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CN105518027A - 使用抗lgr5抗体的方法 - Google Patents

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CN105518027A
CN105518027A CN201480049447.6A CN201480049447A CN105518027A CN 105518027 A CN105518027 A CN 105518027A CN 201480049447 A CN201480049447 A CN 201480049447A CN 105518027 A CN105518027 A CN 105518027A
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CN
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antibody
lgr5
seq
amino acid
hedgehog
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CN201480049447.6A
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F·J·德索瓦热
B·比斯
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F Hoffmann La Roche AG
Original Assignee
F Hoffmann La Roche AG
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Abstract

本文中提供的是使用抗LGR5抗体的方法，例如用于治疗Hedgehog相关疾病，包括基底细胞癌。

Description

使用抗LGR5抗体的方法
对相关申请的交叉引用
本申请依据35U.S.C.§119要求2013年9月17日提交的美国申请No.61/879,089的权益，据此通过援引完整收录其内容。
序列表
本申请含有序列表，其已经经由EFS-Web提交，并且据此通过援引而完整收录。2014年9月3日创建的所述ASCII拷贝命名为P5706R1-WO_SequenceListing.txt，并且大小为51,391个字节。
发明领域
本文中提供的是使用抗LGR5抗体的方法，例如用于治疗Hedgehog相关疾病。
发明背景
癌症生物学中正在兴起的话题之一是癌症亚型的继续肿瘤生长对某些信号传导途径的依赖性。例如，激活Hedgehog(Hh)信号传导途径的突变驱动多种癌症的生长，包括基底细胞癌(BCC)和髓母细胞瘤，以及胰腺癌，前列腺癌，和小细胞肺癌，它们占所有人癌症死亡的多至25％(Epstein,Nat.Rev.Cancer8:743-754(2008))。BCC是世界上最流行的癌症，接近半数的所有美国公民有可能在退休之前发生这种癌症(NCI2010)。二十年鉴定Hh途径成分和它们的功能性作用的广泛研究最近达到顶点，即FDA批准Hh途径拮抗剂Vismodegib用于治疗局部晚期或转移性BCC。虽然Vismodegib是有效的，但是并非所有肿瘤细胞对该药物敏感且可发生进一步抗性。
人LGR5是一种907个氨基酸的蛋白质，其中约540个氨基酸据预测在切割氨基端信号序列后在胞外空间中。LGR5包含外域中的17个不完美富亮氨酸重复基序，和一个位于富亮氨酸区和第一跨膜域之间的半胱氨酸富含区。
发明概述
本文中提供的是使用抗LGR5抗体的方法。例如，本文中提供的是在个体中治疗Hedgehog相关疾病的方法，其包括对该个体施用有效量的抗LGR5抗体。例如，本文中提供的是在个体中治疗基底细胞癌的方法，其包括对该个体施用有效量的本文所述抗LGR5抗体。
本文中还提供的是在个体中治疗Hedgehog相关疾病的方法，其包括对该个体施用有效量的抗LGR5抗体和有效量的Hedgehog途径抑制剂。例如，其中与Hedgehog途径抑制剂单独的治疗相比，所述抗LGR5抗体和所述Hedgehog途径抑制剂各自的量有效延长治疗响应时段和/或延迟复发和/或抗性发生。
本文中提供的是在个体中提高包含Hedgehog途径抑制剂的Hedgehog相关疾病治疗的功效的方法，其中该方法包括对该个体施用有效量的抗LGR5抗体和有效量的该Hedgehog途径抑制剂。
本文中进一步提供的是在个体中治疗Hedgehog相关疾病的方法，其中该治疗包括对该个体施用有效量的抗LGR5抗体和有效量的Hedgehog途径抑制剂，且其中该治疗具有与包括在没有该抗LGR5抗体的情况下(在该抗LGR5抗体缺失下)施用有效量的该Hedgehog途径抑制剂的标准治疗相比升高的功效。
本文中还提供的是在个体中延迟和/或阻止Hedgehog相关疾病复发和/或Hedgehog相关疾病对Hedgehog途径抑制剂的抗性发生的方法，其包括对该个体施用有效量的抗LGR5抗体和有效量的该Hedgehog途径抑制剂。本文中还提供的是在具有Hedgehog相关疾病的个体中延长对Hedgehog途径抑制剂的敏感性时段的的方法，其包括对该个体施用有效量的抗LGR5抗体和有效量的该Hedgehog途径抑制剂。本文中提供的是在具有Hedgehog相关疾病的个体中延长对Hedgehog途径抑制剂的响应持续时间的方法，其包括对该个体施用有效量的抗LGR5抗体和有效量的该Hedgehog途径抑制剂。
本文中提供的是在具有Hedgehog相关疾病的个体中提高对Hedgehog途径抑制剂的敏感性的方法，其包括对该个体施用有效量的抗LGR5抗体和有效量的该Hedgehog途径抑制剂。
在任何方法的一些实施方案中，所述抗LGR5抗体结合SEQIDNO：67氨基酸22-323内或SEQIDNO：67氨基酸22-123内的表位且以≤5nM的亲和力结合LGR5。在一些实施方案中，所述抗LGR5抗体为单克隆抗体。在一些实施方案中，所述抗LGR5抗体为人，人源化，或嵌合抗体。在一些实施方案中，所述抗LGR5抗体为结合SEQIDNO：67的人LGR5的抗体片段。在一些实施方案中，所述抗LGR5抗体并不显著抑制wnt途径信号传导。
在任何方法的一些实施方案中，所述抗LGR5抗体包含：a)包含SEQIDNO：30的氨基酸序列的HVR-H1，包含SEQIDNO：31的氨基酸序列的HVR-H2，和包含SEQIDNO：32的氨基酸序列的HVR-H3；和b)包含SEQIDNO：27的氨基酸序列的HVR-L1，包含SEQIDNO：28的氨基酸序列的HVR-L2，和包含SEQIDNO：29的氨基酸序列的HVR-L3。
在任何方法的一些实施方案中，所述抗LGR5抗体包含：a)包含SEQIDNO：60的氨基酸序列的HVR-H1，包含SEQIDNO：61的氨基酸序列的HVR-H2，和包含SEQIDNO：62的氨基酸序列的HVR-H3；和b)包含SEQIDNO：57的氨基酸序列的HVR-L1，包含SEQIDNO：58的氨基酸序列的HVR-L2，和包含SEQIDNO：59的氨基酸序列的HVR-L3。
在任何方法的一些实施方案中，其中所述抗LGR5抗体包含：a)SEQIDNO：6的VH序列和SEQIDNO：5的VL序列；b)SEQIDNO：8的VH序列和SEQIDNO：7的VL序列；c)SEQIDNO：10的VH序列和SEQIDNO：9的VL序列；d)SEQIDNO：12的VH序列和SEQIDNO：11的VL序列；e)SEQIDNO：14的VH序列和SEQIDNO：13的VL序列；f)SEQIDNO：16的VH序列和SEQIDNO：15的VL序列；g)SEQIDNO：18的VH序列和SEQIDNO：17的VL序列；h)SEQIDNO：20的VH序列和SEQIDNO：19的VL序列；或i)SEQIDNO：26的VH序列和SEQIDNO：25的VL序列。
