CN105801658B - 甜甙及其类似物的制备及作为stat3、erk信号通路靶位点药物在抗肿瘤中的应用 - Google Patents
甜甙及其类似物的制备及作为stat3、erk信号通路靶位点药物在抗肿瘤中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及肿瘤药物领域，特别涉及甜甙及其类似物的制备及作为STAT3、ERK信号通路靶位点药物在抗肿瘤中的应用。一种甜甙及其类似物的制备方法，通过预处理、树脂分离、水解、色谱纯化等步骤，制备出高纯度的目标产物，工艺具有简单、操作性强的特点，产物纯度大于96％。甜甙及其类似物作为STAT3和ERK信号通路靶点药物在治疗肿瘤中的应用，甜甙及其类似物以STAT3信号通路为药物靶点；和/或以ERK信号通路为药物靶点。甜甙及其类似物是以STAT3和/或以ERK信号通路为药物靶点，有效的诱导癌细胞周期阻滞以及促进癌细胞凋亡，实现了抑制癌细胞增殖和促进癌细胞凋亡的目的，对癌症具有非常好的抑制效果。
Description
技术领域
本发明涉及肿瘤药物领域，具体而言，涉及甜甙及其类似物的制备及作为STAT3、ERK信号通路靶位点药物在抗肿瘤中的应用。
背景技术
STAT3是信号转导和转录活化因子(STAT)家族重要的成员，在很多恶性的组织类型肿瘤中均呈现高表达，并在肿瘤发生进程中起促进作用。STAT3在接受非受体酪氨酸激酶、细胞因子以及生长因子等细胞外信号刺激后被磷酸化激活，形成磷酸化的STAT3(phosphorylated STAT3，P-STAT3)。P-STAT3会迅速移至细胞核内，与靶基因的启动子相结合，激活基因的转录，进而影响细胞的生长、增殖与凋亡。STAT3续激活可以导致细胞异常增殖与恶性转化，因而STAT3信号通路与肿瘤的发生、发展密切相关。
目前所研究的STAT3与多种人类肿瘤有关系，如结肠癌、胰腺癌、肺癌、淋巴癌等等。Buettner R综述了STAT在癌肿中的干预作用以及细胞调控中的影响，探讨了STAT信号转导途径对的调控，王俊阁探讨STAT3信号传导通路对喉癌细胞G1～S期调控的可能机制，发现STAT3信号传导通路可能通过调节CDK/Cyclin复合物与细胞周期素依赖性激酶抑制因子(CKI)成员之间的平衡而调节喉癌细胞G1～S期转换。随着对STAT3信号通路的深入研究，STAT3在肿瘤发生发展过程中所起的作用越来越受到重视，以STAT3为靶点的治疗方法，抑制STAT3活化有望为某些恶性肿瘤的治疗开辟新的途径。
STAT3的活化通过磷酸化实现，细胞中STAT3的持续磷酸化会引起一系列的生物学效应，比如细胞的恶性增殖、抗凋亡，因此利用药物来抑制STAT3磷酸化是治疗癌症的重要的突破口。
ERK1/2是有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK)超家族的成员之一，参与细胞增殖与分化、细胞形态维持、细胞骨架的构建、细胞凋亡和细胞的恶变等多种生物学反应，而p-ERK1/2是ERK1/2的磷酸化形式，ERK1/2磷酸化后，进入细胞核作用于c-myc、c-fos、c-jun、NF-κB等转录因子，调节相关基因的转录，进而参与细胞生长、增殖、凋亡，该信号转导通路的活化与肿瘤的发生发展密切相关。
因此，靶向调控STAT3、ERK信号通路可以作为治疗肿瘤的重要途径。自然界是一个巨大的药物宝库，天然化合物具有结构新颖、多样的特点，是当前开发抗肿瘤药物以及药物先导分子的重要来源。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种甜甙及其类似物的制备方法，通过预处理、树脂分离、水解、色谱纯化等步骤，制备出高纯度的目标产物，工艺具有简单、操作性强的特点，产物纯度大于96％。
本发明的第二目的在于提供甜甙及其类似物作为STAT3和ERK信号通路靶点药物在治疗肿瘤中的应用，所述的甜甙及其类似物通过选择性抑制STAT3、ERK信号通路，诱导癌细胞周期阻滞以及促进癌细胞凋亡以实现抑制癌细胞增殖功效。
甜甙是以罗汉果醇为前体，在糖基转移酶作用下发生糖基化而生成的三萜化合物。为了说明甜甙及其类似物的靶向抑癌效果，本发明以甜甙Ⅰ E1、罗汉果甜甙Ⅱ A2单体举例来说明甜甙的信号通路靶向抑癌效果，以罗汉果醇举例来说明甜甙及其类似物的靶向抑癌效果。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
罗汉果甜甙的制备方法，包括以下步骤：
1)将罗汉果粉碎，按罗汉果与水重量比为1:6-8的比例加入水，在80～95℃条件下提取2-4次，每次1～2小时，合并提取液；
2)向提取液中加入壳聚糖絮凝，除去提取液中的鞣质和可溶性蛋白，得到澄清的水溶液；
3)将所述水溶液采用XAD-16树脂进行吸附，用30～50％乙醇进行洗脱，得到富集罗汉果甜甙的水-乙醇混合溶液；
4)将所述混合溶液减压浓缩至浸膏状，并回收乙醇，向浸膏中加入4-5倍质量的去离子水，稀释浸膏，得到粗品甜甙的水溶液；
