CN106366092A - 一种从东革阿里中分离高纯度宽缨酮的工业制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种从东革阿里中分离高纯度宽缨酮的工业制备方法，包括以下步骤：（1）加酶浸泡：将东革阿里原料浸泡于水中，加酶酶解，得酶解东革阿里；（2）加热浸提：将酶解东革阿里加热浸提，得东革阿里浸提液；（3）离心脱脂：冷却后，离心去脂，得脱脂液；（4）超滤、纳滤：将脱脂液进行超滤，纳滤，得宽缨酮纳滤截留液；（5）树脂层析：将宽缨酮纳滤截留液上大孔树脂，梯度洗脱，收集目标段洗脱液，浓缩，得浓缩液；（6）醇相结晶、干燥：过滤，结晶，洗涤，干燥，得高纯度宽缨酮。按照本发明方法所得宽缨酮的纯度可高达98.8%，宽缨酮的最终收率＞90%；本发明方法工艺简单，成本低，可连续操作性强，适合工业化生产，绿色安全。
Description
技术领域
本发明涉及一种提取高纯度宽缨酮的方法，具体涉及一种适用于工业生产的从东革阿里中分离高纯度宽缨酮的制备方法。
背景技术
东革阿里被誉为马来西亚的国宝，是目前国际医药界所推崇的绿色天然药材，马来文“Tongkat Ali”意为“阿里的拐杖”，拐杖在马来文中与男性的生殖器是一个词，隐喻其具有辅助人们实现延寿和增加性能力的作用。东革阿里根的神奇功效源远流长，在东南亚的民间乡村作为传统药材和滋补品已有数百年历史，既可作单味药也可作药方中的重要配药，当地百姓深信其“可治百病”。东革阿里通过其独有的生物化学成分，促进人体分泌更多的荷尔蒙、雄性激素、黄体酮等，可调节人体内分泌，使人体自身阴阳平衡，增强血液循环和新陈代谢，增加肾动力，能延长人的肾生命力约50年，使人更健康、更长寿。研究发现，东革阿里能改善精子的质量，提高精子数量、大小和移动速度。另外，东革阿里对提高生殖力的效果也非常明显，在动物实验中，雄性后代比雌性后代提高了3倍。东革阿里的主要成分为宽缨酮（Eurycomanone）、抗氧化酶、生物碱、β-咔啉类物质、枯木苦味素等。目前，在保健品、药品中应用的均为比例提取物，未来为更好的提高效果，需要更高含量的宽缨酮。
CN103408564B公开了一种东革阿里植物中宽缨酮的提取纯化工艺，包括如下步骤：（1）东革阿里浸膏的制备；（2）浓缩液的脱脂；（3）脱脂液萃取出宽缨酮成分；（4）柱色谱分离；（5）洗脱液脱色；（6）浓缩，结晶；（7）纯化；（8）过滤，干燥，得宽缨酮产品。但是，其工艺路线复杂、工序多，且设备投资大、使用有机溶剂多、生产难度大，不易控制、生产成本高，不适合规模化生产。
CN105294790A公开了一种从甜叶菊中提取高纯度甜叶菊糖苷的方法，包括如下步骤：（1）加酶浸泡：将甜叶菊原料粉碎后浸泡于水中，加入纤维素酶制剂进行酶解，得甜叶菊酶解液；（2）加热浸提：将步骤（1）所得甜叶菊酶解液加热浸提，冷却至室温，离心，过滤，得甜叶菊加酶浸提液；（3）絮凝除杂：将步骤（2）所得甜叶菊加酶浸提液进行水浴加热，加入无机盐絮凝剂，搅拌，进行絮凝处理后，离心，过滤，得甜叶菊除杂液；（4）大孔吸附树脂脱色纯化：将步骤（3）所得甜叶菊除杂液过大孔吸附树脂柱进行脱色吸附，再用洗脱液洗脱，洗脱液进行纳滤，浓缩，得甜叶菊浓缩液；（5）硅胶层析柱分离：将步骤（4）所得甜叶菊浓缩液上硅胶层析柱，然后用乙醇和乙酸乙酯的混合溶剂进行洗脱，分别收集各馏分，浓缩，干燥，得多种高纯度的甜叶菊糖苷产品。但是，该方法不适用于宽缨酮的提取，其工艺路线在冷却、絮凝除杂环节会对宽缨酮造成较大的损耗，且脱脂效果不佳，影响后续大孔树脂吸附；分离纯化采用硅胶层析，相对宽缨酮来说其成本过高。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种产品收率、纯度高，工艺简单，能耗低，环保无污染，适合工业化生产的从东革阿里中分离高纯度宽缨酮的工业制备方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：一种从东革阿里中分离高纯度宽缨酮的工业制备方法，包括以下步骤：
