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CN105232565B - 罗汉果皂苷或其药学上可接受的盐在制备肿瘤放射增敏剂中的应用 - Google Patents

罗汉果皂苷或其药学上可接受的盐在制备肿瘤放射增敏剂中的应用 Download PDF

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CN105232565B CN201510498383.4A CN201510498383A CN105232565B CN 105232565 B CN105232565 B CN 105232565B CN 201510498383 A CN201510498383 A CN 201510498383A CN 105232565 B CN105232565 B CN 105232565B
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Abstract

本发明提供了罗汉果皂苷或其药学上可接受的盐的一种新用途，可用其制备肿瘤放射增敏剂。将由罗汉果皂苷及其药学上可接受的盐作为活性成分制备得到的肿瘤放射增敏剂应用到肿瘤放射治疗时，不但可以增加肿瘤的辐射敏感性，而且还能减少放射治疗的副作用。同时，罗汉果皂苷无毒，不会伤害人体正常细胞，因此本发明具有临床应用前景。

Description

罗汉果皂苷或其药学上可接受的盐在制备肿瘤放射增敏剂中 的应用
技术领域
本发明涉及罗汉果皂苷的应用领域，具体而言，涉及一种罗汉果皂苷或其药学上可接受的盐在制备肿瘤放射增敏剂中的应用。
背景技术
肿瘤包括恶性肿瘤和良性肿瘤。良性肿瘤一般可通过手术切除即可治愈，对人体危害较小。但恶性肿瘤对人体危害较大，目前恶性肿瘤疾病成为我国发病率高、致死率高的疾病。目前，放疗、化疗、手术切除是治疗恶性肿瘤主要方法。放射治疗经历了百余年的发展，成为一种成熟且有效治疗肿瘤疾病的治疗手段，半数以上的恶性肿瘤患者在病情的不同阶段需要作放射治疗。
虽然放射治疗恶性肿瘤的治疗效果可靠，不良反应明确，能使大部分肿瘤得到不同程度的控制，但也存在缺陷。
一是放射治疗在杀伤或杀死恶性肿瘤细胞的同时也会或多或少会损害一定数量的正常细胞，并导致出现一些局部或全身性的损害和反应。即采用放射手段治疗恶性肿瘤过程中会出现一些副反应，例如局部组织肿胀、皮肤充血、色素沉着，毛囊角化、皮肤干性脱皮、脱发等；全身出现乏力、恶心，食欲减退、失眠、白细胞下降等。
二是单独的放射治疗手段只对辐射敏感的恶性肿瘤有比较好的疗效。但是许多恶性肿瘤对辐射并不敏感。此时，增加放射剂量虽然有利于增加辐射的敏感性，但是也会大量杀伤或杀死正常的细胞，给患者带来不可克服的伤害。因此，当恶性肿瘤对辐射不敏感时，只能放弃放射治疗手段。
罗汉果皂苷是一类从葫芦科植物罗汉果的果实中提取出来的多种三萜类化合物的总称。它不但具有罗汉果的特征风味，而且作为三萜烯葡萄糖苷，它具有很高的甜度，其甜度约为蔗糖的300倍，且不产生热量。因此，罗汉果皂苷常常被用作甜味剂、香精等食品添加剂应用到饮料、糖果、食品等行业，改善产品的口感和风味。将其作为活性成分用以制备肿瘤放射增敏剂，迄今未见其相关记载。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供罗汉果皂苷或其药学上可接受的盐在制备肿瘤化疗增敏剂中的应用。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
罗汉果皂苷或其药学上可接受的盐在制备肿瘤放射增敏剂中的应用。