5)将粗品甜甙的水溶液采用Diaion PA树脂进行脱色处理，收集下柱液，得到富集液；
6)将所述富集液于60℃减压浓缩至干，并加入乙醇溶解，得到的混合物用C18反相高效液相色谱分离，流动相为乙腈-水，按照20％-75％的梯度洗脱，收集目标物质，挥发溶剂后分别得到不同糖基化程度的白色结晶罗汉果甜甙。
甜甙及其类似物包括甜甙、以甜甙为母核的盐类衍生物、罗汉果醇以及罗汉果醇C3或C24位上的糖基化衍生物或盐类。本发明提供了罗汉果甜甙单体的制备方法，该制备方法通过预处理、特定树脂的分离、浓缩、特定树脂的分离、浓缩、色谱纯化等步骤，制备出高纯度的目标产物，工艺具有简单、操作性强的特点，产物纯度在98％以上。
罗汉果醇的制备方法，包括以下步骤：
1)将罗汉果粉碎，按罗汉果与水重量比为1:6-8的比例加入水，在80～95℃条件下提取2-4次，每次1～2小时，合并提取液；
2)向提取液中加入壳聚糖絮凝，除去提取液中的鞣质和可溶性蛋白，得到澄清的水溶液；
3)将所述水溶液采用XAD-16树脂进行吸附，用30～50％乙醇进行洗脱，得到富集罗汉果甜甙的水-乙醇混合溶液；
4)将所述混合溶液减压浓缩，并回收乙醇，浓缩至浸膏状，向浸膏中加入4-5倍质量的去离子水，稀释浸膏，得到粗品甜甙的水溶液；
5)将粗品甜甙的水溶液采用Diaion PA树脂进行脱色处理，收集下柱液，得到富集液；
6)向所述富集液中加入糖苷酶反应，反应温度为45～55℃，反应时间为6～8h，所述糖苷酶的重量为富集液重量的4％-6％；
7)离心，得到的沉淀即为罗汉果醇粗品，将所述罗汉果醇粗品水洗3-5次除去水溶杂质，进行冷冻干燥，得到罗汉果醇。
本发明提供的罗汉果醇的制备方法，该制备方法通过预处理、特定树脂的分离、水解、色谱纯化等步骤，制备出高纯度的目标产物，工艺具有简单、操作性强的特点，产物纯度在96％以上。
甜甙及其类似物包括甜甙、以甜甙为母核的盐类衍生物、罗汉果醇以及罗汉果醇C3或C24位上的糖基化衍生物或盐类。罗汉果甜甙上的糖基水解后，可得到罗汉果醇，罗汉果醇是甜甙生物合成的前体，甜甙是罗汉果醇糖基化的衍生物。罗汉果醇骨架上C3和C24位置上连接的葡萄糖基数目不同，形成不同种类甜甙化合。罗汉果甜甙Ⅰ E1为罗汉果醇C3位加入1个糖基后的衍生物；罗汉果甜甙ⅡA2为罗汉果醇C3位，加入2个糖基后的衍生物；罗汉果醇上加入三个或多个糖基后会依次生成甜甙Ⅲ、甜甙Ⅳ、甜甙Ⅴ、甜甙Ⅵ等。
本发明还提供了甜甙及其类似物作为STAT3和ERK信号通路靶点药物在治疗肿瘤中的应用，所述甜甙及其类似物以STAT3信号通路为药物靶点；
和/或
以ERK信号通路为药物靶点。
本发明提供的甜甙及其类似物作为STAT3和ERK信号通路靶点药物在治疗肿瘤中的应用，甜甙及其类似物是以STAT3和/或以ERK信号通路为药物靶点，有效的诱导癌细胞周期阻滞以及促进癌细胞凋亡，实现了抑制癌细胞增殖和促进癌细胞凋亡的目的，对癌症具有非常好的抑制效果。
经验证，甜甙及其类似物具有选择性抑制转录因子STAT3激活的药理活性，抑制肿瘤细胞增殖并促进其凋亡，抑制肿瘤生长和转移等抗肿瘤的药理活性。经蛋白免疫印迹检测，该化合物对STAT3(Tyr705)磷酸化水平具有明显的抑制作用，并且其抑制作用呈浓度依赖性。进一步地，所述甜甙及其类似物以STAT3信号通路为药物靶点，所述甜甙及其类似物抑制转录因子STAT3的磷酸化。
经验证，甜甙及其类似物具有选择性抑制转录因子STAT3激活的药理活性，调控下游周期蛋白和凋亡基因的表达，即甜甙及其类似物通过上调控细胞周期蛋白P21阻滞细胞周期，并下调促凋亡蛋白Bcl-2，从而实现促进肿瘤细胞凋亡的作用。
进一步地，所述甜甙及其类似物上调周期蛋白P21。
更进一步地，所述甜甙及其类似物下调抗凋亡蛋白Bcl-2。
进一步地，所述甜甙及其类似物以ERK信号通路为药物靶点，抑制ERK磷酸化。本发明提供的甜甙及其类似物具有选择性抑制ERK磷酸化的药理活性，可通过抑制ERK磷酸化，实现促进肿瘤细胞凋亡的作用。
甜甙及其类似物是p-STAT3、p-ERK1/2的靶向干预剂，本发明分别选取了多种肿瘤细胞进行了验证，如组织细胞淋巴瘤细胞U937(淋巴癌细胞)、人黑色素瘤A875细胞(实体瘤癌细胞)、人白血病K562细胞(白血病细胞K562)进行STAT3、ERK信号通路干预实验。结果显示，甜甙及其类似物能够抑制STAT3、ERK信号通路并可以应用于抑制肿瘤细胞的增殖。
具体地，所述肿瘤包括实体瘤和非实体瘤；
所述实体瘤包括恶性黑色素瘤、前列腺癌、肾癌、头颈部鳞状细胞癌、肺癌、卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、肝癌、结肠癌以及其他由STAT3和/或ERk信号通路异常表达而引起的肿瘤；
所述非实体瘤包括淋巴瘤、白血病。
进一步地，所述白血病包括大颗粒淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病。
进一步地，所述药物包括以甜甙及其类似物为主要活性成分，或者以甜甙及其类似物为配料制成的药物。