（1）加酶浸泡：将东革阿里原料粉碎后，浸泡于水中，然后加入纤维素酶制剂进行酶解，得酶解东革阿里；
（2）加热浸提：将步骤（1）所得酶解东革阿里加热浸提，得东革阿里浸提液；
（3）离心脱脂：将步骤（2）所得东革阿里浸提液冷却后，离心去脂，得脱脂液；
（4）超滤、纳滤：将步骤（3）所得脱脂液进行超滤，纳滤，得宽缨酮纳滤截留液；
（5）树脂层析：将步骤（4）所得宽缨酮纳滤截留液上大孔树脂，然后用乙醇的水溶液进行梯度洗脱，收集目标段洗脱液，浓缩，得浓缩液；
（6）醇相结晶、干燥：在步骤（5）所得浓缩液中加入乙醇，过滤，结晶，洗涤，干燥，得高纯度宽缨酮。
优选地，步骤（1）中，所述东革阿里原料粉碎后的粒径为10～30目；所述东革阿里原料与水的料液质量比为1:2.5～3.5。发明人研究发现，当浸泡用水量为原料质量2.5～3.5倍时，酶解效果最佳。
优选地，步骤（1）中，所述纤维素酶制剂为诺维信的酸性纤维素酶A966，活力为8200CCU/g。
优选地，步骤（1）中，所述纤维素酶制剂添加的质量（g）为水体积（mL）的0.01～0.03w/v%。所述纤维素酶制剂的加入，有利于东革阿里原料细胞壁的破碎，从而有利于宽缨酮的溶出，但若添加量小于0.01 w/v%，导致酶解效果有所下降，而添加量高于0.03 w/v%又无明显效果提升，继续增加酶用量只会损耗酶制剂。
优选地，步骤（1）中，所述酶解的温度为40～50℃，酶解的时间为120～150min。所述酶解温度下，酶制剂酶解活性最佳；当酶解时间小于120min后，酶解效果不充分；当酶解时间大于150min后，酶解效率趋于平稳状态，收率几乎不增加，继续延长提取时间无意义。
优选地，步骤（2）中，所述浸提为连续逆流提取，浸提的温度为85～95℃，浸提的时间为90～120min。
优选地，步骤（2）中，浸提加入水的质量为东革阿里原料质量的8～12倍。发明人研究发现，若浸提用水量低于8倍，宽缨酮收率下降较快，而若用水量高于12倍以后，宽缨酮收率几乎无增加，再继续增加用水量无意义。
优选地，步骤（3）中，所述冷却后物料温度为5～10℃，在此温度下更有利于脱脂；所述离心为先以3000～3500r/min的速率进行卧螺离心，再以10000～15000r/min的速率进行管式离心。
优选地，步骤（4）中，所述超滤的截留分子量为3～5万道尔顿，超滤时，操作压力为1.0～1.5MPa，物料温度为15～30℃。
优选地，步骤（4）中，所述纳滤的截留分子量为3000～6000道尔顿，纳滤时，操作压力为1.5～2.0MPa，物料温度为15～30℃，纳滤至滤出液电导率≤300μs/cm为止。
优选地，步骤（5）中，所述大孔树脂的型号为HP20、ADS-5、LX-60等。
优选地，步骤（5）中，所述梯度洗脱为：先用乙醇/水的体积比为10/90～30/70的溶液洗脱2～3BV，再用乙醇/水的体积比为60/40～80/20的溶液洗脱2～3BV。第一次洗脱完后层析柱流出液无色且澄清透亮，洗脱液作废液处理，第二次洗脱液全部收集。
优选地，步骤（5）中，所述浓缩为真空浓缩，真空度为-0.1～-0.07MPa，温度为50～70℃，浓缩至浓缩液的质量为原料质量的1/1200～1/900。
优选地，步骤（6）中，以乙醇与浓缩液的体积质量比（mL/g）为0.15～0.55（更优选0.2～0.4）加入乙醇；所述结晶的温度为2～5℃，结晶的时间为20～28h，重复结晶≥1次。
