CN103387603B - 一种rtn4b相关多肽及其制备与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种RTN4B相关多肽及其制备与应用。本发明的RTN4B相关多肽，含有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。本发明还进一步公开了所述RTN4B相关多肽基于化学合成法的制备方法及所述RTN4B相关多肽的用途。本发明的RTN4B相关多肽能够在体外抑制RTN4B的生物学活性，在体内抑制肿瘤细胞的生长。

Description

一种RTN4B相关多肽及其制备与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种RTN4B相关多肽及其制备与应用。

背景技术

RTN4B属于reticolon家族（RTNs），因含有特殊的内质网定位而得名，具有保守的RHD结构框（reticulon-homology domain）。该家族含有四个基因，RTN1、RTN2、RTN3和RTN4，其中关于RTN4的研究报道较多。RTN4（又名Nogo/ASY/RTN-X）基因有多个可变剪接本，主要编码RTN4A（GenBank登录号AF148537），RTN4B（GenBank登录号AF148538）和RTN4C（GenBank登录号AF087901）三种蛋白，其它一些剪接本多在睾丸中特异性表达[Oertle T,Schwab ME.Nogo and its paRTNers.Trends Cell Biol.2003Apr;13(4):187-94.]。

RTN4B在除了肝脏以外的其他所有正常组织中广谱表达，前人的研究工作提示RTN4B参与调控细胞凋亡和肿瘤生长。Tsujimoto等人发现RTN4B能够和Bcl-2，Bcl-xL相互作用并将Bcl-XL及Bcl-2招募到内质网上，逆转Bcl-XL及Bcl-2的凋亡抑制作用[Tagami S,Eguchi Y,Kinoshita M,Takeda M,Tsujimoto Y.A novel protein,RTN-XS,interacts with bothBcl-XL and Bcl-2on endoplasmic reticulum and reduces their anti-apoptotic activity.Oncogene.2000Nov23;19(50):5736-46.]。Yutsudo等人发现RTN4B在小细胞肺癌的样本中出现转录抑制，而过量表达RTN4B可以显著促进肿瘤细胞的凋亡[Li Q,Qi B,Oka K,Shimakage M,Yoshioka N,Inoue H,Hakura A,Kodama K,Stanbridge EJ,Yutsudo M.Link of a new type ofapoptosis-inducing gene ASY/Nogo-B to human cancer.Oncogene.2001Jul5;20(30):3929-36.]。但是，Schwab小组指出RTN4B的表达在很多肿瘤组织来源的EST数据库中都有支持，而且RTN4B在SaOS-2或CHO细胞中没有促进细胞凋亡的迹象[Oertle T,Merkler D,SchwabME.Do cancer cells die because of Nogo-B?Oncogene.2003Mar6;22(9):1390-9.]。因此，RTN4B调控肿瘤生长的机制是否与细胞凋亡有关还尚无定论。但是，近年来的研究进一步发现RTN4B很可能与血管重建、甚至血管新生有关。2004年，Acevedo等人发现RTN4B在哺乳动物血管内皮细胞和平滑肌细胞中都有表达。RTN4B重组蛋白可以促进血管内皮细胞的迁移并抑制平滑肌细胞的迁移。RTN4A/B基因敲除小鼠在血管损伤后出现了异常加厚的血管壁，血管内腔缩小，通过腺病毒载体将RTN4B重新导入到小鼠体内，这种异常增厚的血管壁又能够恢复正常的形态[Acevedo L,Yu J,Erdjument-Bromage H,Miao RQ,Kim JE,Fulton D,Tempst P,Strittmatter SM,Sessa WC.A new role for Nogo as a regulator of vascularremodeling.Nat Med.2004Apr;10(4):382-8.]。随后，Miao等人筛选到了RTN4B在血管内皮细胞表面的受体分子NgBR[Miao RQ,Gao Y,Harrison KD,Prendergast J,Acevedo LM,Yu J,Hu F,Strittmatter SM,Sessa WC.Identification of a receptor necessary for Nogo-B stimulatedchemotaxis and morphogenesis of endothelial cells.Proc Natl Acad Sci U S A.2006 Jul18;103(29):10997-1002.]。敲减实验证明RTN4B和NgBR之间的相互作用是VEGF血管源性分子诱导血管新生所必需的。在斑马鱼模式生物中发现，RTN4B-NgBR的相互作用能够通过激活细胞内的Akt通路调控血管新生[Zhao B,Chun C,Liu Z,Horswill MA,Pramanik K,Wilkinson GA,Ramchandran R,Miao RQ.Nogo-B receptor is essential for angiogenesis inzebrafish via Akt pathway.Blood.2010Dec9;116(24):5423-33.]。

