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CN106008272A - 阳离子性脂质 - Google Patents

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CN106008272A
CN106008272A CN201610312285.1A CN201610312285A CN106008272A CN 106008272 A CN106008272 A CN 106008272A CN 201610312285 A CN201610312285 A CN 201610312285A CN 106008272 A CN106008272 A CN 106008272A
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CN
China
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compound
acid
nucleic acid
lipid
cationic lipid
Prior art date
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Pending
Application number
CN201610312285.1A
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English (en)
Inventor
洼山刚之
江良公宏
直井智幸
八木香机
细江慎太郎
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kyowa Kirin Co Ltd
Original Assignee
Kyowa Hakko Kirin Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kyowa Hakko Kirin Co Ltd filed Critical Kyowa Hakko Kirin Co Ltd
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Pending legal-status Critical Current

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Abstract

本发明提供使得容易将核酸导入到例如细胞内的式(A)表示的阳离子性脂质等、包含该阳离子性脂质及核酸的组合物、使用包含该阳离子性脂质及核酸的组合物将核酸导入细胞内的方法等，所述式(A)中，R1为链烯基等；R2为链烯基等；R3及R4为烷基，或者连接在一起形成亚烷基，或者R3与R5一起形成亚烷基；R5为氢原子等，或者与R3一起形成亚烷基；X1为亚烷基；X2为单键，或者为亚烷基。

Description

阳离子性脂质
本申请是发明名称为“阳离子性脂质”、申请日为2013年7月8日的中国发明专利申请201380046439.1(PCT申请号为PCT/JP2013/068682)的分案申请。
技术领域
本发明涉及使得容易将核酸导入到例如细胞内等的阳离子性脂质、包含该阳离子性脂质的组合物等。
背景技术
阳离子性脂质是具有脂质亲和性区域和亲水性区域的两亲性分子，所述脂质亲和性区域含有一个或多个烃基，所述亲水性区域含有至少一个带正电的极性首基(headgroup)。阳离子性脂质与核酸等巨大分子通过形成以总电荷计带正电的复合体，使得核酸等巨大分子容易通过细胞的原生质膜进入细胞质，因此阳离子性脂质是有用的。可在体外及体内进行的该过程作为转染而被人们知晓。
专利文献1及2公开了一种阳离子性脂质及包含该脂质的脂质粒子，所述阳离子性脂质有利于在体内将核酸送达至细胞内，并且有利于在适于治疗疾病的核酸-脂质粒子组合物中使用。专利文献1中公开了例如2,2－二亚油基－4－(2－二甲基氨基乙基)－[1,3]－二氧戊环(2,2－dilinoleyl－4－(2－dimethylaminoethyl)－[1,3]－dioxolane；DLin－KC2－DMA，结构式如下所示)等阳离子性脂质，
专利文献2中公开了例如4－(二甲基氨基)丁酸(6Z,9Z,28Z,31Z)－三十七碳－6,9,28,31－四烯－19－基酯((6Z,9Z,28Z,31Z)－heptatriaconta－6,9,28,31－tetraen－19－yl 4－(dimethylamino)butanoate；DLin－MC3－DMA，结构式如下所示)等阳离子性脂质，
现有技术文献
专利文献
专利文献1:国际公开第2010/042877号小册子
专利文献2:国际公开第2010/054401号小册子
发明内容
本发明的目的在于提供使得容易将核酸导入到例如细胞内等的阳离子性脂质、包含该阳离子性脂质的组合物等。
本发明涉及以下的(1)～(22)。
(1)式(A)、式(B)或式(C)表示的阳离子性脂质，
(式(A)中，R1为碳原子数8～24的直链状或支链状的烷基、链烯基或者炔基，
R2为碳原子数8～24的直链状或支链状的烷基、链烯基或者炔基，烷氧基乙基，烷氧基丙基，链烯基氧基乙基，链烯基氧基丙基，炔氧基乙基或炔氧基丙基，
R3及R4相同或不同，为碳原子数1～3的烷基，或者连接在一起形成碳原子数2～8的亚烷基，或者R3与R5一起形成碳原子数2～8的亚烷基，
R5为氢原子，碳原子数1～6的烷基，碳原子数3～6的链烯基，氨基，单烷基氨基，羟基，烷氧基，氨基甲酰基，单烷基氨基甲酰基，二烷基氨基甲酰基，或者被相同或不同的1～3个氨基、单烷基氨基、羟基、烷氧基、氨基甲酰基、单烷基氨基甲酰基或二烷基氨基甲酰基取代的碳原子数1～6的烷基或碳原子数3～6的链烯基，或者与R3一起形成碳原子数2～8的亚烷基，
X1为碳原子数1～6的亚烷基，
X2为单键，或者为碳原子数1～6的亚烷基，其中，X1与X2的碳原子数之和为7以下，R5为氢原子时，X2为单键，R5与R3一起形成碳原子数2～6的亚烷基时，X2为单键，或者为亚甲基或亚乙基)；
(式(B)中，R6为碳原子数8～24的直链状或支链状的烷基、链烯基或者炔基，
R7为碳原子数8～24的直链状或支链状的烷基、链烯基或者炔基，烷氧基乙基，烷氧基丙基，链烯基氧基乙基，链烯基氧基丙基，炔氧基乙基或炔氧基丙基)；
(式(C)中，R8为碳原子数8～24的直链状或支链状的烷基、链烯基或者炔基，
R9为碳原子数8～24的直链状或支链状的烷基、链烯基或者炔基，烷氧基乙基，烷氧基丙基，链烯基氧基乙基，链烯基氧基丙基，炔氧基乙基或炔氧基丙基，
X3为碳原子数1～3的亚烷基，
R10为氢原子，或碳原子数1～3的烷基)。
(2)如上述(1)所述的阳离子性脂质，其中，R1、R2、R6、R7、R8及R9各自独立地为十四烷基、十六烷基、(Z)-十四碳-9-烯基、(Z)-十六碳-9-烯基、(Z)-十八碳-6-烯基、(Z)-十八碳-9-烯基、(E)-十八碳-9-烯基、(Z)-十八碳-11-烯基、(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基、(9Z,12Z,15Z)-十八碳-9,12,15-三烯基、(Z)-二十碳-11-烯基、(11Z,14Z)-二十碳-11,14-二烯基或(Z)-二十二碳-13-烯基。
(3)如上述(1)所述的阳离子性脂质，其中，R1、R2、R6、R7、R8及R9各自独立地为(Z)-十八碳-9-烯基、(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基或(11Z,14Z)-二十碳-11,14-二烯基。
(4)如上述(1)～(3)中任一项所述的阳离子性脂质，其中，X1为碳原子数1～3的亚烷基，X2为单键或亚甲基。
(5)如上述(1)～(4)中任一项所述的阳离子性脂质，其中，X3为亚甲基或亚乙基。
(6)如上述(1)～(5)中任一项所述的阳离子性脂质，其中，R3及R4相同或不同，为甲基或乙基，或者连接在一起形成正亚戊基或正亚己基。
(7)如上述(1)～(5)中任一项所述的阳离子性脂质，其中，R3及R5连接在一起形成正亚丙基或正亚丁基，R4为甲基或乙基。
(8)如上述(1)～(7)中任一项所述的阳离子性脂质，其中，R5及R10各自独立地为氢原子或甲基。
(9)一种组合物，含有上述(1)～(8)中任一项所述的阳离子性脂质及核酸。
(10)如上述(9)所述的组合物，其中，该阳离子性脂质与该核酸形成复合体，或者该阳离子性脂质与中性脂质及/或高分子组合所得的物质与该核酸形成复合体。
(11)如上述(9)所述的组合物，其中，该阳离子性脂质与该核酸形成复合体，或者该阳离子性脂质与中性脂质及/或高分子组合所得的物质与该核酸形成复合体，所述组合物含有将该复合体封入的脂质膜。
(12)如上述(9)～(11)中任一项所述的组合物，其中，核酸为具有利用了RNA干扰(RNAi)的、靶基因表达抑制作用的核酸。
(13)如上述(12)所述的组合物，其中，靶基因为在肝脏、肺、肾脏或脾脏中表达的基因。
(14)使用上述(9)～(13)中任一项所述的组合物将该核酸导入细胞内的方法。
(15)如上述(14)所述的方法，其中，细胞为哺乳类动物的肝脏、肺、肾脏或脾脏中的细胞。
(16)如上述(14)或(15)所述的方法，其中，向细胞内导入的方法是通过静脉内施予该组合物来向细胞内导入的方法。
(17)肝脏、肺、肾脏或脾脏相关疾病的治疗方法，包括将上述(13)所述的组合物施予至哺乳动物的步骤。
(18)如上述(17)所述的方法，其中，施予方法为静脉内施予。
(19)一种药物，包含上述(12)所述的组合物，用于治疗疾病。
(20)如上述(19)所述的药物，用于静脉内施予。
(21)肝脏、肺、肾脏或脾脏相关疾病的治疗剂，包含上述(13)所述的组合物。
(22)如上述(21)所述的肝脏、肺、肾脏或脾脏相关疾病的治疗剂，用于静脉内施予。
通过将包含本发明的阳离子性脂质及核酸的组合物施予至哺乳类等，能够将该核酸容易地导入例如细胞内等。
附图说明
[图1]表示将实施例49中得到的制剂(使用了化合物A-1,3～5中的各化合物的制剂)及比较例1中得到的制剂(使用了DLin-KC2-DMA及化合物XI-1～3中的各化合物的制剂)导入来自人肝癌的细胞株HepG2细胞内后的、靶基因的mRNA的表达率。纵轴表示将阴性对照作为1时的靶基因的mRNA的表达率，横轴表示核酸浓度(nM)、使用的阳离子性脂质的化合物编号。
[图2]表示将实施例49中得到的制剂(使用了化合物A-1～5中的各化合物的制剂)及比较例1中得到的制剂(使用了DLin-KC2-MDA的制剂)分别以相当于0.3mg/kg的siRNA的量施予至小鼠48小时后的血清中胆固醇的值。纵轴表示将生理盐水施予组作为100时的血清中胆固醇值的相对值。
[图3]表示将实施例49中得到的制剂(使用了化合物A-1～5中的各化合物的制剂)及比较例1中得到的制剂(使用了DLin-KC2-MDA及化合物XI-1～3中的各化合物的制剂)分别以相当于3mg/kg的siRNA的量施予至小鼠48小时后的血清中胆固醇的值。纵轴表示将生理盐水施予组作为100时的血清中胆固醇值的相对值。
[图4]表示将实施例50或51中得到的制剂(使用了化合物A-6、A-1、A-7及A-8中的各化合物的制剂)分别以相当于0.3mg/kg的siRNA的量施予至小鼠48小时后的血浆中Factor VII蛋白的浓度。纵轴表示将生理盐水施予组作为100时的血浆中Factor VII蛋白的浓度的相对值。
[图5]表示将实施例51中得到的制剂(使用了化合物A-9～12、B-1、B-8及C-1中的各化合物的制剂)分别以相当于0.3mg/kg的siRNA的量施予至小鼠48小时后的血浆中Factor VII蛋白的浓度。纵轴表示将生理盐水施予组作为100时的血浆中Factor VII蛋白的浓度的相对值。
[图6]表示将实施例51中得到的制剂(使用了化合物A-5及A-13～21中的各化合物的制剂)分别以相当于0.3mg/kg的siRNA的量施予至小鼠48小时后的血浆中Factor VII蛋白的浓度。纵轴表示将生理盐水施予组作为100时的血浆中Factor VII蛋白的浓度的相对值。
[图7]表示将实施例51中得到的制剂(使用了化合物A-28～36中的各化合物的制剂)分别以相当于0.3mg/kg的siRNA的量施予至小鼠48小时后的血浆中Factor VII蛋白的浓度。纵轴表示将生理盐水施予组作为100时的血浆中Factor VII蛋白的浓度的相对值。
[图8]表示将实施例51中得到的制剂(使用了化合物C-2～5中的各化合物的制剂)分别以相当于0.3mg/kg的siRNA的量施予至小鼠48小时后的血浆中Factor VII蛋白的浓度。纵轴表示将生理盐水施予组作为100时的血浆中Factor VII蛋白的浓度的相对值。
[图9]表示将比较例2中得到的制剂(使用了化合物XI-4～8中的各化合物的制剂)分别以相当于0.3mg/kg的siRNA的量施予至小鼠48小时后的血浆中Factor VII蛋白的浓度。纵轴表示将生理盐水施予组作为100时的血浆中Factor VII蛋白的浓度的相对值。
[图10]表示将实施例52或53中得到的制剂(使用了化合物A-1、A-6、A-7、A-10、A-12、B-8及C-1中的各化合物的制剂)分别以相当于0.3或0.1mg/kg的siRNA的量施予至小鼠48小时后的血浆中Factor VII蛋白的浓度。纵轴表示将生理盐水施予组作为100时的血浆中Factor VII蛋白的浓度的相对值。■表示0.3mg/kg施予组，□表示0.1mg/kg施予组。
[图11]表示将实施例53中得到的制剂(使用了化合物A-5及A-13～21中的各化合物的制剂)分别以相当于0.3或0.03mg/kg的siRNA的量施予至小鼠48小时后的血浆中Factor VII蛋白的浓度。纵轴表示将生理盐水施予组作为100时的血浆中Factor VII蛋白的浓度的相对值。■表示0.3mg/kg施予组，□表示0.03mg/kg施予组。
[图12]表示将实施例53中得到的制剂(使用了化合物A-28～36中的各化合物的制剂)分别以相当于0.3或0.03mg/kg的siRNA的量施予至小鼠48小时后的血浆中Factor VII蛋白的浓度。纵轴表示将生理盐水施予组作为100时的血浆中Factor VII蛋白的浓度的相对值。■表示0.3mg/kg施予组，□表示0.03mg/kg施予组。
[图13]表示将实施例53中得到的制剂或者与实施例52或53同样地得到的制剂(使用了化合物A-1、A-6、A-10及C-1～5中的各化合物的制剂)及比较例3中得到的制剂(使用了化合物XI-9的制剂)分别以相当于0.3或0.03mg/kg的siRNA的量施予至小鼠48小时后的血浆中Factor VII蛋白的浓度。纵轴表示将生理盐水施予组作为100时的血浆中Factor VII蛋白的浓度的相对值。■表示0.3mg/kg施予组，□表示0.03mg/kg施予组。
[图14]表示将实施例54中得到的制剂(使用了化合物A-1、A-7及A-10中的各化合物的制剂)分别以相当于0.3或0.1mg/kg的siRNA的量施予至小鼠48小时后的血浆中FactorVII蛋白的浓度。纵轴表示将生理盐水施予组作为100时的血浆中Factor VII蛋白的浓度的相对值。■表示0.3mg/kg施予组，□表示0.1mg/kg施予组。
具体实施方式
本发明的阳离子性脂质是式(A)、式(B)或式(C)表示的阳离子性脂质，
(式(A)中，R1为碳原子数8～24的直链状或支链状的烷基、链烯基或者炔基，
R2为碳原子数8～24的直链状或支链状的烷基、链烯基或者炔基，烷氧基乙基，烷氧基丙基，链烯基氧基乙基，链烯基氧基丙基，炔氧基乙基或炔氧基丙基，
R3及R4相同或不同，为碳原子数1～3的烷基，或者连接在一起形成碳原子数2～8的亚烷基，或者R3与R5一起形成碳原子数2～6的亚烷基，
R5为氢原子，碳原子数1～6的烷基，碳原子数3～6的链烯基，氨基，单烷基氨基，羟基，烷氧基，氨基甲酰基，单烷基氨基甲酰基，二烷基氨基甲酰基，或者被相同或不同的1～3个氨基、单烷基氨基、羟基、烷氧基、氨基甲酰基、单烷基氨基甲酰基或二烷基氨基甲酰基取代的碳原子数1～6的烷基或碳原子数3～6的链烯基，或者与R3一起形成碳原子数2～8的亚烷基，
X1为碳原子数1～6的亚烷基，
X2为单键，或者为碳原子数1～6的亚烷基，其中，X1与X2的碳原子数之和为7以下，R5为氢原子时，X2为单键，R5与R3一起形成碳原子数2～6的亚烷基时，X2为单键，或者为亚甲基或亚乙基)；
(式(B)中，R6为碳原子数8～24的直链状或支链状的烷基、链烯基或者炔基，
R7为碳原子数8～24的直链状或支链状的烷基、链烯基或者炔基，烷氧基乙基，烷氧基丙基，链烯基氧基乙基，链烯基氧基丙基，炔氧基乙基或炔氧基丙基)；
(式(C)中，R8为碳原子数8～24的直链状或支链状的烷基、链烯基或者炔基，
R9为碳原子数8～24的直链状或支链状的烷基、链烯基或者炔基，烷氧基乙基，烷氧基丙基，链烯基氧基乙基，链烯基氧基丙基，炔氧基乙基或炔氧基丙基，
X3为碳原子数1～3的亚烷基，
R10为氢原子或碳原子数1～3的烷基)。
以下，有时也将式(A)表示的化合物称为化合物(A)。对于其他式子编号的化合物也同样。
作为碳原子数8～24的直链状或支链状的烷基，可以举出例如辛基、癸基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、2,6,10-三甲基十一烷基、十五烷基、3,7,11-三甲基十二烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、6,10,14-三甲基十五烷-2-基、十九烷基、2,6,10,14-四甲基十五烷基、二十烷基、3,7,11,15-四甲基十六烷基、二十一烷基、二十二烷基、二十三烷基、二十四烷基等。
作为碳原子数8～24的直链状或支链状的链烯基，为具有1个以上的双键的碳原子数8～24的直链状或支链状的链烯基即可，可以举出例如(Z)-十四碳-9-烯基、(Z)-十六碳-9-烯基、(Z)-十八碳-6-烯基、(Z)-十八碳-9-烯基、(E)-十八碳-9-烯基、(Z)-十八碳-11-烯基、(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基、(9Z,12Z,15Z)-十八碳-9,12,15-三烯基、(Z)-二十碳-11-烯基、(11Z,14Z)-二十碳-11,14-二烯基、3,7,11-三甲基十二碳-2,6,10-三烯基、3,7,11,15-四甲基十六碳-2-烯基、(Z)-二十二碳-13-烯基等，可优选举出(Z)-十六碳-9-烯基、(Z)-十八碳-6-烯基、(Z)-十八碳-9-烯基、(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基、(Z)-二十碳-11-烯基、(11Z,14Z)-二十碳-11,14-二烯基、(Z)-二十二碳-13-烯基等。
作为碳原子数8～24的直链状或支链状的炔基，为具有1个以上的叁键的碳原子数8～24的直链状或支链状的炔基即可，可以举出例如十二碳-11-炔基、十四碳-6-炔基、十六碳-7-炔基、十六碳-5,7-二炔基、十八碳-9-炔基等。
作为烷氧基乙基及烷氧基丙基中的烷基部分，可以举出例如上述碳原子数8～24的直链状或支链状的烷基的示例中举出的基团等。
作为链烯基氧基乙基及链烯基氧基丙基中的链烯基部分，可以举出例如上述碳原子数8～24的直链状或支链状的链烯基的示例中举出的基团等。
作为炔氧基乙基及炔氧基丙基中的炔基部分，可以举出例如上述碳原子数8～24的直链状或支链状的炔基的示例中举出的基团等。
需要说明的是，较优选地，R1及R2相同或不同地为碳原子数8～24的直链状或支链状的烷基或链烯基，进一步优选地，R1及R2相同或不同地为碳原子数8～24的直链状或支链状的链烯基，进一步优选地，R1及R2相同或不同地为碳原子数8～24的直链状的链烯基。此外，R1及R2相同是更优选的，在该情况下，更优选地，R1及R2为碳原子数12～24的直链状或支链状的烷基、链烯基或炔基，进一步优选为碳原子数12～24的直链状的链烯基。
R1及R2不同的情况下，R1为碳原子数16～24的直链状或支链状的烷基、链烯基或炔基、R2为碳原子数8～12的直链状或支链状的烷基、链烯基或炔基的情况也是本发明的优选方案之一。在该情况下，更优选R1为碳原子数16～24的直链状的链烯基、R2为碳原子数8～12的直链状的烷基，最优选R1为(Z)-十八碳-9-烯基或(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基、R2为辛基、癸基或十二烷基。此外，R1及R2不同的情况下，R1为碳原子数12～24的直链状或支链状的烷基、链烯基或炔基、R2为烷氧基乙基、烷氧基丙基、链烯基氧基乙基、链烯基氧基丙基、炔氧基乙基或炔氧基丙基的情况，也是本发明的优选方案之一。在该情况下，更优选R1为碳原子数16～24的直链状的链烯基、R2为链烯基氧基乙基，进一步优选R1为(Z)-十八碳-9-烯基、(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基或(11Z,14Z)-二十碳-11,14-二烯基、R2为(Z)-十八碳-9-烯基氧基乙基、(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基氧基乙基或(11Z,14Z)-二十碳-11,14-二烯基氧基乙基，最优选R1为(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基、R2为(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基氧基乙基。
R1及/或R2相同或不同、为碳原子数8～24的直链状或支链状的烷基、链烯基的情况下，优选相同或不同、为十四烷基、十六烷基、(Z)-十四碳-9-烯基、(Z)-十六碳-9-烯基、(Z)-十八碳-6-烯基、(Z)-十八碳-9-烯基、(E)-十八碳-9-烯基、(Z)-十八碳-11-烯基、(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基、(9Z,12Z,15Z)-十八碳-9,12,15-三烯基、(Z)-二十碳-11-烯基、(11Z,14Z)-二十碳-11,14-二烯基或(Z)-二十二碳-13-烯基，更优选相同或不同、为十六烷基、(Z)-十六碳-9-烯基、(Z)-十八碳-6-烯基、(Z)-十八碳-9-烯基、(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基、(Z)-二十碳-11-烯基或(11Z,14Z)-二十碳-11,14-二烯基，进一步优选相同或不同、为(Z)-十八碳-9-烯基、(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基或(11Z,14Z)-二十碳-11,14-二烯基，最优选相同、为(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基。
R6及R7分别与R1及R2的定义相同。但是，R7为碳原子数16～24的直链状或支链状的烷基、链烯基或炔基的情况下，R6及R7优选相同、为(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基。