优选地，步骤（6）中，所述洗涤是指，用2～5℃的冰水洗涤晶体≥2次，每次洗涤水用量为1～2倍晶体体积。
本发明方法适用于各类东革阿里所含宽缨酮的分离提取，尤其是适合于宽缨酮质量含量为0.02～0.05%的东革阿里所含宽缨酮的分离提取。
本发明方法的有益效果如下：
（1）按照本发明方法所提取的高纯度宽缨酮产品呈白色或米白色粉末状，经高效液相色谱法检测，所得宽缨酮的纯度可高达98.8%，杂质含量少，宽缨酮的最终收率＞90%；
（2）本发明方法采用加酶浸泡、加热浸提、膜富集相结合的方法，大大提高了宽缨酮浸出率，同时经过膜富集后的宽缨酮纳滤截留液方便后续层析纯化；
（3）本发明方法舍弃了传统溶剂脱脂、萃取初步分离法，以及制备色谱、硅胶层析等操作难度大、成本高的方法，创造性的采用低温冷却物料，然后通过离心脱脂、超滤和纳滤串联初步分离宽缨酮，再利用大孔层析和结晶法来纯化宽缨酮，其成本低，易操作，解决了传统的制备色谱或硅胶层析成本高、批处理量少、操作要求高等缺点；
（4）本发明方法在提取纯化过程中只使用到水和乙醇，工艺简单，成本低，可连续操作性强，适合工业化生产，食用乙醇在最终产品中的残留量控制在100 ppm以下，相对于现有技术所使用的对人体有害的有机溶剂，更加绿色安全、自然环保。
附图说明
图1是本发明实施例1所得宽缨酮产品的高效液相色谱图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明。
本发明实施例所使用的东革阿里（含宽缨酮0.031%）为进口原料，产地马来西亚；所使用的纤维素酶制剂的型号为：诺维信的酸性纤维素酶A966，活力为8200CCU/g，购于吉宝（青岛）生物科技有限公司；所使用的纳滤膜为陶氏DOW NF90-400型纳滤膜，购于广州华膜水处理设备有限公司；所使用的乙醇为体积分数95%的食品级原料；本发明实施例所使用的化学试剂，如无特殊说明，均通过常规商业途径获得。
本发明实施例宽缨酮的检测方法如下：（1）仪器与试剂：1）宽缨酮标准品购自sigma公司；2）检测仪器：日本岛津高效液相色谱10A、赛多利斯十万分之一电子天平、KQ2200DB超声清洗器、25棕容量瓶；3）试剂：乙腈（色谱纯）、超纯水；（2）色谱条件：色谱柱：C18，4.6*250mm，流动相：A:乙腈，B:0.1%三氟乙酸，梯度洗脱比例依次为10/90，25/75，10/90，流速：1.0mL/min，洗脱方式：高压梯度洗脱，检测波长：240nm，进样量：10μL，出峰时间：9～10mins间。
实施例1
（1）加酶浸泡：将5kg东革阿里粉碎至10～30目后，浸泡于12.5L水中，然后加入1.25g纤维素酶制剂，在40℃下，酶解120min，得酶解东革阿里；
（2）加热浸提：在步骤（1）所得酶解东革阿里中加入40kg水，在85℃下，连续逆流浸提90min，得40.35kg东革阿里浸提液；
（3）离心脱脂：将40.35kg步骤（2）所得东革阿里浸提液冷却至9℃后，先以3000r/min的速率进行卧螺离心，再以10000r/min的速率进行管式离心，得39.50kg脱脂液；
（4）超滤、纳滤：将39.50kg步骤（3）所得脱脂液用截留分子量为5万Da的超滤膜，在操作压力1.5MPa，物料温度为30℃的条件下，进行超滤，超滤液再用截留分子量为6000Da的纳滤膜，在操作压力为2.0MPa，物料温度为30℃的条件下，纳滤至滤出液电导率为300μs/cm为止，得宽缨酮纳滤截留液950mL；
（5）树脂层析：将950mL步骤（4）所得宽缨酮纳滤截留液上50mL的HP20型大孔树脂，然后先用乙醇/纯水体积比为10:90的溶液洗脱2BV，洗脱完后层析柱流出液无色且澄清透亮，洗脱液作废液处理，然后再用乙醇/纯水体积比为80:20的溶液洗脱2BV，收集该段所有洗脱液，将该段洗脱液在真空度-0.08MPa，65℃下，真空浓缩，得4.60g浓缩液；
