CN106029062A

CN106029062A - 用于破坏生物膜稳定性、改变生物膜和分散生物膜的组合物和方法

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Publication number: CN106029062A
Application number: CN201480064187.XA
Authority: CN
Inventors: A.里卡; N.贾库博维奇; D.S.萨马里安; E.科尔德曼
Original assignee: Newcastle University of Upon Tyne; University of Michigan System
Current assignee: Newcastle University of Upon Tyne; University of Michigan System
Priority date: 2013-09-24
Filing date: 2014-09-24
Publication date: 2016-10-12
Also published as: US20160304886A1; AU2014326756A1; AU2024264692A1; CN110129352A; EP3049073A4; EP3150715B1; MX2016003791A; AU2021202650A1; ZA201602797B; AU2014326756B2; CN115177607A; MX374836B; EP3049073B1; EP3049073A1; BR112016006584B1; BR112016006584A2; EP3831374A1; PL3049073T3; DK3049073T3; AU2019271937B2

Abstract

本公开涉及用于破坏生物膜稳定性、改变生物膜3D结构和分散生物膜的组合物和方法，以便提高生物膜细胞去除和/或对其它试剂的敏感性(例如，环境或共施加处理)。具体地，本公开涉及L‑精氨酸在医疗、工业、家庭或环境应用中微生物的去除和/或致感(例如，对抗微生物剂)以及细菌感染(例如，在生物膜中)的治疗中的应用。

Description

用于破坏生物膜稳定性、改变生物膜和分散生物膜的组合物和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2013年9月24日提交的美国临时申请序列号61/881,762和于2014年3月31日提交的美国临时申请序列号日61/972,920的权益，其中每一个通过引用其全文的方式并入本文。

发明领域

本公开涉及用于破坏生物膜稳定性、改变生物膜3D结构和分散生物膜的组合物和方法，以便提高生物膜细胞去除和/或对其它试剂的敏感性(例如，环境或共施加处理)。具体地，本公开涉及L-精氨酸在医疗、工业、家庭或环境应用中微生物的去除和/或致感(例如，对抗微生物剂)以及细菌感染(例如，在生物膜中)的治疗中的应用。

发明背景

生物膜是粘附至表面的微生物的有机群体，并且嵌入粘液质的细胞外聚合性物质(EPS)中。EPS是由细菌细胞、细胞裂解和水解产物所产生的高分子质量的聚合物(>10,000Da)以及从基质吸附的有机物的复杂混合物。EPS参与到在生物膜中微生物的稳定安排的建立中(Wolfaardt等人(1998)Microb.Ecol.35:213-223；通过引用其全文并入本文)，并且细胞外DNA(eDNA)是EPS的主要成分之一(Flemming等人(2001)Water Sci.Technol.43:9-16；Spoering等人(2006)Curr.Opin.Microbiol.9:133-137；每个通过引用其全文并入本文)。生活在生物膜中的细菌通常具有与相同物种的自由浮动(浮游)细菌显著不同的性质，因为膜的致密和受保护的环境允许它们以各种方式合作和互作。这种环境的一个好处是提高了对洗涤剂和抗生素的抗性，因为致密细胞外基质和细胞的外层保护群体的内部。在某些情况下，抗生素抗性可以被增加千倍(Stewart等人(2001)Lancet358:135-138；通过引用其全文并入本文)。可以在各种细菌物种中形成生物膜(例如，不动杆菌属(Acinetobactersp.)(例如，贝利不动杆菌(A.baylyi)、鲍曼不动杆菌(A.baumannii))、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)、大肠杆菌(Escherichia coli)(例如，E.coli K-12)。由这些物种的生物膜形成是在定居或感染过程中医疗结果的主要决定因素。例如，不动杆菌通常通过形成于呼吸器管道上、皮肤和伤口部位、医用导管等上的生物膜的形成移植于在临床情况中的患者，并且是获得性肺炎的常见原因。

由于生物膜是由各要素形成的复杂结构，它们的去除或破坏通常需要使用分散剂、表面活性剂、清洁剂、酶制剂、抗生素、杀虫剂、沸腾工序、腐蚀性化学品、机械清洗、使用抗菌剂、抑制微生物附着、通过消除必需的营养物质抑制生物膜的生长、以及促进生物膜基质的生物质分离和降解(Chen XS,P.S.:Biofilm removal caused by chemicaltreatments.Water Res 2000；34:4229-4233；通过引用其全文并入本文)。然而，这种传统的去除或破坏方法并不是在其中生物膜的形成是不需要的所有情况下都是有效的且可行的。

需要在生物膜中不希望的细菌的其他方法。

发明内容

本发明的实施方案提供导致以下中的一种或多种的组合物(例如，药物、商业、医疗保健等)、系统、用途和方法：诱导细胞损伤、杀灭细胞、破坏导致稳态的失调/损失的细胞内过程、破坏细胞-细胞粘连、诱导结构的三维重排、破坏细胞-细胞信号传导、破坏细胞-细胞代谢的相互作用、破坏对表面的粘附、减少生物膜的致病潜力、减少生物膜质量、降低生物膜中病原菌的比例、增加生物膜中有益菌的比例和防止生物膜中微生物的生长，其包括：使生物膜中的细菌与至少1mM浓度的无细胞的L-精氨酸接触，其中所述接触杀灭或抑制微生物的生长和/或改变生物膜中细胞的3D排布，其可通过阻止它们与其它互作和/或将它们暴露于有害的环境影响来破坏细菌。在一些实施方案中，微生物是细菌。在一些实施方案中，细菌在共凝集物中。在一些实施方案中，生物膜是口腔生物膜。在一些实施方案中，细菌在具有多个不同的细菌种类(例如，链球菌(Streptococcs)和放线菌(Actinomyces)，如格氏链球菌(S.gordonii)和口放线菌(A.oris))的共凝集物或生物膜中。在一些实施方案中，L-精氨酸防止所述细菌的共凝集或促进所述细菌的脱粘附/分散。在一些实施方案中，L-精氨酸以至少1mM(例如，至少10mM、至少50mM、至少100mM、200mM、至少250mM、至少300mM、至少350mM、至少400mM、至少450mM、至少500mM、至少600mM、至少700mM、至少800mM、至少900mM或至少1M)的浓度存在。在一些实施方案中，细菌在多品种口腔生物膜(例如在唾液中的牙斑)中。在一些实施方案中，L-精氨酸破坏唾液中生物膜的生长，没有抗菌活性。在一些实施方案中，所述方法还包括使细菌与氯化十六烷基吡啶(CPC)接触。

另外的实施方案包括包含至少1mM浓度的L-精氨酸以诱导以下一种或多种的组合物的用途：诱导微生物细胞损伤、杀灭细胞、破坏导致稳态的失调/损失的细胞内过程、破坏细胞-细胞粘连、诱导结构的三维重排、破坏细胞-细胞信号传导、破坏细胞-细胞代谢的相互作用、破坏对表面的粘附、减少生物膜的致病潜力、减少生物膜质量、降低生物膜中病原菌的比例、增加生物膜中有益菌的比例或防止生物膜中微生物的生长。在一些实施方案中，组合物还包含氯化十六烷基吡啶(CPC)。

进一步的实施方案提供一种报告生物膜或浮游细胞群的成分的表达或浓度的质粒，其中所述质粒包含在组成型启动子控制下的第一标记物或在由所述成分诱导的启动子控制下的第二标记物。在一些实施方案中，所述标记物是荧光标记物(例如，GFP或Mcherry)。在一些实施方案中，第一启动子是链球菌核糖体启动子(例如，格氏链球菌DL150S核糖体蛋白(SGO_1192)启动子)。在一些实施方案中，第二启动子是格氏链球菌分解代谢控制蛋白A(SGO_0773)或格氏链球菌argC或arcA启动子。

另外的实施方案提供一种含有该质粒的链球菌细胞(如格氏链球菌)。在一些实施方案中，细胞在生物膜中。

一些实施方案提供监测生物膜或浮游细胞培养物的成分(如精氨酸或AI-2)的浓度的方法和用途，包括a)使链球菌细胞与本文所述的质粒接触；以及b)测量标记物的水平。在一些实施方案中，标记物的表达水平与所述成分的水平相关。在一些实施方案中，所述方法还包括使细胞与测试化合物(例如，杀灭或抑制细胞生长或疑似杀灭或抑制细胞生长的药物)接触的步骤。

本文描述了另外的实施方案。

附图说明

图1示出精氨酸的牙菌斑生长中的作用。高浓度和低浓度的L-精氨酸引起生物膜去稳定，并导致许多细胞从在死亡/破坏无响应细胞之后留下的生物膜中分散/去粘附。

图2示出格氏链球菌argC和arcA基因表达响应于外源性L-精氨酸的快速变化的调节。(A)将格氏链球菌细胞在高(5mM)精氨酸中培养，并且在x轴上时间＝0分钟处切换至无精氨酸。(B)将格氏链球菌细胞在中间(0.5mM)精氨酸中培养至后指数生长期，当添加过量(50mM)精氨酸时(时间＝0min)。