本发明的申请人最早克隆了人RTN4基因，并在前期的研究工作中对肿瘤细胞表达的RTN4B进行了深入的功能分析，已经申请专利“一种人蛋白和编码序列、及其制法和用途”[授权公告号：CN 1137383C]，其中涉及到了RTN4B蛋白的合成及其在肝癌诊断试剂盒中的应用。

RTN4B与肿瘤的相关性已在多篇研究中报道，并为本发明的发明人的前期研究工作所证实。RTN4B的表达变化不仅与肿瘤发生发展密切相关，且RTN4B可以参与调节肿瘤生长：过量表达RTN4B可以促进肿瘤细胞在体内生长，而消减RTN4B可以抑制肿瘤细胞在体内的生长。

但是，关于RTN4B如何调节肿瘤生长，利用RNT4B作为分子靶标如何实现肿瘤生长抑制的作用仍是亟待解决的科学问题。本领域迫切需要在深入阐述RTN4B调节肿瘤生长的机制的基础上，以RTN4B为分子靶标，探索新颖有效的抗肿瘤药物。

发明内容

本发明的目的是公开一种RTN4B相关多肽及其制备与应用。

本发明第一方面，公开了一种RTN4B相关多肽，其含有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列或其保守性变异多肽。

SEQ ID NO:1:RRGSS。

本发明的RTN4B相关多肽可以是合成多肽或重组多肽。

本发明的RTN4B相关多肽可以是经修饰的或未经修饰的多肽。

所述修饰是指在分子水平上对蛋白质进行改造，通常不改变一级结构。即在体外将蛋白质的侧链基团通过人工方法，与一些天然或合成的基团特别是具有生物相容性的大分子进行共价连接，从而改变蛋白质的性质如提高了其抗蛋白水解性能、优化了溶解性能、增加半衰期、或更易于纯化等等。具体的，这些修饰可以是糖基化、PEG化、标签抗体等。

所述标签抗体是指是抗原分子中决定抗原特异性的特殊区域或基团，是与抗体特异性结合的结构或序列。可用于DNA重组技术构建包含目的基因以及表位标记的融合蛋白，进而通过特异性标签抗体对其鉴定与纯化，以达到研究的需求。常用的标签抗体包括但不限于：myc、HA、Flag、His、GST等。

