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WO2020067442A1 - 細胞の凍結保存方法 - Google Patents

細胞の凍結保存方法 Download PDF

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WO2020067442A1
WO2020067442A1 PCT/JP2019/038195 JP2019038195W WO2020067442A1 WO 2020067442 A1 WO2020067442 A1 WO 2020067442A1 JP 2019038195 W JP2019038195 W JP 2019038195W WO 2020067442 A1 WO2020067442 A1 WO 2020067442A1
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WO
WIPO (PCT)
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cells
culture
cell
culture substrate
present disclosure
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2019/038195
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English (en)
French (fr)
Inventor
賢二 大山
文哉 大橋
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Terumo Corp
Original Assignee
Terumo Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Priority to EP19867516.7A priority patent/EP3741842A4/en
Publication of WO2020067442A1 publication Critical patent/WO2020067442A1/ja
Priority to US17/004,642 priority patent/US20200390936A1/en
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    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
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    • A01N1/12—Chemical aspects of preservation
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    • A01N1/12—Chemical aspects of preservation
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    • A61L27/3895—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells using specific culture conditions, e.g. stimulating differentiation of stem cells, pulsatile flow conditions
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61L2430/20—Materials or treatment for tissue regeneration for reconstruction of the heart, e.g. heart valves
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0658—Skeletal muscle cells, e.g. myocytes, myotubes, myoblasts

Definitions

  • the present disclosure relates to a method for cryopreserving cells for transplantation, a method for culturing the cells for transplantation, a method for producing a graft containing the cells for transplantation, and a method for the method that can be suitably used in the treatment of various diseases, particularly heart diseases.
  • the present invention relates to a graft containing the sheet-shaped cell culture produced in 1., a composition and a medical product containing the graft, a method for treating a disease using the graft, and the like.
  • Non-Patent Document 1 fetal cardiomyocytes, skeletal myoblasts, mesenchymal stem cells, cardiac stem cells, ES cells, iPS cells, etc. for repairing myocardial tissue damaged by ischemic heart diseases such as angina pectoris and myocardial infarction.
  • Patent Document 1 a cell structure formed using a scaffold and a sheet-shaped cell culture in which cells are formed in a sheet shape have been developed (Patent Document 1, Non-Patent Document 2).
  • sheet-shaped cell culture to treatment use of cultured epidermis sheet for skin damage due to burns, use of corneal epithelial sheet-shaped cell culture for corneal injury, oral mucosal sheet for endoscopic resection of esophageal cancer
  • Studies on the use of cell cultures are underway, and some of them are in the stage of clinical application.
  • the sheet-shaped cell culture, etc. In order to clinically use such a sheet cell culture, it must be aseptically manufactured and transported. However, at present, in order to use the sheet-shaped cell culture, etc., the sheet-shaped cell culture, etc. is used in a large-scale facility such as a cell preparation facility (CPC) that is aseptically managed in the medical institution used. At present, it is difficult to use the sheet-shaped cell culture or the like easily in a medical institution or the like that does not have such a facility without producing it aseptically.
  • CPC cell preparation facility
  • the present disclosure relates to a cryopreservation method for transplant cells, a method for culturing the cells thawed after cryopreservation, and a sheet-like cell culture containing the transplant cells, which can be suitably used in the treatment of various diseases, particularly heart diseases. It is an object of the present invention to provide a method for producing an implant containing the same, a graft produced by the method, a composition and a medical product containing the implant, a method for treating a disease using the implant, and the like.
  • transplanted cells such as a sheet-shaped cell culture
  • a facility such as a CPC
  • the present inventors have been conducting research to enable the use of a sheet-shaped cell culture or the like without having a facility such as CPC, and have transferred from cryopreservation of cells for transplantation to culture and production of transplants. It was conceived that if it could be realized in a closed container that could be used, it would be possible to easily use a transplant such as a sheet-shaped cell culture, but in such a closed container, some operations such as cell washing were extremely difficult. Faced the challenge of becoming complicated.
  • the present invention relates to the following: [1] A method for cryopreserving cells, comprising freezing a cell suspension containing cells for transplantation on a culture substrate. [2] The method of [1], wherein the transplant cell is an adherent cell. [3] The method of [1] or [2], wherein the transplant cell is a myoblast or a cardiomyocyte. [4] The method of [1] to [3], wherein the culture substrate has a cell-adhesive culture surface. [5] The method of [1] to [4], wherein the culture substrate is coated with a temperature-responsive material. [6] The method of [1] to [3], wherein the culture substrate has a culture surface for spheroid formation.
  • a method for culturing cells for transplantation which comprises incubating a cell population with a medium containing a cryoprotectant. [13] The following steps; (A) thawing a cell population cryopreserved on a culture substrate to obtain a cell suspension containing a cryoprotectant; (B) adding a culture medium to the cell suspension obtained in (a) to dilute the cryoprotectant; (C) incubating the cell suspension obtained in (b) on the culture substrate; The method according to [12], comprising: [14] The method of [12] or [13], wherein the cell population contains adherent cells. [15] The method of [12] to [14], wherein the cell population contains myoblasts or cardiomyocytes.
  • the cells for transplantation are present in the cell suspension at a density of 7.5 ⁇ 10 5 cells / cm 2 to 3.0 ⁇ 10 6 cells / cm 2 with respect to the area of the culture substrate.
  • the method according to [23]. [25] The method of [21] to [24], wherein all the steps are performed in a closed vessel.
  • a storage container 1 enclosing a cell culture substrate and cryopreserved cells frozen on the cell culture substrate, and a storage container enclosing a cell culture medium that can be closedly connected to the storage container 1 2.
  • cells for transplantation contained in a sheet-shaped cell culture or the like can be easily stored and used. For this reason, it is possible to aseptically produce and transport the graft in a closed container without requiring complicated procedures and equipment for aseptically producing and transporting the graft. It is expected to contribute to the spread of medical treatments used. In addition, a large facility or the like is not required in the production of such an implant, so that it is possible to significantly reduce the cost.
  • FIG. 1 is a graph showing the results of thawing and recovering cryopreserved cells. No significant difference was observed in the cell recovery rate when the cells were suspended in 200 ⁇ L or more of a cryopreservation solution (at a density of 1.0 ⁇ 10 7 cells / mL or more). Viability did not differ significantly between suspensions of any density.
  • FIG. 2 is a photograph of a sheet-shaped cell culture prepared by collecting and seeding cryopreserved cells of each density. In each case, sheets could be formed without any problem.
  • transplant cell means a cell to be transplanted into a living body.
  • graft refers to a structure for transplantation into a living body, and particularly refers to a structure for transplantation containing the cell for transplantation as a component.
  • suspension state in which at least one state in which cells are adhered to each other in a transplant to form a certain shape as a whole, and each and every cell is present separately, is referred to as the present disclosure.
  • the implant is an implantable structure that does not include structures other than cells and cell-derived substances (eg, a scaffold).
  • Examples of the graft in the present disclosure include, but are not limited to, a sheet-shaped cell culture, a spheroid, a cell aggregate, a cell suspension, a cell suspension containing fibrin gel, and a cell using a nanofiber. Cultures and the like are preferable, and a sheet cell culture or a spheroid is preferable, and a sheet cell culture is more preferable.
  • the “sheet-shaped cell culture” refers to a cell in which cells are connected to each other to form a sheet.
  • spheroid refers to a cell in which cells are connected to each other to form a substantially spherical shape.
  • the cells may be connected to each other directly (including via a cellular element such as an adhesion molecule) and / or via an intermediary substance.
  • the intervening substance is not particularly limited as long as it is a substance capable of at least physically (mechanically) connecting cells, and examples thereof include an extracellular matrix.
  • the intervening substance is preferably derived from cells, particularly from cells constituting a sheet-shaped cell culture or spheroid.
  • the sheet-shaped cell culture may be composed of one cell layer (single layer) or composed of two or more cell layers (laminate (multilayer), for example, two or three layers, Four layers, five layers, six layers, etc.). Further, the sheet-shaped cell culture may have a three-dimensional structure having a thickness exceeding the thickness of one cell without the cells showing a clear layer structure. For example, in a vertical cross section of a sheet-shaped cell culture, a plurality of cells are arranged in a non-uniform (eg, mosaic) vertical direction without being uniformly arranged in a horizontal direction. Is also good.
  • a non-uniform eg, mosaic
  • the cells (transplantation cells) constituting a graft such as a sheet-shaped cell culture are not particularly limited as long as they can form a graft, and include, for example, adherent cells (adherent cells).
  • Adherent cells include, for example, adherent somatic cells (eg, cardiomyocytes, fibroblasts, epithelial cells, endothelial cells, hepatocytes, pancreatic cells, kidney cells, adrenal cells, periodontal ligament cells, gingival cells, periosteal cells, skin Cells, synovial cells, chondrocytes, etc.) and stem cells (eg, tissue stem cells such as myoblasts and cardiac stem cells, embryonic stem cells, pluripotent stem cells such as iPS (induced pluripotent stem) cells, mesenchymal stem cells, etc.) Including.
  • adherent somatic cells eg, cardiomyocytes, fibroblasts, epithelial cells, endothelial cells, hepat
  • the somatic cells may be stem cells, particularly those differentiated from iPS cells (iPS cell-derived adherent cells).
  • Non-limiting examples of cells constituting the graft include, for example, myoblasts (eg, skeletal myoblasts), mesenchymal stem cells (eg, bone marrow, adipose tissue, peripheral blood, skin, hair root, muscle tissue, Endometrium, placenta, cord blood, etc.), cardiomyocytes, fibroblasts, cardiac stem cells, embryonic stem cells, iPS cells, synovial cells, chondrocytes, epithelial cells (eg, oral mucosal epithelial cells, retinal pigment Epithelial cells, nasal mucosal epithelial cells, etc.), endothelial cells (eg, vascular endothelial cells, etc.), hepatocytes (eg, hepatic parenchymal cells, etc.), pancreatic cells (eg, pancreatic islet cells, etc.
  • Non-limiting examples of iPS cell-derived adherent cells include iPS cell-derived cardiomyocytes, fibroblasts, epithelial cells, endothelial cells, hepatocytes, pancreatic cells, renal cells, adrenal cells, periodontal ligament cells, gingival cells, periosteal cells , Skin cells, synovial cells, chondrocytes and the like.
  • myoblasts are precursor cells of striated muscle cells, and include skeletal myoblasts and myoblasts.
  • skeletal myoblasts means myoblasts present in skeletal muscle. Skeletal myoblasts are well known in the art, and can be prepared from skeletal muscle by any known method (eg, the method described in JP-A-2007-89442), or commercially available. It is also available (eg, Lonza, Cat # CC-2580).
  • Skeletal myoblasts include, but are not limited to, markers such as CD56, ⁇ 7 integrin, myosin heavy chain IIa, myosin heavy chain IIb, myosin heavy chain IId (IIx), MyoD, Myf5, Myf6, myogenin, desmin, PAX3, and the like. Can be identified by In certain embodiments, the skeletal myoblasts are CD56 positive. In a more particular embodiment, the skeletal myoblasts are CD56 positive and desmin positive.
  • Skeletal myoblasts include any organism having skeletal muscle, including, but not limited to, humans, non-human primates, rodents (such as mice, rats, hamsters, guinea pigs), rabbits, dogs, cats, pigs, It may be derived from mammals such as horses, cows, goats and sheep.
  • the skeletal myoblast is a mammalian skeletal myoblast.
  • the skeletal myoblast is a human skeletal myoblast.
  • cardioblast refers to myoblasts present in the heart muscle. Cardioblasts are well known in the art and can be identified by a marker such as Isll. Myocardial blasts are any organisms with myocardium, including, but not limited to, humans, non-human primates, rodents (mouse, rat, hamster, guinea pig, etc.), rabbits, dogs, cats, pigs, horses, It may be derived from mammals such as cows, goats and sheep. In one embodiment, the cardiac myoblast is a mammalian cardiac myoblast. In certain embodiments, the cardiac myoblast is a human cardiac myoblast.
  • cardiomyocyte means a cell having the characteristics of a cardiomyocyte, and the characteristics of the cardiomyocyte include, but are not limited to, for example, the expression of a cardiomyocyte marker, the presence of an autonomous beat, and the like .
  • Non-limiting examples of cardiomyocyte markers include, for example, c-TNT (cardiac troponin T), CD172a (alias SIRPA or SHPS-1), KDR (alias CD309, FLK1 or VEGFR2), PDGFRA, EMILIN2, VCAM and the like.
  • Preferred examples of the cardiomyocytes include cardiomyocytes derived from iPS cells.
  • the cells constituting the graft can be derived from any organism that can be treated with the graft. Such organisms include, without limitation, humans, non-human primates, dogs, cats, pigs, horses, goats, sheep, rodents (eg, mice, rats, hamsters, guinea pigs, etc.), rabbits, etc. Is included.
  • the number of types of cells constituting the graft is not particularly limited, and may be composed of only one type of cells, or may be a type using two or more types of cells. When there are two or more types of cells forming the graft, the content ratio (purity) of the most abundant cells is 50% or more, preferably 60% or more, more preferably 70% or more, at the end of the graft formation. It is preferably at least 75%.
  • the sheet-shaped cell culture of the present disclosure preferably does not include a scaffold (support). Scaffolds are sometimes used in the art to attach cells on and / or to their surfaces and maintain the physical integrity of sheet cell cultures, such as polyvinylidene difluoride (although PVDF) membranes and the like are known, the sheet-shaped cell culture of the present disclosure can maintain its physical integrity without such a scaffold. Further, the sheet-shaped cell culture of the present disclosure preferably includes only a substance derived from cells (such as an extracellular matrix) constituting the sheet-shaped cell culture, and does not include other substances.
  • a scaffold support
  • the cell may be a cell derived from a different species or a cell derived from the same species.
  • heterologous cell means a cell derived from an organism of a different species from the recipient when a sheet-shaped cell culture is used for transplantation.
  • cells derived from monkeys and pigs correspond to xenogeneic cells.
  • Allogeneic cell means a cell derived from an organism of the same species as the recipient.
  • human cells correspond to cells derived from the same species.