图3示出存在或不存在0.5mM或0.5M(500mM)精氨酸(Arg)的情况下在唾液中的格氏链球菌生物膜。

图4示出arcR的中断减少了通过格氏链球菌的生物膜形成。

图5示出L-精氨酸对在合并过滤灭菌唾液中发育的唾液衍生群体的物种组成的影响。(A)示出由口腔多品种生物膜长时间暴露至500mM L-精氨酸中引起的细菌多样性(操作分类单元，OTU)的增加。黑色柱代表衍生自在流动的非补充的唾液中发育的生物膜的分析的数据，而灰色柱代表衍生自在500mM补充的唾液中发育的生物膜的分析的数据。(B)示出类群的变化(颜色编码如前)。(C)示出在属(图例从左至右在柱中从底部至顶部；淋球菌，颗粒链菌(Granulicatella)，链球菌等)的组合物变化。

图6示出在静态条件下生长多品种的生物膜对提高L-精氨酸的浓度的影响。在含有补充有不同浓度的L-精氨酸单盐酸盐(LAHCl)的无细胞唾液(CFS)的静态生物膜系统中从含细胞的唾液(CCS)的接种物生长的20小时之久的口腔生物膜的代表性3D透视图。上部透视图(A₁–H₁)是x-y平面的。中部透视图(A₂–H₂)是x-z平面的。下部透视图(A₃–H₃)表示斜视图(x-y-z)。标尺代表50μm。关联表示出平均百分比细胞活力的变化。

图7示出L-精氨酸使在微流体通道中流动的条件下在唾液中生长的多品种口腔生物膜的结构不稳定。代表性3D透视图和从在Bioflux^TM流动的唾液生物膜系统中在不同浓度的L-精氨酸单盐酸盐(LAHCl)中发育20小时的口腔生物膜的计算图像分析得出的生物膜特性。

图8示出500mM L-精氨酸使预制成的多品种不同发育年龄的口腔生物膜去稳定。

图9示出L-精氨酸使预形成多品种口腔生物膜群体去稳定，并且这样做可以提高CPC的渗透(0.01或0.05％)。具体地，该图示出500mM L-精氨酸增强CPC的渗透和杀灭，使得与当再不存在L-精氨酸的情况下使用时相比需要更少的CPC。

图10示出通过响应AI-2的哈维氏弧菌BB170的生物发光的成倍诱导。示出随着L-精氨酸的浓度增加AI-2上产增加量。AI-2数据被标准化为“对照”(未补充唾液)。

图11示出应用L-精氨酸而不是D-精氨酸使细菌群体的生长趋稳定并防止细菌群落的生长。

图12示出(A)可修饰质粒(pPE1010)以允许荧光格氏链球菌DL1(GFP或Mcherry)的产生和(B)允许在相应外源添加的AI-2的格氏链球菌DL1生物膜中GFP荧光的差异表达的评价的两个启动子的实例。

定义

为了便于本发明的理解，许多术语和短语定义如下：

如本文所用的术语“生物膜”是指任何三维的(例如，基质包封)微生物群落显示的多细胞特性。因此，如本文所用，术语生物膜包括表面相关生物膜以及在悬浮液中的生物膜，如絮凝物和颗粒。生物膜可以包括单个微生物物种或可以混合物种复合物，并且可以包括细菌以及真菌、藻类，原生动物或其它微生物。在一些实施方案中，生物膜包括共凝集生物体。在一些实施方案中，生物膜包括单个生物体或不共凝集的多种生物体。

如本文所用，术语“宿主细胞”是指无论在体外还是体内的任何真核或原核细胞(例如，细菌细胞(如大肠杆菌)、酵母细胞、哺乳动物细胞、鸟类细胞、两栖类细胞、植物细胞、鱼类细胞和昆虫细胞)。例如，宿主细胞可以位于转基因动物中。

如本文所用，术语“原核生物”是指一组通常缺乏细胞核的生物体，或任何其它膜结合细胞器。在一些实施方案中，原核细胞是细菌。术语“原核生物”包括古细菌和真细菌。

如本文所用，术语“受试者”是指待通过本发明的方法或组合物来处理的个体(例如，人、动物或其他生物)。受试者包括(但不限于)哺乳动物(例如鼠类、猿猴类、马、牛、猪、犬、猫等)，最优选地包括人类。在本发明的上下文中，术语“受试者”一般是指对于由生物膜形成的细菌的存在表征的状态，或在可能暴露于生物膜形成细菌中的期待中将接受或已经接受治疗的个体。

如本文所用的术语，“体外”是指人工环境和人工环境内发生的过程或反应。体外环境包括(但不限于)试管和细胞培养。术语“体内”是指自然环境(例如，动物或细胞)和在自然环境中发生的过程或反应。

如本文所用，术语“毒性”是指微生物(例如，细菌或真菌)的致病性的程度，例如由所生产的疾病的严重程度或其侵入受试者的组织的能力指示。它一般是由中值致死剂量(LD₅₀)或中值感染剂量(ID₅₀)实验性测量。该术语也可以用来指任何感染剂产生病理作用的能力。

如本文所用，术语“有效量”是指组合物(例如，包含L-精氨酸的组合物)足以实现有益的或期望的结果的量。有效量可以在一次或多次施用、应用或剂量中施用，并且不旨在被限于特定的制剂或施用途径。在一些实施例中，有效量为至少1mM(例如，10mM、50mM、100mM、200mM、300mM、400mM、500mM、750mM、1000mM或更大)。

如本文所用，术语“施用”指给予药物、前药或其它药剂或治疗性处理(例如，包含L-精氨酸的组合物)至生理系统(例如，受试者或体内、体外、或离体细胞、组织和器官)的行为。施用到人体的示例性途径可以通过眼睛(眼)、口腔(口)、皮肤(经皮)、鼻(鼻内)、肺(吸入剂)、口腔粘膜(颊)、耳、通过注射(例如，静脉内、皮下、瘤内、腹膜内等等)、局部施用等。

如本文所用，术语“处理表面”是指将表面暴露于一个或多个包含L-精氨酸的组合物的行为。处理表面的方法包括(但不限于)喷涂、喷雾、浸没和涂覆。

如本文用，术语“共施用”是指对受试者施用至少两种药剂(例如，L-精氨酸结合抗微生物剂)或治疗。在一些实施例中，两种或多种药剂或治疗剂的共施用是同步的。在其他实施例中，在第二药剂/治疗剂之前施用第一药剂/治疗剂。本领域的技术人员理解，使用的各种药剂或治疗剂的制剂和/或施用途径可以是不同的。本领域技术人员可以容易确定用于共施用的合适的剂量。在一些实施例中，当共施用药剂或治疗剂时，各药剂或治疗剂以比适合于单独施用更低剂量施用。因此，共施用是在实施例中是特别合乎需要的，其中药剂或治疗剂的共同施用降低了(一或多种)潜在的有害(例如，有毒)药剂所需剂量。

如本文所用，术语“伤口”广义地指以不同的方式引起的包括皮肤、皮下组织，肌肉、骨骼的组织和其他结构的伤害，所述方式例如，外科手术，(例如，打开癌症后切除伤口，包括但不限于去除黑色素瘤和乳腺癌等)，包含手术后手术伤口，压疮(例如，来自长期卧床休息)和创伤引起的伤口。如本文所用，术语“伤口”非限制性地用于伤口的原因，是物理原因如身体定位为在褥疮中或如用创伤或生物原因(如疾病过程、老化过程、分娩过程或任何其他方式的生物过程)的冲击。由压力引起的伤口还可根据伤口的深度被归类为四级：ⅰ)I级：限于表皮的伤口；ii)Ⅱ级：延伸到真皮的伤口；ⅲ)III级：延伸到皮下组织的伤口；和iv)IV级：其中骨头都露出来的伤口(例如，骨压点，如大转节或骶骨)。术语“部分厚度的伤口”是指限于表皮和真皮的伤口；任何病因的伤口都可以是部分厚度。术语“全厚度伤口”是指包括通过真皮延伸的伤口。

如本文所用，“伤口部位”广泛地指(但不限于)伤口的解剖位置。

如本文所用，术语“敷料”广义地指应用到伤口用于保护、吸收、排水、处理等的任何材料。许多类型的敷料是市售的，包括薄膜(例如，聚氨酯薄膜)、水状胶体(结合到聚氨酯泡沫的亲水胶体颗粒)、水凝胶(包含约至少60％水的交联聚合物)、泡沫体(亲水或疏水)、藻酸钙(来自藻酸钙的纤维的无纺复合物)和玻璃纸(具有增塑剂的纤维素)(Kannon和Garrett(1995)Dermatol.Surg.21:583-590；Davies(1983)Burns 10:94；每个通过引用并入本文)。本发明还提出使用用药理化合物(如，抗生素、防腐剂、凝血酶、镇痛化合物等)浸渍的敷料的用途。多孔伤口敷料包括市售的材料，如 Dermal Regeneration 和

