CN106146335A - 一种芳氧苯酸类衍生物及其作为fxr拮抗剂的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种芳氧苯酸类衍生物及其作为FXR拮抗剂的应用，具体是，提供了如式(Ⅰ)所示化合物或其药学上可接受的盐及其制备方法，其中：R₁选自羟基、甲氧基、乙氧基或氨基，R₂选自氢、卤素、硝基、羧基、甲氧基或甲基，X选自N或O，n1为0或1，n2为0或1。此外，式(Ⅰ)所示化合物或其药学上可接受的盐具有降血脂的药理作用，是一类FXR拮抗剂。

Description

一种芳氧苯酸类衍生物及其作为FXR拮抗剂的应用

技术领域

本发明属于新药设计及合成领域，具体地，涉及芳氧苯酸类衍生物、其制备方法及将其作为FXR拮抗剂的应用。

背景技术

心脑血管疾病是当前危害人类生命和健康最严重的病症，为中老年人的常见病和多发病，在许多国家是发病率和死亡率的首位。动脉粥样硬化是许多心脑血管疾病的基础，大量的实验和临床资料证明动脉粥样硬化和血脂代谢的异常密切相关。因此，血脂调节成为当前该类新药研究的重要领域。

通过前瞻性、随即和对照的临床研究，已经证明一些他汀类药物可以减少动脉粥样硬化和冠心病的发生，降低了冠心病所致的死亡率，降低了心肌梗死的发生率。进一步研究还证明降脂药物的治疗可以减少粥样硬化斑块内脂质的含量，加固纤维脂而稳定斑块，减少斑块破裂而引发的心肌梗死和脑梗死等等严重事件。此外，调血脂药还可恢复受损血管内皮细胞的功能，加强纤溶性和防止血栓形成，并且延缓人的动脉粥样硬化的进展并消退已形成的斑块。因此，积极使用调血脂药物治疗是减轻动脉粥样硬化和减少冠心病的发生的重要措施。

目前临床和常用的调节血脂的药物品种较多，例如他汀类，苯氧芳酸类，离子交换树脂或胆酸螯合剂，烟酸类以及其他调血脂类药物。其中他汀类药物(即HMG-CoA还原酶抑制剂)尤为引人注意。

他汀类药物是胆固醇合成酶的抑制剂。HMG-CoA在HMG-CoA还原酶的作用下转变为甲氧龙酸，他汀类药为化学结构的开放酸部分与HMG-CoA相似，它可竞争性抑制甲氧龙酸的形成，从而降低了胆固醇的合成，因而可以降低血液中胆固醇和低密度脂蛋白(LDL-C)水平。临床研究证明，冠心病患者即使血清中胆固醇和低密度脂蛋白的水平不很高或正常，他汀类药物可以预防动脉粥样硬化斑块的发生、发展和减少冠心病的严重临床事件。然而，长期服用除了他汀类药物有上腹不适等消化系统症状外，相当部分病人还会产生肝功能损害，转氨酶升高，肌肉疼痛，肌酸激酶升高等副反应。

FXR是配体激活的转录因子，调节靶基因的表达，研究发现胆汁酸为其天然配体，参与胆汁酸的代谢,因此也被称为胆汁酸受体；鹅脱氧胆酸(CDCA)为其最合适的天然配体。GW406是第一个人工合成的FXR配体。FXR除参与机体内胆汁酸的代谢，还对脂代谢和糖代谢等起着重要的调节作用。胆固醇代谢成胆汁酸主要有两条通路:1.经典通路是由CYP7A1催化，而且受胆汁酸的负反馈调节；2.替代通路是由CYP27A1催化，占人体总胆汁酸合成的18％，且作为经典通路的补充。经典代谢通路过程是胆固醇的氧化产物与LXR结合并诱导其与RXR形成二聚体，结合到DNA的LXR的反应原件上，激CYP7A1的表达，然后CYP7A1催化胆固醇生成胆汁酸，胆汁酸与FXR结合并诱导其与RXR形成二聚体，结合到DNA的FXR反应原件上，激活SHP的表达，而SHP与LRH-1结合抑制CYP7A1的表达，从而维持胆固醇的代谢平衡。FXR对甘油三酯代谢的调控机制体现在抑制TG的合成：FXR经SHP途径下调SREBP-1c，而SREBP-1c是参与脂肪合成基因的主要转录因子，可激活多种参与脂肪酸和甘油三酯合成的酶的转录，包括ACC、FAS等。最近的研究发现，FXR可以诱导脂肪细胞的分化，从而促进TG在脂肪细胞的储存。也有文献报道FXR拮抗剂降低TG的作用是通过下调SREBP-1c的方式实现的。

目前，报道的FXR拮抗剂大部分为甾体类化合物，包括Z-guggulsterone(GS)、CDRI/80-574、sulfated sterol和scalarane sesterterpene等。迄今为止，非甾体类FXR拮抗剂包括AGN34、取代的异噁唑衍生物。其中天然产物GS是FXR的一个高效拮抗剂，它能够减少小鼠体内低密度脂蛋白(LDL)和甘油三酷(TG)的水平但不能够改善高胆固醇病人的血装脂密度。FXR作为近几年来调节血脂领域出现的新靶点，凭借其独特的调节血脂机制，吸引了众多科研工作者的目光。因此，针对FXR研发出对混合型高脂血症有效的药物具有很大意义。

前期的酰胺类化合物、其制备方法及应用(CN 102838505 A)和酯类化合物、其制备方法和应用(CN 102093II6 A)两篇专利中已发明了大量化合物并证实体内降血脂作用，本专利中的发明以前期为基础，发明了一类芳氧苯酸类衍生物，以羧酸、羧酸酯及酰胺为代表，重点进行了体外FXR拮抗活性的研究，证实具有FXR拮抗作用，而大鼠体内实验证实具有降血脂作用。

