CN106164253A - 从冷冻保存细胞中回收活细胞的方法和装置 - Google Patents

Abstract

本发明提供在融化并回收冷冻保存细胞时能以高效率回收活细胞的方法及用于该方法的装置。通过下述方法解决了上述课题，所述方法为从冷冻保存细胞中回收活细胞的方法，其包括将冷冻保存细胞融化的步骤、和用稀释液对融化后的细胞悬浮液进行稀释的步骤，所述方法的特征在于，以稀释时的最大渗透压负荷为250mOsm/秒以下的方式进行稀释。

Description

从冷冻保存细胞中回收活细胞的方法和装置

技术领域

本发明涉及在融化并回收冷冻保存细胞时能以高效率回收活细胞的方法及用于该方法的装置。

背景技术

近年来，为了修复损伤的组织等，进行了移植各种细胞的尝试。例如，为了修复因心绞痛、心肌梗塞等缺血性心脏病而导致损伤的心肌组织，尝试利用了胎儿心肌细胞、骨骼肌成肌细胞、ES细胞等。

作为如上所述的尝试的一环，开发出了利用支架(scaffold)形成的细胞结构物、使细胞形成为片状而得的片状细胞培养物(例如，参见专利文献1～3)。

关于片状细胞培养物在治疗中的应用，已开展了下述研究：针对由烧伤等导致的皮肤损伤的培养表皮片的利用、针对角膜损伤的角膜上皮片状细胞培养物的利用、针对食道癌内窥镜切除的口腔黏膜片状细胞培养物的利用等。

由此，随着基于再生医疗的新治疗方法的确立，对自体细胞进行冷冻并保存，并在形成人工组织、片状细胞培养物等的三维结构体时，或者在直接移植细胞时，将上述的冷冻保存细胞融化并回收自体细胞，然后使用其进行治疗的机会近年来逐渐增加。

对于细胞而言，通过在液氮内等进行冷冻，可以半永久性地保存，但是由于冷冻时产生的潜热、细胞内产生的冰晶等，细胞会受到损伤，在回收经冷冻保存的细胞时，不能全部作为活细胞被回收。通常，将冷冻保存细胞融化后，为了确保必要量的细胞，需要对融化后的细胞进行培养而使其增殖。但是，进行长时间培养需要劳力和时间，因此，为了削减所述的劳力和时间，期望回收尽可能多的活细胞。因此，通常进行下述尝试：对冷冻·融化方法进行研究以减少对细胞的物理性损伤，从而使活细胞数增多。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特表2007-528755号公报

专利文献2：日本特开2010-81829号公报

专利文献3：日本特开2010-226991号公报

发明内容

发明所要解决的课题

在片状细胞培养物的制造中，从排斥反应少等观点考虑，优选使用自体细胞，但在使用自体细胞制造片状细胞培养物时，由于细胞的增殖、分化需要时间，所以限制了制造工序的速度。因此，提供了一种通过以能够在不使细胞实质性增殖的情况下形成片状细胞培养物的密度接种细胞从而形成片状细胞培养物的方法(例如参见专利文献2等)。通过所述的方法，可以利用比以往更短的时间，制造具有比以往更高的物理强度的片状细胞培养物。

利用上述方法形成片状细胞培养物时，需要比通常更多的细胞，因此，多数情况下使用将从受体采集的细胞通过增殖培养等进行增殖、并预先进行了冷冻保存的细胞。另一方面，使用上述方法制备片状细胞培养物时，如果不接种必要且足够量的细胞，则不能形成片状细胞培养物，而变成增殖培养，或细胞发生分化。例如，将所述的片状细胞培养物用于移植手术的情况下，在马上要实施手术之前制备片状细胞培养物，但在不能确保必要且足够量的细胞时，片状细胞培养物的制备就为时已晚。因此，通常，为了回收大量的活细胞，在对冷冻保存细胞进行冷冻和/或融化时，设法尽可能不给细胞带来物理化学性损伤。

因此，本发明的目的在于提供：在融化并回收冷冻保存细胞时，通过较之现有技术进一步减少给冷冻保存细胞带来的物理化学性损伤，从而以高效率回收活细胞的方法；及用于该方法的装置。