  • Allogeneic cells include autologous cells (also called autologous cells or autologous cells), that is, cells derived from the recipient and allogeneic non-autologous cells (also called allogeneic cells). Autologous cells are preferred in the present disclosure because rejection does not occur even when transplanted. However, it is also possible to use xenogeneic cells or allogeneic non-autologous cells. When xenogeneic cells or allogeneic non-autologous cells are used, immunosuppressive treatment may be necessary to suppress rejection.
  • cells other than autologous cells that is, non-autologous cells of the same species as cells of xenogeneic origin may be collectively referred to as non-autologous cells.
  • the cells are autologous cells or allogeneic cells.
  • the cell is an autologous cell (including an autologous cell derived from an autologous iPS cell and an autologous differentiation-inducing cell obtained by inducing differentiation of an autologous iPS cell).
  • the cells are allogeneic cells (including allogeneic cells derived from allogeneic iPS cells, and allogeneic differentiation-inducing cells obtained by inducing differentiation of allogeneic iPS cells).
  • a sheet-shaped cell culture can be produced by any known method (for example, refer to Patent Document 1, Patent Document 2, JP-A-2010-081829, JP-A-2011-110368, etc.).
  • a method for producing a sheet-shaped cell culture typically involves seeding cells on a culture substrate, forming the seeded cells into a sheet, and peeling the formed sheet-shaped cell culture from the culture substrate. Includes but is not limited to steps. Prior to the step of seeding the cells on the culture substrate, a step of freezing the cells and a step of thawing the cells may be performed. Further, a step of washing the cells may be performed after the step of thawing the cells. Each of these steps can be performed by any known technique suitable for producing a sheet-shaped cell culture.
  • the production method of the present disclosure may include a step of producing a sheet-shaped cell culture, in which case, the step of producing the sheet-shaped cell culture is a step according to the method of producing the sheet-shaped cell culture as a sub-step. Or one or more of the following. In one embodiment, the method does not include the step of growing the cells after thawing the cells and before seeding the cells on a culture substrate.
  • Spheroids can be produced by any known method (for example, see Japanese Patent No. 5523830).
  • the method for producing a spheroid typically includes seeding cells on a culture substrate having a concave portion, spheroidizing the seeded cells, and obtaining the formed spheroids from the culture substrate.
  • the present invention is not limited to this.
  • examples of the spheroid include a graft in which 1,000 cardiomyocytes derived from pluripotent stem cells are formed in a spherical shape having a diameter of 0.2 mm each.
  • the culture substrate is not particularly limited as long as cells can form a cell culture thereon, and includes, for example, containers of various materials and / or shapes, a solid or semi-solid surface in the container, and the like.
  • the container is preferably made of a structure / material that does not allow the passage of a liquid such as a culture solution. Examples of such a material include, but are not limited to, polyethylene, polypropylene, Teflon (registered trademark), polyethylene terephthalate, polymethyl methacrylate, nylon 6,6, polyvinyl alcohol, cellulose, silicon, polystyrene, glass, polyacrylamide, and polydimethyl.
  • Acrylamide, metal eg, iron, stainless steel, aluminum, copper, brass
  • metal eg, iron, stainless steel, aluminum, copper, brass
  • the container preferably has at least one flat surface.
  • a culture container having a bottom surface formed of a culture substrate capable of forming a cell culture and a liquid impermeable side surface.
  • culture vessels include, but are not limited to, cell culture dishes, cell culture bottles, and the like.
  • the bottom of the container may be transparent or opaque. If the bottom surface of the container is transparent, observation and counting of cells can be performed from the back side of the container.
  • the container may have a solid or semi-solid surface inside. Examples of the solid surface include plates and containers made of various materials as described above, and examples of the semi-solid surface include a gel and a soft polymer matrix.
  • the culture substrate may be prepared using the above materials, or a commercially available substrate may be used.
  • Preferred culture substrates include, but are not limited to, for example, a substrate having an adhesive surface suitable for forming a sheet-shaped cell culture, and a substrate having a low adhesive surface suitable for forming a spheroid. And / or a substrate having a uniform well-like structure.
  • a hydrophilic compound such as a collagen gel or a hydrophilic polymer
  • collagen And extracellular matrices such as fibronectin, laminin, vitronectin, proteoglycan, and glycosaminoglycan
  • substrates coated on the surface with cell adhesion factors such as cadherin family, selectin family, and integrin family.
  • such substrates are commercially available (e.g., Corning (R) TC-Treated Culture Dish, Corning , etc.).
  • temperature-responsive gel obtained by crosslinking soft agar, poly (N-isopropylacrylamide) (PIPAAm) with polyethylene glycol (PEG), polyhydroxyethyl methacrylate (A substrate coated with a non-cell-adhesive compound such as a hydrogel such as poly (HEMA) or 2-methacryloyloxyethylphosphorhoscholine (MPC) polymer and / or a substrate having a uniform uneven structure on the surface.
  • a non-cell-adhesive compound such as a hydrogel such as poly (HEMA) or 2-methacryloyloxyethylphosphorhoscholine (MPC) polymer and / or a substrate having a uniform uneven structure on the surface.
  • HEMA poly (HEMA) or 2-methacryloyloxyethylphosphorhoscholine
  • MPC 2-methacryloyloxyethylphosphorhoscholine
  • the culture substrate may be entirely or partially transparent or opaque.
  • the culture substrate may be coated on its surface with a material whose properties change in response to a stimulus, for example, temperature or light.
  • materials include, but are not limited to, for example, (meth) acrylamide compounds, N-alkyl-substituted (meth) acrylamide derivatives (eg, N-ethylacrylamide, Nn-propylacrylamide, Nn-propylmethacrylamide, N-isopropylacrylamide, N-isopropylmethacrylamide, N-cyclopropylacrylamide, N-cyclopropylmethacrylamide, N-ethoxyethylacrylamide, N-ethoxyethylmethacrylamide, N-tetrahydrofurfurylacrylamide, N-tetrahydrofurfuryl methacryl Amide), N, N-dialkyl-substituted (meth) acrylamide derivatives (eg, N, N-dimethyl (meth) acrylamide, N, N-e
  • a predetermined stimulus By applying a predetermined stimulus to these materials, their physical properties, for example, hydrophilicity or hydrophobicity, can be changed, and the detachment of the cell culture adhered on the materials can be promoted.
  • Culture dishes coated with a temperature-responsive materials are commercially available (e.g., UpCell of CellSeed Inc. (R)), they can be used in the production method of the present disclosure.
  • the culture substrate may be in various shapes.
  • the area is not particularly limited, but may be, for example, about 1 cm 2 to about 200 cm 2 , about 2 cm 2 to about 100 cm 2 , about 3 cm 2 to about 50 cm 2 , and the like.
  • a circular culture dish having a diameter of 10 cm is used as a culture substrate.
  • the area is 56.7 cm 2 .
  • the culture surface may be flat or may have an uneven structure. In the case of having an uneven structure, it is preferable to have a uniform uneven structure.
  • the culture substrate may be coated (coated or coated) with serum.
  • a culture substrate coated with serum By using a culture substrate coated with serum, a higher-density sheet-shaped cell culture can be formed.
  • “Coated with serum” means a state in which serum components are attached to the surface of the culture substrate. Such a state is not limited, and can be obtained, for example, by treating a culture substrate with serum.
  • the treatment with serum includes contacting the serum with a culture substrate and, if necessary, incubating for a predetermined period.
  • heterologous serum and / or allogeneic serum can be used.
  • Xenogeneic serum means serum derived from an organism of a different species from the recipient when a sheet-shaped cell culture is used for transplantation.
  • serum derived from cattle or horse such as fetal calf serum (FBS, FCS), calf serum (CS), horse serum (HS), etc.
  • FBS, FCS fetal calf serum
  • CS calf serum
  • HS horse serum
  • homologous serum means serum derived from an organism of the same species as the recipient.
  • human serum corresponds to allogeneic serum.
  • Allogeneic serum includes autologous serum (also called autologous serum), ie, serum from the recipient and allogeneic serum from an individual other than the recipient.
  • autologous serum also called autologous serum
  • sera other than autologous serum that is, heterologous serum and allogeneic serum may be collectively referred to as non-self serum.
  • Serum for coating the culture substrate is commercially available or can be prepared by a routine method from blood collected from a desired organism. Specifically, for example, a method of leaving the collected blood at room temperature for about 20 minutes to about 60 minutes to coagulate, centrifuging the blood at about 1000 ⁇ g to about 1200 ⁇ g, and collecting the supernatant And the like.
  • the serum When incubating on a culture substrate, the serum may be used as a stock solution or diluted. Dilution can be performed in any medium, such as, but not limited to, water, saline, various buffers (eg, PBS, HBSS, etc.), various liquid media (eg, DMEM, MEM, F12, DMEM / F12, DME, RPMI 1640, MCDB (MCDB 102, 104, 107, 120, 131, 153, 199, etc.), L15, SkBM, RITC 80-7, etc. can be used.
  • the dilution concentration is not particularly limited as long as the serum component can adhere to the culture substrate. For example, about 0.5% to about 100% (v / v), preferably about 1% to about 60% (v / V), more preferably from about 5% to about 40% (v / v).
  • the incubation time is not particularly limited as long as the serum component can adhere to the culture substrate. For example, about 1 hour to about 72 hours, preferably about 2 hours to about 48 hours, more preferably about 2 hours to about 48 hours. 24 hours, more preferably about 2 hours to about 12 hours.
  • the incubation temperature is not particularly limited as long as the serum component can adhere to the culture substrate, and is, for example, about 0 ° C. to about 60 ° C., preferably about 4 ° C. to about 45 ° C., and more preferably room temperature to about 40 ° C. It is.
  • the serum may be discarded after incubation.
  • a conventional liquid discarding method such as suction with a pipette or decantation can be used.
  • the culture substrate may be washed with a serum-free washing solution.
  • the serum-free washing solution is not particularly limited as long as it is a liquid medium that does not contain serum and does not adversely affect serum components attached to the culture substrate, and includes, for example, without limitation, water, saline, and various buffers.
  • Liquid eg, PBS, HBSS, etc.
  • various liquid culture media eg, DMEM, MEM, F12, DMEM / F12, DME, RPMI1640, MCDB (MCDB102, 104, 107, 120, 131, 153, 199, etc.), L15 , SkBM, RITC80-7, etc.
  • a washing method a conventional culture substrate washing method, for example, without limitation, a method of adding a serum-free washing solution onto a culture substrate, stirring for a predetermined time (for example, about 5 seconds to about 60 seconds), and then discarding Etc. can be used.
  • the culture substrate may be coated with a growth factor.
  • growth factor means any substance that promotes cell proliferation compared to the absence thereof, for example, epidermal growth factor (EGF), vascular endothelial growth factor (VEGF), fibroblast Cell growth factor (FGF) and the like.
  • the dilution concentration during the incubation is, for example, about 0.0001 ⁇ g / mL to about 1 ⁇ g / mL, preferably about 0.0005 ⁇ g / mL to about 0.5 ⁇ g / mL. It is basically the same as serum except that it is from 05 ⁇ g / mL, more preferably from about 0.001 ⁇ g / mL to about 0.01 ⁇ g / mL.
  • the culture substrate may be coated with a steroid agent.
  • the “steroid agent” refers to a compound having a steroid nucleus that can have an adverse effect on the living body such as adrenocortical dysfunction and Cushing's syndrome.
  • Such compounds include, but are not limited to, for example, cortisol, prednisolone, triamcinolone, dexamethasone, betamethasone, and the like.
  • the dilution concentration at the time of incubation is, for example, about 0.1 ⁇ g / mL to about 100 ⁇ g / mL, preferably about 0.4 ⁇ g / mL, as dexamethasone. It is basically the same as serum except that it is about 40 ⁇ g / mL, more preferably about 1 ⁇ g / mL to about 10 ⁇ g / mL.
  • the culture substrate may be coated with any one of serum, growth factor and steroid, or any combination thereof, ie, serum and growth factor, serum and steroid, serum and growth factor and steroid, Alternatively, it may be coated with a combination of a growth factor and a steroid. When coating with a plurality of components, these components may be mixed and coated simultaneously, or may be coated in separate steps.
  • cryopreservation method of the present disclosure relates to a method for cryopreserving cells for transplantation.
  • the cryopreservation method of the present disclosure is characterized by freezing a cell suspension containing cells for transplantation on a culture substrate.
  • a cryopreservation container such as a cryopreservation vial and cryopreserved by freezing it.
  • the cells for transplantation are cryopreserved by freezing the cell suspension directly on the culture substrate. Therefore, the cryopreserved cells produced by the cryopreservation method of the present disclosure, typically, cryopreserved cells frozen on a cell culture substrate are also encompassed by the presently disclosed invention.
  • the method of freezing the cell suspension may be any method known in the art, such as immersion in liquid nitrogen or cooling with a program freezer.
  • the time until the cell suspension is frozen is not particularly limited, but it is preferable that the cell damage is small and the state of the cell does not change.
  • cryopreserving adherent cells on a cell-adhesive culture substrate it is preferable to freeze the adherent cells before they start to adhere to the culture substrate.
  • the time from the start to the end of freezing is not limited to this, for example, within about 24 hours, within about 12 hours, within about 10 hours, within about 8 hours, within about 6 hours, within about 5 hours, It can be within about 4 hours, within about 3 hours, within about 2 hours, within about 1 hour, within about 30 minutes, and the like.
  • the cells cryopreserved by the method of the present disclosure are not particularly limited as long as they are cells to be used for transplantation, and any cells for transplantation can be used.
  • the cells for transplantation are as described in detail above.
  • the transplant cells are adherent cells, and in a more preferred embodiment, the transplant cells are myoblasts or cardiomyocytes.
  • any medium for suspending cells to be cryopreserved any medium may be used as long as it is used in the art for cryopreservation of cells, and is not limited thereto.
  • DMEM DMEM, MEM, F12, DME, RPMI 1640, MCDB (MCDB 102, 104, 107, 120, 131, 153, 199, etc.), L15, SkBM, RITC80-7, basal medium such as DMEM / F12, Hank's balanced salt solution (HBSS), Earl's balanced salt solution (EBSS) and a buffer such as a phosphate buffer (PBS).
  • basal medium such as DMEM / F12, Hank's balanced salt solution (HBSS), Earl's balanced salt solution (EBSS) and a buffer such as a phosphate buffer (PBS).