发明内容

为开拓临床药物的资源，本发明选择合适的芳氧苯酸类化合物(尤其是吉非罗齐)与含氨基或羟基的苯甲酸或苯甲酸酯类化合物、含氨基或羟基的苯乙酸或苯乙酸酯类化合物，及其衍生物通过酰化反应缩合，以酰胺键或酯键的形式连接，从而提供了一类新型的FXR拮抗剂，用于降血脂药物的开发。

本发明的第一方面是提供如下式(Ⅰ)所示的化合物或其药学上可接受的盐，

其中：

R₁选自羟基、甲氧基、乙氧基、氨基。

R₂选自氢、卤素、硝基、羧基、甲氧基、甲基。

X选自N、O。

n1为0或1。

n2为0或1。

如式(I)所示，在R₂及基团可以是在苯环上的任意取代位置。

本发明中，如式(I)所示化合物的药学上可接受的盐较佳的为本发明化合物和碱性化合物反应生成的盐。所述的碱性化合物较佳的选自氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、碳酸钠或碳酸氢钾等。上述药学上可接受的盐容易分离，可采用常规分离方法提纯，如溶剂萃取、稀释、重结晶、柱色谱和制备薄层色谱等。

在本发明的第一方面中，式(I)所示的化合物优选为：

在本发明第二方面，本发明提供了如上式(I)所示化合物的制备方法，包括：将化合物23与化合物II，在碱催化下，在适当溶剂中反应得到，反应式见以下：

其中，R₁选自羟基、甲氧基、乙氧基或氨基；

R₂选自氢、卤素、硝基、羧基、甲氧基或甲基；

X选自N或O；

所述的碱为三乙胺、N,N-二异丙基乙胺、吡啶、氢氧化钠，

适当溶剂二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、二甲基甲酰胺、吡啶、二氧六环/水、或者其混合溶剂。

在一种优选的实施方式中，所述的碱选自三乙胺、吡啶或氢氧化钠；更优选三乙胺或氢氧化钠。

在一种优选的实施方式中，所述的适当溶剂选自：二氯甲烷、二氧六环/水。

参考文献，化合物23的制备通过将吉非罗齐溶于二氯甲烷中，加入定量催化剂-N,N二甲基甲酰胺搅拌，于常温下滴加草酰氯，反应一段时间得。

上述式(I)所示化合物的制备方法，本领域常规技术人员可以依照经验选取具体的操作步骤，例如：

将化合物23溶于第一溶剂中备用，将化合物II加于第二溶剂中，加入碱于室温下搅拌30-60分钟，再于冰浴下搅拌条件下滴加化合物23的备用溶液，滴加完毕后常温搅拌过夜，酸化后萃取经柱层析及得目标化合物；其中：第一溶剂选自二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、二甲基甲酰胺、吡啶、二氧六环；第二溶剂选自二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、二甲基甲酰胺、吡啶、二氧六环：水/1-10:1-10的混合溶液；加入的碱为三乙胺、N,N-二异丙基乙胺、吡啶、2N氢氧化钠溶液。

此外，上述本发明优选的化合物也还可以通过其他的合成方法得到，例如：

一种实施方式中，化合物5还可以通过如下方法合成：

将吉非罗齐溶于四氢呋喃中，加入碱搅拌30-60分钟，将4-(2-溴乙酰基)苯甲酸的四氢呋喃溶液于冰浴条件下缓慢滴加，常温搅拌过夜，酸化后萃取经柱层析及得化合物5。

其特征在于所加的碱为碳酸钾、碳酸钠、三乙胺、N,N-二异丙基乙胺。

一种实施方式中，化合物8还可以通过如下方法合成：

将化合物12溶于乙醇中，加入碱于80℃回流1-3小时，酸化萃取经柱层析及得化合物8。

另外一种实施方式，化合物11还可以通过如下方法合成：

将化合物8溶于二氯甲烷中，滴加1滴N,N-二甲基甲酰胺后于常温下滴加草酰氯搅拌2小时后，旋出溶剂及过量草酰氯，而后再溶于二氯甲烷中于冰浴条件下滴加于含有三乙胺的甲醇溶液中，滴加完毕后搅拌过夜，萃取经柱层析及得化合物11。

再一种实施方式，化合物22还可以通过如下方法合成：

将化合物27溶于二氯甲烷中，于冰浴条件下缓慢通入氨气搅拌，反应1小时后萃取经柱层析及得化合物22。

在本发明的第三方面，本发明提供了降血脂药物组合物，其中包括第一方面所述的式(I)所述的化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体。

根据治疗目的，可将药物组合物制成各种类型的给药单位剂型，如片剂、丸剂、粉剂、液体、悬浮液、乳液、颗粒剂、胶囊、栓剂和针剂(溶液及悬浮液)等。

在本发明的第四方面，本发明提供了将如式(I)所示化合物(I)或其药学上可接受的盐、或其药物组合物作为FXR拮抗剂的应用。

此外，本发明提供了将如式(I)所示化合物(I)或其药学上可接受的盐、或其药物组合物在调节血脂中的应用。

本发明的如式(I)所示的化合物及其药学上可接受的盐在药物组合物中的含量无特殊限制，可在很宽的范围内进行选择，通常可为质量百分比1-70％，较佳的为质量百分比1-30％。

本发明中，所述的药物组合物的给药方法没有特殊限制。可根据病人年龄、性别和其它条件及症状，选择各种剂型的制剂给药。例如，片剂、丸剂、溶液、悬浮液、乳液、颗粒剂和胶囊是口服给药；针剂可以单独给药，或者和注射用输送液(如葡萄糖溶液及氨基酸溶液)混合进行静脉注射，如有必要可以单纯用针剂进行肌肉、皮内、皮下或腹内注射；栓剂为给药到直肠。