R8及R9分别与R1及R2的定义相同。但是，R8及R9优选相同、为碳原子数16～24的直链状或支链状的烷基、链烯基或炔基，更优选相同、为(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基。
作为R3及R4中的碳原子数1～3的烷基，可以举出例如甲基、乙基、丙基、异丙基及环丙基，可优选举出甲基及乙基，进一步优选看举出甲基。
作为R3和R4一起形成的、碳原子数2～8的亚烷基，可以举出例如亚乙基、正亚丙基、正亚丁基、正亚戊基、正亚己基、正亚庚基、正亚辛基等，优选举出正亚戊基、正亚己基、正亚庚基等，较优选举出正亚戊基、正亚己基等，进一步优选举出正亚己基。
需要说明的是，R3优选为甲基或乙基、或者与R4一起形成碳原子数5～7的亚烷基、或者与R5一起形成碳原子数3～5的亚烷基，但是，R3不与R4一起形成碳原子数5～7的亚烷基的情况下，R4优选为甲基或乙基，较优选为甲基。此外，较优选的是，R3为甲基、或者与R4一起形成正亚戊基或正亚己基，或者R3与R5一起形成亚乙基、正亚丙基，但是，R3不与R4一起形成正亚戊基或正亚己基的情况下，R4较优选为甲基。
作为R5中的碳原子数1～6的烷基，可以举出例如甲基、乙基、丙基、异丙基、环丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、环丁基、环丙基甲基、戊基、异戊基、仲戊基、新戊基、叔戊基、环戊基、己基、环己基等，优选举出甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、仲戊基、叔戊基、新戊基、己基等，进一步优选举出甲基、乙基、丙基等。
作为R5中的碳原子数3～6的链烯基，可以举出例如烯丙基、1-丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基等，可优选举出烯丙基等。
作为R5中的单烷基氨基，为被一个例如碳原子数1～6的烷基(与上述定义相同)取代的氨基即可，可以举出例如甲基氨基、乙基氨基、丙基氨基、丁基氨基、戊基氨基、己基氨基等，优选举出甲基氨基、乙基氨基等。
R5中的氨基及单烷基氨基分别可以在氮原子上的孤对电子上配位氢离子，形成铵基(ammonio)及单烷基铵基，氨基及单烷基氨基分别包括铵基及单烷基铵基。
本发明中，在氨基及单烷基氨基的氮原子上的孤对电子上配位氢离子而成的铵基及单烷基铵基，也可以与制药上可允许的阴离子形成盐。
作为R5中的烷氧基，为被例如碳原子数1～6的烷基(与上述定义相同)取代的羟基即可，可以举出例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、戊氧基、己氧基等，优选举出甲氧基、乙氧基等。
作为R5中的单烷基氨基甲酰基及二烷基氨基甲酰基，可以举出分别被1个及相同或不同的2个例如碳原子数1～6的烷基(与上述定义相同)取代的氨基甲酰基，更具体而言可以举出甲基氨基甲酰基、乙基氨基甲酰基、丙基氨基甲酰基、丁基氨基甲酰基、戊基氨基甲酰基、己基氨基甲酰基、二甲基氨基甲酰基、二乙基氨基甲酰基、乙基甲基氨基甲酰基、甲基丙基氨基甲酰基、丁基甲基氨基甲酰基、甲基戊基氨基甲酰基、己基甲基氨基甲酰基等，优选举出甲基氨基甲酰基、乙基氨基甲酰基、二甲基氨基甲酰基等。
作为R5和R3一起形成的、碳原子数2～6的亚烷基，可以举出例如亚乙基、正亚丙基、正亚丁基、正亚戊基、正亚己基等，优选举出正亚丙基、正亚丁基、正亚戊基等，较优选举出正亚丙基、正亚丁基等，进一步优选举出正亚丙基。
需要说明的是，R5优选为氢原子、碳原子数1～6的烷基、单烷基氨基、羟基、烷氧基或者被相同或不同的1～3个氨基、单烷基氨基、或羟基或烷氧基取代的碳原子数1～6的烷基，或者与R3一起形成碳原子数2～6的亚烷基，更优选为氢原子、甲基、氨基、甲基氨基、羟基、甲氧基、或被相同或不同的1～3个氨基或羟基取代的甲基、或者与R3一起形成碳原子数3～5的亚烷基，进一步优选为氢原子、碳原子数1～3的烷基、或羟基、或者与R3一起形成正亚丙基或正亚丁基，最优选氢原子或与R3一起形成正亚丙基。
作为R10中的碳原子数1～3的烷基，可以举出例如甲基、乙基、丙基、异丙基、环丙基等，可优选举出甲基、乙基、异丙基等，可较优选举出甲基、乙基等。需要说明的是，作为R10，进一步优选为氢原子或甲基，最优选为氢原子。
作为X1及X2中的碳原子数1～6的亚烷基，可以举出例如亚甲基、亚乙基、正亚丙基、正亚丁基、正亚戊基、正亚己基等。
此外，X1优选为碳原子数1～3的亚烷基，最优选为亚甲基或亚乙基，X2优选为单键、亚甲基或亚乙基，较优选为单键或亚甲基。X1与X2的碳原子数之和优选为1～3、最优选为2。在上述任一种情况下，均优选为下述情况：R3及R4相同或不同，为甲基或乙基，R5为氢原子、甲基、氨基、甲基氨基、羟基、甲氧基、或者被相同或不同的1～3个氨基或羟基取代的甲基，或者R3和R4连接在一起形成碳原子数5～7的亚烷基，R5为氢原子、甲基、氨基、甲基氨基、羟基、甲氧基、或者被相同或不同的1～3个氨基或羟基取代的甲基，或者R3和R5连接在一起形成碳原子数3～5的亚烷基，R4为甲基或乙基；均较优选为下述情况：R3及R4为甲基，R5为氢原子，或者R3和R4连接在一起形成正亚戊基或正亚己基，R5为氢原子，或者R3和R5连接在一起形成正亚丙基，R4为甲基。
作为X3中的碳原子数1～3的亚烷基，可以举出例如亚甲基、亚乙基、正亚丙基等，优选举出亚甲基、亚乙基等。
式(A)中的氧原子可以分别被硫原子取代。
式(A)中的1个氧原子被取代为硫原子的式(Aa)表示的化合物Aa，可以通过使劳森试剂(Lawesson’s Reagent、2,4-双(4-甲氧基苯基)-1,3,2,4-二噻二磷杂丁环-2,4-二硫醚(2,4-bis(4-methoxyphenyl)-1,3,2,4-dithiadiphosphetane-2,4-disulfide))等1,3,2,4-二噻二磷杂丁环-2,4-二硫醚衍生物作用于对应的化合物A而得到，
(式(Aa)中，R1、R2、R3、R4、R5、X1及X2分别与上述定义相同)。
关于本发明的阳离子性脂质，在任意氮原子上的孤对电子上配位有氢离子的情况下，也可以与制药上可允许的阴离子形成盐。
本发明中，作为制药上可允许的阴离子，可以举出例如氯化物离子、溴化物离子、硝酸离子、硫酸离子、磷酸离子等无机离子，乙酸离子、草酸离子、马来酸离子、富马酸离子、柠檬酸离子、苯甲酸离子、甲磺酸离子等有机酸离子等。
接下来，对本发明的阳离子性脂质的制造方法进行说明。需要说明的是，在以下所示的制造方法中，定义过的基团在该制造方法的条件下发生改变或不适于实施该制造方法时，可通过采用有机合成化学中常用的导入及除去保护基团的方法[例如ProtectiveGroups in Organic Synthesis,第三版，T.W.Greene著，John Wiley&Sons Inc.(1999年)等中记载的方法]等来制造目标化合物。此外，也可以根据需要改变导入取代基等的反应步骤的顺序。
制造方法
化合物(A)中，R2为碳原子数8～24的直链状或支链状的烷基、链烯基或炔基的化合物(Ia)可通过以下方法来制造。
(式中，R1、R3、R4、R5、X1及X2分别与上述定义相同，R11为碳原子数8～24的直链状或支链状的烷基、链烯基或炔基，Y表示氯原子、溴原子、碘原子、三氟甲磺酰氧基、甲磺酰氧基、苯磺酰氧基、对甲苯磺酰氧基等离去基团，Ar表示对硝基苯基、邻硝基苯基、对氯苯基等取代苯基或无取代苯基)
步骤1及2
化合物(IIa)可如下制造：在无溶剂条件下或在溶剂中，根据需要优选在1～10当量的碱的存在下，在室温与200℃之间的温度下，使氨和化合物(IIIa)反应5分钟～100小时。并且，化合物(IIb)可如下制造：在无溶剂条件下或在溶剂中，根据需要优选在1～10当量的碱的存在下，在室温与200℃之间的温度下，使化合物(IIa)和化合物(IIIb)反应5分钟～100小时。
作为溶剂，可以举出例如甲醇、乙醇、二氯甲烷、氯仿、1,2-二氯乙烷、甲苯、乙酸乙酯、乙腈、乙醚、四氢呋喃、1,2-二甲氧基乙烷、二氧杂环己烷、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、吡啶、水等，它们可以单独或者混合使用。
作为碱，可以举出例如碳酸钾、氢氧化钾、氢氧化钠、甲醇钠、叔丁醇钾、三乙胺、二异丙基乙基胺、N-甲基吗啉、吡啶、1,8-二氮杂双环[5.4.0]-7-十一碳烯(DBU)等。
化合物(IIIa)及化合物(IIIb)可以以市售品的形式得到，或者可以通过已知方法(例如“第5版实验化学讲座13有机化合物的合成I”，第5版，p.374，丸善(2005年))或以其为基准的方法得到。
R1和R11相同时的化合物(IIb)可通过在步骤1中使用2当量以上的化合物(IIIa)得到。
步骤3
化合物(VI)可如下制造：在无溶剂条件下或在溶剂中，根据需要优选在1～10当量的添加剂的存在下，及/或根据需要优选在1～10当量的碱的存在下，在-20℃与150℃之间的温度下，使化合物(IV)与化合物(V)反应5分钟～72小时。
作为溶剂，可以举出例如二氯甲烷、氯仿、1,2-二氯乙烷、甲苯、乙酸乙酯、乙腈、乙醚、四氢呋喃、1,2-二甲氧基乙烷、二氧杂环己烷、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、二甲基亚砜等，它们可以单独或者混合使用。
作为添加剂，可以举出例如1-羟基苯并三唑、4-二甲基氨基吡啶等。
作为碱，可以举出步骤1及2中示例的碱。
化合物(IV)可以以市售品的形式得到。
化合物(V)可以以市售品的形式得到，或者可以通过已知方法(例如“第5版实验化学讲座14有机化合物的合成II”，第5版，p.1，丸善(2005年))或以其为基准的方法得到。
步骤4
化合物(Ia)可如下制造：在无溶剂条件下或在溶剂中，根据需要优选在1～10当量的添加剂的存在下，及/或根据需要优选在1～10当量的碱的存在下，在-20℃与150℃之间的温度下，使化合物(IIb)与化合物(VI)反应5分钟～72小时。
作为溶剂及添加剂，分别可以举出步骤3中示例的溶剂及添加剂。
作为碱，可以举出步骤1及2中示例的碱。
此外，化合物(IIb)也可以通过以下方法来制造。
(式中，R1、R11及Y分别与上述定义相同，Boc表示叔丁氧基羰基，Ns表示2-硝基苯磺酰基)
步骤5
化合物(IIc)可如下制造：在无溶剂条件下或在溶剂中，根据需要优选在1～10当量的添加剂的存在下，及/或根据需要优选在1～10当量的碱的存在下，在室温与200℃之间的温度下，使N-(叔丁氧基羰基)-2-硝基苯磺酰胺和化合物(IIIa)反应5分钟～100小时。
作为溶剂，可以举出步骤1及2中示例的溶剂。
作为添加剂，可以举出例如四正丁基碘化铵、碘化钠等。
作为碱，可以举出例如碳酸铯、碳酸钾、氢氧化钾、氢氧化钠、甲醇钠、叔丁醇钾、三乙胺、二异丙基乙基胺、N-甲基吗啉、吡啶、DBU等。
步骤6
化合物(IId)可如下制造：在无溶剂条件下或在溶剂中，根据需要优选在1～10当量的添加剂的存在下，在-20℃与150℃之间的温度下，用1当量～大大过量的酸对化合物(IIc)处理5分钟～72小时。
作为溶剂，可以举出步骤1及2中示例的溶剂。
作为酸，可以举出例如盐酸、硫酸、磷酸、三氟乙酸等。
作为添加剂，可以举出例如苯甲硫醚、二甲基硫醚、三异丙基硅烷等。
步骤7
化合物(IIe)可如下制造：在无溶剂条件下或在溶剂中，根据需要优选在1～10当量的添加剂的存在下，及/或根据需要优选在1～10当量的碱的存在下，在室温与200℃之间的温度下，使化合物(IIIb)和化合物(IId)反应5分钟～100小时。
作为溶剂，可以举出步骤1及2中示例的溶剂。
作为添加剂及碱，分别可以举出步骤5中示例的添加剂及碱。
步骤8
化合物(IIb)可如下制造：在无溶剂条件下或在溶剂中，根据需要优选在1～10当量的碱的存在下，在室温与200℃之间的温度下，使化合物(IIe)和硫醇化合物反应5分钟～100小时。
作为溶剂，可以举出步骤1及2中示例的溶剂。
作为硫醇化合物，可以举出例如甲硫醇、乙硫醇、十二烷基硫醇(dodecanethiol)、苯硫酚、巯基乙酸等。
作为碱，可以举出步骤5中示例的碱。
化合物(A)中，R2为烷氧基乙基、烷氧基丙基、链烯基氧基乙基、链烯基氧基丙基、炔氧基乙基或炔氧基丙基的化合物(Ib)可通过以下方法来制造。
(式中，R1、R3、R4、R5、X1、X2、Y及Ar分别与上述定义相同，R12为烷氧基乙基、烷氧基丙基、链烯基氧基乙基、链烯基氧基丙基、炔氧基乙基或炔氧基丙基，Ms表示甲磺酰基)
步骤9
化合物(IIf)可如下制造：在无溶剂条件下或在溶剂中，根据需要优选在1～10当量的碱的存在下，在室温与200℃之间的温度下，使化合物(IIa)和化合物(IIIc)反应5分钟～100小时。
作为溶剂，可以举出步骤1及2中示例的溶剂。
作为碱，可以举出步骤1及2中示例的碱。
步骤10
化合物(Ib)可如下制造：在无溶剂条件下或在溶剂中，根据需要优选在1～10当量的添加剂的存在下，及/或根据需要优选在1～10当量的碱的存在下，在-20℃与150℃之间的温度下，使化合物(IIf)与化合物(VI)反应5分钟～72小时。
作为溶剂及添加剂，分别可以举出步骤3中示例的溶剂及添加剂。
作为碱，可以举出步骤1及2中示例的碱。
化合物(IIIc)可通过以下方法来制造。
(式中，R13为碳原子数8～24的直链状或支链状的烷基、链烯基或炔基，X4表示亚乙基或正亚丙基，Ms表示甲磺酰基)
步骤11
化合物(VIIb)可如下制造：在无溶剂条件下或在溶剂中，根据需要优选在1～10当量的碱的存在下，在室温与200℃之间的温度下，使化合物(VIIa)与化合物(VIII)反应5分钟～100小时。
作为溶剂，可以举出步骤3中示例的溶剂。
作为碱，可以举出步骤1及2中示例的碱。
化合物(VIIa)可以以市售品的形式得到，或者可以通过已知方法(例如“第5版实验化学讲座14有机化合物的合成II”，第5版，p.1，丸善(2005年))或以其为基准的方法得到。
化合物(VIII)可以以市售品的形式得到。
步骤12
化合物(IIIc)可如下制造：在无溶剂条件下或在溶剂中，优选在1～10当量的碱的存在下，在-20℃与150℃之间的温度下，使化合物(VIIb)与甲磺酰化试剂反应5分钟～72小时。
作为溶剂，可以举出步骤3中示例的溶剂。
作为碱，可以举出步骤1及2中示例的碱。
作为甲磺酰化试剂，可以举出例如甲磺酸酐、甲磺酰氯等。
此外，化合物(IIf)也可以通过以下方法来制造。
(式中，R1、R12、Y、Ns及Ms分别与上述定义相同)
步骤13
化合物(IIg)可如下制造：在无溶剂条件下或在溶剂中，根据需要优选在1～10当量的添加剂的存在下，及/或根据需要优选在1～10当量的碱的存在下，在室温与200℃之间的温度下，使化合物(IIIc)和化合物(IId)反应5分钟～100小时。
作为溶剂，可以举出步骤1及2中示例的溶剂。
作为添加剂及碱，分别可以举出步骤5中示例的添加剂及碱。
步骤14
化合物(IIf)可如下制造：在无溶剂条件下或在溶剂中，根据需要优选在1～10当量的碱的存在下，在室温与200℃之间的温度下，使化合物(IIg)和硫醇化合物反应5分钟～100小时。
作为溶剂，可以举出步骤1及2中示例的溶剂。
作为硫醇化合物，可以举出步骤8中示例的硫醇化合物。
作为碱，可以举出步骤5中示例的碱。
式(A)中的氧原子为硫原子的下述式(Aa)～(Ac)表示的化合物Aa～Ac可分别通过在步骤4及步骤10中使用式(VI)中的氧原子为硫原子的下述式(VIa)～(VIc)表示的化合物VIa～Vic得到，
(式中，R1、R2、R3、R4、R5、X1及X2分别与上述定义相同)；
(式中，R3、R4、R5、X1、X2及Ar分别与上述定义相同)。
化合物(B)中，R7为碳原子数8～24的直链状或支链状的烷基、链烯基或炔基的化合物(Ba)可通过化合物(IIb)的制造方法得到。
化合物(B)中，R7为烷氧基乙基、烷氧基丙基、链烯基氧基乙基、链烯基氧基丙基、炔氧基乙基或炔氧基丙基的化合物(Bc)可通过化合物(IIf)的制造方法得到。
化合物(C)可通过以下方法来制造。
(式中，R8、R9、R10、X3及Y分别与上述定义相同)
步骤15
化合物(C)可如下制造：在无溶剂条件下或在溶剂中，根据需要优选在1～10当量的添加剂的存在下，及/或根据需要优选在1～10当量的碱的存在下，在室温与200℃之间的温度下，使化合物(IIh)和化合物(Xa)反应5分钟～100小时。
作为溶剂及碱，分别可以举出步骤1及2中示例的溶剂及碱。
作为添加剂，可以举出步骤5中示例的添加剂。
化合物(IIh)可通过化合物(B)的制造方法得到。
化合物(Xa)可以以市售品的形式得到，或者可以通过已知方法(例如“第5版实验化学讲座13有机化合物的合成I”，第5版，p.374，丸善(2005年))或以其为基准的方法得到。
化合物(C)中，R10为氢原子的化合物(Ca)也可以通过以下方法来制造。
(式中，R8、R9、X3及Y分别与上述定义相同，Pro表示三甲基甲硅烷基(trimethylsilyl)、三乙基甲硅烷基、三叔丁基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基或三苯基甲硅烷基等甲硅烷基型保护基团)
步骤16
化合物(IXa)可如下制造：在无溶剂条件下或在溶剂中，根据需要优选在1～10当量的添加剂的存在下，及/或根据需要优选在1～10当量的碱的存在下，在室温与200℃之间的温度下，使化合物(IIh)和化合物(Xb)反应5分钟～100小时。
作为溶剂及碱，分别可以举出步骤1及2中示例的溶剂及碱。
作为添加剂，可以举出步骤5中示例的添加剂。
化合物(IIh)可通过化合物(B)的制造方法得到。
化合物(Xb)可以以市售品的形式得到，或者可以通过已知方法(例如“第5版实验化学讲座18有机化合物的合成VI”，第5版，p.171-172，丸善(2005年))或以其为基准的方法得到。
步骤17
化合物(Ca)可如下制造：在无溶剂条件下或在溶剂中，在-20℃与150℃之间的温度下，使化合物(IXa)和脱保护试剂反应5分钟～72小时。
作为溶剂，可以举出步骤1及2中示例的溶剂。
作为脱保护试剂，可以举出例如四丁基氟化铵、氟化氢吡啶复合体、氢氟酸等氟化合物等，乙酸、三氟乙酸、对甲苯磺酸吡啶鎓、盐酸等酸等。
化合物(C)中，R10为氢原子、X3为碳原子数2的亚烷基的化合物(Cb)也可以通过以下方法来制造。
(式中，R8及R9分别与上述定义相同)
步骤18
化合物(IXb)可如下制造：在无溶剂条件下或在溶剂中，根据需要优选在1～10当量的碱的存在下，在室温与200℃之间的温度下，使化合物(IIh)与优选为1～大大过量的丙烯酸乙酯反应5分钟～100小时。
作为溶剂，可以举出步骤1中示例的溶剂。
作为碱，可以举出例如碳酸钾、氢氧化钾、氢氧化钠、甲醇钠、乙醇钠、叔丁醇钾、三乙胺、二异丙基乙基胺、N-甲基吗啉、吡啶、DBU等。
步骤19
化合物(Cb)可如下制造：在溶剂中，根据需要优选在1～10当量的添加剂的存在下，在-20℃与150℃之间的温度下，使化合物(IXb)与优选为1～10当量的还原剂反应5分钟～72小时。
作为溶剂，可以举出例如四氢呋喃、二氧杂环己烷、乙醚、二氯甲烷、甲苯等，它们可以单独或者混合使用。
作为还原剂，可以举出例如氢化铝锂、氢化铝、氢化二异丁基铝、三乙酰氧基硼氢化钠、氰基硼氢化钠、硼烷等。
作为添加剂，可以举出例如氯化铝、氯化铈、氯化铁、乙酸、盐酸等。
上述各制造方法中的中间体及目标化合物可以通过有机合成化学中常用的分离纯化法、例如过滤、萃取、洗涤、干燥、浓缩、重结晶、各种色谱法等进行分离纯化。此外，中间体也可以不特别地经纯化而供给于后续反应。
本发明的阳离子性脂质中，可以在结构中的氮原子上的孤对电子上配位氢离子，在该情况下，也可以与制药上可允许的阴离子(与上述定义相同)形成盐，本发明的阳离子性脂质中，还包括在该氮原子上的孤对电子上配位有氢离子的化合物。
本发明的阳离子性脂质中，还包括可能存在几何异构体、光学异构体等立体异构体、互变异构体等的物质，本发明的阳离子性脂质包含包括这些异构体在内的全部可能的异构体及它们的混合物。
本发明的阳离子性脂质中的各原子的一部分或全部可以分别被对应的同位素原子取代，化合物(A)、化合物(B)或化合物(C)也包含被这些同位素原子取代了的化合物。例如，化合物(A)、化合物(B)或化合物(C)中的氢原子的一部分或全部可以是原子量为2的氢原子(氘原子)。
对于本发明的阳离子性脂质中的各原子的一部分或全部分别被对应的同位素原子取代了的化合物，可以使用市售的结构单元(building block)通过与上文所述的各制造方法同样的方法来制造。此外，对于化合物(A)、化合物(B)或化合物(C)中的氢原子的一部分或全部被氘原子取代了的化合物，也可以采用例如使用铱络合物作为催化剂、使用重水作为氘源、将醇、羧酸等氘化的方法[参见J.Am.Chem.Soc.,Vol.124,No.10,2092(2002)]等来合成。
根据本发明得到的本发明的阳离子性脂质的具体例子示于表1～7。但是，本发明的阳离子性脂质并不限定于这些。
[表1]
[表2]
[表3]
[表4]
[表5]
[表6]
[表7]
此外，作为本发明中使用的核酸，只要是例如核苷酸及/或与核苷酸具有同等功能的分子聚合得到的分子，则可以为任何分子，可以举出例如作为核糖核苷酸的聚合体的核糖核酸(RNA)、作为脱氧核糖核苷酸的聚合体的脱氧核糖核酸(DNA)、由RNA和DNA形成的嵌合核酸、及上述核酸中的至少一个核苷酸被与该核苷酸具有同等功能的分子取代而得到的核苷酸聚合体等。此外，含有至少一部分核苷酸及/或与核苷酸具有同等功能的分子聚合而得到的分子的结构的衍生物也包括在本发明的核酸中。需要说明的是，本发明中，尿苷U和胸腺嘧啶T可分别互换来读出。
作为与核苷酸具有同等功能的分子，可以举出例如核苷酸衍生物等。
作为核苷酸衍生物，只要是例如对核苷酸进行了修饰的分子，则可以为任何分子，例如与RNA或DNA比较，为了提高核酸酶耐性或使其免受其他分解因子的影响而稳定化、为了提高与互补链核酸的亲和性、为了提高细胞透过性、或者为了使其可见，可优选使用对核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸进行了修饰的分子等。
作为核苷酸衍生物，可以举出例如糖部修饰核苷酸、磷酸二酯键修饰核苷酸、碱基修饰核苷酸等。
作为糖部修饰核苷酸，只要是例如对核苷酸的糖的化学结构的一部分或全部用任意的取代基进行了修饰或取代的核苷酸、或者用任意的原子进行了取代的核苷酸，则可以为任意的核苷酸，可优选使用2’-修饰核苷酸。
作为糖部修饰核苷酸的修饰基团，可以举出例如2’-氰基、2’-烷基、2’-取代烷基、2’-链烯基、2’-取代链烯基、2’-卤素、2’-O-氰基、2’-O-烷基、2’-O-取代烷基、2’-O-链烯基、2’-O-取代链烯基、2’-S-烷基、2’-S-取代烷基、2’-S-链烯基、2’-S-取代链烯基、2’-氨基、2’-NH-烷基、2’-NH-取代烷基、2’-NH-链烯基、2’-NH-取代链烯基、2’-SO-烷基、2’-SO-取代烷基、2’-羧基、2’-CO-烷基、2’-CO-取代烷基、2’-Se-烷基、2’-Se-取代烷基、2’-SiH2-烷基、2’-SiH2-取代烷基、2’-ONO2、2’-NO2、2’-N3、2’-氨基酸残基(从氨基酸的羧酸中除去羟基而得到的基团)、2’-O-氨基酸残基(与上述氨基酸残基的定义相同)等。