在任何方法的一些实施方案中，所述抗LGR5抗体是与细胞毒剂缀合的。在一些实施方案中，所述抗LGR5抗体具有式Ab-(L-D)p，其中：(a)Ab为所述抗LGR5抗体；(b)L为接头；(c)D为选自美登木素生物碱(maytansinoid)，奥瑞司他汀(auristatin)，加利车霉素(calicheamicin)，吡咯并苯并二氮卓(pyrrolobenzodiazepine)，和奈莫柔比星(nemorubicin)衍生物的药物；且(d)p的范围为1-8。
在一些实施方案中，D为奥瑞司他汀。在一些实施方案中，D具有式DE
且其中R2和R6各自为甲基；R3和R4各自为异丙基；R5为H；R7为仲丁基；每一个R8独立选自CH3，O-CH3，OH，和H；R9为H；且R18为-C(R8)2-C(R8)2-芳基。在一些实施方案中，所述药物为MMAE。在一些实施方案中，D为式A的吡咯并苯并二氮卓：
其中虚线表示C1与C2或C2与C3之间任选存在双键；R2独立选自H，OH，＝O，＝CH2，CN，R，OR，＝CH-RD，＝C(RD)2，O-SO2-R，CO2R和COR，且任选还选自卤素或二卤素，其中RD独立选自R，CO2R，COR，CHO，CO2H，和卤素；R6和R9独立选自H，R，OH，OR，SH，SR，NH2，NHR，NRR’，NO2，Me3Sn和卤素；R7独立选自H，R，OH，OR，SH，SR，NH2，NHR，NRR’，NO2，Me3Sn和卤素；Q独立选自O，S和NH；R11为H，或R，或在Q为O的情况下，SO3M，其中M为金属阳离子；R和R’各自独立选自任选取代的C1-8烃基，C3-8杂环基和C5-20芳基基团，且任选涉及基团NRR’时，R和R’与它们所附着的氮原子一起形成任选取代的4，5，6或7元杂环环；R12，R16，R19和R17分别如为R2，R6，R9和R7定义的；R”为C3-12亚烃基基团，该链可以由一个或多个杂原子和/或任选取代的芳香环中断；且X和X’独立选自O，S和N(H)。在一些实施方案中，D具有结构：
其中n为0或1。在一些实施方案中，D具有选自下示的结构：
其中RE和RE”各自独立选自H或RD，其中RD独立选自R，CO2R，COR，CHO，CO2H，和卤素；其中Ar1和Ar2各自独立为任选取代的C5-20芳基；且其中n为0或1。在一些实施方案中，D为式B的吡咯并苯并二氮卓：
其中水平波形线指示共价附着至接头的位点；RV1和RV2独立选自H，甲基，乙基，苯基，氟取代的苯基，和C5-6杂环基；且n为0或1。在一些实施方案中，D为奈莫柔比星衍生物。在一些实施方案中，D具有选自下示的结构：
在任何方法的一些实施方案中，所述接头是蛋白酶可切割的。在一些实施方案中，所述接头包含val-cit二肽或Phe-Lys二肽。在任何方法的一些实施方案中，所述接头是酸不稳定的。在一些实施方案中，所述接头包含腙。
在任何方法的一些实施方案中，所述抗LGR5抗体具有式：
其中S为硫原子。
在任何方法的一些实施方案中，所述抗LGR5抗体具有式：
在任何方法的一些实施方案中，所述抗LGR5抗体具有选自下组的式：
在任何方法的一些实施方案中，p的范围为2-5。
在任何方法的一些实施方案中，所述Hedgehog途径抑制剂为Smoothened的拮抗剂。在任何方法的一些实施方案中，所述Hedgehog途径抑制剂为Smoothened的环杷明竞争性拮抗剂。在一些实施方案中，所述Smoothened的拮抗剂为2-氯-N-[4-氯-3-(吡啶-2-基)苯基]-4-(甲基磺酰基)苯甲酰胺或其盐。在一些实施方案中，所述Smoothened的拮抗剂为2-氯-N-[4-氯-3-(吡啶-2-基)苯基]-4-(甲基磺酰基)苯甲酰胺。在一些实施方案中，所述Smoothened的拮抗剂为Vismodegib。
在任何方法的一些实施方案中，所述Hedgehog相关疾病为癌症。在一些实施方案中，所述癌症为基底细胞癌。在一些实施方案中，所述基底细胞癌为局部晚期或转移性基底细胞癌。在一些实施方案中，所述癌症为髓母细胞瘤。在一些实施方案中，所述Hedgehog相关疾病是LGR5阳性的。
在任何方法的一些实施方案中，所述Hedgehog途径抑制剂与所述抗LGR5抗体伴随施用。在一些实施方案中，所述Hedgehog途径抑制剂与所述抗LGR5抗体分开，序贯，或同时施用。
附图简述
本专利或申请文件含有至少一幅着色的附图。此专利或专利申请公开文本及彩色附图的拷贝会在请求和支付必要费用后由专利局提供。
图1显示与对照小鼠(A-B)相比，在K14-CreER；Ptch1fl/fl；p53fl/fl小鼠(C-D)中观察到的广泛的基底细胞癌。
图2显示与未处理对照K14-CreER；Ptch1fl/fl；p53fl/fl小鼠(A)相比，用GDC-0449(Vismodegib)处理后K14-CreER；Ptch1fl/fl；p53fl/fl小鼠(B)中的广泛的肿瘤消退。用75mg/kgGDC-0449poBID处理56天后在动物K14-CreER；Ptch1fl/fl；p53fl/fl小鼠中仍然观察到残留疾病，如(C-D)中所示。
图3显示(A)未处理对照K14-CreER；Ptch1fl/fl；p53fl/fl小鼠中的Lgr5表达，和(B)用75mg/kgGDC-0449poBID处理28天后K14-CreER；Ptch1fl/fl；p53fl/fl小鼠中的Lgr5表达。(C-D)显示对照(5d盐水)(C)和DT处理(5d)(D)中K14-CreER；Ptch1fl/fl；p53fl/fl；Lgr5DTR.EGFP小鼠中DTR介导的消融的影响。DAPI为蓝色，GFP为绿色，而凋亡标志物CC3以红色显示。
图4。(A-B)显示用75mg/kgGDC-0449poBID处理38天后K14-CreER；Ptch1fl/fl；p53fl/fl；Lgr5DTR.EGFP小鼠中的肿瘤消退。(C-F)显示用75mg/kgGDC-0449poBID处理28天继以用75mg/kgGDC-0449poBID+DT处理8天后K14-CreER；Ptch1fl/fl；p53fl/fl；Lgr5DTR.EGFP小鼠中增强的肿瘤消退。(G-H)显示用75mg/kgGDC-0449poBID处理28天继以用75mg/kgGDC-0449poBID+DT处理8天显著降低/消除K14-CreER；Ptch1fl/fl；p53fl/fl；Lgr5DTR.EGFP中的残留浅表基底细胞癌。DAPIDNA染色为蓝色。(G)角蛋白5染色为红色。(H)凋亡标志物CC3为红色。
发明详述
I.定义
如本文中使用的，术语“Hedgehog”指Hedgehog家族的任何成员，包括Sonic，Indian，Desert和TiggyWinkle。该术语可以用于表示蛋白质或基因。该术语还用于描述不同动物物种中的同系物/直向同系物序列。
如本文中使用的，术语“Hedgehog(Hh)信号传导途径”和“Hedgehog(Hh)信号传导”可互换使用，指正常情况下由该信号传导级联的各个成员(诸如Hedgehog，Patched(Ptch)，Smoothened(Smo)，和Gli)介导的事件链。Hedgehog途径甚至能在Hedgehog蛋白缺失下通过激活下游成分而被激活。仅仅作为举例，Smo过表达会在Hedgehog缺失下激活该途径。Hh信号传导成分或Hh信号传导途径的成员指参与Hh信号传导途径的基因产物。Hh信号传导成分常常显著地或实质性影响细胞/组织中Hh信号的传输，通常导致下游基因表达水平的程度变化和/或表型变化。根据它们的生物学功能和对下游基因激活/表达的最终结局的影响，Hh信号传导成分可以分成正和负调节物。正调节物是正面影响Hh信号的传输，即当Hh存在时刺激下游生物学事件的Hh信号传导成分。例子包括Hedgehog，Smo，和Gli。负调节物是负面影响Hh信号的传输，即当Hh存在时抑制下游生物学事件的Hh信号传导成分。例子包括(但不限于)Ptch和SuFu。