如本文所用，术语“有毒”是指与施用有毒物之前相同的细胞或组织相比，在受试者、细胞或组织上的任何不利或有害影响。

如本文所用，术语“药物组合物”是指活性剂(如L-精氨酸)与惰性或活性载体的组合，使得该组合物特别适用于体外、体内或离体诊断或治疗用途。

如本文所用的术语“药学上可接受”或“药理学上可接受的”是指当施用于受试者时基本上不产生不良反应(例如，中毒反应、过敏反应或免疫反应)的组合物。

如本文所用，术语“局部”是指本发明的组合物施用到皮肤和粘膜细胞和组织的表面(例如，肺泡、颊、舌、咀嚼或鼻粘膜，以及排在中空性器官或体腔中的其他组织和细胞)。

如本文所用，术语“药学上可接受的载体”是指任何标准的药物载体，包括(但不限于)磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液(例如，例如油/水或水/油乳液)，以及各种类型的润湿剂、任何和所有溶剂、分散介质、包衣、月桂基硫酸钠、等渗和吸收延迟剂、崩解剂(例如马铃薯淀粉或淀粉羟基乙酸钠)等等。该组合物还可以包括稳定剂和防腐剂。为对于载体、稳定剂和佐剂的实例。(参见例如，Martin，雷明顿药物科学(Remington's PharmaceuticalSciences)，第15版，Mack Publ.Co.,Easton,Pa.(1975)，其通过引用并入本文)。在某些实施例中，本发明的组合物可以配制用于兽医、园艺或农业用途。此类制剂包括蘸剂，喷雾剂，拌种剂，干细胞注射剂、喷雾剂和雾剂。在某些实施例中，本发明的组合物可以用于任何应用中，其中理想的是改变(例如，抑制)生物膜的形成，例如，食品工业应用；消费品(例如，医疗产品、用于受损或发育免疫系统的消费者(例如，婴儿、儿童、老年人、患有疾病或处于疾病风险的消费者)的产品等等。

如本文所用,术语“医疗设备”包括例如，在医学治疗(例如，对于疾病或损伤)过程中，在患者的身体上、在患者的身体中或通过患者的身体使用的任何材料或设备。医疗设备包括(但不限于)此类物品，如医疗用植入物、伤口护理设备、药物递送设备和体腔和个人保护设备。所述医疗用植入物包括(但不限于)尿导管、血管内导管、透析分流器、伤口引流管、皮肤缝合线、血管移植物、可植入网眼、眼内设备、心脏瓣膜等等。伤口护理设备包括(但不限于)一般伤口敷料、生物移植材料、胶带封口和敷料以及手术切割被单。药物递送设备包括(但不限于)针、药物递送皮肤贴剂、药物递送粘膜贴剂和医用海绵。体腔和个人保护设备包括(但不限于)棉塞、海绵、手术和检验手套、隐形眼镜和牙刷。节育装置包括(但不限于)子宫内避孕器(IUD)、隔膜和避孕套。

如本文所用，术语“治疗剂”是指降低受试者(例如，通过形成生物膜的微生物接触的受试者)中感染、发病率和发病死亡率，或预防在通过形成生物膜的微生物接触的宿主中感染、发病率或发病死亡率的组合物。如本文所用，治疗剂包括预防性使用的药剂，例如在缺乏形成生物膜的生物体中，鉴于将来可能暴露于形成生物膜生物体。此类药剂另外可包含药学上可接受的化合物(例如佐剂、赋形剂、稳定剂、稀释剂等)。在一些实施例中，本发明的治疗剂以外用组合物、可注射的组合物、可摄取组合物等形式施用。当途径是局部的时，形式可为(例如)溶液、乳膏、软膏、药膏或喷雾。

如本文所用，术语“病原体”是指在宿主中引起疾病状态(例如，感染、癌症等)的生物药剂。“病原体”包括(但不限于)病毒、细菌、古细菌、真菌、原生动物、支原体、朊病毒和寄生生物。

如本文所用，术语“微生物(microbe)”是指微生物，并且旨在包括单独的生物体或包含任何数量的生物体的制品两者。

如本文所用，术语“微生物”是指任何物种或类型的微生物，包括(但不限于)细菌、古细菌、真菌、原生动物、支原体和寄生生物。

如本文所用，术语“真菌”当使用时涉及真核生物，如霉菌和酵母菌，包括双态性真菌。

术语“细菌”(bacteria/bacterium)是指包括在原核生物界中的所有门中的所有原核生物。这意味着术语包括被认为是细菌的所有微生物，包括支原体、衣原体、放线菌、链霉菌和立克次体。所有形式的细菌都包括在定义内，包括球菌、杆菌、螺旋体、原生质球、原生质体等。也包括在术语内的是革兰氏阴性或革兰氏阳性原核有机体。“革兰氏阴性”和“革兰氏阳性”是指革兰氏染色过程的染色模式，其在本领域中是公知的。(参见Finegold和Martin，Diagnostic Microbiology，第6版，CV Mosby St.Louis，第13-15页(1982))。“革兰氏阳性细菌”是保留在革兰氏染色中使用的主要染料的细菌，导致染色的细胞通常在显微镜下出现深蓝紫色。“革兰氏阴性细菌”不保留在革兰氏染色中使用的主要染料，而是通过复染剂染色。因此，革兰氏阴性菌通常出现红色。

术语“非致病性细菌(non-pathogenic bacteria/non-pathogenic bacterium)”包括所有已知的和未知的非致病性细菌(革兰氏阳性或革兰氏阴性)和已突变或转化为非致病性细菌的任何致病性细菌。此外，本领域技术人员认识到，一些细菌可能对特定物种是致病的，但对其它物种是非致病的；因此，这些细菌可以在其中它是非致病或突变的物种中使用，使得它是非致病的。

如本文所用，术语“非人动物”是指所有的非人类的动物，包括(但不限于)脊椎动物，如啮齿类、非人灵长类动物、绵羊、牛、反刍动物、兔类动物、猪、山羊、马、犬、猫、鸟类等。

如本文所用，术语“细胞培养物”是指任何体外培养的细胞，包括(例如)原核细胞和真核细胞。包括在该术语内的是连续的细胞系(例如，具有永生表型)、原代细胞培养物、转化的细胞系、有限细胞系(例如，未转化的细胞)、在固体或液体培养基中或上的细菌培养物，和任何其它体外保持的细胞群。

如本文所用的术语“涂层”是指覆盖例如医疗设备或其部分的材料层。涂层可被施加到表面或在植入物的材料内浸渍。

如本文所用，术语“抗微生物剂”是指降低预防或抑制细菌和/或真菌生物生长的组合物。抗微生物剂的实例包括例如，抗生素和防腐剂。

如本文所用的术语“防腐剂”是指抑制微生物活性的抗菌物质，包括(但不限于)α-萜品醇、甲基异噻唑啉酮、氯化十六烷基吡啶、氯二甲苯酚、六氯酚、氯己定和其它阳离子双胍、二氯甲烷，碘和碘伏(iodophores)、三氯生、2-氨基乙基磺酰胺(taurinamide)、呋喃妥因、乌洛托品、醛类、丙烯酸、银、苄基过氧化物、醇，以及羧酸和盐。本领域技术人员认识到，这些抗菌剂可以以两种或多种组合使用，以获得协同或相加的效果。防腐剂的组合的一些实例包括氯己定，氯己定和氯二甲酚，氯己定和甲基异噻唑啉酮，氯己定和(α-萜品醇，甲基异噻唑啉酮和α-萜品醇的混合物；百里酚和氯二甲苯酚；氯己定和西吡氯铵；或氯己定、甲基异噻唑啉酮和百里酚。这些组合提供对多种生物体的广谱的活性。

如本文所用的术语“抗生素”被定义为抑制微生物的生长，优选不伤害宿主的物质。例如，抗生素可以抑制细胞壁合成、蛋白质合成、核酸合成或改变细胞膜的功能。

抗生素的类别包括(但不限于)大环内酯类(例如，红霉素)、青霉素类(例如，奈夫西林)、头孢菌素(例如，头孢唑啉)、碳青霉烯类(例如，泰能)、单酰胺菌素(例如，氨曲南)、其他β-内酰胺抗生素、β-内酰胺抑制剂(例如，舒巴坦)，酢浆草(例如利奈唑胺)、氨基糖苷类(例如，庆大霉素)、氯霉素、磺酰胺类(例如磺胺甲恶唑)、糖(例如，万古霉素)、喹诺酮类(例如，环丙沙星)、四环素类(例如，米诺环素)、夫西地酸、甲氧苄啶、甲硝唑、克林霉素，莫匹罗星、利福霉素类(例如，利福平)、链阳性菌素(例如，奎奴普丁和达福普汀)脂蛋白(例如，达托霉素)、多烯(例如，两性霉素B)、唑类(例如，氟康唑)和棘球白素(例如，卡泊芬净醋酸盐)。

