CN105601731A - 纯化牛跟腱胶原蛋白的方法及其海绵的制备 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及纯化胶原蛋白的方法，目的是通过采用新的方法充分粉碎牛跟腱，纯化胶原蛋白中用调节pH析出胶原法代替盐析、透析脱盐法，海绵成型工艺中不添加化学交联剂，简易工艺流程，提高胶原蛋白的提取率，达到高合格率的胶原蛋白海绵，以及采用所述的胶原蛋白制备止血海绵。
Description
技术领域
本发明涉及以简易工艺达到高合格率的胶原海绵的制备方法。
背景技术
胶原蛋白是脊椎动物体内含量最多、分布较广的蛋白质。纤维状胶原蛋白形成所有哺乳动物结缔组织的结构基础，也是构成许多组织尤其结缔组织的主要成分，约占机体总蛋白的25％。胶原蛋白独特的三股螺旋结构，赋予其良好的生物相容性、生物可降解性、无毒性使其在医药、生物组织工程等方面展现出极大潜力。
但是，市场上的胶原海绵的价格昂贵，柔韧性比较差，且用有潜在毒性的交联剂交联，其会严重影响海绵的生物相容性。一般的胶原蛋白海绵工艺复杂，工艺流程主要包括原料预处理--提取胶原蛋白--盐析--透析脱盐--交联--冷冻干燥。工艺流程中，一方面，在盐析过程中会引入氯离子杂质，需要采用透析进行脱盐纯化胶原过程中。由于透析袋的孔径比较小，大分子胶原溶液呈粘稠状，容易堵塞膜孔，限制胶原溶液中的小分子杂质如氯离子的排出，难以实现提高胶原的纯度目的。且透析耗时较长，操作比较麻烦，如中国发明专利公开说明书CN100444902C中用0.01％～0.1％醋酸作为透析外液透析2天，每天至少换液一次，再用磷酸氢二钠溶液透析至pH达到5以上。中国发明专利公开说明书CN101569759A用NaCl为透析外液透析，每4小时换一次透析液，透析5天。透析过程中由于杂质离子和水离子发生置换，引起透析袋的膨胀，导致膜孔变大，胶原溶液会部分析出透析袋，且透析袋会因过度膨胀而涨破，这些因素均会导致胶原溶液的损失，降低胶原的产率。若用水洗胶原代替透析法，需要重复多次水洗才能洗至加硝酸银没有出现沉淀(图1和图2)，此操作较繁琐，且在洗涤过程中部分胶原溶液随水洗液流失，同样降低胶原的提取率。在研究过程中，我们发现将胶原提取液调节至中性可析出大量胶原(图3)，而取其上清液盐析析出的胶原量很少，调节pH对胶原析出的影响程度远远大于盐析，故可选择直接调节pH而不盐析，减少水洗胶原的次数，进而简化工艺流程。
另一方面，若胶原溶液交联程度控制不好，会导致在去除交联剂过程中胶原海绵出现裂缝，且难以去除交联剂，如中国发明专利公开说明CN101005865A中胶原溶液与戊二醛交联，但是要从高亲水性胶原海绵中完全清除戊二醛比较困难，需要重复多次水洗至无戊二醛，该工艺不仅复杂，而且难以彻底清除戊二醛，残留的少量戊二醛对周围细胞有害，严重影响生物相容性，造成胶原蛋白海绵的合格率降低，市场价格昂贵。
为此，本研究重点在于充分粉碎牛跟腱以提高胶原提取率，不盐析直接调节pH来纯化胶原蛋白来简化工艺，避免使用有毒的化学交联剂来提高胶原蛋白的性能，简化工艺，降低成本，提高牛跟腱的经济价值。
发明内容
本发明鉴于上述现状，目的是提供简易工艺得到高纯度，其止血效果好，修复效果好，价格低的医用胶原蛋白海绵。
解决问题的技术方案
本发明涉及采用切片机和组织搅碎机依次充分绞碎速冻的牛跟腱，再用NaOH去除杂蛋白，异丙醇或乙醇脱脂，使产品的脂肪含量降到最低。
本发明涉及将提取的胶原溶液的pH调节至中性，使胶原充分析出来，代替盐析胶原的方法，避免引入氯离子，再采用直接水洗的方法纯化胶原蛋白。
