粘度可以随着施加剪切力下降至少30％。在一些实施方式中，肽溶液的粘度可以随着施加剪切力下降至少50％。在一些实施方式中，肽溶液的粘度可以随着施加剪切力下降至少70％。在一些实施方式中，肽溶液的粘度可以随着施加剪切力下降至少90％。
在一些实施方式中，流变性质的改变是暂时的。在一些实施方式中，肽组合物表征为具有流变性恢复特征。例如，在一些实施方式中，此类组合物表征为其一种或多种流变性质在范围约1min至约48小时的时间段内恢复。
在一些实施方式中，当一种或多种流变性质返回至其初始值至少20％的水平时，认为实现了流变性恢复。
在一些实施方式中，当施加剪切力后观察到的一种或多种流变性质的改变恢复至少 30％时，认为实现了流变性恢复。
在一些实施方式中，肽组合物可以在施加剪切力后恢复其储能模量。在一些实施方式中，肽溶液在1min内可以恢复其原始储能模量的约0.1至100％。在一些实施方式中，肽溶液在1min内可以恢复其原始储能模量的约0.1至10％。在一些实施方式中，肽溶液在20min内可以恢复其原始储能模量的约20至100％。在一些实施方式中，肽溶液在20min 内可以恢复其原始储能模量的约20至60％。
在一些实施方式中，肽溶液可以在过滤后随着时间的推移恢复其粘度。在一些实施方式中，肽溶液在1min内可以恢复其初始粘度的约0.1至30％。在一些实施方式中，肽溶液在1min内可以恢复其初始粘度的约0.1至100％。在一些实施方式中，肽溶液在20min 内可以恢复其初始粘度的约20至100％。在一些实施方式中，肽溶液在20min内可以恢复其初始粘度的约20至60％。
本申请特别地举例说明了在施加剪切力后(例如特别地在通过针后，例如具有特定结构的)对某些肽组合物的流变性质进行的适当调整(参见实施例4)。在这个实施例中的结果显示了从注射后1分钟开始储能模量的对数增加，如针对RADA16的图10、针对 KLD12的图11和针对IEIK13的图12所示。
除了其他以外，本申请提供了利用其可以向一个或多个某些肽组合物施加高剪切力的方法，以便将其一种或多种流变性质调整至适宜水平(例如降低粘度)，以使得该组合物变得适合过滤，并且在灭菌过滤的一些实施方式中，在向其施加选定的剪切力后的一段时间内对该组合物进行这种过滤，以使得进行过滤的同时仍保持经调整的流变性质(例如在这些性质显著恢复或完全恢复发生之前)。
总体来说，如本申请所描述的，可以通过向肽组合物应用(和/或使肽组合物通过)剪切稀化部件施加剪切力。在一些实施方式中，剪切稀化部件是或者包括针、膜和/或筛网。在一些实施方式中，例如，使用多个单独的剪切稀化部件，以使得能够实现高通量过滤。
在一些实施方式中，本发明提供了能够实现商业化规模的肽组合物过滤的装置和方法。
作为剪切稀化部件的针
在一些非限制性实施方式中，可以经由注射通过一个或多个针施加剪切力。因此，在一些实施方式中，可以将一个或多个针作为剪切稀化部件。
在一些实施方式中，针可以是至少约1mm长。在一些实施方式中，针可以是至少约2mm长。在一些实施方式中，针可以是至少约5mm长。在一些实施方式中，针可以是至少约10mm长。在一些实施方式中，针可以是至少约15mm长。在一些实施方式中，针可以是至少约20mm长。在一些实施方式中，针可以是至少约30mm长。在一些实施方式中，针可以是至少约40mm长。在一些实施方式中，针可以是至少约50mm长。
在一些实施方式中，针的规格可以在约20号至约34号范围内。在一些实施方式中，针的规格可以在约25号至约34号范围内。在一些实施方式中，针的规格可以在约27号至约34号范围内。
图5公开了根据一个或多个非限制性实施方式的灭菌装置的一个非限制性实施方式。如图所示，可以将肽组合物(例如自组装肽的粘性溶液)(左侧)转移至带有针的第一注射器中，注射至第二注射器中(右侧)，然后进行过滤。
作为剪切稀化部件的膜
在一些实施方式中，用于向本申请所述的肽组合物施加剪切力的剪切稀化部件可以是特征为具有微米级或纳米级孔的装置或实体。图13描述了根据本申请的一个或多个非限制性实施方式的灭菌装置的一个非限制性实施方式。如图所示，可以将肽溶液(例如自组装肽的粘性溶液)转移至分散注射器(或压力容器)中，递送至用于提供剪切力的具有孔的第一室中，然后在第二室中过滤。正如本领域技术人员所理解的，膜直径的尺寸可以根据肽溶液的量而改变。