经试验证实，本发明的RTN4B相关多肽能体外抑制RTN4B的生物学活性。

较优的，所述RTN4B相关多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。

本发明的RTN4B相关多肽可以为线性多肽或环肽。

本发明第二方面，公开了所述RTN4B相关多肽的制备方法，包括采用化学合成法获得所述RTN4B相关多肽的线性多肽。

获得线性多肽后，还可进一步将所述线性多肽首尾环化获得环肽。

在本发明的一个实施案例中，是以固相树脂载体、氨基酸为材料，利用肽键的缩合反应人工合成多肽链，它包括步骤：

(a)将肽链的羧基端氨基酸首先共价连接到固相载体上；

(b)经过脱氨基保护基，与过量的活化羧基的下一个氨基酸缩合反应，从而延长肽链；

(c)循环步骤b依次连接序列中的氨基酸直至延长到肽链氨基末端；

(d)从固相载体上切割肽链并脱去侧链保护基，经纯化获得线性多肽。

上述各步骤所采用的条件和试剂均为多肽合成中的常规。

进一步的，在制备环肽时，所述步骤d为：从固相载体上切割肽链，环化后脱去侧链保护基，经纯化获得环肽。

本发明的RTN4B相关多肽也可以采用重组技术从原核或真核宿主中产生。

本发明第三方面，公开了一种分离的多核苷酸，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列选自下组：（a）编码所述RTN4B相关多肽的多核苷酸；（b）与多核苷酸（a)互补的多核苷酸。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA可以是单链的或是双链的。

本发明的多核苷酸可用于构建表达本发明的RNT4B相关多肽的重组表达载体。重组表达载体指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。在本发明中适用的载体包括但不限于:在细菌中表达的基于T7的表达载体(Rosenberg,et al.Gene,1987,56.125)；在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体(Lee and Nathans,J Bio Chem.263:3521,1988)和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。为了方便重组表达载体的纯化，还可以进一步在构建重组表达载体时，在RTN4B相关多肽编码基因的一端增加标签抗体的编码序列以方便纯化。

本发明第四方面，公开了所述RTN4B相关多肽在制备抑制RTN4B的生物学活性的药物或制剂中的用途。

现有技术已报道了RTN4B的多种功能，如与肿瘤细胞的凋亡、血管重建、血管新生、黏附、迁移等相关。本发明所述的RTN4B相关多肽可以抑制RTN4B的生物学活性，意味着其潜在的药用价值。

本发明第五方面，公开了所述RTN4B相关多肽在制备治疗或预防肿瘤的药物中的用途。

在本发明的一个实施例中，具体列举了本发明的RTN4B相关多肽对肝癌的抑制作用，这意味着本发明的RTN4B相关多肽有望成为抗癌药物。实施例的方法是通过腹腔注射多肽，抑制腋下肿瘤细胞移植瘤的生长。它包括步骤：(a)将肿瘤细胞移植到裸鼠腋下；(b)通过腹腔给药的方式将多肽注入裸鼠体内；(c)记录裸鼠移植瘤的生长速率并通过免疫组化分析瘤体内的细胞生长和血管生长状况[技术参考：Yamada S,Bu XY,Khankaldyyan V,Gonzales-Gomez I,McComb JG,Laug WE.Effect of the angiogenesis inhibitor Cilengitide(EMD 121974)on glioblastoma growth in nude mice.Neurosurgery.2006Dec;59(6):1304-12]。结果证实本发明的RTN4B相关多肽能够通过抑制血管内皮细胞黏附的能力实现肿瘤生长抑制。

本发明第五方面，还公开了一种治疗或预防肿瘤的方法，为向对象施用所述RNT4B相关多肽。

所述肿瘤选自其生长或增殖与RNT4B蛋白的表达或活性相关的肿瘤。

进一步的，所述肿瘤为肝癌。

本发明第六方面，公开了所述RTN4B相关多肽在制备抑制血管内皮细胞黏附的药物或制剂中的应用。

在本发明的一个实施例中，该方法是通过将多肽与肿瘤细胞孵育后，抑制肿瘤细胞在RTN4B表面的黏附能力，它包括步骤：(a)将血管内皮细胞与多肽孵育；(b)用RTN4B蛋白包被细胞培养皿；(c)将血管内皮细胞接种到培养皿中；(d)检测1小时内血管内皮细胞在RTN4B表面黏附的比例[技术参考：Gonzalez AM,Gonzales M,Herron GS,Nagavarapu U,Hopkinson SB,Tsuruta D,Jones JC.Complex interactions between the laminin alpha4subunitand integrins regulate endothelial cell behavior in vitro and angiogenesis in vivo.Proc Natl AcadSci U S A.2002Dec10;99(25):16075-80.]。