如本文中使用的，术语“Hedgehog信号传导拮抗剂”，“Hh信号传导拮抗剂”和“Hh信号传导途径抑制剂”可互换使用，指抑制正面Hh信号传导成分(诸如Hedgehog，Ptch，或Gli)的生物活性或下调Hh信号传导成分的表达的药剂。它们还包括上调Hh信号传导成分的负调节物的药剂。Hedgehog信号传导拮抗剂可以针对由Hedgehog途径中的任何基因编码的蛋白质，包括(但不限于)Sonic，Indian或DesertHedgehog，Smoothened，ptch-1，ptch-2，gli-1，gli-2，gli-3，等。例如，Hh信号传导途径抑制剂可以指部分或完全阻断，抑制，或中和由Hh介导的生物学活性的任何分子。抑制剂的例子包括抗体；配体抗体；小分子拮抗剂；反义和抑制性RNA(例如shRNA)分子。在一个特定实施方案中，抑制剂具有约1,000nM或更少的结合亲和力(解离常数)。在另一个实施方案中，抑制剂具有约100nM或更少的结合亲和力。在另一个实施方案中，抑制剂具有约50nM或更少的结合亲和力。在一个特定实施方案中，抑制剂以1,000nM或更少的IC50抑制Hh信号传导。在另一个实施方案中，抑制剂以500nM或更少的IC50抑制Hh信号传导。在另一个实施方案中，抑制剂以50nM或更少的IC50抑制Hh信号传导。在某些实施方案中，拮抗剂将一种或多种Hh途径成分的表达水平或生物学活性降低或抑制至少10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或更多。在一些实施方案中，Hh信号传导抑制剂为Smoothened的拮抗剂。
如本文中使用的，术语“Hedgehog相关病症”或“Hedgehog相关疾病”包括与Hedgehog途径破坏或异常有关的疾病和病症，以及与涉及Hedgehog途径激活的正常但不想要的生长状态有关的病症。“Hedgehog相关病症”包括但不限于肿瘤形成，癌症，赘生物形成，恶性过度增殖性病症，和非恶性过度增殖性病症。“Hedgehog相关病症”还包括良性前列腺增生，银屑病，湿性黄斑变性，骨硬化症和不想要的毛发生长。
术语“基本上相同”在用于本文时表示两个数值之间足够高的相似程度，以致本领域技术人员将认为在用所述数值(例如Kd值或表达)所测量的生物学特性背景内两个数值之间的差异具有很小的或没有生物学和/或统计学显著性。作为参照/比较值的函数，所述两个数值之间的差异例如小于约50％，小于约40％，小于约30％，小于约20％，和/或小于约10％。
短语“实质性不同”在用于本文时表示两个数值之间足够高的差异程度，以致本领域技术人员将认为在用所述数值(例如Kd值)所测量的生物学特性背景内两个数值之间的差异具有统计学显著性。作为参照/比较分子值的函数，所述两个数值之间的差异例如大于约10％，大于约20％，大于约30％，大于约40％，和/或大于约50％。
出于本文中的目的，“受体人框架”指包含自人免疫球蛋白框架或如下文定义的人共有框架衍生的轻链可变域(VL)框架或重链可变域(VH)框架的氨基酸序列的框架。自人免疫球蛋白框架或人共有框架“衍生”的受体人框架可以包含其相同的氨基酸序列，或者它可以含有氨基酸序列变化。在一些实施方案中，氨基酸变化的数目是10或更少，9或更少，8或更少，7或更少，6或更少，5或更少，4或更少，3或更少，或2或更少。在一些实施方案中，VL受体人框架与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列在序列上相同。
“亲和力”指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有指示，如本文中使用的，“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗体和抗原)之间1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以用解离常数(Kd)来表述。亲和力可以通过本领域知道的常用方法来测量，包括本文中所描述的方法。下文描述了用于测量结合亲和力的具体的说明性和例示性的实施方案。
“亲和力成熟的”抗体指在一个或多个高变区(HVR)中具有一处或多处改变的抗体，与不拥有此类改变的亲本抗体相比，此类改变导致该抗体对抗原的亲和力改善。
术语“抗LGR5抗体”和“结合LGR5的抗体”指能够以足够亲和力结合LGR5，使得该抗体可作为诊断剂和/或治疗剂用于靶向LGR5的抗体。在一个实施方案中，根据例如通过放射免疫测定法(RIA)的测量，抗LGR5抗体结合无关的，非LGR5的蛋白质的程度小于该抗体对LGR5的结合的约10％。在某些实施方案中，结合LGR5的抗体具有≤1μM，≤100nM，≤10nM，≤5nM，≤4nM，≤3nM，≤2nM，≤1nM，≤0.1nM，≤0.01nM，或≤0.001nM(例如10-8M或更少，例如10-8M到10-13M，例如10-9M到10-13M)的解离常数(Kd)。在某些实施方案中，抗LGR5抗体结合在来自不同物种的LGR5中保守的LGR5表位。
本文中的术语“抗体”以最广义使用，并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体，多克隆抗体，多特异性抗体(例如双特异性抗体)，和抗体片段，只要它们展现出期望的抗原结合活性。
“抗体片段”指与完整抗体不同的分子，其包含完整抗体的一部分且结合完整抗体结合的抗原。抗体片段的例子包括但不限于Fv，Fab，Fab’，Fab’-SH，F(ab’)2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
与参照抗体“结合相同表位的抗体”指在竞争测定法中将参照抗体对其抗原的结合阻断50％或更多的抗体，且相反，参照抗体在竞争测定法中将该抗体对其抗原的结合阻断50％或更多。本文中提供了例示性的竞争测定法。
术语“癌症”和“癌性”指向或描述哺乳动物中特征通常为细胞生长/增殖不受调控的生理疾患。癌症的例子包括但不限于癌，淋巴瘤(例如何杰金氏(Hodgkin)淋巴瘤和非何杰金氏淋巴瘤)，母细胞瘤，肉瘤和白血病。此类癌症的更具体例子包括鳞状细胞癌，小细胞肺癌，非小细胞肺癌，肺的腺癌，肺的鳞癌，腹膜癌，肝细胞癌，胃肠癌，胰腺癌，胶质瘤，宫颈癌，卵巢癌，肝癌(livercancer)，膀胱癌，肝瘤(hepatoma)，乳腺癌，结肠癌，结肠直肠癌，小肠癌，子宫内膜癌或子宫癌，唾液腺癌，肾癌，肝癌(livercancer)，前列腺癌，外阴癌，甲状腺癌，肝癌(hepaticcarcinoma)，白血病和其它淋巴增殖性病症，及各种类型的头和颈癌。
术语“嵌合”抗体指其中的重和/或轻链的一部分自特定的来源或物种衍生，而重和/或轻链的剩余部分自不同来源或物种衍生的抗体。
抗体的“类”指其重链拥有的恒定域或恒定区的类型。抗体有5大类：IgA，IgD，IgE，IgG，和IgM，并且这些中的几种可以进一步分成亚类(同种型)，例如，IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1，和IgA2。与不同类免疫球蛋白对应的重链恒定域分别称作α，δ，ε，γ，和μ。
