CN106032546A

CN106032546A - 从鱼鳞中提取医用材料基胶原蛋白的方法

Info

Publication number: CN106032546A
Application number: CN201510118864.8A
Authority: CN
Inventors: 何兰; 王南平; 郭休玉
Original assignee: Shanghai Fisheries Research Institute
Current assignee: Shanghai Fisheries Research Institute
Priority date: 2015-03-18
Filing date: 2015-03-18
Publication date: 2016-10-19

Abstract

本发明提出了一种从鱼鳞中提取医用材料基胶原蛋白的方法，包括：(1)清洗鱼鳞；使用脱色剂和双氧水脱色所述鱼鳞；清洗脱色后的所述鱼鳞；(2)将鱼鳞放入乙二胺四乙酸溶液中，搅拌，每10-15小时换一次乙二胺四乙酸溶液，沥去水；(3)对鱼鳞进行搅拌清洗；(4)将鱼鳞放入醋酸溶液中，再加入蛋白酶进行酶解提胶；离心，取上清液；(5)将上清液加入饱和的NaCl或(NH₄)₂SO₄溶液，静置后离心，取沉淀粗胶原；透析纯化；(6)冷冻干燥。本发明制备的胶原蛋白可以更好的保持胶原的天然结构，对鱼鳞进行脱色前处理，去除鱼鳞表面黑色素，改善胶原色泽；提高胶原纯度；酶促提取胶原提高胶原成品率。

Description

从鱼鳞中提取医用材料基胶原蛋白的方法

技术领域

本发明涉及生物医用材料制备领域，特别是指一种从鱼鳞中提取医用材料基胶原蛋白的方法。

背景技术

胶原是动物体内含量最丰富的重要结构性蛋白，广泛分布于从水生动物到脊椎动物所有多细胞动物的皮肤、骨骼、软骨、牙齿、肌腱、韧带、血管中，是支持组织和结缔组织的主要组成成分，约占机体总蛋白的25％。在动物体内起支撑器官、保护机体、连接、营养等多种功能。胶原蛋白具有独特的结构和功能特征：由3条α多肽链通过α螺旋形成三股螺旋的超螺旋结构；遗传性不同的α多肽链构成18种不同结构的胶原蛋白；有10％左右的羟脯氨酸；分子间的相互交联使之具有很高的强度。胶原蛋白还具有低抗原活性、低刺激性以及促进细胞生长等生物化学性能，是一种理想的生物医用材料：可以应用于止血敷料、充填材料以及支架等方面；另外，胶原蛋白与其它材料之间的兼容性，也使它可以与其它材料复合使用，如与羟磷灰石复合作骨修补，与透明质酸、壳聚糖或者海藻酸等复合作组合工程的支架和药物控释系统。

天然高分子胶原来源广泛，可以从陆生动物如猪、牛的皮、骨、腱等部位获取。也可以从水生动物中如鱼皮鳞中获取。由于陆生生物安全性问题日益受到人们的关注，很多国家和地区都限制了陆生生物来源胶原蛋白制品的使用范围，而水生生物的皮、骨、鳍等含丰富的胶原蛋白,被国内外学者认为是安全的胶原蛋白来源。

鱼鳞是鱼皮的变形物，是鱼体与外界接触的边缘组织，占鱼体重量的5％左右，鱼鳞在构造上近似于陆栖动物的骨骼组成，成分和骨骼相似，但是鱼鳞中的无机盐类含量较动物骨骼中无机盐类的含量要少得多。鱼鳞中含有50％以上的胶原蛋白，且为单一的I型胶原蛋白，是制备生物医用材料的优质材料。

鱼鳞在水产品加工过程中往往作为废弃资源处理，未能得到很好的充分的利用，既污染环境又浪费资源。现有一些采用鱼鳞为原料来制备胶原蛋白的方法，但是这些方法一般用强碱等化学试剂进行前处理，影响胶原的三维结构。

有鉴于此，一种能够保持胶原蛋白的天然结构，并且使鱼鳞废物再利用提取方法的出现就很有必要了。

发明内容

本发明提出一种从鱼鳞中提取医用材料基胶原蛋白的方法，解决了现有技术中从鱼鳞中提取胶原蛋白却无法保持胶原蛋白的天然结构的问题。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种从鱼鳞中提取医用材料基胶原蛋白的方法，包括：

(1)清洗鱼鳞；使用脱色剂和双氧水脱色所述鱼鳞；清洗脱色后的所述鱼鳞；

(2)将经过步骤(1)处理后的鱼鳞放入乙二胺四乙酸溶液(EDTA溶液)中，搅拌，每10-15小时换一次乙二胺四乙酸溶液，沥去水；

(3)对经过步骤(2)处理后的鱼鳞进行搅拌清洗；

(4)将经过步骤(3)处理后的鱼鳞放入醋酸溶液中，再加入蛋白酶进行酶解提胶；之后离心，取上清液；

(5)将所述上清液加入饱和的NaCl或(NH₄)₂SO₄溶液，直至胶液中的盐含量达到4％～6％后，静置后离心，取沉淀粗胶原；将所述粗胶原蛋白再次溶解在醋酸溶液或纯水中，进行透析纯化，每8～12小时换透析外液一次，重复4～6次；

