CN105821026A - 一种使植物具有抗咪唑啉酮类除草剂特性的乙酰乳酸合成酶及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种使植物具有抗咪唑啉酮类除草剂特性的乙酰乳酸合成酶及其应用，该乙酰乳酸合成酶的氨基酸序列如SEQ ID No：1所示；编码该乙酰乳酸合成酶的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。该乙酰乳酸合成酶在水稻品种“CL55”中表达，与野生型乙酰乳酸合成酶蛋白质相比具有4个突变位点。将编码乙酰乳酸合成酶的基因转化到植物中编码乙酰乳酸合成酶，可使转基因植物具有抗咪唑啉酮类除草剂的特性。
Description
技术领域
本发明涉及一种使植物具有抗咪唑啉酮类除草剂特性的乙酰乳酸合成酶及其应用，更具体地涉及一种来源于水稻品种“CL55”的乙酰乳酸合成酶，该乙酰乳酸合成酶的编码基因转化植物使植物具有抗咪唑啉酮类除草剂的特性。
背景技术
水稻是我国乃至世界的主要粮食作物，是全球近一半人口的主要热量来源。在我国，水稻的种植总面积、总产量和单位面积产量均居各类粮食作物的首位。近年来，由于半矮杆水稻品种的种植，水稻种植方式由传统的移栽方式向直播转变，杂草稻随后蔓延开来并且日益严重。全国由于杂草对水稻的危害，导致水稻产量损失达11％，目前，杂草稻已经成为全球水稻田杂草危害的新问题。由于杂草稻同栽培稻亲缘关系密切，尚没有理想的除草剂可以安全而有效地控制杂草稻。
咪唑啉酮类除草剂选择性强、广谱、高活性，经根与叶吸收，可进行播前混土、苗前土表处理及茎叶喷雾，即能防除一年生禾本科与阔叶杂草，也能防除多年生杂草。咪唑啉酮类除草剂在土壤中吸附性小、持效期较长，广泛用于大豆等旱田作物，它对防除水稻田杂草稻非常有效。目前通过非转基因手段培育的抗除草剂作物主要是抗咪唑啉酮类作物，其中，已经商品化的有玉米、小麦、油菜、水稻和向日葵等。
目前，已经发现水稻品种“Kinmaze”的乙酰乳酸合成酶蛋白质Trp547和SER627的双位点突变(Kawaietal.2007Anovelmutantacetolactatesynthasegenefromricecells,whichconfersresistancetoALS-inhibitingherbicides.J.Pestic.Sci,32:89-98)，以及广东的水稻品种“黄占华”、“黄占丝”的乙酰乳酸合成酶蛋白质Ala96、Trp548、SER627的单位点突变(中国专利CN102586215B)会使水稻获得抗咪唑啉酮类除草剂的特性。但是，要从根本上解决水稻直播田杂草稻问题，仍需要培育出具有高效的抗咪唑啉酮类除草剂特性的转基因植物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种使植物具有抗咪唑啉酮类除草剂特性的乙酰乳酸合成酶及其应用，该乙酰乳酸合成酶的编码基因来源于水稻品种“CL55”(保藏号：CGMCCNo.9348；建议的分类命名：粳稻Oryzasativasubsp.japonica；保藏日期：2014年7月14日；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101)，将其转化到植物中，使植物具有抗咪唑啉酮类除草剂的特性。
为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：
一种使植物具有抗咪唑啉酮类除草剂特性的乙酰乳酸合成酶，其氨基酸序列如SEQIDNo：1所示。
所述使植物具有抗咪唑啉酮类除草剂特性的乙酰乳酸合成酶的编码基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。
一种使植物具有抗咪唑啉酮类除草剂特性的乙酰乳酸合成酶在培育抗咪唑啉酮类除草剂植物中的应用。