采用放射手段治疗恶性肿瘤时，常常会出现一些副作用，或者有的恶性肿瘤对于辐射不敏感，从而无法采用放射手段进行治疗。本发明通过研究发现罗汉果皂苷具有良好的肿瘤放疗增敏的效果，因此可用以制备放射增敏剂。迄今尚未见有关于罗汉果皂苷这一应用的报道。
优选地，所述罗汉果皂苷具有如下的结构通式：
式中，R和R1为葡萄糖残基，所述葡萄糖残基的化学结构包括
中的任意一种。
优选地，所述罗汉果皂苷为罗汉果皂苷Ⅴ，所述罗汉果皂苷Ⅴ的CAS number为88901-36-4，分子式为C60H102O29，其化学结构式如下：
优选地，所述罗汉果皂苷为罗汉果皂苷Ⅵ，所述罗汉果皂苷Ⅵ的CAS number为89590-98-7，分子式为C66H112O34，其化学结构式如下：
优选地，所述罗汉果皂苷为罗汉果皂苷Ⅲ，所述罗汉果皂苷Ⅲ的CAS number为130567-83-8，分子式为C48H82O19，其化学结构式如下：
优选地，所述罗汉果皂苷为罗汉果皂苷Ⅱ，所述罗汉果皂苷Ⅱ的CAS number为88901-38-6，分子式为C42H72O14，具有如下的化学结构式：
优选地，所述罗汉果皂苷为罗汉果皂苷Ⅳ，所述罗汉果皂苷Ⅳ的CAS number为89590-95-4，分子式为C54H92O24，具有如下的化学结构式：
优选地，所述放射增敏剂包括所述罗汉果皂苷及其药学上可接受的盐和可接受的载体；所述可接受的载体为一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质。它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是各组分之间以及各组分和本发明中罗汉果皂苷之间能够相互掺和，而不明显降低药效。所述可接受的载体包括纤维素及其衍生物、明胶、滑石、固体润滑剂、硫酸钙、植物油、多元醇、乳化剂、润湿剂、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水中的一种或多种。
优选地，所述放射增敏剂为口服液体制剂、颗粒剂、片剂、冲剂、胶丸、胶囊、缓释剂、滴丸剂或口崩解剂中的任意一种。
应用罗汉果皂苷制备得到的肿瘤放射增敏剂的施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括：口服、注射、瘤内和局部给药方式。
用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂或颗粒剂中的任意一种。在这些固体剂型中，活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂或载体混合，如磷酸二钙或柠檬酸钠，或与以下成分混合：(a)填料或增溶剂，例如，乳糖、淀粉、蔗糖、甘露醇、葡萄糖或硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。
固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性化合物或化合物的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。必要时，活性化合物也可与上述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。
用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性化合物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、碳酸乙酯、异丙醇、1，3-丁二醇乙酸乙酯、丙二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。