进一步地，所述药物由所述甜甙及其类似物与药学上可接受的载体制成包合物、脂质体、微球、纳米粒或乳剂。
具体地，所述药物的剂型包括注射剂、针剂、片剂、冲剂、颗粒剂、丸剂、胶囊、悬浮剂、乳剂中的任一种；
所述丸剂包括滴丸剂和软胶丸剂。
此外，本发明提供的甜甙及其类似物除了制备成药物外，还可以制备成保健品或食品，如饼干、口香糖、饮料、茶、奶糖、奶制品等。
优选地，所述药物还包括含有所述甜甙及其类似物的保健品和食品。
进一步地，所述甜甙及其类似物包括甜甙、以甜甙为母核的盐类衍生物、罗汉果醇以及罗汉果醇C3或C24位上的糖基化衍生物或盐类。
其中，所述甜甙可以罗汉果甜甙Ⅰ E1、罗汉果甜甙Ⅱ A2、甜甙Ⅲ、甜甙Ⅳ、甜甙Ⅴ、甜甙Ⅵ等。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明提供的甜甙及其类似物作为STAT3和ERK信号通路靶点药物在治疗肿瘤中的应用，是以STAT3和/或以ERK信号通路为药物靶点，有效的诱导癌细胞周期阻滞以及促进癌细胞凋亡，实现了抑制癌细胞增殖和促进癌细胞凋亡的目的，对癌症具有非常好的抑制效果；
(2)本发明所提供的化合物甜甙及其类似物具有选择性抑制转录因子STAT3激活的药理活性，调控下游周期蛋白和凋亡基因的表达，甜甙及其类似物通过上调控细胞周期蛋白P21阻滞细胞周期，同时下调促凋亡蛋白Bcl-2，从而实现促进肿瘤细胞凋亡的作用；
(3)本发明提供的甜甙及其类似物还以ERK信号通路为药物靶点，抑制ERK磷酸化，可通过抑制ERK磷酸化，实现促进肿瘤细胞凋亡的作用；
(4)本发明提供的甜甙及其类似物作为STAT3、ERK信号通路靶位点药物在抗肿瘤药物中的应用，肿瘤包括恶性黑色素瘤、前列腺癌、肾癌、头颈部鳞状细胞癌、肺癌、卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、肝癌、结肠癌、淋巴瘤、白血病；
(5)本发明提供的甜甙及其类似物作为STAT3和ERK信号通路靶点药物在治疗肿瘤中的应用，甜甙及其类似物可制成各种剂型，并且可以制成保健品和食品，以达到治疗肿瘤的效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明实施例1提取的罗汉果甜甙Ⅰ E1的HPLC图谱；
图2为本发明实施例1提取的罗汉果甜甙Ⅱ A2的HPLC图谱；
图3为本发明实施例2提取的罗汉果醇的HPLC图谱；
图4为本发明实施例3罗汉果甜甙Ⅰ E1作用于淋巴瘤U937细胞后，磷酸化的ERK1/2(P-ERK1/2)和磷酸化的STAT3(P-STAT3)表达量变化图；
图5为本发明实施例3罗汉果甜甙Ⅱ A2作用于黑色素瘤A875细胞后，磷酸化的ERK1/2(P-ERK1/2)和磷酸化的STAT3(P-STAT3)表达量变化图；
图6为本发明实施例3罗汉果甜甙Ⅱ A2作用于白血病细胞K562后，磷酸化的ERK1/2(P-ERK1/2)和磷酸化的STAT3(P-STAT3)表达量变化图；
图7为本发明实施例3罗汉果醇作用于黑色素瘤A875细胞淋巴瘤U937细胞后，磷酸化的STAT3(P-STAT3)表达量变化图；
图8为本发明实施例3罗汉果醇作用于黑色素瘤A875细胞淋巴瘤U937细胞后，磷酸化的ERK1/2(P-ERK1/2)表达量变化图；
图9为本发明实施例4罗汉果甜甙Ⅰ E1作用于淋巴瘤U937细胞后，周期调控蛋白P21和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达量变化图；
图10为本发明实施例4罗汉果甜甙Ⅱ A2作用于黑色素瘤A875细胞后，周期调控蛋白P21和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达量变化图；
图11为本发明实施例4罗汉果醇作用于白血病细胞K562后，周期调控蛋白P21和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达量变化图；
图12为本发明实施例5不同浓度的罗汉果醇作用于黑色素瘤A875细胞后，细胞周期变化图；
图13为本发明实施例6罗汉果醇作用于淋巴瘤U937细胞后，细胞凋亡变化图；
图14为本发明实施例6罗汉果甜甙Ⅰ E1作用于人黑色素瘤A875细胞后，细胞凋亡变化图；
图15为本发明实施例6罗汉果甜甙Ⅱ A2作用于白血病细胞K562后，细胞凋亡变化图；
图16为本发明实施例6不同浓度的罗汉果甜甙Ⅱ A2作用于人黑色素瘤A875细胞后，细胞凋亡变化图；
图17为本发明实施例7不同浓度的罗汉果甜甙Ⅱ A2作用于人黑色素瘤A875细胞后，荧光显微镜观察细胞形态变化图；
图18为本发明实施例8不同浓度的罗汉果甜甙Ⅰ E1作用于淋巴瘤U937细胞后，细胞生长抑制率柱形图；
图19为本发明实施例8不同浓度的罗汉果醇作用于人黑色素瘤A875细胞后，细胞生长抑制率柱形图；
图20为本发明实施例8不同浓度的罗汉果甜甙Ⅱ A2作用于白血病细胞K562后，细胞生长抑制率柱形图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售获得的常规产品。