此外，作为糖部修饰核苷酸，还可以举出例如具有2’位的修饰基团与4’位的碳原子桥联的结构的桥联结构型人工核酸(Bridged Nucleic Acid)(BNA)，更具体而言为2’位的氧原子与4’位的碳原子介由亚甲基桥联而得到的锁人工核酸(Locked Nucleic Acid)(LNA)、及亚乙基桥联结构型人工核酸(Ethylene bridged nucleic acid)(ENA)[NucleicAcid Research,32,e175(2004)]等，它们也包括在2’-修饰核苷酸中。
此外，作为糖部修饰核苷酸，还可以举出肽核酸(PNA)[Acc.Chem.Res.,32,624(1999)]、氧基肽核酸(OPNA)[J.Am.Chem.Soc.,123,4653(2001)]、肽核糖核酸(PRNA)[J.Am.Chem.Soc.,122,6900(2000)]等。
作为糖部修饰核苷酸的修饰基团，优选为2’-氰基、2’-卤素、2’-O-氰基、2’-烷基、2’-取代烷基、2’-O-烷基、2’-O-取代烷基、2’-O-链烯基、2’-O-取代链烯基、2’-Se-烷基、2’-Se-取代烷基等，更优选为2’-氰基、2’-氟、2’-氯、2’-溴、2’-三氟甲基、2’-O-甲基、2’-O-乙基、2’-O-异丙基、2’-O-三氟甲基、2’-O-[2-(甲氧基)乙基]、2’-O-(3-氨基丙基)、2’-O-[2-(N,N-二甲基氨基氧基)乙基]、2’-O-[3-(N,N-二甲基氨基)丙基]、2’-O-{2-[2-(N,N-二甲基氨基)乙氧基]乙基}、2’-O-[2-(甲基氨基)-2-氧代(oxo)乙基]、2’-Se-甲基等，进一步优选为2’-O-甲基、2’-O-乙基、2’-氟等，最优选为2’-O-甲基及2’-O-乙基。
此外，糖部修饰核苷酸的修饰基团也可以从其大小考虑来定义优选的范围，从氟的大小考虑优选相当于-O-丁基的大小的基团，从-O-甲基的大小考虑较优选相当于-O-乙基的大小的基团。
关于糖部修饰核苷酸的修饰基团中的烷基，与本发明的阳离子性脂质的定义中的碳原子数1～6的烷基的定义相同。
作为糖部修饰核苷酸的修饰基团中的链烯基，可以举出碳原子数3～6的链烯基，可以举出例如烯丙基、1-丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基等。
作为糖部修饰核苷酸的修饰基团中的卤素，可以举出例如氟原子、氯原子、溴原子、碘原子等。
作为氨基酸残基中的氨基酸，可以举出例如脂肪族氨基酸(具体而言，甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸等)、羟基氨基酸(具体而言，丝氨酸、苏氨酸等)、酸性氨基酸(具体而言，天冬氨酸、谷氨酸等)、酸性氨基酸酰胺(具体而言，天冬酰胺、谷氨酰胺等)、碱性氨基酸(具体而言，赖氨酸、羟基赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸等)、含硫氨基酸(具体而言，半胱氨酸、胱氨酸、蛋氨酸等)、亚氨基酸(具体而言，脯氨酸、4-羟基脯氨酸等)等。
作为糖部修饰核苷酸的修饰基团中的取代烷基及取代链烯基的取代基，可以举出例如卤素(与上述定义相同)、羟基、硫烷基、氨基、氧代(oxo)、-O-烷基(该-O-烷基的烷基部分与上述烷基定义相同)、-S-烷基(该-S-烷基的烷基部分与上述烷基定义相同)、-NH-烷基(该-NH-烷基的烷基部分与上述烷基定义相同)、二烷基氨基氧基(该二烷基氨基氧基的两个烷基部分相同或不同，与上述烷基定义相同)、二烷基氨基(该二烷基氨基的两个烷基部分相同或不同，与上述烷基定义相同)、二烷基氨基烷基氧基(该二烷基氨基烷基氧基的两个烷基部分相同或不同，与上述烷基定义相同，亚烷基部分表示从上述烷基中除去1个氢原子而得到的基团)等，取代数优选为1～3。
作为磷酸二酯键修饰核苷酸，只要是对核苷酸的磷酸二酯键的化学结构的一部分或全部用任意的取代基进行了修饰或取代的核苷酸、或者用任意的原子进行了取代的核苷酸，则可以为任意的核苷酸，可以举出例如磷酸二酯键被硫代磷酸酯键取代的核苷酸、磷酸二酯键被二硫代磷酸酯键取代的核苷酸、磷酸二酯键被磷酸烷基酯键取代的核苷酸、磷酸二酯键被氨基磷酸酯键取代的核苷酸等。
作为碱基修饰核苷酸，只要是对核苷酸的碱基的化学结构的一部分或全部用任意的取代基进行了修饰或者取代的核苷酸、或者用任意的原子进行了取代的核苷酸，则可以为任意的核苷酸，可以举出例如碱基内的氧原子被硫原子取代的核苷酸、氢原子被碳原子数1～6的烷基取代的核苷酸、甲基被氢原子或碳原子数2～6的烷基取代的核苷酸、氨基被碳原子数1～6的烷基、碳原子数1～6的烷酰基等保护基团保护的核苷酸等。
进而，作为核苷酸衍生物，还可以举出在核苷酸或糖部、磷酸二酯键或碱基的至少一方被修饰了的核苷酸衍生物中加成其他化学物质(如脂质、磷脂、吩嗪、叶酸、菲啶、蒽醌、吖啶、荧光素、罗丹明、香豆素、色素等)而得到的物质，具体而言，可以举出5’-多胺加成核苷酸衍生物、胆固醇加成核苷酸衍生物、甾体加成核苷酸衍生物、胆汁酸加成核苷酸衍生物、维生素加成核苷酸衍生物、绿色荧光素(Cy3)加成核苷酸衍生物、红色荧光素(Cy5)加成核苷酸衍生物、荧光素(fluoroscein)(6-FAM)加成核苷酸衍生物及生物素加成核苷酸衍生物等。
此外，本发明中使用的核酸中，核苷酸或核苷酸衍生物可以与该核酸内的其他核苷酸或核苷酸衍生物形成亚烷基结构、肽结构、核苷酸结构、醚结构、酯结构、及组合了这些结构中的至少一种的结构等的交联结构。
作为本发明中使用的核酸，优选举出抑制靶基因表达的核酸，较优选举出利用了RNA干扰(RNAi)的具有靶基因表达抑制作用的核酸。
作为本发明中的靶基因，只要是产生mRNA并进行表达的基因，则没有特别限定，优选为例如与肿瘤或炎症相关的基因，可以举出例如编码血管内皮生长因子(vascularendothelial growth factor，以下简称为VEGF)、血管内皮生长因子受体(vascularendothelial growth factor receptor，以下简称为VEGFR)、成纤维细胞生长因子、成纤维细胞生长因子受体、来自血小板的生长因子、来自血小板的生长因子受体、肝细胞生长因子、肝细胞生长因子受体、Kruppel样因子(Kruppel-like factor，以下简称为KLF)、表达序列标签(Ets)转录因子、核因子、低氧诱导因子、细胞周期相关因子、染色体复制相关因子、染色体修复相关因子、微管相关因子、生长信号途径相关因子、生长相关转录因子、凋亡相关因子等蛋白质的基因等，具体而言可以举出VEGF基因、VEGFR基因、成纤维细胞生长因子基因、成纤维细胞生长因子受体基因、来自血小板的生长因子基因、来自血小板的生长因子受体基因、肝细胞生长因子基因、肝细胞生长因子受体基因、KLF基因、Ets转录因子基因、核因子基因、低氧诱导因子基因、细胞周期相关因子基因、染色体复制相关因子基因、染色体修复相关因子基因、微管相关因子基因(例如CKAP5基因等)、生长信号途径相关因子基因(例如KRAS基因等)、生长相关转录因子基因、凋亡相关因子基因(例如BCL-2基因等)等。
此外，作为本发明中的靶基因，优选例如在肝脏、肺、肾脏或脾脏中表达的基因，较优选在肝脏中表达的基因，可以举出例如上述与肿瘤或炎症相关的基因、乙型肝炎病毒基因组、丙型肝炎病毒基因组、编码下述蛋白质的基因等，所述蛋白质为载脂蛋白(APO)、羟甲基戊二酸单酰(HMG)CoA还原酶、kexin 9型丝氨酸蛋白酶(PCSK9)、第12因子、胰高血糖素受体、糖皮质激素受体、白三烯受体、血栓烷A2受体、组胺H1受体、碳酸酐酶、血管紧张肽转变酶、肾素、p53、酪氨酸磷酸酶(PTP)、钠依赖性葡萄糖运输载体、肿瘤坏死因子、白细胞介素、铁调素(hepcidin)、甲状腺素运载蛋白(transthyretin)、抗凝血酶、蛋白质C、matriptase酶(例如TMPRSS6基因等)等。
作为抑制靶基因表达的核酸，只要是例如含有与编码蛋白质等的基因(靶基因)的mRNA的一部分的碱基序列互补的碱基序列、并且抑制靶基因表达的核酸，则可以使用例如siRNA(短干扰RNA，short interference RNA)、miRNA(微型RNA，microRNA)等双链核酸、shRNA(短发卡RNA，short hairpinRNA)、反义核酸、核酶等单链核酸等任意的核酸，优选为双链核酸。
将含有与靶基因的mRNA的一部分碱基序列互补的碱基序列的核酸称为反义链核酸，还将含有与反义链核酸的碱基序列互补的碱基序列的核酸称为有义链核酸。有义链核酸是指由靶基因的一部分碱基序列形成的核酸本身等、能够与反义链核酸配对形成双链形成部的核酸。
所谓双链核酸，是指两根链配对从而具有双链形成部的核酸。所谓双链形成部，是指构成双链核酸的核苷酸或其衍生物构成碱基对并且形成双链的部分。关于构成双链形成部的碱基对，通常为15～27个碱基对，优选为15～25个碱基对，更优选为15～23个碱基对，进一步优选为15～21个碱基对，特别优选为15～19个碱基对。
作为双链形成部的反义链核酸，优选使用例如包含靶基因的mRNA的一部分序列的核酸、或者在该核酸中取代、缺失或添加1～3个碱基、优选1～2个碱基、更优选1个碱基、并且具有靶蛋白质的表达抑制活性的核酸。构成双链核酸的单链的核酸通常包含15～30个碱基(核苷)的序列，优选为15～29个碱基，更优选为15～27个碱基，进一步优选为15～25个碱基，特别优选为17～23个碱基，最优选为19～21个碱基。
构成双链核酸的反义链、有义链中的任一方、或者双方的核酸可以在与双链形成部连续的3’侧或5’侧具有未形成双链的追加的核酸。所述未形成双链的部分也称为突出部(overhang，突出端)。
作为具有突出部的双链核酸，可以使用例如在至少一方的链的3’末端或5’末端具有包含1～4个碱基、通常包含1～3个碱基的突出部的双链核酸，优选使用具有包含2个碱基的突出部的双链核酸，更优选使用具有包含dTdT或UU的突出部的双链核酸。突出部可以仅在反义链一方具有，可以仅在有义链一方具有，也可以在反义链和有义链双方均具有，优选使用在反义链和有义链双方具有突出部的双链核酸。
此外，也可以使用与双链形成部连续且与靶基因的mRNA的碱基序列的一部分或全部一致的序列、或者与双链形成部连续且与靶基因的mRNA的互补链的碱基序列的一部分或全部一致的序列。此外，作为抑制靶基因表达的核酸，也可以使用例如通过Dicer等核糖核酸酶的作用生成上述双链核酸的核酸分子(国际公开第2005/089287号小册子)、或者不具有3’末端或5’末端的突出部的双链核酸等。
此外，上述双链核酸为siRNA时，优选的是，反义链中，由5’末端侧向3’末端侧至少第1～17个碱基(核苷)的序列为与靶基因的mRNA的连续17个碱基的序列互补的碱基的序列；更优选的是，该反义链中，由5’末端侧向3’末端侧第1～19个碱基的序列为与靶基因的mRNA的连续19个碱基的序列互补的碱基的序列，或者第1～21个碱基的序列为与靶基因的mRNA的连续21个碱基的序列互补的碱基的序列，或者第1～25个碱基的序列为与靶基因的mRNA的连续25个碱基的序列互补的碱基的序列。
进而，本发明中使用的核酸为siRNA时，优选该核酸中的糖的10～70％、更优选15～60％、进一步优选20～50％为在2’位被修饰基团取代的核糖。本发明中的在2’位被修饰基团取代的核糖是指核糖的2’位的羟基被修饰基团取代，可以与核糖的2’位的羟基的立体配置相同或不同，优选与核糖的2’位的羟基的立体配置相同。作为在2’位被修饰基团取代的核糖的修饰基团，可以举出糖部修饰核苷酸中的2’-修饰核苷酸的修饰基团的定义中示例的修饰基团及氢原子，优选2’-氰基、2’-卤素、2’-O-氰基、2’-烷基、2’-取代烷基、2’-O-烷基、2’-O-取代烷基、2’-O-链烯基、2’-O-取代链烯基、2’-Se-烷基、2’-Se-取代烷基等，更优选2’-氰基、2’-氟、2’-氯、2’-溴、2’-三氟甲基、2’-O-甲基、2’-O-乙基、2’-O-异丙基、2’-O-三氟甲基、2’-O-[2-(甲氧基)乙基]、2’-O-(3-氨基丙基)、2’-O-[2-(N,N-二甲基)氨基氧基]乙基、2’-O-[3-(N,N-二甲基氨基)丙基]、2’-O-{2-[2-(N,N-二甲基氨基)乙氧基]乙基}、2’-O-[2-(甲基氨基)-2-氧代乙基]、2’-Se-甲基、氢原子等，进一步优选2’-O-甲基、2’-O-乙基、2’-氟、氢原子等，最优选2’-O-甲基及2’-O-氟。
本发明中使用的核酸中包括：核酸的结构中的磷酸部、酯部等中含有的氧原子等被取代为例如硫原子等其他原子的衍生物。
此外，键合于反义链及有义链的5’末端的碱基的糖中，各个5’位的羟基可以被磷酸基或上述修饰基团、或者通过机体内的核酸分解酶等转化为磷酸基或上述修饰基团的基团修饰。
此外，键合于反义链及有义链的3’末端的碱基的糖中，各个3’位的羟基可以被磷酸基或上述修饰基团、或者通过机体内的核酸分解酶等转化为磷酸基或上述修饰基团的基团修饰。
作为单链的核酸，只要是例如包含由靶基因的连续15～27个碱基(核苷)、优选15～25个碱基、更优选15～23个碱基、进一步优选15～21个碱基、特别优选15～19个碱基组成的序列的互补序列的核酸、或者在该核酸中有1～3个碱基、优选1～2个碱基、更优选1个碱基被取代、缺失或添加，并且具有靶蛋白质的表达抑制活性的核酸，则可以为任意的核酸。该单链的核酸优选包含15～30个碱基(核苷)的序列，更优选15～27个碱基、进一步优选15～25个碱基、特别优选15～23个碱基的单链核酸。
作为单链核酸，也可以使用将构成上述双链核酸的反义链及有义链经间隔序列(间隔寡核苷酸)连接而得到的核酸。作为间隔寡核苷酸，优选6～12个碱基的单链核酸分子，优选其5’末端侧的序列为2个U。作为间隔寡核苷酸的例子，可以举出包含UUCAAGAGA序列的核酸。关于经由间隔寡核苷酸连接的反义链及有义链的顺序，任一方形成5’侧均可。作为该单链核酸，优选为例如通过茎环结构具有双链形成部的shRNA等单链核酸。shRNA等单链核酸通常为50～70个碱基长度。
也可以使用70个碱基长度以下、优选50个碱基长度以下、进一步优选30个碱基长度以下的核酸，其被设计为通过核糖核酸酶等的作用而形成上述单链核酸或双链核酸。
需要说明的是，本发明中使用的核酸可以采用已知的RNA或DNA合成法、及RNA或DNA修饰法进行制造。
本发明的组合物为包含本发明的阳离子性脂质及核酸的组合物，可以举出例如包含本发明的阳离子性脂质与核酸的复合体、或者组合本发明的阳离子性脂质与中性脂质及/或高分子所得的物质与核酸的复合体的组合物，包含该复合体及将该复合体封入的脂质膜的组合物等。该脂质膜为脂单层膜(脂质单分子膜)或脂双层膜(脂质双分子膜)均可。需要说明的是，该脂质膜中可以含有本发明的阳离子性脂质、中性脂质及/或高分子。此外，该复合体及/或该脂质膜中也可以含有除本发明的阳离子性脂质以外的阳离子性脂质。
此外，作为本发明的组合物，还可以举出例如包含除本发明的阳离子性脂质以外的阳离子性脂质与核酸的复合体、或者组合除本发明的阳离子性脂质以外的阳离子性脂质与中性脂质及/或高分子所得的物质与核酸的复合体以及将该复合体封入的脂质膜、且该脂质膜中含有本发明的阳离子性脂质的组合物等。此时的脂质膜也为脂单层膜(脂质单分子膜)或脂双层膜(脂质双分子膜)均可。此外，该脂质膜中也可以含有除本发明的阳离子性脂质以外的阳离子性脂质、中性脂质及/或高分子。
本发明的组合物中，较优选为包含本发明的阳离子性脂质与核酸的复合体的组合物，包含本发明的阳离子性脂质与核酸的复合体及将该复合体封入的脂质膜、且该脂质膜中含有本发明的阳离子性脂质的组合物，以及包含除本发明的阳离子性脂质以外的阳离子性脂质与核酸的复合体及将该复合体封入的脂质膜、且该脂质膜中含有本发明的阳离子性脂质的组合物；进一步优选为包含本发明的阳离子性脂质与核酸的复合体的组合物，以及包含本发明的阳离子性脂质与核酸的复合体及将该复合体封入的脂质膜、且该脂质膜中含有本发明的阳离子性脂质的组合物；最优选为包含本发明的阳离子性脂质与核酸的复合体及将该复合体封入的脂质膜、且该脂质膜中含有本发明的阳离子性脂质的组合物。需要说明的是，在任意情况下，该脂质膜中均可以含有中性脂质及/或高分子。此外，该复合体及/或该脂质膜中也可以含有除本发明的阳离子性脂质以外的阳离子性脂质。
作为复合体的形态，可以举出例如核酸与由脂单(单分子)层形成的膜(逆胶束)的复合体、核酸与脂质体的复合体、核酸与胶束的复合体等，可优选举出核酸与由脂单层形成的膜的复合体、或者核酸与脂质体的复合体。
作为包含复合体及将该复合体封入的脂质膜的组合物，可以举出例如该复合体以及用脂双层膜将该复合体封入而得到的脂质体等。
需要说明的是，本发明的组合物中，可以使用一种或多种本发明的阳离子性脂质，此外，也可以在本发明的阳离子性脂质中混合除本发明的阳离子性脂质以外的阳离子性脂质。
作为除本发明的阳离子性脂质以外的阳离子性脂质，可以举出例如日本特开昭61-161246号公报(美国专利5049386号说明书)中公开的、N-[1-(2,3-二油基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、N-(2,3-二-(9-(Z)-十八碳烯酰基氧基))-丙-1-基-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTAP)等，国际公开第91/16024号小册子及国际公开第97/019675号小册子中公开的、N-[1-(2,3-二油基氧基丙基)]-N,N-二甲基-N-羟基乙基溴化铵(DORIE)、2,3-二油基氧基-N-[2-(精胺羧基酰胺)乙基]-N,N-二甲基-1-丙基-三氟乙酸铵(DOSPA)等，国际公开第2005/121348号小册子中公开的DLinDMA等，国际公开第2009/086558号小册子中公开的DLin-K-DMA，国际公开第2011/136368号小册子中公开的(3R,4R)-3,4-双((Z)-十六碳-9-烯基氧基)-1-甲基吡咯烷、N-甲基-N,N-双(2-((Z)-十八碳-6-烯基氧基)乙基)胺等；优选举出DOTMA、DOTAP、DORIE、DOSPA、1,2-二亚油基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)、2,2-二亚油基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)等具有包含2个未取代烷基的叔胺部位或包含3个未取代烷基的季铵部位的阳离子性脂质；较优选举出具有所述叔胺部位的阳离子性脂质。所述叔胺部位及所述季铵部位的未取代烷基较优选为甲基。
需要说明的是，本发明的组合物可以包含核酸，也可以包含与核酸化学性地近似的化合物。
本发明的组合物可以采用已知的制造方法或基于已知的制造方法的方法进行制造，可以采用任何制造方法进行制造。例如，对于作为组合物之一的包含脂质体的组合物的制造，可以适用已知的脂质体的制备方法。作为已知的脂质体的制备方法，可以举出例如Bangham等的脂质体制备法[参见“J.Mol.Biol.”,1965年,第13卷,p.238-252]、乙醇注入法[参见“J.Cell Biol.”,1975年,第66卷,p.621-634]、法兰西加压法[参见“FEBS Lett.”,1979年,第99卷,p.210-214]、冻融法[参见“Arch.Biochem.Biophys.”,1981年,第212卷,p.186-194]、逆向蒸发法[参见“Proc.Natl.Acad.Sci.USA”,1978年,第75卷,p.4194-4198]或pH梯度法(参见例如日本专利第2572554号公报、日本专利第2659136号公报等)等。作为制造脂质体时将脂质体分散的溶液，可以使用例如水、酸、碱、各种缓冲液、生理盐水或氨基酸输液等。此外，制造脂质体时，还可以添加例如柠檬酸、抗坏血酸、半胱氨酸或乙二胺四乙酸(EDTA)等抗氧化剂、例如丙三醇、葡萄糖或氯化钠等的等渗剂等。此外，也可以通过例如下述方法制造脂质体：将本发明的阳离子性脂质、或者本发明的阳离子性脂质与除本发明的阳离子性脂质以外的阳离子性脂质的混合物等溶解在例如乙醇等有机溶剂中，蒸馏除去溶剂后，添加生理盐水等，振荡搅拌，形成脂质体。
此外，本发明的组合物可以通过下述方法来制造，所述方法为例如将本发明的阳离子性脂质、或者本发明的阳离子性脂质与除本发明的阳离子性脂质以外的阳离子性脂质的混合物预先溶解在氯仿中，接着加入核酸的水溶液和甲醇并进行混合，形成阳离子性脂质/核酸的复合体，进而取出氯仿层，向其中加入聚乙二醇化磷脂、中性脂质和水，形成油包水型(W/O)乳液，采用逆向蒸发法进行处理从而进行制造的方法(参见日本特表2002-508765号公报)；将核酸溶解在酸性电解质水溶液中，加入例如本发明的阳离子性脂质、或者本发明的阳离子性脂质与除本发明的阳离子性脂质以外的阳离子性脂质的混合物(乙醇中)，降低乙醇浓度至20v/v％从而制备内含上述核酸的脂质体，进行尺寸过滤，通过透析除去过量的乙醇后，进一步提高试样的pH，透析除去附着在组合物表面的核酸从而进行制造的方法(参见日本特表2002-501511号公报及Biochimica et Biophysica Acta,2001年,第1510卷,p.152-166)等。
本发明的组合物中，包含含有本发明的阳离子性脂质与核酸的复合体、或者组合本发明的阳离子性脂质与中性脂质及/或高分子所得的物质与核酸的复合体、以及将该复合体封入的脂双层膜的脂质体的组合物，可以按照例如国际公开第02/28367号小册子及国际公开第2006/080118号小册子等中记载的制造方法进行制造。
此外，本发明的组合物中，例如包含本发明的阳离子性脂质与核酸的复合体、或者组合本发明的阳离子性脂质与中性脂质及/或高分子所得的物质与核酸的复合体、以及将该复合体封入的脂质膜的组合物，包含除本发明的阳离子性脂质以外的阳离子性脂质与核酸的复合体、或者组合除本发明的阳离子性脂质以外的阳离子性脂质与中性脂质及/或高分子所得的物质与核酸的复合体、以及将该复合体封入的脂质膜、且该脂质膜中含有本发明的阳离子性脂质的组合物等，可如下得到：按照国际公开第02/28367号小册子及国际公开第2006/080118号小册子等中记载的制造方法，制造各复合体，将该复合体在不溶解的状态下分散至水或0～20％乙醇水溶液中(A液)，另将各个脂质膜成分溶解在例如乙醇水溶液中(B液)，将等量的A液和B液混合，进而适当地加水，由此得到。需要说明的是，作为A液及B液中的阳离子性脂质，可以使用一种或多种本发明的阳离子性脂质或除本发明的阳离子性脂质以外的阳离子性脂质，此外，也可以将本发明的阳离子性脂质与除本发明的阳离子性脂质以外的阳离子性脂质组合来混合使用。
需要说明的是，本发明中，在包含本发明的阳离子性脂质与核酸的复合体、或者组合本发明的阳离子性脂质与中性脂质及/或高分子所得的物质与核酸的复合体、以及将该复合体封入的脂质膜的组合物，包含除本发明的阳离子性脂质以外的阳离子性脂质与核酸的复合体、或者组合除本发明的阳离子性脂质以外的阳离子性脂质与中性脂质及/或高分子所得的物质与核酸的复合体、以及将该复合体封入的脂质膜、且该脂质膜中含有本发明的阳离子性脂质的组合物等的制造中及制造后，由于复合体中的核酸与脂质膜中的阳离子性脂质的静电相互作用、复合体中的阳离子性脂质与脂质膜中的阳离子性脂质的融合，复合体及膜的结构会发生位移，所得的物质也分别被包括在包含本发明的阳离子性脂质与核酸的复合体、或组合本发明的阳离子性脂质与中性脂质及/或高分子所得的物质与核酸的复合体、以及将该复合体封入的脂质膜的组合物，或者包含除本发明的阳离子性脂质以外的阳离子性脂质与核酸的复合体、或组合除本发明的阳离子性脂质以外的阳离子性脂质与中性脂质及/或高分子所得的物质与核酸的复合体、以及将该复合体封入的脂质膜、且该脂质膜中含有本发明的阳离子性脂质的组合物等中。