在一些实施方式中，剪切稀化部件的孔径可以是约0.45μm至120μm。在一些实施方式中，剪切稀化部件的孔径可以是约1μm至100μm。在一些实施方式中，剪切稀化部件的孔径可以是约3μm至80μm。在一些实施方式中，剪切稀化部件的孔径可以是约4μm 至50μm。
作为剪切稀化部件的筛网
在一些实施方式中，剪切稀化部件可以具有微米级或纳米级孔。在一些实施方式中，孔可以形成图案或者在一些实施方式中可以在厚度约10μm至10mm的板上钻孔。图15 描述了根据本申请的一个或多个非限制性实施方式的灭菌装置的一个非限制性实施方式。可以将剪切稀化部件插入图13所示的第一过滤室中。
在一些实施方式中，在本申请所述的剪切稀化部件的实施方式中的孔可以具有的最大尺寸在约0.5μm至200μm范围内。在一些实施方式中，此类尺寸可以在约0.5μm至100 μm范围内。在一些实施方式中，此类尺寸可以在约0.5μm至80μm范围内。在一些实施方式中，此类尺寸可以在约0.5μm至50μm范围内。
在一些实施方式中，该实施方式的一个剪切稀化部件可以在孔之间具有范围从约5μm 至约10mm内的夹点。
在一些实施方式中，剪切稀化部件可以全部或部分由选自下组的材料制成：不锈钢、钨、钛、类似金属、硅、陶瓷或塑料材料及其组合。
应用
在一些实施方式中，将应用了本申请所述技术的肽组合物随后用于一个或多个涉及细胞生物、组织或生物体的应用中(例如以使得灭菌组合物具有特别效用)。
如本领域所公知的，已证实某些肽组合物(例如某些自组装的肽组合物)可用作细胞在体内和/或体外生长的基质，和/或作为空隙填充物、止血剂、液体流动的屏障、伤口愈合剂等。在一些实施方式中，此类组合物形成了具有一种或多种所需性质(例如孔和/或通道的尺寸、强度、可变形性、凝胶形成可逆性、透明度等)的肽水凝胶。
本领域技术人员在阅读了本申请之后将立即意识到此类肽组合物(包括凝胶组合物和特别是包括可逆的胶凝组合物)在多种应用其的背景下的用途。特别值得关注的是在体内的应用(例如外科应用或其他应用，特别是允许或获益于通过可施用或应用组合物的套管类装置(如针)递送的那些)。
实施例
实施例1：高粘性肽溶液的过滤
除了其他以外，本实施例描述了不同肽组合物(即特别是自组装肽的组合物)的流变性质，并显示了针对不同肽和/或针对相同肽的不同浓度显著的参数可变性，如粘度、储能模量(例如刚性)、损耗模量和屈服应力。本实施例还显示了这些溶液中的某些不适用过滤。特别地，本实施例显示了这些肽的高粘度溶液对过滤技术构成了挑战。确定了多种肽溶液的流变性质，特别是针对以下表1所示的浓度制备的RADA16、IEIK13和KLD12溶液。可以看出，总体来说，浓度越高的溶液显示出的最大粘度越高。而且，具有不同序列的肽在相同浓度的溶液中显示出不同的最大粘度。例如，2％KLD12、2.5％KLD12和1.5％ IEIK13溶液的最大粘度分别为2.5％RADA16的2、3.4和3.2倍。
表1选定浓度肽溶液的流变性质
Figure BDA0001148023440000151
Figure BDA0001148023440000161
*:在振荡应力1Pa的条件下
#:在已检测的应力范围内在粘度图中获得的最大粘度数据。
将表1中列出的每个肽溶液通过具有25mm醋酸纤维素膜的0.2μm Nalgene注射器过滤器过滤。1％和1.5％的KLD12溶液(可以看出，其特征为具有相对较低的浓度、粘度和 /或刚性)成功通过过滤器。而相反的是，2％and 2.5％的KLD12溶液和1.5％的IEIK13溶液(可以看出，其特征为具有相对较高的浓度、粘度和/或刚性)不能成功通过过滤器；反而过滤器破裂。
实施例2：肽溶液的高压灭菌处理
本实施例显示了一些肽组合物(即，特定地如本申请所述的自组装肽的组合物)对热处理具有令人吃惊的稳定性。特别地，本实施例显示了即使在121℃下进行25分钟高压灭菌处理某些肽组合物仍然保持稳定的摩尔质量。因此，本实施例确立了能够通过应用高热(例如高压灭菌)技术成功地对此类组合物进行灭菌。但是，该实施例同时表明某些肽组合物对此类处理不稳定。
图1-3显示了分别对RADA16、IEKI13和KLD12的某些组合物进行高压灭菌处理的结果。