在用于本文时，术语“细胞毒剂”指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。细胞毒剂包括但不限于：放射性同位素(例如At211，I131，I125，Y90，Re186，Re188，Sm153，Bi212，P32，Pb212和Lu的放射性同位素)；化学治疗剂或药物(例如甲氨蝶呤(methotrexate)，阿霉素(adriamicin)，长春花生物碱类(vincaalkaloids)(长春新碱(vincristine)，长春碱(vinblastine)，依托泊苷(etoposide))，多柔比星(doxorubicin)，美法仑(melphalan)，丝裂霉素(mitomycin)C，苯丁酸氮芥(chlorambucil)，柔红霉素(daunorubicin)或其它嵌入剂)；生长抑制剂；酶及其片段，诸如溶核酶；抗生素；毒素，诸如小分子毒素或者细菌，真菌，植物或动物起源的酶活性毒素，包括其片段和/或变体；及下文公开的各种抗肿瘤或抗癌剂。
“效应器功能”指那些可归于抗体Fc区且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应器功能的例子包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)下调；和B细胞活化。
药剂(例如药物配制剂)的“有效量”指在必需的剂量和时段上有效实现期望的治疗或预防结果的量。
术语“表位”指抗原分子上抗体所结合的特定位点。
本文中的术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链中至少含有恒定区一部分的C端区。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区自Cys226，或自Pro230延伸至重链的羧基端。然而，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。除非本文中另有规定，Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号方式依照EU编号系统，又称作EU索引，如记载于Kabat等,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD,1991。
“框架”或“FR”指除高变区(HVR)残基外的可变域残基。一般地，可变域的FR由4个FR域组成：FR1，FR2，FR3，和FR4。因而，HVR和FR序列在VH(或VL)中一般以如下的顺序出现：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
术语“全长抗体”，“完整抗体”，和“全抗体”在本文中可互换使用，指与天然抗体结构具有基本上类似的结构或者具有含有如本文中所限定的Fc区的重链的抗体。
术语“LGR5的糖基化形式”指通过添加碳水化合物残基经过翻译后修饰的LGR5天然存在形式。
术语“宿主细胞”，“宿主细胞系”，和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且指已经导入外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“经转化的细胞”，其包括原代的经转化的细胞及自其衍生的后代而不考虑传代的次数。后代在核酸内容物上可以与亲本细胞不完全相同，而是可以含有突变。本文中包括具有与在初始转化细胞中筛选或选择的相同功能或生物学活性的突变体后代。
“人抗体”指拥有与由人或人细胞生成的或利用人抗体全集或其它人抗体编码序列自非人来源衍生的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列的抗体。人抗体的此定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“人共有框架”指代表人免疫球蛋白VL或VH框架序列选集中最常存在的氨基酸残基的框架。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列选集来自可变域序列亚组。通常，序列亚组是如Kabat等，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第五版,NIHPublication91-3242,BethesdaMD(1991),第1-3卷中的亚组。在一个实施方案中，对于VL，亚组是如Kabat等，见上文中的亚组κI。在一个实施方案中，对于VH，亚组是如Kabat等，见上文中的亚组III。
“人源化”抗体指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体会包含至少一个，通常两个基本上整个可变域，其中所有或基本上所有HVR(例如，CDR)对应于非人抗体的那些，且所有或基本上所有FR对应于人抗体的那些。任选地，人源化抗体可以至少包含自人抗体衍生的抗体恒定区的一部分。抗体，例如非人抗体的“人源化形式”指已经经历人源化的抗体。
在用于本文时，术语“高变区”或“HVR”指抗体可变域中在序列上高变的和/或形成结构上限定的环(“高变环”)的每个区。一般地，天然的4链抗体包含6个HVR；三个在VH中(H1，H2，H3)，且三个在VL中(L1，L2，L3)。HVR一般包含来自高变环和/或来自“互补决定区”(CDR)的氨基酸残基，后一种是最高序列变异性的和/或牵涉抗原识别。例示性高变环存在于氨基酸残基26-32(L1)，50-52(L2)，91-96(L3)，26-32(H1)，53-55(H2)，和96-101(H3)(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。例示性CDR(CDR-L1，CDR-L2，CDR-L3，CDR-H1，CDR-H2，和CDR-H3)存在于氨基酸残基L1的24-34，L2的50-56，L3的89-97，H1的31-35B，H2的50-65，和H3的95-102(Kabat等,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD(1991))。除了VH中的CDR1外，CDR一般包含形成高变环的氨基酸残基。CDR还包含“特异性决定残基”，或“SDR”，其是接触抗原的残基。SDR包含在称作缩短的-CDR，或a-CDR的CDR区内。例示性的a-CDR(a-CDR-L1，a-CDR-L2，a-CDR-L3，a-CDR-H1，a-CDR-H2，和a-CDR-H3)存在于L1的氨基酸残基31-34，L2的50-55，L3的89-96，H1的31-35B，H2的50-58，和H3的95-102(见Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))。除非另有指示，可变域中的HVR残基和其它残基(例如，FR残基)在本文中依照Kabat等，见上文编号。
“免疫缀合物”指与一种或多种异源分子，包括但不限于细胞毒剂缀合的抗体。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如，牛，绵羊，猫，犬，和马)，灵长类(例如，人和非人灵长类诸如猴)，家兔，和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或受试者是人。
“分离的抗体”指已经与其天然环境的组分分开的抗体。在一些实施方案中，抗体纯化至大于95％或99％的纯度，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE，等电聚焦(IEF)，毛细管电泳)或层析(例如，离子交换或反相HPLC)测定的。关于用于评估抗体纯度的方法的综述，见例如Flatman等,J.Chromatogr.B848:79-87(2007)。
“分离的核酸”指已经与其天然环境的组分分开的核酸分子。分离的核酸包括通常含有核酸分子的细胞中含有的核酸分子，但是核酸分子在染色体外或在与其天然染色体位置不同的染色体位置处存在。