按照国际公开第02/28367号及国际公开第2006/080118号等中记载的制造方法，制造核酸(与上述定义相同)、优选为双链核酸与包含本发明的阳离子性脂质及/或除本发明的阳离子性脂质以外的阳离子性脂质的脂质体的复合体，将该复合体在不溶解的状态下分散至水或0～20％乙醇水溶液中(A液)，另将本发明的阳离子性脂质及/或除本发明的阳离子性脂质以外的阳离子性脂质溶解在乙醇水溶液中(B液)，将等量或体积比为1:1的A液和B液混合，或者进而适当地加水，由此也可以得到包含该核酸和该阳离子性脂质的组合物。该组合物优选为包含阳离子性脂质与核酸的复合体、及将该复合体封入的脂质膜的组合物，更优选为包含该核酸与由含有该阳离子性脂质的脂单层形成的膜(逆胶束)的复合体、及将该复合体封入的脂质膜的组合物。这些情况下的脂质膜为脂单层膜(脂质单分子膜)或脂双层膜(脂质双分子膜)均可。
此外，关于本发明公开的该核酸与该脂质体的复合体中的脂质体，优选为预先将大小调节成了平均粒径10nm～400nm、更优选30nm～110nm、进一步优选40nm～80nm的脂质体。此外，该复合体及/或脂质膜中，也可以含有中性脂质及/或高分子。此外，A液只要能形成脂质体与该核酸的复合体即可，乙醇浓度可以为20～40％，。
此外，代替将等量的A液和B液混合，可以以成为将A液和B液混合后复合体不溶解、且B液中的阳离子性脂质不溶解的乙醇浓度的、优选复合体不溶解、B液中的阳离子性脂质不溶解、且乙醇浓度为30～60％的乙醇水溶液的比例将A液和B液混合，或者也可以以成为将A液和B液混合后复合体不溶解的乙醇浓度的比例将A液和B液混合，进而加水，由此调配成B液中的阳离子性脂质不溶解的乙醇浓度。
本发明公开的该A液中的核酸与脂质体的复合体，在将A液和B液混合、进而适当地加水后，其形态变成了由含有阳离子性脂质的脂单层形成的膜(逆胶束)与核酸的复合体。采用本发明公开的制造方法得到的包含该核酸和该阳离子性脂质的组合物，优选为包含阳离子性脂质与核酸的复合体及将该复合体封入的脂质膜的组合物，更优选为包含由含有阳离子性脂质的脂单层形成的膜(逆胶束)与核酸的复合体、及将该复合体封入的脂质膜、且该脂质膜中含有阳离子性脂质的组合物，其制造性(收率及/或均匀性)优异。
本发明的组合物中，复合体中的本发明的阳离子性脂质的分子总数优选相对于该核酸的磷原子数为0.5～4倍、更优选为1.5～3.5倍、进一步优选为2～3倍。此外，该复合体中的本发明的阳离子性脂质及除本发明的阳离子性脂质以外的阳离子性脂质的分子总数优选相对于该核酸的磷原子数为0.5～4倍、更优选为1.5～3.5倍、进一步优选为2～3倍。
本发明的组合物中，包含复合体及将该复合体封入的脂质膜的组合物中的本发明的阳离子性脂质的分子总数优选相对于该核酸的磷原子数为1～10倍、更优选为2.5～9倍、进一步优选为3.5～8倍。此外，该组合物中的本发明的阳离子性脂质及除本发明的阳离子性脂质以外的阳离子性脂质的分子总数优选相对于该核酸的磷原子数为1～10倍、更优选为2.5～9倍、进一步优选为3.5～8倍。
作为中性脂质，可以为单纯脂质、复合脂质或衍生脂质中的任一种，可以举出例如磷脂、甘油糖脂、神经鞘糖脂、鞘氨基醇(sphingoid)或甾醇等，但不限定于这些。
本发明的组合物中包含中性脂质时，中性脂质的分子总数优选相对于本发明的阳离子性脂质及除本发明的阳离子性脂质以外的阳离子性脂质的分子总数为0.1～1.8倍、更优选为0.3～1.2倍、进一步优选为0.4～1.0倍。本发明的组合物均可以将中性脂质包含在复合体中，也可以包含在将复合体封入的脂质膜中，较优选至少包含在将复合体封入的脂质膜中，进一步优选在复合体及将该复合体封入的脂质膜中的任一方中均有包含。
作为中性脂质中的磷脂，可以举出例如磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine)(具体而言，大豆磷脂酰胆碱(soybean phosphatidylcholine)、蛋黄磷脂酰胆碱(egg yolkphosphatidylcholine)(EPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(distearoyl phosphatidylcholine)(DSPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(dipalmitoyl phosphatidylcholine)(DPPC)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(palmitoyloleoyl phosphatidylcholine)(POPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(dimyristoyl phosphatidylcholine)(DMPC)、二油酰磷脂酰胆碱(dioleoylphosphatidylcholine)(DOPC)等)、磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine)(具体而言，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(distearoyl phosphatidylethanolamine)(DSPE)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(dipalmitoyl phosphatidylethanolamine)(DPPE)、二油酰磷脂酰乙醇胺(dioleoyl phosphatidylethanolamine)(DOPE)、二肉豆蔻酰磷酸乙醇胺(dimyristoylphosphoethanolamine)(DMPE)、16-0-单甲基PE(16-0-monomethyl PE)、16-0-二甲基PE(16-0-dimethyl PE)、18-1-反式PE(18-1-trans PE)、棕榈酰油酰-磷脂酰乙醇胺(palmitoyloleoyl-phosphatidylethanolamine)(POPE)、1-硬酯酰-2-油酰-磷脂酰乙醇胺(1-stearoyl-2-oleoyl-phosphatidylethanolamine)(SOPE)等)、甘油磷脂(glycerophospholipid)(具体而言，磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine)、磷脂酸(phosphatidic acid)、磷脂酰甘油(phosphatidylglycerol)、磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol)、棕榈酰油酰磷脂酰甘油(palmitoyloleoylphosphatidylglycerol)(POPG)、溶血磷脂酰胆碱(lysophosphatidylcholine)等)、神经鞘氨醇磷脂(sphingophospholipid)(具体而言，神经鞘磷脂(sphingomyelin)、磷酸乙醇胺神经酰胺(ceramide phosphoethanolamine)、神经酰胺磷酸甘油(ceramidephosphoglycerol)、磷酸甘油磷酸神经酰胺(ceramide phosphoglycerophosphate)等)、甘油磷酸脂(glycerophosphonolipid)、神经鞘磷酸脂(sphingophosphonolipid)、天然卵磷脂(natural lecithin)(具体而言蛋黄卵磷脂(egg yolk lecithin)、大豆卵磷脂(soybeanlecithin)等)或者氢化磷脂(hydrogenated phospholipid)(具体而言氢化大豆磷脂酰胆碱(hydrogenated soybean phosphatidylcholine)等)等天然或者合成的磷脂。
作为中性脂质中的甘油糖脂，可以举出例如硫氧基核糖基甘油酯(sulfoxyribosyl glyceride)、二糖基甘油二酯(diglycosyl diglyceride)、二半乳糖甘油二酯(digalactosyl diglyceride)、半乳糖甘油二酯(galactosyl diglyceride)或者糖基甘油二酯(glycosyl diglyceride)等。
作为中性脂质中的鞘糖脂，可以举出例如半乳糖基脑苷脂(galactosylcerebroside)、乳糖脑苷脂(lactosyl cerebroside)或者神经节苷脂(ganglioside)等。
作为中性脂质中的鞘氨基醇，可以举出例如鞘氨糖(sphingan)、二十鞘氨糖(icosasphingan)、鞘氨醇(sphingosine)或者它们的衍生物等。作为衍生物，可以举出将例如鞘氨糖、二十鞘氨糖或者鞘氨醇等的-NH2转化为-NHCO(CH2)xCH3(式中，x为0～18的整数，其中优选6、12或者18)的产物等。
作为中性脂质中的甾醇，可以举出例如胆固醇(cholesterol)、二氢胆甾醇(dihydrocholesterol)、羊毛甾醇(lanosterol)、β-谷甾醇(β-sitosterol)、菜油甾醇(campesterol)、豆甾醇(stigmasterol)、菜子甾醇(brassicasterol)、麦角钙化甾醇(ergocasterol)、岩藻甾醇(fucosterol)或者3β-[N-(N’,N’-二甲基氨基乙基)氨基甲酰基]胆固醇(3β-[N-(N’,N’-dimethylaminoethyl)carbamoyl]cholesterol)(DC-Chol)等。
作为高分子，可以举出包含例如蛋白质、白蛋白、葡聚糖、polyfect、脱乙酰壳多糖(chitosan)、硫酸葡聚糖(dextran sulfate)、例如聚-L-赖氨酸、聚乙烯亚胺、聚天冬氨酸、苯乙烯马来酸共聚物、异丙基丙烯酰胺-丙烯基吡咯烷酮共聚物、聚乙二醇修饰树状聚体(dendrimer)、聚乳酸、聚乳酸聚乙醇酸或聚乙二醇化聚乳酸等高分子或者它们的盐的一种以上形成的胶束等。
此处，高分子中的盐，包括例如金属盐、铵盐、酸加成盐、有机胺加成盐、氨基酸加成盐等。作为金属盐，可以举出例如锂盐、钠盐、钾盐等碱金属盐，镁盐、钙盐等碱土金属盐，铝盐或锌盐等。作为铵盐，可以举出例如铵或四甲基铵等盐。作为酸加成盐，可以举出例如盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐或磷酸盐等无机酸盐，及乙酸盐、马来酸盐、富马酸盐或柠檬酸盐等有机酸盐。作为有机胺加成盐，可以举出例如吗啉或哌啶等的加成盐。作为氨基酸加成盐，可以举出例如甘氨酸、苯基丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或赖氨酸等的加成盐。
此外，本发明的组合物均优选包含例如选自糖、肽、核酸及水溶性高分子中的一种以上的物质的脂质衍生物或脂肪酸衍生物或者表面活性剂等，可以包含在复合体中，也可以包含在将复合体封入的脂质膜中，较优选在复合体及将该复合体封入的脂质膜中均有包含。
本发明的组合物包含选自糖、肽、核酸及水溶性高分子中的一种以上的物质的脂质衍生物或脂肪酸衍生物时，选自糖、肽、核酸及水溶性高分子中的一种以上的物质的脂质衍生物及脂肪酸衍生物的分子总数优选相对于本发明的阳离子性脂质及除本发明的阳离子性脂质以外的阳离子性脂质的分子总数为0.05～0.3倍、更优选为0.07～0.25倍、进一步优选为0.1～0.2倍。
作为选自糖、肽、核酸及水溶性高分子中的一种以上的物质的脂质衍生物或脂肪酸衍生物或者表面活性剂，优选看举出糖脂、或水溶性高分子的脂质衍生物或脂肪酸衍生物，较优选看举出水溶性高分子的脂质衍生物或脂肪酸衍生物。选自糖、肽、核酸及水溶性高分子中的一种以上的物质的脂质衍生物或脂肪酸衍生物或者表面活性剂优选为下述具有两面性的物质，所述物质具有分子的一部分与组合物的其他构成成分通过例如疏水性亲和力、静电相互作用等结合的性质，并且具有其他部分与制造组合物时的溶剂通过例如亲水性亲和力、静电相互作用等结合的性质。
作为糖、肽或核酸的脂质衍生物或脂肪酸衍生物，可以举出例如蔗糖、山梨醇、乳糖等糖、例如来自酪蛋白的肽、来自蛋白的肽、来自大豆的肽、谷胱甘肽等肽、或者例如DNA、RNA、质粒、siRNA、ODN等核酸、与上述组合物的定义中举出的中性脂质或本发明的阳离子性脂质或者例如硬脂酸、棕榈酸、肉豆蔻酸、月桂酸等脂肪酸结合而成的物质等。
此外，作为糖的脂质衍生物或脂肪酸衍生物，还包括例如上述组合物的定义中举出的甘油糖脂或神经鞘糖脂等。
作为水溶性高分子的脂质衍生物或脂肪酸衍生物，可以举出例如聚乙二醇、聚甘油、聚乙烯亚胺、聚乙烯醇、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺、寡糖、糊精、水溶性纤维素、葡聚糖、硫酸软骨素、聚甘油、脱乙酰壳多糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚天冬酰胺、聚-L-赖氨酸、甘露聚糖、普鲁兰多糖、寡甘油等或它们的衍生物、与上述组合物的定义中举出的中性脂质或本发明的阳离子性脂质、或者例如硬脂酸、棕榈酸、肉豆蔻酸或月桂酸等脂肪酸结合而成的物质、它们的盐等，较优选举出聚乙二醇或聚甘油等的脂质衍生物或脂肪酸衍生物及它们的盐，进一步优选举出聚乙二醇的脂质衍生物或脂肪酸衍生物及它们的盐。
作为聚乙二醇的脂质衍生物或脂肪酸衍生物，可以举出例如聚乙二醇化脂质[具体而言，聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺(更具体而言，1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](PEG-DSPE)、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](PEG-DMPE)等)、聚氧乙烯氢化蓖麻油60、聚氧乙烯蓖麻油(CREMOPHOREL)等]、聚乙二醇失水山梨糖醇脂肪酸酯类(具体而言，聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯等)或聚乙二醇脂肪酸酯类等，较优选举出聚乙二醇化脂质。
作为聚甘油的脂质衍生物或脂肪酸衍生物，可以举出例如聚甘油化脂质(具体而言，聚甘油-磷脂酰乙醇胺等)或聚甘油脂肪酸酯类等，较优选举出聚甘油化脂质。
作为表面活性剂，可以举出例如聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯(具体而言，聚山梨酸酯80等)、聚氧乙烯聚氧丙烯二醇(具体而言，普朗尼克(Pluronic)F68等)、失水山梨糖醇脂肪酸酯(具体而言，失水山梨糖醇单月桂酸酯、失水山梨糖醇单油酸酯等)、聚氧乙烯衍生物(具体而言，聚氧乙烯氢化蓖麻油60、聚氧乙烯月桂醇等)、丙三醇脂肪酸酯或聚乙二醇烷基醚等，优选举出聚氧乙烯聚氧丙烯二醇、丙三醇脂肪酸酯或聚乙二醇烷基醚等。
此外，对于本发明的组合物中的复合体及脂质膜，还可以任意地进行利用例如水溶性高分子等的表面改性[参见D.D.Lasic、F.Martin编,“Stealth Liposomes”(美国),CRCPress Inc,1995年,p.93-102]。作为可用于表面改性的水溶性高分子，可以举出例如聚乙二醇、聚甘油、聚乙烯亚胺、聚乙烯醇、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺、寡糖、糊精、水溶性纤维素、葡聚糖、硫酸软骨素、聚甘油、脱乙酰壳多糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚天冬酰胺、聚-L-赖氨酸、甘露聚糖、普鲁兰多糖、寡甘油等，优选举出葡聚糖、普鲁兰多糖、甘露聚糖、支链淀粉或羟基乙基淀粉等。此外，表面改性中，可以使用选自糖、肽、核酸及水溶性高分子中的一种以上的物质的脂质衍生物或脂肪酸衍生物(与上述定义相同)等。该表面改性是使本发明的组合物中的复合体及脂质膜中包含选自糖、肽、核酸及水溶性高分子中的一种以上的物质的脂质衍生物或脂肪酸衍生物或者表面活性剂的方法之一。
此外，也可以任选地通过将经靶向化的配体以共价键键合于本发明的脂质纳米粒子的脂质成分的极性首残基而将该经靶向化的配体直接键合于本发明的脂质纳米粒子的表面(参见国际公开第2006/116107号小册子)。
本发明的组合物中的复合体或将复合体封入的脂质膜的平均粒径可以根据需要自由选择，优选为下文所述的平均粒径。作为调节平均粒径的方法，可以举出例如挤出法、将较大的多层膜脂质体(MLV)等机械粉碎(具体而言，使用Manton Gaulin、高压微射流均质机(Microfluidizer)等)的方法[参见R.H.Muller、S.Benita、B.Bohm编著,“Emulsion andNanosuspensions for the Formulation of Poorly Soluble Drugs”,Germany,Scientific Publishers Stuttgart,1998年,p.267-294]等。
关于本发明的组合物中的复合体的大小，平均粒径优选为约5nm～200nm，更优选为约20nm～150nm，进一步优选为约30nm～100nm。
关于本发明的组合物(将复合体封入的脂质膜)的大小，平均粒径优选为约10nm～300nm，更优选为约30nm～200nm，进一步优选为约50nm～150nm。
对于本发明的组合物中的复合体或将复合体封入的脂质膜的平均粒径，可采用例如动态光散射法进行测定。
通过将本发明的组合物导入哺乳类的细胞，能够将本发明的组合物中的核酸导入细胞内。
在体内将本发明的组合物向哺乳类的细胞中的导入可以按照能够在体内进行的已知的转染的工序进行。例如，通过将本发明的组合物静脉内施予至包括人在内的哺乳动物，能够送达至例如产生肿瘤或炎症的脏器或部位，将本发明的组合物中的核酸导入送达脏器或部位的细胞内。作为产生肿瘤或炎症的脏器或部位，没有特别限定，可以举出例如胃、大肠、肝脏、肺、脾脏、胰腺、肾脏、膀胱、皮肤、血管、眼球等。此外，通过将本发明的组合物静脉内施予至包括人在内的哺乳动物，能够送达至例如肝脏、肺、脾脏及/或肾脏，将本发明的组合物中的核酸导入送达脏器或部位的细胞内。肝脏、肺、脾脏及/或肾脏的细胞可以为正常细胞、与肿瘤或炎症相关的细胞或者与其他疾病相关的细胞中的任一种。
本发明的组合物中的核酸只要是具有利用了RNA干扰(RNAi)的靶基因表达抑制作用的核酸，则能够在体内将抑制靶基因的表达的该核酸等导入哺乳类的细胞内，能够抑制靶基因的表达。施予对象优选为人。
此外，本发明中的靶基因只要是例如肝脏、肺、肾脏或脾脏中表达的基因、优选肝脏中表达的基因，则能够将本发明的组合物用作肝脏、肺、肾脏或脾脏相关疾病的治疗剂或预防剂、优选肝脏相关疾病的治疗剂或预防剂。
即，本发明还提供肝脏、肺、肾脏或脾脏相关疾病的治疗方法，其中，将上文说明过的本发明的组合物施予至哺乳动物。施予对象优选为人，较优选罹患肝脏、肺、肾脏或脾脏相关疾病的人。
此外，本发明的组合物还可以用作在关于肝脏、肺、肾脏或脾脏相关疾病的治疗剂或预防剂的体内药效评价模型中用于验证抑制靶基因的有效性的工具。
本发明的组合物还可以用作以例如血液成分等的生物体成分(例如血液、消化道等)中的上述核酸的稳定化、副作用的降低、或者增大对包含靶基因的表达部位的组织或脏器的药物蓄积性等为目的的制剂。
将本发明的组合物用作药品中的肝脏、肺、肾脏或脾脏相关疾病等的治疗剂或预防剂时，作为施予途径，优选使用在治疗时最有效的施予途径，可以举出例如口腔内、气管内、直肠内、皮下、肌肉内或静脉内等肠胃外施予或口服施予，优选举出静脉内施予或肌肉内施予，较优选举出静脉内施予。
施予量根据施予对象的症状、年龄、施予途径等的不同而不同，例如可以以换算为核酸的1天施予量约为0.1μg～1000mg的方式施予。
作为适合于静脉内施予或肌肉内施予的制剂，可以举出例如注射剂，可以将通过上述方法制备的组合物的分散液直接以例如注射剂等的形态使用，也可以从该分散液中通过例如过滤、离心分离等除去溶剂进行使用，也可以将该分散液冷冻干燥进行使用、及/或将加入了例如甘露糖醇、乳糖、海藻糖、麦芽糖或甘氨酸等赋形剂的分散液冷冻干燥进行使用。
为注射剂时，优选向上述组合物的分散液或上述除去溶剂或冷冻干燥而得的组合物中混合例如水、酸、碱、各种缓冲液、生理盐水或氨基酸输液等来制备注射剂。此外，也可以添加例如柠檬酸、抗坏血酸、半胱氨酸或者EDTA等抗酸化剂或丙三醇、葡萄糖或氯化钠等的等渗剂等来制备注射剂。此外，也可以加入例如丙三醇等冷冻保存剂进行冷冻保存。
接下来，通过实施例、参考例及试验例具体地说明本发明。但是，本发明并不限定于这些实施例、参考例及试验例。
需要说明的是，实施例及参考例中所示的质子核磁共振光谱(1H NMR)是在270MHz、300MHz、400MHz或500MHz下测得的，根据化合物及测定条件的不同，有时未能清楚地观测到交换性质子。需要说明的是，作为信号多重度的表述，使用通常所用的表述方式，br表示表观上的宽信号。
实施例1
二((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基)胺(化合物B-1)
向氨(东京化成工业公司制、约2mol/L甲醇溶液、18.0mL、36.0mmol)中加入甲磺酸(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基酯(Nu-Chek Prep,Inc公司制、1.55g、4.50mmol)，使用微波反应装置于130℃搅拌3小时。向反应液中加入饱和碳酸氢钠水溶液，用氯仿萃取5次。合并有机层，用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸镁干燥后过滤，进行减压浓缩，由此得到(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基胺的粗产物。
向得到的粗产物中加入甲磺酸(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基酯(Nu-Chek Prep,Inc公司制、1.24g、3.60mmol)及50％氢氧化钠水溶液(1.44g、18.0mmol)，在油浴上于110℃搅拌60分钟。冷却至室温后，用乙酸乙酯稀释反应液，用水洗涤，然后用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸镁干燥后过滤，进行减压浓缩。将得到的残渣用硅胶柱色谱法(氯仿/甲醇＝100/0～95/5)进行纯化，由此得到化合物B-1(0.838g、收率36.2％)。
ESI-MS m/z:515(M+H)+；1H-NMR(CDCl3)δ:0.89(t,J＝6.9Hz,6H),1.30(br s,33H),1.41-1.54(m,4H),2.01-2.09(m,8H),2.59(t,J＝7.2Hz,4H),2.77(t,J＝5.6Hz,4H),5.28-5.43(m,8H).