除了这些惰性稀释剂外，所述肿瘤放射增敏剂也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料。
除了活性化合物外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。
用于肠胃外注射的肿瘤放射增敏剂可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。
用于局部给药的肿瘤放射增敏剂的剂型包括软膏剂、散剂、贴剂、喷射剂和吸入剂。活性成分在无菌条件下与生理上可接受的载体及任何防腐剂、缓冲剂，或必要时可能需要的推进剂一起混合。
本发明所述的肿瘤放射增敏剂可以单独给药，或者与其他药学上可接受的化合物联合给药。
使用本发明所述的肿瘤放射增敏剂时，是将安全有效量的药物适用于需要治疗的哺乳动物(如人)，其中施用时剂量为药学上认为的有效给药剂量，
每次剂量的范围，例如对于65kg体重的人而言，日给药剂量通常为100～400mg。具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素。
优选地，所述肿瘤放射增敏剂在制备具有能够上调P53抑癌基因的表达和/或下调Bcl-2蛋白的表达的药物中的应用。
p53作为重要的抗癌基因，能使肿瘤细胞凋亡，从而防止组织细胞癌变。同时P53还具有帮助细胞基因修复缺陷的功能。Bcl-2为抗凋亡蛋白，能够抑制细胞的程序性凋亡。经研究发现，p53、Bcl-2基因在放疗增敏中同样发挥了重要作用，通过促进p53表达或抑制Bcl-2的表达达到放疗增敏的效果。在本发明中，经研究发现，罗汉果皂苷能够上调肿瘤细胞中P53抑癌基因的表达或者下调Bcl-2蛋白的表达。这一发现揭示了罗汉果皂苷作为放射增敏剂时的作用机理：即罗汉果皂苷有可能通过促进P53抑癌基因的表达或抑制Bcl-2的表达来促进肿瘤细胞的凋亡，从而提高放射敏感性。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)提供了罗汉果皂苷在制备肿瘤放射增敏剂中的应用，迄今为止尚未见相关的报道。
(2)提出了如下的放射增敏机制：罗汉果皂苷可能是通过促进肿瘤细胞P53抑癌基因的表达或抑制Bcl-2的表达来提高放射敏感性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为罗汉果皂苷Ⅱ调控Hep-G2肝癌细胞中P53、Bcl-2蛋白表达的实验结果；
图2为不同处理(空白组、纯药物组、纯放射组和药物、放射联合组)对Hep-G2肝癌细胞凋亡的影响；
图3为不同处理(空白组、纯药物组、纯放射组和药物、放射联合组)对Hep-G2肝癌细胞形态的影响；
图4为罗汉果皂苷Ⅴ调控肺癌细胞A549中P53、Bcl-2蛋白表达的实验结果；
图5为不同处理(空白组、纯药物组、纯放射组和药物、放射联合组)对A549肺癌细胞凋亡的影响；
图6为不同处理(空白组、纯药物组、纯放射组和药物、放射联合组)对A549肺癌细胞形态的影响。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明中所提到的罗汉果皂苷采用如下方法制备而成：
1)将罗汉果粉碎、称重，按罗汉果与水质量比为1:6-1:8的比例加入水，在80-95℃的温度下搅拌提取1-3个小时，离心收集上清液，将沉淀重复搅拌提取1-4次，每次均离心收集上清液，合并上清液以得到提取液；
2)向上述提取液中加入絮凝剂，除去所述提取液中的鞣质和可溶性蛋白，得到澄清的水溶液；
3)采用XAD-16树脂对上述水溶液进行吸附，然后用30-50％的乙醇进行洗脱，得到富集罗汉果三萜皂苷的水-乙醇混合溶液；