“编码抗LGR5抗体的分离的核酸”指编码抗体重和轻链(或其片段)的一种或多种核酸分子，包括单一载体或不同载体中的此类核酸分子，和存在于宿主细胞中的一个或多个位置的此类核酸分子。
如本文中使用的，术语“LGR5”指源自细胞中LGR5前体蛋白加工的任何天然，成熟LGR5。该术语包括来自任何脊椎动物来源的LGR5，包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人和猕猴)和啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)，除非另有说明。该术语还包括LGR5的天然存在变体，例如剪接变体或等位变体。一种例示性的人LGR5前体蛋白(带信号序列，氨基酸1-21)的氨基酸序列显示于SEQIDNO：67。一种例示性的成熟人LGR5的氨基酸序列。
术语“LGR5阳性癌症”指包含在其表面上表达LGR5的细胞的癌症。为了确定细胞是否在表面上表达LGR5的目的，认为LGR5mRNA表达与细胞表面上的LGR5表达有关。在一些实施方案中，通过选自原位杂交和RT-PCR(包括定量RT-PCR)的方法来测定LGR5mRNA的表达。或者，例如可以使用针对LGR5的抗体在诸如免疫组织化学，FACS，等方法中测定细胞表面上的LGR5表达。
术语“LGR5阳性细胞”指在其表面上表达LGR5的细胞。
在用于本文时，术语“单克隆抗体”指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体是相同的和/或结合相同表位，除了例如含有天然存在的突变或在单克隆抗体制备物的生成期间发生的可能的变体抗体外，此类变体一般以极小量存在。与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，单克隆抗体制备物的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。如此，修饰语“单克隆”指示抗体自一群基本上同质的抗体获得的特性，而不应解释为要求通过任何特定方法来生成抗体。例如，可以通过多种技术来生成要依照本发明使用的单克隆抗体，包括但不限于杂交瘤方法，重组DNA方法，噬菌体展示方法，和利用含有所有或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文中描述了用于生成单克隆抗体的此类方法和其它例示性方法。
“裸抗体”指未与异源模块(例如细胞毒性模块)或放射性标记物缀合的抗体。裸抗体可以存在于药物配制剂中。
“天然抗体”指具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异四聚糖蛋白，由二硫化物键合的两条相同轻链和两条相同重链构成。从N至C端，每条重链具有一个可变区(VH)，又称作可变重域或重链可变域，接着是三个恒定域(CH1，CH2，和CH3)。类似地，从N至C端，每条轻链具有一个可变区(VL)，又称作可变轻域或轻链可变域，接着是一个恒定轻(CL)域。根据其恒定域氨基酸序列，抗体轻链可归入两种类型中的一种，称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。
术语“包装插页”用于指治疗产品的商业包装中通常包含的用法说明书，其含有关于涉及此类治疗产品应用的适应症，用法，剂量，施用，联合疗法，禁忌症和/或警告的信息。
关于参照多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为比对序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分时，候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。为测定百分比氨基酸序列同一性目的的对比可以以本领域技术范围内的多种方式进行，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST，BLAST-2，ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以决定用于比对序列的合适参数，包括对所比较序列全长获得最大对比所需的任何算法。然而，为了本发明的目的，％氨基酸序列同一性值是使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生的。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech,Inc.编写，并且源代码已经连同用户文档一起提交给美国版权局(USCopyrightOffice,WashingtonD.C.,20559)，其中其以美国版权注册号TXU510087注册。公众自Genentech,Inc.,SouthSanFrancisco,California可获得ALIGN-2程序，或者可以从源代码编译。ALIGN2程序应当编译成在UNIX操作系统，包括数码UNIXV4.0D上使用。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定且不变。
在采用ALIGN-2来比较氨基酸序列的情况中，给定氨基酸序列A相对于(to)，与(with)，或针对(against)给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者可表述为具有或包含相对于，与，或针对给定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)如下计算：
分数X/Y乘100
其中X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对中评分为相同匹配的氨基酸残基数，且其中Y是B中的氨基酸残基总数。应当领会，若氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B的长度不相等，则A相对于B的％氨基酸序列同一性将不等于B相对于A的％氨基酸序列同一性。除非另有明确说明，本文中所使用的所有％氨基酸序列同一性值都是依照上一段所述，使用ALIGN-2计算机程序获得的。
术语“药物配制剂”指处于如下的形式，使得容许其中含有的活性成分的生物学活性是有效的，且不含对会接受配制剂施用的受试者具有不可接受的毒性的别的组分的制剂。
“药学可接受载体”指药物配制剂中与活性成分不同的，且对受试者无毒的成分。药学可接受载体包括但不限于缓冲剂，赋形剂，稳定剂，或防腐剂。
在用于本文时，“治疗”(及其语法变化形式，诸如“处理”或“处置”)指试图改变所治疗个体的自然进程的临床干预，可以是为了预防或在临床病理学的进程中进行。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发，缓解症状，削弱疾病的任何直接或间接病理学后果，预防转移，减缓疾病进展的速率，改善或减轻疾病状态，及免除或改善预后。在有些实施方案中，本发明的抗体用于延迟疾病的发生/发展，或用于减缓疾病的进展。
术语“伴随”在本文中用于指施用两种或更多种治疗剂，给药的时间足够接近，其中它们个别的治疗效果在时间上交叠。因而，并行施用包括在中止施用一种或多种药剂后继续施用一种或多种其它药剂的给药方案。在一些实施方案中，伴随施用是并行地，序贯地，和/或同时地。
“降低或抑制”指引起20％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，或更大的总体降低的能力。降低或抑制可以指所治疗的病症的症状，转移的存在或大小，或原发性肿瘤的大小。