本发明第七方面，公开了一种药物或制剂，其活性成分含有所述RTN4B相关多肽。

所述药物可为用于抑制RTN4B的生物学活性作用的药物或制剂；或者为，用于治疗或预防肿瘤的药物；或者为，用于抑制血管内皮细胞黏附的药物或制剂。

所述药物或制剂中，还可包括药用辅料。

所述药用辅料是为解决制剂的成型性、有效性、稳定性、安全性、提高活性或生物有效性、在口服的情况下产生可接受的口感或气味等制剂相关问题而加入处方中除主药以外的药用物料。

药用辅料可以是各种载体、稀释剂、填充剂、结合剂及其它赋形剂，这依赖于给药方式及所设计的剂量形式。各种防腐剂、润滑剂、分散剂、矫味剂、保湿剂、抗氧化剂、甜味剂、着色剂、稳定剂也可加入其中。具体的，所述药用辅料可包括但不限于糖类（如：乳糖、葡萄糖、蔗糖）、淀粉（如玉米淀粉和土豆淀）、纤维素及其衍生物（如狡甲基纤维素钠、乙基纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素）、西黄蓍胶粉末、麦芽、明胶、滑石、固体润滑剂（如硬脂酸和硬脂酸镁）、硫酸钙、植物油（如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油）、蜡、脂肪、乙醇、多元醇（如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇）、聚乙烯吡咯烷酮、海藻酸、乳化剂（如Tween）、润湿剂（如月桂基硫酸钠）、着色剂、调味剂（如甜味剂）、压片剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂(如羟基苯甲酸甲酯和丙酯)、无热原水、等渗盐溶液、缓冲液（如磷酸盐缓冲液）中的一种或多种的组合。

选用药用辅料时，应当选择与本发明的RTN4B相关多肽相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低药物组合物的效果的辅料。

本发明的药物或制剂可以是片剂、丸剂、粉剂、溶液剂、糖浆剂、灭菌注射溶液等。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物宜在无菌条件下制造。

配制好的药物或制剂可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。使用药物时，是将安全有效量的本发明融合蛋白或其抗体施用于对象。例如每天约50微克/千克体重－约500毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。

本发明根据RTN4B的生物学活性及作用途径设计了靶向RTN4B的短肽分子。经试验证明，本发明的RTN4B相关多肽能够在体外抑制RTN4B的生物学活性、抑制血管内皮细胞黏附，在体内抑制肿瘤细胞的生长，从而实现对肿瘤生长的控制，具有被开发成抗癌药物的潜力。

附图说明

图1多肽对RTN4B调节细胞黏附能力的抑制作用试验。

纵坐标：相对细胞黏附率

横坐标：

NT：BSA对照孔

P4+PBS：添加RTN4B-P4及对照PBS的孔

P4+138：添加RTN4B-P4及本发明多肽的孔

图2多肽对肿瘤细胞生长抑制作用试验。

横坐标：

cRDfV：对照环肽cRDfV组

cRGDfV：阳性对照cRGDfV组

cRRGSS：本发明环肽组

具体实施方式

本发明通过固相合成的方法获得所述短肽时，利用HPLC技术进行纯化，并利用质谱分析其纯度，获得了高纯度的短肽。

本发明在体外血管内皮细胞黏附实验中进行了短肽应用，发现了该短肽能够很好地抑制血管内皮细胞的黏附。RTN4B的研究报道和我们的工作均发现RTN4B能够促进血管内皮细胞（如HUVEC）的黏附，并很可能通过介导黏附这一事件调节肿瘤微环境中血管内皮细胞的活性，促进肿瘤血管新生（图1）。利用本发明的短肽与血管内皮细胞孵育后，RTN4B对血管内皮细胞的黏附能力的调节作用被显著抑制（图2）。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。试验中未说明的百分比均为重量百分比。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODSIN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