本发明中，可以根据服药方法、病人年龄、性别和其它条件以及症状适当地选择用药剂量。通常的给药剂量可为：约0.1～300mg药物活性成分/kg体重/天。一般来说，每个给药单位剂型可含1～200mg的药物活性成分。

以下将通过具体实施例进一步阐述本发明，但并不用于限制本发明的保护范围。在不脱离本发明构思的前提下，本领域技术人员可在权利要求范围内对制备方法和使用仪器作出改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

具体实施方式

实施例1：5-(2,5-二甲基苯氧基)-2,2-二甲基戊酰氯的制备

将吉非罗齐25.3g溶于二氯甲烷150mL中，加入N,N-二甲基甲酰胺1mL搅拌，于0℃下滴加草酰氯19.0g，常温下反应3小时，旋出二氯甲烷，得目标化合物26.2g，收率97.5％。实施例2：4-(5-(2,5-二甲基苯氧基)-2,2-二甲基戊酰氧基)苯甲酸(化合物1)的制备

将5-(2,5-二甲基苯氧基)-2,2-二甲基戊酰氯2.68g溶于1,4-二氧六环15mL中备用，将对羟基苯甲酸1.38g加于1,4-二氧六环:水/1:1的15mL混合溶剂中，于0℃条件下加入2N氢氧化钠10mL，搅拌30分钟，再于0℃条件下滴加备用的溶液，继续搅拌10小时，酸化，乙酸乙酯萃取，无水硫酸镁干燥，柱层析，得目标化合物2.9g，收率78.4％。ESI-MSm/z:369[M-H]⁺.¹H-NMR(400MHz,DMSO)δ:7.99-7.97(d,2H,J＝8.0Hz),7.18-7.16(d,2H,J＝8.0Hz),6.98-6.96(d,1H,J＝8.0Hz),6.73(s,1H),6.64-6.62(d,1H,J＝8.0Hz),4.00-3.98(t,2H,J＝5.6Hz),2.II(s,3H),2.08(s,3H),1.98-1.79(m,4H),1.32(s,6H).

实施例3：3-(5-(2,5-二甲基苯氧基)-2,2-二甲基戊酰氧基)苯甲酸(化合物2)的制备

将5-(2,5-二甲基苯氧基)-2,2-二甲基戊酰氯2.68g溶于1,4-二氧六环15mL中备用，将间羟基苯甲酸1.38g加于1,4-二氧六环:水/1:1的15mL混合溶剂中，于0℃条件下加入2N氢氧化钠水溶液10mL，搅拌30分钟，再于0℃条件下滴加备用的溶液，继续搅拌10小时，酸化，乙酸乙酯萃取，无水硫酸镁干燥，柱层析，得目标化合物3.4g，收率91.9％。ESI-MS m/z:369[M-H]⁺.

实施例4：2-(5-(2,5-二甲基苯氧基)-2,2-二甲基戊酰氧基)苯甲酸(化合物3)的制备

将5-(2,5-二甲基苯氧基)-2,2-二甲基戊酰氯2.68g溶于1,4-二氧六环15mL中备用，将邻羟基苯甲酸1.38g加于1,4-二氧六环:水/1:1的15mL混合溶剂中，于0℃条件下加入2N氢氧化钠水溶液10mL，搅拌30分钟，再于0℃条件下滴加备用的溶液，继续搅拌10小时，酸化，乙酸乙酯萃取，无水硫酸镁干燥，柱层析，得目标化合物3.2g,收率86.5％。ESI-MS m/z:369[M-H]⁺.761[2M+Na-H]⁺.¹H NMR(400MHz,DMSO)δ13.08(s,1H),7.91(d,J＝7.8Hz,1H),7.61(t,J＝7.8Hz,1H),7.37(t,J＝7.8Hz,1H),7.06(d,J＝7.8Hz,1H),6.98(d,J＝7.4Hz,1H),6.73(s,1H),6.63(d,J＝7.4Hz,1H),3.98(t,J＝4.7Hz,2H),2.25(s,3H),2.09(s,3H),1.87–1.73(m,4H),1.31(s,6H).

实施例5：2-(4-(5-(2,5-二甲基苯氧基)-2,2-二甲基戊酰氧基)苯基)乙酸(化合物4)的制备

将5-(2,5-二甲基苯氧基)-2,2-二甲基戊酰氯2.68g溶于1,4-二氧六环15mL中备用，将对羟基苯乙酸1.52g加于1,4-二氧六环:水/1:1的15mL混合溶剂中，于0℃条件下加入2N氢氧化钠水溶液10mL，搅拌30分钟，再于0℃条件下滴加备用的溶液，继续搅拌10小时，酸化，乙酸乙酯萃取，无水硫酸镁干燥，柱层析，得目标化合物3.2g,收率83.3％。ESI-MS m/z:383[M-H]⁺.¹H NMR(400MHz,DMSO)δ12.35(s,1H),7.29(d,J＝8.6Hz,2H),6.99(d,J＝8.6Hz,2H),6.98(d,J＝7.3Hz,1H),6.74(s,1H),6.64(d,J＝7.3Hz,1H),3.99(t,J＝5.7Hz,2H),3.59(s,2H),2.25(s,3H),2.09(s,3H),1.85–1.72(m,4H),1.30(s,6H).

实施例6：4-(2-(5-(2,5-二甲基苯氧基)-2,2-二甲基戊酰氧基)乙酰基)苯甲酸(化合物5)的制备

将吉非罗齐2.68g和无水K₂CO₃2.76g加于四氢呋喃15mL中搅拌1小时，4-(2-溴乙酰基)苯甲酸2.43g的四氢呋喃溶液10mL用恒压滴液漏斗缓慢滴加于上述混合液中，20℃继续搅拌10小时，酸化，乙酸乙酯萃取，无水硫酸镁干燥，柱层析，得目标化合物2.3g,收率55.8％。ESI-MS m/z:411[M-H]⁺.¹H NMR(400MHz,DMSO)δ8.08(d,J＝8.4Hz,2H),8.04(d,J＝8.4Hz,2H),6.98(d,J＝7.4Hz,1H),6.73(s,1H),6.63(d,J＝7.4Hz,1H),5.50(s,2H),3.93(d,J＝4.2Hz,2H),2.25(s,3H),2.10(s,3H),1.75(s,4H),1.II(s,6H).

