CN106167527A

CN106167527A - 一种融合蛋白

Info

Publication number: CN106167527A
Application number: CN201610408473.4A
Authority: CN
Inventors: 郝晓勇; 黄招琴
Original assignee: Changsha Haoyiya Medical Technology Co Ltd
Current assignee: Haimen Ruike Pharmaceutical Technology Co., Ltd
Priority date: 2016-06-13
Filing date: 2016-06-13
Publication date: 2016-11-30

Abstract

本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种融合蛋白；包括第一肽段区和第二肽段区，第一肽段区的C端与第二肽段区的N端相连；其中，第一肽段区包括分泌信号肽、以及磷脂酰丝氨酸结合蛋白肽段，第二肽段区包括连接肽段、以及跨膜肽段，磷脂酰丝氨酸结合蛋白肽段包括抗磷脂酰丝氨酸抗体或膜联蛋白中与磷脂酰丝氨酸特异结合的肽段；本发明的融合蛋白具有细胞膜蛋白特点和与脂质双层结构结合的能力，表达该蛋白的免疫杀伤细胞或干细胞将具有组织浸润或在疾病组织、损伤部位富集能力，可用于疾病组织的示踪、显影、化疗或光疗。

Description

一种融合蛋白

技术领域

本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种融合蛋白。

背景技术

磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)，是一类普遍存在的磷脂，通常位于真核细胞膜的内层，是细胞膜组分之一。在正常生理情况下，细胞质膜脂的分布存在不对称性，这是由于在细胞质膜中存在一种磷脂转位酶，可以特异地将磷脂酰丝氨酸(PS)与磷脂酰乙醇胺(PE)运送到膜的内小叶，同时，另外一种细胞质膜中的翻转酶负责将磷脂酰丝氨酸(PS)与磷脂酰胆碱(PC)运送至细胞质膜外小叶。这两种酶对膜同时起作用，但翻转酶的反应速度比转位酶慢10倍。这两个酶促反应各自独立进行，即当翻转酶的活性被抑制时，转位酶仍有活性。在正常生理情况下，这两种酶的作用相互协调，引起膜内主要磷脂的不对称分布，即鞘磷脂(SM)和磷脂酰胆碱(PC)集中分布在细胞质膜外小叶，而磷脂酰丝氨酸(PS)与磷脂酰乙醇胺(PE)集中分布于细胞质膜内小叶。这种膜脂的不对称性分布是细胞的一种自我保护机制，与细胞识别、内吞与外排、凝血及某些疾病如血栓、自身免疫病等的发展有密切关系。

研究发现，在细胞受到损伤或出现早期凋亡(Apoptosis，又称程序性细胞死亡)时，磷脂酰丝氨酸会出现外翻现象：即双层脂质膜上带负电荷的丝氨酸从原来朝向细胞浆变成朝向细胞膜外，其产生原理或机制尚不十分清楚。在细胞实验室，人们通常会用荧光标记的膜联蛋白A5(Annexin A5，原称Annexin V)以及碘化丙锭来检测、区分体外培养细胞中的正常、早期凋亡和死亡细胞。

Annexin-V，钙离子依赖性磷脂结合膜联蛋白家族(ANXA1-ANXA13)的成员之一，是分子量为35～36KD的Ca²⁺依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素(FITC、PE)或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶(propidine iodide，PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。

早期细胞凋亡在临床上与一系列疾病例如大脑与心肌缺血性损伤、神经变性、自身免疫性疾病和恶性实体肿瘤损伤等相关。然而上述方法难以在体内实现对磷脂酰丝氨酸外翻作用的示踪和药物靶向。

鉴于膜联蛋白A5与凋亡细胞膜上外翻的磷脂酰丝氨酸结合的特点，本发明以期将磷脂酰丝氨酸的单克隆抗体、膜联蛋白A5及其衍生重组蛋白与放射性同位素、药物、蛋白或发光剂偶联(融合)，用于疾病组织的示踪(Tracer)、显影(Imaging)、化疗或光疗。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种表达该蛋白的免疫杀伤细胞或干细胞具有组织浸润或在疾病组织、损伤部位富集能力，可用于疾病组织的示踪、显影、化疗或光疗的融合蛋白。

本发明第一方面提供一种融合蛋白，包括第一肽段区和第二肽段区，所述第一肽段区的C端与第二肽段区的N端相连；其中，所述第一肽段区包括分泌信号肽、以及磷脂酰丝氨酸结合蛋白肽段，所述第二肽段区包括连接肽段、以及跨膜肽段，所述磷脂酰丝氨酸结合蛋白肽段包括抗磷脂酰丝氨酸抗体或膜联蛋白中与磷脂酰丝氨酸特异结合的肽段。