特定抗生素的实例包括(但不限于)红霉素、萘夫西林、头孢唑啉、亚胺培南、氨曲南、庆大霉素、磺胺甲恶唑、万古霉素、环丙沙星、甲氧苄啶、利福平、甲硝哒唑、氯林可霉素、替考拉宁、莫匹罗星、阿奇霉素、克拉霉素、氧氟沙星、洛美沙星、诺氟沙星、萘啶酸、司帕沙星、培氟沙星、氨氟沙星、加替沙星、莫西沙星、吉米沙星、依诺沙星、氟罗沙星、米诺环素、利奈唑胺、替马沙星、托氟沙星、克林沙星、舒巴坦、棒酸、两性霉素B、氟康唑、伊曲康唑、酮康唑和制霉菌素。抗生素的其他实例，如在Sakamoto等人，通过引用并入本文的美国专利第4,642,104号中列出的那些对本领域普通技术人员将是很容易想到的。

如本文所用，术语“样品”以其最广泛的含义使用。在某种意义上说，它是指包括获自任何来源的标品或培养物，以及生物和环境样品。生物样品可获自动物(包括人)并包括液体、固体、组织和气体。生物样品包括血液制品，如血浆、血清等。然而，这样的例子不应当理解为限制适用于本发明的样品类型。

具体实施方式

生物膜是其中细胞彼此粘附和/或粘附在表面上的微生物的聚集体。这些粘附细胞经通常嵌入胞外聚合物(EPS)的自产基质内。生物膜的EPS(也被称为粘液)是通常由胞外DNA、蛋白质和各种结构的多糖构成且由各种组合物构成的聚合物团块。生物膜可以于活体或非活体表面上形成，并代表在自然、工业和临床环境中微生物生命的普遍模式。在生物膜上生长的微生物细胞生理学上不同于相同生物体的浮游细胞，其反过来是可漂浮或游在液体培养基中的单细胞。

响应于许多因素形成微生物生物膜包括但不限于，在表面上特异性或非特异性附着位点的细胞识别、营养暗示，或在某些情况下，通过将浮游细胞暴露于亚抑制浓度的抗生素中。当细胞切换到生物膜生长模式时，其经历行为上的表型转变，其中大批基因被差异调节(Petrova等人，J.Bacteriol.2012May；194(10):2413-25；Stoodley等人,Annu RevMicrobiol.2002；56:187-209)。

虽然本发明不受任何类型的生物膜限定，但是生物膜的形成通常始于自由浮动的微生物对表面的附着。这些第一寄生物最初通过微弱的可逆的范德华力粘附到表面。如果寄生物不立即从表面分离，那么它们就可以使用细胞粘附结构如菌毛更永久地自我固定。

最初的寄生物普遍通过提供更多样化的粘附位点并开始构建有共同生物膜的矩阵促进其他细胞的到来。一些物种不能自身连接到表面，但往往能够自我锚定到基质或直接锚定到更早的寄生物。在这种定殖期间细胞能够通过群体感应来通信，例如使用此类化合物作为N-酰基高丝氨酸内酯(AHL)。一旦定植开始，生物膜通过细胞分裂和更新的组合来增长。生物膜形成的最后阶段被称为发育，虽然本文中术语“形成”和“发育”可互换使用。在此最后阶段，生物膜建立，并且可以仅在形状和尺寸上发生变化。生物膜的发育可使聚合细胞集落(或群体)日益增加抗生素抗性。

来自生物膜集落的细胞的扩散是生物膜的生命周期的重要阶段。扩散使生物膜扩散且定值到新表面。降解生物膜的细胞外基质的酶(如dispersin B和脱氧核糖核酸酶)可在生物膜分散中起作用(Whitchurch等人(2002)Science 295：1487；通过引用将其全文并入本文)。生物膜基质降解酶可以用作抗生物膜试剂(Kaplan等人(2004)AntimicrobialAgents and Chemotherapy 48(7)：2633-6；Xavier等人(2005)Microbiology 151(Pt 12)：3817-32；其每个通过引用将其全文并入本文)。脂肪酸信使(顺式-2-癸烯酸)可诱导分散和抑制生物膜集落的生长。通过铜绿假单胞菌分泌，这种化合物诱导在细菌的几个物种和酵母白色念珠菌中分散(Davies等人(2009)Journal of Bacteriology 191(5)：1393-403；通过引用将其文并入本文)。

生物膜是普遍存在的，并且通常在浸没在或暴露于某些水溶液的固体基质上发现，尽管它们可以形成为在液体表面并还在叶片的表面上的浮动垫，特别是在高湿度的气候条件下。如果有足够的能源用于生长，生物膜将会迅速增长至肉眼可见。许多类型的微生物可以形成生物膜，例如细菌、古细菌、原生动物、真菌和藻类。生物膜可以包含单一类型的微生物(单种群落的生物膜)，或者通常为多种类型。在一些混合物种生物膜中，每组执行特定的代谢功能。

生物膜形成的环境包括(但不限于)：在自然水域(例如，河流、池塘、溪流、海洋、矿泉)中的基质(例如，岩石、鹅卵石)；极端环境(例如，温泉，包括极酸或极碱性pH的水域；冰川)；住宅和工业环境，其中固体表面暴露于液体中(例如，淋浴器、水和污水管道、在食品制备或加工区的地板和柜台、冷却水系统、海洋工程系统)；船体及海洋船舶的内饰；污水及自来水处理设施(例如，水过滤器、管道、保温水箱)；受污染的水域；在活生物体内或在活生物体上(例如牙斑、例如皮肤的表面定植或感染、组织或器官或体腔或在伤口部位的表面；植入表皮；植入物内部)；在植入设备如导管、假体心脏瓣膜、人工关节和子宫内设备的惰性表面；等。

生物膜参与身体中各种各样的微生物感染。其中生物膜涉及的感染过程包括(但不限于)：尿道感染、导管感染、中耳感染、牙菌斑和牙龈炎的形成、隐形眼镜污染(Imamura等人(2008)Antimicrobial Agents and Chemotherapy 52(1):171–82；通过引用将其文并入本文)，和不常见但更致命过程，例如心内膜炎、囊性纤维化感染和永久留置设备(如关节假体和心脏瓣膜)的感染(Lewis等人(2001)Antimicrobial Agents and Chemotherapy 45(4)：999-1007；Parsek等人(2003)Annual Review of Microbiology 57：677-701；每个通过引用其全文并入本文)。细菌生物膜可以损害皮肤伤口愈合，并且减少愈合或治疗感染的皮肤伤口的局部抗菌效率(Davis等人(2008)Wound Repair and Regeneration 16(1)：23-9；通过引用其全文并入本文)。

共凝集是通过在共凝集细胞表面上的互补蛋白粘附素和多糖受体介导的通常不同细菌的高度特异性识别和附着力(Kolenbrander，Annu Rev Microbiol 54，413-437，2000；Rickard等人，Trends Microbiol 11，94-100，2003a)。这个现象不同于自动聚集，这是遗传上相同的细菌彼此识别和粘附(Khemaleelakul等人，J Endod 32，312-318，2006；Rickard等人，FEMS Microbiol Lett 220，133-140，2003b；Van Houdt&Michiels，ResMicrobiol 156，626-633，2005)。共凝集在1970年的人牙菌斑的细菌(Gibbons&Nygaard，Arch Oral Biol 15，1397-1400，1970)之间首次描述，在过去二十年的工作已经表明，它也发生在在废水絮凝体和淡水生物膜中从人体肠道、人类泌尿生殖道分离的细菌之间(Ledder等人，FEMS Microbiol Ecol 66,630-636,2008；Phuong等人,J Biotechnol,2011；Reid等人,Can J Microbiol 34,344-351,1988；Rickard等人,Appl Environ Microbiol66,431-434,2000；Simoe等人,Appl Environ Microbiol 74,1259-1263,2008)。共凝集也已经显示出发生在许多分类学上不同的淡水物种间(Rickard等人,Appl EnvironMicrobiol 68,3644-3650,2002；Rickard等人,2003b,同上；Rickard等人,Appl EnvironMicrobiol 70,7426-7435,2004b；Simoes等人,Appl Environ Microbiol 74,1259-1263,2008)和在浮游和生物膜群中(Rickard等人,J Appl Microbiol 96,1367-1373,2004a)。鞘氨醇单胞菌泳池(芽单胞菌)和藤黄微球菌之间共凝集的研究证明物种共凝集的能力改变在流动和静态环境两者中双物种生物膜发育(Min&Rickard,Appl Environ Microbiol 75,3987-3997,2009；Min等人,Biofouling 26,931-940,2010)。共凝集可介导生物膜的发育、结构变化以及在物种组成上的改变(Hojo等人,J Dent Res 88,982-990,2009；Kolenbrander等人,Periodontol 2000 42,47-79,2006；Rickard等人,2003a，同上)。此外，共凝集可以在促进或阻碍致病菌种与淡水成生物膜一体化中发挥作用(Buswell等人,ApplEnviron Microbiol 64,733-741,1998)。支持这种可能性的证据可以被发现在牙菌斑生物膜的研究中，其中诱导共凝集以促进口腔病原体如牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis)的整合(Kolenbrander等人,Periodontol 2000 42,47-79,2006；Whitmore&Lamont,Mol Microbiol 81,305-314,2011)。