  • HBSS Hank's balanced salt solution
  • EBSS Earl's balanced salt solution
  • PBS phosphate buffer
  • the culture substrate used in the method of the present disclosure is not particularly limited as long as it is a culture substrate that can withstand freezing treatment and can suitably culture cells for transplantation.
  • the culture substrate if the transplant cell is an adherent cell, the culture substrate preferably has a cell-adhesive culture surface.
  • the culture substrate may vary depending on the use of the cells for transplantation.
  • the culture substrate for the purpose of producing a sheet-shaped cell culture from cells for transplantation, the culture substrate preferably has a culture surface coated with a cell-adhesive, preferably temperature-responsive material, and forms spheroids.
  • the culture substrate is preferably a culture surface having a culture surface for spheroid formation, for example, a culture surface having a low-adhesion surface and / or a uniform well-like structure.
  • a culture substrate having appropriate properties in view of the cryopreserved cells for transplantation and its use.
  • the cell suspension of the cells for transplantation may include a support or the like.
  • a support or the like may be any as long as it is advantageous for forming an implant.
  • the material of the support or the like is preferably a material that does not have an adverse effect when implanted in a living body, more preferably a biodegradable material, such as polylactic acid and fibrin gel. Therefore, examples of such a support include films and supports made of biodegradable polymers such as polylactic acid, polyglycolic acid, and polycaprolactone, and supports made of biological components such as fibrin gel.
  • the cell suspension cryopreserved on the culture substrate preferably contains a cryoprotectant to prevent frost damage.
  • cryoprotective agents that can be used in the cryopreservation method of the present disclosure include those commonly used in the art, as long as they do not contain manufacturing process impurities such as serum in view of preservation of cells for transplantation. Examples thereof include, but are not limited to, dimethyl sulfoxide (DMSO), polyhydric alcohols such as glycerol, saccharides such as trehalose, and polyamino acids such as polylysine.
  • the content of the cryoprotectant is not particularly limited as long as the cells can be protected from damage during freezing and does not adversely affect the cells, and is not limited thereto. For example, about 1 to 20%, about 5% -15%, about 7-12%, and the like.
  • the amount of the cell suspension to be cryopreserved is not particularly limited as long as it can be suitably frozen on the culture substrate. If the amount of the cell suspension is too large, the freezing takes a long time and frost damage is likely to occur. Therefore, an appropriate amount or more of the cell suspension is not preferable.
  • the amount of the cell suspension is preferably about 5 to 1000 ⁇ L / cm 2 , more preferably about 10 to 300 ⁇ L / cm 2 , based on the area of the culture substrate.
  • the amount of cells to be cryopreserved can vary depending on the size of the culture substrate, and can be determined in view of the purpose of culture after thawing.
  • the amount of cells in the cell suspension is, for example, about 7.5 ⁇ 10 5 cells / cm 2 to 3.0 ⁇ 10 6 cells based on the area of the culture substrate. / Cm 2 .
  • cryopreserved cells are thawed and then subjected to transplant formation culture.
  • graft formation culture means a culture for forming cultured cells as a transplant, and particularly when the transplant is a sheet-shaped cell culture, is referred to as “sheet culture”. Sheeting of cells can be performed by any known technique and conditions. Non-limiting examples of such a method are described in, for example, JP-A-2010-081829, JP-A-2010-226991, JP-A-2011-110368, JP-A-2011-172925, WO 2014/185517, and the like.
  • graft formation culture can be achieved, for example, by culturing cells under conditions that form cell-cell adhesion. Such conditions may be any as long as they can form cell-cell adhesion, but usually, cell-cell adhesion can be formed under the same conditions as general cell culture conditions. Such conditions include, for example, culturing at about 37 ° C., 5% CO 2.
  • the cultivation can be performed under normal pressure (atmospheric pressure, non-pressurized).
  • the explant formation culture (sheet culture)
  • the cells do not necessarily need to proliferate since cell-cell adhesion only needs to be formed.
  • the explant formation culture is performed without growing the cells.
  • the amount of cryopreserved cells is not limited to this, but may be, for example, based on the area of the culture surface of the culture substrate. , About 5.0 ⁇ 10 5 / cm 2 to about 1.0 ⁇ 10 7 / cm 2 , about 5.0 ⁇ 10 5 / cm 2 to about 5.0 ⁇ 10 6 / cm 2 , about 5.0 ⁇ 10 5 / cm 2 to about 3.0 ⁇ 10 6 / cm 2 , about 1.0 ⁇ 10 6 / cm 2 to about 1.0 ⁇ 10 7 / cm 2 , about 1.
  • It may be 0 ⁇ 10 6 / cm 2 , about 2.0 ⁇ 10 6 / cm 2 to about 3.0 ⁇ 10 6 / cm 2 , and the like. In one preferred embodiment, from about 7.5 ⁇ 10 5 / cm 2 to 3.0 ⁇ 10 6 / cm 2 , and in another preferred embodiment, from about 1.76 ⁇ 10 6 / cm 2 It is about 2.33 ⁇ 10 6 pieces / cm 2 .
  • the volume of the cell suspension is not particularly limited as long as it is a dose capable of suspending the above cell amount, but if it is too large, the size of the culture substrate also needs to be relatively large, so that it is not too large. preferable.
  • Non-limiting examples of cell suspension volumes include about 10 mL, about 11 mL, about 12 mL, about 13 mL, about 14 mL, about 15 mL, about 16 mL, about 17 mL, about 18 mL, about 19 mL, about 20 mL, about 21 mL, about 22 mL , About 23 mL, about 24 mL, about 25 mL, about 26 mL, about 27 mL, about 28 mL, about 29 mL, about 30 mL, and the like.
  • the capacity of the culture substrate for cryopreserving the cells is not particularly limited as long as the cells can be accommodated, but is preferably larger than the capacity of the cell suspension in view of the subsequent addition of the medium.
  • the volume of the culture substrate can be about 5 times, about 6 times, about 7 times, about 8 times, about 9 times, about 10 times the cell suspension.
  • the cryopreserved cells of the present disclosure may be subjected to culturing as it is on a culture substrate after thawing.
  • the medium used for culturing is added to the cell suspension obtained by thawing, and then used for culturing.
  • the details of the culture are as described in the culture method below.
  • the step of culturing the explant does not include a step of washing the cells (replacement of the cell culture medium) after thawing the frozen cells and before culturing the explant.
  • ⁇ 2> Culture method of the present disclosure relates to a method for culturing cells for transplantation, which comprises incubating cells with a medium containing a cryoprotectant.
  • the cryoprotectant and the cells for transplantation are as described in detail in ⁇ 1> above.
  • Such a culture method can be typically performed after thawing cells cryopreserved by the cryopreservation method described in ⁇ 1> above.
  • the culture method of the present disclosure includes the following steps: (A) thawing the cell population cryopreserved on the culture substrate to obtain a cell suspension containing a cryoprotectant; (B) adding a culture medium to the cell suspension obtained in (a) to dilute the cryoprotectant; and (C) a step of incubating the cell suspension obtained in (b) on the culture substrate.
  • step (a) thaw the cryopreserved cells cryopreserved on the culture substrate.
  • Thawing may be performed by any method known in the art, as long as the method does not cause undue damage to the cryopreserved cells.
  • a water bath, a hot water bath, spontaneous thawing, and rapid addition of a heated medium may be used. It can be carried out by a method such as thawing.
  • a cell suspension dispersed in the cryopreservation solution can be obtained.
  • a culture medium is added to the cell suspension obtained in step (a).
  • the cryoprotectant contained in the cell suspension obtained in (a) is diluted.
  • the culture medium is not particularly limited as long as it is commonly used in the art, and examples thereof include physiological saline, various physiological buffers (eg, PBS, HBSS, etc.), various cell culture base media.
  • physiological saline e.g., physiological saline, various physiological buffers (eg, PBS, HBSS, etc.), various cell culture base media.
  • a device based on the above may be used.
  • basal medium examples include, but are not limited to, DMEM, MEM, F12, DME, RPMI1640, MCDB (MCDB102, 104, 107, 120, 131, 153, 199, etc.), L15, SkBM, RITC80-7, DMEM / F12 and the like.
  • MCDB MCDB102, 104, 107, 120, 131, 153, 199, etc.
  • L15 SkBM, RITC80-7
  • DMEM / F12 examples include, but are not limited to, DMEM, MEM, F12, DME, RPMI1640, MCDB (MCDB102, 104, 107, 120, 131, 153, 199, etc.), L15, SkBM, RITC80-7, DMEM / F12 and the like.
  • the basal medium may be used with its standard composition (for example, as it is commercially available), or its composition may be appropriately changed depending on the cell type and cell conditions. Therefore, the
  • the graft forming medium may contain additives such as normal serum (eg, bovine serum such as fetal bovine serum, horse serum, human serum, etc.) and various growth factors (eg, FGF, EGF, VEGF, HGF, etc.).
  • normal serum eg, bovine serum such as fetal bovine serum, horse serum, human serum, etc.
  • various growth factors eg, FGF, EGF, VEGF, HGF, etc.
  • the cell-free cell culture does not contain heterologous serum such as bovine serum and horse serum.
  • the present disclosure is characterized in that graft forming culture is performed using a graft forming medium containing a cell adhesive component, whereby a high quality graft can be formed even when the graft forming medium is serum-free. It is effective.
  • the graft forming medium does not contain serum.
  • the amount of the medium to be added is not particularly limited as long as the cryoprotectant can be diluted to a concentration sufficient for culturing the cryopreserved cells.
  • the amount of medium to be added is about 5 It can be up to 30 mL, and in one preferred embodiment it can be 5-10 mL.
  • the dilution ratio of the cryopreservation solution can be 2 to 100 times, and in a preferred embodiment, 5 to 15 times.
  • step (c) the cell suspension to which the culture medium has been added in (b) is incubated on a culture substrate.
  • the culturing in the culturing method of the present disclosure is not limited to culturing for growing general cells, but also, for example, explant forming culture for forming a transplant from a cell population (typically, sheet culture). A culture in which the cell number does not substantially change is also included.
  • the culture method of the present disclosure can be used for any cell population, but in a preferred embodiment, the cell population to be cultured includes cells for transplantation.
  • the cells for transplantation used in the culture method of the present disclosure are as described in detail above.
  • the cell population comprises adherent cells, and in one more preferred embodiment, the cell population comprises myoblasts or cardiomyocytes.
  • a medium (cell suspension) containing a cryoprotectant may be added to the culture medium, or a culture medium may be added to the medium containing the cryoprotectant.
  • a culture medium is added to a medium (cell suspension) containing a cryoprotectant.
  • the cryoprotectant is as described in detail in ⁇ 1> above.
  • the cryoprotectant is DMSO.
  • the culture substrate used in the culture method of the present disclosure is the same as that described in detail in ⁇ 1> above. That is, the culture substrate used in the culture method of the present disclosure has a cell-adhesive culture surface in a preferred embodiment, and has a culture surface coated with a temperature-responsive material in a more preferred embodiment. In another preferred embodiment, the culture substrate has a culture surface for spheroid formation. Such culture substrates are known in the art, as described above, and are commercially available.
  • step (c) is a step of culturing explants. If step (c) is a graft forming culture, the resulting cell culture will be a graft.
  • one preferred embodiment of the present disclosure comprises the following steps: (A) a step of thawing a cell population containing cells for transplant cryopreserved on a culture substrate to obtain a cell suspension containing a cryoprotectant; (B) adding a culture medium to the cell suspension obtained in (A); (C) a step of explant-culturing the cell suspension obtained in (B) on the culture substrate; And a method for producing an implant.
  • steps (A) and (B) are as described in detail for steps (a) and (b) in the culture method.
  • the explant formation culture in the step (C) is typically a sheet culture.
  • the details of the sheet culture are as described above. Therefore, in one preferred embodiment of the method for producing an implant of the present disclosure, the implant is a sheet-shaped cell culture.
  • the transplant formation culture in step (C) may be a culture for forming spheroids.
  • the method may further include a step of further diluting the cryoprotectant in the transplant formation culture or a washing step for removing the cryoprotectant from the transplant formation culture. .
  • the cell for transplantation is not particularly limited as long as it can form a graft, and is typically an adherent cell.
  • the cells for transplantation are myoblasts or cardiomyocytes.
  • the cardiomyocytes may be iPS cell-derived cardiomyocytes.
  • the cells In culturing to form a transplant, particularly a sheet-shaped cell culture, the cells have a high density, for example, a density that reaches confluence, that is, the degree that it is assumed that the cells cover the entire adhesion surface of the culture container when seeded. It is preferably present at a density of
  • the "density to reach confluence" is typically the density at which cells are expected to contact each other, the density at which contact inhibition occurs, or the density at which cell growth is substantially stopped by contact inhibition, or It can be more.
  • the density is not limited to this, for example, about 5.0 ⁇ 10 5 / cm 2 to about 1.0 ⁇ 10 7 / cm 2 , about 5.0 ⁇ 10 5 / cm 2 About 5.0 ⁇ 10 6 pieces / cm 2 , about 5.0 ⁇ 10 5 pieces / cm 2 to about 3.0 ⁇ 10 6 pieces / cm 2 , about 1.0 ⁇ 10 6 pieces / cm 2 1.0 ⁇ 10 7 / cm 2 , about 1.0 ⁇ 10 6 / cm 2 to about 5.0 ⁇ 10 6 / cm 2 , about 1.0 ⁇ 10 6 / cm 2 to about 3.
  • the culture method and the method for producing a transplant of the present disclosure typically, cells cryopreserved by the cryopreservation method described in detail in ⁇ 1> above are used. Therefore, the culture method and the method for producing a transplant of the present disclosure may include the cryopreservation method described in the above ⁇ 1> before step (a) or step (A).
  • the culture method and the method for producing a transplant of the present disclosure at least some of the steps can be performed in a closed container.
  • the cell population cryopreserved by the method of ⁇ 1> is aseptically enclosed in a closed system container, and the cryopreserved cell population is thawed in a closed system container.
  • a culture method or a method for producing an explant can be performed. Therefore, preferably, in the culture method and the method for producing a transplant of the present disclosure, all the steps are performed in a closed vessel.
  • Implant of the present disclosure Another aspect of the present disclosure relates to an implant manufactured by the manufacturing method of the present disclosure.
  • the implants of the present disclosure are useful for treating diseases that are ameliorated by the application of the implants, such as various diseases associated with tissue abnormalities.