具体的，所述连接肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示；通过15个特殊氨基酸的柔性肽链与跨膜成分相偶联，转变为可以在真核细胞膜上、医用病毒包膜上或其它脂质双层结构上锚定表达或存在的膜蛋白。

具体的，所述磷脂酰丝氨酸结合蛋白肽段包括膜联蛋白A5中与磷脂酰丝氨酸特异结合的肽段。

具体的，所述第一肽段区的氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示。

本发明中的融合蛋白，其细胞内胞浆区可以是无功能的寡肽、也可以在跨膜肽段的C端连接有一种或两种以上的具有细胞调节功能的信号转导肽段。

其中，信号转导肽段为兴奋性的或抑制性的，例如对免疫细胞有兴奋性刺激作用的CD3zeta分子的胞浆肽段以及具有共刺激作用的CD28分子的胞浆肽段；即，所述信号转导肽段包括CD3zeta分子的胞浆肽段和/或CD28分子的胞浆肽段。

具体的，所示融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：8或11所示。

本发明第二方面提供一种核酸分子，其包含能够编码前述的融合蛋白。

具体的，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO：7或10所示。

本发明第三方面涉及载体，其含有本发明第二方面任一项的核酸分子。

以下对本发明做进一步描述：

应当说明的是，本发明中的术语“载体”指的是，可将编码某蛋白的多聚核苷酸插入其中并使蛋白获得表达的一种核酸运载工具。载体可通过转化、转导或转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内表达得以表达。举例来说，载体包括：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。用作载体的动物病毒种类有逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可能含有多种控制表达的元件，包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。载体还有可能包括有协助其进入细胞的成分，如病毒颗粒、脂质体或蛋白外壳，但不仅仅只有这些物质。

本发明中可表达融合蛋白的载体，通过质粒转染、病毒载体或病毒颗粒感染、电转等方式，可以在任何真核细胞，例如免疫细胞(粒细胞、NK细胞、树突状细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、巨噬细胞或其他血液细胞)、干细胞(胚胎干细胞、胎盘干细胞、脐带干细胞、脐带血干细胞、骨髓干细胞、造血干细胞、间充质干细胞、成体干细胞、祖细胞、iPSC以及其他具有多能性的各种组织干细胞)各种宿主细胞内表达。

在本发明中，术语“多肽”指的是，是指α-氨基酸以肽键连接在一起而形成的化合物，也是蛋白质水解的中间产物。通常由10-100氨基酸分子脱水缩合而成的化合物叫多肽，它们的分子量低于10,000Da(Dalton，道尔顿)，能透过半透膜，不被三氯乙酸及硫酸铵所沉淀。也有文献把由2-10个氨基酸组成的肽称为寡肽(小分子肽)；10-50个氨基酸组成的肽称为多肽；由50个以上的氨基酸组成的肽就称为蛋白质；换言之，广义来讲，蛋白质有时也被称为多肽。术语“肽段”，指的是多肽或蛋白质分子中，具有某一特定功能的由多个氨基酸组成的肽。

在本发明中，术语“细胞凋亡”是指某种原因造成的“程序性细胞死亡”，区别于其他类型的细胞溶解性死亡。

在本发明中，术语“细胞归巢性”泛指不同细胞经血液循环趋向性迁移并定居于某种组织的特定区域的性质。例如淋巴细胞归巢性和干细胞归巢性。

在本发明中，术语“共刺激信号分子”(Co-stimulating molecule)是指免疫细胞表面的一些粘附分子，如CD28、CD134/OX40、CD137/4-1BB、CD40等，通过与其配体结合，激活免疫细胞的第二信号，增强免疫细胞的增殖能力及细胞因子的分泌功能，延长活化免疫细胞的存活时间。

在本发明中，术语“胞外区”和“胞外肽段”是指膜蛋白位于细胞外的肽链区段。

在本发明中，术语“跨膜区”和“跨膜肽段”是指膜蛋白位于细胞双层脂质膜内的肽链区段。

在本发明中，术语“胞浆区”和“胞浆肽段”是指膜蛋白位于细胞内的肽链区段。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：运用基因重组技术把磷脂酰丝氨酸结合蛋白，如抗磷脂酰丝氨酸抗体或膜联蛋白A5，转变成细胞膜上锚定的融合蛋白。通过把具有在疾病损伤部位富集能力的膜联蛋白A5变成各种功能性细胞的一部分，例如具有肿瘤杀伤作用的T淋巴细胞和具有再生性修复功能的间充质干细胞，从而使功能性细胞的归巢性改变成为可能；根据细胞类型和使用目的，重组表达的膜联蛋白A5可以与不同的细胞内调节信号融合，从而改变该细胞的部分功能。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。