4)将上述水-乙醇混合溶液进行减压浓缩，并回收乙醇，浓缩至膏状的浸膏并称重，向该浸膏中加入3-6倍质量的去离子水来稀释浸膏，以得到粗品罗汉果三萜皂苷水溶液；
5)采用Diaion PA树脂对上述粗品罗汉果三萜皂苷水溶液进行脱色处理，收集下注液，得到富集液，再利用半制备液相色谱分离制得纯度大于98％的罗汉果三萜皂苷。
关于步骤1)，在80-95℃的温度下搅拌提取1-3个小时，优选提取2个小时；离心收集上清液，将沉淀重复搅拌提取1-4次，每次均离心收集上清液，优选重复提取1次即可，但是重复提取的次数越多则获得的提取液就越多。
关于步骤2)，所用的絮凝剂为壳聚糖，是现有技术中已有的成熟产品，属于有机高分子絮凝剂。
关于步骤3)，XAD-16树脂具体为Amberlite XAD-16非离子型大孔树脂，一般用于抗生素、萜类等小分子的吸附。
关于步骤5)，Diaion PA树脂具体为三菱化学阴离子交换树脂多孔型-Diaion PA系列，在此主要用于罗汉果三萜皂苷的脱色；半制备液相色谱的色谱条件：色谱柱为反相C18柱(其为非极性色谱柱)，紫外检测波长为214±2.0nm；流动相为乙腈-水，梯度洗脱0-20min 40％乙腈，20-40min 40-60％乙腈，40-60min 60％乙腈；流速为1.0mL/min；柱温25℃；按不同的保留时间收集样品，根据所含糖基数目越多、保留时间越短、出峰越快，依次收集得到下文将详述的罗汉果皂苷Ⅵ(22min)、罗汉果皂苷Ⅴ(27min)、罗汉果皂苷Ⅳ(35min)、罗汉果皂苷Ⅲ(41min)、罗汉果皂苷Ⅱ(46min)。
实验例1
本实验例验证了CAS number为88901-38-6，分子式为C42H72O14的罗汉果皂苷Ⅱ对肝癌细胞的放射增敏效果。
1、采用Western Blot方法(即WB法)检测罗汉果皂苷Ⅱ对肝癌细胞Hep-G2中P53、Bcl-2的影响
将Hep-G2细胞在不同浓度药(0μmol·L-1，10μmol·L-1，30μmol·L-1，60μmol·L-1)物培养24h后终止细胞培养，后吸除培养液，采用PBS(浓度为0.01mol L-1，pH 7.4)洗涤，加入含PMSF裂解液50μL/孔，置冰浴环境中裂解30min。后在14000r min-1的转速下离心10min，获得总蛋白。采用BCA比色法测蛋白浓度，取50μg总蛋白，经12％SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，电转移至PVDF膜，5％脱脂牛奶(含0.1％Tween 20)封闭lh，加抗体p53、Bcl-2以及β-actin，一抗4℃孵育过夜(β-actin作为上样量对照)；TBS-T洗膜3次，每次5min；加辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗，室温孵育1h，用漂洗液(TBS-T)洗膜3次，每次10min，加入ECL避光孵育5min，荧光影像分析仪显影，扫描、分析，检测检测P53、Bcl-2，β-actin蛋白表达水平，其结果如图1所示。
如图1可以看出，经过罗汉果皂苷Ⅱ处理的Hep-G2肝癌细胞的Bcl-2蛋白的表达明显下降，且Bcl-2蛋白的表达量与罗汉果皂苷Ⅱ的浓度呈现负相关，而P53蛋白表达明显上调，且表达量与罗汉果皂苷Ⅱ的浓度呈现正相关。
可见，罗汉果皂苷具有上调肿瘤细胞p53和下调Bcl-2的作用，因此，罗汉果皂苷Ⅱ具有增加肿瘤细胞的放疗敏感性的潜力，可将其制备肿瘤放射增敏剂。
2、空白组、纯药物组、纯放射组、联合组(照射+药物)对肝癌细胞凋亡的影响
利用流式细胞技术检测罗汉果皂苷Ⅱ对肝癌细胞凋亡的影响。收集不同分组培养的细胞，用冷200μL PBS洗涤细胞两次，收集细胞；加入50μL的结合液(Binding Buffer)重悬细胞，加入2μL的Annexin V-FITC混匀，加入5μL PI混匀，避光、室温作用10min，进行流式细胞仪检测。其检测结果如图2所示。