为了说明甜甙及其类似物的信号通路靶向抑癌效果，以甜甙ⅠE1，甜甙Ⅱ A2为例来说明甜甙的信号通路靶向抑癌效果，以罗汉果醇为例来说明甜甙类似物靶向抑癌效果。
实施例1
罗汉果甜甙Ⅰ E1、罗汉果甜甙Ⅱ A2的制备
1)将罗汉果粉碎，按罗汉果与水重量比为1:6-8的比例加入水，在80～95℃条件下提取2-4次，每次1～2小时，合并提取液；
2)向提取液中加入壳聚糖絮凝，除去提取液中的鞣质和可溶性蛋白，得到澄清的水溶液；
3)将所述水溶液采用XAD-16树脂进行吸附，用30～50％乙醇进行洗脱，得到富集罗汉果甜甙的水-乙醇混合溶液；
4)将所述混合溶液减压浓缩至浸膏状，并回收乙醇，向浸膏中加入4-5倍质量的去离子水，稀释浸膏，得到粗品甜甙的水溶液；
5)将粗品甜甙的水溶液采用Diaion PA树脂进行脱色处理，收集下柱液，得到富集液；
6)将所述富集液于60℃减压浓缩至干，并加入乙醇溶解，得到的混合物用C18反相高效液相色谱分离，流动相为乙腈-水，按照20％-75％的梯度洗脱，收集目标物质，挥发溶剂后分别得白色结晶罗汉果甜甙Ⅰ E1、罗汉果甜甙Ⅱ A2。
得到的罗汉果甜甙Ⅰ E1的化学式为C36H62O9，分子量：638.9，CAS:88901-39-7,甜甙Ⅰ E1的结构式为：
得到的罗汉果甜甙Ⅱ A2，CAS 88901-45-5，分子式C42H72O14，分子量801.01。结构式为：
对得到的罗汉果甜甙Ⅰ E1、罗汉果甜甙Ⅱ A2进行HPLC分析，得到的图谱如图1和图2所示。从图1和图2可以看出，本发明提供的甜甙及其类似物的制备方法，得到的罗汉果甜甙Ⅰ E1、罗汉果甜甙Ⅱ A2的纯度均达96％以上。
实施例2
罗汉果醇的制备方法，包括以下步骤：
1)将罗汉果粉碎，按罗汉果与水重量比为1:6-8的比例加入水，在80～95℃条件下提取2-4次，每次1～2小时，合并提取液；
2)向提取液中加入壳聚糖絮凝，除去提取液中的鞣质和可溶性蛋白，得到澄清的水溶液；
3)将所述水溶液采用XAD-16树脂进行吸附，用30～50％乙醇进行洗脱，得到富集罗汉果甜甙的水-乙醇混合溶液；
4)将所述混合溶液减压浓缩，并回收乙醇，浓缩至浸膏状，向浸膏中加入4-5倍质量的去离子水，稀释浸膏，得到粗品甜甙的水溶液；
5)将粗品甜甙的水溶液采用Diaion PA树脂进行脱色处理，收集下柱液，得到富集液；
6)向所述富集液中加入糖苷酶反应，反应温度为45～55℃，反应时间为6～8h，所述糖苷酶的重量为富集液重量的4％-6％；
7)离心，得到的沉淀即为罗汉果醇粗品，将所述罗汉果醇粗品水洗3-5次除去水溶杂质，进行冷冻干燥，得到罗汉果醇。
得到的罗汉果醇的分子量为476.7,CAS:88930-15-8，分子式为C30H52O4，结构式为
对得到的罗汉果醇进行HPLC分析，得到的图谱如图3所示。从图3可以看出，本发明提供的罗汉果醇的制备方法，得到的罗汉果醇的纯度达98％以上。
实施例3
分别将罗汉果甜甙Ⅰ E1、罗汉果甜甙Ⅱ A2和罗汉果醇对STAT3、ERK靶位点蛋白的调控通过免疫印迹法进行检测，具体为：
组1：将组织细胞淋巴瘤U937细胞(1x106个/孔)接种于6孔培养板中过夜，分别加入0和10μmol/L的罗汉果甜甙Ⅰ E1、罗汉果甜甙Ⅱ A2和罗汉果醇继续培养24h；
组2：将人黑色素瘤A875细胞(1x106个/孔)接种于6孔培养板中过夜，分别加入0和10μmol/L的罗汉果甜甙Ⅰ E1、罗汉果甜甙ⅡA2和罗汉果醇继续培养24h；
组3：将白血病细胞K562(1x106个/孔)接种于6孔培养板中过夜，分别加入0和10μmol/L的罗汉果甜甙Ⅰ E1、罗汉果甜甙ⅡA2和罗汉果醇继续培养24h；
终止细胞培养后，吸除培养液，PBS(0.01mol/L，pH 7.4)洗涤，加入含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液50μl/孔，置冰浴裂解30min，4℃，14000r/min离心10min，取上清获得总蛋白；
以牛血清白蛋白(BSA)做标准品，测蛋白浓度。取50μg总蛋白，经12％SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，电转移至PVDF膜(聚偏二氟乙烯膜)，5％脱脂牛奶(含0.1％Tween 20)封闭1h，加抗体p-STAT3(Tyr705)和p-Erk1/2以及β-actin，一抗4℃孵育过夜(β-actin作为上样量对照)；TBS-T洗膜3次，每次5min；加辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗，室温孵育1h，用漂洗液(TBS-T)洗膜3次，每次10min，加入ECL避光孵育5min，荧光影像分析仪显影，扫描分析，免疫印迹试验检测的结果如图4-6所示。