用于解决课题的手段

在对细胞进行冷冻时，为了使细胞免受由冰晶导致的物理性损伤，通常采取的手段是添加冷冻保护剂(frost damage-protecting agent)。作为通常可用作冷冻保护剂的物质的例子，可以举出二甲基亚砜(DMSO)。但是，DMSO在37℃左右具有细胞毒性是已知的，在已将冷冻保存细胞融化的时候会发挥细胞毒性，因此，通常通过例如快速稀释等来尽可能减小其细胞毒性。

本申请的发明人在研究从冷冻细胞中高效率地回收活细胞的方法的过程中，发现了与以往的认识不同的现象：越是为了降低DMSO的细胞毒性而快速稀释融化后的细胞悬浮液，则能回收的活细胞数越低。在对该现象的进一步研究中发现，若快速稀释，则由于急剧的渗透压变化而对细胞造成很大的损伤，而通过在稀释时抑制渗透压负荷，可以降低上述对细胞的损伤从而提高细胞的存活率。进一步继续进行研究，结果完成了本发明。

即，本发明涉及以下内容。

[1]从冷冻保存细胞中回收活细胞的方法，所述方法包括将冷冻保存细胞融化的步骤、和用稀释液对融化后的细胞悬浮液进行稀释的步骤，所述方法的特征在于，以稀释时的最大渗透压负荷为250mOsm/秒以下的方式进行稀释。

[2]如[1]所述的方法，其特征在于，以稀释时的最大渗透压负荷为50mOsm/秒以下的方式添加稀释液。

[3]如[1]或[2]所述的方法，其特征在于，以稀释时的最大渗透压负荷为40mOsm/秒～50mOsm/秒的方式添加稀释液。

[4]如[1]～[3]中任一项所述的方法，其中，细胞为骨骼肌成肌细胞。

[5]如[1]～[4]中任一项所述的方法，其中，稀释液包含：对将融化后的细胞悬浮液转移至其他容器后的冷冻保存容器进行冲洗而得的冲洗液。

[6]冷冻保存细胞融化装置，其包含：

(i)动作部，所述动作部将稀释液注入；及

(ii)运算控制部，所述运算控制部确定并控制动作部的稀释液注入速度。

[7]如[6]所述的装置，其还包含：

(iii)测定部，所述测定部测定液体的渗透压。

[8]套件，所述套件包含用于不经增殖培养地制造片状细胞培养物的方法中的细胞、及培养基材，所述方法包括以能够在不使细胞实质性增殖的情况下形成片状细胞培养物的密度接种细胞的工序，所述套件中，细胞是利用[1]～[5]中任一项所述的方法回收的细胞。

发明的效果

本发明中，通过抑制渗透压负荷，从而减少以往未受到关注的因急剧的渗透压变化而致死的细胞数，由此使能回收的活细胞数增加。通过本发明，即使经过冷冻、融化步骤也能够在保持高存活能力的状态下回收细胞，特别地，即使在融化后不经过增殖培养而进行使用的情况下，也能够确保足够的活细胞数。

具体实施方式

本发明涉及从冷冻保存细胞中以高效率回收活细胞的方法及装置。

以下，基于本发明的优选实施方式对本发明进行说明。

(1)活细胞的回收方法

本发明在一个方面涉及从冷冻保存细胞中回收活细胞的方法，所述方法包括将冷冻保存细胞融化的步骤、和用稀释液对融化后的细胞悬浮液进行稀释的步骤，所述方法的特征在于，使稀释时的渗透压变化十分缓慢。

本发明中，所谓“冷冻保存细胞”，通常是指被冷冻保存的细胞本身，但有时也指被冷冻保存的细胞的1个冷冻保存单位。在该情况下，所谓冷冻保存单位，是指作为一个群体(例如1支试管等)而共同被冷冻保存的细胞群。因此，在该情况下，将“冷冻保存细胞”融化时，可得到经冷冻的“细胞悬浮液”。

本发明中，所谓“稀释时的渗透压负荷”，是指因添加了稀释液而发生变化的渗透压的每单位时间的变化率。渗透压负荷根据稀释液的添加速度(每单位时间的添加量)、稀释液与稀释对象的溶液(例如融化后的细胞悬浮液)的渗透压之差等因素而变化。所谓“最大渗透压负荷”，是指在从稀释开始到稀释结束的期间内，因稀释液的添加而发生变化的渗透压负荷中的最大的数值。