从图2中可以看出，药物组、放射组均有明显抑制肿瘤细胞生长的作用；联合组的作用效果最好，肝癌细胞凋亡数目明显增加，说明罗汉果皂苷Ⅱ具有增敏的效果。
3、空白组、纯药物组、纯放射组、联合组(照射+药物)对肝癌细胞形态的影响
利用tunel染色观察照射组、药物组、联合组(照射+药物)对肝癌细胞形态的影响：用PBS洗涤细胞1次；用4％多聚甲醛固定细胞30分钟；用PBS洗涤1次；加入含0.1％TritonX-100的PBS，冰浴孵育2分钟，破膜；用PBS洗涤1次；用甲醇配制的0.3％过氧化氢溶液(0.3％H2O2in Methanol)中室温孵育20分钟，以灭活切片内源的过氧化物酶。随后用PBS洗涤3次；在样品上加50μl生物素标记液，37℃孵育60分钟；用PBS洗涤1次，滴加0.2ml标记反应终止液，室温孵育10分钟；用PBS洗涤3次；在样品上加50μl Streptavidin-HRP工作液，室温孵育30分钟；用PBS洗涤3次；滴加0.4ml DAB显色液，室温孵育15分钟；用PBS洗涤3次；用苏木素染色液进行细胞核染色。随后用PBS洗涤3次；直接显微镜进行观察。其结果如图3所示。
tunel染色后，正常癌细胞不发生着色；发生凋亡的癌细胞被着棕色，颜色变深，凋亡的肝癌细胞变小、核固缩。从图3中可以看出：纯药物组、纯放射组、联合组均有促进肝癌细胞凋亡的作用，其中联合组中肝癌细胞凋亡现象最为明显，肝癌细胞中细胞核染成了深棕色。这一结果也表明罗汉果皂苷Ⅱ具有放射增敏作用。
4、克隆形成实验
克隆形成实验测定细胞放射敏感性。稀释Hep-G2细胞至1×104/mL，加入96孔板，每孔100μL。分为纯照射组、联合组(药物+照射组)。照射前，药物+照射组中给要处理加入罗汉果皂苷Ⅱ(其在联合组中的浓度为10μmol/L)作用24h。然后，在室温下，采用6MV-X线单次照射，剂量分别为0Gy、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy，照射条件：6MV-X线，室温照射，照射野面积15cm×15cm，加1.5cm等效组织填充物。照射完毕后，更换培养液继续孵育2周后弃去各孔上清液，甲醛固定，Giemsa染色，倒置显微镜下计含50个以上细胞以上的克隆数，统计结果，计算细胞存活率。存活分数SF2＝(实验组平均OD值/空白对照组平均OD值)×100％，放射增敏比SER＝放射对照组SF/(药物组+放射组SF)。利用多靶单击模型SF＝1-(1-e-D/D0)N计算放射敏感性相关的参数D0、Dq、N、K。实验重复3次，取平均值，用prism 5软件进行曲线拟合以及计算相关放射生物学参数。
表1不同剂量射线照射后肝癌细胞存活分数
表2罗汉果皂苷Ⅱ对于Hep-G2放射敏感性的影响
不同处理 D0/Gy SF2/％ Dq/Gy N SER
照射组 2.32 58.01 1.20 1.68 --
联合组 1.68 39.23 0.55 1.38 1.48
实验数据表明用药组的D0、SF2、Dq以及N均明显低于单纯照射组。D0作为多靶学说重要参数，表示D0指一次放射杀灭63％细胞所需剂量，D0变小意味药物增加了细胞对射线的敏感性，加入药物后D0从2.32降至1.68，罗汉果皂苷Ⅱ增加了肝癌细胞对射线的敏感性；SF2可直接反映罗汉果皂苷Ⅱ对细胞敏感的影响，加入药物后SF2降低为39.23％，实验结果说明罗汉果皂苷Ⅱ对肝癌细胞具有增敏作用。Dq(准阈剂量)反映细胞亚致死性损伤的修复能力，Dq变小说明肝癌细胞亚致死性损伤修复能力降低。实验的结果显示罗汉果皂苷Ⅱ对Hep-G2肝癌细胞在辐射增敏实验中具有增敏效应。
实施例2
