CN106117321A

CN106117321A - 一种抗肿瘤多肽及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN106117321A
Application number: CN201610494568.2A
Authority: CN
Inventors: 马克里; 黄晓华; 李颖; 栾明春; 王聪聪; 何欣; 马晓光; 张巧姝
Original assignee: Dalian Medical University
Current assignee: Dalian Medical University
Priority date: 2016-06-29
Filing date: 2016-06-29
Publication date: 2016-11-16

Abstract

本发明涉及一种具有抗肿瘤作用的多肽及其制备方法和应用。本发明所述的抗肿瘤多肽由21个氨基酸组成，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明多肽利用固相化学合成法合成，产量高，工艺稳定，分子量为2265.15Da。本发明多肽具有抑制肿瘤细胞增殖和浸润转移的活性，且治疗肿瘤安全有效，在临床抗肿瘤治疗上具有重要的应用价值。

Description

一种抗肿瘤多肽及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种多肽及其制备方法和应用，特别涉及一种具有抗肿瘤作用的多肽及其制备方法和应用，属于生物制药领域。

背景技术

恶性肿瘤是一类严重威胁人类健康和生命的疾病，浸润转移是恶性肿瘤主要生物学特征之一，也是恶性肿瘤难于治愈最终导致病人死亡的主要原因。肿瘤在体内的转移是一系列连续的细胞移行过程，包括瘤细胞从原发瘤的脱落、瘤细胞向周围组织浸润及在组织中的迁移、瘤细胞穿透血管壁进入血液循环、瘤细胞经血液循环到达转移靶器官以及转移瘤的形成等。因此，弄清楚恶性肿瘤浸润转移的分子机制，寻找抑制肿瘤浸润转移的药物靶点，设计新型高效的、低毒的抗肿瘤转移药物，以提高恶性肿瘤病人临床治愈率及提高生存率，是目前恶性肿瘤治疗的重要策略之一。

目前已发现多种有抗肿瘤作用多肽，有的已进入临床前实验阶段，但抑制肿瘤转移的多肽报道很少。有研究发现，MANS肽(肉豆蔻基富含丙氨酸n末端序列)能有效阻止肿瘤细胞的运动。MANS肽能抑制小鼠肺癌细胞移动或转移。研究分析，当MANS肽被一种蛋白激酶(蛋白质-肉豆蔻基富含丙氨酸C激酶)被激活时，它结合细胞骨架，也结合肌动蛋白以及细胞膜。使肌动蛋白的运动转化成细胞的运动。伊利诺伊大学的研究者发现大豆肽lunasin可以明显降低其结肠癌的转移，给小鼠口服20mg的大豆肽lunasin可以降低94％的转移性肿瘤；lunasin同化疗药物奥沙利铂一起联合使用可产生更为明显的结果，可以使得肝脏中的转移性肿瘤降低6倍。研究者深入研究揭示，lunasin可以渗入到癌细胞中引发其死亡，而且可以和至少一种转移性癌细胞上的受体进行结合。

多肽类药物具有分子量小、低毒性、高活性、无免疫原性、易于穿透肿瘤细胞等特点，且能以多种方式给药、易于多途径吸收。多肽药物对人类的健康正做出越来越大的贡献。有科学家提出21世纪将是多肽的世纪，多肽产业将是21世纪的“朝阳产业”。

发明内容

本发明的目的是基于抗肿瘤多肽分子设计理论和固相化学合成技术，提供一种具有高效、低毒的抗肿瘤活性的多肽。

本发明提供一种抗肿瘤多肽，所述抗肿瘤多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。分子量为2265.15Da。

本发明还提供上述的抗肿瘤多肽在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明还提供所述的抗肿瘤多肽的制备方法，所述抗肿瘤多肽可以采用固相化学合成法直接获得。