实施例7：4-(5-(2,5-二甲基苯氧基)-2,2-二甲基戊酰胺基)苯甲酸(化合物6)的制备

将5-(2,5-二甲基苯氧基)-2,2-二甲基戊酰氯2.68g溶于1,4-二氧六环15mL中备用，将对氨基苯甲酸1.37g加于1,4-二氧六环:水/1:1的15mL混合溶剂中，于0℃条件下加入2N氢氧化钠10mL，搅拌30分钟，再于0℃条件下滴加备用的溶液，继续搅拌10小时，酸化，乙酸乙酯萃取，无水硫酸镁干燥，柱层析，得目标化合物3.3g,收率89.4％。ESI-MSm/z:370[M+H]⁺.¹H-NMR(400MHz,DMSO)δ:12.68(s,1H),9.48(s,1H),7.86-7.88(d,2H,J＝8.0Hz),7.77-7.79(d,2H,J＝8.0Hz),6.95-6.97(d,1H,J＝8.0Hz),6.66(s,1H),6.59-6.61(d,1H,J＝8.0Hz),3.89-3.91(t,2H),2.20(s,3H),2.06(s,3H),1.66-1.78(m,4H),1.25(s,6H).

实施例8：3-(5-(2,5-二甲基苯氧基)-2,2-二甲基戊酰胺基)苯甲酸(化合物7)的制备

将5-(2,5-二甲基苯氧基)-2,2-二甲基戊酰氯2.68g溶于1,4-二氧六环15mL中备用，将间氨基苯甲酸1.37g加于1,4-二氧六环:水/1:1的15mL混合溶剂中，于0℃条件下加入2N氢氧化钠10mL，搅拌30分钟，再于0℃条件下滴加备用的溶液，继续搅拌10小时，酸化，乙酸乙酯萃取，无水硫酸镁干燥，柱层析，得目标化合物3.5g,收率94.9％。ESI-MSm/z:384[M+H]⁺.¹H NMR(400MHz,DMSO)δ12.75(s,1H),9.43(s,1H),8.27(s,1H),7.93(d,J＝8.2Hz,1H),7.63(d,J＝7.8Hz,1H),7.41(t,J＝7.9Hz,1H),6.96(d,J＝7.5Hz,1H),6.67(s,1H),6.60(d,J＝7.6Hz,1H),3.90(t,J＝5.8Hz,2H),2.21(s,3H),2.07(s,3H),1.85–1.73(m,2H),1.65(dd,J＝11.6,6.1Hz,2H),1.25(s,6H).

实施例9：2-(5-(2,5-二甲基苯氧基)-2,2-二甲基戊酰胺基)苯甲酸(化合物8)的制备

将5-(2,5-二甲基苯氧基)-2,2-二甲基戊酰氯2.68g溶于二氯甲烷15mL中备用，将邻氨基苯甲酸乙酯1.65g加于二氯甲烷15mL中，于0℃条件下加入三乙胺4.2mL，搅拌30分钟，再于0℃条件下滴加备用的溶液，继续搅拌10小时，稀盐酸酸化，乙酸乙酯萃取，无水硫酸镁干燥，旋干萃取液后加入乙醇30mL和氢氧化钠0.8g于80℃回流2小时，旋出溶剂，稀盐酸酸化至PH2，乙酸乙酯萃取，无水硫酸镁干燥，旋干后柱层析，得目标化合物2.9g,收率78.6％。ESI-MS m/z:370[M+H]⁺.392[M+Na]⁺.H NMR(400MHz,DMSO)δ11.56(s,1H),8.63(d,J＝8.0Hz,1H),8.01(d,J＝8.0Hz,1H),7.66–7.51(t,J＝7.6Hz,1H),7.14(t,J＝7.6Hz,1H),6.94(d,J＝7.5Hz,1H),6.64(s,1H),6.59(d,J＝7.4Hz,1H),3.89(t,J＝5.9Hz,2H),2.20(s,3H),2.04(s,3H),1.81–1.57(m,4H),1.27(s,6H).

实施例10：2-(4-(5-(2,5-二甲基苯氧基)-2,2-二甲基戊酰胺基)苯基)乙酸(化合物9)的制备

将5-(2,5-二甲基苯氧基)-2,2-二甲基戊酰氯2.68g溶于1,4-二氧六环15mL中备用，将对氨基苯乙酸1.52g加于1,4-二氧六环:水/1:1的15mL混合溶剂中，于0℃条件下加入2N氢氧化钠水溶液10mL，搅拌30分钟，再于0℃条件下滴加备用的溶液，继续搅拌10小时，酸化，乙酸乙酯萃取，无水硫酸镁干燥，柱层析，得目标化合物3.4g,收率88.7％。ESI-MS m/z:384[M+H]⁺.406[M+Na]⁺.¹H NMR(400MHz,DMSO)δ9.17(s,1H),7.55(d,J＝8.4Hz,2H),7.16(d,J＝8.4Hz,2H),6.97(d,J＝7.5Hz,1H),6.68(s,1H),6.61(d,J＝7.4Hz,1H),3.91(t,J＝6.1Hz,2H),3.49(s,2H),2.22(s,3H),2.08(s,3H),1.85–1.58(m,4H),1.23(s,6H).