  • the implant of the present disclosure is for use in treating a disease ameliorated by the application of the implant, particularly a disease associated with tissue abnormalities.
  • the graft of the present disclosure has properties similar to those of the constituent cells, so that at least the conventional myoblast or fibroblast is used.
  • the present invention can be applied to a tissue or a disease that can be treated with a transplant including the same.
  • the tissues to be treated include, but are not limited to, for example, myocardium, cornea, retina, esophagus, skin, joints, cartilage, liver, pancreas, gingiva, kidney, thyroid, skeletal muscle, middle ear, bone marrow, stomach, Gastrointestinal tract such as the small intestine, duodenum, and large intestine.
  • Examples of the disease to be treated include, but are not limited to, heart disease (eg, myocardial injury (myocardial infarction, cardiac trauma), cardiomyopathy, etc.), corneal disease (eg, corneal epithelial stem cell exhaustion, cornea) Injury (thermal / chemical erosion), corneal ulcer, corneal opacity, corneal perforation, corneal scar, Stevens-Johnson syndrome, ocular pemphigus, etc., retinal diseases (eg, retinitis pigmentosa, age-related macular degeneration, etc.) Esophageal disease (eg, prevention of esophageal inflammation / stenosis after esophageal surgery (removal of esophageal cancer)), skin disease (eg, skin damage (trauma, burn), etc.), joint disease (eg, osteoarthritis, etc.) Cartilage disease (eg, cartilage damage), liver disease (eg, chronic liver disease), pancreatic disease (eg, diabetes),
  • Patent Document 1 Non-patent Document 1 Tanaka et al., J Gastroenterol. 2013; 48 (9): 1081-9.
  • the implants of the present disclosure can also be fragmented to an injectable size and injected at the site of need for treatment to achieve greater efficacy than injection with a single cell suspension (Wang et al., Cardiovasc Res. 2008; 77 (3): 515-24). Thus, such uses are also possible for the implant of the present disclosure.
  • Treatment method of the present disclosure Another aspect of the present disclosure relates to a method of treating a disease in a subject in need thereof, comprising applying an effective amount of an implant produced by the method of the present disclosure to the subject in need thereof.
  • the disease to be treated is as described above.
  • treatment is intended to include all types of medically acceptable prophylactic and / or therapeutic interventions, such as for the cure, temporary remission or prevention of disease.
  • treatment includes medically acceptable treatments for a variety of purposes, including slowing or stopping the progression of a disease associated with tissue abnormalities, regressing or eliminating lesions, preventing the onset of the disease or preventing its recurrence, and the like. Involve interventions.
  • a component that enhances the survival, engraftment, and / or function of a graft, and other active components that are useful for treating a target disease are used in combination with the graft or the like of the present disclosure. be able to.
  • the treatment method of the present disclosure may further include a step of manufacturing the implant of the present disclosure according to the manufacturing method of the present disclosure.
  • the treatment method of the present disclosure is a source of cells (eg, skin cells, blood cells, etc., when using iPS cells) or a source of cells for producing a graft from a subject prior to the step of producing the graft.
  • the method may further include a step of collecting a tissue (for example, skin tissue, blood or the like when using iPS cells).
  • the subject from whom the cells or tissue from which the cells are to be sourced is harvested is the same individual as the subject to whom a cell culture, composition, or explant is administered.
  • the subject from whom the cells or tissue from which the cells are to be sourced is harvested is a homologous distinct body from the subject to be administered, such as a cell culture, composition, or implant.
  • the subject from which the cells or the tissue from which the cells are sourced is harvested is an individual that is heterogeneous to the subject receiving the administration, such as a graft.
  • an effective amount is, for example, an amount capable of suppressing the onset or recurrence of a disease, reducing symptoms, or delaying or stopping the progress (for example, the size, weight, and number of sheet-shaped cell cultures). And preferably an amount that prevents the onset and recurrence of the disease or cures the disease. Also preferred is an amount that does not cause adverse effects beyond the benefit of administration. Such an amount can be appropriately determined, for example, by a test in a laboratory animal such as a mouse, a rat, a dog or a pig, or a disease model animal, and such a test method is well known to those skilled in the art.
  • the size of a tissue lesion to be treated can be an important index for determining an effective amount.
  • the administration method examples include intravenous administration, intramuscular administration, intraosseous administration, intrathecal administration, and direct application to tissues.
  • the frequency of administration is typically once per treatment, but multiple administrations are possible if the desired effect is not obtained.
  • the cell culture, the composition, the sheet-shaped cell culture, or the like of the present invention may be fixed to a target tissue by a locking means such as a suture or staple.
  • Kit of the present disclosure One aspect of the present disclosure relates to an implant manufacturing kit for manufacturing an implant using the cryopreservation method and the culture method (method for manufacturing an implant) of the present disclosure.
  • the implant manufacturing kit of the present disclosure includes a storage container 1 in which a cell culture substrate and a cryopreserved cell frozen on the cell culture substrate are enclosed, and a cell culture, which can be closed and connected to the storage container 1. And a storage container 2 in which a culture medium is enclosed.
  • the kit of the present disclosure and the method of using the same will be described in detail by taking, as an example, the case of producing a sheet-shaped cell culture containing skeletal myoblasts.
  • the kit of the present disclosure has a storage container 1 and a storage container 2, and these containers have a structure that can be closed and connected.
  • the term “closeably connectable” means that both containers are connected as one closed system while maintaining the closeability in each container. Therefore, both containers can be connected and detached while maintaining sterility.
  • a cell culture substrate for example, a culture dish coated with a temperature-responsive material
  • cells for transplantation for example, skeletal myoblasts
  • a medium in which cells for transplantation can be cultured for example, a medium that can be used for sheet culture, such as DMEM / F12
  • DMEM / F12 a medium that can be used for sheet culture, such as DMEM / F12
  • the cells for transplantation are cryopreserved, the cells may be cryopreserved on the culture substrate and then aseptically sealed in the storage container 1 or may be sterilely sealed in the storage container 1 (cells).
  • the cells for transplantation on the culture dish may be frozen together with the storage container.