实施例1本发明多肽的固相合成

合成原料及相关试剂：

(1)保护氨基酸原料:Fmoc-L-Cys(Trt)-OH等(芴甲氧羰基-S-三苯甲基-L-半胱氨酸)（苏州天马医药集团精细化学品有限公司）；

(2)缩合试剂和荧光，生物素原料:HBTU（苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐）（苏州天马医药集团精细化学品有限公司），HOBT（1-羟基苯并三氮唑）（苏州天马医药集团精细化学品有限公司），DIEA（N,N-二异丙基乙胺）（国药集团上海化学试剂公司），FITC（异硫氰酸荧光素）（SIGMA），D-BIOTIN（D-生物素）（SIGMA）；

(3)溶剂：DMF(二甲基甲酰胺)（Dikma），DCM(二氯甲烷)（Dikma），乙腈（Fisher）；

(4)树脂：2-chlorotrityl chloride resin(2-氯三苯甲基氯树脂)（天津市南开合成科技有限公司）

(5)脱保护试剂：哌啶（国药集团上海化学试剂公司）；

(6)切割试剂：TFA（三氟乙酸）（J.T.Baker），TIS(三异丙基硅烷)（ALDRICH），EDT(1,2-乙二硫醇)；

(7)氮气(上海比欧气体工业公司)；

(8)无水乙醚（上海试一化学试剂有限公司）；(9)精密电子天平（北京赛多利斯天平有限公司）。

仪器设备：

(1)SYMPHONY型12通道多肽合成仪(型号：SYMPHONY，软件：Version.201厂家：Protein Technologies.Inc)；

(2)SHIMADZU高效液相色谱仪(型号：制备型，分析型，软件：Class-VP.Sevial System，厂商：SHIMADZU)；

(3)LABCONCO冻干机(型号：Freezone.Plus.6，厂商：LABCONCO；

(4)离心机（上海安亭科学仪器厂型号：TDL-40B）。

合成过程：

线性多肽的制备：

（1）树脂溶涨：将2-chlorotrityl chloride resin放入反应管中，加DMF(15ml/g)，振荡30min。

（2）接第一个氨基酸：通过沙芯抽滤掉溶剂，加入3倍摩尔过量的Fmoc-L-Cys(Trt)-OH氨基酸，再加入10倍摩尔过量的DIEA，最后加入DMF溶解，振荡30min。

（3）脱保护：去掉DMF，加20%哌啶DMF溶液(15ml/g)，5min，去掉再加20%哌啶DMF溶液(15ml/g)，15min。

（4）检测：抽掉哌啶溶液，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮，KCN，苯酚溶液各一滴，105℃－110℃加热5min，变深蓝色为阳性反应。

（5）洗涤：DMF(10ml/g)两次，甲醇(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次。

（6）缩合：保护氨基酸(Fmoc-L-Cys(Trt)-OH)三倍过量，HBTU三倍过量，均用尽量少DMF溶解，加入反应管，立刻加入NMM（N-甲基吗啉）十倍过量，反应30min。

（7）洗涤：DMF(10ml/g)一次，甲醇(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次。

（8）重复2-7步操作，从右到左依次连接序列中的氨基酸。

（9）抽干，按照下列方法洗树脂。DMF(10ml/g)两次，甲醇(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次，DCM(10ml/g)两次，抽干10min。

（10）从树脂上切割并脱去侧链保护基：配制切割液（10mL/g）TFA94.5%；水2.5%；EDT2.5%；TIS1%，切割时间120min。

（11）吹干洗涤：将裂解液用氮气尽量吹干，用乙醚洗六次，然后常温挥干。

（12）用HPLC纯化多肽：将粗肽用纯水或者加少量乙腈溶解，按照下列条件纯化：泵A:0.1%三氟乙酸纯水溶液；泵B:0.1%三氟乙酸纯乙腈溶液；总流量：1.0ml/min；体积:30ul；波长：220nm;