本发明的方法的特征在于，对将冷冻保存细胞融化而得到的细胞悬浮液进行稀释，并且使其稀释时的渗透压变化十分缓慢。通常，将冷冻保存细胞融化并回收活细胞时，出于降低融化后的细胞悬浮液中存在的细胞毒性成分的影响等目的，向融化后的细胞悬浮液中添加培养基等进行稀释。本申请的发明人发现，若在上述稀释的工序中急剧进行稀释，则由于因悬浮液渗透压的急剧变化而对细胞造成损伤，导致活细胞的存活率降低。

若稀释时的渗透压变化十分缓慢，则对细胞造成的损伤降低，活细胞的回收量增大。对于使渗透压变化缓慢的方法而言，可以使用本技术领域中已知的所有方法，例如减慢添加稀释液的速度，使用与细胞悬浮液的渗透压差小的稀释液等。优选例如不使用具有细胞毒性的稀释液等的不造成渗透压负荷以外的损伤的方法。

本发明中可使用的稀释液不受特别限定，但优选不对细胞造成物理化学性损伤的稀释液。作为稀释液的例子，可以举出例如DMEM培养基等液体培养基；Hanks平衡盐溶液、PBS等缓冲液；生理盐水等等渗溶液；蒸馏水等，但并不限定于此。另外，也可以进一步添加白蛋白等其他成分。

本说明书中，单位Osm作为渗透压的单位使用，1Osm是指与1mol/L的理想溶液具有的渗透压等效的渗透压。另外，虽然稀释时的渗透压负荷是以室温条件下每1秒的渗透压的变化(单位：Osm/秒)来表示的，但只要是可以体现渗透压变化的大小的单位，则可使用任何单位，并不限定于此，例如可以举出稀释液的添加速度、体积或重量的增加速度等。

对于渗透压负荷而言，可以实时地计量渗透压变化；也可以求出某2个时间点的渗透压，以这期间的每单位时间的平均变化的方式求出。在某段时间范围内以一定的速度添加稀释液的情况下，只要添加的是同一稀释液，则一般认为，在开始添加稀释液的时间点的渗透压负荷为该时间段范围内的渗透压负荷的最大值，随着稀释液的添加量增大，渗透压负荷逐渐减少。因此，在某种方式中，在以一定的速度添加同一稀释液的情况下，求出开始添加稀释液时的渗透压及其单位时间后(例如，在本发明的上述例中为1秒后)的渗透压，并将两个时间点的渗透压之差视为该稀释中的最大渗透压负荷。

以下，对于本实施方式的方法，按每个工序进行说明。

＜冷冻保存细胞的融化＞

本工序中，作为将冷冻保存细胞融化时的条件，可以使用本技术领域中已知的任何条件。一般地，若缓慢地融化，则容易因冰晶等而对细胞造成物理性损伤，因此，通常使用例如已设定为约37℃的水浴等，一举进行加热而使其融化。在本工序中，可以使用本技术领域中作为使活细胞的回收量提高的方法而已知的任意方法。

对于本方法中可以使用的细胞而言，只要是可冷冻保存的细胞，则没有特别限制，可以使用本技术领域中已知的所有细胞。优选地，胚胎干细胞、神经干细胞、造血干细胞、间充质干细胞等成体干细胞、成纤维细胞、骨骼肌成肌细胞、成骨细胞等母细胞等可用于再生医疗的细胞是优选的，其中优选可作为自体细胞进行采集、增殖的成体干细胞、母细胞等；从可用性、处理的简便程度等的观点考虑，最优选骨骼肌成肌细胞。关于细胞，从活细胞回收量的观点考虑，优选使用对数增殖期的细胞。

冷冻保存细胞的量可根据冷冻保存容器的容量而变化，但通常使用将细胞密度调整为1×10⁵～5×10⁷个/ml左右后分注至冷冻细胞用容器中的冷冻保存用细胞悬浮液。理想的情况下，经冷冻保存的全部细胞均可作为活细胞而被回收，因此，冷冻保存前的细胞悬浮液中的细胞数可以作为计算所回收的活细胞数时的总体参数。