术语“可变区”或“可变域”指抗体重或轻链中牵涉抗体结合抗原的域。天然抗体的重链和轻链可变域(分别为VH和VL)一般具有类似的结构，其中每个域包含4个保守的框架区(FR)和3个高变区(HVR)。(见例如Kindt等,KubyImmunology,第6版,W.H.FreemanandCo.,第91页(2007))。单个VH或VL域可以足以赋予抗原结合特异性。此外，可以分别使用来自结合抗原的抗体的VH或VL域筛选互补VL或VH域的文库来分离结合特定抗原的抗体。见例如，Portolano等,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等,Nature352:624-628(1991)。
在用于本文时，术语“载体”指能够增殖与其连接的另一种核酸的核酸分子。该术语包括作为自身复制型核酸结构的载体及并入接受其导入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。
“烃基”(alkyl)指含正，仲，叔或环碳原子的C1-C18烃(碳氢化合物)。例子有甲基(Me，-CH3)，乙基(Et，-CH2CH3)，1-丙基(n-Pr，正丙基，-CH2CH2CH3)，2-丙基(i-Pr，异丙基，-CH(CH3)2)，1-丁基(n-Bu，正丁基，-CH2CH2CH2CH3)，2-甲基-1-丙基(i-Bu，异丁基，-CH2CH(CH3)2)，2-丁基(s-Bu，仲丁基，-CH(CH3)CH2CH3)，2-甲基-2-丙基(t-Bu，叔丁基，-C(CH3)3)，1-戊基(正戊基，-CH2CH2CH2CH2CH3)，2-戊基(-CH(CH3)CH2CH2CH3)，3-戊基(-CH(CH2CH3)2)，2-甲基-2-丁基(-C(CH3)2CH2CH3)，3-甲基-2-丁基(-CH(CH3)CH(CH3)2)，3-甲基-1-丁基(-CH2CH2CH(CH3)2)，2-甲基-1-丁基(-CH2CH(CH3)CH2CH3)，1-己基(-CH2CH2CH2CH2CH2CH3)，2-己基(-CH(CH3)CH2CH2CH2CH3)，3-己基(-CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3))，2-甲基-2-戊基(-C(CH3)2CH2CH2CH3)，3-甲基-2-戊基(-CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3)，4-甲基-2-戊基(-CH(CH3)CH2CH(CH3)2)，3-甲基-3-戊基(-C(CH3)(CH2CH3)2)，2-甲基-3-戊基(-CH(CH2CH3)CH(CH3)2)，2,3-二甲基-2-丁基(-C(CH3)2CH(CH3)2)，3,3-二甲基-2-丁基(-CH(CH3)C(CH3)3)。
如本文中使用的，术语“C1-C8烃基”指具有1至8个碳原子的直链的或分支的，饱和的或不饱和的烃(碳氢化合物)。代表性的“C1-C8烃基”基团包括但不限于-甲基，-乙基，-正丙基，-正丁基，-正戊基，-正己基，-正庚基，-正辛基，-正壬基和-正癸基；而分支的C1-C8烃基包括但不限于-异丙基，-仲丁基，-异丁基，-叔丁基，-异戊基，2-甲基丁基，不饱和的C1-C8烃基包括但不限于-乙烯基，-丙烯基，-1-丁烯基，-2-丁烯基，-异丁烯基，-1-戊烯基，-2-戊烯基，-3-甲基-1-丁烯基，-2-甲基-2-丁烯基，-2,3-二甲基-2-丁烯基，1-己烯基，2-己烯基，3-己烯基，-乙炔基，-丙炔基，-1-丁炔基，-2-丁炔基，-1-戊炔基，-2-戊炔基，-3-甲基-1-丁炔基。C1-C8烃基基团可以是未取代的，或者是用一个或多个下述基团取代的，包括但不限于-C1-C8烃基，-O-(C1-C8烃基)，-芳基，-C(O)R’，-OC(O)R’，-C(O)OR’，-C(O)NH2，-C(O)NHR’，-C(O)N(R’)2，-NHC(O)R’，-SO3R’，-S(O)2R’，-S(O)R’，-OH，-卤素，-N3，-NH2，-NH(R’)，-N(R’)2和-CN；其中每一个R’独立选自H，-C1-C8烃基和芳基。
如本文中使用的，术语“C1-C12烃基”指具有1至12个碳原子的直链的或分支的，饱和的或不饱和的烃。C1-C12烃基基团可以是未取代的，或者是用一个或多个下述基团取代的，包括但不限于-C1-C8烃基，-O-(C1-C8烃基)，-芳基，-C(O)R’，-OC(O)R’，-C(O)OR’，-C(O)NH2，-C(O)NHR’，-C(O)N(R’)2，-NHC(O)R’，-SO3R’，-S(O)2R’，-S(O)R’，-OH，-卤素，-N3，-NH2，-NH(R’)，-N(R’)2和-CN；其中每一个R’独立选自H，-C1-C8烃基和芳基。
如本文中使用的，术语“C1-C6烃基”指具有1至6个碳原子的直链的或分支的，饱和的或不饱和的烃。代表性“C1-C6烃基”基团包括但不限于-甲基，-乙基，-正丙基，-正丁基，-正戊基，和-正己基；而分支的C1-C6烃基包括但不限于-异丙基，-仲丁基，-异丁基，-叔丁基，-异戊基，和2-甲基丁基；不饱和的C1-C6烃基包括但不限于-乙烯基，-丙烯基，-1-丁烯基，-2-丁烯基，-异丁烯基，-1-戊烯基，-2-戊烯基，-3-甲基-1-丁烯基，-2-甲基-2-丁烯基，-2,3-二甲基-2-丁烯基，1-己烯基，2-己烯基，和3-己烯基。C1-C6烃基基团可以是未取代的，或者是用一个或多个上文关于C1-C8烃基基团所述的基团取代的。
术语“C1-C4烃基”，如本文中使用的，指具有1至4个碳原子的直链的或分支的，饱和的或不饱和的烃。代表性“C1-C4烃基”基团包括但不限于-甲基，-乙基，-正丙基，和-正丁基；而分支的C1-C4烃基包括但不限于-异丙基，-仲丁基，-异丁基，-叔丁基；不饱和的C1-C4烃基包括但不限于-乙烯基，-丙烯基，-1-丁烯基，-2-丁烯基，和-异丁烯基。C1-C4烃基基团可以是未取代的，或者是用一个或多个上文关于C1-C8烃基基团所述的基团取代的。
“烃氧基”指与氧形成单键的烃基基团。例示性烃氧基包括但不限于甲氧基(-OCH3)和乙氧基(-OCH2CH3)。“C1-C5烃氧基”指有1至5个碳原子的烃氧基基团。烃氧基基团可以是未取代的，或者是用一个或多个上文关于烃基基团所述的基团取代的。
“烯基”指有至少一个不饱和位点即碳-碳，sp2双键的含正，仲，叔或环碳原子的C2-C18烃。例子包括但不限于：次乙基或乙烯基(-CH＝CH2)，丙烯基(-CH2CH＝CH2)，环戊烯基(-C5H7)，和5-己烯基(-CH2CH2CH2CH2CH＝CH2)。“C2-C8烯基”指有至少一个不饱和位点即碳-碳，sp2双键的含2至8个正，仲，叔或环碳原子的烃。
“炔基”指有至少一个不饱和位点即碳-碳，sp三键的含正，仲，叔或环碳原子的C2-C18烃。例子包括但不限于：乙炔基(-C≡CH)和丙炔基(-CH2C≡CH)。“C2-C8炔基”指有至少一个不饱和位点即碳-碳，sp三键的含2至8个正，仲，叔或环碳原子的烃。
“亚烷基”(alkylene)指1-18个碳原子且具有两个单价基心(radicalcenter)(通过自亲本烷烃的同一碳原子或两个不同碳原子除去两个氢原子而衍生的)的饱和的，分支的或直链的或环状的烃基。典型的亚烷基包括但不限于：亚甲基(-CH2-)，1,2-乙基(-CH2CH2-)，1,3-丙基(-CH2CH2CH2-)，1,4-丁基(-CH2CH2CH2CH2-)，等等。
“C1-C10亚烷基”指通式-(CH2)1-10-的直链，饱和烃基团。C1-C10亚烷基的例子包括亚甲基，亚乙基，亚丙基，亚丁基，亚戊基，亚己基，亚庚基，亚辛基，亚壬基和亚癸基。