附图说明

图1是本发明中融合蛋白构建示意图；

图2是本发明第一实施例中pEGFP-N1-776linker酶切结果图；

图3是本发明第一实施例中pIres2-clone 5-28Z-EGFP酶切结果图；

图4是本发明第一实施例中融合蛋白在真核细胞内表达结果图；

图5是本发明第一实施例中融合蛋白经抗体结合后的荧光图；

图6是本发明第二实施例中转染“pEGFP-N1-Clone 5-776linker”24小时后的HEK293细胞荧光图；

图7是本发明第一实施例中转染“pEGFP-N1-Clone 5-314linker”24小时后的HEK293细胞荧光图；

图8是本发明第二实施例中转染“pEGFP-N1-Clone 5-776linker”的HEK293流式细胞仪检测结果图；

图9是本发明第一实施例中转染“pEGFP-N1-Clone 5-314linker”的HEK293流式细胞仪检测结果图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1膜表达功能性膜联蛋白A5融合蛋白构建及表达

本实施例提供一种融合蛋白，其构建方式如图1B所示，包括第一肽段区和第二肽段区，第一肽段区包括分泌信号肽、以及磷脂酰丝氨酸结合蛋白肽段，第二肽段区包括连接肽段、跨膜肽段、以及具有细胞调节功能的信号转导肽段。具体实验步骤如下：

1、融合蛋白第二肽段区构建

选取商用真核表达质粒pEGFP-N1(SEQ ID NO：1)作为载体。基因合成编码融合蛋白第二肽段区的核苷酸序列(SEQ ID NO：2)，该序列自5’端依次包含Hind III位点、Kozak序列gccacc、翻译起始密码ATG、3xGGGGS肽链编码核酸序列(SEQ ID NO：12)、CD8a片段(P01732-1中382nt-630nt)、CD28片段(P10747-1中538nt-660nt)、CDzeta片段(P20963-1中154nt-491nt)、BamHI位点。其中，3xGGGGS肽链编码核酸序列编码连接肽段，CD8a片段编码跨膜肽段，CD28片段和CDzeta片段编码信号转导肽段。

将第二肽段区的双链cDNA用内切酶Hind III和BamHI处理后，接入双酶处理过的载体pEGFP-N1，得到产物“pEGFP-N1-776linker”；酶切结果如图2所示，图中A条带为未酶切质粒，B条带为HindIII和BamHI双酶切反应产物(插入基因776bp)，C条带为核酸分子大小标志物，结果表明载体正常，包含编码融合蛋白第二肽段区的核苷酸序列。

2、融合蛋白第一肽段区构建

基因合成编码融合蛋白第一肽段区的核苷酸序列(SEQ ID NO：3)，该序列自5’端依次包含NheI位点、CD8a分泌信号肽片段(P01732-1中1nt-63nt)、膜联蛋白A5(P08758中编码碱基4nt-960nt)、BglII位点，接入商用质粒pIres2-EGFP的衍生质粒pIres2-28Z-EGFP(SEQ ID NO：4)，得到质粒pIres2-clone5-28Z-EGFP，酶切结果如图3所示，条带a为核酸分子大小标志物，条带b为NheI和BglII双酶切反应产物(插入基因1020bp)，条带c为未酶切质粒，结果表明载体正常，包含编码融合蛋白第一肽段区的核苷酸序列。

3、融合蛋白载体构建

设计PCR克隆上游引物GAagatctgccaccATGGCCTTACCAGTGACCG(SEQ ID NO：5)和下游引物cgaagcttGTCATCTTCTCCACAGAG(SEQ ID NO：6)，经常规PCR扩增，用琼脂糖凝胶电泳后纯化PCR产物，经双酶切处理，接入“pEGFP-N1-776linker”；所得质粒经测序检验无误。所得融合质粒为“pEGFP-N1-Clone 5-776linker”，其表达的膜表达功能性膜联蛋白A5融合蛋白的核酸序列如SEQ ID NO：7所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。