实施例2
二((Z)-十八碳-9-烯基)胺(化合物B-2)
采用与参考例1同样的方法，使用氨(东京化成工业公司制、约2mol/L甲醇溶液、12.0mL、24.0mmol)及甲磺酸(Z)-十八碳-9-烯基酯(Nu-Chek Prep,Inc公司制、1.87g、5.40mmol)，得到化合物B-2(0.562g、收率36.2％)。
ESI-MS m/z:519(M+H)+；1H-NMR(CDCl3)δ:0.88(t,J＝6.7Hz,6H),1.29(br s,45H),1.41-1.52(m,4H),1.97-2.05(m,8H),2.58(t,J＝7.2Hz,4H),5.28-5.40(m,4H).
实施例3
二((Z)-十六碳-9-烯基)胺(化合物B-3)
采用与参考例1同样的方法，使用氨(SIGMA-ALDRICH公司制、约7mol/L甲醇溶液、1.66mL、11.6mmol)及甲磺酸(Z)-十六碳-9-烯基酯(Nu-Chek Prep,Inc公司制、0.488g、1.46mmol)，得到化合物B-3(0.243g、收率36.0％)。
1H-NMR(CDCl3)δ:0.89(t,J＝6.9Hz,6H),1.24-1.37(m,37H),1.43-1.52(m,4H),1.98-2.05(m,8H),2.58(t,J＝7.2Hz,4H),5.31-5.38(m,4H).
实施例4
二((11Z,14Z)-二十碳-11,14-二烯基)胺(化合物B-4)
采用与参考例1同样的方法，使用氨(SIGMA-ALDRICH公司制、约7mol/L甲醇溶液、1.60mL、11.2mmol)及甲磺酸(11Z,14Z)-二十碳-11,14-二烯基酯(Nu-Chek Prep,Inc公司制、0.521g、1.40mmol)，得到化合物B-4(0.292g、收率36.6％)。
1H-NMR(CDCl3)δ:0.89(t,J＝6.8Hz,6H),1.24-1.39(m,41H),1.43-1.51(m,4H),2.02-2.08(m,8H),2.58(t,J＝7.3Hz,4H),2.77(t,J＝6.7Hz,4H),5.30-5.41(m,8H).
实施例5
二((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基)氨基甲酸3-(二甲基氨基)丙基酯(化合物A-1)
将实施例1中得到的化合物B-1(1.35g、2.63mmol)溶解于氯仿(18mL)中，加入采用以“J.Am.Chem.Soc.”,1981年,第103卷,p.4194-4199中记载的方法为基准的方法合成的碳酸3-(二甲基氨基)丙基4-硝基苯基酯盐酸盐(化合物VI-1)(1.20g、3.94mmol)及三乙胺(1.47mL、10.5mmol)，使用微波反应装置于110℃搅拌60分钟。向反应液中加入化合物VI-1(200mg、0.658mmol)，使用微波反应装置于110℃搅拌20分钟。向反应液中加入化合物VI-1(200mg、0.658mmol)，使用微波反应装置于110℃搅拌20分钟。向反应液中加入化合物VI-1(200mg、0.658mmol)，使用微波反应装置于110℃搅拌20分钟。用氯仿稀释反应液，用1mol/L氢氧化钠水溶液洗涤3次，然后用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸镁干燥后过滤，进行减压浓缩。将得到的残渣溶解于少量的正己烷/乙酸乙酯(1/4)中，使其吸附于氨基修饰的硅胶垫上，用正己烷/乙酸乙酯(1/4)进行洗脱，进行减压浓缩。将得到的残渣用硅胶柱色谱法(氯仿/甲醇＝100/0～95/5)进行纯化，由此得到化合物A-1(1.39g、收率82.2％)。
ESI-MS m/z:644(M+H)+；1H-NMR(CDCl3)δ:0.89(t,J＝6.7Hz,6H),1.29(br s,32H),1.45-1.56(m,4H),1.74-1.85(m,2H),2.00-2.09(m,8H),2.23(s,6H),2.35(t,J＝7.4Hz,2H),2.77(t,J＝5.8Hz,4H),3.13-3.23(m,4H),4.10(t,J＝6.4Hz,2H),5.28-5.43(m,8H).
实施例6
二((Z)-十八碳-9-烯基)氨基甲酸3-(二甲基氨基)丙基酯
(化合物A-2)
采用与实施例5同样的方法，代替化合物B-1使用实施例2中得到的化合物B-2(0.156g、0.301mmol)，得到化合物A-2(0.267g、收率88.7％)。
ESI-MS m/z:648(M+H)+；1H-NMR(CDCl3)δ:0.88(t,J＝6.6Hz,6H),1.28(br s,44H),1.45-1.55(m,4H),1.75-1.85(m,2H),1.97-2.04(m,8H),2.23(s,6H),2.34(t,J＝7.6Hz,2H),3.13-3.24(m,4H),4.10(t,J＝6.4Hz,2H),5.28-5.40(m,4H).
实施例7
二((Z)-十六碳-9-烯基)氨基甲酸3-(二甲基氨基)丙基酯
(化合物A-3)
采用与实施例5同样的方法，代替化合物B-1使用实施例3中得到的化合物B-3(0.164g、0.355mmol)，得到化合物A-3(0.116g、收率55.2％)。
ESI-MS m/z:592(M+H)+；1H-NMR(CDCl3)δ:0.88(t,J＝6.9Hz,6H),1.21-1.38(m,36H),1.47-1.54(m,4H),1.75-1.83(m,2H),2.00-2.04(m,8H),2.22(s,6H),2.34(t,J＝7.4Hz,2H),3.11-3.24(m,4H),4.10(t,J＝6.4Hz,2H),5.30-5.38(m,4H).
实施例8
二((11Z,14Z)-二十碳-11,14-二烯基)氨基甲酸3-(二甲基氨基)丙基酯(化合物A-4)
采用与实施例5同样的方法，代替化合物B-1使用实施例4中得到的化合物B-4(0.288g、0.505mmol)，得到化合物A-4(0.290g、收率82.2％)。
ESI-MS m/z:700(M+H)+；1H-NMR(CDCl3)δ:0.89(t,J＝6.8Hz,6H),1.21-1.40(m,40H),1.46-1.54(m,4H),1.76-1.83(m,2H),2.02-2.08(m,8H),2.23(s,6H),2.35(t,J＝7.6Hz,2H),2.77(t,J＝6.7Hz,4H),3.10-3.24(m,4H),4.10(t,J＝6.4Hz,2H),5.30-5.41(m,8H).
实施例9
二((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基)氨基甲酸2-(二甲基氨基)乙基酯(化合物A-5)
采用与实施例5同样的方法，使用实施例1中得到的化合物B-1(0.215g、0.418mmol)，以及，代替化合物VI-1而使用碳酸2-(二甲基氨基)乙基4-硝基苯基酯盐酸盐(化合物VI-2)(0.162g、0.557mmol)，得到化合物A-5(0.184g、收率70.0％)。
ESI-MS m/z:630(M+H)+；1H-NMR(CDCl3)δ:0.89(t,J＝6.8Hz,6H),1.12-1.39(m,32H),1.45-1.54(m,4H),2.00-2.07(m,8H),2.28(s,6H),2.57(t,J＝7.2Hz,2H),2.77(t,J＝6.7Hz,4H),3.11-3.24(m,4H),4.17(t,J＝6.7Hz,2H),5.28-5.41(m,8H).
参考例1
5-氨基-N,N-二((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基)戊酰胺(化合物XI-1)
将实施例1中得到的化合物B-1(150mg、0.292mmol)溶解于氯仿(4mL)中，加入5-(叔丁氧基羰基氨基)戊酸(东京化成工业公司制、95mg、0.438mmol)、二异丙基乙基胺(0.255mL、1.46mmol)及HATU(O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓六氟磷酸盐)(Aldrich公司制、222mg、0.584mmol)，于室温搅拌4小时。向反应混合物中加入饱和碳酸氢钠水溶液，用乙酸乙酯萃取水层。用水、饱和食盐水洗涤有机层，用无水硫酸镁干燥后过滤，进行减压浓缩。将得到的残渣用硅胶柱色谱法(氯仿/甲醇＝100/0～97/3)进行纯化，由此得到5-(二((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基)氨基)-5-氧代戊基氨基甲酸叔丁基酯。
将5-(二((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基)氨基)-5-氧代戊基氨基甲酸叔丁基酯溶解于二氯甲烷(4mL)中，加入三氟乙酸(0.450mL、5.84mmol)，于室温搅拌4小时。向反应混合物中加入饱和碳酸氢钠水溶液，用氯仿萃取水层。用饱和食盐水洗涤有机层，用无水硫酸镁干燥后过滤，进行减压浓缩。将得到的残渣用硅胶柱色谱法(氯仿/甲醇＝100/0～90/10)进行纯化，由此得到化合物XI-1(124mg、收率96.1％)。
ESI-MS m/z:614(M+H)+；1H-NMR(CDCl3)δ:0.89(t,J＝6.8Hz,6H),1.28-1.38(m,32H),1.43-1.57(m,6H),1.63-1.73(m,2H),2.05(q,J＝7.0Hz,8H),2.30(t,J＝7.2Hz,2H),2.71(t,J＝7.2Hz,2H),2.77(t,J＝6.2Hz,4H),3.19(t,J＝7.7Hz,2H),3.28(t,J＝7.7Hz,2H),5.28-5.43(m,8H).
参考例2
5-(二甲基氨基)-N,N-二((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基)戊酰胺(化合物XI-2)
将参考例1中得到的化合物XI-1(90.0mg、0.147mmol)溶解于1,2-二氯乙烷(2mL)和甲醇(2mL)中，加入甲醛(0.219mL、2.94mmol)及三乙酰氧基硼氢化钠(Acros Organics公司制、311mg、1.47mmol)，于室温搅拌5小时。向反应溶液中加入饱和碳酸氢钠水溶液，用乙酸乙酯萃取水层。用饱和氯化钠水溶液洗涤有机层，用无水硫酸镁干燥后过滤，进行减压浓缩。将得到的残渣用硅胶柱色谱法(氯仿/甲醇＝100/0～75/25)进行纯化，由此得到化合物XI-2(88.2mg、收率93.9％)。
ESI-MS m/z:642(M+H)+；1H-NMR(CDCl3)δ:0.89(t,J＝7.0Hz,6H),1.26-1.38(m,32H),1.46-1.71(m,8H),2.05(q,J＝7.0Hz,8H),2.22(s,6H),2.29(q,J＝7.0Hz,4H),2.77(t,J＝6.2Hz,4H),3.19(t,J＝7.9Hz,2H),3.28(t,J＝7.7Hz,2H),5.28-5.42(m,8H).
参考例3
二((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基)氨基甲酸3-氨基丙基酯(化合物XI-3)
将实施例1中得到的化合物B-1(146mg、0.284mmol)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(5mL)中，加入采用以“J.Am.Chem.Soc.”,1981年,第103卷,p.4194-4199中记载的方法为基准的方法合成的3-((4-硝基苯氧基)羰基氧基)丙基氨基甲酸叔丁基酯(145mg、0.426mmol)及三乙胺(0.158mL、1.14mmol)，于室温彻夜搅拌。向反应混合物中加入水，用乙酸乙酯萃取水层。用水、饱和食盐水洗涤有机层，用无水硫酸镁干燥后过滤，进行减压浓缩。将得到的残渣用硅胶柱色谱法(氯仿/甲醇＝100/0～98/2)进行纯化，由此得到二((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基)氨基甲酸3-((N-丁氧基羰基)氨基)丙基酯。
将二((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基)氨基甲酸3-((N-丁氧基羰基)氨基)丙基酯溶解于二氯甲烷(4mL)中，加入三氟乙酸(0.242mL、3.13mmol)，于室温搅拌8小时。向反应混合物中加入饱和碳酸氢钠水溶液，用氯仿萃取水层。用饱和食盐水洗涤有机层，用无水硫酸镁干燥后过滤，进行减压浓缩。将得到的残渣用硅胶柱色谱法(NH硅胶、氯仿/甲醇＝100/0～90/10)进行纯化，由此得到化合物XI-3(75.6mg、收率43.3％)。
ESI-MS m/z:616(M+H)+；1H-NMR(CDCl3)δ:0.89(t,J＝6.8Hz,6H),1.26-1.38(m,32H),1.46-1.54(m,4H),1.73-1.82(m,2H),2.05(q,J＝6.6Hz,8H),2.76-2.80(m,6H),3.18(br s,4H),4.15(t,J＝6.2Hz,2H),5.29-5.43(m,8H).
参考例4
碳酸2-(1-甲基吡咯烷-2-基)乙基4-硝基苯基酯盐酸盐(化合物VI-3)
向氯甲酸4-硝基苯基酯(东京化成工业公司制、1.761g、8.56mmol)的乙醚(20mL)溶液中，加入2-(1-甲基吡咯烷-2-基)乙醇(东京化成工业公司制、1.0mL、7.13mmol)的乙醚(20mL)溶液，于室温彻夜搅拌。对反应液进行减压浓缩，利用乙醇/乙醚(1/1)使得到的残渣结晶，进行过滤，由此得到化合物VI-3(1.27g、收率54％)。
1H-NMR(DMSO-d6)δ:1.59-1.77(m,2H),1.82-2.09(m,3H),2.15-2.26(m,1H),2.76(s,3H),2.93-3.05(m,2H),3.61-3.20(m,3H),4.80(br s,1H),6.95(d,J＝9.2Hz,2H),8.11(d,J＝9.2Hz,2H)
参考例5
碳酸4-硝基苯基3-(哌啶-1-基)丙基酯盐酸盐(化合物VI-4)
向氯甲酸4-硝基苯基酯(1.58g、7.67mmol)的乙醚(32mL)溶液中，加入3-(哌啶-1-基)丙烷-1-醇(SIGMA-ALDRICH公司制、1.00mL、6.39mmol)，于室温彻夜搅拌。对反应液进行减压浓缩，利用乙醇使得到的残渣结晶，进行过滤，由此得到化合物VI-4(1.86g、收率84％)。
ESI-MS m/z:309(M+H)+；1H-NMR(DMSO-d6)δ:1.28-1.49(m,1H),1.62-1.89(m,5H),2.10-2.26(m,2H),2.76-2.96(m,2H),3.04-3.19(m,2H),3.36-3.49(m,2H),4.33(t,J＝6.1Hz,2H),7.58(d,J＝9.2Hz,2H),8.33(d,J＝9.2Hz,2H),10.37(br s,1H).
参考例6
碳酸4-硝基苯基3-(吡咯烷-1-基)丙基酯盐酸盐(化合物VI-5)
向氯甲酸4-硝基苯基酯(596mg、2.84mmol)的乙醚(10mL)溶液中，加入3-(吡咯烷-1-基)丙烷-1-醇(ABCR公司制、386mg、2.84mmol)乙醚(10mL)溶液，于室温搅拌2小时。对反应液进行减压浓缩，利用乙醇使得到的残渣结晶，进行过滤，由此得到化合物VI-5(498mg、收率53％)。
1H-NMR(DMSO-d6)δ:1.76-1.84(m,2H),1.85-2.00(m,4H),3.11-3.16(m,2H),3.30-3.44(m,4H),3.47(t,J＝6.0Hz,2H),4,77(br s,1H),6.95(d,J＝9.2Hz,2H),8.11(d,J＝9.2Hz,2H)
实施例10
二((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基)氨基甲酸2-(1-甲基吡咯烷-2-基)乙基酯(化合物A-6)
将实施例1中得到的化合物B-1(0.161g、0.314mmol)溶解于乙腈(3.0mL)中，加入参考例4中得到的化合物VI-3(0.156g、0.470mmol)及三乙胺(0.219mL、1.57mmol)，于80℃搅拌2小时。用乙酸乙酯稀释反应液，用水洗涤，用无水硫酸镁干燥后过滤，进行减压浓缩。将得到的残渣用氨基硅胶柱色谱法(正己烷/乙酸乙酯＝80/20)进行纯化，由此得到化合物A-6(0.172g、收率82％)。
ESI-MS m/z:670(M+H)+；1H-NMR(CDCl3)δ:0.89(t,J＝6.9Hz,6H),1.20-1.40(m,32H),1.45-1.57(m,6H),1.62-1.83(m,2H),1.94-2.18(m,12H),2.31(s,3H),2.77(t,J＝6.7Hz,4H),3.03-3.26(m,5H),4.06-4.17(m,2H),5.29-5.42(m,8H).
实施例11
二((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基)氨基甲酸3-(哌啶-1-基)丙基酯(化合物A-7)
采用与实施例5同样的方法，代替化合物VI-1使用参考例5中得到的化合物VI-4，得到化合物A-7(0.387g、收率81％)。
ESI-MS m/z:684(M+H)+；1H-NMR(CDCl3)δ:0.89(t,J＝6.9Hz,6H),1.21-1.62(m,42H),1.79-1.86(m,2H),2.02-2.08(m,8H),2.32-2.42(m,6H),2.77(t,J＝6.7Hz,4H),3.10-3.43(m,4H),4.09(t,J＝6.4Hz,2H),5.29-5.42(m,8H).
实施例12
二((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基)氨基甲酸3-(吡咯烷-1-基)丙基酯(化合物A-8)
采用与实施例10同样的方法，代替化合物VI-3使用参考例6中得到的化合物VI-5(0.168g、0.508mmol)，得到化合物A-8(0.225g、收率99％)。
ESI-MS m/z:670(M+H)+；1H-NMR(CDCl3)δ:0.89(t,J＝6.9Hz,6H),1.21-1.40(m,32H),1.46-1.55(m,4H),1.76-1.80(m,4H),1.82-1.89(m,2H),2.01-2.08(m,8H),2.47-2.55(m,6H),2.77(t,J＝6.7Hz,4H),3.11-3.24(m,4H),4.11(t,J＝6.4Hz,2H),5.29-5.42(m,8H).
参考例7
2-硝基-N-((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基)苯磺酰胺(化合物IId-1)
向甲磺酸(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基酯(Nu-Chek Prep,Inc公司制、2.85g、8.27mmol)的乙腈(30ml)溶液中，加入碳酸铯(6.74g、20.67mmol)、四丁基碘化铵(东京化成工业公司制、3.05g、8.27mmol)及N-(叔丁氧基羰基)-2-硝基苯磺酰胺(东京化成工业公司制、2.50g、8.27mmol)，在加热回流下使其反应3小时。将反应液冷却至室温，加入水，用乙酸乙酯萃取。用无水硫酸镁干燥有机层后过滤，进行减压浓缩。将残渣用柱色谱法(正己烷/乙酸乙酯＝91/9～70/30)进行纯化，由此得到(2-硝基苯基)磺酰基((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)氨基甲酸叔丁基酯(3.21g、收率70.5％)。
向(2-硝基苯基)磺酰基((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)氨基甲酸叔丁基酯(3.21g、5.83mmol)的二氯甲烷(22.5ml)溶液中加入三氟乙酸(9.63ml、126mmol)，于室温搅拌0.5小时。向反应液中加入二氯甲烷及氢氧化钠水溶液(1mol/L、100mL)，进而加入饱和碳酸氢钠水溶液，将水层的pH调节为8以上。用二氯甲烷对得到的混合物进行萃取，用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸镁干燥后过滤，进行减压浓缩。将残渣用柱色谱法(正己烷/氯仿＝50/50～0/100)进行纯化，由此得到化合物IId-1(2.48g、收率94％)。
ESI-MS m/z:451(M+H)+；1H-NMR(CDCl3)δ:0.89(t,J＝7.0Hz,3H),1.22-1.39(m,16H),1.52(m,2H),2.01-2.05(m,4H),2.77(t,J＝6.6Hz,2H),3.09(q,J＝6.7Hz,2H),5.23(m,1H),5.31-5.42(m,4H),7.71-7.76(m,2H),7.78-7.87(1H),8.13-8.15(m,1H).
实施例13
十二烷基((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)胺(化合物B-5)
向参考例7中得到的化合物IId-1(0.714g、1.584mmol)和1-溴十二烷(东京化成工业制、0.474g、1.90mmol)的乙腈(6ml)溶液中，加入四丁基碘化铵(东京化成工业公司制、0.585g、1.58mmol)及碳酸铯(1.03g、3.17mmol)，于60℃搅拌1小时。向反应液中加入水，用正己烷萃取3次。将萃取液用柱色谱法(正己烷/乙酸乙酯＝94/6～84/16)进行纯化，得到N-十二烷基-2-硝基-N-((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)苯磺酰胺(0.750g、收率76％)。
向N-十二烷基-2-硝基-N-((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)苯磺酰胺(0.748g、1.21mmol)的乙腈(7ml)溶液中，加入1-十二烷基硫醇(东京化成工业公司制、0.611g、3.02mmol)及1,8-二氮杂双环[5.4.0]-7-十一碳烯(Nacalai Tesque公司制、0.460g、3.02mmol)，于60℃搅拌1小时。向反应液中加入水，用乙酸乙酯萃取2次。合并有机层，用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸镁干燥后过滤，进行减压浓缩。将残渣用柱色谱法(正己烷/乙酸乙酯＝80:20，然后氯仿/甲醇＝100/0～88/12)进行纯化，由此得到化合物B-5(0.534g、定量的收率)。
ESI-MS m/z:434(M+H)+；1H-NMR(CDCl3)δ:0.88(t,J＝6.9Hz,3H),0.89(t,J＝6.9Hz,3H),1.24-1.38(m,35H),1.49-1.54(m,4H),2.05(q,J＝7.0Hz,4H),2.62(t,J＝7.4Hz,4H),2.77(t,J＝6.8Hz,2H),5.30-5.41(m,4H).
实施例14
癸基((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)胺(化合物B-6)
采用与实施例13同样的方法，使用参考例7中得到的化合物IId-1(0.619g、1.37mmol)，以及，代替1-溴十二烷而使用1-溴癸烷(东京化成工业公司制、0.365g、1.65mmol)，得到化合物B-6(0.423g、收率76％)。
ESI-MS m/z:406(M+H)+；1H-NMR(CDCl3)δ:0.88(t,J＝7.1Hz,3H),0.89(t,J＝6.9Hz,3H),1.25-1.38(m,31H),1.46-1.50(m,4H),2.05(q,J＝7.0Hz,4H),2.59(t,J＝7.2Hz,4H),2.77(t,J＝6.9Hz,2H),5.31-5.40(m,4H).
实施例15
((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)(辛基)胺(化合物B-7)
采用与实施例13同样的方法，使用参考例7中得到的化合物IId-1(0.714g、1.58mmol)，以及，代替1-溴十二烷而使用1-溴辛烷(东京化成工业公司制、0.367g、1.90mmol)，得到化合物B-7(0.519g、收率87％)。
ESI-MS m/z:378(M+H)+；1H-NMR(CDCl3)δ:0.88(t,J＝7.1Hz,3H),0.89(t,J＝6.9Hz,3H),1.24-1.39(m,27H),1.48-1.54(m,4H),2.05(q,J＝7.0Hz,4H),2.62(t,J＝7.4Hz,4H),2.77(t,J＝6.6Hz,2H),5.30-5.41(m,4H).