罗汉果甜甙Ⅰ E1、罗汉果甜甙Ⅱ A2和罗汉果醇对U937细胞处理后得到的结果一致。以罗汉果甜甙Ⅰ E1对U937细胞的作用为例，具体如图4所示。可以看出甜甙及其类似物作用于U937细胞24h后，磷酸化的ERK1/2(P-ERK1/2)和磷酸化的STAT3(P-STAT3)表达量明显下降。此外，还用0、10、150、250μmol/L的甜甙及其类似物分别对U937细胞处理24h，得知磷酸化的ERK1/2(P-ERK1/2)和磷酸化的STAT3(P-STAT3)表达量下降的程度随甜甙及其类似物处理浓度的增加而增加。表明甜甙及其类似物具有抑制STAT3与ERK蛋白的活化、阻断STAT3、ERK信号通路的作用。
罗汉果甜甙Ⅰ E1、罗汉果甜甙Ⅱ A2和罗汉果醇对黑色素瘤A875细胞处理后得到的结果一致。罗汉果甜甙Ⅱ A2对黑色素瘤A875细胞的作用如图5所示；此外，罗汉果醇对黑色素瘤A875细胞的作用如图7和图8所示。可以看出甜甙及其类似物作用于黑色素瘤A875细胞24h后，磷酸化的ERK1/2(P-ERK1/2)和磷酸化的STAT3(P-STAT3)表达量明显下降。此外，经试验验证，磷酸化的ERK1/2(P-ERK1/2)和磷酸化的STAT3(P-STAT3)表达量下降的程度随甜甙及其类似物处理浓度的增加而增加，与U937细胞结果一致。表明甜甙及其类似物具有抑制STAT3与ERK蛋白的活化、阻断STAT3、ERK信号通路的作用。
罗汉果甜甙Ⅰ E1、罗汉果甜甙Ⅱ A2和罗汉果醇对白血病细胞K562处理后得到的结果一致。以罗汉果甜甙Ⅱ A2对白血病细胞K562的作用为例，具体如图6所示。可以看出甜甙及其类似物作用于白血病细胞K562 24h后，磷酸化的ERK1/2(P-ERK1/2)和磷酸化的STAT3(P-STAT3)表达量明显下降。并且，经试验验证，磷酸化的ERK1/2(P-ERK1/2)和磷酸化的STAT3(P-STAT3)表达量下降的程度随甜甙及其类似物处理浓度的增加而增加，与U937细胞结果一致。表明甜甙及其类似物具有抑制STAT3与ERK蛋白的活化、阻断STAT3、ERK信号通路的作用。
实施例4
STAT3、ERK信号通路可以调控周期蛋白与凋亡基因，为了验证罗汉果甜甙Ⅰ E1、罗汉果甜甙Ⅱ A2和罗汉果醇的作用，对STAT3、ERK下游的基因表达情况进行了检测，分别测定了罗汉果甜甙ⅠE1、罗汉果甜甙Ⅱ A2和罗汉果醇三种甜甙及其类似物对组织细胞淋巴瘤U937细胞、人黑色素瘤A875细胞、白血病细胞K562中Bcl-2和P21蛋白的影响。
甜甙及其类似物对Bcl-2和P21蛋白的调控通过免疫印迹法进行检测，具体为：分别将组织细胞淋巴瘤U937细胞、人黑色素瘤A875细胞、白血病细胞K562(1x106个/孔)接种于6孔培养板中过夜，分别加入0和10μmol/L的甜甙及其类似物继续培养24h。终止细胞培养后，吸除培养液，PBS(0.01mol/L,pH 7.4)洗涤，加入含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液50μL/孔，置冰浴裂解30min，4℃，14000r/min离心10min，取上清获得总蛋白。
以牛血清白蛋白(BSA)做标准品，测蛋白浓度。取50μg总蛋白，经12％SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，电转移至PVDF膜(聚偏二氟乙烯膜)，5％脱脂牛奶(含0.1％Tween 20)封闭1h，加抗体P21、Bcl-2以及β-actin，一抗4℃孵育过夜(β-actin作为上样量对照)；TBS-T洗膜3次，每次5min；加辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗，室温孵育1h，用漂洗液(TBS-T)洗膜3次，每次10min，加入ECL避光孵育5min，荧光影像分析仪显影，扫描分析。免疫印迹试验检测的结果如图9-11所示。
罗汉果甜甙Ⅰ E1、罗汉果甜甙Ⅱ A2和罗汉果醇对U937细胞处理后得到的结果一致。以罗汉果甜甙Ⅰ E1对U937细胞的作用为例，具体如图9所示。可以看出，甜甙及其类似物作用于U937细胞24h后，STAT3信号关联的下游周期调控蛋白P21明显上调，抗凋亡蛋白Bcl-2明显下调。此外，还用0、10、150、250μmol/L的不同甜甙及其类似物分别对U937细胞处理24h，得到不同浓度的甜甙及其类似物作用于U937细胞24h后，甜甙及其类似物均可以剂量依赖性抑制STAT3的激活，同时上调周期调控基因P21，并抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达。P21、Bcl-2蛋白的表达量呈现药物浓度依赖性，说明甜甙及其类似物通过阻断STAT3、ERK位点，进而调控信号通路下游周期蛋白和凋亡基因的表达，从而达到抑制癌细胞生长、促进癌细胞凋亡的作用。