  • the cell suspension is thawed on the cell culture substrate (in the cell culture dish).
  • Such cell suspensions typically include a cryoprotectant.
  • the storage container 1 and the storage container 2 are connected in a closed manner, and the medium aseptically sealed in the storage container 2 is added to the cell culture substrate in the storage container 1.
  • the cell culture substrate is in a state in which the cell population is suspended in the medium containing the cryoprotectant.
  • the suspension is transplanted together with the storage container to form a graft (for example, a sheet culture) to obtain a graft such as a sheet-shaped cell culture. In this way, it is possible to form a graft aseptically.
  • cryoprotectant medium, culture substrate, and other members and methods used in the kit of the present disclosure, those described in detail above can be used.
  • Example 1 Preparation of sheet cell culture
  • the skeletal myoblasts (including fibroblasts) prepared from human skeletal muscle by a conventional method were each contained in 600, 300, 200, 100, and 50 ⁇ L of MCDB131 medium containing 10% DMSO so that 2 ⁇ 10 7 cells were contained. It was suspended and stored frozen at -150 ° C. The frozen cells were thawed in warm water at 37 ° C. to obtain a cell suspension, and then diluted by adding 10 mL of DMEM / F12 medium containing 20% human serum (Thermo Fisher Scientific Inc.), followed by temperature responsiveness. The cells were seeded on a culture dish (UpCell (R) 3.5 cm, cell seed).
  • UpCell (R) UpCell (R) 3.5 cm, cell seed).
  • an explant such as a sheet-shaped cell culture that can withstand medical grade can be efficiently produced.
  • the use of the kit of the present disclosure makes it possible to aseptically transport the graft material and produce the graft aseptically even in a medical institution without a large facility such as a CPC. It is expected to contribute to the spread of regenerative medicine using pieces.

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Abstract

種々の疾患、特に心臓疾患の処置において好適に用いることができる移植用細胞の凍結保存方法および凍結保存後解凍した当該細胞の培養方法、当該移植用細胞を含むシート状細胞培養物を含む移植片の製造方法、当該方法で製造された移植片、当該移植片を含む組成物および医療製品、当該移植片を用いた疾患の処置方法などの提供を目的とする。　培養基材上で、移植用細胞を含む細胞懸濁液を凍結させることを特徴とする、細胞の凍結保存方法および凍結保護剤を含む培地 で細胞 集団をインキュベートすることを特徴とする、移植用細胞の培養方法により、上記課題が解決された。

Description

細胞の凍結保存方法
　本開示は、種々の疾患、特に心臓疾患の処置において好適に用いることができる移植用細胞の凍結保存方法、当該移植用細胞の培養方法、当該移植用細胞を含む移植片の製造方法、当該方法で製造されたシート状細胞培養物を含む移植片、当該移植片を含む組成物および医療製品、当該移植片を用いた疾患の処置方法などに関する。 
　近年、損傷した組織等の修復のために、種々の細胞を移植する試みが行われている。例えば、狭心症、心筋梗塞などの虚血性心疾患により損傷した心筋組織の修復のために、胎児心筋細胞、骨格筋芽細胞、間葉系幹細胞、心臓幹細胞、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞等の利用が試みられている（非特許文献１）。 
　このような試みの一環として、スキャフォールドを利用して形成した細胞構造物や、細胞をシート状に形成したシート状細胞培養物が開発されてきた（特許文献１、非特許文献２）。 
　シート状細胞培養物の治療への応用については、火傷などによる皮膚損傷に対する培養表皮シートの利用、角膜損傷に対する角膜上皮シート状細胞培養物の利用、食道ガン内視鏡的切除に対する口腔粘膜シート状細胞培養物の利用などの検討が進められており、その一部は臨床応用の段階に入っている。 
　かかるシート状細胞培養物を臨床的に利用するためには、無菌的に製造および輸送される必要がある。しかしながら現状では、シート状細胞培養物等を使用するためには、使用する医療機関内において、無菌的に管理された細胞調製施設（ＣＰＣ）などの大型の施設で、シート状細胞培養物等を無菌的に製造するほかなく、そのような施設を持たない医療機関等において手軽にシート状細胞培養物等を利用することは困難であるのが現状である。 
特表２００７－５２８７５５号公報
Haraguchi et al., Stem Cells Transl Med. 2012 Feb;1(2):136-41 Sawa et al., Surg Today. 2012 Jan;42(2):181-4
　本開示は、種々の疾患、特に心臓疾患の処置において好適に用いることができる移植用細胞の凍結保存方法および凍結保存後解凍した当該細胞の培養方法、当該移植用細胞を含むシート状細胞培養物を含む移植片の製造方法、当該方法で製造された移植片、当該移植片を含む組成物および医療製品、当該移植片を用いた疾患の処置方法などの提供を目的とする。 
　上述のとおり、シート状細胞培養物などの移植細胞を含む移植片を使用するためには、医療機関等においてＣＰＣなどの施設を有している必要がある。本発明者らは、ＣＰＣなどの施設を有しなくてもシート状細胞培養物等の使用を可能にするために研究する中で、移植用細胞の凍結保存から培養、移植片の製造を移送可能な閉鎖系容器内で実現できれば、簡便にシート状細胞培養物等の移植片を利用できるようになることを着想したが、このような閉鎖系容器では細胞の洗浄などの一部操作が非常に煩雑となるという課題に直面した。かかる課題を解決すべくさらに研究を続ける中で、凍結保存細胞を解凍して得た細胞懸濁液に十分量の培地を加えて培養した場合であっても、医療グレードとして十分な細胞培養物を得ることができることを見出し、さらに研究を進めた結果、本発明を完成させるに至った。 
　すなわち、本発明に下記に掲げるものに関する： 
［１］培養基材上で、移植用細胞を含む細胞懸濁液を凍結させることを特徴とする、細胞の凍結保存方法。 
［２］移植用細胞が、接着細胞である、［１］の方法。 
［３］移植用細胞が、筋芽細胞または心筋細胞である、［１］または［２］の方法。 
［４］培養基材が、細胞接着性の培養面を有する、［１］～［３］の方法。 
［５］培養基材が、温度応答性材料で被覆されている、［１］～［４］の方法。 
［６］培養基材が、スフェロイド形成用の培養面を有する、［１］～［３］の方法。 
［７］細胞懸濁液が、凍結保護剤を含む、［１］～［６］の方法。 
［８］細胞懸濁液が、５～２０％の凍結保護剤を含む、［１］～［７］の方法。 
［９］細胞懸濁液が、培養基材の面積に対して、５μＬ／ｃｍ２～１０００μＬ／ｃｍ２の密度で培養基材上に存在する、［１］～［８］のいずれか一項に記載の方法。 
［１０］移植用細胞が、培養基材の面積に対して、７．５×１０５個／ｃｍ２～３．０×１０６個／ｃｍ２の密度で細胞懸濁液中に存在する、［１］～［９］の方法。 
［１１］細胞培養基材上で凍結された、凍結保存細胞。 
［１２］凍結保護剤を含む培地で細胞集団をインキュベートすることを特徴とする、移植用細胞の培養方法。 
［１３］以下のステップ； 
（ａ）培養基材上で凍結保存された細胞集団を解凍して凍結保護剤を含む細胞懸濁液を得るステップ、 
（ｂ）（ａ）で得られた細胞懸濁液に培養用の培地を添加して凍結保護剤を希釈するステップ、 
（ｃ）（ｂ）で得られた細胞懸濁液を、前記培養基材上でインキュベートするステップ、 
を含む、［１２］の方法。 
［１４］細胞集団が、接着細胞を含む、［１２］または［１３］方法。 
［１５］細胞集団が、筋芽細胞または心筋細胞を含む、［１２］～［１４］の方法。 
［１６］凍結保護剤が、ＤＭＳＯである、［１２］～［１５］の方法。 
［１７］培養基材が、細胞接着性の培養面を有する、［１３］～［１６］の方法。 
［１８］培養基材が、温度応答性材料で被覆されている、［１３］～［１７］の方法。 
［１９］培養基材が、スフェロイド形成用の培養面を有する、［１３］～［１６］の方法。 
［２０］全ての工程が閉鎖系の容器内で実施される、［１３］～［１９］の方法。 
［２１］以下のステップ； 
（Ａ）培養基材上で凍結保存された移植用細胞を含む細胞集団を解凍して凍結保護剤を含む細胞懸濁液を得るステップ、 
（Ｂ）（Ａ）で得られた細胞懸濁液に培養用の培地を添加して凍結保護剤を希釈するステップ、 
（Ｃ）（Ｂ）で得られた細胞懸濁液を、前記培養基材上で移植片形成培養するステップ、 
を含む、移植片の製造方法。 
［２２］移植片が、シート状細胞培養物である、［２１］に記載の方法。 
［２３］移植用細胞が、筋芽細胞または心筋細胞である、［２１］または［２２］の方法 
［２４］移植用細胞が、培養基材の面積に対して、７．５×１０５個／ｃｍ２～３．０×１０６個／ｃｍ２の密度で細胞懸濁液中に存在する、［２１］～［２３］の方法。 
［２５］全ての工程が閉鎖系の容器内で実施される、［２１］～［２４］の方法。 
［２６］細胞培養基材および該細胞培養基材上で凍結された凍結保存細胞を封入した保存容器１と、該保存容器１と閉鎖的に連結可能な、細胞培養用培地を封入した保存容器２とを含む、移植片製造キット。 
　本発明によれば、シート状細胞培養物等に含有される移植用細胞を、簡便に保存および利用可能となる。このため、無菌的に移植片を製造および輸送するために煩雑な手順や設備を必要とすることなく、閉鎖系容器内で無菌的に製造および輸送することが可能となるため、かかる移植片を利用した医療の普及に貢献することが期待される。また、かかる移植片の製造においても大型の施設等を必要とすることがないため、大幅なコストダウンをすることが可能となる。 
図１は、凍結保存細胞を融解して回収した結果を表すグラフである。細胞回収率は、２００μＬ以上の凍結保存液で懸濁した場合（１．０×１０７個／ｍＬ以上の密度）であれば有意な差が見られなかった。バイアビリティは、いずれの密度の懸濁液であっても有意な差が見られなかった。 図２は、各密度の凍結保存細胞を回収、播種して作成したシート状細胞培養物の写真図である。いずれの場合も問題なくシート化できていた。
　以下、本開示を詳細に説明する。 
　本明細書において別様に定義されない限り、本明細書で用いる全ての技術用語および科学用語は、当業者が通常理解しているものと同じ意味を有する。本明細書中で参照する全ての特許、出願、公開された出願および他の出版物は、その全体を参照により本明細書に援用する。また本明細書において参照された出版物と本明細書の記載に矛盾が生じた場合は、本明細書の記載が優先されるものとする。 
　本開示において、「移植用細胞」は、生体内へ移植するための細胞を意味する。本開示において「移植片」は、生体内へ移植するための構造物を意味し、特に前記移植用細胞を構成成分として含む移植用構造物を意味する。移植片において細胞同士は接着して全体としてある形状を形成している状態を少なくとも一つ含み、一つ一つの細胞が全てバラバラに遊離して存在している、いわゆる懸濁状態は、本開示の「移植片」には含まれない。好ましい一態様においては、移植片は、細胞および細胞由来の物質以外の構造物（例えばスキャフォールドなど）を含まない移植用構造物である。本開示における移植片としては、これに限定するものではないが、例えばシート状細胞培養物、スフェロイド、細胞凝集塊、細胞懸濁物、フィブリンゲルを含む細胞懸濁物、ナノファイバーを用いた細胞培養物などが挙げられ、好ましくはシート状細胞培養物またはスフェロイド、より好ましくはシート状細胞培養物である。 
　本開示において、「シート状細胞培養物」は、細胞が互いに連結してシート状になったものをいう。本開示において、「スフェロイド」は細胞が互いに連結して略球状になったものをいう。細胞同士は、直接（接着分子などの細胞要素を介するものを含む）および／または介在物質を介して、互いに連結していてもよい。介在物質としては、細胞同士を少なくとも物理的（機械的）に連結し得る物質であれば特に限定されないが、例えば、細胞外マトリックスなどが挙げられる。介在物質は、好ましくは細胞由来のもの、特に、シート状細胞培養物やスフェロイドを構成する細胞に由来するものである。細胞は少なくとも物理的（機械的）に連結されるが、さらに機能的、例えば、化学的、電気的に連結されてもよい。シート状細胞培養物は、１の細胞層から構成されるもの（単層）であっても、２以上の細胞層から構成されるもの（積層体（多層）、例えば、２層、３層、４層、５層、６層など）であってもよい。また、シート状細胞培養物は、細胞が明確な層構造を示すことなく、細胞１個分の厚みを超える厚みを有する３次元構造を有してもよい。例えば、シート状細胞培養物の垂直断面において、細胞が水平方向に均一に整列することなく、不均一に（例えば、モザイク状に）垂直方向に複数の細胞が配置 された状態で存在していてもよい。 
　シート状細胞培養物などの移植片を構成する細胞（移植用細胞）は、移植片を形成し得るものであれば特に限定されず、例えば、接着細胞（付着性細胞）を含む。接着細胞は、例えば、接着性の体細胞（例えば、心筋細胞、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、肝細胞、膵細胞、腎細胞、副腎細胞、歯根膜細胞、歯肉細胞、骨膜細胞、皮膚細胞、滑膜細胞、軟骨細胞など）および幹細胞（例えば、筋芽細胞、心臓幹細胞などの組織幹細胞、胚性幹細胞、ｉＰＳ（induced pluripotent stem）細胞などの多能性幹細胞、間葉系幹細胞等）などを含む。体細胞は、幹細胞、特にｉＰＳ細胞から分化させたもの（ｉＰＳ細胞由来接着細胞）であってもよい。移植片を構成する細胞の非限定例としては、例えば、筋芽細胞（例えば、骨格筋芽細胞など）、間葉系幹細胞（例えば、骨髄、脂肪組織、末梢血、皮膚、毛根、筋組織、子宮内膜、胎盤、臍帯血由来のものなど）、心筋細胞、線維芽細胞、心臓幹細胞、胚性幹細胞、ｉＰＳ細胞、滑膜細胞、軟骨細胞、上皮細胞（例えば、口腔粘膜上皮細胞、網膜色素上皮細胞、鼻粘膜上皮細胞など）、内皮細胞（例えば、血管内皮細胞など）、肝細胞（例えば、肝実質細胞など）、膵細胞（例えば、膵島細胞など）、腎細胞、副腎細胞、歯根膜細胞、歯肉細胞、骨膜細胞、皮膚細胞等が挙げられる。ｉＰＳ細胞由来接着細胞の非限定例としては、ｉＰＳ細胞由来の心筋細胞、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、肝細胞、膵細胞、腎細胞、副腎細胞、歯根膜細胞、歯肉細胞、骨膜細胞、皮膚細胞、滑膜細胞、軟骨細胞などが挙げられる。 
　本開示において「筋芽細胞」は、横紋筋細胞の前駆細胞であり、骨格筋芽細胞および心筋芽細胞を含む。 