实施例16
十二烷基((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基)氨基甲酸3-(二甲基氨基)丙基酯(化合物A-9)
采用与实施例5同样的方法，代替化合物B-1使用实施例13中得到的化合物B-5(0.260g、0.600mmol)，得到化合物A-9(0.309g、收率91％)。
ESI-MS m/z:563(M+H)+；1H-NMR(CDCl3)δ:0.88(t,J＝6.9Hz,3H),0.89(t,J＝6.9Hz,3H),1.23-1.38(m,34H),1.48-1.53(m,4H),1.77-1.82(m,2H),2.05(q,J＝7.1Hz,4H),2.23(s,6H),2.34(t,J＝7.6Hz,2H),2.77(t,J＝6.6Hz,2H),3.13-3.22(m,4H),4.10(t,J＝6.5Hz,2H),5.30-5.41(m,4H).
实施例17
癸基((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基)氨基甲酸3-(二甲基氨基)丙基酯(化合物A-10)
采用与实施例5同样的方法，代替化合物B-1使用实施例14中得到的化合物B-6(0.185g、0.456mmol)，得到化合物A-10(0.228g、收率93％)。
ESI-MS m/z:535(M+H)+；1H-NMR(CDCl3)δ:0.88(t,J＝6.8Hz,3H),0.89(t,J＝6.7Hz,3H),1.24-1.38(m,30H),1.48-1.53(m,4H),1.77-1.82(m,2H),2.05(q,J＝7.0Hz,4H),2.22(s,6H),2.34(t,J＝7.5Hz,2H),2.77(t,J＝6.8Hz,2H),3.14-3.22(m,4H),4.10(t,J＝6.4Hz,2H),5.31-5.40(m,4H).
实施例18
((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基)(辛基)氨基甲酸3-(二甲基氨基)丙基酯(化合物A-11)
采用与实施例5同样的方法，代替化合物B-1使用实施例15中得到的化合物B-7(0.227g、0.600mmol)，得到化合物A-11(0.275g、收率90％)。
ESI-MS m/z:507(M+H)+；1H-NMR(CDCl3)δ:0.88(t,J＝6.9Hz,3H),0.89(t,J＝6.9Hz,3H),1.22-1.39(m,26H),1.47-1.54(m,4H),1.76-1.82(m,2H),2.05(q,J＝6.0Hz,4H),2.23(s,6H),2.34(t,J＝7.6Hz,2H),2.77(t,J＝6.6Hz,2H),3.12-3.22(m,4H),4.10(t,J＝6.5Hz,2H),5.30-5.41(m,4H).
参考例8
甲磺酸2-((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基氧基)乙基酯(化合物IIIc-1)
向甲磺酸(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基酯(983mg、2.85mmol)中加入乙二醇(3.16ml、57.1mmol)及1,4-二氧杂环己烷(5ml)，在加热回流下搅拌1天。将反应液冷却至室温后，加入氢氧化钠水溶液(0.5mol/L)，用正己烷萃取2次。合并有机层，用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸镁干燥后过滤，进行减压浓缩。将残渣用柱色谱法(氯仿100％)进行纯化，由此得到2-((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基氧基)乙醇(668mg、收率75％)。
向2-((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基氧基)乙醇(660mg、2.13mmol)和三乙胺(0.444mL、3.19mmol)的二氯甲烷(9ml)溶液中，于0℃加入甲磺酸酐(SIGMA-ALDRICH公司制、0.247ml、3.19mmol)，于室温搅拌40分钟。向反应液中加入水，用氯仿萃取。用盐酸(1mol/L)、饱和碳酸氢钠水溶液、饱和食盐水洗涤有机层，用无水硫酸镁干燥后过滤，减压浓缩从而得到化合物IIIc-1。
实施例19
(9Z,12Z)-N-(2-((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基氧基)乙基)十八碳-9,12-二烯-1-胺(化合物B-8)
采用与实施例13同样的方法，使用参考例7中得到的化合物IId-1(0.798g、1.77mmol)，以及，代替1-溴十二烷而使用参考例8中得到的化合物IIIc-1(0.826g、2.13mmol)，得到化合物B-8(0.676g、收率68％)。
ESI-MS m/z:558(M+H)+；1H-NMR(CDCl3)δ:0.89(t,J＝6.9Hz,6H),1.27-1.38(m,32H),1.46-1.52(m,2H),1.54-1.60(m,3H),2.05(q,J＝7.0Hz,8H),2.61(t,J＝7.3Hz,2H),2.77(t,J＝5.5Hz,6H),3.42(t,J＝6.8Hz,2H),3.52(t,J＝5.4Hz,2H),5.30-5.41(m,8H).
实施例20
((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基)(2-((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基氧基)乙基)氨基甲酸3-(二甲基氨基)丙基酯(化合物A-12)
采用与实施例5同样的方法，代替化合物B-1使用实施例19中得到的化合物B-8(0.184g、0.330mmol)，得到化合物A-12(0.208g、收率92％)。
ESI-MS m/z:687(M+H)+；1H-NMR(CDCl3)δ:0.89(t,J＝6.9Hz,6H),1.25-1.38(m,32H),1.50-1.57(m,4H),1.77-1.83(m,2H),2.05(q,J＝7.0Hz,8H),2.22(s,6H),2.34(t,J＝7.4Hz,2H),2.77(t,J＝6.6Hz,4H),3.23-3.54(m,8H),4.11(t,J＝6.5Hz,2H),5.30-5.41(m,8H).
参考例9
N,N-双(2-((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基氧基)乙基)胺(化合物XI-4)
向氢化钠(油性、60％、1.69g、42.2mmol)中，一边搅拌一边缓慢添加N-苄基二乙醇胺(东京化成工业公司制、1.65g、8.44mmol)的甲苯(10mL)溶液，然后滴加甲磺酸(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基酯(Nu-Chek Prep,Inc公司制、6.69g、19.4mmol)的甲苯(10mL)溶液。在加热回流下搅拌得到的混合物4小时。冷却至室温后，用乙醇中止反应。向得到的混合物中加入饱和食盐水，用乙酸乙酯萃取2次。合并有机层，用无水硫酸镁干燥后，进行减压浓缩。将残渣用硅胶柱色谱法(氯仿/甲醇＝100/0～99/1)进行纯化，由此得到N-苄基-N,N-双(2-((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基氧基)乙基)胺(4.01g、收率69％)。
将N-苄基-N,N-双(2-((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基氧基)乙基)胺(4.01g、5.89mmol))溶解于1,2-二氯乙烷(29mL)中，加入氯甲酸1-氯乙基酯(东京化成工业公司制、1.90mL、17.4mmol)，于130℃搅拌1小时。向反应溶液中加入甲醇(29mL)，于130℃再搅拌1小时。冷却至室温后，向反应液中加入饱和碳酸氢钠水溶液，用氯仿萃取2次。合并有机层，用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸镁干燥后，进行减压浓缩。将残渣用氨基硅胶柱色谱法(正己烷/乙酸乙酯＝90/10～75/25)进行纯化，由此得到化合物XI-4(5.56g、收率92％)。
ESI-MS m/z:621(M+H)+；1H-NMR(CDCl3)δ:0.89(t,J＝7.0Hz,6H),1.27-1.30(m,33H),1.53-1.59(m,4H),2.05(q,J＝7.1Hz,8H),2.77(t,J＝6.8Hz,4H),2.80(t,J＝5.4Hz,4H),3.42(t,J＝6.8Hz,4H),3.53(t,J＝5.4Hz,4H),5.30-5.41(m,8H).
参考例10
双(2-((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基氧基)乙基)氨基甲酸3-(二甲基氨基)丙基酯
(化合物XI-5)
采用与实施例5同样的方法，代替化合物B-1使用参考例9中得到的化合物XI-4(1.20g、1.99mmol)，得到化合物XI-5(1.32g、收率91％)。
ESI-MS m/z:732(M+H)+；1H-NMR(CDCl3)δ:0.89(t,J＝7.0Hz,6H),1.27-1.30(m,30H),1.51-1.57(m,4H),1.77-1.83(m,4H),2.05(q,J＝7.0Hz,8H),2.23(s,6H),2.34(t,J＝7.5Hz,2H),2.77(t,J＝6.7Hz,4H),3.38-3.54(m,12H),4.12(t,J＝6.5Hz,2H),5.30-5.41(m,8H).
参考例11
3-(二((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基)氨基)丙酸乙酯(化合物XI-6)
将实施例1中得到的化合物B-1(0.788g、1.53mmol)溶解于乙醇(8mL)中，加入丙烯酸乙酯(东京化成工业公司制、1.67mL、15.3mmol)及乙醇钠(和光纯药工业公司制、0.0520g、0.767mmol)，在加热回流下搅拌3小时。对反应液进行减压浓缩后，将得到的残渣用硅胶柱色谱法(正己烷/乙酸乙酯＝85/15)进行纯化，由此得到化合物XI-6(0.699g、收率74％)。
ESI-MS m/z:615(M+H)+；1H-NMR(CDCl3)δ:0.89(t,J＝6.9Hz,6H),1.21-1.45(m,39H),2.02-2.08(m,8H),2.35-2.44(m,6H),2.75-2.80(m,6H),4.12(q,J＝7.0Hz,2H),5.30-5.42(m,8H).
实施例21
3-(二((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基)氨基)丙烷-1-醇(化合物C-1)
将参考例11中得到的化合物XI-6(0.199g、0.324mmol)溶解于四氢呋喃(2mL)中，在冰冷下加入氢化铝锂(纯正化学公司制、0.012g、0.324mmol)，搅拌3小时。向反应液中加入水(0.0600mL、3.33mmol)及氟化钠(Nacalai Tesque公司制、0.408g、9.72mmol)，于室温搅拌0.5小时。通过Celite过滤除去不溶物。对滤液进行浓缩后，用硅胶柱色谱法(氯仿/甲醇＝98/2)进行纯化，由此得到化合物C-1(0.181g、收率98％)。
ESI-MS m/z:573(M+H)+；1H-NMR(CDCl3)δ:0.89(t,J＝6.9Hz,6H),1.21-1.40(m,32H),1.42-1.51(m,4H),1.64-1.71(m,2H),2.02-2.08(m,8H),2.40(t,J＝7.3Hz,4H),2.64(t,J＝5.3Hz,2H),2.77(t,J＝6.7Hz,4H),3.79(t,J＝5.3Hz,2H),5.30-5.42(m,8H).
参考例12
3-(二((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基)氨基)丙烷-1,2-二醇(化合物XI-7)
将实施例1中得到的化合物B-1(0.228g、0.444mmol)溶解于二氯乙烷(2mL)中，加入甲醇(2mL)及2,3-二羟基丙醛(Nacalai Tesque公司制、0.400g、4.44mmol)，于室温搅拌0.5小时。向反应液中加入三乙酰氧基硼氢化钠(东京化成工业公司制、0.470g、2.22mmol)，于室温彻夜搅拌。向反应液中加入2,3-二羟基丙醛(0.400g、4.44mmol)，于室温搅拌3小时。向反应液中加入三乙酰氧基硼氢化钠(0.470g、2.22mmol)，于室温彻夜搅拌。向反应液中加入饱和碳酸氢钠水溶液，用氯仿萃取2次。合并有机层，用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸镁干燥后过滤，进行减压浓缩。将得到的残渣用氨基硅胶柱色谱法(正己烷/乙酸乙酯＝50/50)进行纯化，由此得到化合物XI-7(0.0449g、收率17％)。
ESI-MS m/z:589(M+H)+；1H-NMR(CDCl3)δ:0.89(t,J＝6.9Hz,6H),1.19-1.51(m,36H),2.02-2.08(m,8H),2.38-2.62(m,6H),2.77(t,J＝6.7Hz,4H),3.46-3.50(m,1H),3.69-3.77(m,2H),5.30-5.42(m,8H).
参考例13
3-((3R,4R)-3,4-双((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基氧基)吡咯烷-1-基)丙烷-1-醇(化合物XI-8)
化合物XI-8采用国际公开第2011/136368号小册子中记载的方法合成。
实施例22
二((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基)氨基甲酸4-(二甲基氨基)丁基酯(化合物A-13)
步骤1
向氯甲酸4-硝基苯基酯(0.867g、4.21mmol)的二氯甲烷(20mL)溶液中，加入4-(叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基-1-丁醇(SIGMA-ALDRICH公司制、1.0mL、4.21mmol)和三乙胺(0.881mL,6.32mmol)，于室温搅拌1小时。向反应液中加入饱和碳酸氢钠水溶液，用氯仿萃取2次。将有机层用无水硫酸镁干燥后过滤，进行减压浓缩。将得到的残渣用硅胶柱色谱法(正己烷/乙酸乙酯＝90/10)进行纯化，由此得到碳酸4-(叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)丁基4-硝基苯基酯(1.44g、收率92％)。
步骤2
采用与实施例10同样的方法，代替化合物VI-3使用步骤1中得到的碳酸4-(叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)丁基4-硝基苯基酯(0.640g、1.733mmol)，得到二((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基)氨基甲酸4-(叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)丁基酯的粗纯化物。将得到的二((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基)氨基甲酸4-(叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)丁基酯的粗纯化物溶解于四氢呋喃(10mL)中，加入四丁基氟化铵(东京化成工业公司制、约1mol/L四氢呋喃溶液、2.14mL、2.14mmol)，于室温搅拌1小时。向反应液中加入四正丁基氟化铵(约1mol/L四氢呋喃溶液、2.14mL、2.14mmol)，于室温搅拌2小时后，于50℃搅拌1小时。向反应液中加入饱和碳酸氢钠水溶液，用乙酸乙酯萃取2次。将有机层用无水硫酸镁干燥后过滤，进行减压浓缩。将得到的残渣用硅胶柱色谱法(氯仿/甲醇＝95/5)进行纯化，由此得到二((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基)氨基甲酸4-羟基丁基酯(0.652g、收率73％)。
步骤3
向步骤2中得到的二((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基)氨基甲酸4-羟基丁基酯(0.193g、0.306mmol)的二氯甲烷(2mL)溶液中，在冰冷下加入甲磺酰氯(纯正化学公司制、0.0360mL、0.460mmol)和三乙胺(0.0930mL、0.919mmol)，于0℃搅拌30分钟。向反应液中加入饱和碳酸氢钠水溶液，用氯仿萃取2次。将有机层用无水硫酸镁干燥后过滤，进行减压浓缩。将得到的残渣溶解于四氢呋喃(1mL)中，加入二甲基胺(Aldrich公司制、约2mol/L四氢呋喃溶液、1.53mL、3.06mmol)，使用微波反应装置于100℃搅拌1小时后，使用微波反应装置于130℃搅拌1小时。对反应液进行减压浓缩，将得到的残渣用氨基硅胶柱色谱法(正己烷/乙酸乙酯＝80/20)进行纯化，由此得到化合物A-13(0.159g、收率79％)。
ESI-MS m/z:658(M+H)+；1H-NMR(CDCl3)δ:0.90(q,J＝6.5Hz,6H),1.20-1.38(m,32H),1.45-1.56(m,6H),1.61-1.69(m,2H),2.01-2.08(m,8H),2.21(s,6H),2.28(t,J＝7.6Hz,2H),2.77(t,J＝6.6Hz,4H),3.12-3.23(m,4H),4.07(t,J＝6.6Hz,2H),5.29-5.42(m,8H).
参考例14
碳酸(1-甲基哌啶-4-基)甲基4-硝基苯基酯盐酸盐(化合物VI-6)
向氯甲酸4-硝基苯基酯(1.50g、7.28mmol)的四氢呋喃(32mL)溶液中加入1-甲基-4-哌啶甲醇(东京化成工业公司制、1.0mL、7.28mmol)，于室温搅拌2小时。滤取析出的晶体，由此得到化合物VI-6(1.55g、收率64％)。
ESI-MS m/z:295(M+H)+；1H-NMR(CDCl3)δ:1.93-2.19(m,4H),2.68-2.82(m,3H),3.51-3.62(m,5H),4.21(d,J＝6.0Hz,2H),7.38(d,J＝9.1Hz,2H),8.27(d,J＝9.1Hz,2H),12.44(br s,1H).
参考例15
碳酸(1-甲基哌啶-3-基)甲基4-硝基苯基酯盐酸盐(化合物VI-7)
采用与参考例14同样的方法，代替1-甲基-4-哌啶甲醇使用1-甲基-3-哌啶甲醇(东京化成工业公司制、1.0mL、7.21mmol)，得到化合物VI-7(2.32g、收率97％)。
ESI-MS m/z:295(M+H)+.
参考例16
碳酸(1-甲基哌啶-2-基)甲基4-硝基苯基酯盐酸盐(化合物VI-8)
采用与参考例14同样的方法，代替1-甲基-4-哌啶甲醇使用1-甲基-2-哌啶甲醇(东京化成工业公司制、1.0mL、7.43mmol)，得到化合物VI-8(2.37g、收率96％)。
1H-NMR(CDCl3)δ:1.51-1.63(m,1H),1.81-2.38(m,5H),2.85-2.99(m,4H),3.21-3.30(m,1H),3.49-3.60(m,1H),4.66(dd,J＝13.1,2.4Hz,1H),4.78-4.86(m,1H),7.47(d,J＝9.1Hz,2H),8.28(d,J＝＝9.1Hz,2H),12.40(br s,1H).
参考例17
碳酸3-(环己亚胺(azepane)-1-基)丙基4-硝基苯基酯盐酸盐(化合物VI-9)
采用与参考例14同样的方法，代替1-甲基-4-哌啶甲醇使用3-(环己亚胺-1-基)丙醇(CHEMBRIDGE公司制,0.700g,4.45mmol)，得到化合物VI-9(1.47g、收率92％)。
ESI-MS m/z:323(M+H)+；1H-NMR(CDCl3)δ:1.60-1.75(m,2H),1.79-1.94(m,5H),2.15-2.27(m,2H),2.44-2.53(m,2H),2.90-3.02(m,2H),3.14-3.24(m,2H),3.55-3.65(m,2H),4.41(t,J＝5.9Hz,2H),7.37-7.43(m,2H),8.25-8.32(m,2H),12.48(br s,1H).
参考例18
碳酸1-甲基哌啶-4-基4-硝基苯基酯盐酸盐
(化合物VI-10)
采用与参考例14同样的方法，代替1-甲基-4-哌啶甲醇使用1-甲基哌啶-4-醇(SIGMA-ALDRICH公司制,0.300g,2.60mmol)，得到化合物VI-10(0.740g、收率90％)。
ESI-MS m/z:281(M+H)+.
参考例19
碳酸1-甲基哌啶-3-基4-硝基苯基酯盐酸盐(化合物VI-11)
采用与参考例14同样的方法，代替1-甲基-4-哌啶甲醇使用1-甲基哌啶-3-醇(SIGMA-ALDRICH公司制,0.305g,2.65mmol)，得到化合物VI-11(0.410g、收率49％)。
ESI-MS m/z:281(M+H)+.
参考例20
碳酸(1-甲基吡咯烷-3-基)甲基4-硝基苯基酯盐酸盐(化合物VI-12)
采用与参考例14同样的方法，代替1-甲基-4-哌啶甲醇使用(1-甲基-3-吡咯烷基)甲醇(Matrix Scientific公司制、0.500g、7.43mmol)，得到化合物VI-12(0.943g、收率69％)。
ESI-MS m/z:281(M+H)+.
实施例23
二((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)氨基甲酸(1-甲基哌啶-4-基)甲基酯
(化合物A-14)
采用与实施例10同样的方法，代替化合物VI-3使用参考例14中得到的化合物VI-6(0.228g、0.689mmol)，得到化合物A-14(0.258g、收率84％)。
ESI-MS m/z:670(M+H)+；1H-NMR(CDCl3)δ:0.89(t,J＝6.9Hz,6H),1.22-1.39(m,32H),1.46-1.54(m,4H),1.56-1.66(m,3H),1.67-1.74(m,2H),1.88-1.95(m,2H),2.05(q,J＝6.9Hz,8H),2.26(s,3H),2.77(t,J＝6.8Hz,4H),2.85(d,J＝11.7Hz,2H),3.13-3.23(m,4H),3.92(d,J＝6.3Hz,2H),5.30-5.42(m,8H).
实施例24
二((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)氨基甲酸(1-甲基哌啶-3-基)甲基酯
(化合物A-15)
采用与实施例10同样的方法，代替化合物VI-3使用参考例15中得到的化合物VI-7(0.238g、0.719mmol)，得到化合物A-15(0.239g、收率74％)。
ESI-MS m/z:670(M+H)+；1H-NMR(CDCl3)δ:0.89(t,J＝6.9Hz,6H),0.92-1.02(m,1H),1.22-1.39(m,32H),1.46-1.54(m,4H),1.55-1.65(m,1H),1.66-1.74(m,3H),1.82-1.89(m,1H),1.91-2.00(m,1H),2.05(q,J＝7.0Hz,8H),2.26(s,3H),2.74-2.80(m,5H),2.84-2.89(m,1H),3.12-3.23(m,4H),3.87(dd,J＝10.7,7.6Hz,1H),3.97(dd,J＝10.7,5.4Hz,1H),5.30-5.41(m,8H).
实施例25
二((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)氨基甲酸(1-甲基哌啶-2-基)甲基酯
(化合物A-16)
采用与实施例10同样的方法，代替化合物VI-3使用参考例16中得到的化合物VI-8(0.256g、0.774mmol)，得到化合物A-16(0.313g、收率91％)。
ESI-MS m/z:670(M+H)+；1H-NMR(CDCl3)δ:0.89(t,J＝6.9Hz,6H),1.22-1.39(m,32H),1.46-1.64(m,8H),1.71-1.76(m,2H),2.02-2.12(m,10H),2.32(s,3H),2.77(t,J＝6.8Hz,4H),2.79-2.84(m,1H),3.11-3.24(m,4H),4.05(dd,J＝11.1,4.9Hz,1H),4.17(dd,J＝11.1,4.9Hz,1H),5.30-5.42(m,8H).
实施例26
二((Z)-十八碳-9-烯基)氨基甲酸2-(1-甲基吡咯烷-2-基)乙基酯(化合物A-17)
采用与实施例10同样的方法，代替化合物B-1使用实施例2中得到的化合物B-2(0.300g、0.579mmol)，得到化合物A-17(0.360g、收率92％)。
ESI-MS m/z:674(M+H)+；1H-NMR(CDCl3)δ:0.88(t,J＝6.9Hz,6H),1.21-1.38(m,44H),1.45-1.85(m,8H),1.93-2.18(m,12H),2.32(s,3H),3.03-3.26(m,5H),4.05-4.18(m,2H),5.30-5.39(m,4H).
实施例27
二((Z)-十八碳-9-烯基)氨基甲酸(1-甲基哌啶-3-基)甲基酯(化合物A-18)
采用与实施例10同样的方法，代替化合物B-1而使用实施例2中得到的化合物B-2(0.300g、0.579mmol)，以及，代替化合物VI-3而使用参考例15中得到的化合物VI-7(0.287g、0.896mmol)，得到化合物A-18(0.390g、收率100％)。
ESI-MS m/z:674(M+H)+；1H-NMR(CDCl3)δ:0.85-1.04(m,7H),1.20-1.38(m,44H),1.46-1.74(m,8H),1.82-2.06(m,10H),2.26(s,3H),2.74-2.82(m,1H),2.83-2.89(m,1H),3.10-3.25(m,4H),3.87(dd,J＝10.5,7.3Hz,1H),3.98(dd,J＝10.5,5.3Hz,1H),5.30-5.39(m,4H).