本实验例验证了CAS number为88901-36-4，分子式为C60H102O29的罗汉果皂苷Ⅴ对肺癌细胞的放射增敏效果。
1、罗汉果皂苷Ⅴ对肺癌细胞中P53、Bcl-2的影响
利用蛋白免疫实验Western Blot检测罗汉果皂苷Ⅴ对P53、Bcl-2的影响。
将Hep-G2细胞在不同浓度药(0μmol·L-1，10μmol·L-1，30μmol·L-1，60μmol·L-1)物培养24h后终止细胞培养，后吸除培养液，采用PBS(浓度为0.01mol L-1，pH 7.4)洗涤，加入含PMSF裂解液50μL/孔，置冰浴环境中裂解30min。后在14000r min-1的转速下离心10min，获得总蛋白。采用BCA比色法测蛋白浓度，取50μg总蛋白，经12％SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，电转移至PVDF膜，5％脱脂牛奶(含0.1％Tween 20)封闭lh，加抗体P53、Bcl-2以及β-actin，一抗4℃孵育过夜(β-actin作为上样量对照)；TBS-T洗膜3次，每次5min；加辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗，室温孵育1h，用漂洗液(TBS-T)洗膜3次，每次10min，加入ECL避光孵育5min，荧光影像分析仪显影，扫描、分析，检测检测P53、Bcl-2，β-actin蛋白表达水平，其结果如图4所示。
如图4所示，经过罗汉果皂苷Ⅴ处理的A549细胞的Bcl-2蛋白的表达明显下降，且Bcl-2蛋白的表达量与罗汉果皂苷Ⅴ的浓度呈现负相关，而P53蛋白表达明显上调，且表达量与罗汉果皂苷Ⅴ的浓度呈现正相关。
实施例中，罗汉果皂苷Ⅴ具有上调肿瘤细胞P53和下调Bcl-2的作用，因此，罗汉果皂苷具有增加肿瘤细胞的放疗敏感性的潜力，可将其用作制备肿瘤放射增敏剂。2、空白组、纯药物组、纯放射组、联合组(照射+药物)对肺癌细胞凋亡的影响
利用流式细胞技术检测罗汉果皂苷Ⅴ对肺癌细胞凋亡的影响。收集不同分组培养的细胞，用冷200μL PBS洗涤细胞两次，收集细胞；加入50μL的结合液(Binding Buffer)重悬细胞，加入2μL的Annexin V-FITC混匀，加入5μL PI混匀，避光、室温作用10min，进行流式细胞仪检测。其检测结果如图5所示。
从图5中可以看出，药物组、放射组均有明显抑制肿瘤细胞生长的作用；联合组的作用效果最好，肝癌细胞凋亡数目明显增加，说明罗汉果皂苷Ⅴ具有增敏的效果。
3、空白组、纯药物组、纯放射组、联合组(照射+药物)对肺细胞形态的影响
A549细胞分组培养后，吸出废液，每孔加入0.5mL固定液，固定25min，PBS洗2次，每次洗3min，加入Hoechst 33258染液，室温避光染色20min。使用荧光显微镜观察细胞形态变化。其检测结果如图6所示。
从图6中可以看出，空白组细胞核完整，着色均匀，荧光成弥散状，未出现细胞凋亡现象；药物组、放射组中，均出现部分呈颗粒状荧光状凋亡细胞，放射组的效果好于药物组；联合组中出现大量皱缩、凋亡的细胞，说明联合组对肺癌细胞具有强烈抑制作用。
4、克隆形成实验
克隆形成实验测定细胞放射敏感性。稀释A549细胞至1×104/mL，加入96孔板，每孔100μL。分为纯照射组、联合组(药物+照射组)。照射前，药物+照射组中给要处理加入罗汉果皂苷Ⅴ(其在联合组中的浓度为10μmol/L)作用24h。然后，在室温下，采用6MV-X线单次照射，剂量分别为0Gy、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy，照射条件：6MV-X线，室温照射，照射野面积15cm×15cm，加1.5cm等效组织填充物。照射完毕后，更换培养液继续孵育2周后弃去各孔上清液，甲醛固定，Giemsa染色，倒置显微镜下计含50个以上细胞以上的克隆数，统计结果，计算细胞存活率。存活分数SF2＝(实验组平均OD值/空白对照组平均OD值)×100％，放射增敏比SER＝放射对照组SF/(药物组+放射组SF)。利用多靶单击模型SF＝1-(1-e-D/D0)N计算放射敏感性相关的参数D0、Dq、N、K。实验重复3次，取平均值，用prism 5软件进行曲线拟合以及计算相关放射生物学参数。