在优先的技术方案中，采用固相化学合成法合成本发明的抗肿瘤多肽，包括如下步骤：

(1)将Fmoc保护氨基酸在Fmoc-Rink Linker-树脂上按预先设计的顺序从C端到N端逐个进行偶合并去除Fmoc保护基，得连接有树脂的多肽链；

(2)步骤(1)得到的多肽链中加入裂解液，在25～35℃温度下裂解2-4h，抽滤，滤液经纯化得到多肽粗品。

进一步地，在步骤(1)中将Fmoc保护氨基酸在Fmoc-Rink Linker-树脂上偶合的并去除Fmoc保护基的方法为：称取Fmoc-Rink Linker-树脂放入反应器中，加入DCM，加入Fmoc保护氨基酸和DIEA，用氮气鼓泡反应3h，然后加入甲醇和DIEA，反应半小时，抽掉反应液，用DMF、DCM洗净，加入适量哌啶去除Fmoc保护基，得连接有树脂的多肽链。

进一步地，步骤(2)中所述的裂解液为87.5％的TFA水溶液。

进一步地，步骤(2)中所述的滤液的纯化包括如下步骤：滤液中加入冰乙醚使多肽沉降出来，离心得到多肽粗品。

在上述步骤(1)中在树脂上偶合每一个氨基酸并去除Fmoc保护基后，用茚三酮检测是否已连接有氨基酸。以此类推，按照本发明给出的多肽氨基酸的顺序从C端到N端逐个引入氨基酸，得到连接有树脂的多肽链。

对于上述制备方法获得的本发明的抗肿瘤多肽粗品用质谱仪检测该序列分子量的正确性，用高效液相色谱进一步提纯。

采用划痕法、Boyden小室培养法，观察了本发明多肽对人结肠癌sw620细胞、sw480细胞、乳腺癌MDA-MB-231细胞等不同组织来源的肿瘤细胞贴壁生长、体外迁移运动等的影响。结果证实，本发明多肽具有直接抑制肿瘤细胞体外迁移运动的活性。其抑制肿瘤细胞体外迁移运动的活性随浓度增加而升高，50ug/mL浓度完全抑制各种肿瘤细胞体外迁移运动。

采用MTT试验观察了本发明多肽对人结肠癌sw620细胞、细胞和乳腺癌MDA-MB-231细胞，等不同组织来源的肿瘤细胞增殖的活性。结果证明，本发明多肽具有直接抑制肿瘤细胞增殖的活性。且抑制作用随多肽处理浓度升高而增强。本发明多肽60ug/mL时对细胞增殖抑制率达48％(sw620)和sw480的抑制率达39％(MDA-MB-231细胞)。

用本发明多肽处理人结肠癌sw620细胞和MDA-MB-231细胞，采用细胞荧光组化等技术观察了本发明多肽对不同组织来源的肿瘤细胞生长形态的影响及诱导凋亡的作用。研究结果证明，用本发明多肽处理肿瘤细胞72小时后，细胞胞体发生收缩，形态变得不规则，细胞胞浆中出现颗粒和空泡，最后从培养板脱落。采用FITC-Annexin V和Hoechst 33258荧光染料作为检测凋亡的探针，检测本发明多肽对肿瘤细胞诱导凋亡的作用。结果显示，60ug/mL多肽处理细胞72后，部分细胞FITC-Annexin V结合阳性，胞内出现凋亡小体，说明本发明多肽可诱导肿瘤细胞凋亡。

采用腹水型小鼠肝癌细胞株Hca细胞皮下接种，观察本发明多肽对肿瘤细胞皮下成瘤的影响。结果显示，皮下肿瘤的形成和生长受到明显的抑制。与对照组相比，本发明多肽对肿瘤生长的抑制达到77.87％。上述研究结果说明，本发明多肽可用于体内肿瘤的治疗。