罗汉果甜甙Ⅰ E1、罗汉果甜甙Ⅱ A2和罗汉果醇对黑色素瘤A875细胞处理后得到的结果一致。以罗汉果甜甙Ⅱ A2对黑色素瘤A875细胞的作用为例，具体如图10所示。可以看出，甜甙及其类似物作用于人黑色素瘤A875细胞24h后，STAT3信号关联的下游周期调控蛋白P21明显上调，抗凋亡蛋白Bcl-2明显下调。此外，试验证明，不同浓度的甜甙及其类似物作用于人黑色素瘤A875细胞24h后，甜甙及其类似物可以剂量依赖性抑制STAT3的激活，同时上调周期调控基因P21，并抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，结果与U937细胞一致。P21、Bcl-2蛋白的表达量呈现药物浓度依赖性，说明甜甙及其类似物通过阻断STAT3、ERK位点，进而调控信号通路下游周期蛋白和凋亡基因的表达，从而达到抑制癌细胞生长、促进癌细胞凋亡的作用。
罗汉果甜甙Ⅰ E1、罗汉果甜甙Ⅱ A2和罗汉果醇对白血病细胞K562处理后得到的结果一致。以罗汉果醇对白血病细胞K562的作用为例，具体如图11所示。可以看出，甜甙及其类似物作用于白血病细胞K562 24h后，STAT3信号关联的下游周期调控蛋白P21明显上调，抗凋亡蛋白Bcl-2明显下调；并且，试验证明，不同浓度的甜甙及其类似物作用于白血病细胞K56224h后，甜甙及其类似物可以剂量依赖性抑制STAT3的激活，同时上调周期调控基因P21，并抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，结果与U937细胞一致。P21、Bcl-2蛋白的表达量呈现药物浓度依赖性，说明甜甙及其类似物通过阻断STAT3、ERK位点，进而调控信号通路下游周期蛋白和凋亡基因的表达，从而达到抑制癌细胞生长、促进癌细胞凋亡的作用。
Bcl-2为抗凋亡蛋白，能够抑制细胞的程序性凋亡，Bcl-2的过量表达是导致细胞恶性增殖的重要原因，而Bcl-2又是受STAT3调控的下游蛋白。经过甜甙及其类似物(罗汉果甜甙Ⅰ E1、罗汉果甜甙Ⅱ A2和罗汉果醇)处理的U937细胞、人黑色素瘤A875细胞、白血病细胞K562的STAT3蛋白磷酸化受到抑制的同时，Bcl-2蛋白的表达明显下降，Bcl-2蛋白的表达量与STAT3受到的抑制呈现正相关，这也是促进癌细胞凋亡的重要原因。
实施例5
罗汉果甜甙Ⅰ E1、罗汉果甜甙Ⅱ A2和罗汉果醇对组织细胞淋巴瘤U937细胞、人黑色素瘤A875细胞、白血病细胞K562的细胞周期分布的影响
药物对细胞周期阻滞是抑制癌细胞增殖的重要途径。选取对数生长期的组织细胞淋巴瘤U937细胞、人黑色素瘤A875细胞和白血病细胞K562，分别用0和10μmol/L的甜甙及其类似物-罗汉果甜甙Ⅰ E1、罗汉果甜甙Ⅱ A2和罗汉果醇培养24h后，用0.25％胰酶消化，收集用药组和对照组细胞，用PBS洗涤细胞，离心2500rpm，5min收集细胞，70％冷乙醇固定，4℃过夜，离心去乙醇，加入含RNase A的PBS，再加入碘化丙啶(PI)染色混匀(RNase A，终浓度为50mg/L，PI终浓度为25mg/L)，37℃避光孵育30min，用流式细胞仪检测。
STAT3信号通路涉及到细胞周期基因的表达，从而影响细胞周期进程。罗汉果甜甙Ⅰ E1、罗汉果甜甙Ⅱ A2和罗汉果醇对U937细胞处理后得到的结果一致。从流式细胞仪检测结果可以得出，经甜甙及其类似物处理后，淋巴瘤U937细胞的G0/G1期细胞所占比例逐渐升高，说明甜甙及其类似物能导致U937细胞发生G0/G1阻滞。
此外，还分别用0、1、10、150、250μmol/L的三种甜甙及其类似物对U937细胞处理24h，罗汉果甜甙Ⅰ E1、罗汉果甜甙ⅡA2和罗汉果醇对U937细胞处理后得到的结果一致。得到随着甜甙及其类似物浓度的增加，处于G0/G1期细胞的比例逐渐升高，细胞周期分布发生明显变化，说明甜甙及其类似物能导致U937细胞发生G0/G1阻滞，甜甙及其类似物对癌细胞的周期阻滞作用呈现剂量依赖性。说明甜甙及其类似物可通过抑制STAT3信号通路、调控周期蛋白，从而诱导肿瘤细胞的细胞周期阻滞来抑制肿瘤生长。
罗汉果甜甙Ⅰ E1、罗汉果甜甙Ⅱ A2和罗汉果醇对黑色素瘤A875细胞处理后得到的结果一致。从流式细胞仪检测结果可以得出，经甜甙及其类似物处理后，人黑色素瘤A875细胞的G0/G1期细胞所占比例逐渐升高，说明甜甙及其类似物能导致人黑色素瘤A875细胞发生G0/G1阻滞。此外，以罗汉果醇对黑色素瘤A875细胞的作用为例，具体如图12所示。可以看出，随着甜甙及其类似物浓度的增加，处于G0/G1期细胞的比例逐渐升高，细胞周期分布发生明显变化，说明甜甙及其类似物能导致人黑色素瘤A875细胞发生G0/G1阻滞，甜甙及其类似物对癌细胞的周期阻滞作用呈现剂量依赖性，结果与U937细胞一致。说明甜甙及其类似物可通过抑制STAT3信号通路、调控周期蛋白，从而诱导肿瘤细胞的细胞周期阻滞来抑制肿瘤生长。
罗汉果甜甙Ⅰ E1、罗汉果甜甙Ⅱ A2和罗汉果醇对白血病细胞K562处理后得到的结果一致。经甜甙及其类似物处理后，白血病细胞K562的细胞周期发生阻滞。此外，随着甜甙及其类似物浓度的增加，细胞阻滞的比例逐渐升高，细胞周期分布发生明显变化，说明甜甙及其类似物能导致白血病细胞K562发生细胞周期阻滞，甜甙及其类似物对癌细胞的周期阻滞作用呈现剂量依赖性。说明甜甙及其类似物可通过抑制STAT3信号通路、调控周期蛋白，从而诱导肿瘤细胞的细胞周期阻滞来抑制肿瘤生长。