“亚烯基”指2-18个碳原子且具有两个单价基心(radicalcenter)(通过自亲本烯烃的同一碳原子或两个不同碳原子除去两个氢原子而衍生的)的不饱和的，分支的或直链的或环状的烃基。典型的亚烯基包括但不限于：1,2-亚乙烯基(-CH＝CH-)。
“亚炔基”指2-18个碳原子且具有两个单价基心(radicalcenter)(通过自亲本炔烃的同一碳原子或两个不同碳原子除去两个氢原子而衍生的)的不饱和的，分支的或直链的或环状的烃基。典型的亚炔基包括但不限于：亚乙炔基(-C≡C-)，亚丙炔基(-CH2C≡C-)，和亚4-戊炔基(-CH2CH2CH2C≡C-)。
“芳基”指碳环芳香族基团。芳基基团的例子包括但不限于苯基，萘基和蒽基。碳环芳香族基团或杂环芳香族基团可以是未取代的，或者是用一个或多个下述基团取代的，包括但不限于-C1-C8烃基，-O-(C1-C8烃基)，-芳基，-C(O)R’，-OC(O)R’，-C(O)OR’，-C(O)NH2，-C(O)NHR’，-C(O)N(R’)2，-NHC(O)R’，-S(O)2R’，-S(O)R’，-OH，-卤素，-N3，-NH2，-NH(R’)，-N(R’)2和-CN；其中每一个R’独立选自H，-C1-C8烃基和芳基。
“C5-C20芳基”指碳环芳香环中有5至20个碳原子的芳基基团。C5-C20芳基基团的例子包括但不限于苯基，萘基和蒽基。C5-C20芳基基团可以是取代的或未取代的，如上文关于芳基基团所述。“C5-C14芳基”指碳环芳香环中有5至14个碳原子的芳基基团。C5-C14芳基基团的例子包括但不限于苯基，萘基和蒽基。C5-C14芳基基团可以是取代的或未取代的，如上文关于芳基基团所述。
“亚芳基”指具有两个共价键且可以是邻位，间位，或对位构型(如下示结构所示)的芳基基团：
其中苯基基团可以是未取代的，或者是用至多四个下述基团取代的，包括但不限于-C1-C8烃基，-O-(C1-C8烃基)，-芳基，-C(O)R’，-OC(O)R’，-C(O)OR’，-C(O)NH2，-C(O)NHR’，-C(O)N(R’)2，-NHC(O)R’，-S(O)2R’，-S(O)R’，-OH，-卤素，-N3，-NH2，-NH(R’)，-N(R’)2和-CN；其中每一个R’独立选自H，-C1-C8烃基和芳基。
“芳基烃基”指与碳原子(通常是末端或sp3碳原子)成键的氢原子之一用芳基替换的无环烃基。典型的芳基烃基包括但不限于苄基，2-苯基乙烷-1-基，2-苯基乙烯-1-基，萘基甲基，2-萘基乙烷-1-基，2-萘基乙烯-1-基，萘并苄基，2-萘并苯基乙烷-1-基等等。芳基烃基基团包含6至20个碳原子，例如芳基烃基基团的烃基模块(包括烷基，烯基或炔基)是1至6个碳原子，芳基模块是5至14个碳原子。
“杂芳基烃基”指与碳原子(通常是末端或sp3碳原子)成键的氢原子之一用杂芳基替换的无环烃基。典型的杂芳基烃基基团包括但不限于2-苯并咪唑基甲基，2-呋喃基乙基，等等。杂芳基烃基基团包含6至20个碳原子，例如杂芳基烃基基团的烃基模块(包括烷基，烯基或炔基)是1至6个碳原子，杂芳基模块是5至14个碳原子和1至3个选自N，O，P，和S的杂原子。杂芳基烃基基团的杂芳基模块可以是具有3至7个环成员(2至6个碳原子)的单环或具有7至10个环成员(4至9个碳原子和1至3个选自N，O，P，和S的杂原子)的双环，例如双环[4,5]，[5,5]，[5,6]，或[6,6]体系。
“取代的烃基”，“取代的芳基”，和“取代的芳基烃基”分别指其中一个或多个氢原子各自独立用取代基替换的烃基，芳基，和芳基烃基。典型的取代基包括但不限于-X，-R，-O-，-OR，-SR，-S-，-NR2，-NR3，＝NR，-CX3，-CN，-OCN，-SCN，-N＝C＝O，-NCS，-NO，-NO2，＝N2，-N3，NC(＝O)R，-C(＝O)R，-C(＝O)NR2，-SO3 -，-SO3H，-S(＝O)2R，-OS(＝O)2OR，-S(＝O)2NR，-S(＝O)R，-OP(＝O)(OR)2，-P(＝O)(OR)2，-PO3，-PO3H2，-C(＝O)R，-C(＝O)X，-C(＝S)R，-CO2R，-CO2，-C(＝S)OR，-C(＝O)SR，-C(＝S)SR，-C(＝O)NR2，-C(＝S)NR2，-C(＝NR)NR2，其中每一个X独立为卤素：F，Cl，Br，或I；且每一个R独立为-H，C2-C18烃基，C6-C20芳基，C3-C14杂环，保护基团或前体药物模块。上文所述亚烷基，亚烯基，和亚炔基也可以被类似的取代。
“杂芳基”和“杂环”指其中一个或多个环原子是杂原子(例如氮，氧和硫)的环体系。杂环基包含3至20个碳原子和1至3个选自N，O，P，和S的杂原子。杂环可以是具有3至7个环成员(2至6个碳原子和1至3个选自N，O，P，和S的杂原子)的单环或具有7至10个环成员(4至9个碳原子和1至3个选自N，O，P，和S的杂原子)的双环，例如双环[4,5]，[5,5]，[5,6]，或[6,6]体系。
例示性杂环记载于例如Paquette,LeoA.,“PrinciplesofModernHeterocyclicChemistry”(W.A.Benjamin,NewYork,1968)，特别是第1，3，4，6，7，和9章；“TheChemistryofHeterocyclicCompounds,AseriesofMonographs”(JohnWiley&Sons,NewYork,1950至今)，特别是第13，14，16，19，和28卷；及J.Am.Chem.Soc.(1960)82:5566。
举例而言，杂环的例子包括但不限于吡啶基，二氢吡啶基，四氢吡啶基(哌啶基)，噻唑基，四氢硫苯基(tetrahydrothiophenyl)，硫氧化的四氢硫苯基，嘧啶基，呋喃基，噻吩基，吡咯基，吡唑基，咪唑基，四唑基，苯并呋喃基，硫萘基(thianaphthalenyl)，吲哚基，indolenyl，喹啉基，异喹啉基，苯并咪唑基，哌啶基，4-哌啶酮基，吡咯烷基，2-吡咯烷酮基，吡咯啉基，四氢呋喃基，双-四氢呋喃基，四氢吡喃基，双-四氢吡喃基，四氢喹啉基，四氢异喹啉基，十氢喹啉基，八氢异喹啉基，吖辛因基(azocinyl)，三嗪基，6H-1,2,5-噻二嗪基，2H,6H-1,5,2-二噻嗪基，噻吩基，噻蒽基，吡喃基，异苯并呋喃基，色烯基，口占吨基，酚口恶噻基(phenoxathinyl)，2H-吡咯基，异噻唑基，异口恶唑基，吡嗪基，哒嗪基，吲嗪基，异吲哚基，3H-吲哚基，1H-吲唑基，嘌呤基(purinyl)，4H-喹嗪基，酞嗪基，萘啶基，喹喔啉基，喹唑啉基，噌啉基，喋啶基，4aH-咔唑基，咔唑基，β-咔啉基，菲啶基，吖啶基，嘧啶基，菲咯啉基，酚嗪基，酚噻嗪基，呋咱基，酚口恶嗪基，异色满基，色满基，咪唑烷基，咪唑啉基，吡唑烷基，吡唑啉基，哌嗪基，二氢吲哚基，异二氢吲哚基，奎宁环基，吗啉基，口恶唑烷基，苯并三唑基，苯并异口恶唑基，羟吲哚基，苯并口恶唑啉基，和靛红酰基(isatinoyl)。
举例而言而非限制，碳键合的杂环键合于吡啶的2，3，4，5，或6位，哒嗪的3，4，5，或6位，嘧啶的2，4，5，或6位，吡嗪的2，3，5，或6位，呋喃，四氢呋喃，噻吩(thiofuran)，噻吩(thiophene)，吡咯或四氢吡咯的2，3，4，或5位，口恶唑，咪唑或噻唑的2，4，或5位，异口恶唑，吡唑或异噻唑的3，4，或5位，吖丙啶的2或3位，吖丁啶的2，3，或4位，喹啉的2，3，4，5，6，7，或8位，或异喹啉的1，3，4，5，6，7，或8位。还要更典型的是，碳键合的杂环包括2-吡啶基，3-吡啶基，4-吡啶基，5-吡啶基，6-吡啶基，3-哒嗪基，4-哒嗪基，5-哒嗪基，6-哒嗪基，2-嘧啶基，4-嘧啶基，5-嘧啶基，6-嘧啶基，2-吡嗪基，3-吡嗪基，5-吡嗪基，6-吡嗪基，2-噻唑基，4-噻唑基，或5-噻唑基。