本发明的有益效果：

本发明公开一种由21个氨基酸组成的多肽，其特点是分子量小，是目前发现的具有抗肿瘤作用的最短的多肽。分子量小，易于固相化学合成，结构稳定。与体内细胞表面表达的天然蛋白质结构类似，因此无免疫原性；同时具有抑制肿瘤细胞增殖及细胞转移的生物活性，并且治疗肿瘤安全有效，可作为抗肿瘤药物。

本发明的多肽具有高效、低毒的抗肿瘤活性，且可采用固相化学合成法合成，产量高，工艺稳定，在肿瘤的药物研发上具有重要的应用价值。

附图说明

图1为本发明多肽的质谱检测图谱；

图2为采用划痕法检测本发明多肽对人结肠癌sw620细胞(A)、sw480细胞(B)和乳腺癌MDA-MB-231细胞(C)的体外迁移运动的影响；

图3为采用Boyden小室培养法检测本发明多肽对人结肠癌sw620细胞(A)、sw480细胞(B)、乳腺癌MDA-MB-231细胞(C)体外迁移运动的影响。图3棒图的横坐标中：1为空白对照组，2为随机对照组，3为20μg/mL多肽处理组，4为40μg/mL多肽处理组，5为60μg/mL多肽处理组；

图4为本发明多肽对人结肠癌sw620细胞(A)、sw480细胞(B)、乳腺癌MDA-MB-231细胞(C)细胞生长形态的影响结果；

图5为本发明多肽对sw620细胞(A)和MDA-MB-231细胞(B)生长抑制的浓度曲线；

图6为采用FITC-Annexin V检测本发明多肽对人结肠癌sw620细胞凋亡的影响；

图7为采用Hoechst 33258荧光染料检测本发明多肽对人结肠癌sw620细胞和MDA-MB-231细胞凋亡的影响；

图8为本发明多肽在小鼠模型体内抗肿瘤作用。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本发明中所出现的缩略语的说明：

Fmoc-Rink Linker-树脂

Fmoc 9-芴甲氧羰基

DMF 二甲基甲酰胺

DCM 二氯甲烷

HOBT 1-羟基苯并三唑

DIC N,N-二异丙基碳二亚胺

DIEA N,N-二异丙基乙胺吡啶

PIP 哌啶

TFA 三氟乙酸

实施例1制备本发明多肽

以下制备多肽的Fmoc-Rink Linker-树脂，Fmoc保护氨基酸、缩合试剂、裂解试剂、茚三酮检测试剂、无水乙醚和乙腈均购买于国内生化试剂公司。

1.1本发明多肽树脂的合成

本发明多肽树脂为：

Asp(otbu)-Lys(Boc)-Ser(tbu)-Ser(tbu)-Phe-Ile-Ser(tbu)-Val-Leu-Gln(trt)-Thr(tbu)-Ser(tbu)-Ser(tbu)-Ser(tbu)-Ser(tbu)-Leu-Arg(Pbf)-Met-Gly-Ala-Tyr(tbu)-NH-Rink Linker-树脂。

使用Fmoc-Rink Linker-树脂为开始载体，通过去Fmoc保护和偶联反应，依次与表1所示的保护氨基酸偶联，制得本发明多肽树脂。本实施例所使用的保护氨基酸从树脂起算第1至第21个氨基酸相对应的Fmoc保护氨基酸如下表所示：

表1.保护氨基酸

1.2接入第21～1个氨基酸。

1.2.1接入第21个氨基酸。

制备从C端到N端逐个进行。称取Fmoc-Rink Linker树脂放入反应器中，加入DCM，加入Fmoc-Tyr(tbu)(L型酪氨酸)(4mmol当量)，1mmol的DIEA，用氮气鼓泡反应3h。然后加入1mL甲醇，1mL DIEA，反应半小时，抽掉反应液，用DMF、DCM洗净。加入适量哌啶去除Fmoc(9-芴甲氧羰基)保护基，洗净，茚三酮检测。