牙菌斑是由上百种可以共同引起口腔和全身性疾病的细菌组成(Jakubovics等人,Oral diseases.2010；16(8):729-39；Kuo等人,Public Health.2008；122(4):417-33.)。在牙菌斑发育期间，细菌感知和响应改变它们在这些生物膜内自我建立的能力的多种外源性细菌或环境衍生的化学物质。

口腔生物膜形成整个工业化和发展中国家的主要问题。从最近的调查数据表明，23.7％的美国成年人有未经治疗的龋齿，而38.5％的成年人有中度至重度牙周炎(National Center for Health Statistics.Health,United States,2011:With SpecialFeature on Socioeconomic Status and Health.Hyattsville,MD:2012；Eke等人,Journal of dental research.2012；91(10):914-20)。.未经治疗的龋齿还会影响15-20％的孩子长达19年，而牙周炎是中老年人群中的主要问题，其中64％的65岁以上的成年人患有严重形式的这种病征(National Center for Health Statistics.Health,UnitedStates,2011:With Special Feature on Socioeconomic Status andHealth.Hyattsville,MD:2012；Eke等人,Journal of dental research.2012；91(10):914-20)。显然，迫切需要用于控制牙菌斑相关的疾病的新方法。

牙菌斑是良好平衡的稳态细菌群体(Marsh等人，Periodontology 2000.2011；55(1):16-35)。本发明的实施例提供了广泛作用的干预，例如改变此类口腔细菌群体的平衡，并且在控制牙菌斑有关的疾病上比目标个体物种的战略更为有效。牙菌斑含有微生物的互动“意识”群体。在清洁牙齿表面上，牙菌斑通过微生物繁衍发育(Jakubovics等人，同上；Kolenbrander等人,Nature reviews Microbiology.2010；8(7):471-80；Kolenbrander等人,Periodontology 2000.2006；42:47-79 23,24)。最初的寄生物，主要是链球菌属，粘附到唾液表膜并且产生生物膜层，其通过共凝集、细胞-细胞信号传导和代谢物识别支持其他物种的整合(Jakubovics等人，同上；Kolenbrander等人,Nature reviewsMicrobiology.2010；8(7):471-80；Hojo等人,Journal of dental research.2009；88(11):982-90；Rickard等人,Trends Microbiol.2003；11(2):94-100；Bowden等人,Advances in dental research.1997；11(1):81-99)。共凝集涉及细菌间的特异性识别和粘附，并使不同物种紧密靠拢。这增加了交换细胞-细胞信号传导分子或代谢物的潜能(Kolenbrander等人,Nature reviews Microbiology.2010；8(7):471-80；Hojo等人，同上)。例如，信号传导分子自体诱导物-2(AI-2)介导共凝集伴侣口腔链球菌和放线菌的互惠生长，并有利于含有共凝集伴侣格氏链球菌和口腔链球菌的生物膜的发育(Cuadra-Saenz等人,Microbiology.2012；158(Pt 7):1783-95；Rickard等人,Molecularmicrobiology.2006；60(6):1446-56.)。重要代谢物的例子包括过氧化氢，其由一些链球菌产生并且抑制其它物种(包括变形链球菌)(Zhu等人,Oxid Med Cell Longev.2012；2012:717843)，以及乳酸，其由链球菌产生并通过共凝集用于能源的韦荣球菌属(Veillonella)物种使用(Egland等人，Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America，2004；101(48):16917-22)。精氨酸对代谢物交换很重要(Jakubovics等人，同上)，但不同于其它通信机制，它还会破坏口腔细菌之间的共凝集和看起来具有对生物膜结构产生重大影响(Edwards等人，Oral microbiology andimmunology.2007；22(4):217-24；Sato等人,J Microbiol Immunol Infect.2012；Ellen等人,Oral microbiology and immunology.1992；7(4):198-203.)。

因此，虽然到目前为止精氨酸接受有限的注意力，但是它是生物膜发育的重要的全局调节物和诱发龋齿或牙周疾病的关键组分(Nascimento等人，Oral microbiology andimmunology.2009；24(2):89-95)。“营养毒力，”即获取来自主机的营养细菌系统被认为是关键因素发病机理，这一概念正逐渐成为感染性疾病的一个重要范例(Abu Kwaik等，Cellular microbiology.2013；15(6):882-90)。尤其是氨基酸通常时对细菌的生长限制资源。即使当物种具有对于氨基酸生物合成所需的所有基因时，它们在一定的条件下可以是功能性营养缺陷型。例如，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)具有编码来自L-谷氨酸的L-精氨酸生物合成的完整遗传途径，但在体外无L-精氨酸的情况下不能生长(Nuxoll等人，PLoS pathogens.2012；8(11):e1003033)。同样，格氏链球菌可以厌氧生物合成L-精氨酸，但是在需氧条件下为官能精氨酸营养缺陷型(Jakubovics等人，同上)。口腔链球菌在体外具有对氨基酸的各种不同需要(Cowman等人，Applied microbiology.1975；30(3)：374-80；Cowman等人，Journal of dental research.1978；57(1):48；Terleckyj等人,Infect Immun.1975；11(4)：656-64)，并且不能很好地理解这些营养缺乏型如何限制牙菌斑增长。早期定植菌从唾液获得大部分营养物质(Bowden等人，Advances in dentalresearch.1997；11(1):81-99)。人的唾液可含有高达40μM游离精氨酸(Van Wuyckhuyse等人，Journal of dental research.1995；74(2):686-90)。格氏链球菌无法在<25μM L-精氨酸下需氧生长(Jakubovics等人，同上)。格氏链球菌生长的精氨酸限制可以通过与口放线菌的共凝集来克服(Jakubovics等人，同上)。与单一培养物相比，格氏链球菌精氨酸生物合成基因的表达强烈下调共凝集，表明共凝集减轻低精氨酸应力。此外，在精氨酸受限的条件下，口放线菌的共凝集支持格氏链球菌增长。因此，细菌间的相互作用对于唾液中生长是重要的。

I.治疗方法

在本公开内容的实施例的发展过程中进行的实验表明：高浓度的精氨酸消除通过格氏链球菌的生物膜形成。生物膜的形成以剂量依赖方式对精氨酸毫摩尔水平高度敏感。

唾液中精氨酸浓度被认为保留低的，由于连续摄取到细胞中和通过细菌精氨酸酶系统(ADS)旋转，这分解精氨酸至ATP，氨和L-谷氨酰胺(Van Wuyckhuyse等人，Journal ofdental research.1995；74(2):686-90)。氨的产生增加斑块的局部pH，这能防止龋齿(Liu等人,International journal of oral science.2012；4(3):135-40.)。机会性病原体铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的ADS在生物膜上被上调，并且这些系统对保护细胞免受氧和糖酵解衍生的羧酸(39，40)是必不可少的。口腔链球菌的ADS已经显示在混合物种系统中影响生物膜形成，其中由S.中间型ADS的L-精氨酸的清除抑制由牙周病原菌牙龈卟啉菌(P.gingivalis)的生物膜形成(Cugini等人，Microbiology.2013；159(Pt 2):275-85)。ADS的产生在转录水平上由ArgR/AhrC家族调节子(如ArcR)调控(Liu等人，Applied andenvironment al microbiology.2008；74(16):5023-30；Zeng等人,Journal ofbacteriology.2006；188(3):941-9))。ArcR在营养丰富的培养基中格氏链球菌生物膜形成是重要的。

本文所述的进一步的实验证实L-精氨酸通过减少生物膜的生物量和减少病原菌的总量和比例来降低生物膜的致病潜力(例如，没有直接的抗微生物活性)；并且L-精氨酸扩大/增强抗菌微生物(如CPC)的活性。这是通过由通过松动生物膜并且还改变细菌的生长速率来提高抗菌微生物的进入；L-精氨酸导致细胞-细胞信号传导失调；L-精氨酸是组合治疗，其上调代谢、改变细胞-细胞信号传导并且抑制细胞-细胞粘连；并且L-精氨酸增加可以对付潜在病原体如变形链球菌的负面影响的有益细菌的比例。

因此，本发明的实施例提供了含有L-精氨酸(例如，单独或与CPC共组合)的组合物(例如，药物或研究的组合物或试剂盒)，以及在治疗或预防细菌感染(例如，牙菌斑)中和在表面的去污(例如，医疗器械的表面)中使用L-精氨酸的药物、工业或研究方法。

在一些实施例中，本公开内容提供了组合物以及用于使用L-精氨酸以破坏生物膜内的细胞-细胞相互作用(附着力)、扰乱细菌稳态、诱导细胞损伤和杀灭、破坏导致稳态的失调/损失的细胞内过程、破坏生物膜细胞-细胞粘连、诱导结构的3D重排、破坏细胞-细胞信号传导、破坏细胞-细胞代谢的相互作用和/或破坏对表面的粘附的组合物和方法。

在一些实施例中，L-精氨酸单独和集体地诱导一种或多种上述的和这些任务，以杀灭和/或降低细胞活性和减少生物膜生物质。在一些实施例中，这也允许对抗微生物剂(如L-精氨酸-抗微生物剂或混合物)改进的杀灭。