在进行高压灭菌处理之前，测得RADA16的摩尔质量为1712，这与其计算得到的摩尔质量相匹配。但是，质谱分析表明在高压灭菌处理过程中RADA16发生了降解，从而表明这种技术不能用于对此类RADA16组合物灭菌。
在进行高压灭菌处理之前，测得IEIK13的摩尔质量为1622，这也与其计算得到的摩尔质量相匹配。质谱分析表明IEIK13在高压灭菌处理后未降解，从而表明这种技术能够有效地用于此类IEIK13组合物的灭菌。
在进行高压灭菌处理之前，测得KLD12的摩尔质量为1467，这与其计算得到的摩尔质量相匹配。KLD12在高压灭菌处理过程中部分降解。由于KLD12在高压灭菌处理过程中降解，因此确定高压灭菌处理不是对此类KLD12组合物进行灭菌的优选技术；对若干肽浓度的KLD12采用常规过滤方法进行灭菌。
在高压灭菌前后确定某些肽组合物的流变性质。数据如图4所示。可以看出，经高压灭菌的IEIK13令人吃惊的显示出与未进行高压灭菌的IEIK13几乎相同的流变强度，而RADA16显示出明显降低的流变强度。
可以将高压灭菌处理用于如本申请所述的IEIK13组合物的灭菌，但应避免用于RADA16组合物。
实施例3：应用剪切力的肽组合物的流变性质
本实施例表明应用剪切力可以降低某些肽溶液的粘度和/或刚性，还表明粘度和/或刚性的这种降低能够使这些组合物适于多种过程和/或技术(例如过滤)，如果不进行这种处理的话这些组合物不适于这些过程和/或技术。
剪切流测试
使用带有20mm板的流变仪(DHR-1,TA Instruments)对肽溶液进行剪切流测试。2.5％ RADA16溶液的结果如图9所示，1.5％IEIK13溶液的结果如图10所示。如图所示，2.5％ RADA16和IEIK13 1.5％溶液均显示出典型的剪切稀化性质。即随着剪切速率的增加其粘度显著降低。随着剪切速率的增加，剪切力立即增加，然后当粘度达到平稳状态时剪切力略有降低。2.5％RADA16溶液的屈服应力为约40Pa，1.5％IEIK13溶液的屈服应力为约60Pa。
粘度恢复
在应用高剪切应力后评估RADA16和IEIK13溶液的粘度恢复时间。使用DHR-1流变仪(TA Instruments)，在向样品应用1min 1000 1/sec的剪切速率后在0.005 1/sec剪切速率下进行流量测试，检测2.5％RADA16和1.5％IEIK13溶液的粘度变化。RADA16和 IEIK13溶液显示出典型的触变性行为，这表明其粘度缓慢恢复。不希望受到任何特定理论的束缚，我们提出这些溶液的流变性质恢复时间可能是基于肽分子重新组装成在溶液中的结构(例如纳米纤维)。2.5％RADA16和1.5％IEIK13溶液的完全重新组装时间为约12 至48小时。2.5％RADA16溶液的结果如图11所示，1.5％IEIK13溶液的结果如图12所示。
储能模量的恢复
表2中列出了将肽组合物注射通过30号针后在1min和20min恢复为原始储能模量的百分率。IEIK13(具体地，2.5％的IEIK13溶液)的恢复速率在肽溶液中是最快的，其显示出在20min内100％恢复为原始储能模量。在检测恢复情况的那些中KLD12是最慢的；其显示出在20min内仅恢复为原始储能模量的23％(2.5％的)。在一些非限制性实施方式中，其在通过针(例如注射)后，花费大约12至48小时完全恢复至原始模量。
表2注射通过30号针后在1min和20min恢复为原始储能模量的情况
Figure BDA0001148023440000181
在将其注射通过30号针后，对RADA16和IEIK13溶液进行流变性检测。结果显示从注射后1分钟开始储能模量呈现出对数增加。RADA16的结果见图6，KLD12的结果见图 7和IEIK13的结果见图8。
实施例4：作为剪切稀化部件的针
本实施例描述了使用针作为剪切稀化部件对肽组合物(具体地，如本申请所述的自组装肽)进行的过滤过程。特别地，本实施例显示了应用适当的剪切力(例如经由通过剪切稀化部件)能够改变组合物的流变性质(例如能够降低粘度和/或刚性等)，以使得其能够成功通过滤器，如灭菌滤器。