1.2.2接入第20～1个氨基酸

采用上述同样方法，依次接入表1中对应的第20～1个保护氨基酸，接完所有保护氨基酸后，即得到的Fmoc-多肽树脂，加入适量哌啶去除Fmoc(9-芴甲氧羰基)保护基，过滤洗涤后，即得本发明多肽树脂。

1.3本发明多肽粗品的制备

取得的多肽树脂中加入87.5％TFA裂解液(TFA水溶液，每克多肽树脂中加入10mL裂解液)，温度控制30度，反应三个小时；然后抽滤得到液体，用冰乙醚沉降出来，氮气吹去大部分的溶剂后，向残液中倒人20mL无水乙醚，出现白色絮状沉淀，在4000RPM转速，5℃条件下离心5分钟，倒去溶剂乙醚，向沉淀中加入无水乙醚20mL，振荡，同样条件下离心5分钟，再重复一次，除去大部分的杂质。沉淀真空干燥24小时。固体残留物用离子水溶解，冷冻干燥得到白色絮状固体，得本发明多肽粗品的固体粗品。

1.4本发明多肽粗品的纯化

将冻干的粗品多肽，溶于0.1％TFA/乙腈溶液进行高效液相色谱(HPLC)分离。HPLC在Waters-600E多通道系统上进行，选用Gemini-NX 10μC18 100A，4.6×250mm半制备柱，Wa-ters 2487紫外检测器(L＝215和254nm)，用0.1％TFA/乙腈溶液进行梯度洗脱。收集主要峰产物，减压旋蒸除去HPLC的样品锋中的乙腈。在冷冻干燥机上冷冻干燥，获得目标产物多肽，多肽纯度为95.46％。

1.5本发明多肽纯品的质谱鉴定

最终产物经过ESI-MS方法鉴定。纯化的多肽质谱图见图1。本发明多肽的理论分子量为2264.55Da(100％M+H)，质谱条件：样品溶解于甲醇，通过Cole-Panner 74900注射泵打入电喷雾质谱。电喷雾质谱条件：喷雾器压力为7或11Psi，干燥器(N)流速为4L或8L/分钟，温度为300℃。喷雾针电压为4kV。质谱分析表明，纯化多肽的分子量为2265.15Da，其分子量与计算值相符。

本发明的抗肿瘤多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，其分子量为2265.15Da。

SEQ ID No.1所示的抗肿瘤多肽的氨基酸序列如下：DKSSFISVLQTSSSSLRMGAY，即Asp-Lys-Ser-Ser-Phe-Ile-Ser-Val-Leu-Gln-Thr-Ser-Ser-Ser-Ser-Leu-Arg-Met-Gly-Ala-Tyr。

实施例2本发明多肽抑肿瘤细胞体外迁移运动的研究

本发明多肽由实施例1方法制备。用10mmol/L、pH7.4的PBS缓冲液稀释为1mg/mL，0～4℃保存。人结肠癌sw620细胞株、sw480细胞株和乳腺癌MDA-MB-231细胞株购自中科院上海细胞库。Leibovitz’sL-15细胞培养液，购自北京中科迈晨科技有限公司。DMEM细胞培养液，购自美国Gibco公司。

2.1采用划痕法研究本发明多肽对不同肿瘤细胞体外迁移运动的影响

将对数生长期的人结肠癌sw620细胞株、sw480细胞株接种于12孔板中，于Leibovitz’sL-15培养液中培养；将对数生长期的人乳腺癌MDA-MB-231于DMEM培养液中培养。待细胞铺满至90％时进行划痕。划痕后用PBS清洗细胞3次，加入新的培养基。向各孔中分别加入不同浓度的本发明多肽(使处理终浓度分别为20、40、60μg/mL)，空白对照不加(control)，随机对照组(random)加入80μg/ml随机氨基酸序列短肽。重新置于培养箱中继续培养48h后，在倒置显微镜下观察不同浓度的本发明多肽对SW620、SW480细胞及MDA-MB-231细胞运动迁移能力的影响。结果如图2，其中图2A、2B和2C依次分别为本发明多肽对SW620、SW480细胞及MDA-MB-231细胞的影响，由图可见，本发明多肽可显著抑制肿瘤细胞的迁移能力，且呈浓度依赖性。20μg/ml时即出现明显的抑制，60μg/ml时可达到100％的抑制。本发明多肽对不同组织来源的肿瘤细胞体外迁移运动都具有抑制作用。说明本发明多肽的作用具有广谱性。