表3不同剂量射线照射后肺癌细胞存活分数
表4罗汉果皂苷Ⅴ对于A549放射敏感性的影响
不同处理 D0/Gy SF2/％ Dq/Gy N SER
照射组 2.33 64.01 1.60 1.99 --
联合组 1.91 47.23 0.79 1.51 1.33
实验数据表明用药组的D0、SF2、Dq以及N均明显低于单纯照射组。D0作为多靶学说重要参数，表示D0指一次放射杀灭63％细胞所需剂量，D0变小意味药物增加了细胞对射线的敏感性，加入药物后D0从2.33降至1.91，罗汉果皂苷Ⅴ增加了肝癌细胞对射线的敏感性；SF2可直接反映罗汉果皂苷Ⅴ对细胞敏感的影响，加入药物后SF2降低为47.23％，实验结果说明罗汉果皂苷Ⅴ对肝癌细胞具有增敏作用。Dq(准阈剂量)反映细胞的亚致死性损伤的修复能力，变小说明肝癌细胞亚致死性损伤修复能力降低。实验的结果显示罗汉果皂苷Ⅴ对肺癌细胞株A549在辐射增敏实验中具有增敏效应。
实施例3
本实验例验证了CAS number89590-98-7，分子式为C66H112O34的罗汉果皂苷Ⅵ对宫颈癌Hela细胞的放射增敏效果。
克隆成形实验
克隆形成实验测定细胞放射敏感性。稀释Hela细胞至1×104/mL，加入96孔板，每孔100μL。分为纯照射组、联合组(药物+照射组)。照射前，药物+照射组中给要处理加入罗汉果皂苷Ⅵ(其在联合组中的浓度为10μmol/L)作用24h。然后，在室温下，采用6MV-X线单次照射，剂量分别为0Gy、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy，照射条件：6MV-X线，室温照射，照射野面积15cm×15cm，加1.5cm等效组织填充物。照射完毕后，更换培养液继续孵育2周后弃去各孔上清液，甲醛固定，Giemsa染色，倒置显微镜下计含50个以上细胞以上的克隆数，统计结果，计算细胞存活率。存活分数SF2＝(实验组平均OD值/空白对照组平均OD值)×100％，放射增敏比SER＝放射对照组SF/(药物组+放射组SF)。利用多靶单击模型SF＝1-(1-e-D/D0)N计算放射敏感性相关的参数D0、Dq、N、K。实验重复3次，取平均值，用prism 5软件进行曲线拟合以及计算相关放射生物学参数。
表5不同剂量射线照射后Hela细胞存活分数
表6罗汉果皂苷Ⅵ对于Hela放射敏感性的影响
不同处理 D0/Gy SF2/％ Dq/Gy N SER
照射组 4.01 82 3.31 2.29 --
联合组 3.57 75 2.23 1.87 1.09
实验数据表明用药组的D0、SF2、Dq以及N均低于单纯照射组。D0作为多靶学说重要参数，表示D0指一次放射杀灭63％细胞所需剂量，D0变小意味药物增加了细胞对射线的敏感性，加入药物后D0从4.01降至3.57，罗汉果皂苷Ⅵ增加了Hela细胞对射线的敏感性；SF2可直接反映罗汉果皂苷Ⅵ对细胞敏感的影响，加入药物后SF2降低，实验结果说明罗汉果皂苷Ⅵ对宫颈癌细胞具有增敏作用。Dq(准阈剂量)反映细胞的亚致死性损伤的修复能力，变小说明肝癌细胞亚致死性损伤修复能力降低。实验的结果显示罗汉果皂苷Ⅵ对宫颈癌癌细胞株Hela在辐射增敏实验中具有增敏效应。
应用例1
将罗汉果皂苷Ⅳ用以具有制备肿瘤放射增敏效果的口服片剂。