作为冷冻保存液，可以使用已知可在本技术领域中用于细胞的冷冻保存的任意的冷冻保存液，许多制造商已在销售。另外，可以使用通常的细胞培养基，也可以使用向培养基中添加二甲基亚砜(DMSO)、甘油等冷冻保护剂(通常添加1～20％左右，优选添加5～10％左右)而得的细胞培养基。此外，可以也使用100％血清替代培养基。

冷冻细胞用容器可以使用本技术领域中通常使用的任意的冷冻细胞用容器，例如市售的冷冻管(Cryovials)、安瓿、冷冻保存袋等。

＜细胞悬浮液的稀释＞

如前文所述，由于通过融化得到的细胞悬浮液可能含有细胞毒性成分(例如DMSO等)，因而可以通过稀释来降低该细胞毒性成分的影响。本发明的方法具有下述特征：通过在该稀释时使渗透压变化十分缓慢，即通过使渗透压负荷充分小，从而增大融化细胞的存活率。

本发明的方法中，“十分缓慢的渗透压变化”的阈值可根据使用的细胞、融化的条件、温度等而变化。例如使用通常的冷冻保存液(例如含有10％左右的DMSO的DMEM培养基等)和通常的稀释液(例如市售的DMEM培养基等)时，在某种方式中，最大渗透压负荷为约250mOsm/秒以下，优选为约220mOsm/秒以下。最大渗透压负荷更优选为约100mOsm/秒以下，进一步优选为约50mOsm/秒以下。

此外，若稀释花费时间过长，则有时例如在细胞悬浮液中的细胞毒性成分的影响下，细胞因渗透压负荷以外的理由而被施予损伤，因此，从该观点考虑，优选快速稀释。本发明的方法中，最大渗透压负荷的下限值可以不特别设定，在使用通常的冷冻保存液(例如含有10％左右的DMSO的DMEM培养基等)和通常的稀释液(例如市售的DMEM培养基等)的情况下，最大渗透压负荷优选为约2mOsm/秒以上，更优选为约20mOsm/秒以上，进一步优选为约40mOsm/秒以上。

因此，在本发明的方法的一个优选方式中，最大渗透压负荷为2mOsm/秒～250mOsm/秒，更优选为2mOsm/秒～220mOsm/秒，进一步优选为20mOsm/秒～100mOsm/秒，从能回收的活细胞量的观点考虑，最优选为40mOsm/秒～50mOsm/秒。

本工序中，对于稀释而言，可以在将融化后的细胞悬浮液加入至冷冻保存容器中的状态下进行，也可以转移至其他容器中而进行。在转移至其他容器中而进行的情况下，为了提高融化细胞的存活率，用稀释液对将细胞悬浮液转移后的冷冻保存容器进行冲洗，并将该冲洗液添加至细胞悬浮液中。所述的冲洗液的添加也相当于本发明的稀释。因此，本发明的一个方式中，稀释液包含：对将融化后的细胞悬浮液转移至其他容器后的冷冻保存容器进行冲洗而得的冲洗液。

如前文所述，在本发明的方法中，最初向融化后的细胞悬浮液中添加的稀释液最容易影响最大渗透压负荷。因此，在本发明的一个方式中，最大渗透压负荷为从稀释开始至稀释为3倍为止的期间内的最大渗透压负荷；在另一个方式中，最大渗透压负荷为从稀释开始至稀释为2倍为止的期间内的最大渗透压负荷。

在本发明的一个优选方式中，稀释是一边计量渗透压并调节最大渗透压负荷一边进行的。渗透压的计量可以始终持续地进行，也可以例如每隔1秒、每隔10秒、每隔30秒、每隔1分钟等、以特定的时间间隔进行。渗透压的计量方法可以使用本技术领域中已知的所有方法，但并不限定于此，例如可以使用渗透压力计(Osmometer)等进行计量。

(2)冷冻保存细胞融化装置

本发明在一个方面涉及用于将冷冻保存细胞融化并以高效率回收活细胞的装置。本方式的装置具备：(i)动作部，所述动作部将稀释液注入；及(ii)运算控制部，所述运算控制部确定并控制动作部的稀释液注入速度。

对于注入稀释液的动作部而言，只要是可以注入液体的形状，则为任何形状均可，优选为可以通过滴加来添加液体的形状。动作部可以根据来自运算控制部的信号而调节稀释液的添加速度。