实施例11：4-(2-(5-(2,5-二甲基苯氧基)-2,2-二甲基戊酰胺基)乙酰基)苯甲酸(化合物10)的制备

将4-(2-溴乙酰基)苯甲酸2.43g和六次甲基四胺1.40g加于四氢呋喃20mL中，20℃条件下搅拌6小时，抽滤后将滤饼加入无水乙醇20mL中，向该混合液中加入4mL浓盐酸，45℃下搅拌2小时，冷却抽滤，5mL无水乙醇洗涤，烘干后加于15mL二氯甲烷中，再于0℃向该混合液中加入三乙胺4.2mL,缓慢滴入预先制备的10mL的5-(2,5-二甲基苯氧基)-2,2-二甲基戊酰氯2.68g,搅拌12小时后酸化，萃取，无水硫酸镁干燥，旋干后柱层析，得目标化合物1.2g，29.2％。ESI-MS m/z:410[M-H]⁺.¹H NMR(400MHz,DMSO)δ8.02(q,J＝8.5Hz,4H),7.92(t,J＝5.5Hz,1H),6.98(d,J＝7.5Hz,1H),6.71(s,1H),6.62(d,J＝7.4Hz,1H),4.54(d,J＝5.5Hz,2H),3.88(t,J＝5.5Hz,2H),2.25(s,3H),2.10(s,3H),1.82–1.50(m,4H),1.14(s,6H).

实施例12：2-(5-(2,5-二甲基苯氧基)-2,2-二甲基戊酰胺基)苯甲酸甲酯(化合物11)的制备

将2-(5-(2,5-二甲基苯氧基)-2,2-二甲基戊酰胺基)苯甲酸(化合物8)3.69g溶于二氯甲烷30mL中，加入N,N-二甲基甲酰胺0.5mL搅拌，于0℃下滴加草酰氯，常温下反应5小时，旋出过量的二氯甲烷草酰氯后再加于25mL二氯甲烷中，于0℃下滴入10mL甲醇和2.1mL的三乙胺混合液中搅拌12小时。稀盐酸酸化，无水硫酸镁干燥，柱层析，得目标化合物3.1g,收率80.9％。ESI-MS m/z:384[M+H]⁺.¹H NMR(400MHz,DMSO)δ11.08(s,1H),8.56(dd,J＝8.5,0.9Hz,1H),7.98(dd,J＝8.0,1.6Hz,1H),7.72–7.54(m,1H),7.26–7.08(m,1H),6.94(d,J＝7.5Hz,1H),6.64(s,1H),6.58(d,J＝7.5Hz,1H),3.90(d,J＝6.1Hz,2H),3.88(s,3H),2.20(s,3H),2.04(s,3H),1.79–1.73(m,2H),1.71–1.64(m,2H),1.28(s,6H).

实施例13：2-(5-(2,5-二甲基苯氧基)-2,2-二甲基戊酰胺基)苯甲酸乙酯(化合物12)的制备

将5-(2,5-二甲基苯氧基)-2,2-二甲基戊酰氯2.68g溶于二氯甲烷15mL中备用，将邻氨基苯甲酸乙酯1.65g加于二氯甲烷15mL中，于0℃条件下加入三乙胺4.2mL，搅拌30分钟，再于0℃条件下滴加备用的溶液，继续搅拌10小时，稀盐酸酸化，乙酸乙酯萃取，无水硫酸镁干燥，柱层析，得目标化合物3.3g,收率89.4％。ESI-MS m/z:398[M+H]⁺.420[M+Na]⁺.¹H NMR(400MHz,DMSO)δ11.13(s,1H),8.57(d,J＝8.4Hz,1H),8.00(d,J＝6.8Hz,1H),7.62(t,J＝6.8Hz,1H),7.17(t,J＝8.4Hz,1H),6.95(d,J＝7.4Hz,1H),6.65(s,1H),6.59(d,J＝7.4Hz,1H),4.35(q,J＝7.1Hz,2H),3.90(t,J＝5.0Hz,2H),2.20(s,3H),2.04(s,3H),1.79–1.73(m,2H),1.71–1.64(m,2H),1.34(t,J＝7.1Hz,3H),1.28(s,6H).

实施例14：2-(5-(2,5-二甲基苯氧基)-2,2-二甲基戊酰胺基)-6-甲基苯甲酸(化合物13)的制备

将5-(2,5-二甲基苯氧基)-2,2-二甲基戊酰氯2.68g溶于1,4-二氧六环15mL中备用，将2-氨基-6-甲基苯甲酸1.51g加于1,4-二氧六环:水/1:1的15mL混合溶剂中，于0℃条件下加入2N氢氧化钠10mL，搅拌30分钟，再于0℃条件下滴加备用的溶液，继续搅拌10小时，酸化，乙酸乙酯萃取，无水硫酸镁干燥，柱层析，得目标化合物3.5g,收率91.4％。ESI-MS m/z:382[M-H]⁺.¹H NMR(400MHz,DMSO)δ9.82(s,1H),7.79(d,J＝8.4Hz,1H),7.34(t,J＝7.7Hz,1H),7.05(d,J＝7.7Hz,1H),6.97(d,J＝7.4Hz,1H),6.68(s,1H),6.61(d,J＝7.4Hz,1H),3.91(t,J＝5.2Hz,2H),2.41(s,3H),2.23(s,3H),2.07(s,3H),1.77–1.61(m,4H),1.22(s,6H).