实施例6
选取对数生长期的淋巴瘤U937细胞、人黑色素瘤A875细胞和白血病细胞K562，分别用0和10μmol/L的甜甙及其类似物-罗汉果甜甙Ⅰ E1、罗汉果甜甙Ⅱ A2和罗汉果醇培养24h后，收集细胞，用冷200μl PBS洗涤细胞两次，收集细胞；加入100μl的结合液(BindingBuffer)重悬细胞，加入2μl的AnnexinⅤ-FITC混匀后，避光、室温作用10min，再加入5μl的碘化丙啶(PI)混匀；避光、室温作用10min，进行流式细胞仪检测，结果如图13-15所示。
罗汉果甜甙Ⅰ E1、罗汉果甜甙Ⅱ A2和罗汉果醇对U937细胞处理后得到的结果一致。以罗汉果醇为例，结果如图13所示。可以看出，甜甙及其类似物作用于组织细胞淋巴瘤U937细胞24h，葫芦二烯醇可诱导组织细胞淋巴瘤U937细胞凋亡。此外，还用0、10、150、250μmol/L的甜甙及其类似物对U937细胞处理24h，得到随着甜甙及其类似物浓度的升高，细胞凋亡数目增加，即甜甙及其类似物对淋巴瘤U937细胞的作用呈剂量依赖性。
罗汉果甜甙Ⅰ E1、罗汉果甜甙Ⅱ A2和罗汉果醇对人黑色素瘤A875细胞处理后得到的结果一致。以罗汉果甜甙Ⅰ E1为例，结果如图14所示。可以看出，甜甙及其类似物作用于人黑色素瘤A875细胞24h，甜甙及其类似物可诱导人黑色素瘤A875细胞凋亡。并且采用不同浓度的甜甙及其类似物作用于人黑色素瘤A875细胞，以罗汉果甜甙Ⅱ A2为例，结果如图16所示。可以看出，随着甜甙及其类似物浓度的升高，细胞凋亡数目增加，即甜甙及其类似物对人黑色素瘤A875细胞的作用呈剂量依赖性，结果与淋巴瘤U937细胞一致。
罗汉果甜甙Ⅰ E1、罗汉果甜甙Ⅱ A2和罗汉果醇对白血病细胞K562处理后得到的结果一致。以罗汉果甜甙Ⅱ A2为例，结果如图15所示。可以看出，甜甙及其类似物作用于白血病细胞K562 24h，甜甙及其类似物可诱导白血病细胞K562凋亡。并且采用不同浓度的甜甙及其类似物作用于白血病细胞K562，随着甜甙及其类似物浓度的升高，细胞凋亡数目增加，即甜甙及其类似物对白血病细胞K562的作用呈剂量依赖性，结果与淋巴瘤U937细胞一致。
实施例7
选取对数生长期的淋巴瘤U937细胞、人黑色素瘤A875细胞和白血病细胞K562，将细胞调至浓度1×104个/ml，转移至六孔板培养，培养24h后加入药物，使终浓度分别为0、10、100和250μmol/L，阴性对照组仅加入全培养基，阳性对照组加入罗汉果甜甙Ⅱ A2，培养24h后，吸出废液，每孔加入固定液，固定25min，PBS洗2次，每次洗3min，加入Hoechst 33258染液，室温避光染色30min，使用荧光显微镜观察细胞形态变化。
其中，罗汉果甜甙ⅡA2对A875黑色素瘤细胞荧光显微镜下观察图如图17所示。图17中，图A为培养液处理组，荧光显微镜下细胞核完整,着色均匀,荧光成弥散状,比较黯淡；图B、C、D分别为10、100、250μmo/L处理组细胞,随药物浓度的升高,其染色质呈浓染的块状或颗粒状荧光，细胞核染色质凝聚,细胞核裂解,着色不规则,呈现出细胞凋亡的典型变化。
此外，罗汉果甜甙ⅡA2对淋巴瘤U937细胞和白血病细胞K562的作用效果与对人黑色素瘤A875细胞结果一致。另外，用罗汉果甜甙Ⅰ E1和罗汉果醇采用相同的方法分别对人黑色素瘤A875细胞、淋巴瘤U937细胞和白血病细胞K562处理后，得到的结果与罗汉果甜甙ⅡA2结果一致。
可以得出，甜甙及其类似物作用于人黑色素瘤A875细胞、淋巴瘤U937细胞和白血病细胞K562 24h后，甜甙及其类似物可诱导各癌细胞凋亡，并且随着甜甙及其类似物浓度的升高，细胞凋亡数目增加，即甜甙及其类似物对癌细胞的作用呈剂量依赖性。
实施例8
取对数生长期的淋巴瘤U937细胞、人黑色素瘤A875细胞和白血病细胞K562，分别调整细胞浓度至2×107/L，以每孔100μl接种于96孔培养板中，预培养24h后，加入100μl不同浓度培养液配制的，使每组甜甙及其类似物终浓度分别为0.1、1、10、100、200、250μmol/L6个剂量，设DMSO培养的细胞作对照组。
分别于24h进行MTT比色实验:每次实验结束前每孔加入浓度为5mg/ml MTT液15μl，37℃避光培养继续培养4h后，每孔加DMSO 150μl，摇床震荡10min，置于酶标仪490nm检测光密度值(OD)，按以下公式计算抑制率:细胞生长抑制率＝(对照组OD490-试验组OD490)/对照组OD490×100％。
罗汉果甜甙Ⅰ E1、罗汉果甜甙Ⅱ A2和罗汉果醇对U937细胞处理后得到的结果一致。以罗汉果甜甙Ⅰ E1为例，结果如图18所示。可以看出，MTT实验结果显示甜甙及其类似物对组织细胞淋巴瘤U937细胞的增殖具有抑制作用，随着药物浓度的增加或作用时间的延长，其抑制率也随之增加，表明甜甙及其类似物对U937细胞的增殖抑制作用具有明显的剂量依赖性和时间依赖性。经ANOVA方差分析，不同剂量组之间、不同时间组之间及其与对照组之间的差异均有显著性意义。