　本開示において「骨格筋芽細胞」は、骨格筋に存在する筋芽細胞を意味する。骨格筋芽細胞は当該技術分野でよく知られており、骨格筋から任意の既知の方法（例えば、特開２００７－８９４４２号公報に記載の方法など）により調製することもできるし、商業的に入手することもできる（例えば、Lonza、Cat# CC-2580）。骨格筋芽細胞は、限定されずに、例えば、ＣＤ５６、α７インテグリン、ミオシン重鎖ＩＩａ、ミオシン重鎖ＩＩｂ、ミオシン重鎖ＩＩｄ（ＩＩｘ）、ＭｙｏＤ、Ｍｙｆ５、Ｍｙｆ６、ミオゲニン、デスミン、ＰＡＸ３などのマーカーにより同定することができる。特定の態様において、骨格筋芽細胞はＣＤ５６陽性である。さらに特定の態様において、骨格筋芽細胞はＣＤ５６陽性およびデスミン陽性である。骨格筋芽細胞は、骨格筋を有する任意の生物、限定されずに、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類（マウス、ラット、ハムスター、モルモットなど）、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジなどの哺乳動物に由来してもよい。一態様において、骨格筋芽細胞は哺乳動物の骨格筋芽細胞である。特定の態様において、骨格筋芽細胞はヒト骨格筋芽細胞である。 
　本開示において「心筋芽細胞」は、心筋に存在する筋芽細胞を意味する。心筋芽細胞は当該技術分野でよく知られており、Ｉｓｌ１などのマーカーにより同定することができる。心筋芽細胞は、心筋を有する任意の生物、限定されずに、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類（マウス、ラット、ハムスター、モルモットなど）、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジなどの哺乳動物に由来してもよい。一態様において、心筋芽細胞は哺乳動物の心筋芽細胞である。特定の態様において、心筋芽細胞はヒト心筋芽細胞である。 
　本開示において「心筋細胞」は、心筋細胞の特徴を有する細胞を意味し、心筋細胞の特徴としては、限定されずに、例えば、心筋細胞マーカーの発現、自律的拍動の存在などが挙げられる。心筋細胞マーカーの非限定例としては、例えば、ｃ－ＴＮＴ（cardiac troponin T）、ＣＤ１７２ａ（別名ＳＩＲＰＡまたはＳＨＰＳ－１）、ＫＤＲ（別名ＣＤ３０９、ＦＬＫ１またはＶＥＧＦＲ２）、ＰＤＧＦＲＡ、ＥＭＩＬＩＮ２、ＶＣＡＭなどが挙げられる。心筋細胞としては、ｉＰＳ細胞由来の心筋細胞が好ましく例示される。 
　移植片を構成する細胞は、移植片による治療が可能な任意の生物に由来し得る。かかる生物には、限定されずに、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、げっ歯目動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモットなど）、ウサギなどが含まれる。また、移植片を構成する細胞の種類の数は特に限定されず、１種類のみ細胞で構成されていてもよいが、２種類以上の細胞を用いたものであってもよい。移植片を形成する細胞が２種類以上ある場合、最も多い細胞の含有比率（純度）は、移植片の形成終了時において、５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは７５％以上である。 
　本開示のシート状細胞培養物は、好ましくはスキャフォールド（支持体）を含まない。スキャフォールドは、その表面上および／またはその内部に細胞を付着させ、シート状細胞培養物の物理的一体性を維持するために当該技術分野において用いられることがあり、例えば、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）製の膜等が知られているが、本開示のシート状細胞培養物は、かかるスキャフォールドがなくともその物理的一体性を維持することができる。また、本開示のシート状細胞培養物は、好ましくは、シート状細胞培養物を構成する細胞由来の物質（細胞外マトリックスなど）のみからなり、それら以外の物質を含まない。 
　細胞は異種由来細胞であっても同種由来細胞であってもよい。ここで「異種由来細胞」は、シート状細胞培養物が移植に用いられる場合、そのレシピエントとは異なる種の生物に由来する細胞を意味する。例えば、レシピエントがヒトである場合、サルやブタに由来する細胞などが異種由来細胞に該当する。また、「同種由来細胞」は、レシピエントと同一の種の生物に由来する細胞を意味する。例えば、レシピエントがヒトである場合、ヒト細胞が同種由来細胞に該当する。同種由来細胞は、自己由来細胞（自己細胞または自家細胞ともいう）、すなわち、レシピエントに由来する細胞と、同種非自己由来細胞（他家細胞ともいう）を含む。自己由来細胞は、移植しても拒絶反応が生じないため、本開示においては好ましい。しかしながら、異種由来細胞や同種非自己由来細胞を利用することも可能である。異種由来細胞や同種非自己由来細胞を利用する場合は、拒絶反応を抑制するため、免疫抑制処置が必要となることがある。なお、本明細書中で、自己由来細胞以外の細胞、すなわち、異種由来細胞と同種非自己由来細胞を非自己由来細胞と総称することもある。本開示の一態様において、細胞は自家細胞（autologous cells）また は他家細胞（allogeneic cells）で ある。本開示の一態様において、細胞は自家細胞（自家ｉＰＳ細胞に由来する自家細胞、自家ｉＰＳ細胞を分化誘導して得られた自家分化誘導細胞を 含む）である。本開示の別の態様において、細胞は他家細胞（他家ｉＰＳ細胞に由来する他家細胞、他家ｉＰＳ細胞を分化誘導して得られた他家分化誘導細胞を 含む）である。 
　シート状細胞培養物は、既知の任意の方法（例えば、特許文献１、特許文献２、特開２０１０－０８１８２９、特開２０１１－１１０３６８など参照）で製造することができる。シート状細胞培養物の製造方法は、典型的には、細胞を培養基材上に播種するステップ、播種した細胞をシート化するステップ、形成されたシート状細胞培養物を培養基材から剥離するステップを含むが、これに限定されない。細胞を培養基材上に播種するステップの前に、細胞を凍結するステップおよび細胞を解凍するステップを行ってもよい。さらに、細胞を解凍するステップの後に細胞を洗浄するステップを行ってもよい。これら各ステップは、シート状細胞培養物の製造に適した既知の任意の手法で行うことができる。本開示の製造方法は、シート状細胞培養物を製造するステップを含んでもよく、その場合、シート状細胞培養物を製造するステップは、サブステップとして上記シート状細胞培養物の製造方法に係るステップの１または２以上を含んでもよい。ある一態様において、細胞を解凍するステップの後、細胞を培養基材上に播種するステップの前に細胞を増殖させるステップを含まない。 
　スフェロイドは、既知の任意の方法（例えば、特許５５２３８３０など参照）で製造することができる。スフェロイドの製造方法は、典型的には、細胞を、凹状部を有する培養基材上に播種するステップ、播種した細胞をスフェロイド化するステップ、形成されたスフェロイドを培養基材から取得するステップを含むが、これに限定されない。例えば、スフェロイドとしては多能性幹細胞由来の心筋細胞を１０００個ずつ直径０．２ｍｍの球状に形成した移植片などが挙げられる。 
　培養基材は、細胞がその上で細胞培養物を形成し得るものであれば特に限定されず、例えば、種々の材質および／または形状の容器、容器中の固形もしくは半固形の表面などを含む。容器は、培養液などの液体を透過させない構造・材料が好ましい。かかる材料としては、限定することなく、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、テフロン（登録商標）、ポリエチレンテレフタレート、ポリメチルメタクリレート、ナイロン６，６、ポリビニルアルコール、セルロース、シリコン、ポリスチレン、ガラス、ポリアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、金属（例えば、鉄、ステンレス、アルミニウム、銅、真鍮）等が挙げられる。また、容器は、少なくとも１つの平坦な面を有することが好ましい。かかる容器の例としては、限定することなく、例えば、細胞培養物の形成が可能な培養基材で構成された底面と、液体不透過性の側面とを備えた培養容器が挙げられる。かかる培養容器の特定の例としては、限定されずに、細胞培養皿、細胞培養ボトルなどが挙げられる。容器の底面は透明であっても不透明であってもよい。容器の底面が透明であると、容器の裏側から細胞の観察、計数などが可能となる。また、容器は、その内部に固形もしくは半固形の表面を有してもよい。固形の表面としては、上記のごとき種々の材料のプレートや容器などが、半固形の表面としては、ゲル、軟質のポリマーマトリックスなどが挙げられる。培養基材は、上記材料を用いて作製してもよいし、市販のものを利用してもよい。 
　好ましい培養基材としては、限定することなく、例えば、シート状細胞培養物の形成に適した、接着性の表面を有する基材、スフェロイドの形成に適した、低接着性の表面を有する基材および／または均一なウェル状構造を有する基材などが挙げられる。具体的には、シート状細胞培養物の形成の場合であれば、例えば、コロナ放電処理したポリスチレン、コラーゲンゲルや親水性ポリマーなどの親水性化合物を該表面にコーティングした基材、さらには、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカンなどの細胞外マトリックスや、カドヘリンファミリー、セレクチンファミリー、インテグリンファミリーなどの細胞接着因子などを表面にコーティングした基材などが挙げられる。また、かかる基材は市販されている（例えば、Corning(R) TC-Treated Culture Dish、Corningなど）。またスフェロイドの形成の場合であれば、例えば軟寒天、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）（ＰＩＰＡＡｍ）をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で架橋した温度応答性ゲル（市販名：メビオールゲル）、ポリメタクリル酸ヒドロキシエチル（ポリＨＥＭＡ）、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリスコリン（ＭＰＣ）ポリマーなどのハイドロゲルなどの非細胞接着性化合物を表面にコーティングした基材および／または均一な凹凸構造を表面に有する基材などが挙げられる。かかる基材もまた市販されている（例えば、EZSPHERE(R)など）。培養基材は全体または部分が透明であっても不透明であってもよい。 
　培養基材は、刺激、例えば、温度や光に応答して物性が変化する材料で表面が被覆されていてもよい。かかる材料としては、限定されずに、例えば、（メタ）アクリルアミド化合物、Ｎ－アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体（例えば、Ｎ－エチルアクリルアミド、Ｎ－ｎ－プロピルアクリルアミド、Ｎ－ｎ－プロピルメタクリルアミド、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド、Ｎ－イソプロピルメタクリルアミド、Ｎ－シクロプロピルアクリルアミド、Ｎ－シクロプロピルメタクリルアミド、Ｎ－エトキシエチルアクリルアミド、Ｎ－エトキシエチルメタクリルアミド、Ｎ－テトラヒドロフルフリルアクリルアミド、Ｎ－テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド等）、Ｎ，Ｎ－ジアルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体（例えば、Ｎ，Ｎ－ジメチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ－エチルメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジエチルアクリルアミド等）、環状基を有する（メタ）アクリルアミド誘導体（例えば、１－（１－オキソ－２－プロペニル）－ピロリジン、１－（１－オキソ－２－プロペニル）－ピペリジン、４－（１－オキソ－２－プロペニル）－モルホリン、１－（１－オキソ－２－メチル－２－プロペニル）－ピロリジン、１－（１－オキソ－２－メチル－２－プロペニル）－ピペリジン、４－（１－オキソ－２－メチル－２－プロペニル）－モルホリン等）、またはビニルエーテル誘導体（例えば、メチルビニルエーテル）のホモポリマーまたはコポリマーからなる温度応答性材料、アゾベンゼン基を有する光吸収性高分子、トリフェニルメタンロイコハイドロオキシドのビニル誘導体とアクリルアミド系単量体との共重合体、および、スピロベンゾピランを含むＮ－イソプロピルアクリルアミドゲル等の光応答性材料などの公知のものを用いることができる（例えば、特開平２－２１１８６５、特開２００３－３３１７７参照）。これらの材料に所定の刺激を与えることによりその物性、例えば、親水性や疎水性を変化させ、同材料上に付着した細胞培養物の剥離を促進することができる。温度応答性材料で被覆された培養皿は市販されており（例えば、CellSeed Inc.のUpCell(R)）、これらを本開示の製造方法に使用することができる。 
　培養基材は、種々の形状であってもよい。また、その面積は特に限定されないが、例えば、約１ｃｍ２～約２００ｃｍ２、約２ｃｍ２～約１００ｃｍ２、約３ｃｍ２～約５０ｃｍ２などであってよい。例えば、培養基材として直径１０ｃｍの円形の培養皿が挙げられる。この場合、面積は５６．７ｃｍ２となる。培養表面は平坦であってもよいし、凹凸構造を有していてもよい。凹凸構造を有する場合、均一な凹凸構造であることが好ましい。 
　培養基材は血清でコート（被覆またはコーティング）されていてもよい。血清でコートされた培養基材を用いることにより、より高密度のシート状細胞培養物を形成することができる。「血清でコートされている」とは、培養基材の表面に血清成分が付着している状態を意味する。かかる状態は、限定されずに、例えば、培養基材を血清で処理することにより得ることができる。血清による処理は、血清を培養基材に接触させること、および、必要に応じて所定期間インキュベートすることを含む。 
　血清としては、異種血清および／または同種血清を用いることができる。異種血清は、シート状細胞培養物を移植に用いる場合、そのレシピエントとは異なる種の生物に由来する血清を意味する。例えば、レシピエントがヒトである場合、ウシやウマに由来する血清、例えば、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、ＦＣＳ）、仔ウシ血清（ＣＳ）、ウマ血清（ＨＳ）などが異種血清に該当する。また、「同種血清」は、レシピエントと同一の種の生物に由来する血清を意味する。例えば、レシピエントがヒトである場合、ヒト血清が同種血清に該当する。同種血清は、自己血清（自家血清ともいう）、すなわち、レシピエントに由来する血清、およびレシピエント以外の同種個体に由来する同種他家血清を含む。なお、本明細書中で、自己血清以外の血清、すなわち、異種血清と同種他家血清を非自己血清と総称することもある。 
　培養基材をコートするための血清は、市販されているか、または、所望の生物から採取した血液から定法により調製することができる。具体的には、例えば、採取した血液を室温で約２０分～約６０分程度放置して凝固させ、これを約１０００×ｇ～約１２００×ｇ程度で遠心分離し、上清を採取する方法などが挙げられる。 
　培養基材上でインキュベートする場合、血清は原液で用いても、希釈して用いてもよい。希釈は、任意の媒体、例えば、限定することなく、水、生理食塩水、種々の緩衝液（例えば、ＰＢＳ、ＨＢＳＳなど）、種々の液体培地（例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、Ｆ１２、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＤＭＥ、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＣＤＢ（ＭＣＤＢ１０２、１０４、１０７、１２０、１３１、１５３、１９９など）、Ｌ１５、ＳｋＢＭ、ＲＩＴＣ８０－７など）等で行うことができる。希釈濃度は、血清成分が培養基材上に付着することができれば特に限定されず、例えば、約０．５％～約１００％（ｖ／ｖ）、好ましくは約１％～約６０％（ｖ／ｖ）、より好ましくは約５％～約４０％（ｖ／ｖ）である。 
　インキュベート時間も、血清成分が培養基材上に付着することができれば特に限定されず、例えば、約１時間～約７２時間、好ましくは約２時間～約４８時間、より好ましくは約２時間～約２４時間、さらに好ましくは約２時間～約１２時間である。インキュベート温度も、血清成分が培養基材上に付着することができれば特に限定されず、例えば、約０℃～約６０℃、好ましくは約４℃～約４５℃、より好ましくは室温～約４０℃である。 