运算控制部确定从动作部注入的稀释液的注入速度，并对其进行控制。注入速度的确定可以使用预先输入的数值，也可以由该瞬间的细胞悬浮液的渗透压等算出。使用预先输入的数值时，并不限定于此，例如，可以举出输入最初的细胞悬浮液的液量和渗透压，并根据添加的稀释液的量、渗透压和温度等确定当前的渗透压或添加速度；预先设定稀释液添加速度的变化程序等。

由该瞬间的细胞悬浮液的渗透压算出稀释液的添加速度的情况下，本发明的装置可以进一步具备测定液体的渗透压的测定部。具备测定部的情况下，运算控制部可以基于从测定部输入的信息而确定添加速度。

本发明的装置是用于将冷冻保存细胞融化并回收活细胞的装置，除了具备上述动作部、运算控制部和测定部以外，还可以进一步具备用于将冷冻保存细胞融化的任意的设备。用于将冷冻保存细胞融化并回收活细胞的设备在本技术领域中已众所周知，只要是本领域技术人员，则立即能够理解具备何种设备。作为所述的设备的例子，并不限定于此，例如可以举出：用于将冷冻保存细胞融化，或者用于将装置内保持为一定温度的温度调节部；用于从冷冻保存容器中转移更换细胞悬浮液的移液器(pipette)部；用于对细胞悬浮液进行离心分离的旋转部；计数活细胞数的细胞计数(cell count)部等。

(3)片状细胞培养物的制造方法和套件

如前文所述，由本发明的回收方法回收的细胞可特别合适地用于此后不经过增殖培养即进行使用的情况。因此，本发明在一个方面涉及使用由本发明的回收方法回收的细胞来制造片状细胞培养物的方法。

本发明中，“片状细胞培养物”是指细胞相互连接呈片状的培养物。细胞彼此可以直接(包括介由粘附分子等细胞要素的方式)相互连接、及/或介由中间物而相互连接。作为中间物，只要是至少能够将细胞彼此物理性(机械性)地连接的物质，则不受特别限制，例如，可以举出胞外基质等。中间物优选为来自细胞的物质，特别优选为来自构成细胞培养物的细胞的物质。细胞至少被物理性(机械性)地连接，也可以进一步被功能性地连接，例如化学性连接、电连接。片状细胞培养物可以是由1个细胞层构成的细胞培养物(单层)，也可以是由2个以上的细胞层构成的细胞培养物(叠层(多层)，例如，2层、3层、4层、5层、6层等)。

片状细胞培养物优选不包含支架(支撑体)。在本技术领域中，支架有时被用于使细胞附着在其表面上及/或其内部从而维持片状细胞培养物的物理一体性，例如，已知有聚偏氟乙烯(PVDF)制的膜等，但本发明中的片状细胞培养物即使在没有该支架时也能够维持其物理一体性。另外，片状细胞培养物优选仅包含来自构成细胞培养物的细胞的物质，不包含其他物质。

本发明的制造方法包括：通过本发明的回收方法将经冷冻保存的细胞融化并进行回收的步骤、和接种回收的细胞并形成片状细胞培养物的步骤。

对于本发明的制造方法而言，在将经冷冻保存的细胞融化并进行回收的步骤之后，且在形成片状细胞培养物的步骤之前，可以包括清洗细胞的步骤。细胞的清洗可以利用已知的任意方法进行，典型地，例如可通过将细胞悬浮于清洗液(例如，含有或不含血清、血清成分(血清白蛋白等)的培养液(例如，培养基等)或生理缓冲液(例如，PBS、HBSS等)等)中、进行离心分离、弃置上清液并回收沉淀的细胞而实现，但并不限于此。在清洗细胞的步骤中，上述悬浮、离心分离、回收的循环可以实施1次或多次(例如，2、3、4、5次等)。在本发明的一个方式中，清洗细胞的步骤在将冷冻的细胞融化的步骤之后立即进行。

本发明的制造方法中的形成片状细胞培养物的步骤可以利用已知的任意方法进行。作为所述方法，可不受限制地举出例如专利文献1～3等中记载的方法。形成片状细胞培养物的步骤可以在培养基材上进行。另外，形成片状细胞培养物的步骤可以包括将细胞接种至培养基材上的步骤、及使接种的细胞片化的步骤。在一个方式中,本发明的制造方法在将细胞融化并进行回收的步骤和形成片状细胞培养物的步骤之间不包括使细胞增殖的步骤。