实施例15：2-(5-(2,5-二甲基苯氧基)-2,2-二甲基戊酰胺基)-6-氟苯甲酸(化合物14)的制备

将5-(2,5-二甲基苯氧基)-2,2-二甲基戊酰氯2.68g溶于1,4-二氧六环15mL中备用，将2-氨基-6-氟苯甲酸1.55g加于1,4-二氧六环:水/1:1的15mL混合溶剂中，于0℃条件下加入2N氢氧化钠10mL，搅拌30分钟，再于0℃条件下滴加备用的溶液，继续搅拌10小时，酸化，乙酸乙酯萃取，无水硫酸镁干燥，柱层析，得目标化合物3.1g,收率80.1％。ESI-MS m/z:386[M-H]⁺.¹H NMR(400MHz,DMSO)δ10.65(s,1H),8.07(d,J＝8.4Hz,1H),7.54(dd,J＝14.6,8.4Hz,1H),7.15(dd,J＝14.4,8.2Hz,1H),6.95(d,J＝7.6Hz,1H),6.66(s,1H),6.56(d,J＝8.4Hz,1H),3.90(t,J＝5.7Hz,2H),2.21(s,3H),2.06(s,3H),1.78–1.62(m,4H),1.II(s,6H).

实施例16：2-(5-(2,5-二甲基苯氧基)-2,2-二甲基戊酰胺基)-5-甲基苯甲酸(化合物15)的制备

将5-(2,5-二甲基苯氧基)-2,2-二甲基戊酰氯2.68g溶于1,4-二氧六环15mL中备用，将2-氨基-5-甲基苯甲酸1.51g加于1,4-二氧六环:水/1:1的15mL混合溶剂中，于0℃条件下加入2N氢氧化钠10mL，搅拌30分钟，再于0℃条件下滴加备用的溶液，继续搅拌10小时，酸化，乙酸乙酯萃取，无水硫酸镁干燥，柱层析，得目标化合物3.7g,收率96.7％。ESI-MS m/z:382[M-H]⁺.¹H NMR(400MHz,DMSO)δ11.43(s,1H),8.52(d,J＝8.5Hz,1H),7.82(s,1H),7.40(dd,J＝8.7,2.0Hz,1H),6.95(d,J＝7.5Hz,1H),6.64(s,1H),6.59(d,J＝7.5Hz,1H),3.89(t,J＝5.9Hz,2H),2.29(s,3H),2.20(s,3H),2.04(s,3H),1.78–1.71(m,2H),1.70–1.62(m,2H),1.26(s,6H).

实施例17：2-(5-(2,5-二甲基苯氧基)-2,2-二甲基戊酰胺基)-5-氟苯甲酸(化合物16)的制备

将5-(2,5-二甲基苯氧基)-2,2-二甲基戊酰氯2.68g溶于1,4-二氧六环15mL中备用，将2-氨基-5氟苯甲酸1.51g加于1,4-二氧六环:水/1:1的15mL混合溶剂中，于0℃条件下加入2N氢氧化钠10mL，搅拌30分钟，再于0℃条件下滴加备用的溶液，继续搅拌10小时，酸化，乙酸乙酯萃取，无水硫酸镁干燥，柱层析，得目标化合物3.4g,收率87.9％。ESI-MS m/z:386[M-H]⁺.¹H NMR(400MHz,DMSO)δ11.37(s,1H),8.63(dd,J＝9.4,5.2Hz,1H),7.71(dd,J＝9.4,3.2Hz,1H),7.56–7.40(m,1H),6.94(d,J＝7.6Hz,1H),6.63(s,1H),6.58(d,J＝7.6Hz,1H),3.89(t,J＝5.9Hz,2H),2.20(s,3H),2.04(s,3H),1.78–1.60(m,4H),1.26(s,6H).

实施例18：2-(5-(2,5-二甲基苯氧基)-2,2-二甲基戊酰胺基)对苯二甲酸(化合物17)的制备

将5-(2,5-二甲基苯氧基)-2,2-二甲基戊酰氯2.68g溶于1,4-二氧六环15mL中备用，将2-氨基对苯二甲酸1.81g加于1,4-二氧六环:水/1:1的15mL混合溶剂中，于0℃条件下加入2N氢氧化钠20mL，搅拌30分钟，再于0℃条件下滴加备用的溶液，继续搅拌10小时，酸化，乙酸乙酯萃取，无水硫酸镁干燥，柱层析，得目标化合物3.9g,收率94.4％。ESI-MS m/z:412[M-H]⁺.¹H NMR(400MHz,DMSO)δ11.51(s,1H),9.20(d,J＝1.6Hz,1H),8.08(d,J＝8.2Hz,1H),7.66(dd,J＝8.2,1.7Hz,1H),6.92(d,J＝7.4Hz,1H),6.63(s,1H),6.56(d,J＝7.4Hz,1H),3.90(t,J＝5.7Hz,2H),2.19(s,3H),2.03(s,3H),1.77–1.64(m,4H),1.28(s,6H).

实施例19：2-(5-(2,5-二甲基苯氧基)-2,2-二甲基戊酰胺基)-4-甲氧基苯甲酸(化合物18)的制备

将5-(2,5-二甲基苯氧基)-2,2-二甲基戊酰氯2.68g溶于1,4-二氧六环15mL中备用，将2-氨基-4甲氧基苯甲酸1.67g加于1,4-二氧六环:水/1:1的15mL混合溶剂中，于0℃条件下加入2N氢氧化钠10mL，搅拌30分钟，再于0℃条件下滴加备用的溶液，继续搅拌10小时，酸化，乙酸乙酯萃取，无水硫酸镁干燥，柱层析，得目标化合物3.6g,收率90.2％。ESI-MS m/z:398[M-H]⁺.

实施例20：2-(5-(2,5-二甲基苯氧基)-2,2-二甲基戊酰胺基)-4-氯苯甲酸(化合物19)的制备

将5-(2,5-二甲基苯氧基)-2,2-二甲基戊酰氯2.68g溶于1,4-二氧六环15mL中备用，将2-氨基-4氯苯甲酸1.71g加于1,4-二氧六环:水/1:1的15mL混合溶剂中，于0℃条件下加入2N氢氧化钠10mL，搅拌30分钟，再于0℃条件下滴加备用的溶液，继续搅拌10小时，酸化，乙酸乙酯萃取，无水硫酸镁干燥，柱层析，得目标化合物3.4g,收率84.4％。ESI-MS m/z:402[M-H]⁺.¹H NMR(400MHz,DMSO)δ11.67(s,1H),8.72(s,1H),8.00(d,J＝8.6Hz,1H),7.20(dd,J＝8.6,2.2Hz,1H),6.98(d,J＝7.5Hz,1H),6.93(d,J＝7.6Hz,1H),6.70(s,1H),6.63(s,1H),6.58(t,J＝6.0Hz,1H),3.90(d,J＝4.1Hz,2H),2.20(s,3H),2.03(s,3H),1.78–1.71(m,2H),1.68–1.64(m,2H),1.27(s,6H).