图5显示了根据本申请的灭菌装置的一个非限制性实施方式。如图所示，该装置包括第一注射器，其向组合物应用足以改变其流变性质的剪切力以使其成功通过第二注射器，第二注射器配有具有合适孔径的膜滤器以实现对组合物进行灭菌。具体地，所示装置包括具有30号针的第一注射器(0.3mm x 25mm，具有双侧通气的内灌洗针，Transcodent公司,德国)(中间)和带有膜滤器的第二注射器(右侧)。将粘性的2.5％KLD12溶液(左侧)转移至第一注射器，然后注射进入第二注射器(右侧)，之后再通过膜滤器过滤。使用这种方法，成功对2.5％KLD12溶液进行了过滤。
实施例5：高通量剪切稀化部件
本实施例描述了某些剪切稀化部件。操作原理类似上文所述的第一针。具体地，每个剪切稀化部件施加适宜的和足够的剪切力以调整被施予剪切力的肽组合物的一个或多个流变性质，以使得该组合物变得适于过滤，并且特别适于通过除菌滤器过滤。在一些实施方式中，可以将多个针或其等效物作为剪切稀化部件使用。
膜滤器
本实施例表明能够使用膜滤器(孔径>0.45μm)作为剪切稀化部件。可以将粘性的2.5％ KLD12或1.5％IEIK13溶液转移至分散注射器(或压力容器)，使用剪切稀化部件(例如，孔径范围从0.45μm至120μm)递送至第一室，然后在第二室中通过过滤膜(例如，孔径：0.2μm)过滤。
为考察剪切稀化部件的孔径对粘性肽溶液粘度改变的影响，使2.5％KLD12和1.5％ IEIK溶液通过选定的孔径，并评估其表观粘度变化情况。2.5％KLD溶液通过了孔径为41 μm、20μm和5μm的剪切稀化部件。该溶液的粘度降至足够低以使得将含有该溶液的容器翻转时其能够流下来。尽管通过孔径为120μm的剪切稀化部件后的2.5％KLD溶液的粘度略低于通过前的2.5％KLD组合物的粘度，但是其仍太粘而无法在容器翻转测试中流下来。当通过孔径5μm的膜时，1.5％IEIK13溶液的粘度显著降低。结果见图14。
使用1.0％RADA16溶液对剪切稀化部件使粘度降低的情况进行了研究(如图13所示)。在注射压力50psi的条件下，使显示出剪切稀化和触变性行为的1.0％RADA16溶液通过剪切稀化部件。该溶液显示出1.4～1.7mL/min的输出。在注射压力50psi的条件下(即事先未暴露于剪切稀化部件)，该溶液是不能通过滤器(孔径0.2μm)的。但是，水(典型的牛顿流体)显示输出流速是相对恒定的。结果见表3。
表3图13中所示系统对RADA16 1％溶液和水的过滤能力
Figure BDA0001148023440000191
Figure BDA0001148023440000201
*：剪切稀化部件和滤器的直径为25mm。
如上文所示，2.5％KLD12和1.5％IEK13溶液不能过滤通过具有25mm醋酸纤维素膜的0.2μm Nalgene注射式滤器。2.5％RADA16通常不适于通过0.2μm膜过滤。暴露于剪切稀化部件后，2.5％RADA16、1.5％IEIK13和2.5％KLD12溶液在注射压力为100psi条件下能够过滤，其分别显示出3.8、12.5和11.4mL/min的输出。这些溶液不使用剪切稀化部件不能过滤。可以成功使用图13 中所示的剪切稀化部件对不易过滤的粘性肽溶液进行灭菌和过滤。结果见表4。
表4图13所示过滤系统对2.5％RADA16、1.5％IEIK13、2.5％KLD12溶液的过滤能力
Figure BDA0001148023440000202
*：膜直径为25mm。
筛网
本实施例表明能够成功使用具有微米级和/或纳米级孔的筛网作为剪切稀化部件。可以将粘性的2.5％KLD12或1.5％IEIK13溶液转移至分散注射器(或室)，注射至包括具有微米级和/或纳米级孔的剪切稀化部件的第一室，然后通过第二室中的膜滤器(孔径：0.2μm) 过滤。可以使用高压室代替注射用注射器递送肽组合物。可以选择膜尺寸(例如直径)和 /或其他性质(例如孔径等)以适应待通过的肽组合物的量。
表5图13和图15所示带有微米级孔的筛网系统对于2.5％RADA16、1.5％IEIK13、2.5％ KLD12溶液的过滤能力
Figure BDA0001148023440000203
*：膜直径为25mm。
#：孔尺寸为直径50μm、孔夹点450μm和孔深500μm。
序列表
<110> 三维矩阵有限责任公司
<120> 肽组合物的灭菌和过滤
<130> 2004837-0044
<150> 61/950536
<151> 2014-03-10
<160> 3