对于培养基材而言，只要细胞能在其上形成细胞培养物，则不受特别限制，例如，包括各种材质的容器、容器中的固态或半固态的表面等。容器优选为不使培养液等液体透过的结构·材料。作为所述材料，不受限制，例如可以举出聚乙烯、聚丙烯、Teflon(注册商标)、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚甲基丙烯酸甲酯、尼龙6,6、聚乙烯醇、纤维素、硅、聚苯乙烯、玻璃、聚丙烯酰胺、聚二甲基丙烯酰胺、金属(例如，铁、不锈钢、铝、铜、黄铜)等。另外，容器优选具有至少1个平坦的面。作为所述容器的例子，不受限制，例如可以举出细胞培养皿、细胞培养瓶等。另外，容器可以在其内部具有固态或半固态的表面。作为固态的表面，可以举出如上所述的各种材料的板、容器等，作为半固态的表面，可以举出凝胶、软质的聚合物基质等。培养基材可以使用上述材料来制作，也可以利用市售的培养基材。作为优选的培养基材，不受限制，例如可以举出适于片状细胞培养物的形成的、具有粘附性表面的基材。具体而言，可以举出具有亲水性表面的基材，例如，在所述表面上被覆有经电晕放电处理的聚苯乙烯、胶原凝胶(collagen gel)、亲水性聚合物等亲水性化合物的基材；另外，还可以举出表面被覆有胶原、纤连蛋白、层粘连蛋白(laminin)、玻连蛋白(tronectin)、蛋白多糖(proteoglycan)、糖胺多糖(glycosaminoglycan)等胞外基质、钙黏着蛋白家族(cadherinfamily)、选择素家族(seletin family)、整合素家族(integrin family)等细胞粘附因子等的基材等。另外，上述基材已有市售(例如，Corning^(R)TC处理培养皿(TC-TreatedCulture Dish)、Corning等)。

作为培养基材，为了赋予所期望的性质·特性等，可以使用表面被覆有各种材料的培养基材。作为被覆材料，例如，已知有聚合物、血清、生长因子、甾体药物等各种材料，本领域技术人员可以根据想要赋予培养基材的性质·特性进行适当选择。例如，为了赋予基材表面的亲水性、疏水性随着温度而变化的性质，可以利用含有(甲基)丙烯酰胺化合物、N-烷基取代(甲基)丙烯酰胺衍生物(例如，N-乙基丙烯酰胺、N-正丙基丙烯酰胺、N-正丙基甲基丙烯酰胺、N-异丙基丙烯酰胺、N-异丙基甲基丙烯酰胺、N-环丙基丙烯酰胺、N-环丙基甲基丙烯酰胺、N-乙氧基乙基丙烯酰胺、N-乙氧基乙基甲基丙烯酰胺、N-四氢糠基丙烯酰胺、N-四氢糠基甲基丙烯酰胺等)、N,N-二烷基取代(甲基)丙烯酰胺衍生物(例如，N,N-二甲基(甲基)丙烯酰胺、N,N-甲基乙基丙烯酰胺、N,N-二乙基丙烯酰胺等)、具有环状基团的(甲基)丙烯酰胺衍生物(例如，1-(1-氧代-2-丙烯基)-吡咯烷、1-(1-氧代-2-丙烯基)-哌啶、4-(1-氧代-2-丙烯基)-吗啉、1-(1-氧代-2-甲基-2-丙烯基)-吡咯烷、1-(1-氧代-2-甲基-2-丙烯基)-哌啶、4-(1-氧代-2-甲基-2-丙烯基)-吗啉等)、或乙烯基醚衍生物(例如，甲基乙烯基醚)的均聚物或共聚物的温度响应性材料等进行被覆。被覆有温度响应性材料的培养皿已有市售(例如，CellSeed Inc.的UpCell^(R))，可以将其用于本发明的制造方法中。

另外，为了形成更高密度的片状细胞培养物，培养基材可以被覆有血清。所谓“被覆有血清”，是指在培养基材的表面附着有血清成分的状态，所述状态不受限制，例如，可以通过用血清对培养基材进行处理而获得。利用血清的处理包括使血清与培养基材接触、及根据需要孵育规定的时间。用于被覆的血清可以是与接种细胞的来源种为相同种的血清(同种血清)，也可以是不同种的血清(异种血清)，但优选为同种血清，更优选为从接种细胞的来源个体得到的血清(自体血清)。