在一些实施例中，本发明提供了包含L-精氨酸单独或与药学上可接受的载体或其它期望的缓释材料(例如，清洁剂或消毒剂等)组合的组合物。

在一些实施例中，本公开提供了组合物(例如，牙科护理组合物如牙膏、漱口水等)，其包含L-精氨酸与例如CPC组合。

用于局部施用的药物组合物和制剂可以包括透皮贴剂、软膏、洗剂、乳膏、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体、漱口水和粉末。常规的药物载体，水性、粉末或油性基质，增稠剂等可能是必要的或期望的。

用于口服施用的组合物和制剂包括粉末或颗粒剂、在水或非水介质中的悬浮液或溶液、胶囊剂、小药囊或片剂。增稠剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或粘合剂可能是期望的。

用于肠胃外、鞘内或脑室内施用的组合物和制剂可包括也可以含有缓冲剂、稀释剂和其它适合的添加剂的无菌水溶液，所述添加剂例如(但不限于)渗透增强剂、载体化合物和其他药学上可接受的载体或赋形剂。

本公开的药物组合物包括(但不限于)溶液、乳剂和含脂质体的制剂。这些组合物可由多种组分组成，所述组分包括(但不限于)预形成的液体、自乳化固体和自乳化半固体。

药物制剂，其可以方便地以单位剂量形式存在，可根据制药工业中熟知的常规技术来制备。

组合物可以另外包含在药物组合物中常规发现的其他辅助组分。因此，例如，组合物可含有额外的、相容的、药学活性材料，如(例如)止痒剂、收敛剂、局部麻醉剂或抗炎剂，或可以含有在以物理上配制各种剂型的组合物的其它材料，例如染料、调味剂、防腐剂、抗氧化剂、遮光剂、增稠剂和稳定剂。然而，当添加此类材料时，不应该不适当地与组合物的组分的生物活性干涉。如果需要，该制剂可以是灭菌的并且与助剂混合，所述助剂例如润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、缓冲液、着色剂、调味剂和/或芳香物质等，其不有害地与制剂的活性剂相互作用。

在一些实施例中，药物组合物包含a)L-精氨酸，和b)一种或多种用于杀灭或预防微生物生长(例如，抗生素)或影响在生物膜的生长、形成或健康影响或微生物的其它试剂。

在一些实施例中，本发明提供了使用L-精氨酸治疗或预防细菌感染或存在于表面上的生物膜(如，牙菌斑)的试剂盒、医药组合物或其它施用系统。所述试剂盒可包括任何和所有的用于研究或治疗用途必要的、有用的或足够的组分，包括(但不限于)L-精氨酸、药物载体和有用的，以及用于疗或预防细菌感染有用的、必需的或足够的其它组分。在一些实施例中，试剂盒提供所需组分的子集，其中预期使用者将提供剩余的组分。在一些实施例中，试剂盒包含两个或更多个分离的容器，其中每个容器容纳带递送的组分的子集。任选地，组合物和试剂盒包含其它活性成分以达到所希望的治疗效果。

在一些实施例中，L-精氨酸用来杀灭在共凝集或生物膜中的细菌。包含本文所述的L-精氨酸的组合物发现在杀灭或抑制多种微生物(例如，病原性细菌或真菌)的生长的用途。在一些实施例中，L-精氨酸或含有L-精氨酸的组合物发现在身体中或在身体上的细菌感染(例如，在共凝集或生物膜的细菌感染)的治疗中的用途。在一些实施例中，L-精氨酸或其组合物用于治疗伤口的细菌感染、败血症、在胃或肠中的致病细菌感染等。

在一些实施例中，药物组合物以维持或持续的方式施用(例如，每天一次或多次，每天两次或更多次，每周一次或多次，等等)。在一些实施例中，组合物被连续施用(例如，通过皮肤贴剂、绷带或时间释放制剂)。在一些实施例中，组合物施用一次、两次、五次、十次或更多次。在一些实施例中，组合物施用几周、几月、几年或无限期的时间。

在一些实施例中，L-精氨酸或包含L-精氨酸的组合物发现在医疗设备(例如，导管、窥器等)或可植入医疗设备(如，起搏器、内部除颤器、人造关节或骨头等)的去污中的用途。

在一些实施例中，L-精氨酸或包含L-精氨酸的组合物发现在表面(如，包括生物膜的表面)的去污中的用途。实例包括(但不限于)家居表面、医院或临床表面(如，检查表，操作室等)，等等。

在一些实施例中，L-精氨酸或包含L-精氨酸的组合物发现在食品或食品准备区的去污或保护中的用途。例如，在一些实施例中，在收货后将L-精氨酸施加到食品，以使免受未来的污染或处理现有的污染。

在一些实施例中，L-精氨酸或包含L-精氨酸的组合物发现在治疗和/或预防龋病和牙龈疾病中的用途。在一些实施例中，L-精氨酸被加入到漱口水、牙膏或其它口腔护理产品中。

II.筛选组合物和方法

本公开的实施例提供用于确定在生物膜或浮游细胞种的生物膜组分(例如精氨酸或AI-2)的水平的组合物和方法。精氨酸被链球菌内源化并通过三个不同但相关的调节蛋白的作用感测：ArcR、AhrC和ArgR。当他们结合精氨酸时，这些改变它们的结构，使得它们结合到启动子序列或由启动子释放。

因此，本公开的实施例提供报告在生物膜或浮游细胞培养物中的组分的表达或浓度的质粒。在一些实施例中，所述质粒包括在组成型表达的细菌启动子的控制下的第一可检测(例如，荧光)标记物或第二标记物(例如，不同颜色的荧光标签)，所述第二标记物由在生物膜中的组分(例如，在生物膜或细胞培养物中的精氨酸或AI-2)诱导。本公开不限于特定的启动子或报告基因。荧光标记的实例包括(但不限于)荧光素酶、氯霉素乙酰转移酶、绿色荧光蛋白(GFP)或Mcherry。在一些实施例中，启动子是链球菌启动子(例如，在格氏链球菌中有活性的启动子，如(例如)格氏链球菌DL1 50S核糖体蛋白(SGO_1192)、格氏链球菌argC或arcA启动子或分解代谢物控制蛋白A(SGO_0773))。在一些实施例中，50S核糖体蛋白启动子或其它链球菌核糖体启动子或乳酸乳球菌启动子(如usp45)用作控制第一标记物的组成型表达的启动子。在一些实施例中，分解代谢物控制的蛋白A启动子是AI-2。在一些实施例中，argC或arcA启动子响应于精氨酸。

在一些实施例中，本公开提供使用本文所述的质粒来监控生物膜的组分(例如，精氨酸或AI-2)或浮游的细胞群(例如，在链球菌属如格氏链球菌)的浓度的方法，其包括：a)使链球菌细胞与本文所述的启动子接触；和b)测定标记物的水平。在一些实施例中，在由外部生物膜组分诱导的启动子或组成型启动子控制下来自标记物的信号水平与来自组分的已知量/浓度信号的水平相比(例如，标准曲线)。在一些实施例中，然后荧光的水平在荧光计或成像系统中相关。

在一些实施例中，报告质粒和方法发现在研究、筛分(例如，药物筛选)和诊断应用中的用途。例如，在一些实施例中，将测试化合物(例如，抗微生物药物)加入到生物膜或浮游细胞群中，并且测定测试化合物对生物膜组分(例如，精氨酸)的水平的影响。

实验

为了证明和进一步说明本发明的某些优选实施例和方面，提供以下实例，并且以下实例不应当被理解为限制其范围。

实例1

本实例涉及由单一物种的细菌形成的生物膜。在这些系统中，L-精氨酸对细菌基因调控、表型、代谢和生物膜形成具有不同的影响。

精氨酸感应触发基因调控。

格氏链球菌包含用于L-精氨酸的生物合成的完整遗传途径。然而，像金黄色葡萄球菌，在实验室条件下其时官能精氨酸营养缺陷型(Jakubovics等人，同上，Nuxoll等人，PLoS pathogens.2012；8(11):e1003033)。从精氨酸充满的培养基到精氨酸缺乏的培养基的转变导致格氏链球菌的表型显着变化。除了先前示出由共凝集进行调节的基因外，存在几个充分表征的细胞表面黏附素的表达的显著降低(表1)。在一般情况下，代谢物随着精氨酸生物合成途径(其是强烈上调的)的异常而减少(图2)。在营养限制情况下，这些数据与特异的生物膜分散细胞的状态的发育一致，类似于由二态水生细菌新月柄杆菌产生的(England等人，Journal of bacteriology.2010；192(3):819-33.)。本实例涉及由单一物种的细菌形成的生物膜。在这些系统中，L-精氨酸对细菌基因调控、表型、代谢和生物膜形成具有不同的影响。