进一步，所述咪唑啉酮类除草剂是指咪唑乙烟酸(英文名称:Imazethapyr，化学名称：2-[4,5-二氢-4-甲基-4-(1-甲基乙基)-5-氧代-1H-咪唑-2-基]-5-乙基-3-吡啶羧酸)或者甲咪唑烟酸(英文名：Imazameth，化学名称：(RS)-2-(4-异丙基-4-甲基-5-氧-2-咪唑啉-2-基)-5-甲基烟酸)。
又，所述植物为水稻或玉米。
本发明所述的乙酰乳酸合成酶蛋白质与其他野生型乙酰乳酸合成酶蛋白质(其氨基酸序列如SEQIDNO:3所示)相比具有4个突变位点，将编码该合成酶的基因转化到植物中，可使水稻、玉米等植物具有抗咪唑啉酮类除草剂的特性。
具体是将本发明编码乙酰乳酸合成酶的基因转化到水稻中得到转基因1300-CL55水稻，在转基因1300-CL55水稻和野生型水稻苗期喷洒咪唑啉酮类除草剂，十天后，野生型水稻植株全部死亡，而转基因1300-CL55水稻植株全部存活；将编码乙酰乳酸合成酶的基因转化到玉米中得到转基因1300-CL55玉米，在转基因1300-CL55玉米和野生型玉米苗期喷洒咪唑啉酮类除草剂，十天后，野生型玉米植株全部死亡，而转基因1300-CL55玉米植株全部存活。因此，含有本发明如SEQIDNO：1所示的乙酰乳酸合成酶的转基因植物具有抗咪唑啉酮类除草剂的特性。
本发明有益效果：
1)本发明如SEQIDNo：1所示的乙酰乳酸合成酶是在水稻品种“CL55”中表达出来的，编码该合成酶的基因转化到植物中编码乙酰乳酸合成酶，使转基因植物可以表达乙酰乳酸合成酶蛋白质，进而使转基因植物具有抗咪唑啉酮类除草剂的特性。
2)含有本发明乙酰乳酸合成酶基因的植物安全稳定，对植物生长没有不良影响，对环境无污染。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
下列实施例中如无特殊说明均为《分子克隆实验指南(第三版)》(科学出版社，2002年)、《植物组织培养原理与技术-》(化学工程出版社，2009年)、《现代作物栽培学》(高等教育出版社，2011年)所记载的方法。本实施例中，引物DNA的合成和DNA测序委托上海生工生物工程股份有限公司进行，化学试剂、实验菌株、分子生物学试剂盒和酶类从杭州南天生物科技有限公司购买。组织培养使用的NBDC共培养基、NBDS筛选培养基、MSPD预分化培养基、MSD分化培养基、生根培养基等从杭州莱枫生物科技有限公司购买。
实施例1.确定水稻品种“CL55”中的乙酰乳酸合成酶基因
根据已知的乙酰乳酸合成酶的核酸序列(如SEQIDNO：4所示)设计引物：AHAS-F:5'atggctacgaccgccgcggccgcg；AHAS-R:5'atacacagtcctgccatcaccatc。使用上述2个引物，通过聚合酶链式反应(PCR)从水稻品种“CL55”水稻基因组中扩增出1935bp条带。其中，PCR反应体系为：50μl2х高保真聚合酶(PFU)Mix，4μlAHAS-F(10μM)，4μlAHAS-R(10μM)，1μl“CL55”基因组DNA，41μl去离子水(ddH2O)，总体积100μl；PCR反应程序为：1.95℃，10分钟；2.95℃，40秒；3.52℃，40秒；4.68℃，2分钟；5.步骤2～4，循环25次；6.68℃，10分钟；7.16℃，保存。
将PCR产物DNA测序，其序列如SEQIDNO：2所示，获得本发明“CL55”水稻中的“CL55”乙酰乳酸合成酶基因序列。根据核苷酸编码氨基酸的密码子规律，推算获得该乙酰乳酸合成酶基因编码蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。
通过比对“CL55”水稻中如SEQIDNO：1所示的乙酰乳酸合成酶氨基酸序列和野生型乙酰乳酸合成酶蛋白质序列(如SEQIDNO：3所示)，本发明的乙酰乳酸合成酶氨基酸序列具有4个突变位点：Ala11Thr、Trp293Arg、Gln401Ala和Ser627Asn。