梯度：:Time（单位：分钟）   A      B

              05.00         90%    10%

              30.00         20%   80%

              30.10              停止

<检测器A>

柱:Venusi MRC-ODS C18  30x250mm

（13）最后将纯化后的溶液冻干，既得到序列为RRGSS的线性多肽成品。

环肽的制备：

步骤（1）-（9），（11）-（14）与线性多肽制备一致获得序列为RRGSS的环肽成品，其中步骤10采用以下三个步骤替代：

（101）从树脂上切割多肽：配制切割液：TFA 1%；DCM99%。切割液用量是每1克树脂肽加10ml的切割液，反应时间是2h，室温密封切割。

（102）环化：切割液用氮气吹干，加入HBTU三倍过量，用尽量少DMF溶解，加入反应管，立刻加入NMM十倍过量，反应30min。

（103）脱去侧链保护基：配制切割液（10mL/g）TFA94.5%；水2.5%；EDT2.5%；TIS1%，切割时间120min。

鉴定：分别取少量的线性多肽及环肽成品，做MS的分子量鉴定符合预期，测序鉴定，序列符合预期，HPLC分析纯度为95%，MS方法鉴定结构符合预期。

实施例2本发明多肽在体外细胞黏附中的应用

原料及相关试剂：磷酸缓冲液，胰酶（invitrogen公司），M200培养基及LSGS血清（cascade biologics公司），牛血清白蛋白（上海生工生物工程技术服务有限公司），MTS/PMS试剂盒（Promega公司），人HUVEC细胞（ScienCell公司）。

仪器设备：细胞培养箱（Heraeus公司），倒置显微镜（Leica公司），水平离心机（Eppendorf离心机），酶标仪（Bio-Rad公司）。

实验过程：

（1）孔板准备：PBS稀释RTN4B-P4蛋白（为ZL00111791.2公开的RTN4B蛋白的部分胞外区段，具有促进细胞黏附的活性，可经多肽合成），包被96孔板，每孔100μL。4℃过夜。次日PBS洗涤一遍后，加入1%BSA进行封闭，每孔150μL。37℃放置1h，再用预热的无血清培养基洗涤一遍后可用于细胞接种。

RTN4B-P4蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO:2)：

SPQAEPVWTPPAPAPAAPPSTPAAPKRRGSSGSVVVDLLYWRDIKKTGVV。

RTN4B-P4蛋白采用多肽合成的方法制备获得。

（2）细胞接种：当细胞在培养瓶中增殖至90%的汇合度时更换成无血清培养基继续培养16h后可进行消化收获。弃去细胞原培养基，先用数毫升1×PBS洗涤细胞一遍，然后加入1-2mL胰蛋白酶消化液，摇晃均匀后弃去消化液，仅留0.5mL左右于瓶内，将培养瓶置37℃培养箱中消化1-2min左右，待细胞变圆，可从瓶壁脱离时，加入含血清的培养基终止胰酶消化，吹散细胞，转入无菌离心管内，1000rpm离心5min。弃去离心上清后，用含0.1%BSA的无血清培养基将细胞调整至5×10⁵/mL的密度。

（3）封阻结合：将稀释后的细胞悬液与实施例1制备的线性多肽在37℃孵育30min，工作浓度为20mM，然后将细胞悬液接种到96孔板中，每孔100μL。对照组加入相同体积的PBS。

（4）洗板和显色：细胞接种后1h，吸去培养基。保留三个平行孔作为全细胞孔。其余各孔用预热的无血清培养剂或PBS洗涤，重复洗涤三次直至未黏附细胞被完全洗去。剩余细胞用MTS试剂盒显色计算细胞数。相对细胞黏附率的计算方法是实验孔的OD值除以全细胞孔的OD值后的商。

试验结果：如图1所示，与对照NT组相比，RTN4B-P4（P4+PBS组）能够促进细胞黏附。但是，当内皮细胞与本发明制备的多肽孵育之后，内皮细胞在P4表面的黏附能力显著下降（P4+138组）。

结果显示，多肽能够抑制RTN4B调节细胞黏附能力。由于线性环肽能够抑制RTN4B调节细胞黏附能力，环肽与之序列一致，因此认为也具有抑制RTN4B调节细胞黏附能力。