生物膜形成在环境有密切关系的微生物膜系统中。

格氏链球菌生物膜的精氨酸依赖性施用的效果在改性Bioflux微流体系统进行评估。从≥6不同志愿者中收集和合并人的唾液(Cuadra-Saenz等人，Microbiology.2012；158(Pt 7):1783-95)，稀释至25％，并且根据模拟不同的条件的需要添加额外补充成分(如蔗糖、氯化血红素、BHI)。请注意，在即使不补充唾液的情况下我们强劲生长生物膜，并且合并的唾液最下化唾液成分的变化。为了获得在合并唾液中游离精氨酸水平的指示，在≥3种不同合并的唾液样品中使用标准技术测量精氨酸(Jakubovics等人，同上；Van Wuyckhuyse等人,Journal of dental research.1995；74(2):686-90)。该Bioflux系统的24个通道都涂有唾液，用单一培养的格氏链球菌(或收获自唾液的多品种生物膜)接种，并且用无细胞唾液在37℃下发育生物膜。20小时后，用活/死染色剂染色细胞，并使用Leica SPE CLSM可视化。使用COMSTAT(Heydorn等人,Microbiology.2000；146(Pt 10):2395-407)、ImageJ(Collins,Biotechniques.2007；43(1Suppl):25-30)以及IMARIS软件(Bitplane,Switzerland)量化生物质和结构生物膜参数。图3示出高浓度的精氨酸(500mM)显著降低存在的生物膜的程度。

精氨酸和细菌生物膜的形成。

精氨酸已经显示在生物膜形成和由革兰氏阳性和革兰氏阴性菌的宿主定植中起关键作用。例如，在囊性纤维化痰中发现的生理浓度下，精氨酸促进铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)生物膜的形成(Bernier等人,Research in microbiology.2011；162(7):680-8)。精氨酸是阻止铜绿假单胞菌分群的唯一氨基酸，因此，在此物种中促进固着生活方式中起着关键作用(Bernier等人，同上)。在金黄色葡萄球菌中，在精氨酸生物合成途径中的最终基因，argH，是在小鼠肾脏脓肿模型中对于毒性必需的，表明精氨酸被限制在体内(Nuxoll等人，同上)。许多口腔链球菌是营养缺陷型或对精氨酸条件性营养缺陷型(Jakubovics等人，同上，Cowman等人,Applied microbiology.1975；30(3):374-80；Terleckyj等人,Infect Immun.1975；11(4):656-64；Cowman等人,Appliedmicrobiology.1974；27(1):86-92；Rogers等人,Journal of generalmicrobiology.1990；136(12):2545-50)。使用argH突变和补充株调查格氏链球菌精氨酸生物合成途径对在唾液生物膜的生长的重要性。本发明并不限于特定的机理。实际上，机制的理解对于实践本发明不是必须的。尽管如此，可以预期的是精氨酸为对于L-精氨酸的生物合成缺陷型链球菌生长为在唾液生物膜中的单一物种菌落的限制性营养物。此外，可以预期的是，与生物膜中的其它物种的共凝集克服L-精氨酸限制的效果，但是通过添加升高量的L-精氨酸而受破坏。

在生物膜中的精氨酸分解代谢。

与浮游细胞相比，由于在编码精氨酸脱亚胺酶系统(ADS)的基因的表达的增加，在铜绿假单胞菌的生物膜细胞中，精氨酸代谢被上调(Xu等人,PloS one.2013；8(2):e57050；Sauer等人,Journal of bacteriology.2002；184(4):1140-54)。ADS是在该生物体中无氧代谢的重要组分。转换到ADS介导的厌氧发酵与铜绿假单胞菌对环丙沙星和妥布霉素的增加的易感性相关(Borriello等人，Antimicrobial agents and chemotherapy.2004；48(7):2659-64)。ADS在金黄色葡萄球菌的致病中也是重要的。实际上，金黄色葡萄球菌的USA300致病谱系已经获得了遗传元素，称为精氨酸分解代谢移动元件(ACME)，其中包含编码ADS途径的基因，并且被认为是促进在皮肤上生长和存活的关键因素(Otto等人,International journal of medical microbiology:IJMM.2013)。这样，ACME可以对于USA300菌株的高透射性非常重要。

高浓度的精氨酸负面地影响某些口腔细菌定植口腔生物膜的能力。精氨酸已经示出抑制口腔细菌之间的若干不同的共凝集相互作用(Edwards等人,Oral microbiologyand immunology.2007；22(4):217-24；George等人,Oral microbiology andimmunology.1992；7(5):285-90.PubMed PMID:1494452；Kaplan等人,Molecularmicrobiology.2009；71(1):35-47；Takemoto等人,Journal of periodontalresearch.1993；28(1):21-6.；Nagata等人,Journal of dental research.1990；69(8):1476-9.)。本文所述的数据表明，口腔生物膜内的共凝集的破坏导致细菌从生物膜的释放。营养成分诱导铜绿假单胞菌生物膜的扩散，并且这种现象涉及精氨酸代谢所需的基因(Sauer等人,Journal of bacteriology.2004186(21):7312–7326)。图4示出在格氏链球菌中编码ArcR的基因中，精氨酸脱亚胺酶系统的基因调节子对于由格氏链球菌的生物膜形成是必须的，由于缺乏arcR基因的菌株不形成强生物膜。因此，L-精氨酸是生物膜形成的中心调节子。

表1.选择跟随低精氨酸的转变强烈调节的格式链球菌基因。

对于多基因位点，显示通过基因座的平均倍数变化。

实例2

本实施例描述L-精氨酸对包含在代表人类口腔的条件下生长的物种的口腔生物膜的影响。使用基于微流体的方法，使用人唾液作为接种物并且25％的过滤灭菌的人唾液作为营养源，证明HCL-均衡的L-精氨酸(LAHCL)以浓度依赖性的方式使口服生物膜不稳定。去稳定表示为生物膜结构的损失和细菌群落成员的变化，由激光共聚焦显微镜和454焦磷酸测序确定。非常有限的抗菌效果是显而易见的，并仅检测为生物膜扰动的结果，以及对去稳定的最佳浓度为50mM至500mM。由于使用HCl平衡的L-精氨酸(L-精氨酸单盐酸盐)和人唾液的缓冲能力，记录到pH值没有实质性的变化。

由于传统的控制口腔生物膜的方法在很大程度上依赖于抗微生物剂，L-精氨酸被证实去稳定效应，与其他抗微生物剂具有协同效应以更有效地对灭活生物膜细胞进行研究。混合L-精氨酸与西吡氯铵(CPC)导致至少五倍大的生物膜失活(通过活/死染色)。总的来说，证实L-精氨酸在代表人类口腔的条件下具有广阔的口腔生物膜去稳定影响。这种影响用来去除生物膜或加强传统的基于CPC的抗菌治疗战略。

结果示于图5至图11中。图5示出在L-精氨酸(500mM)处理生物膜的群体组分的变化。图6示出在静态(不流动)微孔板系统中L-精氨酸(CLSM)对在合并的过滤灭菌唾液中发育的唾液衍生群体的细菌的多品种生物膜的影响。500mM的L-精氨酸去稳定多品种口腔生物膜群体以减少生物膜的生物量(以及因此细菌(包括病原体)的总数)，也使生物膜相对于结构更加扩散。虽然在指示非响应死/受损细胞留在生物膜中的红色“信号”中存在轻微的统计学显著，但并没有观察到实质性的杀灭。

图7示出代表性3D透视图和从在Bioflux^TM流动的唾液生物膜系统中在不同浓度的L-精氨酸单盐酸盐(LAHCl)中发育20小时的口腔生物膜的计算图像分析得出的生物膜特性。绿色信号表示存活的活细胞，且红色信号表示受损/死细胞。关联表显示在细胞活力、生物膜的生物量、厚度和粗糙度的变化。从跨三个实验和标准偏差的至少18个透视图中衍生的数据示于括号内。*P<0.05；**P<0.01；**P<0.001：来自CFS控制的显著差异。

图9示出L-精氨酸使多品种口腔生物膜群体去稳定，以提高CPC的渗透。结果，低CPC浓度用于实现相同水平的杀灭/灭活/细胞损伤。

图10示出在哈维氏弧菌报告菌株BB170标准化为阳性对照(BB152)的荧光素酶产生的成倍诱导。用给定浓度的精氨酸的纯CFS(无细胞唾液)控制运行与微流体流出进行比较，其包含具有用给定浓度的L-精氨酸生长的细菌的任何分泌的分子。首先通过取每个浓度4个试验的平均值并用对于阴性对照的平均除以它们，产生感应数来产生值。从多品种生物膜产生的AI-2的量随着用于治疗他们的精氨酸浓度增加而增加。这表明L-精氨酸激发细菌群体，因为AI-2是用于代谢的代理。高AI-2也可对群体具有去稳定影响，这可以解释或有助于在生物膜中可见的结构变化。

图11示出应用L-精氨酸破坏细菌生物膜群体，而D-精氨酸不具有相同的效果。因此，精氨酸的去稳定影响对L型是特异的。

总之，这些实例证明L-精氨酸通过减少生物膜的生物量和减少病原菌的总量和比例来降低生物膜的致病潜力；L-精氨酸扩大/增强抗菌微生物(如CPC)的活性。这是通过由通过松动生物膜并且还改变细菌的生长速率来提高抗菌微生物的进入；L-精氨酸导致细胞-细胞信号传导失调；L-精氨酸是组合治疗，其上调代谢、改变细胞-细胞信号传导并且抑制细胞-细胞粘连；并且L-精氨酸增加可以对付潜在病原体如变形链球菌的负面影响的有益细菌的比例。韦荣球菌(Veillonella)物种的比例在生物膜中增加，如非龋齿链球菌的比例。