本发明涉及不添加交联剂，冷冻干燥得到胶原海绵的制造方法。
本发明生产工艺简单，生产成本较低，具有广泛的推广价值。
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
具体实施方式
实施例1纯化胶原蛋白及其海绵制备的具体步骤如下：
1)用刀片将置于-20℃速冻的牛跟腱去除筋膜，肌肉和脂肪等杂质，用切片机切成0.3mm厚，再用搅碎机充分粉碎；
2)用稀碱溶液除去杂蛋白6～8小时，用蒸馏水洗至中性，再用醇类物质脱脂，用蒸馏水洗至中性且无异味；
3)溶解在pH2～3的稀酸溶液中；
4)向上述溶液中加入适量的胃蛋白酶，胶原蛋白与胃蛋白酶的重量比为25∶1，4℃下搅拌48小时；
5)将提取液离心，收集上清液，用10mol/L氢氧化钠将胶原溶液调至中性，收集得到的胶原沉淀，先加入0.5mol/L的醋酸溶解胶原沉淀，再加入胶原溶液两倍体积的超纯水充分搅拌水洗，离心取沉淀，继续加两倍体积的超纯水洗涤，如此重复操作，洗涤至胶原溶液为中性，即可得到高纯度的胶原蛋白。
6)将胶原溶液搅拌均匀，分装于培养皿中，在-20℃下预冻6小时，用冷冻干燥机冻干得到胶原海绵。
7)用Co60照射灭菌，包装，入库。
实施例2纯化胶原蛋白及其海绵制备的具体步骤如下：
1)用刀片将置于-20℃速冻的牛跟腱去除筋膜，肌肉和脂肪等杂质，用切片机切成0.3mm厚，再用搅碎机充分粉碎；
2)用稀碱溶液除去杂蛋白6～8小时，用蒸馏水洗至中性，再用醇类物质脱脂，用蒸馏水洗至中性且无异味；
3)溶解在pH2～3的稀酸溶液中；
4)向上述溶液中加入适量的胃蛋白酶，胶原蛋白与胃蛋白酶的重量比为50∶1，4℃下搅拌60小时；
5)将提取液离心，收集上清液，用10mol/L氢氧化钠将胶原溶液调至中性，收集得到的胶原沉淀，先加入0.5mol/L的醋酸溶解胶原沉淀，再加入胶原溶液两倍体积的超纯水充分搅拌水洗，离心取沉淀，继续加两倍体积的超纯水洗涤，如此重复操作，洗涤至胶原溶液为中性，即可得到高纯度的胶原蛋白。
6)将胶原溶液搅拌均匀，分装于培养皿中，在-20℃下预冻7小时，用冷冻干燥机冻干得到胶原海绵。
7)用Co60照射灭菌，包装，入库。
实施例3纯化胶原蛋白及其海绵制备的具体步骤如下：
1)用刀片将置于-20℃速冻的牛跟腱去除筋膜，肌肉和脂肪等杂质，用切片机切成0.3mm厚，再用搅碎机充分粉碎；
2)用稀碱溶液除去杂蛋白6～8小时，用蒸馏水洗至中性，再用醇类物质脱脂，用蒸馏水洗至中性且无异味；
3)溶解在pH2～3的稀酸溶液中；
4)向上述溶液中加入适量的胃蛋白酶，胶原蛋白与胃蛋白酶的重量比为100∶1，4℃下搅拌72小时；
5)将提取液离心，收集上清液，用10mol/L氢氧化钠将胶原溶液调至中性，收集得到的胶原沉淀，先加入0.5mol/L的醋酸溶解胶原沉淀，再加入胶原溶液两倍体积的超纯水充分搅拌水洗，离心取沉淀，继续加两倍体积的超纯水洗涤，如此重复操作，洗涤至胶原溶液为中性，即可得到高纯度的胶原蛋白。
6)将胶原溶液搅拌均匀，分装于培养皿中，在-20℃下预冻8小时，用冷冻干燥机冻干得到胶原海绵。
7)用Co60照射灭菌，包装，入库。