2.2采用化学趋化法(Boyden小室法)研究本发明多肽对不同肿瘤细胞体外迁移的影响

向Boyden小室下室各加入500μL含10％胎牛血清的L-15培养基，放置8μm孔的聚碳酸酯滤膜。向上室加入浓度为1×10⁵/mL肿瘤细胞300μL，处理组同时加入不同浓度的本发明多肽(浓度分别为20、40、60μg/ml)，空白对照不加(control)。随机对照组(random)加入80μg/ml随机氨基酸序列短肽。于37℃、5％CO₂培养箱中培养48h后，取出小室，用棉签轻轻擦掉膜上室面未穿膜的细胞。4℃甲醇固定30min后用0.1％DAPI染色，然后置于荧光显微镜下观察并拍照。计数穿膜细胞数。对每个滤膜检查随机取4个视野(200×)，并取其总数记值。结果及统计学数据见如图3，其中图3A、3B和3C依次分别为本发明多肽对SW620、SW480细胞及MDA-MB-231细胞的影响，由图可见，本发明多肽可显著抑制肿瘤细胞的迁移能力，且呈浓度依赖性。抑制作用具有广谱性。

实施例3本发明多肽对肿瘤细胞生长形态的影响

将对数生长期的人结肠癌sw620细胞株、sw480细胞株接种于12孔板中，于Leibovitz’sL-15培养液中培养；将对数生长期的人乳腺癌MDA-MB-231于DMEM培养液中培养。向各处理组分别加入60μg/mL浓度的本发明多肽,空白对照不加(control)。于37℃、5％CO₂培养箱中培养48h后，在倒置显微镜下观察本发明多肽对不同肿瘤细胞生长形态的影响。结果如图4，其中图4A、4B和4C依次分别为60μg/mL本发明多肽(对SW620、SW480细胞及MDA-MB-231的影响，由图可见，本发明多肽处理细胞后，细胞胞浆中出现颗粒，细胞收缩，形态变得不规则，破碎，最后漂浮，凋亡。

实施例4采用MTT法研究本发明多肽对肿瘤细胞生长、增殖的影响

称取5mg MTT，加入1mL PBS反复吹打使其充分溶解。用注射器完全吸取后经过0.22μm滤膜过滤器进一步除菌，最后移至EP管中，为MTT贮存液(5mg/mL)，用锡箔纸包好以避光，4℃保存。

将肿瘤细胞株接种96孔板中，每孔加入0.1mL浓度为20000/mL的细胞悬液。分别于含有20、40、60μg/mL浓度的本发明多肽的Leibovitz’sL-15培养液中培养72小时，空白对照不加(control)。弃培养基，各孔加入10μL MTT溶液(5mg/mL)，37℃继续培养90min。终止培养，每孔加入150μL DMSO，在摇床上缓慢摇晃10min，使DMSO能彻底溶解紫色结晶。立即用酶标仪测其在波长480nm的吸光度值(OD490)。最后绘制生长曲线，以时间为横坐标，OD490吸光度值为纵坐标。结果见图5，其中图5A、5B分别为本发明多肽对SW620及MDA-MB-231细胞的影响，由图可见，与对照组相比，细胞增殖率随多肽处理浓度提高呈明显下降趋势。当多肽处理浓度60μg/mL时，细胞增殖抑制率分别达到达到48％(sw620细胞)和39％(MDA-MD-231细胞)，说明本发明多肽可抑制肿瘤细胞的体外生长增殖。