(6)收集步骤(5)的透析液进行冷冻干燥处理，获得水分≤12％的活性胶原蛋白干品。

作为优选的技术方案，所述步骤(1)-(5)的温度条件为0-4℃。

作为优选的技术方案，所述步骤(1)中的鱼鳞为新鲜或冷冻的鱼鳞；其中鱼鳞为罗非鱼鱼鳞、青鱼鱼鳞、草鱼鱼鳞、鲢鱼鱼鳞、鳙鱼鱼鳞等淡水鱼鳞以及黄鱼鱼鳞，鲷鱼鱼鳞等海水鱼鱼鳞。

作为优选的技术方案，所述步骤(1)脱色剂为质量百分比为5％-10％过硫酸铵、40％-50％过硫酸钾、5％-15％过硫酸钠、5％-15％二氧化硅、1％-5％EDTA、5％-15％过碳酸钠和1％-10％偏硅酸钠；其中鱼鳞与所述脱色剂的添加比例为1:2-5。

作为优选的技术方案，所述步骤(2)鱼鳞与乙二胺四乙酸溶液的料液比为1:10-30(w/w)。

作为优选的技术方案，所述步骤(3)鱼鳞与醋酸溶液的料液比为1:10-30(w/w)。

作为优选的技术方案，所述步骤(3)蛋白酶为胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶或菠萝蛋白酶。

作为优选的技术方案，所述步骤(3)将离心的沉淀再次加入醋酸溶液中，料液比为1:10-30(w/w)，捣碎，加入蛋白酶搅拌，在3-6℃条件下离心，取上清液；该步骤重复1-2次。

有益效果

(1)本发明的提取方法，回避采用高强度的化学试剂和机械粉碎等方法，制备的胶原蛋白可以更好的保持胶原的天然结构。另外，本发明对鱼鳞进行脱色前处理，这有别于之前的技术，去除鱼鳞表面黑色素，改善胶原色泽，提高胶原纯度；酶促提取胶原提高胶原成品率，成品率≥10％。

(2)本发明工艺流程用时短，操作简单，适宜工业化推广。

(3)本发明制备得到的胶原蛋白纯度≥95％，胶原三螺旋结构保持完整，生物相容性好，符合生物医用材料要求。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施方案或现有技术中的技术方案，下面将对实施方案或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施方案，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明一种鱼鳞胶原蛋白SDS-PAGE图谱；1-样品条带1；2-样品条带2；3-样品条带3；4-样品条带4；其中样品条带1为γ三聚体含量3.53％，样品条带2为β二聚体含量51.21％，样品条带3为α₂含量33.47％，样品条带4为α₁含量10.12％。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

取新鲜罗非鱼鳞100g，用20倍4℃清水漂洗30min，并重复一次，沥去水。

将鱼鳞放入200g含有5％过硫酸铵，50％过硫酸钾，10％过硫酸钠，10％二氧化硅，1％EDTA，15％过碳酸钠，9％偏硅酸钠的脱色剂中，再加入2％双氧水，搅拌均匀，4℃浸渍24hr。

用去离子水4℃1:20(w/w)清洗4次，每次30min，沥去水。

将鱼鳞放入4℃0.5mol/LEDTA溶液中，料液比1:30(w/w)，搅拌48hr，每12hr换液一次，沥去水。

用去离子水4℃(1:30，w/w)清洗4次，每次1hr，沥去水。

将洗净的鱼鳞放入4℃0.5mol/L的醋酸溶液中，料液比1:30(w/w)，加入0.2％胃蛋白酶，酶解提胶24hr。

在4℃条件下用10000rpm离心，取上清液。

将沉淀再次放入4℃0.5mol/L的醋酸溶液中，料液比1:20(w/w)，用组织捣碎机捣碎，加入0.2％的胃蛋白酶，搅拌24hr，在4℃条件下用10000rpm离心，取上清液。

合并2次上清液，加入30％的NaCl溶液盐析，使料液中NaCl终浓度为5％，沉淀静置。

将盐析溶液在4℃条件下离心，转速为10000rpm，收集沉淀的粗胶原。

将粗胶原以1:5(w/w)比例放入4℃纯水中溶解，以1:20(w/w)纯水为透析外液，半透膜截留分子量100KDa进行透析，在4℃条件下透析处理72hr，每12hr更换一次透析外液，获得纯化胶原溶液。