实施例2.构建含有“CL55”乙酰乳酸合成酶基因的农杆菌诱导植物转化载体
农杆菌转化T-DNA载体是基于pCambia1300载体而构建的。获取表达乙酰乳酸合成酶各个原件的步骤如下：
(1)获得可用于构建的“CL55”乙酰乳酸合成酶基因片段
“CL55”乙酰乳酸合成酶基因的核苷酸序列通过PCR从“CL55”的基因组中获得，引物两端设计酶切位点：
AHASF-BamH1：5'GTGGGATCCatggctacgaccgccgcggccgcg，5’端被设计上BamHI位点；
AHASR-Sac1：5'GTGGAGCTCatacacagtcctgccatcaccatc，5’端被设计上SacI位点。
将AHASF-BamH1和AHASR-Sac1扩增出的PCR产物进行纯化，然后将纯化后的产物进行BamH1和Sac1双酶切，获得核苷酸片段AHAS55。
(2)获得可用于构建的终止子核苷酸片段
PEPC终止子(如SEQIDNO：5所示)从玉米的基因组中通过PCR获得，使用的引物分别是：
PEPCF-Sac1:5'GTGGAGCTCaagagctcactggctaggcg，5’端被设计上SacI位点；
PEPCF-Sac1:5'GTGGGTACCggtaccttaaacaagtccatc，5’端被设计上KpnI位点。
将PEPCF-Sac1和PEPCF-Sac1扩增出的PCR产物进行纯化，然后将纯化后的产物进行Sac1和Kpn1双酶切，获得核苷酸片段PEPC-Ter。
(3)获得可用于构建的启动子
Ubiquitin-1启动子(如SEQIDNO：6所示)从玉米的基因组中通过PCR获得，使用的引物分别是：
UbiF-Hind：5'GCGAAGCTTgcatgcctacagtgcagcgt，5’端被设计上HindIII位点)；
UbiR-BamH：5'GTGGGATCCgatgccccagatgatgtccac，5’端被设计上BamHI位点)。
将UbiF-Hind和UbiR-BamH扩增出的PCR产物进行纯化，然后将纯化后的产物进行HindIII和BamHI双酶切，获得核苷酸片段Ubi-PMT。
将上述乙酰乳酸合成酶表达原件进行转化T-DNA载体构建：将pCambia1300载体进行HindIII和SacI双酶切获得核苷酸片段1300-HS，将1300-HS、Ubi-PMT和AHAS55进行连接，将连接产物转入克隆菌株大肠杆菌TG1中，鉴定获得质粒1300-Ubi-AHAS55。将质粒1300-Ubi-AHAS55进行SacI和KpnI双酶切获得核苷酸片段1300-SK，将1300-SK和PEPC-Ter进行连接，将连接产物转入克隆菌株TG1中，鉴定获得可用于农杆菌植物转化的含有T-DNA载体的质粒1300-CL55。
实施例3.在野生型水稻品种中表达“CL55”的乙酰乳酸合成酶
将质粒1300-CL55转入农杆菌菌株LBA4044中，以此农杆菌进行植物转化。转基因水稻的获得方法是采用现有技术。选取成熟饱满的秀水134种子去壳，诱导产生愈伤组织作为转化材料。取包含质粒1300-CL55的农杆菌划板，挑单菌落接种准备转化用农杆菌。将待转化的愈伤组织放入浓度为OD595＝0.4的农杆菌液中(含乙酰丁香酮)，让农杆菌结合到愈伤组织表面，然后把愈伤组织转移到NBDC共培养基(含有50mg/ml的潮霉素)中，共培养2-3天。用无菌水冲洗转化后的愈伤，转移到含抗生素的NBDS筛选培养基上，筛选培养两个月(中间继代一次)。把筛选后，生长活力良好的愈伤转移到MSPD预分化培养基上培养20天左右，然后将预分化好的愈伤组织移到MSD分化培养基，14小时光照分化发芽。2-3周后，把抗性再生植株转移到生根培养基上壮苗生根。最后，将再生植株洗去琼脂移植于温室中，得到1300-CL55转基因水稻植株，此植株作为鉴定材料。