实例3

质粒(参见例如图12)被用来监测在精氨酸或AI-2的存在下报告基因的表达。对描述于England等人(Proc Natl Acad Sci U S A.2004 Nov 30；101(48):16917-22.Epub2004Nov 16)中的pPE1010主链进行修饰，以在格氏链球菌DL1或其它物种的链球菌中表达荧光基因如GFP或Mcherry。具体地讲，将来自差异调节的基因的启动子插入隐匿在pPE1010上的GFP或Mcherry基因的上游(或类似的链球菌质粒穿梭载体系统)以差异表达(图12A和12B)。实例(图12B)执行示出当暴露于外源添加的自体诱导物-2(AI-2)时，由50S核糖体蛋白(SGO_1192；负责高度丰富的50S核糖体蛋白L10的基因rplJ)最小化差异表达与由分解代谢物控制蛋白A(SGO_0773；ccpA)的不同差异基因表达的比较。该质粒提供用于监测在生物膜中的细菌的组成型产生的荧光探针和可在生物膜(例如在牙斑生物膜中发现的那些)中报告精氨酸(或AI-2)的浓度的报告系统。

所有出版物、专利以及在上述说明书中提及的专利申请和登记号通过引用其全文并入本文。尽管已经结合具体实施例对本发明进行了描述，但是应当理解的是所要求保护的本发明不应不适当地局限于此类具体实施例中。实际上，对本发明的描述的组合物和方法的各种修改和变型对本领域的普通技术人员将是显而易见，并且旨在在以下权利要求的范围内。

Claims

1.一种诱导细胞损伤、杀灭细胞、破坏导致稳态的失调/损失的细胞内过程、破坏细胞-细胞粘连、诱导结构的三维重排、破坏细胞-细胞信号传导、破坏细胞-细胞代谢的相互作用、破坏对表面的粘附、减少生物膜的致病潜力、减少生物膜质量、降低生物膜中病原菌的比例、增加生物膜中有益菌的比例和/或防止生物膜中微生物的生长的方法，所述方法包括：

使生物膜中的细菌与至少1mM浓度的无细胞的L-精氨酸接触，其中所述接触导致以下一种或多种：诱导细胞损伤、杀灭细胞、破坏导致稳态的失调/损失的细胞内过程、破坏细胞-细胞粘连、诱导结构的三维重排、破坏细胞-细胞信号传导、破坏细胞-细胞代谢的相互作用、破坏对表面的粘附、减少生物膜的致病潜力、增加生物膜中有益菌的比例和防止所述微生物的生长。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述微生物是细菌。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述细菌在共凝集物中。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述生物膜是口腔生物膜。

5.根据权利要求2所述的方法，其中所述细菌在具有多个不同的细菌种类的共凝集物或生物膜中。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述L-精氨酸防止所述细菌的共凝集或脱粘附/分散。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述L-精氨酸以至少100mM的浓度存在。

8.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述L-精氨酸以至少200mM的浓度存在。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述L-精氨酸以至少500mM的浓度存在。

10.根据权利要求5所述的方法，其中所述细菌种类是链球菌属和放线菌属。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述细菌种类是格氏链球菌和口放线菌。

12.根据权利要求1所述的方法，还包括使所述细菌与氯化十六烷基吡啶(CPC)接触。

13.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物膜在唾液中，并且所述L-精氨酸破坏所述生物膜没有抗微生物活性。

14.包含至少1mM浓度的L-精氨酸以导致以下一种或多种的组合物的用途：诱导细胞损伤、杀灭细胞、破坏导致稳态的失调/损失的细胞内过程、破坏细胞-细胞粘连、诱导结构的三维重排、破坏细胞-细胞信号传导、破坏细胞-细胞代谢的相互作用、破坏对表面的粘附、减少生物膜的致病潜力、减少生物膜质量、降低生物膜中病原菌的比例、增加生物膜中有益菌的比例和防止生物膜中微生物的生长。

15.根据权利要求14所述的用途，其中所述微生物是细菌。

16.根据权利要求15所述的用途，其中所述细菌在共凝集物中。

17.根据权利要求14至16中任一项所述的用途，其中所述生物膜是口腔生物膜。

18.根据权利要求15所述的用途，其中所述细菌在具有多个不同的细菌种类的共凝集物或生物膜中。

19.根据权利要求14至18中任一项所述的用途，其中所述L-精氨酸防止所述细菌的共凝集或脱粘附/分散。

20.根据权利要求14至19中任一项所述的用途，其中所述L-精氨酸以至少100mM的浓度存在。

21.根据权利要求14至20中任一项所述的用途，其中所述L-精氨酸以至少200mM的浓度存在。

22.根据权利要求14至21中任一项所述的用途，其中所述L-精氨酸以至少500mM的浓度存在。

23.根据权利要求18所述的用途，其中所述细菌种类是链球菌属和放线菌属。

24.根据权利要求23所述的用途，其中所述细菌种类是格氏链球菌和口放线菌。

25.根据权利要求14所述的用途，其中所述组合物还包含CPC。

26.根据权利要求14的用途，其中所述生物膜在唾液中，并且所述L-精氨酸破坏所述生物膜没有抗微生物活性。

27.一种诱导细胞损伤、杀灭细胞、破坏导致稳态的失调/损失的细胞内过程、破坏细胞-细胞粘连、诱导结构的三维重排、破坏细胞-细胞信号传导、破坏细胞-细胞代谢的相互作用、破坏对表面的粘附、减少生物膜的致病潜力、减少生物膜质量、降低生物膜中病原菌的比例、增加生物膜中有益菌的比例和/或防止生物膜中微生物的生长的方法，所述方法包括：

使生物膜中的细菌与至少1mM浓度的无细胞的L-精氨酸与CPC的组合接触，其中所述接触导致以下一种或多种：诱导细胞损伤、杀灭细胞、破坏导致稳态的失调/损失的细胞内过程、破坏细胞-细胞粘连、诱导结构的三维重排、破坏细胞-细胞信号传导、破坏细胞-细胞代谢的相互作用、破坏对表面的粘附、减少生物膜的致病潜力、增加生物膜中有益菌的比例和防止所述微生物的生长。

28.包含至少1mM浓度的L-精氨酸与CPC的组合导致以下一种或多种的组合物的用途：诱导细胞损伤、杀灭细胞、破坏导致稳态的失调/损失的细胞内过程、破坏细胞-细胞粘连、诱导结构的三维重排、破坏细胞-细胞信号传导、破坏细胞-细胞代谢的相互作用、破坏对表面的粘附、减少生物膜的致病潜力、减少生物膜质量、降低生物膜中病原菌的比例、增加生物膜中有益菌的比例和防止生物膜中微生物的生长。

29.一种报告生物膜或浮游细胞群的成分的表达或浓度的质粒，其中所述质粒包含在组成型启动子控制下的第一标记物或在由所述成分诱导的启动子控制下的第二标记物。

30.根据权利要求29所述的质粒，其中所述标记物是荧光标记物。

31.根据权利要求30所述的质粒，其中所述荧光标记物是GFP或Mcherry。

32.根据权利要求29所述的质粒，其中所述第一启动子是链球菌核糖体启动子。

33.根据权利要求32所述的质粒，其中所述启动子是格氏链球菌DL1 50S核糖体蛋白(SGO_1192)启动子。

34.根据权利要求29所述的质粒，其中所述第二启动子是格氏链球菌分解代谢控制蛋白A(SGO_0773)或格氏链球菌argC或arcA启动子。

35.一种链球菌细胞，其包含权利要求29至34中任一项所述的质粒。

36.根据权利要求35所述的链球菌细胞，其中所述细胞是格氏链球菌。

37.根据权利要求35所述的链球菌细胞，其中所述细胞存在于生物膜中。

38.一种监测生物膜的成分的浓度的方法，所述方法包括：

a)使链球菌细胞与权利要求29至34中任一项所述的质粒接触；以及

b)测量所述标记物的水平。

39.根据权利要求38所述的方法，其中所述成分是精氨酸或AI-2。

40.根据权利要求38所述的方法，其中所述第一或第二标记物的表达水平与所述成分的水平相关。

41.根据权利要求38所述的方法，还包括使所述细胞与测试化合物接触的步骤。

42.根据权利要求41所述的方法，其中所述测试化合物为药物。

43.根据权利要求29至34中任一项所述的质粒监测生物膜或浮游细胞培养物的成分的浓度的用途。

44.根据权利要求43所述的用途，其中所述成分是精氨酸或AI-2。

45.根据权利要求43所述的用途，其中所述第一或第二标记物的表达水平与所述成分的水平相关。

46.根据权利要求43所述的用途，还包括使所述细胞与测试化合物接触的步骤。

47.根据权利要求46所述的方法，其中所述测试化合物为药物。