实施例28
二((11Z,14Z)-二十碳-11,14-二烯基)氨基甲酸2-(1-甲基吡咯烷-2-基)乙基酯(化合物A-19)
采用与实施例10同样的方法，代替化合物B-1使用实施例4中得到的化合物B-4(0.300g、0.526mmol)，得到化合物A-19(0.369g、收率97％)。
ESI-MS m/z:726(M+H)+；1H-NMR(CDCl3)δ:0.89(t,J＝6.9Hz,6H),1.21-1.40(m,40H),1.44-1.85(m,8H),1.93-2.18(m,12H),2.32(s,3H),2.77(t,J＝6.4Hz,4H),3.04-3.27(m,5H),4.05-4.18(m,2H),5.29-5.42(m,8H).
实施例29
二((11Z,14Z)-二十碳-11,14-二烯基)氨基甲酸(1-甲基哌啶-3-基)甲基酯(化合物A-20)
采用与实施例10同样的方法，代替化合物B-1而使用实施例4中得到的化合物B-4(0.300g、0.526mmol)，以及，代替化合物VI-3而使用参考例15中得到的化合物VI-7(0.261g、0.789mmol)，得到化合物A-20(0.374g、收率98％)。
ESI-MS m/z:726(M+H)+；1H-NMR(CDCl3)δ:0.85-1.04(m,7H),1.21-1.40(m,40H),1.45-1.75(m,8H),1.82-2.09(m,10H),2.26(s,3H),2.74-2.90(m,6H),3.11-3.24(m,4H),3.87(dd,J＝10.5,7.5Hz,1H),3.98(dd,J＝10.5,5.5Hz,1H),5.29-5.43(m,8H).
实施例30
二((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)氨基甲酸(1-甲基吡咯烷-2-基)甲基酯(化合物A-21)
将实施例1中得到的化合物B-1(0.0831g、0.162mmol)溶解于二氯乙烷(1mL)中，加入1,1’-羰基二咪唑(Nacalai Tesque公司制、0.0394g、0.243mmol)，于室温彻夜搅拌。向反应液中加入碘甲烷(东京化成工业公司制、0.101mL、1.62mmol)，于60℃彻夜搅拌。对反应液进行减压浓缩。将得到的残渣溶解于四氢呋喃(1mL)中，加入1-甲基吡咯烷-2-甲醇(和光纯药工业公司制、0.0372g、0.323mmol)和三乙胺(0.0563mL、0.404mmol)，于室温彻夜搅拌后，于60℃搅拌反应液3小时。向反应液中加入饱和碳酸氢钠水溶液，用正己烷萃取2次。将有机层用无水硫酸镁干燥后过滤，进行减压浓缩。将得到的残渣用氨基硅胶柱色谱法(正己烷/乙酸乙酯＝90/10)进行纯化，由此得到化合物A-21(0.0318g、收率30％)。
ESI-MS m/z:656(M+H)+；1H-NMR(CDCl3)δ:0.89(t,J＝6.9Hz,6H),1.24-1.39(m,32H),1.46-1.67(m,5H),1.67-1.85(m,2H),1.89-2.00(m,1H),2.05(q,J＝7.0Hz,8H),2.21-2.30(m,1H),2.42(s,3H),2.43-2.51(m,1H),2.77(t,J＝6.6Hz,4H),3.03-3.08(m,1H),3.11-3.25(m,4H),4.00(dd,J＝10.5,6.0Hz,1H),4.08(dd,J＝10.5,5.5Hz,1H),5.29-5.42(m,8H).
实施例31
二(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基氨基甲酸(1-甲基吡咯烷-3-基)甲基酯
(化合物A-22)
采用与实施例10同样的方法，代替化合物VI-3使用参考例20中得到的化合物VI-12(0.277g、0.876mmol)，得到化合物A-22(0.263g、收率66％)。
ESI-MS m/z:656(M+H)+；1H-NMR(CDCl3)δ:0.89(t,J＝6.9Hz,6H),1.20-1.40(m,32H),1.44-1.78(m,5H),1.92-2.09(m,9H),2.24(dd,J＝9.4,6.2Hz,1H),2.34(s,3H),2.39-2.63(m,3H),2.68-2.80(m,5H),3.10-3.25(m,4H),3.95(dd,J＝10.5,7.8Hz,1H),4.03(dd,J＝10.5,6.4Hz,1H),5.28-5.42(m,8H).
实施例32
二(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基氨基甲酸2-(1-甲基哌啶-2-基)乙基酯(化合物A-23)
步骤1
向氯甲酸4-硝基苯基酯(0.844g、7.19mmol)的四氢呋喃(12mL)溶液中加入2-(1-甲基哌啶-2-基)乙醇(Matrix Scientific公司制、0.500g、3.49mmol)，于室温彻夜搅拌。对反应液进行减压浓缩，得到碳酸2-(1-甲基哌啶-2-基)乙基4-硝基苯基酯盐酸盐的粗纯化物。
步骤2
采用与实施例10同样的方法，代替化合物VI-3使用步骤1中得到的碳酸2-(1-甲基哌啶-2-基)乙基4-硝基苯基酯盐酸盐的粗纯化物(0.302g、0.876mmol)，得到化合物A-23(0.299g、收率75％)。
ESI-MS m/z:684(M+H)+；1H-NMR(CDCl3)δ:0.89(t,J＝6.9Hz,6H),1.19-1.40(m,32H),1.45-1.75(m,11H),1.93-2.11(m,11H),2.27(s,3H),2.74-2.86(m,5H),3.10-3.24(m,4H),4.06-4.19(m,2H),5.29-5.42(m,8H).
实施例33
二((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)氨基甲酸3-(环己亚胺-1-基)丙基酯
(化合物A-24)
采用与实施例10同样的方法，代替化合物VI-3使用参考例17中得到的化合物VI-9，得到化合物A-24(0.136g、收率67％)。
ESI-MS m/z:698(M+H)+；1H-NMR(CDCl3)δ:0.86-0.94(m,6H),1.22-1.41(m,36H),1.45-1.67(m,8H),1.75-1.85(m,2H),2.00-2.11(m,8H),2.55(t,J＝7.5Hz,2H),2.62(t,J＝5.1Hz,4H),2.77(t,J＝5.9Hz,4H),3.13-3.23(m,4H),4.10(t,J＝6.4Hz,2H),5.28-5.45(m,8H).
实施例34
((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基)(2-((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基氧基)乙基)氨基甲酸3-(哌啶-1-基)丙基酯(化合物A-29)
采用与实施例10同样的方法，代替化合物B-1而使用实施例19中得到的化合物B-8(0.150g、0.269mmol)，以及，代替化合物VI-3而使用参考例5中得到的化合物VI-4(0.201g、0.672mmol)，得到化合物A-29(0.170g、收率87％)。
ESI-MS m/z:728(M+H)+；1H-NMR(CDCl3)δ:0.89(t,J＝6.8Hz,6H),1.22-1.40(m,32H),1.40-1.63(m,14H),1.78-1.87(m,2H),2.05(q,J＝6.6Hz,8H),2.33-2.41(m,6H),2.77(t,J＝6.0Hz,4H),3.20-3.31(m,2H),3.40(t,J＝6.6Hz,4H),3.46-3.57(m,2H),4.10(t,J＝6.4Hz,2H),5.27-5.45(m,8H).
实施例35
((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基)(2-((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基氧基)乙基)氨基甲酸2-(1-甲基吡咯烷-2-基)乙基酯(化合物A-30)
采用与实施例10同样的方法，代替化合物B-1使用实施例19中得到的化合物B-8(0.120g、0.215mmol)，得到化合物A-30(0.140g、收率91％)。
ESI-MS m/z:714(M+H)+；1H-NMR(CDCl3)δ:0.89(t,J＝6.8Hz,6H),1.21-1.40(m,32H),1.45-1.59(m,6H),1.64-1.82(m,2H),1.93-2.17(m,12H),2.31(s,3H),2.70-2.81(m,4H),3.06(t,J＝7.8Hz,1H),3.20-3.31(m,2H),3.40(t,J＝5.9Hz,4H),3.46-3.58(m,2H),4.06-4.17(m,2H),5.28-5.44(m,8H).
实施例36
((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基)(2-((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基氧基)乙基)氨基甲酸3-(环己亚胺-1-基)丙基酯
(化合物A-31)
采用与实施例10同样的方法，代替化合物B-1而使用实施例19中得到的化合物B-8(0.150g、0.269mmol)，以及，代替化合物VI-3而使用参考例17中得到的化合物VI-9(0.145g、0.403mmol)，得到化合物A-31(0.170g、收率85％)。
ESI-MS m/z:742(M+H)+；1H-NMR(CDCl3)δ:0.89(t,J＝6.8Hz,6H),1.21-1.39(m,32H),1.48-1.65(m,12H),1.72-1.85(m,2H),2.05(q,J＝6.6Hz,8H),2.55(t,J＝7.5Hz,2H),2.61(t,J＝5.3Hz,4H),2.77(t,J＝5.9Hz,4H),3.21-3.30(m,2H),3.40(t,J＝6.8Hz,4H),3.46-3.55(m,2H),4.10(t,J＝6.4Hz,2H),5.26-5.42(m,8H).
实施例37
((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基)(2-((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基氧基)乙基)氨基甲酸(1-甲基哌啶-3-基)甲基酯(化合物A-32)
采用与实施例10同样的方法，代替化合物B-1而使用实施例19中得到的化合物B-8(0.150g、0.269mmol)，以及，代替化合物VI-3而使用参考例15中得到的化合物VI-7(0.133g、0.403mmol)，得到化合物A-32(0.145g、收率76％)。
ESI-MS m/z:714(M+H)+；1H-NMR(CDCl3)δ:0.91(t,J＝6.8Hz,6H),1.23-1.45(m,32H),1.49-1.77(m,9H),1.83-2.03(m,2H),2.07(q,J＝6.6Hz,8H),2.28(s,3H),2.76-2.91(m,2H),2.80(t,J＝5.9Hz,4H),3.21-3.33(m,2H),3.43(t,J＝6.4Hz,4H),3.48-3.58(m,2H),3.85-4.05(m,2H),5.30-5.47(m,8H).
参考例21
甲磺酸2-((Z)-十八碳-9-烯基氧基)乙基酯(化合物IIIc-2)
采用与实施例8同样的方法，代替甲磺酸(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基酯使用甲磺酸(Z)-十八碳-9-烯-1-基酯(2.00g、5.77mmol)，得到化合物IIIc-2(1.29g、收率57％)。
ESI-MS m/z:391(M+H)+；1H-NMR(CDCl3)δ:0.89(t,J＝6.6Hz,3H),1.22-1.38(m,22H),1.50-1.62(m,2H),1.97-2.05(m,4H),3.06(s,3H),3.48(t,J＝6.8Hz,2H),3.67-3.72(m,2H),4.36-4.39(m,2H),5.35(t,J＝5.5Hz,2H).
参考例22
甲磺酸2-((Z)-十六碳-9-烯基氧基)乙基酯(化合物IIIc-3)
采用与实施例8同样的方法，代替甲磺酸(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基酯使用甲磺酸(Z)-十六碳-9-烯-1-基酯(2.00g、6.28mmol)，得到化合物IIIc-3(1.52g、收率67％)。
ESI-MS m/z:363(M+H)+；1H-NMR(CDCl3)δ:0.90(t,J＝6.6Hz,3H),1.25-1.38(m,18H),1.53-1.62(m,2H),1.98-2.06(m,4H),3.07(s,3H),3.49(t,J＝6.6Hz,2H),3.68-3.72(m,2H),4.36-4.40(m,2H),5.36(t,J＝5.5Hz,2H).
实施例38
(9Z,12Z)-N-(2-((Z)-十八碳-9-烯基氧基)乙基)十八碳-9,12-二烯-1-胺(化合物B-9)
采用与实施例13同样的方法，使用参考例7中得到的化合物IId-1(0.800g、1.78mmol)，以及，代替1-溴十二烷而使用参考例21中得到的化合物IIIc-2(0.728g、1.86mmol)，得到化合物B-9(0.600g、收率60％)。
ESI-MS m/z:560(M+H)+；1H-NMR(CDCl3)δ:0.86-0.94(m,6H),1.24-1.39(m,40),1.51-1.62(m,2H),1.96-2.10(m,8H),2.68(t,
J＝7.3Hz,2H),2.78(t,J＝6.0Hz,2H),2.85(t,J＝5.1Hz,2H),3.45(t,J＝6.8Hz,2H),3.57(t,J＝5.1Hz,2H),5.30-5.44(m,6H).
实施例39
(9Z,12Z)-N-(2-((Z)-十六碳-9-烯基氧基)乙基)十八碳-9,12-二烯-1-胺(化合物B-10)
采用与实施例13同样的方法，使用参考例7中得到的化合物IId-1(0.610g、1.35mmol)，以及，代替1-溴十二烷而使用参考例22中得到的化合物IIIc-3(0.589g、1.62mmol)，得到化合物B-10(0.550g、收率76％)。
ESI-MS m/z:532(M+H)+；1H-NMR(CDCl3)δ:0.85-0.93(m,6H),1.23-1.38(m,34H),1.45-1.54(m,4H),1.94-2.11(m,8H),2.60(t,J＝7.3Hz,2H),2.77(t,J＝5.4Hz,4H),3.43(t,J＝6.8Hz,2H),3.53(t,J＝5.4Hz,2H),5.29-5.44(m,6H).
实施例40
(2-((Z)-十八碳-9-烯基氧基)乙基)((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基)氨基甲酸3-(哌啶-1-基)丙基酯(化合物A-33)
采用与实施例10同样的方法，代替化合物B-1而使用实施例38中得到的化合物B-9(0.130g、0.232mmol)，以及，代替化合物VI-3而使用参考例5中得到的化合物VI-4(0.120g、0.348mmol)，得到化合物A-33(0.137g、收率81％)。
ESI-MS m/z:729(M+H)+；1H-NMR(CDCl3)δ:0.84-0.92(m,6H),1.20-1.36(m,38H),1.40-1.62(m,10H),1.77-1.87(m,2H),1.96-2.09(m,8H),2.37(t,J＝7.5Hz,6H),2.77(t,J＝5.9Hz,2H),3.20-3.31(m,2H),3.40(t,J＝6.6Hz,4H),3.45-3.56(m,2H),4.10(t,J＝6.4Hz,2H),5.28-5.44(m,6H).
实施例41
(2-((Z)-十八碳-9-烯基氧基)乙基)((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基)氨基甲酸2-(1-甲基吡咯烷-2-基)乙基酯(化合物A-34)
采用与实施例10同样的方法，代替化合物B-1使用实施例38中得到的化合物B-9(0.130g、0.232mmol)，得到化合物A-34(0.131g、收率79％)。
ESI-MS m/z:716(M+H)+；1H-NMR(CDCl3)δ:0.85-0.92(m,6H),1.20-1.39(38H,m),1.47-1.61(m,8H),1.66-1.83(m,2H),1.93-2.18(10H,m),2.32(s,3H),2.78(t,J＝5.9Hz,2H),3.07(t,J＝8.4Hz,1H),3.21-3.31(m,2H),3.41(t,J＝6.6Hz,4H),3.47-3.56(m,2H),4.08-4.19(m,2H),5.29-5.43(m,6H).
实施例42
(2-((Z)-十八碳-9-烯基氧基)乙基)((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基)氨基甲酸3-(二甲基氨基)丙基酯(化合物A-35)
采用与实施例10同样的方法，代替化合物B-1而使用实施例38中得到的化合物B-9(0.130g、0.232mmol)，以及，代替化合物VI-3而使用化合物VI-1(0.106g、0.348mmol)，得到化合物A-35(0.100g、收率63％)。
ESI-MS m/z:690(M+H)+；1H-NMR(CDCl3)δ:0.85-0.92(m,6H),1.20-1.39(m,38H),1.45-1.59(m,4H),1.74-1.84(m,2H),1.96-2.09(m,8H),2.23(s,6H),2.34(t,J＝7.5Hz,2H),2.77(t,J＝5.7Hz,2H),3.21-3.30(m,2H),3.35-3.44(m,4H),3.45-3.55(m,2H),4.11(t,J＝6.4Hz,2H),5.26-5.44(m,6H).
实施例43
(2-((Z)-十六碳-9-烯基氧基)乙基)((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基)氨基甲酸3-(二甲基氨基)丙基酯(化合物A-36)
采用与实施例10同样的方法，代替化合物B-1而使用实施例39中得到的化合物B-10(0.150g、0.282mmol)，以及，代替化合物VI-3而使用化合物VI-1(0.095g,0.310mmol)，得到化合物A-36(0.148g、收率79％)。
ESI-MS m/z:662(M+H)+；1H-NMR(CDCl3)δ:0.85-0.94(m,6H),1.21-1.39(m,34H),1.47-1.59(m,4H),1.76-1.84(m,2H),1.94-2.09(m,8H),2.23(s,6H),2.34(t,J＝7.3Hz,2H),2.77(t,J＝6.3Hz,2H),3.20-3.31(m,2H),3.31-3.45(m,4H),3.45-3.57(m,2H),4.11(t,J＝6.3Hz,2H),5.27-5.46(m,6H).
实施例44
(2-((Z)-十六碳-9-烯基氧基)乙基)((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基)氨基甲酸3-(哌啶-1-基)丙基酯(化合物A-37)
采用与实施例10同样的方法，代替化合物B-1而使用实施例39中得到的化合物B-10(0.150g、0.282mmol)，以及，代替化合物VI-3而使用参考例5中得到的化合物VI-4(0.107g、0.310mmol)，得到化合物A-37(0.148g、收率75％)。
ESI-MS m/z:702(M+H)+；1H-NMR(CDCl3)δ:0.82-0.96(m,6H),1.23-1.39(m,34H),1.39-1.48(m,2H),1.49-1.61(m,8H),1.79-1.86(m,2H),1.95-2.09(m,8H),2.33-2.42(m,6H),2.78(t,J＝6.8Hz,2H),3.21-3.32(m,2H),3.34-3.44(m,4H),3.46-3.56(m,2H),4.10(t,J＝6.3Hz,2H),5.29-5.44(m,6H).
实施例45
3-(二((Z)-十八碳-9-烯基)氨基)丙烷-1-醇(化合物C-2)
步骤1
采用与参考例11同样的方法，代替化合物B-1使用实施例2中得到的化合物B-2(500mg、0.965mmol)，得到3-(二((Z)-十八碳-9-烯基)氨基)丙酸乙酯(548mg、收率92％)。
步骤2
采用与实施例21同样的方法，代替化合物XI-6使用3-(二((Z)-十八碳-9-烯基)氨基)丙酸乙酯(548mg、0.887mmol)，得到化合物C-2(0.445g,收率87％)。
ESI-MS m/z:577(M+H)+；1H-NMR(CDCl3)δ:0.88(t,J＝6.9Hz,6H),1.24-1.42(m,44H),1.42-1.50(m,4H),1.65-1.70(m,2H),2.01(q,J＝6.4Hz,8H),2.40(t,J＝7.5Hz,4H),2.63(t,J＝5.5Hz,2H),3.79(t,J＝5.3Hz,2H),5.30-5.39(m,4H).
实施例46
3-(二((11Z,14Z)-二十碳-11,14-二烯基)氨基)丙烷-1-醇(化合物C-3)
步骤1
采用与参考例11同样的方法，代替化合物B-1使用实施例4中得到的化合物B-4(400mg、0.702mmol)，得到3-(二((11Z,14Z)-二十碳-11,14-二烯基)氨基)丙酸乙酯(548mg、收率90％)。
步骤2
采用与实施例21同样的方法，代替化合物XI-6使用3-(二((11Z,14Z)-二十碳-11,14-二烯基)氨基)丙酸乙酯(424mg、0.633mmol)，得到化合物C-3(352mg,收率88％)。
ESI-MS m/z:629(M+H)+；1H-NMR(CDCl3)δ:0.89(t,J＝6.9Hz,6H),1.24-1.40(m,40H),1.42-1.50(m,4H),1.64-1.70(m,2H),2.02-2.08(m,8H),2.40(t,J＝7.5Hz,4H),2.63(t,J＝5.3Hz,2H),2.78(t,J＝6.4Hz,4H),3.79(t,J＝5.0Hz,2H),5.29-5.42(m,8H).
实施例47
2-(二((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基)氨基)乙醇(化合物C-4)
步骤1
向实施例1中得到的化合物B-1(600mg,1.17mmol)的1,2-二氯乙烷(2.0mL)溶液中加入碳酸钾(243mg,1.76mmol)及溴乙酸乙酯(195μL,1.76mmol)，于85℃彻夜搅拌。向得到的混合物中加入水，用庚烷萃取2次。合并有机层，用水洗涤，用无水硫酸钠干燥，进行过滤，进行减压浓缩。将残渣用氨基硅胶柱色谱法(庚烷/乙酸乙酯＝100/0～95/5)进行纯化，由此得到2-(二((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基)氨基)乙酸乙酯(527mg,收率75％)。
步骤2
采用与实施例21同样的方法，代替化合物XI-6使用2-(二((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基)氨基)乙酸乙酯(527mg、0.878mmol)，得到化合物C-4(433mg,收率88％)。
ESI-MS m/z:559(M+H)+；1H-NMR(CDCl3)δ:0.89(t,J＝6.9Hz,6H),1.24-1.39(m,32H),1.39-1.46(m,4H),2.02-2.08(m,8H),2.43(t,J＝7.5Hz,4H),2.57(t,J＝5.3Hz,2H),2.77(t,J＝6.2Hz,4H),3.52(t,J＝5.5Hz,2H),5.29-5.41(m,8H).
实施例48
4-(二((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基)氨基)丁烷-1-醇(化合物C-5)
步骤1
向实施例1中得到的化合物B-1(500mg,0.973mmol)的1,2-二氯乙烷(2.0mL)溶液中，加入碳酸钾(202mg,1.46mmol)及叔丁基(4-碘丁氧基)二甲基硅烷(SIGMA-ALDRICH公司制,378μL,1.46mmol)，于85℃搅拌4小时。向得到的混合物中加入水，用庚烷萃取2次。合并有机层，用水洗涤，用无水硫酸钠干燥，进行过滤，进行减压浓缩。将残渣用硅胶柱色谱法(庚烷/乙酸乙酯＝95/5～80/20)进行纯化，由此得到(4-(叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)丁基)二((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基)胺(233mg,收率34％)。
步骤2
向(4-(叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)丁基)二((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基)胺(233mg,0.333mmol)的四氢呋喃(5mL)溶液中，加入四丁基氟化铵(1mol/L四氢呋喃溶液,0.666mL,0.666mmol)，于室温彻夜搅拌。向得到的混合物中加入饱和食盐水，用乙酸乙酯萃取。用无水硫酸钠干燥有机层，进行过滤，进行减压浓缩。将残渣用氨基硅胶柱色谱法(庚烷/乙酸乙酯＝90/10)进行纯化，进而用硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/甲醇＝100/0～90/10)进行纯化，由此得到化合物C-5(160mg,收率82％)。
ESI-MS m/z:587(M+H)+；1H-NMR(CDCl3)δ:0.89(t,J＝6.9Hz,6H),1.23-1.40(m,32H),1.43-1.51(m,4H),1.62-1.68(m,4H),2.05(q,J＝7.0Hz,8H),2.41-2.45(m,6H),2.77(t,J＝6.6Hz,4H),3.53-3.56(m,2H),5.29-5.42(m,8H).