细胞向培养基材上的接种可以以已知的任意方法及条件进行。关于细胞向培养基材上的接种，例如可以通过将细胞悬浮于培养液而得的细胞悬浮液注入至培养基材(培养容器)中而进行。关于细胞悬浮液的注入，可以使用滴管(spuit)、移液器等适合于细胞悬浮液的注入操作的器具。

在本发明的优选方式中，以能够在不使细胞实质性增殖的情况下形成片状细胞培养物的密度进行接种。“能够在不使细胞实质性增殖的情况下形成片状细胞培养物的密度”是指，在用实质上不含生长因子的非增殖系培养液进行培养时，可以形成片状细胞培养物的细胞密度。例如，为骨骼肌成肌细胞时，在使用含有生长因子的培养液的方法中，为了形成片状细胞培养物，将细胞以约6,500个/cm²的密度接种至培养基材(例如，参见专利文献1)，但即便将上述密度的细胞用不含生长因子的培养液进行培养，也不会形成片状的细胞培养物。因此，本方式中的接种密度高于使用含有生长因子的培养液的方法中的密度。关于所述密度，具体而言，例如，对于骨骼肌成肌细胞而言，典型的密度为约1.0×10⁵个/cm²以上。关于接种密度的上限，只要不损害片状细胞培养物的形成、且细胞不进入分化状态，则不受特别限制，对于骨骼肌成肌细胞而言，接种密度小于约3.4×10⁶个/cm²。

使接种的细胞片化的步骤也可以以已知的任意方法及条件进行，但并不限定于此，例如可以使用专利文献1～3中记载的方法等。认为细胞的片化可以通过细胞彼此介由粘附分子、胞外基质等细胞间粘附机构相互粘附而实现。因此，使接种的细胞片化的步骤可以通过例如在形成细胞间粘附的条件下对细胞进行培养来实现。

对于用于本发明的制造方法中的培养液而言，只要可以维持细胞的生存则不受特别限制，典型地，可以利用以氨基酸、维生素类、电解质为主成分的培养液。在本发明的一个方式中，培养液为以细胞培养用的基础培养基为基底的培养液。所述基础培养基不受限制，例如，包括DMEM、MEM、F12、DMEM/F12、DME、RPMI1640、MCDB(MCDB102、104、107、120、131、153、199等)、L15、SkBM、RITC80-7等。这些基础培养基大多已有市售，其组成也是已知的。但是，用于本发明的制造方法中时，也可以根据细胞种类、细胞条件适当变更其组成。

在本发明的制造方法的一个方式中，在将细胞解冻的步骤之后，在不使细胞实质性增殖的情况下形成片状细胞培养物。通过该步骤，可以进一步提高片状细胞培养物的活性。

“不使细胞实质性增殖”是指，不使细胞以超出计量误差的范围的程度增殖，关于细胞是否增殖，例如，可以通过将接种时的细胞数和片状细胞培养物形成后的细胞数进行比较来评价。本发明中，对于片状细胞培养物形成后的细胞数而言，典型地为接种时的细胞数的约300％以下，优选为约200％以下，更优选为约150％以下，进一步优选为约125％以下，特别优选为约100％以下。

细胞的增殖受到各种条件、例如接种细胞数(接种细胞密度)、培养环境(例如，培养时间、培养温度等)、培养基的组成等的影响，因此，通过调节这些条件，可以不使细胞实质性增殖。这些条件中，通过提高接种细胞密度，可以在抑制细胞的增殖的同时用较短时间获得片状细胞培养物，因此，本发明中优选通过接种细胞密度来控制增殖。关于能够在细胞不实质性增殖的情况下形成片状细胞培养物的密度，如上文所述。因此，在一个更优选的方式中，在将细胞解冻的步骤之后，在不经过进一步的细胞增殖步骤、不使细胞实质性增殖的条件下进行片化步骤。