实施例21：2-(5-(2,5-二甲基苯氧基)-2,2-二甲基戊酰胺基)-4-溴苯甲酸(化合物20)的制备

将5-(2,5-二甲基苯氧基)-2,2-二甲基戊酰氯2.68g溶于1,4-二氧六环15mL中备用，将2-氨基-4溴苯甲酸2.16g加于1,4-二氧六环:水/1:1的15mL混合溶剂中，于0℃条件下加入2N氢氧化钠10mL，搅拌30分钟，再于0℃条件下滴加备用的溶液，继续搅拌10小时，酸化，乙酸乙酯萃取，无水硫酸镁干燥，柱层析，得目标化合物3.9g,收率87.1％。ESI-MS m/z:446[M-H]⁺.¹H NMR(400MHz,DMSO)δ11.72(s,1H),8.87(s,1H),7.92(d,J＝8.5Hz,1H),7.33(dd,J＝8.5,2.1Hz,1H),6.93(d,J＝7.5Hz,1H),6.63(s,1H),6.57(d,J＝7.5Hz,1H),3.90(t,J＝5.9Hz,2H),2.20(s,3H),2.03(s,3H),1.80–1.71(m,2H),1.71–1.62(m,2H),1.26(s,6H).

实施例22：2-(5-(2,5-二甲基苯氧基)-2,2-二甲基戊酰胺基)-4-硝基苯甲酸(化合物21)的制备

将5-(2,5-二甲基苯氧基)-2,2-二甲基戊酰氯2.68g溶于1,4-二氧六环15mL中备用，将2-氨基-4硝基苯甲酸1.82g加于1,4-二氧六环:水/1:1的15mL混合溶剂中，于0℃条件下加入2N氢氧化钠10mL，搅拌30分钟，再于0℃条件下滴加备用的溶液，继续搅拌10小时，酸化，乙酸乙酯萃取，无水硫酸镁干燥，柱层析，得目标化合物3.6g,收率87.0％。实施例23：2-(5-(2,5-二甲基苯氧基)-2,2-二甲基戊酰胺基)苯甲酰胺(化合物22)的制备

将2-(5-(2,5-二甲基苯氧基)-2,2-二甲基戊酰胺基)苯甲酸(化合物8)3.69g溶于二氯甲烷30mL中，加入N,N-二甲基甲酰胺0.5mL搅拌，于0℃下滴加草酰氯，常温下反应5小时，旋出二氯甲烷过量的草酰氯后再加于30mL二氯甲烷中，于0℃下通入氨气1小时，稀盐酸酸化洗，饱和碳酸氢钠水溶液洗，饱和氯化钠水溶液洗，无水硫酸镁干燥，柱层析，得目标化合物3.3g，收率89.7％。ESI-MS m/z:370[M+H]⁺.¹H NMR(400MHz,DMSO)δ11.55(s,1H),8.63(d,J＝7.6Hz,1H),8.01(d,J＝6.4Hz,1H),7.68–7.51(m,1H),7.14(t,J＝8.2Hz,1H),6.95(d,J＝11.5Hz,1H),6.65(s,1H),6.59(d,J＝7.1Hz,1H),3.90(t,J＝5.9Hz,2H),2.20(s,3H),2.04(s,3H),1.85–1.53(m,4H),1.27(s,6H).

实施例24：FXR拮抗活性测试

所用试剂材料供应商如下：

1.基本缓冲液的配制

a.准备20ml 1x基本缓冲液，混合后待用。缓冲液详细列表如下：

材料	终浓度(mM)
		Tris-Hcl	20
EDTA	1
		glycerol	10％
Triton X-100	0.0025％
		KF	400
BSA	0.01％
		Sodium Molybdate	10
DTT	5
		H2O	补足到20ml

2.化合物溶液的配制

a.对于对照化合物GS，先用100％DMSO稀释成30mM母液，然后按3倍稀释到所需终浓度。

b.对于待检测化合物，先用100％DMSO稀释成20mM母液，然后按3倍稀释到所需终浓度。

c.对于激活化合物GW4064，用100％DMSO稀释成520uM母液，然后加5nl到384孔板各孔中(不包括低值孔)待用，其终浓度达到130nM。

3.1x蛋白混合液的配制

a.按每孔需要10ul溶液计算，首先用1x基本缓冲液准备2xFXR-LBD/Eu Anti-GST蛋白溶液，使GST-FXR-LBD蛋白溶液终浓度达到3nM。详表如下：

材料	终浓度(mM)
		GST-FXR-LBD	3
Eu Anti-GST(nl)	50nl/孔

b.按每孔需要10ul溶液计算，首先用1x基本缓冲液准备2xFXR Biotin-SRC1/SA-APC多肽溶液，使SRC1多肽溶液终浓度达到500nM。详表如下：

材料	终浓度(mM)
		Biotin-Peptide	500
SA-APC	50nl/孔

c.把以上两种2x GST-ER/Eu Anti-GST溶液和2x peptide/SA-APC溶液按体积1：1混合均匀，待用。

d.将1x蛋白混合溶液加入384孔板每个孔，每孔加20ul。

e.将384孔板放入离心机室温1000转离心10秒，取出。

f.将384孔板在室温放置3小时后读数。

4.TR-FRET assay读数

将384板放入EnVision多功能酶标仪读数。

5.结果处理

a.读数665和615(nm)值，并以615值做校正值，最终数值表示为665值/615值。

b.计算抑制率(％)