　インキュベート後に血清を廃棄してもよい。血清の廃棄手法としては、ピペットなどによる吸引や、デカンテーションなどの慣用の液体廃棄手法を用いることができる。本開示の好ましい態様においては、血清廃棄後に、培養基材を無血清洗浄液で洗浄してもよい。無血清洗浄液としては、血清を含まず、培養基材に付着した血清成分に悪影響を与えない液体媒体であれば特に限定されず、例えば、限定することなく、水、生理食塩水、種々の緩衝液（例えば、ＰＢＳ、ＨＢＳＳなど）、種々の液体培地（例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、Ｆ１２、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＤＭＥ、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＣＤＢ（ＭＣＤＢ１０２、１０４、１０７、１２０、１３１、１５３、１９９など）、Ｌ１５、ＳｋＢＭ、ＲＩＴＣ８０－７など）等で行うことができる。洗浄手法としては、慣用の培養基材洗浄手法、例えば、限定することなく、培養基材上に無血清洗浄液を加えて所定時間（例えば、約５秒～約６０秒間）撹拌後、廃棄する手法などを用いることができる。 
　本開示において、培養基材を、成長因子でコートしてもよい。ここで、「成長因子」は、細胞の増殖を、それがない場合に比べて促進する任意の物質を意味し、例えば、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）などを含む。成長因子による培養基材のコート手法、廃棄手法および洗浄手法は、インキュベーション時の希釈濃度が、例えば、約０．０００１μｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、好ましくは約０．０００５μｇ／ｍＬ～約０．０５μｇ／ｍＬ、より好ましくは約０．００１μｇ／ｍＬ～約０．０１μｇ／ｍＬである以外は、基本的に血清と同じである。 
　本開示において、培養基材を、ステロイド剤でコートしてもよい。ここで「ステロイド剤」は、ステロイド核を有する化合物のうち、生体に、副腎皮質機能不全、クッシング症候群などの悪影響を及ぼし得るものをいう。かかる化合物としては、限定されずに、例えば、コルチゾール、プレドニゾロン、トリアムシノロン、デキサメタゾン、ベタメタゾン等が含まれる。ステロイド剤による培養基材のコート手法、廃棄手法および洗浄手法は、インキュベーション時の希釈濃度が、デキサメタゾンとして、例えば、約０．１μｇ／ｍＬ～約１００μｇ／ｍＬ、好ましくは約０．４μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、より好ましくは約１μｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬである以外は、基本的に血清と同じである。 
　培養基材は、血清、成長因子およびステロイド剤のいずれか１つでコートしても、これらの任意の組合わせ、すなわち、血清と成長因子、血清とステロイド剤、血清と成長因子とステロイド剤、または、成長因子とステロイド剤の組合わせでコートしてもよい。複数の成分でコートする場合、これらの成分を混合して同時にコートしてもよいし、別々のステップでコートしてもよい。 
＜１＞本開示の凍結保存方法 
　本開示の一側面は、移植用細胞を凍結保存する方法に関する。本開示の凍結保存方法は、培養基材上で、移植用細胞を含む細胞懸濁液を凍結させることを特徴とする。従来は、細胞を凍結保存する場合、細胞懸濁液を凍結保存バイアル等の凍結保存容器に封入し、それを凍結させることにより凍結保存していたが、本開示の方法は、凍結保存容器ではなく培養基材上で直接細胞懸濁液を凍結させることにより、移植用細胞を凍結保存するものである。したがって本開示の凍結保存方法により製造される凍結保存細胞、典型的には細胞培養基材上で凍結された凍結保存細胞も、本開示の発明に包含される。 
　細胞懸濁液を凍結させる方法は、当該技術分野において公知のいかなる方法を用いてもよく、例えば、液体窒素に浸す、プログラムフリーザーで冷却するなどの方法が挙げられる。細胞懸濁液を凍結させるまでの時間は特に限定されないが、細胞にダメージが少なく、また細胞の状態に変化がないことが好ましい。例えば細胞接着性の培養基材上で接着細胞を凍結保存する場合、該接着細胞が培養基材に接着し始める前に凍結させることが好ましい。したがって凍結開始から終了までの時間は、これに限定するものではないが、例えば約２４時間以内、約１２時間以内、約１０時間以内、約８時間以内、約６時間以内、約５時間以内、約４時間以内、約３時間以内、約２時間以内、約１時間以内、約３０分以内などであってよい。 
　本開示の方法で凍結保存される細胞は、移植の用に供する細胞であれば特に限定されず、任意の移植用細胞を用いることができる。移植用細胞は、上記において詳述したとおりである。好ましい態様において、移植用細胞は接着細胞であり、より好ましい態様において、移植用細胞は筋芽細胞または心筋細胞である。 
　凍結保存される細胞を懸濁する媒体は、当該技術分野において細胞の凍結保存に用いる媒体であればいかなるものを用いてもよく、これに限定するものではないが、例えばＤＭＥＭ、ＭＥＭ、Ｆ１２、ＤＭＥ、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＣＤＢ（ＭＣＤＢ１０２、１０４、１０７、１２０、１３１、１５３、１９９など）、Ｌ１５、ＳｋＢＭ、ＲＩＴＣ８０－７、ＤＭＥＭ／Ｆ１２などの基礎培地、ハンクス平衡塩液（ＨＢＳＳ）、アール平衡塩液（ＥＢＳＳ）、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）などの緩衝液などが挙げられる。 
　本開示の方法により凍結保存される移植用細胞は、その後解凍され、そのまま培養に供される。したがって本開示の方法に用いられる培養基材は、凍結処理に耐えられ、かつ移植用細胞を好適に培養可能な培養基材であれば特に限定されない。例えば移植用細胞が接着細胞であれば、培養基材は細胞接着性の培養面を有するものであることが好ましい。また、移植用細胞の用途によっても培養基材は異なり得る。例えば移植用細胞からシート状細胞培養物を製造する目的であれば、培養基材は細胞接着性の、好ましくは温度応答性材料でコーティングされた培養面を有することが好ましく、スフェロイドを形成する目的であれば、培養基材はスフェロイド形成用の培養面、例えば低接着性の表面および／または均一なウェル状構造を有する培養面を有する培養基材が好ましい。当業者であれば、凍結保存される移植用細胞およびその用途等に鑑みて、適切な性質を有する培養基材を選択することができる。 
　本開示の方法により移植用細胞を凍結保存する場合、支持体やスキャフォールドなど（以下合わせて「支持体等」と称する）と一緒に凍結保存されてよい。したがって、移植用細胞の細胞懸濁液には、支持体等を含んでよい。かかる支持体等は、移植片の形成に有利なものであればいかなるものであってもよい。かかる支持体等の材質としては、生体内に移植した場合に悪影響のないものが好ましく、より好ましくは生分解性のものであり、例えばポリ乳酸、フィブリンゲルなどが挙げられる。したがってかかる支持体等としては、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロラクトンなどの生分解性ポリマーからなるフィルムや支持体、フィブリンゲルなどの生体由来成分からなる支持体などが挙げられる。 
　培養基材上で凍結保存される細胞懸濁液は、凍害防止のため、好ましくは凍結保護剤を含んでいる。本開示の凍結保存方法に用い得る凍結保護剤としては、移植用細胞の保存という点に鑑みて血清などの製造工程不純物を含まないものであれば、当該技術分野において通常用いられているものを用いることができ、これに限定するものではないが、例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロールなどの多価アルコール、トレハロースなどの糖類、ポリリジンなどのポリアミノ酸などが挙げられる。凍結保護剤の含有量は、凍結の際に細胞をダメージから保護でき、かつ細胞に悪影響を与えなければ特に限定されず、これに限定するものではないが、例えば約１～２０％、約５～１５％、約７～１２％などが挙げられる。 
　凍結保存される細胞懸濁液の量は、培養基材上で好適に凍結可能な量であれば特に限定されない。細胞懸濁液が多すぎる場合、凍結に時間がかかってしまい、凍害が起こりやすくなってしまうため、適量以上の細胞懸濁液は好ましくない。細胞懸濁液の量は、好ましくは、培養基材の面積に対して、約５～１０００μＬ／ｃｍ２程度、より好ましくは約１０～３００μＬ／ｃｍ２程度である。 
　凍結保存される細胞の量は、培養基材の大きさによって変化し得、また解凍後の培養目的に鑑みて決定され得る。解凍後、増殖培養に供される場合、細胞懸濁液中の細胞量は、培養基材の面積に対して、例えば約７．５×１０５個／ｃｍ２～３．０×１０６個／ｃｍ２程度であり得る。 
　一態様において凍結保存細胞は、解凍後、移植片形成培養に供される。本開示において「移植片形成培養」は、培養細胞を移植片として形成するための培養を意味し、特に移植片がシート状細胞培養物である場合、「シート化培養」と称する。細胞のシート化は、既知の任意の手法および条件で行うことができる。かかる手法の非限定例は、例えば、特開2010-081829、特開2010-226991、特開2011-110368、特開2011-172925、WO 2014/185517などに記載されている。細胞の移植片形成（例えばシート化）は、細胞同士が接着分子や、細胞外マトリックスなどの細胞間接着機構を介して互いに接着することにより達成されると考えられている。したがって、移植片形成培養は、例えば、細胞を、細胞間接着を形成する条件下で培養することにより達成することができる。かかる条件は、細胞間接着を形成することができればいかなるものであってもよいが、通常は一般的な細胞培養条件と同様の条件であれば細胞間接着を形成することができる。かかる条件としては、例えば、約３７℃、５％ＣＯ２での培養が挙げられる。また、培養は通常の圧力下（大気圧下、非加圧下）で行うことができる。移植片形成培養（シート化培養）においては、細胞間接着が形成されればよいため、必ずしも細胞が増殖する必要はない。好ましい一態様において、移植片形成培養（シート化培養）は、細胞を増殖させずに行われる。 
　凍結保存細胞を解凍後、移植片形成培養に供する場合、凍結保存細胞（すなわち移植用細胞）の量としては、これに限定するものではないが、例えば培養基材の培養面の面積に対して、約５．０×１０５個／ｃｍ２～約１．０×１０７個／ｃｍ２、約５．０×１０５個／ｃｍ２～約５．０×１０６個／ｃｍ２、約５．０×１０５個／ｃｍ２～約３．０×１０６個／ｃｍ２、約１．０×１０６個／ｃｍ２～約１．０×１０７個／ｃｍ２、約１．０×１０６個／ｃｍ２～約５．０×１０６個／ｃｍ２、約１．０×１０６個／ｃｍ２～約３．０×１０６個／ｃｍ２、約１．５×１０６個／ｃｍ２～約１．０×１０７個／ｃｍ２、約１．５×１０６個／ｃｍ２～約５．０×１０６個／ｃｍ２、約１．５×１０６個／ｃｍ２～約３．０×１０６個／ｃｍ２、約２．０×１０６個／ｃｍ２～約１．０×１０７個／ｃｍ２、約２．０×１０６個／ｃｍ２～約５．０×１０６個／ｃｍ２、約２．０×１０６個／ｃｍ２～約３．０×１０６個／ｃｍ２などであり得る。好ましい一態様において、約７．５×１０５個／ｃｍ２～３．０×１０６個／ｃｍ２であり、別の好ましい一態様においては、約１．７６×１０６個／ｃｍ２～約２．３３×１０６個／ｃｍ２である。 
　細胞懸濁液の容量は、上記細胞量を懸濁可能な用量であれば特に限定されないが、多すぎる場合は培養基材の大きさも相対的に大きくなる必要があるため、多すぎないことが好ましい。細胞懸濁液の容量の非限定例は、約１０ｍＬ、約１１ｍＬ、約１２ｍＬ、約１３ｍＬ、約１４ｍＬ、約１５ｍＬ、約１６ｍＬ、約１７ｍＬ、約１８ｍＬ、約１９ｍＬ、約２０ｍＬ、約２１ｍＬ、約２２ｍＬ、約２３ｍＬ、約２４ｍＬ、約２５ｍＬ、約２６ｍＬ、約２７ｍＬ、約２８ｍＬ、約２９ｍＬ、約３０ｍＬなどであり得る。 
　細胞を凍結保存する培養基材の容量は、細胞を収容できる限り特に限定されないが、その後培地を添加することに鑑みると、細胞懸濁液の容量より大きいことが好ましい。一態様において、培養基材の容量は、細胞懸濁液の約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍であり得る。 
　本開示の凍結保存細胞は、解凍後、培養基材上でそのまま培養に供されてよい。解凍後そのまま培養に供される場合、解凍して得られた細胞懸濁液に、培養に用いる培地を加えてから培養に供される。培養についての詳細は、後述の培養方法に記載されたとおりである。好ましい一態様において、移植片形成培養の際、凍結した細胞を解凍した後、移植片形成培養するまでに細胞を洗浄する（細胞培養液を置換する）ステップは含まない。 
＜２＞本開示の培養方法 
　本開示の一側面は、凍結保護剤を含む培地で細胞をインキュベートすることを特徴とする、移植用細胞の培養方法に関する。本開示の培養方法において、凍結保護剤および移植用細胞については、上記＜１＞で詳述したとおりである。かかる培養方法は、典型的には上記＜１＞に記載の凍結保存方法により凍結保存された細胞を解凍後に実施できる。 
　以下に、＜１＞の凍結保存方法で凍結保存された細胞を培養する場合を例として、本発明を詳述する。 
　本開示の培養方法は、典型的な一態様において、以下の工程を含む： 
（ａ）培養基材上で凍結保存された細胞集団を解凍して凍結保護剤を含む細胞懸濁液を得る工程； 
（ｂ）（ａ）で得られた細胞懸濁液に培養用の培地を添加して凍結保護剤を希釈する工程；および 
（ｃ）（ｂ）で得られた細胞懸濁液を、前記培養基材上でインキュベートする工程。 
　工程（ａ）において、培養基材上で凍結保存された凍結保存細胞を解凍する。解凍には、凍結保存細胞に必要以上のダメージを与えるものでない限り、当該技術分野において公知のいかなる方法を用いてもよく、例えば水浴、湯浴、自然解凍、加温した培地を添加して急速解凍などの方法により実施することができる。かかる工程により、凍結保存液に分散された細胞懸濁液を得ることができる。 
　工程（ｂ）において、工程（ａ）で得られた細胞懸濁液に、培養用の培地を添加する。これにより、（ａ）で得られた細胞懸濁液中に含まれる凍結保護剤を希釈する。培養用の培地は、当該技術分野において通常用いられるものであれば特に限定されず、例えば、生理食塩水、種々の生理緩衝液（例えば、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ等）、種々の細胞培養用の基礎培地をベースにしたものなどを使用してもよい。かかる基礎培地には、限定されずに、例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、Ｆ１２、ＤＭＥ、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＣＤＢ（ＭＣＤＢ１０２、１０４、１０７、１２０、１３１、１５３、１９９など）、Ｌ１５、ＳｋＢＭ、ＲＩＴＣ８０－７、ＤＭＥＭ／Ｆ１２などが含まれる。これらの基礎培地の多くは市販されており、その組成も公知となっている。基礎培地は、標準的な組成のまま（例えば、市販されたままの状態で）用いてもよいし、細胞種や細胞条件に応じてその組成を適宜変更してもよい。したがって、本発明に用いる基礎培地は、公知の組成のものに限定されず、１または２以上の成分が追加、除去、増量もしくは減量されたものを含む。移植片形成媒体は、通常血清（例えば、ウシ胎仔血清などのウシ血清、ウマ血清、ヒト血清等）、種々の成長因子（例えば、ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ等）などの添加物を含んでもよいが、シート状細胞培養物をゼノフリー条件下で製造する場合、特にウシ血清、ウマ血清などの異種血清を含まないことが好ましい。本開示は、細胞接着性成分を含む移植片形成媒体を用いて移植片形成培養することを特徴とし、これにより移植片形成媒体が無血清であっても高品質で移植片形成可能であるという効果を奏するものである。したがって好ましい一態様において、移植片形成媒体は血清を含まない。 
　添加する培地の量は、凍結保存した細胞を培養するのに十分な濃度まで凍結保護剤を希釈可能な量であれば特に限定されない。例えば直径１０ｃｍの円形の培養皿に、約７．５×１０５個／ｃｍ２～３．０×１０６個／ｃｍ２程度の細胞が凍結保存されていた場合、加える培地の量は約５～３０ｍＬであり得、好ましい一態様においては、５～１０ｍＬとなり得る。凍結保存液の希釈率は２倍～１００倍であり得、好ましい一態様においては、５倍～１５倍となり得る。 
　工程（ｃ）において、（ｂ）で培養用培地を添加された細胞懸濁液を、培養基材上でインキュベートする。本開示の培養方法における培養は、一般的な細胞を増殖させるための培養だけでなく、例えば細胞集団から移植片を形成するための移植片形成培養（典型的にはシート化培養）などの、細胞数が実質的に変化しない培養も含まれる。 