收集透析液放入-60℃低温冷冻干燥机冻干至水分12％以下，获得胶原蛋白干品。

上述制备的胶原蛋白中胶原蛋白纯度≥95％。

实施例2

取冷冻草鱼鳞200g，用20倍4℃清水漂洗30min，并重复一次，沥干。

将鱼鳞放入200g含有8％过硫酸铵，45％过硫酸钾，10％过硫酸钠，12％二氧化硅，2％EDTA，15％过碳酸钠，8％偏硅酸钠的脱色剂中，再加入2％双氧水，搅拌均匀，4℃浸渍24hr。

用去离子水4℃1:20(w/w)清洗4次，每次30min，沥去水。

用去离子水4℃(1:30w/w)清洗4次，每次1hr，沥去水。

将洗净的鱼鳞放入4℃0.5mol/L的醋酸溶液中，料液比1:30(w/w)，加入0.4％胰蛋白酶，酶解提胶24hr。

在4℃条件下用15000rpm离心，取上清液。

将沉淀再次放入4℃0.5mol/L的醋酸溶液中，料液比1:20(w/w)，用组织捣碎机捣碎，加入0.4％的胰蛋白酶，搅拌24hr，在4℃条件下用15000rpm离心，取上清液。

再次将沉淀放入4℃0.5mol/L的醋酸溶液中，料液比1:10，加入0.4％的胰蛋白酶，搅拌12hr，在4℃条件下用15000rpm离心，取上清液。

合并3次上清液，加入30％的(NH₄)₂SO₄溶液盐析使滤液中终浓度为5％，沉淀静置。

将盐析溶液在4℃条件下低温离心，转速为10000rpm，收集沉淀的粗胶原蛋白。

将粗胶原以1:4(w/w)比例放入0.5mol/L醋酸溶液中再次溶解，以1:20(w/w)磷酸盐缓冲液(81％Na₂HPO₄0.2mol/L,19％NaH₂PO₄0.2mol/L)为透析外液，半透膜截留分子量100KDa进行透析，在4℃条件下透析处理72hr，每12hr更换一次透析外液。

收集透析外液放入-60℃低温冷冻干燥机冻干至水分12％以下，获得胶原蛋白干品。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种从鱼鳞中提取医用材料基胶原蛋白的方法，包括：

(2)将经过步骤(1)处理后的鱼鳞放入乙二胺四乙酸溶液中，搅拌，每10-15小时换一次乙二胺四乙酸溶液，沥去水；

(3)对经过步骤(2)处理后的鱼鳞进行搅拌清洗；

(6)收集步骤(5)的透析液用进行冷冻干燥处理，获得水分≤12％的活性胶原蛋白干品。

2.根据权利要求1所述的一种从鱼鳞中提取医用材料基胶原蛋白的方法，其特征在于，所述步骤(1)-(5)的温度条件为0-4℃。

3.根据权利要求1所述的一种从鱼鳞中提取医用材料基胶原蛋白的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的鱼鳞为新鲜或冷冻的鱼鳞；其中鱼鳞为淡水鱼鳞或海水鱼鳞。

4.根据权利要求3所述的一种从鱼鳞中提取医用材料基胶原蛋白的方法，其特征在于，所述淡水鱼鳞为罗非鱼鱼鳞、青鱼鱼鳞、草鱼鱼鳞或鲢鱼鱼鳞、鳙鱼鱼鳞；所述海水鱼鳞为黄鱼鱼鳞或鲷鱼鱼鳞。

5.根据权利要求1所述的一种从鱼鳞中提取医用材料基胶原蛋白的方法，其特征在于，所述步骤(1)脱色剂为质量百分比为5％-10％过硫酸铵、40％-50％过硫酸钾、5％-15％过硫酸钠、5％-15％二氧化硅、1％-5％EDTA、5％-15％过碳酸钠和1％-10％偏硅酸钠；其中鱼鳞与所述脱色剂的添加比例为1:2-5。

6.根据权利要求1所述的一种从鱼鳞中提取医用材料基胶原蛋白的方法，其特征在于，所述步骤(2)鱼鳞与乙二胺四乙酸溶液的料液比为1:10-30(w/w)。

7.根据权利要求1所述的一种从鱼鳞中提取医用材料基胶原蛋白的方法，其特征在于，所述步骤(3)鱼鳞与醋酸溶液的料液比为1:10-30(w/w)。

8.根据权利要求1所述的一种从鱼鳞中提取医用材料基胶原蛋白的方法，其特征在于，所述步骤(3)蛋白酶为胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶或菠萝蛋白酶。

9.根据权利要求1所述的一种从鱼鳞中提取医用材料基胶原蛋白的方法，其特征在于，所述步骤(3)将离心的沉淀再次加入醋酸溶液中，料液比为1:10-30(w/w)，捣碎，加入蛋白酶搅拌，在3-6℃条件下离心，取上清液；该步骤重复1-2次。