实施例5采用FITC-Annexin V和Hoechst 33258荧光染料检测本发明多肽对肿瘤细胞凋亡的影响。

5.1实验材料

FITC-Annexin V细胞凋亡检测试剂盒购自Life technologies公司。

Hoechst 33258荧光染料细胞凋亡检测试剂盒购自碧云天生物科技有限公司，均按照试剂盒说明操作。

5.2实验方法

收集对数生长期的肿瘤细胞，将sw620细胞悬浮于含有不同浓度的本发明多肽的Leibovitz’sL-15培养液中，空白对照不加多肽(control)。MDA-MB-231细胞悬浮于含有不同浓度的本发明多肽的DMEM培养液中培养中(对照组不含多肽)。分别接种于12孔板中，于5％CO₂、37℃培养培养48h。吸除培养液，用PBS洗涤一次。分别均按照试剂盒说明操作。图6为采用FITC-Annexin V检测细胞凋亡的实验结果。绿色荧光染色则为凋亡细胞，被绿色和红色荧光双染的是坏死细胞，未染色的为正常细胞。由图可见，本发明多肽可引起SW620细胞的凋亡，且呈浓度依赖性。相对于对照组，多肽处理浓度60μg/mL时，凋亡率达到30％。图7为采用Hoechst 33258荧光染料检测细胞凋亡的实验结果。蓝色荧光为凋亡细胞内的凋亡小体，代表发生凋亡的细胞。由图可见，本发明多肽可诱导SW620细胞和MDA-MB-231细胞的凋亡，且呈浓度依赖性。60μg/mL浓度多肽处理时，凋亡率达到30％。采用两种方法均证明，本发明多肽可诱导肿瘤细胞的凋亡。

实施例6本发明多肽在小鼠模型体内抗肿瘤作用的研究

6.1实验材料

实验动物：六周龄昆明小鼠，购自大连医科大学动物中心。

细胞株：小鼠高淋巴道转移肝癌Hca-P细胞株由有大连医科大学病理教研室提供。

6.2实验方法

将小鼠高淋巴道转移肝癌Hca-P细胞分为对照组和本发明多肽处理组，分别于含60μg/ml本发明多肽或不含多肽(对照组)的RPMI 1640培养液中，5％CO₂、37℃孵育24小时。收集细胞，调细胞浓度为1.0×10⁷/ml。在小鼠右侧腋窝处皮下接种100uL/只(1.0×10⁶个细胞)，于14天后断头处死小鼠，取出瘤体，称重并拍照。结果见图8和表2。实验结果显示，本发明多肽可显著抑制肝内的生长。其抑瘤率达77.87％。

表2.本发明多肽的抑瘤率

Claims

1.一种抗肿瘤多肽，其特征在于，所述抗肿瘤多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.权利要求1所述的抗肿瘤多肽在制备抗肿瘤药物中的应用。

3.一种如权利要求1所述的抗肿瘤多肽的制备方法，其特征在于，所述制备方法为固相化学合成，包括以下步骤：

(2)步骤(1)得到的多肽链中加入裂解液，在25～35℃温度下，反应2-4小时，抽滤，滤液经纯化得到多肽粗品。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中将Fmoc保护氨基酸在Fmoc-Rink Linker-树脂上偶合并去除Fmoc保护基的方法为：称取Fmoc-Rink Linker-树脂放入反应器中，加入DCM，加入Fmoc保护氨基酸和DIEA，用氮气鼓泡反应3h，然后加入甲醇和DIEA，反应半小时，抽掉反应液，用DMF、DCM洗净，加入适量哌啶去除Fmoc保护基，得连接有树脂的多肽链。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述的滤液的纯化包括如下步骤：滤液中加入冰乙醚使多肽沉降出来，离心得到多肽粗品。