　本開示の培養方法は、任意の細胞集団に対して用いることができるが、好ましい一態様において、培養される細胞集団は、移植用細胞を含む。本開示の培養方法において用いられる移植用細胞は、上記において詳述したとおりである。したがって好ましい一態様において、細胞集団は接着細胞を含み、より好ましい一態様において、細胞集団は筋芽細胞または心筋細胞を含む。 
　本開示の培養方法においては、培養用の培地に凍結保護剤を含む媒体（細胞懸濁液）を加えてもよいし、凍結保護剤を含む媒体に培養用の培地を加えてもよい。典型的には上述のとおり、凍結保護剤を含む媒体（細胞懸濁液）に培養用の培地を加える。凍結保護剤は、上記＜１＞において詳述したとおりである。好ましい一態様において、凍結保護剤は、ＤＭＳＯである。 
　本開示の培養方法においては、典型的には＜１＞の方法で凍結保存された細胞集団をそのまま培養に用いる。したがって本開示の培養方法に用いられる培養基材は、上記＜１＞において詳述したものと同じである。すなわち、本開示の培養方法に用いられる培養基材は、好ましい一態様において細胞接着性の培養面を有し、より好ましい一態様において温度応答性材料で被覆された培養面を有するものである。また、別の好ましい一態様において、培養基材は、スフェロイド形成用の培養面を有している。このような培養基材は上述のとおり当該技術分野において公知であり、市販されている。 
　上述のとおりインキュベートは、実質的に細胞数に変化のないインキュベートであってもよく、かかるインキュベートは典型的には移植片形成培養である。したがって本開示の特に好ましい一態様において、工程（ｃ）は移植片形成培養をする工程である。工程（ｃ）が移植片形成培養であれば、その結果として得られる細胞培養物は、移植片となる。したがって本開示の好ましい一態様は、以下の工程： 
（Ａ）培養基材上で凍結保存された移植用細胞を含む細胞集団を解凍して凍結保護剤を含む細胞懸濁液を得る工程； 
（Ｂ）（Ａ）で得られた細胞懸濁液に培養用の培地を添加する工程；および 
（Ｃ）（Ｂ）で得られた細胞懸濁液を、前記培養基材上で移植片形成培養する工程； 
を含む、移植片の製造方法に関する。 
　本開示の移植片の製造方法において、工程（Ａ）および（Ｂ）については、上記培養方法における工程（ａ）および（ｂ）について詳述したとおりである 
　工程（Ｃ）における移植片形成培養は、典型的にはシート化培養である。シート化培養の詳細は、上述したとおりである。したがって本開示の移植片の製造方法の好ましい一態様においては、移植片はシート状細胞培養物である。工程（Ｃ）における移植片形成培養は、スフェロイドを形成するための培養であってもよい。工程（Ｃ）における移植片形成培養の後に、移植片形成培養中の凍結保護剤をさらに希釈する工程または移植片形成培養から凍結保護剤を除去するための洗浄の工程をさらに含んでいてもよい。 
　かかる移植片の製造方法において、移植用細胞は、移植片を形成可能な細胞であれば特に限定されず、典型的には接着細胞である。好ましい一態様において、移植用細胞は筋芽細胞または心筋細胞である。心筋細胞はｉＰＳ細胞由来の心筋細胞であってよい。 
　移植片、特にシート状細胞培養物を形成するための培養においては、細胞が高密度、例えばコンフルエントに達する密度、すなわち播種した際に細胞が培養容器の接着表面一面を覆うことが想定される程度の密度で存在することが好ましい。「コンフルエントに達する密度」とは、典型的には、細胞が互いに接触することが想定される程度の密度、接触阻害が発生する密度、または接触阻害により細胞の増殖を実質的に停止する密度あるいはそれ以上であり得る。かかる密度としては、これに限定するものではないが、例えば約５．０×１０５個／ｃｍ２～約１．０×１０７個／ｃｍ２、約５．０×１０５個／ｃｍ２～約５．０×１０６個／ｃｍ２、約５．０×１０５個／ｃｍ２～約３．０×１０６個／ｃｍ２、約１．０×１０６個／ｃｍ２～約１．０×１０７個／ｃｍ２、約１．０×１０６個／ｃｍ２～約５．０×１０６個／ｃｍ２、約１．０×１０６個／ｃｍ２～約３．０×１０６個／ｃｍ２、約１．５×１０６個／ｃｍ２～約１．０×１０７個／ｃｍ２、約１．５×１０６個／ｃｍ２～約５．０×１０６個／ｃｍ２、約１．５×１０６個／ｃｍ２～約３．０×１０６個／ｃｍ２、約２．０×１０６個／ｃｍ２～約１．０×１０７個／ｃｍ２、約２．０×１０６個／ｃｍ２～約５．０×１０６個／ｃｍ２、約２．０×１０６個／ｃｍ２～約３．０×１０６個／ｃｍ２などが挙げられる。好ましい一態様において、約７．５×１０５個／ｃｍ２～３．０×１０６個／ｃｍ２であり、別の好ましい一態様においては、約１．７６×１０６個／ｃｍ２～約２．３３×１０６個／ｃｍ２である。 
　本開示の培養方法および移植片の製造方法においては、上述のとおり、典型的には上記＜１＞で詳述した凍結保存方法により凍結保存された細胞を用いる。したがって本開示の培養方法および移植片の製造方法は、工程（ａ）または工程（Ａ）の前に、上記＜１＞で詳述した凍結保存方法を含んでよい。 
　好ましい一態様において、本開示の培養方法および移植片の製造方法は、少なくとも一部の工程を閉鎖系の容器内で実施することができる。典型的には、＜１＞の方法で凍結保存された細胞集団を、閉鎖系の容器内に無菌的に封入し、該凍結保存された細胞集団を閉鎖系容器内で解凍し、本開示の培養方法または移植片の製造方法を行うことができる。したがって好ましくは、本開示の培養方法および移植片の製造方法は、全ての工程が閉鎖系の容器内で実施される。 
＜３＞本開示の移植片 
　本開示の別の側面は、本開示の製造方法により製造された移植片に関する。本開示の移植片は、移植片の適用により改善される疾患、例えば、組織の異常に関連する種々の疾患の処置に有用である。したがって、一態様において、本開示の移植片は、移植片の適用により改善される疾患、特に、組織の異常に関連する疾患の処置に用いるためのものである。本開示の移植片は、従来の移植片に比べて高い機械的強度を有する以外は、これと同様の構成細胞固有の性質を有しているため、少なくとも従来の筋芽細胞または線維芽細胞を含む移植片による処置が可能な組織や疾患に適用することができる。処置の対象となる組織としては、限定されずに、例えば、心筋、角膜、網膜、食道、皮膚、関節、軟骨、肝臓、膵臓、歯肉、腎臓、甲状腺、骨格筋、中耳、骨髄、胃、小腸、十二指腸、大腸などの消化管などが挙げられる。また、処置の対象となる疾患としては、限定されずに、例えば、心疾患（例えば、心筋傷害（心筋梗塞、心外傷）、心筋症など）、角膜疾患（例えば、角膜上皮幹細胞疲弊症、角膜損傷（熱・化学腐食）、角膜潰瘍、角膜混濁、角膜穿孔、角膜瘢痕、スティーブンス・ジョンソン症候群、眼類天疱瘡など）、網膜疾患（例えば、網膜色素変性症、加齢黄斑変性症など）、食道疾患（例えば、食道手術（食道ガン除去）後の食道の炎症・狭窄の予防など）、皮膚疾患（例えば、皮膚損傷（外傷、熱傷）など）、関節疾患（例えば、変形性関節炎など）、軟骨疾患（例えば、軟骨の損傷など）、肝疾患（例えば、慢性肝疾患など）、膵臓疾患（例えば、糖尿病など）、歯科疾患（例えば、歯周病など）、腎臓疾患（例えば、腎不全、腎性貧血、腎性骨異栄養症など）、甲状腺疾患（例えば、甲状腺機能低下症など）、筋疾患（例えば、筋損傷、筋炎など）、中耳疾患（例えば、中耳炎など）、骨髄疾患（例えば、白血病、再生不良性貧血、免疫不全疾患など）が挙げられる。本開示の移植片が上記疾患に有用であることは、例えば、特許文献１、非特許文献１、Tanaka et al., J Gastroenterol. 2013;48(9):1081-9.などに記載されている。本開示の移植片は、注射可能な大きさに断片化し、これを処置が必要な部位に注射することで、単細胞懸濁液による注射よりも高い効果を得ることもできる（Wang et al., Cardiovasc Res. 2008;77(3):515-24）。したがって、本開示の移植片についても、このような利用法が可能である。 
＜４＞本開示の治療方法 
　本開示の別の側面は、本開示の方法により製造された移植片の有効量を、それを必要とする対象に適用することを含む、前記対象における疾患を処置する方法に関する。処置の対象となる疾患は、上記したとおりである。 
　本開示において、用語「処置」は、疾患の治癒、一時的寛解または予防などを目的とする医学的に許容される全ての種類の予防的および／または治療的介入を包含するものとする。例えば、「処置」の用語は、組織の異常に関連する疾患の進行の遅延または停止、病変の退縮または消失、当該疾患発症の予防または再発の防止などを含む、種々の目的の医学的に許容される介入を包含する。 
　本開示の処置方法においては、移植片の生存性、生着性および／または機能などを高める成分や、対象疾患の処置に有用な他の有効成分などを、本開示の移植片等と併用することができる。 
　本開示の処置方法は、本開示の製造方法に従って、本開示の移植片を製造するステップをさらに含んでもよい。本開示の処置方法は、移植片を製造するステップの前に、対象から移植片を製造するための細胞（ｉＰＳ細胞を用いる場合は、例えば、皮膚細胞、血球等）または細胞の供給源となる組織（ｉＰＳ細胞を用いる場合は、例えば、皮膚組織、血液等）を採取するステップをさらに含んでもよい。一態様において、細胞または細胞の供給源となる組織を採取する対象は、細胞培養物、組成物、または移植片等の投与を受ける対象と同一の個体である。別の態様において、細胞または細胞の供給源となる組織を採取する対象は、細胞培養物、組成物、または移植片等の投与を受ける対象とは同種の別個体である。別の態様において、細胞または細胞の供給源となる組織を採取する対象は、移植片等の投与を受ける対象とは異種の個体である。 
　本開示において、有効量とは、例えば、疾患の発症や再発を抑制し、症状を軽減し、または進行を遅延もしくは停止し得る量（例えば、シート状細胞培養物のサイズ、重量、枚数等）であり、好ましくは、当該疾患の発症および再発を予防し、または当該疾患を治癒する量である。また、投与による利益を超える悪影響が生じない量が好ましい。かかる量は、例えば、マウス、ラット、イヌまたはブタなどの実験動物や疾患モデル動物における試験などにより適宜決定することができ、このような試験法は当業者によく知られている。また、処置の対象となる組織病変の大きさは、有効量決定のための重要な指標となり得る。 
　投与方法としては、例えば、静脈投与、筋肉内投与、骨内投与、髄腔内投与、組織への直接的な適用などが挙げられる。投与頻度は、典型的には１回の処置につき１回であるが、所望の効果が得られない場合には、複数回投与することも可能である。組織に適用する際、本発明の細胞培養物、組成物、またはシート状細胞培養物等を対象の組織に縫合糸やステープルなどの係止手段により固定してもよい。 
＜５＞本開示のキット 
　本開示の一側面は、本開示の凍結保存方法および培養方法（移植片の製造方法）を用いて移植片を製造するための移植片製造キットに関する。本開示の移植片製造キットは、細胞培養基材および該細胞培養基材上で凍結された凍結保存細胞を封入した保存容器１と、該保存容器１と閉鎖的に連結可能な、細胞培養用培地を封入した保存容器２とを含むものである。以下、骨格筋芽細胞を含むシート状細胞培養物を製造する場合を例として、本開示のキットおよびその使用方法を詳述する。
　本開示のキットは、保存容器１および保存容器２を有し、これらの容器は閉鎖的に連結可能な構造となっている。「閉鎖的に連結可能」であるとは、各容器内の閉鎖性を保ったまま両容器を一つの閉鎖系として接続することを言う。したがって両容器は、無菌性を保ったまま接続し、また脱離することが可能である。 
　保存容器１には、細胞培養基材（例えば温度応答性材料で被覆された培養皿）および該培養基材上に凍結保存された移植用細胞（例えば骨格筋芽細胞）が、保存容器２には移植用細胞を培養可能な培地（例えばシート化培養に使用可能な培地、例えばＤＭＥＭ／Ｆ１２など）が無菌的に封入されている。移植用細胞を凍結保存する場合、培養基材上で凍結保存された後に保存容器１に無菌的に封入されてもよいし、保存容器１に無菌的に封入された状態の培養基材（細胞培養皿）上の移植用細胞を保存容器ごと凍結させてもよい。 
　本開示のキットを使用する場合、まず凍結保存された細胞を解凍する。これにより細胞培養基材上（細胞培養皿内）に細胞懸濁液が解凍されることになる。かかる細胞懸濁液は、典型的には凍結保護剤を含んでいる。次に、保存容器１および保存容器２を閉鎖的に連結させ、保存容器２に無菌的に封入されている培地を、保存容器１内の細胞培養基材に添加する。これにより、細胞培養基材は、凍結保護剤を含む培地に細胞集団が懸濁された懸濁液が入っている状態となる。次にかかる懸濁液を、保存容器ごと移植片形成培養（例えばシート化培養）して、シート状細胞培養物などの移植片を得る。こうして無菌的に移植片を形成することが可能である。 
　本開示のキットにおいて用いられる凍結保護剤、培地、培養基材などの部材や手法などは、全て上記において詳述されているものを用いることができる。 
　本開示を以下の例を参照してより詳細に説明するが、これは本開示の特定の具体例を示すものであり、本開示はこれらに限定されるものではない。 
例１：シート状細胞培養物の調製 
　ヒト骨格筋から定法により調製した骨格筋芽細胞（線維芽細胞を含む）を、６００、３００、２００、１００および５０μＬの１０％ＤＭＳＯを含むＭＣＤＢ１３１培地に、それぞれ２×１０７個含まれるように懸濁し、－１５０℃にて凍結保存した。凍結保存した細胞を３７℃の温水中で融解して細胞懸濁液を得た後、１０ｍＬの２０％ヒト血清含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Thermo Fisher Scientific Inc.）を加えて希釈し、温度応答性培養皿（UpCell(R)３．５ｃｍ、セルシード）に播種した。その際，１０μＬ細胞懸濁液をサンプリングし、トリパンブルーにて染色後セルカウントを実施した。その後３７℃、５％ＣＯ２下で１２～２６時間シート化培養を行った。シート化培養後、培地を除去し、１０００μＬの冷却したＨＢＳＳ（＋）（Thermo Fisher Scientific Inc.）を加えて１０分静置し、その後静かにピペッティングしてシート状細胞培養物を完全に剥離させた。 
　結果を図１および図２に示す。 
　細胞の凍結保存液量としては２００μＬ以上（すなわち１．０×１０７個／ｍＬ以下の密度）であれば回収率が低下しない傾向が見られた。また、すべての条件でシート化できたことから、凍結保存液が含まれていたとしてもシート化できることがわかった。 
　本開示の方法およびキットによれば、医療グレードに耐え得るシート状細胞培養物などの移植片を、効率的に製造可能である。特に本開示のキットを用いることにより、ＣＰＣなどの大型設備を有しない医療機関などでも、移植片の材料を無菌的に輸送し、無菌的に移植片を製造することが可能となるため、移植片を利用した再生医療の普及に貢献することが期待される。 

Claims (13)

  1. 　凍結保護剤を含む培地で細胞集団をインキュベートすることを特徴とする、移植用細胞の培養方法。 
  2. 　以下のステップ； 
    （ａ）培養基材上で凍結保存された細胞集団を解凍して凍結保護剤を含む細胞懸濁液を得るステップ、 
    （ｂ）（ａ）で得られた細胞懸濁液に培養用の培地を添加して凍結保護剤を希釈するステップ、 
    （ｃ）（ｂ）で得られた細胞懸濁液を、前記培養基材上でインキュベートするステップ、 
    を含む、請求項１に記載の方法。 
  3. 　細胞集団が、接着細胞を含む、請求項１または２に記載の方法。 
  4. 　細胞集団が、筋芽細胞または心筋細胞を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。 
  5. 　凍結保護剤が、ＤＭＳＯである、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。 
  6. 　培養基材が、細胞接着性の培養面を有する、請求項２～５のいずれか一項に記載の方法。 
  7. 　培養基材が、温度応答性材料で被覆されている、請求項２～６のいずれか一項に記載の方法。 
  8. 　培養基材が、スフェロイド形成用の培養面を有する、請求項２～５のいずれか一項に記載の方法。 
  9. 　以下のステップ； 
    （Ａ）培養基材上で凍結保存された移植用細胞を含む細胞集団を解凍して凍結保護剤を含む細胞懸濁液を得るステップ、 
    （Ｂ）（Ａ）で得られた細胞懸濁液に培養用の培地を添加して凍結保護剤を希釈するステップ、 
    （Ｃ）（Ｂ）で得られた細胞懸濁液を、前記培養基材上で移植片形成培養するステップ、 
    を含む、移植片の製造方法。 
  10. 　移植片が、シート状細胞培養物である、請求項９に記載の方法。 
  11. 　移植用細胞が、筋芽細胞または心筋細胞である、請求項９または１０に記載の方法。
  12. 　移植用細胞が、培養基材の面積に対して、７．５×１０５個／ｃｍ２～３．０×１０６個／ｃｍ２の密度で細胞懸濁液中に存在する、請求項９～１１のいずれか一項に記載の方法。 
  13. 　細胞培養基材および該細胞培養基材上で凍結された凍結保存細胞を封入した保存容器１と、該保存容器１と閉鎖的に連結可能な、細胞培養用培地を封入した保存容器２とを含む、移植片製造キット。 
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