罗汉果甜甙Ⅰ E1、罗汉果甜甙Ⅱ A2和罗汉果醇对黑色素瘤A875细胞处理后得到的结果一致。以罗汉果醇为例，结果如图19所示。可以看出，MTT实验结果显示甜甙及其类似物对黑色素瘤A875细胞的增殖具有抑制作用，随着药物浓度的增加或作用时间的延长，其抑制率也随之增加，表明甜甙及其类似物对黑色素瘤A875细胞的增殖抑制作用具有明显的剂量依赖性和时间依赖性。经ANOVA方差分析，不同剂量组之间、不同时间组之间及其与对照组之间的差异均有显著性意义。
罗汉果甜甙Ⅰ E1、罗汉果甜甙Ⅱ A2和罗汉果醇对白血病细胞K562处理后得到的结果一致。以罗汉果甜甙Ⅱ A2为例，结果如图20所示。可以看出，MTT实验结果显示甜甙及其类似物对白血病细胞K562的增殖具有抑制作用，随着药物浓度的增加或作用时间的延长，其抑制率也随之增加，表明甜甙及其类似物对白血病细胞K562的增殖抑制作用具有明显的剂量依赖性和时间依赖性。经ANOVA方差分析，不同剂量组之间、不同时间组之间及其与对照组之间的差异均有显著性意义。
此外，还分别对前列腺癌细胞、肾癌细胞、头颈部鳞状细胞癌细胞、肺癌细胞、卵巢癌细胞、乳腺癌细胞、胰腺癌细胞、肝癌细胞、结肠癌细胞进行了实施例3-8的试验，结果均与淋巴瘤U937细胞的结果一致。
另外，还对甜甙Ⅲ、甜甙Ⅳ、甜甙Ⅴ、甜甙Ⅵ等进行了实施例2-8的试验，结果均与罗汉果甜甙Ⅰ E1、罗汉果甜甙Ⅱ A2一致；此外分别对前列腺癌细胞、肾癌细胞、头颈部鳞状细胞癌细胞、肺癌细胞、卵巢癌细胞、乳腺癌细胞、胰腺癌细胞、肝癌细胞、结肠癌细胞进行了实施例3-8的试验，结果均与淋巴瘤U937细胞的结果一致。
本申请提供的甜甙及其类似物制成保健品和食品，如饼干、口香糖、饮料、茶、奶糖、奶制品等；对恶性黑色素瘤、前列腺癌、肾癌、头颈部鳞状细胞癌、肺癌、卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、肝癌、结肠癌、淋巴瘤和白血病也具有非常好的抑制效果。
以上实施例说明甜甙及其类似物具有选择性抑制核转录因子STAT3、ERK信号通路并具有抑制肿瘤细胞生长并诱导其凋亡，抑制肿瘤增殖的功效。涉及STAT3信号通路的肿瘤包括实体瘤如：恶性黑色素瘤、前列腺癌、肾癌、头颈部鳞状细胞癌、肺癌、卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、肝癌、结肠癌等；非实体瘤如淋巴瘤，白血病如：大颗粒淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病等。由于甜甙及其类似物具有抑制STAT3、ERK信号通路的药用价值，故可以推知对其他涉及STAT3、ERK信号的癌症均具有抑制作用。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
Claims (9)
1.甜甙及其类似物作为STAT3和ERK信号通路靶点药物在制备治疗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述甜甙及其类似物以STAT3信号通路为药物靶点；
和/或
以ERK信号通路为药物靶点，诱导癌细胞周期阻滞以及促进癌细胞凋亡；
所述甜甙及其类似物为甜甙、以甜甙为母核的盐类衍生物；
所述肿瘤为恶性黑色素瘤或白血病。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述甜甙及其类似物以STAT3信号通路为药物靶点，所述甜甙及其类似物抑制转录因子STAT3的磷酸化。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述甜甙及其类似物上调周期蛋白P21。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述甜甙及其类似物下调抗凋亡蛋白Bcl-2。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述甜甙及其类似物以ERK信号通路为药物靶点，抑制ERK磷酸化。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述白血病包括大颗粒淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物包括以甜甙及其类似物为主要活性成分，或者以甜甙及其类似物为配料制成的药物。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述药物为由甜甙及其类似物与药学上可接受的载体制成包合物、脂质体、微球、纳米粒或乳剂。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型包括注射剂、针剂、片剂、冲剂、颗粒剂、丸剂、胶囊、悬浮剂、乳剂中的任一种；
所述丸剂包括滴丸剂和软胶丸剂。
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