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 1
Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala
1 5 10 15
<210> 2
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 2
Lys Leu Asp Leu Lys Leu Asp Leu Lys Leu Asp Leu
1 5 10
<210> 3
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 3
Ile Glu Ile Lys Ile Glu Ile Lys Ile Glu Ile Lys Ile
1 5 10

Claims (18)

1.一种用于灭菌液体肽组合物的方法，所述液体肽组合物具有SEQ ID NO:3: Ile-Glu-Ile-Lys-Ile-Glu-Ile-Lys-Ile-Glu-Ile-Lys-Ile所示的序列，所述方法包括对所述组合物进行高压和加热灭菌处理。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法不包括灭菌过滤。
3.根据权利要求1所述的方法，所述加热处理在121℃进行25 min。
4.一种用于灭菌液体肽组合物的方法，其中所述液体肽组合物具有SEQ ID NO:3:Ile-Glu-Ile-Lys-Ile-Glu-Ile-Lys-Ile-Glu-Ile-Lys-Ile所示的序列，所述液体肽组合物在频率为1 rad/sec和振荡应力为1 Pa的条件下具有范围在300至5,000 Pa内的初始储能模量，
所述方法包括步骤：
向所述液体肽组合物施加高剪切应力，以使得所述组合物的储能模量暂时降至所述初始储能模量0.01%至80%范围内的水平；和
当其粘度处于该降低的水平时将所述组合物过滤。
5.根据权利要求4所述的方法，其中向所述组合物施加高剪切应力的步骤利用至少一个剪切稀化部件。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述至少一个剪切稀化部件是或者包括至少一个针。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述至少一个针的长度至少为1 mm。
8.根据权利要求6所述的方法，其中所述至少一个针的规格在25号至35号的范围内。
9.根据权利要求5所述的方法，其中所述至少一个剪切稀化部件是或者包括至少一个具有微米或纳米级孔的筛网。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述微米或纳米级孔具有范围在0.5 μm至200 μm内的最大尺寸。
11.根据权利要求9所述的方法，其中孔之间的夹点为5 μm至10 mm。
12.根据权利要求9所述的方法，其中所述筛网至少部分地由选自下组的材料制成：不锈钢、钨、钛、硅、陶瓷、塑料及其组合。
13.根据权利要求9所述的方法，其中所述筛网的厚度为10 μm至10 mm。
14.根据权利要求5所述的方法，其中所述至少一个剪切稀化部件是或者包括至少一个具有微米或纳米级孔的膜。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述孔具有范围从0.45 μm至120 μm的尺寸。
16.根据权利要求4所述的方法，其中所述高剪切力的范围从30至200 Pa。
17.根据权利要求4所述的方法，其中所述液体肽组合物在过滤前加压。
18.根据权利要求4所述的方法，还包括在真空下贮存所述液体肽组合物。
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SE01 Entry into force of request for substantive examination
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GR01 Patent grant
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