（6）醇相结晶、干燥：在步骤（5）所得4.60g浓缩液中加入1.0mL无水乙醇充分搅拌，严密过滤，然后置于2℃下，冷却结晶24h，得6mL晶体，然后将晶体用2℃的冰水洗涤2次，每次用水10mL，重复冷却结晶1次并洗涤，真空干燥，得1.50g宽缨酮产品。
所得宽缨酮产品呈白色粉末状，经高效液相色谱法检测（色谱图如图1所示），宽缨酮的出峰时间为9.35min，宽缨酮的纯度为98.1%，最终收率为94.93%。
实施例2
（1）加酶浸泡：将5kg东革阿里粉碎至10～30目后，浸泡于15L水中，然后加入3.0g纤维素酶制剂，在45℃下，酶解130min，得酶解东革阿里；
（2）加热浸提：在步骤（1）所得酶解东革阿里中加入50kg水，在90℃下，连续逆流浸提100min，得49.65kg东革阿里浸提液；
（3）离心脱脂：将49.65kg步骤（2）所得东革阿里浸提液冷却至7℃，先以3300r/min的速率进行卧螺离心，再以13000r/min的速率进行管式离心，得49.06kg脱脂液；
（4）超滤、纳滤：将49.06kg步骤（3）所得脱脂液用截留分子量为4万Da的超滤膜，在操作压力1.3MPa，物料温度为20℃的条件下，进行超滤，超滤液用截留分子量为4000Da的纳滤膜膜，在操作压力为1.7MPa，物料温度为20℃的条件下，纳滤至滤出液电导率为300μs/cm为止，得宽缨酮纳滤截留液920mL；
（5）树脂层析：将920mL步骤（4）所得宽缨酮纳滤截留液上50mL的 HP20型大孔树脂，然后先用乙醇/纯水体积比为20:80的溶液洗脱2.5BV，洗脱完后层析柱流出液无色且澄清透亮，洗脱液作废液处理，然后再用乙醇/纯水体积比为70:30的溶液洗脱2.5BV，收集该段所有洗脱液，将该段洗脱液在真空度-0.085MPa，60℃下，真空浓缩，得4.38g浓缩液；
（6）醇相结晶、干燥：在步骤（5）所得4.38g浓缩液中加入1.5mL无水乙醇充分搅拌，严密过滤，然后置于3℃下，冷却结晶28h，得6mL晶体，然后将晶体用3℃的冰水洗涤2次，每次用水10mL，重复冷却结晶1次并洗涤，真空干燥，得1.45g宽缨酮产品。
所得宽缨酮产品呈白色粉末状，经高效液相色谱法检测，宽缨酮的纯度为98.4%，最终收率为92.05%。
实施例3
（1）加酶浸泡：将5kg东革阿里粉碎至10～30目后，浸泡于17.5L水中，然后加入5.25g纤维素酶制剂，在50℃下，酶解150min，得酶解东革阿里；
（2）加热浸提：在步骤（1）所得酶解东革阿里中加入60kg水，在95℃下，连续逆流浸提120min，得60.05kg东革阿里浸提液；
（3）离心脱脂：将60.05kg步骤（2）所得东革阿里浸提液冷却至5℃，先以3500r/min的速率进行卧螺离心，再以15000r/min的速率进行管式离心，得59.20kg脱脂液；
（4）超滤、纳滤：将59.20kg步骤（3）所得脱脂液用截留分子量为3万Da的超滤膜，在操作压力1.0MPa，物料温度为15℃的条件下，进行超滤，超滤液用截留分子量为3000Da的纳滤膜，在操作压力为1.5MPa，物料温度为15℃的条件下，纳滤至滤出液电导率为300μs/cm为止，得宽缨酮纳滤截留液935mL；
（5）树脂层析：将935mL步骤（4）所得宽缨酮纳滤截留液上50mL的 HP20型大孔树脂，然后先用乙醇/纯水体积比为30:70的溶液洗脱3BV，洗脱完后层析柱流出液无色且澄清透亮，洗脱液作废液处理，然后再用乙醇/纯水体积比为60:40的溶液洗脱3BV，收集该段所有洗脱液，将该段洗脱液在真空度-0.1MPa，50℃下，真空浓缩，得5.10g浓缩液；