4、融合蛋白表达

所得质粒“pEGFP-N1-Clone 5-776linker”经工程菌培养、放大和制备后，用于真核细胞的表达检测。将HEK293细胞接种于6孔板，等到70-80％饱和度时，用Lip2000转染上述质粒至293细胞，24小时后，用适量一抗兔抗酶联蛋白A5多抗(北京义翘神州生物技术公司)与细胞在37℃孵温30分钟，生理盐水清洗两次；再加二抗PE标记山羊抗兔IgG(H+L)，在37℃孵温15分钟，生理盐水清洗两次后，观察细胞荧光。在同一目镜框下，改变滤色镜片，部分细胞同时显示胞浆内的EGFP绿色荧光(图4)和细胞膜上抗体染色的PE红色荧光(图5)，表明功能性膜联蛋白A5融合蛋白在细胞内正确表达而且膜联蛋白A5锚定在细胞膜外。

实施例2膜表达非功能性膜联蛋白A5融合蛋白构建及表达

本实施例提供一种融合蛋白，其构建方式如图1A所示，包括第一肽段区和第二肽段区，第一肽段区包括分泌信号肽、以及磷脂酰丝氨酸结合蛋白肽段，第二肽段区包括连接肽段、以及跨膜肽段。具体实验步骤如下：

1、融合蛋白第二肽段区构建

基因合成编码融合蛋白第二肽段区的核苷酸序列(SEQ ID NO：9)，该序列自5’端依次包含Hind III位点、Kozak序列gccacc、翻译起始密码ATG、3xGGGGS肽链编码核酸序列、CD8a片段(P01732-1中382nt-629nt)、BamHI位点。

2、融合蛋白载体构建

与实施例一中的融合蛋白第二肽段区相比，CD28的共刺激信号肽和CD3zeta的信号肽编码序列已经除去，只包含CD8a的九个细胞内氨基酸；接入质粒“pEGFP-N1-776linker”。所得质粒“pEGFP-N1-Clone 5-314linker”经测序检验无误，其表达的膜表达非功能性膜联蛋白A5融合蛋白的核酸序列如SEQ ID NO：10所示，其氨基酸序列如SEQ IDNO：11所示。

3、融合蛋白表达

所得质粒“pEGFP-N1-Clone 5-314linker”和“pEGFP-N1-Clone 5-776linker”经工程菌培养、放大和制备后，用于真核细胞的表达检测。将HEK293细胞接种于6孔板，等到70-80％饱和度时，用Lip2000转染上述质粒至293细胞，24小时后，观察和记录膜联蛋白A5融合蛋白在细胞表达显示的绿色EGFP荧光，结果分别如图7和图6所示。

将六孔板内转染细胞经胰酶处理后收集，PBS清洗三次，用适量一抗兔抗酶联蛋白A5多抗(北京义翘神州生物技术公司)与细胞在37℃孵温15分钟，PBS清洗两次；再加二抗PE标记山羊抗兔IgG(H+L)，在37。℃孵温10分钟，PBS清洗两次后，用流式细胞仪检测EGFP和PE信号。EGFP信号显示，不论是膜表达功能性膜联蛋白A5融合蛋白(pEGFP-N1-Clone 5-776linker，图8)，还是膜表达非功能性膜联蛋白A5融合蛋白(pEGFP-N1-Clone 5-314linker，图9)，膜联蛋白A5融合蛋白均在细胞内正确表达，而PE信号表明在细胞膜外锚定的膜联蛋白A5三维构象没有改变，提示膜联蛋白A5的功能性正常。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种融合蛋白，其特征在于：包括第一肽段区和第二肽段区，所述第一肽段区的C端与第二肽段区的N端相连；其中，所述第一肽段区包括分泌信号肽、以及磷脂酰丝氨酸结合蛋白肽段，所述第二肽段区包括连接肽段、以及跨膜肽段，所述磷脂酰丝氨酸结合蛋白肽段包括抗磷脂酰丝氨酸抗体或膜联蛋白中与磷脂酰丝氨酸特异结合的肽段。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：所述连接肽段的氨基酸序列如SEQ IDNO：12所示。

3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：所述磷脂酰丝氨酸结合蛋白肽段包括膜联蛋白A5中与磷脂酰丝氨酸特异结合的肽段。

4.根据权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于：所述第一肽段区的氨基酸序列如SEQID NO：13所示。

5.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：所述跨膜肽段的C端还连接有具有细胞调节功能的信号转导肽段。

6.根据权利要求5所述的融合蛋白，其特征在于：所述信号转导肽段包括CD3zeta分子的胞浆肽段和/或CD28分子的胞浆肽段。

7.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：所示融合蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO：8或11所示。

8.一种核酸分子，其特征在于：其包含能够编码根据权利要求1至7任一项的融合蛋白。

9.根据权利要求1所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ IDNO：7或10所示。

10.一种载体，其特征在于：其含有根据权利要求8或9任一项的核酸分子。