本发明的其他方面涉及用于制造片状细胞培养物的套件，所述套件包含用于上述片状细胞培养物的制造(尤其是不经过增殖培养的片状细胞培养物的制造)中的一部分或全部的要素。

本发明的套件可以不受限制地包含例如形成片状细胞培养物的细胞(例如，冷冻保存细胞、由本发明的回收方法回收的细胞等)、培养液、培养皿、器具类(例如，移液器、滴管、镊子等)、与片状细胞培养物的制造方法相关的说明(例如，使用说明书；记录有与制造方法、本发明的冷冻保存细胞的回收方法相关的信息的介质，例如，软盘、CD、DVD、蓝光光盘、存储卡、USB存储器等)等。

以下给出本发明的具体方式，进一步详细说明本发明，但本发明并不限定于这些具体例。

实施例

例1.稀释液的添加速度与细胞存活率的相关性

冷冻保存细胞的融化和活细胞的回收按如下方式进行。将冷冻保存有骨骼肌成肌细胞的冻存管(Cryo Tube)放入设定为37℃的水浴中3～4分钟，将冷冻保存细胞融化。将融化后的细胞悬浮液从1.8mL冻存管中转移至225mL锥形管(conical tube)中。此外，为了将残存于冻存管中的细胞也回收，用1mL的清洗液(向HBSS中添加白蛋白而得的清洗液)冲洗冻存管，并改变添加速度而将其添加至上述细胞悬浮液中。进而，与上述冲洗液同样地改变添加速度而向锥形管中添加30mL清洗液，于4℃、240×g条件下离心7分钟后弃置上清液。再次添加30mL清洗液，于4℃、240×g条件下离心7分钟后弃置上清液，添加5mL清洗液从而得到细胞悬浮液。

取出得到的细胞悬浮液的一部分，将其混合在锥虫蓝(Trypan blue)中后，实施细胞计数，由细胞计数结果算出融化后的存活细胞数，并按下式算出细胞存活率。细胞存活率(％)＝融化后的活细胞数/融化后的总细胞数×100

冲洗液的添加速度分别为1.2mL/分钟、4.0mL/分钟、15.0mL/分钟和360mL/分钟以上，清洗液的添加速度在滴加条件下为冲洗液的添加速度的4倍，在非滴加条件下为冲洗液的2倍。

最大渗透压负荷根据以下计算公式算出。需要说明的是，作为细胞悬浮液的初始渗透压值，使用1400mOsm；作为稀释液的渗透压值，使用300mOsm。

结果示于下表。需要说明的是，表中，稀释开始时的容量表示开始稀释时的细胞悬浮液的量。

[表1]

对于滴加1～4的4个模式而言，细胞存活率的平均值在任一情况下均超过90％，而与之相对，在未进行滴加的情况下则停留在87％左右。另外，即使是滴加而进行了稀释的情形，在减少细胞悬浮液的量的条件(滴加5)下，最大渗透压负荷也变为约610mOsm/秒，该情况下，细胞存活率的平均值为83％左右。此外，在进行了滴加的模式中，最大渗透压负荷为约44mOsm/秒的滴加3的情况下的细胞存活率最高。

Claims (8)

1.从冷冻保存细胞中回收活细胞的方法，所述方法包括将冷冻保存细胞融化的步骤、和用稀释液对融化后的细胞悬浮液进行稀释的步骤，所述方法的特征在于，以稀释时的最大渗透压负荷为250mOsm/秒以下的方式进行稀释。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，以稀释时的最大渗透压负荷为50mOsm/秒以下的方式添加稀释液。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，以稀释时的最大渗透压负荷为40mOsm/秒～50mOsm/秒的方式添加稀释液。

4.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，细胞为骨骼肌成肌细胞。

5.如权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，稀释液包含：对将融化后的细胞悬浮液转移至其他容器后的冷冻保存容器进行冲洗而得的冲洗液。

6.冷冻保存细胞融化装置，其包含：

(i)动作部，所述动作部将稀释液注入；及

(ii)运算控制部，所述运算控制部确定并控制动作部的稀释液注入速度。

7.如权利要求6所述的装置，其还包含：

(iii)测定部，所述测定部测定液体的渗透压。

8.套件，所述套件包含用于不经增殖培养地制造片状细胞培养物的方法中的细胞、及培养基材，所述方法包括以能够在不使细胞实质性增殖的情况下形成片状细胞培养物的密度接种细胞的工序，所述套件中，细胞是利用权利要求1～5中任一项所述的方法回收的细胞。