取罗汉果皂苷Ⅳ500g，加入适量的糊精混合均匀后再加入蒸馏水制得软材，用制粒机制得干燥颗粒，灭菌后采用压片机制得直径为1cm的半成品片剂，后放入紫外射线环境中照射15分钟灭菌即得口服片剂品，片剂每片皂苷Ⅳ含量为60mg。
入选条件：卡氏评分≥70；病理证实为非小细胞肺癌；临床分期：Ⅱ～Ⅲ期；无明显心、肺、肝、肾功能异常；将入院80例非小细胞肺癌患者随机分为两组，增敏组39例：在放疗第1天开始服用口服片剂，每次一片(每片中皂苷Ⅳ60mg)，每日3次，直至放疗结束。照射方法采用常规分割外放射治疗，均采用15MVX线照射，总剂量66～70Gy/33～35f，6～7周完成。对照组41例：单纯放疗，方法同增敏组。
表7增敏组与对照组近期放疗效果比较。
1)与对照组比较P<0.05
注：括号为百分比
结果表5所示，疗效评定标准,包括完全缓解(CR)、部分缓解(PR)、客观有效(CR+PR)，显示增敏组效果显著好于对照组，皂苷Ⅳ具有一定增敏效果。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (9)

1.罗汉果皂苷或其药学上可接受的盐在制备肿瘤放射增敏剂中的应用，其特征在于，所述罗汉果皂苷具有如下的结构通式：
式中，R和R1为葡萄糖残基，所述葡萄糖残基的化学结构包括
中的任意一种。
2.根据权利要求1所述的罗汉果皂苷或其药学上可接受的盐在制备肿瘤放射增敏剂中的应用，其特征在于，所述罗汉果皂苷为罗汉果皂苷Ⅴ，所述罗汉果皂苷Ⅴ的CAS number为88901-36-4，分子式为C60H102O29。
3.根据权利要求1所述的罗汉果皂苷或其药学上可接受的盐在制备肿瘤放射增敏剂中的应用，其特征在于，所述罗汉果皂苷为罗汉果皂苷Ⅵ，所述罗汉果皂苷Ⅵ的CAS number为89590-98-7，分子式为C66H112O34。
4.根据权利要求1所述的罗汉果皂苷或其药学上可接受的盐在制备肿瘤放射增敏剂中的应用，其特征在于，所述罗汉果皂苷为罗汉果皂苷Ⅲ，所述罗汉果皂苷Ⅲ的CAS number为130567-83-8，分子式为C48H82O19。
5.根据权利要求1所述的罗汉果皂苷或其药学上可接受的盐在制备肿瘤放射增敏剂中的应用，其特征在于，所述罗汉果皂苷为罗汉果皂苷Ⅱ，所述罗汉果皂苷Ⅱ的CAS number为88901-38-6，分子式为C42H72O14。
6.根据权利要求1所述的罗汉果皂苷或其药学上可接受的盐在制备肿瘤放射增敏剂中的应用，其特征在于，所述罗汉果皂苷为罗汉果皂苷Ⅳ，所述罗汉果皂苷Ⅳ的CAS number为89590-95-4，分子式为C54H92O24。
7.根据权利要求1-6任一项所述的罗汉果皂苷或其药学上可接受的盐在制备肿瘤放射增敏剂中的应用，其特征在于，所述放射增敏剂包括所述罗汉果皂苷和可接受的载体；
所述可接受的载体为一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，包括纤维素及其衍生物、明胶、固体润滑剂、硫酸钙、植物油、多元醇、乳化剂、润湿剂、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水中的一种或多种。
8.根据权利要求7所述的罗汉果皂苷或其药学上可接受的盐在制备肿瘤放射增敏剂中的应用，其特征在于，所述放射增敏剂为口服液体制剂、颗粒剂、片剂、冲剂、胶丸、胶囊、缓释剂、滴丸剂或口崩解剂中的任意一种。
9.根据权利要求1所述的罗汉果皂苷或其药学上可接受的盐在制备肿瘤放射增敏剂中的应用，其特征在于，所述肿瘤放射增敏剂在制备具有能够上调P53抑癌基因的表达和/或下调Bcl-2蛋白的表达的药物中的应用。
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