实施例4转基因水稻的抗咪唑啉酮类除草剂分析
在温室中种植秀水134和转基因1300-CL55水稻植株，每个除草剂处理秀水134和转基因1300-CL55水稻植株各30株，在水稻苗期喷洒咪唑烟乙酸或者甲咪唑烟酸除草剂。
其中，咪唑烟乙酸除草剂为山东先达公司的“豆说好”，稀释浓度为稀释200倍，终浓度除草剂用量为500毫升。在喷洒除草剂10天后，观察水稻植株的死亡率，实验结果参见表1。
其中，甲咪唑烟酸除草剂为德国巴斯夫公司的“百垄通”，稀释浓度为稀释1000倍，终浓度除草剂用量为500毫升。在喷洒除草剂10天后，观察水稻植株的死亡率，实验结果参见表1。
由表1可知，喷洒除草剂10天后，野生型的秀水134植株全部死亡，而含有本发明所述乙酰乳酸合成酶基因(转基因T-DNA)的水稻植株全部存活。因此说明含有本发明如SEQIDNO：1所示的乙酰乳酸合成酶的水稻植株具有抗咪唑啉酮类除草剂的特性。
表1
实施例5.在野生型玉米品种中表达“CL55”乙酰乳酸合成酶
将质粒1300-CL55转入农杆菌菌株LBA4044中，以此农杆菌进行植物转化。转基因玉米的获得方法是采用现有技术。取授粉后8-10天的Hi-2玉米穗，收集所有的未成熟胚(大小为1.0-1.5mm)作为转化材料。取包含质粒1300-CL55的农杆菌划板，挑单菌落接种准备转化用农杆菌。将待转化的愈伤组织放入浓度为OD595＝0.4的农杆菌液中(含乙酰丁香酮)，让农杆菌结合到愈伤组织表面，然后把愈伤组织转移到无抗生素的NBDC共培养基中，共培养10-14天。把愈伤组织继续转移到含抗生素的NBDC共培养基(含有50mg/ml的潮霉素)中，共培养14-21天。转移到含抗生素的NBDS筛选培养基上，筛选培养14-21天。把筛选后，生长活力良好的愈伤转移到MSPD预分化培养基上培养10-14天左右，然后将预分化好的愈伤组织移到MSD分化培养基，14小时光照分化发芽。10-14天后，把抗性再生植株转移到生根培养基上壮苗生根。最后，将再生植株洗去琼脂移植于温室中，得到1300-CL55转基因玉米植株，此植株作为鉴定材料。
实施例6.转基因玉米的抗咪唑啉酮类除草剂分析
在温室中种植Hi-2玉米和转基因1300-CL55玉米植株，每个除草剂处理Hi-2玉米和转基因1300-CL55玉米植株各30株，在玉米苗期喷洒咪唑烟乙酸或者甲咪唑烟酸除草剂。
其中，咪唑烟乙酸除草剂为山东先达公司的“豆说好”，稀释浓度为稀释200倍，终浓度除草剂用量为500毫升。在喷洒除草剂10天后，观察玉米植株的死亡率，实验结果参见表2。
其中，甲咪唑烟酸除草剂为德国巴斯夫公司的“百垄通”，稀释浓度为稀释1000倍，终浓度除草剂用量为500毫升。在喷洒除草剂10天后，观察玉米植株的死亡率，实验结果参见表2。
由表2可知，喷洒除草剂10天后，野生型的Hi-2植株全部死亡，而含有如SEQIDNO：1所示的乙酰乳酸合成酶基因(转基因T-DNA)的玉米植株全部存活。因此，可以说明含有本发明如SEQIDNO：1所示的乙酰乳酸合成酶的玉米植株具有抗咪唑啉酮类除草剂的特性。
表2
Claims (5)
1.一种使植物具有抗咪唑啉酮类除草剂特性的乙酰乳酸合成酶，其氨基酸序列如SEQIDNo：1所示。
2.如权利要求1所述的乙酰乳酸合成酶的编码基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。
3.如权利要求1所述的乙酰乳酸合成酶在培育抗咪唑啉酮类除草剂植物中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述咪唑啉酮类除草剂为咪唑乙烟酸或甲咪唑烟酸。
5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述植物为水稻或玉米。
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