本发明通过对牛跟腱的预处理，加酶量，提取时间，胶原溶液预冻时间的工艺参数的控制，得到的胶原蛋白通过紫外扫描表明牛跟腱胶原蛋白在235nm处有明显的吸收峰，与I型胶原蛋白的特征性吸收峰基本重叠，可判定提取的为I型胶原蛋白(图4)。另外，I型胶原蛋白为由三条多肽链互相缠绕形成的三螺旋结构，包括α1(2条)、α2(1条)链两种。SDS-PAGE凝胶电泳图中的胶原蛋白条带电泳迁移的位置与I型胶原蛋白标准品相同，表明提取的胶原蛋白提取物符合I型胶原蛋白特征，此外SDS-PAGE电泳图上几乎无杂带，表明提取物的纯度比较高(图5)。未交联的胶原蛋白溶液冷冻干燥后，形成疏松多孔的海绵结构，其色泽洁白并带有一定的韧性(图6和图7)。
附图说明
图1是加硝酸银检测胶原溶液中氯离子浓度的脱盐工艺图；图2是胶原蛋白水洗液的紫外扫描图；图3是胶原等电点析出图；图4是牛跟腱胶原蛋白紫外扫描图(A：I型胶原蛋白标准品；B：牛跟腱胶原蛋白)；图5是牛跟腱胶原蛋白的SDS-PAGE电泳图谱图；图6是胶原海绵表面形貌图；图7是胶原海绵受力后形貌图。
Claims (4)
1.纯化牛跟腱胶原蛋白的方法，包括以下步骤：
1)用刀片将置于-20℃速冻的牛跟腱去除筋膜，肌肉和脂肪等杂质，用切片机切成0.3mm厚，再用组织搅碎机充分粉碎；
2)用稀碱溶液除去杂蛋白6～8小时，用蒸馏水洗至中性，再用醇类物质脱脂，用蒸馏水洗至中性且无异味；
3)溶解在pH2～3的稀酸溶液中；
4)向上述溶液中加入适量的胃蛋白酶，4℃下搅拌48～72小时；
5)将提取液离心，收集上清液，用10mol/L氢氧化钠将胶原溶液调至中性，收集得到的胶原沉淀，先加入0.5mol/L的醋酸溶解胶原沉淀，再加入胶原溶液两倍体积的超纯水充分搅拌水洗，离心取沉淀，继续加两倍体积的超纯水洗涤，如此重复操作，洗涤至胶原溶液为中性，即可得到高纯度的胶原蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)采用切片机将牛跟腱切成薄片，再用组织搅碎机充分绞碎，可保证牛跟腱在提取过程中与酸溶液充分接触，提高胶原蛋白的提取率；所述步骤2)中的稀碱溶液为0.1mol/L～0.2mol/L的氢氧化钠或碳酸钠溶液，醇类为10％～12％的异丙醇或70％～75％的乙醇溶液；所述步骤3)中的稀酸为1％～3％的醋酸溶液；所述步骤4)牛跟腱与胃蛋白酶的重量比为(50～100)∶1；所述步骤5)中主要利用透析的小分子经过半透膜扩散到透析外液中，将胶原溶液中的小分子杂质与胶原蛋白大分子分开的原理，以阶梯式稀释胶原溶液中醋酸的浓度的水洗方法，来代替使用透析袋透析溶液的方法。
3.医用胶原海绵的制备方法，包括以下步骤：
1)用刀片将置于-20℃速冻的牛跟腱去除筋膜，肌肉和脂肪等杂质，用切片机切成0.3mm厚，再用搅碎机充分粉碎；
2)用稀碱溶液除去杂蛋白6～8小时，用蒸馏水洗至中性，再用醇类物质脱脂，用蒸馏水洗至中性且无异味；
3)溶解在pH2～3的稀酸溶液中；
4)向上述溶液中加入胃蛋白酶，4℃搅拌48～72小时；
5)将提取液离心，收集上清液，用10mol/L氢氧化钠将胶原提取液调至中性，收集得到的胶原沉淀，先加入0.5mol/L的醋酸溶解胶原沉淀，再加入胶原溶液两倍体积的超纯水充分搅拌水洗，离心取沉淀，继续加两倍体积的超纯水洗涤，如此重复操作，洗涤至胶原溶液为中性，即可得到高纯度的胶原蛋白；
6)将胶原溶液搅拌均匀，分装于培养皿中，在-20℃下预冻6～8小时，用冷冻干燥机冻干得到胶原海绵状材料。
7)用Co60照射灭菌，包装，入库。
4.根据权利要求3所述的制备胶原蛋白海绵的方法，其特征在于，胶原海绵中不含有化学交联剂，采用物理交联法Co60照射灭菌，包装，入库。
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