（6）醇相结晶、干燥：在步骤（5）所得5.10g浓缩液中加入2.0mL无水乙醇充分搅拌，严密过滤，然后置于5℃下，冷却结晶20h，得7mL晶体，然后将晶体用5℃的冰水洗涤2次，每次用水10mL，重复冷却结晶1次并洗涤，真空干燥，得1.42g宽缨酮产品。
所得宽缨酮产品呈白色粉末状，经高效液相色谱法检测，宽缨酮的纯度为98.8%，最终收率为90.51%。
Claims (10)
1.一种从东革阿里中分离高纯度宽缨酮的工业制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）加酶浸泡：将东革阿里原料粉碎后，浸泡于水中，然后加入纤维素酶制剂进行酶解，得酶解东革阿里；
（2）加热浸提：将步骤（1）所得酶解东革阿里加热浸提，得东革阿里浸提液；
（3）离心脱脂：将步骤（2）所得东革阿里浸提液冷却后，离心去脂，得脱脂液；
（4）超滤、纳滤：将步骤（3）所得脱脂液进行超滤，纳滤，得宽缨酮纳滤截留液；
（5）树脂层析：将步骤（4）所得宽缨酮纳滤截留液上大孔树脂，然后用乙醇的水溶液进行梯度洗脱，收集目标段洗脱液，浓缩，得浓缩液；
（6）醇相结晶、干燥：在步骤（5）所得浓缩液中加入乙醇，过滤，结晶，洗涤，干燥，得高纯度宽缨酮。
2.根据权利要求1所述从东革阿里中分离高纯度宽缨酮的工业制备方法，其特征在于：步骤（1）中，所述东革阿里原料粉碎后的粒径为10～30目；所述东革阿里原料与水的料液质量比为1:2.5～3.5。
3.根据权利要求1或2所述从东革阿里中分离高纯度宽缨酮的工业制备方法，其特征在于：步骤（1）中，所述纤维素酶制剂添加的质量为水体积的0.01～0.03w/v%；所述酶解的温度为40～50℃，酶解的时间为120～150min。
4.根据权利要求1～3之一所述从东革阿里中分离高纯度宽缨酮的工业制备方法，其特征在于：步骤（2）中，所述浸提为连续逆流提取，浸提的温度为85～95℃，浸提的时间为90～120min；浸提加入水的质量为东革阿里原料质量的8～12倍。
5.根据权利要求1～4之一所述从东革阿里中分离高纯度宽缨酮的工业制备方法，其特征在于：步骤（3）中，所述冷却后物料温度为5～10℃；所述离心为先以3000～3500r/min的速率进行卧螺离心，再以10000～15000r/min的速率进行管式离心。
6.根据权利要求1～5之一所述从东革阿里中分离高纯度宽缨酮的工业制备方法，其特征在于：步骤（4）中，所述超滤的截留分子量为3～5万道尔顿，超滤时，操作压力为1.0～1.5MPa，物料温度为15～30℃。
7.根据权利要求1～6之一所述从东革阿里中分离高纯度宽缨酮的工业制备方法，其特征在于：步骤（4）中，所述纳滤的截留分子量为3000～6000道尔顿，纳滤时，操作压力为1.5～2.0MPa，物料温度为15～30℃，纳滤至滤出液电导率≤300μs/cm为止。
8.根据权利要求1～7之一所述从东革阿里中分离高纯度宽缨酮的工业制备方法，其特征在于：步骤（5）中，所述梯度洗脱为：先用乙醇/水的体积比为10/90～30/70的溶液洗脱2～3BV，再用乙醇/水的体积比为60/40～80/20的溶液洗脱2～3BV。
9.根据权利要求1～8之一所述从东革阿里中分离高纯度宽缨酮的工业制备方法，其特征在于：步骤（5）中，所述浓缩为真空浓缩，真空度为-0.1～-0.07MPa，温度为50～70℃，浓缩至浓缩液的质量为原料质量的1/1200～1/900。
10.根据权利要求1～9之一所述从东革阿里中分离高纯度宽缨酮的工业制备方法，其特征在于：步骤（6）中，以乙醇与浓缩液的体积质量比为0.15～0.55加入乙醇；所述结晶的温度为2～5℃，结晶的时间为20～28h，重复结晶≥1次。
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