根据以下公式计算抑制率(％)

$\%\mathrm{Inhibition}=\left(\frac{\mathrm{Max}-X}{\mathrm{Max}-\mathrm{Min}}\right)\×100\%$

X是每个浓度的“665值比615值”。Min是只加DMSO的空白对照孔的“665值比615值”平均值。Max是只加激活化合物和DMSO的高信号对照孔的“665值比615值”平均值。

实验结果：

实施例25：片剂的制备

处方：	用量
		化合物1	50mg
微晶纤维素	250mg
		交联聚乙烯吡咯烷酮	50mg
预胶化淀粉	100mg
		硬脂酸镁	5mg

制备方法：按上述配方，将粉碎过筛后的化合物1、微晶纤维素、预胶化淀粉和交联聚乙烯吡咯烷酮均匀混合，然后与5％乙醇溶液混合，制粒、干燥，之后再与润滑剂混合，压片即可。其中，所述的化合物1粉碎过筛为过60目筛；所述的微晶纤维素、预胶化淀粉和交联聚乙烯吡咯烷酮粉碎过筛为过80目筛；所述的制粒的颗粒粒径大小为20目；所述的干燥的温度较佳的为90℃控制水分质量百分比3％以内。

实施例28：胶囊的制备

制备方法：按上表配方，将药物与辅料各原料混匀，填充至胶囊壳中即可。

实施例26：注射剂制备

制备方法：按上述配方，使用乳钵，将化合物或其盐与润湿剂研磨混合均匀，然后与助悬剂、防腐剂和注射用水均匀混合，再研磨即可。其中，所述的研磨的颗粒大小为0.5μm。实施例27：化合物降血脂药效学研究

试剂及批号：

猪油 市售

胆固醇 上海蓝季科技发展有限公司 批号：090720

丙基硫氧嘧啶 上海蓝季科技发展有限公司 批号：090505

脱氧胆酸 上海蓝季科技发展有限公司 批号：090615

吐温80 CP 国药集团化学试剂有限公司 批号：F20090507

1,2-丙二醇 国药集团化学试剂有限公司 AR 批号：T20070125

脂肪乳剂制备方法：取猪油25g，放在200ml的烧杯里，放在煤气灶上加热,待温度升到100℃时,加入10g胆固醇,溶化,再加入1g丙硫氧嘧啶,充分搅匀,然后加入25ml吐温80,制成油相。同时在另一烧杯中加入30ml蒸馏水和1,2－丙二醇20ml,放在水浴锅中加热至60℃,然后加入2g脱氧胆酸钠,充分搅拌直到完全溶解,制成水相。然后将水相加入油相,充分混匀,即制成脂肪乳剂。

动物适应性喂养3天，根据体重分出6只作为空白对照组(Control)，其余动物每天上午9:00-11:00灌胃脂肪乳，1ml/100g体重，连续灌胃2周。再根据体重将给予脂肪乳剂的动物分为模型组(Model)阳性药组和给药组，每组动物数量根据化合物总量确定。

继续灌胃脂肪乳剂，同时阳性药组给予Sim(10mg/kg)和SIPI-762380mg/kg，给药组剂量分别为80、20mg/kg，模型组给予等体积溶剂。于分组当日开始口服给药，每天下午3:00-4:00给药。每周一称量体重，观察动物情况。连续给药14天，动物禁食12h，眼眶采血1ml。进行血脂测定。

采用日立自动生化分析仪7080测定血清胆固醇(CHO)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-c)和高密度脂蛋白(HDL-c)。

给药后大鼠血脂水平(X±SD，mmol/L)

Claims (12)

1.如式(Ⅰ)所示化合物或其药学上可接受的盐，

其中：

R₁选自羟基、甲氧基、乙氧基或氨基，

R₂选自氢、卤素、硝基、羧基、甲氧基或甲基，

X选自N或O，

n1为0或1，

n2为0或1。

2.如权利要求1所述化合物或其药学上可接受的盐，其中，n1为0。

3.如权利要求1所述化合物或其药学上可接受的盐，其中，n1为1。

4.如权利要求1-3任意一项所述的式I所示化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，R₂及基团是在苯环上的任意取代位置。

5.如权利要求1-4任意一项所述的式I所示化合物或其药学上可接受的盐，其为但不限于下列化合物：

6.权利要求1-5任意一项如式(Ⅰ)所示的化合物的合成方法，包括将化合物23与化合物II，在碱催化下，在适当溶剂中反应得到，反应式见以下：

其中，R₁选自羟基、甲氧基、乙氧基或氨基；

R₂选自氢、卤素、硝基、羧基、甲氧基或甲基；

X选自N或O；

所述的碱为三乙胺、N,N-二异丙基乙胺、吡啶、氢氧化钠，

适当溶剂二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、二甲基甲酰胺、吡啶、二氧六环/水、或者其混合溶剂。

7.根据权利要求6的合成方法，其中，所述的碱为三乙胺、吡啶或氢氧化钠。

8.根据权利要求7的合成方法，其中，所述的碱为三乙胺或氢氧化钠。

9.包含权利要求1-5任意一项所述的式(I)所示化合物或其药学上可接受的盐和药学上可接受载体的药物组合物。

10.如权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，其为片剂、丸剂、粉剂、液体、悬浮液、乳液、颗粒剂、胶囊、栓剂或针剂形式。

11.如权利要求1-5任意一项所述的化合物(I)或其药学上可接受的盐、或其药物组合物作为FXR拮抗剂的应用。

12.如权利要求1-5任意一项所述的化合物(I)或其药学上可接受的盐、或其药物组合物在调节血脂中的应用。