参考例23
2,3-双((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基氧基)丙基(甲基)氨基甲酸3-(二甲基氨基)丙基酯(化合物XI-9)
步骤1
向采用国际公开第2009/129395号小册子中记载的方法合成的2,3-双((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基氧基)丙烷-1-醇(0.303g,0.514mmol)的二氯甲烷(4ml)溶液中，于0℃加入三乙胺(0.108ml,0.772mmol)和甲磺酰氯(0.060ml,0.772mmol)，于室温搅拌3小时。向反应液中加入饱和碳酸氢钠水溶液，用乙酸乙酯萃取，用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸镁干燥后过滤，进行减压浓缩。
将得到的残渣溶解于二氯甲烷(4mL)中，加入甲胺(7mol/L甲醇溶液,2.20mL)，使用微波反应装置于110℃搅拌5分钟。向反应液中加入水，用正己烷萃取，用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸镁干燥后过滤，进行减压浓缩。将得到的残渣用氨基硅胶柱色谱法(正己烷/乙酸乙酯＝95/5～70/30)进行纯化，得到N-甲基-2,3-双((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基)丙碳-1-胺(0.278g,收率90％)。
ESI-MS m/z:603(M+H)+；1H-NMR(CDCl3)δ:0.89(t,J＝7.1Hz,6H),1.27-1.39(m,34H),1.51-1.58(m,3H),2.05(q,J＝7.1Hz,8H),2.44(s,3H),2.64-2.70(m,2H),2.77(t,J＝6.9Hz,4H),3.41-3.50(m,5H),3.54-3.58(m,1H),3.61-3.65(m,1H),5.30-5.41(m,8H).
步骤2
向N-甲基-2,3-双((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基)丙烷-1-胺(0.220g,0.365mmol)的乙腈(2mL)悬浮液中，加入化合物VI-1(0.167g,0.548mmol)和三乙胺(0.255mL,1.827mmol)，于80℃彻夜搅拌。用饱和碳酸氢钠水溶液稀释反应液，用乙酸乙酯萃取。用饱和食盐水洗涤有机层，用无水硫酸镁干燥后过滤，进行减压浓缩。将残渣用氨基硅胶柱色谱法(正己烷/乙酸乙酯＝80/20～65/35)进行纯化，得到化合物XI-9(0.178g,收率67％)。
ESI-MS m/z:732(M+H)+；1H-NMR(CDCl3)δ:0.89(t,J＝6.9Hz,6H),1.26-1.38(m,32H),1.51-1.59(m,4H),1.77-1.83(m,2H),2.05(q,J＝7.0Hz,8H),2.22(s,6H),2.34(t,J＝7.4Hz,2H),2.77(t,J＝6.8Hz,4H),2.97(s,3H),3.19-3.25(m,1H),3.38-3.65(m,8H),4.12(t,J＝6.3Hz,2H),5.30-5.41(m,8H).
实施例49
使用实施例5～9中得到的化合物(化合物A-1～5)，如下所述制备组合物。所使用的核酸是含有有义链[5’-rGmUrCrAmUrCrArCrArCmUrGrArAmUrArCrCrArAmU-3’(带有r及m的碱基上所键合的糖分别为核糖及2’位的羟基被-O-甲基取代的核糖)]、和反义链[5’-rArUrUrGrGrUrArUrUrCrArGrUrGrUrGrArUrGrArCrArC-3’(碱基上所键合的糖均为核糖，将5’末端磷酸化)]的、抑制载脂蛋白B(Apolipoprotein-B，以下表示为apo-b)基因表达的抗APO-B siRNA，从Gene Design公司获得(以下称为apo-b siRNA)。
称量各试样使其溶解在90vol％乙醇中，使得化合物A-1～5中的各化合物/1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(甲氧基(聚乙二醇)-2000)钠盐(PEG-DMPE Na、N-(羰基甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺＝钠盐、日油公司制)/二硬脂酰卵磷脂(DSPC、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱、日油公司制)/胆固醇(日油公司制)＝8.947/1.078/5.707/13.698mmol/L，制备脂质膜的构成成分的溶液。另一方面，将apo-b siRNA/蒸馏水(24mg/mL)用Tris-EDTA缓冲液(200mM Tris-HCl、20mM EDTA、Invitrogen制)及20mM柠檬酸缓冲液(pH5.0)稀释，制备1.5mg/mL的apo-b siRNA水溶液(2mM Tris-EDTA缓冲液、20mM柠檬酸缓冲液、pH5.0)。
将得到的脂质溶液加热至37℃后，取500μL移至用于制备制剂的容器中，在搅拌下加入500μL得到的apo-b siRNA水溶液。在搅拌下，向1000μL得到的脂质核酸混合悬浮液中，加入1000μL的20mM柠檬酸缓冲液(含有300mM NaCl，pH6.0)，进而滴加3310μL的DPBS(Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline、Dulbecco磷酸缓冲生理盐水、Invitrogen制)，得到粗制剂。对于得到的粗制剂，使用Amicon Ultra(Millipore公司制)进行浓缩后，用DPBS稀释，在净化工作台(clean bench)内用0.2μm的过滤器(东洋滤纸公司制)进行过滤。对得到的组合物的siRNA浓度进行测定，用DPBS进行稀释，使得以siRNA浓度计为0.3或0.03mg/mL，由此得到制剂(包含化合物A-1～5中的各化合物、及核酸的组合物)。
使用粒径测定装置(Zetasizer Nano ZS、Malvern公司制、下同)对制剂(组合物)的平均粒径进行了测定。结果示于表8。
[表8]
化合物编号 A-1 A-2 A-3 A-4 A-5
得到的制剂的粒径(nm) 151.8 135.8 150.0 159.0 137.0
比较例1
将化合物1变更为采用以专利文献1中记载的方法为基准的方法合成的DLin-KC2-DMA及参考例1～3中得到的化合物(化合物XI-1～3)，除此以外，与实施例49同样地操作，得到制剂。
比较例中使用的化合物(DLin-KC2-DMA及化合物XI-1～3)的结构式示于表9。
使用粒径测定装置对制剂(组合物)的平均粒径进行了测定。结果示于表10。
[表9]
[表10]
试验例1
将实施例49中得到的各制剂(包含化合物A-1,3～5中的各化合物、及核酸的组合物)及比较例1中得到的各制剂(包含DLin-KC2-DMA及化合物XI-1～3中的各化合物、以及核酸的组合物)，分别通过以下方法导入来自人肝癌的细胞株HepG2细胞(HB-8065)中。
用Opti-MEM(GIBCO公司、31985)稀释各制剂使核酸的最终浓度为3-100nM，将稀释后的各制剂按照每孔20μL注入96孔的培养板中后，接种悬浮于含有1.25％胎牛血清(FBS、SAFC Biosciences公司、12203C)的Opti-MEM中的HepG2细胞，使细胞数为6250个/80μL/孔，在37℃、5％CO2的条件下进行培养，由此将各制剂导入HepG2细胞内。此外，作为阴性对照组，接种未作任何处理的细胞。
将导入了各制剂的细胞在37℃的5％CO2培养箱内培养24小时，用冰冷过的磷酸缓冲化生理盐水(PBS、GIBCO公司、14190)洗涤，使用Cells-to-Ct Kit(Applied Bioscience(ABI)公司、AM1728)，按照制品中附带的说明书中记载的方法，回收总RNA，并以得到的总RNA作为模板通过逆转录反应制作cDNA。
以得到的cDNA作为模板，以通用探针库(Universal Probe Library、RocheApplied Science公司、04683633001)作为探针，使用ABI7900HT Fast(ABI公司制)，按照附带的使用说明书中记载的方法进行PCR反应，由此使apo-b基因及作为组成型表达基因的甘油醛3-磷酸脱氢酶(D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，以下表示为gapdh)基因进行PCR反应，分别测定mRNA扩增量，以gapdh的mRNA扩增量作为内部对照，算出apo-b的mRNA的准定量值。将以相同方式测得的阴性对照组中的apo-b的mRNA的准定量值设为1，由apo-b的mRNA的准定量值求出apo-b的mRNA的表达率。得到的apo-b的mRNA的表达率的结果示于图1。
由图1可知，将实施例49中得到的制剂(包含化合物A-1,3～5中的各化合物、及核酸的组合物)以及比较例1中得到的各制剂中的包含DLin-KC2-DMA、化合物XI-1及化合物XI-3中的各化合物、以及核酸的组合物导入来自人肝癌的细胞株HepG2细胞内后，抑制了apo-b基因的mRNA的表达。另一方面，将比较例1中得到的各制剂中的包含化合物XI-2及核酸的组合物导入来自人肝癌的细胞株HepG2细胞内后，没有抑制apo-b基因的mRNA的表达。
试验例2
对于实施例49中得到的各制剂(包含化合物A-1～5中的各化合物、及核酸的组合物)及比较例1中得到的各制剂(包含DLin-KC2-DMA及化合物XI-1～3中的各化合物、以及核酸的组合物)，分别通过以下方法实施了体内药效评价试验。需要说明的是，对于各制剂，与试验相应地用DPBS稀释后进行使用。
对小鼠(Balb/c，从CLEA Japan获得)进行驯化饲育后，将各制剂以按siRNA浓度计为3～0.3mg/kg的剂量静脉内施予至小鼠。于施予开始48小时后采血，使用小型冷冻离心机(05PR-22:日立公司制)，于4℃以3000rpm对采集的血液离心分离20分钟。使用胆固醇检测试剂盒(Cholesterol Assay Kit)(Cayman Chemical公司制、Cat#:10007640)，按照制品的说明书中记载的方法，采用ARVO(530nm/595nm)或EnVision(531nm/595nm)测定标准液及血清样品中的荧光强度。根据得到的荧光强度绘制标准曲线，算出血清中的胆固醇浓度。
算出的血清中的胆固醇浓度的结果示于图2及图3。
由图2及图3可知，对实施例49中得到的制剂(包含抑制apo-b基因的表达的抗APO-B siRNA、和化合物A-1～5中的各化合物的组合物)进行体内药效评价试验的、胆固醇浓度的测定结果，比采用比较例1中得到的各制剂中的包含化合物XI-1～3及核酸的组合物的测定结果低，表明通过施予实施例22中得到的制剂，apo-b基因的表达被强烈抑制。
因此，确认了本发明的组合物能够将核酸导入细胞内等中，本发明的阳离子性脂质是能够容易地在体内将核酸送达细胞内的阳离子性脂质。
实施例50
使用实施例10中得到的化合物(化合物A-6)，如下所述制备组合物。所使用的核酸是含有有义链[5'-rGrGrAfUfCrAfUfCfUfCrArArGfUfCfUfUrAfCdTdT-3'(带有r、d及f的碱基上所键合的糖分别为核糖、脱氧核糖及2’位的羟基被氟取代的核糖，由5’末端侧向3’末端侧第20个碱基上所键合的脱氧核糖与第21个碱基上所键合的脱氧核糖之间的键为硫代磷酸酯键)]、和反义链[5'-rGfUrArArGrAfCfUfUrGrArGrAfUrGrAfUfCfCdTdT-3'(带有r、d及f的碱基上所键合的糖分别为核糖、脱氧核糖及2’位的羟基被氟取代的核糖，由5’末端侧向3’末端侧第20个碱基上所键合的脱氧核糖与第21个碱基上所键合的脱氧核糖之间的键为硫代磷酸酯键)]的、抑制凝血因子VII(Coagulation Factor VII，以下表示为f7)基因的表达的抗f7siRNA，从Gene Design公司获得(以下称为f7siRNA)。
称量各试样使其溶解在100vol％乙醇中，使得化合物A-6/PEG-DMPE Na(日油公司制)/DSPC(日油公司制)/胆固醇(日油公司制)＝3.532/0.270/1.156/2.401mmol/L，制备脂质膜的构成成分的溶液。另一方面，将f7siRNA/蒸馏水(24mg/mL)用Tris-EDTA缓冲液(200mM Tris-HCl、20mM EDTA、Invitrogen制)及20mM柠檬酸缓冲液(pH4.0)稀释，制备0.375mg/mL的f7siRNA水溶液(2mM Tris-EDTA缓冲液、20mM柠檬酸缓冲液、pH4.0)。
将得到的脂质溶液加热至37℃后，取800μL移至用于制备制剂的容器，在搅拌下加入800μL得到的f7siRNA水溶液。在搅拌下，向1600μL得到的脂质核酸混合悬浮液中，加入1600μL的20mM柠檬酸缓冲液(含有300mM NaCl，pH6.0)，进而滴加7086μL的DPBS(Invitrogen制)，得到粗制剂。对于得到的粗制剂，使用Amicon Ultra(Millipore公司制)进行浓缩后，用DPBS稀释，在净化工作台内用0.45μm的过滤器(东洋滤纸公司制)进行过滤。对得到的组合物的siRNA浓度进行测定，用DPBS进行稀释，使得以siRNA浓度计为0.03mg/mL，由此得到制剂(包含化合物A-6及核酸的组合物)。
使用粒径测定装置对制剂(组合物)的平均粒径进行了测定。结果示于表11。
实施例51
使用实施例1～48中得到的化合物中的化合物A-1、A-5、A-7～21、A-28～36、B-1、B-8及C-1～5中的各化合物，与实施例50同样地操作，得到制剂(包含化合物A-1、A-5、A-7～21、A-28～36、B-1、B-8及C-1～5中的各化合物、及核酸的组合物)。
使用粒径测定装置对制剂(组合物)的平均粒径进行了测定。结果示于表11。
[表11]
比较例2
将化合物A-6变更为参考例9～13中得到的化合物(化合物XI-4～8)，除此以外，与实施例50同样地操作，得到制剂。
比较例2中使用的化合物(化合物XI-4～8)的结构式示于表12。
使用粒径测定装置对制剂(组合物)的平均粒径进行了测定。结果示于表13。
[表12]
[表13]
试验例3
对于实施例50及51中得到的各制剂(包含化合物A-1、A-5～21、A-28～36、B-1、B-8及C-1～5中的各化合物、及核酸的组合物)及比较例2中得到的各制剂(包含化合物XI-4～8及核酸的组合物)，分别通过以下方法实施了体内药效评价试验。需要说明的是，对于各制剂，与试验相应地用DPBS或生理盐水稀释后进行使用。
对小鼠(Balb/c，从CLEA Japan获得)进行驯化饲育后，将各制剂以按siRNA浓度计为0.3、0.1及/或0.03mg/kg的剂量静脉内施予至小鼠。于施予开始48小时后采血，使用微量高速冷冻离心机(TOMY MX305:Tomy seiko公司制)，于4℃以8000rpm对采集的血液离心分离8分钟。使用BIOPHEN VII kit(ANIARA公司制cat#:A221304)，按照制品的说明书中记载的方法，采用ARVO(405nm)测定标准液及血浆样品中的吸光度。根据得到的吸光度绘制标准曲线，算出血浆中的Factor VII蛋白浓度。需要说明的是，例数为各组3只。
算出的血浆中的Factor VII蛋白浓度的结果示于图4～9。
由图4～8可知，对实施例50及51中得到的各制剂(包含抑制Factor VII基因的表达的抗Factor VII siRNA、和化合物A-6、A-1、A-7～12、B-1、B-8、C-1、A-5、A-13～21、A-28～26及C-2～5中的各化合物的组合物)进行体内药效评价试验的、血浆中Factor VII蛋白浓度的测定结果表明，通过施予实施例50及51中得到的各制剂，Factor VII基因的表达被强烈抑制。
因此，确认了本发明的组合物能够将核酸导入细胞内等中，本发明的阳离子性脂质是能够容易地在体内将核酸送达细胞内的阳离子性脂质。
实施例52
使用实施例5中得到的化合物A-1，如下所述制备组合物。
作为核酸，将与实施例50中使用的核酸相同的核酸用蒸馏水制备成24mg/mL进行使用。
称量各试样使其悬浮在含有盐酸及乙醇的水溶液中，使得化合物A-1/PEG-DMPENa(日油公司制)＝57.3/5.52mmol/L，用vortex搅拌混合器进行搅拌，并且反复进行加热，得到均匀的悬浮液。于室温下将该悬浮液通过0.2μm的聚碳酸酯膜滤器(membranefilter)，进而通过0.05μm的聚碳酸酯膜滤器，得到化合物A-1/PEG-DMPE Na的粒子(脂质体)的分散液。使用粒径测定装置对得到的脂质体的平均粒径进行测定，确认其平均粒径在30nm～100nm的范围内。将得到的脂质体的分散液与f7siRNA溶液以脂质体的分散液:f7siRNA溶液＝3:1的比例混合，再加入3倍量的蒸馏水并进行混合，由此制备化合物A-1/PEG-DMPE Na/f7siRNA复合体的分散液。
另一方面，称量各试样使其溶解在90vol％乙醇中，使得A-1/PEG-DMPE Na(日油公司制)/DSPC(日油公司制)/胆固醇(日油公司制)＝8.947/1.078/5.707/13.698mmol/L，制备脂质膜构成成分的溶液。
将得到的脂质膜构成成分的溶液加热后，与得到的化合物A-1/PEG-DMPE Na/f7siRNA复合体的分散液以1:1的比例混合，再混合数倍量的蒸馏水，得到粗制剂。
对于得到的粗制剂，使用Amicon Ultra(Millipore公司制)进行浓缩后，用生理盐水稀释，在净化工作台内用0.2μm的过滤器(东洋滤纸公司制)进行过滤。对得到的组合物的siRNA浓度进行测定，用生理盐水进行稀释，使得以siRNA浓度计为0.03、0.01或0.003mg/mL，由此得到制剂(包含化合物A-1及核酸的组合物)。
使用粒径测定装置对制剂(组合物)的平均粒径进行了测定。结果示于表14。
实施例53
使用实施例1～48中得到的化合物中的化合物A-5～7、A-10、A-12～21、A-28～36、B-8及C-1～5中的各化合物，与实施例52同样地操作，得到制剂(包含化合物A-5～7、A-10、A-12～21、A-28～36、B-8及C-1～5中的各化合物、及核酸的组合物)。
使用粒径测定装置对制剂(组合物)的平均粒径进行了测定。结果示于表14。
[表14]
比较例3
将化合物A-1变更为参考例23中得到的化合物XI-9，除此以外，与实施例52同样地操作，得到制剂。
比较例3中使用的化合物(化合物XI-9)的结构式示于表12。
使用粒径测定装置对制剂(组合物)的平均粒径进行了测定。结果示于表13。
试验例4
对于实施例52及53中得到的各制剂或者与实施例52或53同样地操作而得到的制剂(包含化合物A-1、A-5～7、A-10、A-12～21、A-28～36、B-8及C-1～5中的各化合物、及核酸的组合物)、及比较例3中得到的制剂(包含化合物XI-9及核酸的组合物)，通过与试验例3同样的方法实施体内药效评价试验。算出的血浆中的Factor VII蛋白浓度的结果示于图10～13。
实施例54
分别使用实施例5、11及17中得到的化合物(化合物A-1、A-7及A-10)，如下所述制备组合物。作为核酸，使用与实施例50中使用的核酸相同的核酸。
称量各试样使其溶解在100vol％乙醇中，使得化合物A-1、A-7或A-10中的各化合物/PEG-DMPE Na(日油公司制)/DSPC(日油公司制)/胆固醇(日油公司制)＝7.030/0.755/2.038/4.892mmol/L，制备脂质膜的构成成分的溶液。另一方面，将f7siRNA/蒸馏水(24mg/mL)用Tris-EDTA缓冲液(200mM Tris-HCl、20mM EDTA、Invitrogen制)及20mM柠檬酸缓冲液(pH4.0)稀释，制备0.536mg/mL的f7siRNA水溶液(2mM Tris-EDTA缓冲液、20mM柠檬酸缓冲液、pH4.0)。
将得到的脂质溶液加热至37℃后，取560μL移至用于制备制剂的容器中，在搅拌下加入560μL得到的f7siRNA水溶液。在搅拌下，向1120μL得到的脂质核酸混合悬浮液中，加入1120μL的20mM柠檬酸缓冲液(含有300mM NaCl，pH6.0)，进而滴加4960μL的DPBS(Invitrogen制)，得到粗制剂。对于得到的粗制剂，使用Amicon Ultra(Millipore公司制)进行浓缩后，用DPBS稀释，在净化工作台内用0.45μm的过滤器(东洋滤纸公司制)进行过滤。进一步，对得到的组合物的siRNA浓度进行测定，用DPBS进行稀释，使得以siRNA浓度计为0.03或0.01mg/mL，得到制剂(包含化合物A-1、A-7及A-10中的各化合物、及核酸的组合物)。
使用粒径测定装置对制剂(组合物)的平均粒径进行了测定。结果示于表15。
[表15]
化合物编号 A-1 A-7 A-10
得到的制剂的粒径(nm) 113.0 123.3 156.2
试验例5
对于实施例54中得到的各制剂(包含化合物A-1、A-7或A-10中的各化合物、及核酸的组合物)，通过与试验例3同样的方法实施体内药效评价试验。算出的血浆中的FactorVII蛋白浓度的结果示于图14。
产业上的可利用性
通过将包含本发明的阳离子性脂质及核酸的组合物施予至哺乳类等，能够容易地将该核酸导入例如细胞内等。
序列表自由文本
序列号1-载脂蛋白B siRNA有义链
序列号2-载脂蛋白B siRNA反义链
序列号3-凝血因子VII siRNA有义链
序列号4-凝血因子VII siRNA反义链

Claims (14)

1.式(B)或式(C)表示的阳离子性脂质，
式(B)中，R6为碳原子数8～24的直链状或支链状的烷基、链烯基或者炔基，
R7为碳原子数8～24的直链状或支链状的烷基、链烯基或者炔基，烷氧基乙基，烷氧基丙基，链烯基氧基乙基，链烯基氧基丙基，炔氧基乙基或炔氧基丙基；
式(C)中，R8为碳原子数8～24的直链状或支链状的烷基、链烯基或者炔基，
R9为碳原子数8～24的直链状或支链状的烷基、链烯基或者炔基，烷氧基乙基，烷氧基丙基，链烯基氧基乙基，链烯基氧基丙基，炔氧基乙基或炔氧基丙基，
X3为碳原子数1～3的亚烷基，
R10为氢原子，或碳原子数1～3的烷基。
2.如权利要求1所述的阳离子性脂质，其中，R6、R7、R8及R9独立地为十四烷基、十六烷基、(Z)-十四碳-9-烯基、(Z)-十六碳-9-烯基、(Z)-十八碳-6-烯基、(Z)-十八碳-9-烯基、(E)-十八碳-9-烯基、(Z)-十八碳-11-烯基、(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基、(9Z,12Z,15Z)-十八碳-9,12,15-三烯基、(Z)-二十碳-11-烯基、(11Z,14Z)-二十碳-11,14-二烯基或(Z)-二十二碳-13-烯基。
3.如权利要求1所述的阳离子性脂质，其中，R6、R7、R8及R9独立地为十六烷基、(Z)-十六碳-9-烯基、(Z)-十八碳-6-烯基、(Z)-十八碳-9-烯基、(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基、(Z)-二十碳-11-烯基或(11Z,14Z)-二十碳-11,14-二烯基。
4.如权利要求1～3中任一项所述的阳离子性脂质，其中，X3为亚甲基或亚乙基。
5.如权利要求1～3中任一项所述的阳离子性脂质，其中，R10独立地为氢原子或甲基。
6.一种组合物，其包含权利要求1～3中任一项所述的阳离子性脂质及核酸。
7.如权利要求6所述的组合物，其中，所述阳离子性脂质与所述核酸形成复合体，或者所述阳离子性脂质与中性脂质及/或高分子组合所得的物质与所述核酸形成复合体。
8.如权利要求6所述的组合物，其中，所述阳离子性脂质与所述核酸形成复合体，或者所述阳离子性脂质与中性脂质及/或高分子组合所得的物质与所述核酸形成复合体，所述组合物含有将所述复合体封入的脂质膜。
9.如权利要求6所述的组合物，其中，核酸为具有利用RNA干扰(RNAi)的、靶基因表达抑制作用的核酸。
10.如权利要求9所述的组合物，其中，靶基因为在肝脏、肺、肾脏或脾脏中表达的基因。
11.一种药物，用于治疗疾病，所述药物包含权利要求9所述的组合物。
12.如权利要求11所述的药物，其为用于静脉内施予的药物。
13.肝脏、肺、肾脏或脾脏相关疾病的治疗剂，所述治疗剂包含权利要求10所述的组合物。
14.如权利要求13所述的肝脏、肺、肾脏或脾脏相关疾病的治疗剂，用于静脉内施予。
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