实施例3本发明多肽在体内细胞生长中的应用

原料及相关试剂：磷酸缓冲液，胰酶（invitrogen公司），DMEM培养基和胎牛血清（Gibco公司），3-4周龄的裸鼠（上海斯莱克公司），肿瘤细胞株SMMC-7721等。

仪器设备：细胞培养箱（Heraeus公司），倒置显微镜（Leica公司），水平离心机（Eppendorf离心机），SPF动物室。

实验过程：

1．将环肽用PBS稀释，配置成5mg/mL的母液，PH值调整至7.4。

2．饲养裸鼠（3-4周龄）。

3．培养SMMC7721肝癌细胞，收集细胞，用无血清培养基重悬至2*10⁷/mL。

4．将细胞悬液接种到裸鼠皮下，每只小鼠200uL，共40只小鼠。

5．细胞注射4天后，将40只小鼠等分为4组，进行瘤内多肽注射，每只小鼠200uL。连续注射13天。

6．停药后第3天取瘤。

7．进行瘤体重量分析，每组去掉最大及最小值。

空白对照：等体积的PBS。

对照环肽组：cRDfV，采用多肽合成并参考实施例1的环化方法制备获得。

阳性对照组：cRGDfV（已经进入临床III期的RGD环肽，采用多肽合成并参考实施例1的环化方法制备获得。

试验环肽组：采用实施例1制备的环肽。

（4）瘤体记录：每两天测量一次瘤体大小，并按照a×b²计算瘤体大小。

（5）最后一次注射后两天取瘤，瘤体称重并拍照。

结果：如图2所示，和对照环肽相比，cRRGSS（试验环肽组）和cRGDfV（阳性对照组）都有抑制瘤体生长的作用，结果表明，本发明的环肽能够抑制肿瘤细胞的生长。由于本发明的线性肽与之序列一致，因此认为线性肽也具有抑制肿瘤细胞的生长的作用。

Claims (12)

1.一种RTN4B相关多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述RTN4B相关多肽为环肽。

2.如权利要求1所述RTN4B相关多肽，其特征在于，所述RTN4B相关多肽能体外抑制RTN4B的生物学活性。

3.如权利要求1或2所述RTN4B相关多肽的制备方法，包括采用化学合成法获得所述RTN4B相关多肽的线性多肽，将所述线性多肽首尾环化获得环肽。

4.如权利要求3所述RTN4B相关多肽的制备方法，其特征在于，包括下列步骤：

(a)将肽链的羧基端氨基酸首先共价连接到固相载体上；

(b)经过脱氨基保护基，与过量的活化羧基的下一个氨基酸缩合反应，从而延长肽链；

(c)循环步骤b依次连接序列中的氨基酸直至延长到肽链氨基末端；

(d)从固相载体上切割肽链，环化后脱去侧链保护基，经纯化获得环肽。

5.RTN4B相关多肽在制备抑制RTN4B的生物学活性的药物或制剂中的用途，所述RTN4B相关多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述RTN4B相关多肽为环肽或线型多肽。

7.RTN4B相关多肽在制备治疗或预防肿瘤的药物中的用途，所述RTN4B相关多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述RTN4B相关多肽为环肽。

8.如权利要求7所述RTN4B相关多肽的用途，其特征在于，所述肿瘤选自其生长或增殖与RNT4B蛋白的表达或活性相关的肿瘤。

9.如权利要求8所述RTN4B相关多肽的用途，其特征在于，所述肿瘤为肝癌。

10.RTN4B相关多肽在制备抑制血管内皮细胞黏附的药物或制剂中的应用，所述RTN4B相关多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

11.如权利要求10所述的用途，其特征在于，所述RTN4B相关多肽为环肽或线型多肽。

12.一种药物或制剂，其活性成分含有权利要求1或2所述RTN4B相关多肽。