举例而言而非限制，氮键合的杂环键合于吖丙啶，吖丁啶，吡咯，吡咯烷，2-吡咯啉，3-吡咯啉，咪唑，咪唑啉，2-咪唑啉，3-咪唑啉，吡唑，吡唑啉，2-吡唑啉，3-吡唑啉，哌啶，哌嗪，吲哚，二氢吲哚，1H-吲唑的1位，异吲哚或异二氢吲哚的2位，吗啉的4位，及咔唑或β-咔啉的9位。还要更典型的是，氮键合的杂环包括1-吖丙啶基(aziridyl)，1-吖丁啶基(azetedyl)，1-吡咯基，1-咪唑基，1-吡唑基，和1-哌啶基。
“C3-C8杂环”指其中1至4个环碳原子独立地用选自O，S和N的杂原子替换的芳香族或非芳香族C3-C8碳环。C3-C8杂环的代表性例子包括但不限于苯并呋喃基，苯并噻吩，吲哚基，苯并吡唑基，香豆素基，异喹啉基，吡咯基，硫苯基，呋喃基，噻唑基，咪唑基，吡唑基，三唑基，喹啉基，嘧啶基，吡啶基，吡啶酮基，吡嗪基，哒嗪基，异噻唑基，异口恶唑基和四唑基。C3-C8杂环可以是未取代的，或者是用至多7个下述基团取代的，包括但不限于-C1-C8烃基，-O-(C1-C8烃基)，-芳基，-C(O)R’，-OC(O)R’，-C(O)OR’，-C(O)NH2，-C(O)NHR’，-C(O)N(R’)2，-NHC(O)R’，-S(O)2R’，-S(O)R’，-OH，-卤素，-N3，-NH2，-NH(R’)，-N(R’)2和-CN；其中每一个R’独立选自H，-C1-C8烃基和芳基。
“C3-C8杂环基/C3-C8杂环并”指其中杂环基团的氢原子之一用键替换的上文定义的C3-C8杂环基团。C3-C8杂环基可以是未取代的，或者是用至多6个下述基团取代的，包括但不限于-C1-C8烃基，-O-(C1-C8烃基)，-芳基，-C(O)R’，-OC(O)R’，-C(O)OR’，-C(O)NH2，-C(O)NHR’，-C(O)N(R’)2，-NHC(O)R’，-S(O)2R’，-S(O)R’，-OH，-卤素，-N3，-NH2，-NH(R’)，-N(R’)2和-CN；其中每一个R’独立选自H，-C1-C8烃基和芳基。
“C3-C20杂环”指其中1至4个环碳原子独立地用选自O，S和N的杂原子替换的芳香族或非芳香族C3-C20碳环。C3-C20杂环可以是未取代的，或者是用至多7个下述基团取代的，包括但不限于-C1-C8烃基，-O-(C1-C8烃基)，-芳基，-C(O)R’，-OC(O)R’，-C(O)OR’，-C(O)NH2，-C(O)NHR’，-C(O)N(R’)2，-NHC(O)R’，-S(O)2R’，-S(O)R’，-OH，-卤素，-N3，-NH2，-NH(R’)，-N(R’)2和-CN；其中每一个R’独立选自H，-C1-C8烃基和芳基。
“C3-C20杂环基/C3-C20杂环并”指其中杂环基团的氢原子之一用键替换的上文定义的C3-C20杂环基团。
“碳环”指饱和的或不饱和的环，作为单环具有3至7个碳原子，作为双环具有7至12个碳原子。单环碳环具有3至6个环原子，还要更典型的是5或6个环原子。双环碳环具有7至12个环原子，例如排列成双环[4,5]，[5,5]，[5,6]或[6,6]体系，或者具有9或10个环原子，排列成双环[5,6]或[6,6]体系。单环碳环的例子包括环丙基，环丁基，环戊基，1-环戊-1-烯基，1-环戊-2-烯基，1-环戊-3-烯基，环己基，1-环己-1-烯基，1-环己-2-烯基，1-环己-3-烯基，环庚基，和环辛基。
“C3-C8碳环”指3，4，5，6，7或8个成员的饱和的或不饱和的非芳香族碳环。代表性C3-C8碳环包括但不限于-环丙基，-环丁基，-环戊基，-环戊二烯基，-环己基，-环己烯基，-1,3-环己二烯基，-1,4-环己二烯基，-环庚基，-1,3-环庚二烯基，-1,3,5-环庚三烯基，-环辛基，和-环辛二烯基。C3-C8碳环基团可以是未取代的，或者是用一个或多个下述基团取代的，包括但不限于-C1-C8烃基，-O-(C1-C8烃基)，-芳基，-C(O)R’，-OC(O)R’，-C(O)OR’，-C(O)NH2，-C(O)NHR’，-C(O)N(R’)2，-NHC(O)R’，-S(O)2R’，-S(O)R’，-OH，-卤素，-N3，-NH2，-NH(R’)，-N(R’)2和-CN；其中每一个R’独立选自H，-C1-C8烃基和芳基。
“C3-C8碳环基/C3-C8碳环并”指其中碳环基团的氢原子之一用键替换的上文定义的C3-C8碳环基团。
“接头”指包含使抗体共价附着于药物模块的共价键或原子链的化学模块。在各个实施方案中，接头包括二价基，诸如烃二基(alkyldiyl)，芳二基，杂芳二基，诸如-(CR2)nO(CR2)n-，烃氧基重复单元(例如聚亚乙基氧基(polyethyleneoxy)，PEG，聚亚甲基氧基(polymethyleneoxy))和烃氨基(例如聚乙烯氨基，JeffamineTM)等模块；及二酸酯和酰胺，包括琥珀酸酯，琥珀酰胺，二乙醇酸酯，丙二酸酯，和己酰胺。在各种实施方案中，接头可包含一个或多个氨基酸残基，诸如缬氨酸，苯丙氨酸，赖氨酸，和高赖氨酸。
术语“手性”指分子具有镜像对映体不可重叠的特性，而术语“非手性”指分子可重叠于其镜像对映体上。
术语“立体异构体”指具有相同的化学结构，但是在原子或基团的空间排列方面有所不同的化合物。
“非对映异构体”指具有两个或更多个手性中心且其分子彼此不为镜像对映体的空间异构体。非对映异构体具有不同的物理特性，例如熔点，沸点，光谱特性，和反应性。非对映异构体的混合物可以在高分辨率的分析规程下分开，诸如电泳和层析。
“对映异构体”指化合物的彼此为不可重叠镜像的两种空间异构体。
本文中使用的立体化学的定义和规则一般遵循S.P.Parker,Ed.,McGraw-HillDictionaryofChemicalTerms(1984)McGraw-HillBookCompany,NewYork；及Eliel,E.andWilen,S.,StereochemistryofOrganicCompounds(1994)JohnWiley&Sons,Inc.,NewYork。许多有机化合物以旋光形式存在，即它们有能力旋转平面偏振光的平面。在描述旋光化合物时，前缀D和L或R和S用于表示分子关于其手性中心的绝对构型。前缀d和l或(+)和(-)用于表示化合物对平面偏振光的旋转的标记，其中(-)或1指化合物是左旋的。以(+)或d为前缀的化合物是右旋的。对于指定的化学结构，这些立体异构体是相同的，只是它们互为镜像。一种特定立体异构体还可称作对映异构体，此类异构体的混合物通常称作对映异构体混合物。对映异构体的50:50混合物称作外消旋混合物或外消旋物，它们可以在没有立体选择性或立体特异性的化学反应或工艺中存在。术语“外消旋混合物”和“外消旋物”指两种对映异构体等摩尔混合从而没有旋光性的混合物。
“离去基团”指可以用另一官能团取代的官能团。某些离去基团是本领域公知的，例子包括但不限于卤化物(例如氯化物，溴化物，碘化物)，甲烷磺酰基(甲磺酰基)，对甲苯磺酰基(甲苯磺酰基)，三氟甲基磺酰基(三氟甲磺酸根)，和三氟甲基磺酸根。
术语“保护基团”指常用于使化合物上的其它官能团起反应的同时封闭或保护特定官能度的取代基。例如，“氨基保护基团”指附着至化合物中的氨基基团并阻断或保护氨基官能度的取代基。合适的氨基保护基团包括但不限于乙酰基，三氟乙酰基，叔丁氧羰基(BOC)，苄氧羰基(CBZ)和9-芴甲氧羰基(Fmoc)。关于保护基团及其用途的一般性说明参见T.W.Greene,ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis,JohnWiley&Sons,NewYork,1991或更晚的版本。
II.治疗性方法
A.治疗性方法
本文中提供的是使用抗LGR5抗体的方法。例如，本文中提供的是在个体中治疗Hedgehog相关疾病的方法，其包括对该个体施用有效量的抗LGR5抗体。例如，本文中提供的是在个体中治疗基底细胞癌的方法，其包括对该个体施用有效量的本文所述抗LGR5抗体。在一些实施方案中，所述抗LGR5抗体是与细胞毒剂缀合的抗LGR5抗体(在本文中也称作免疫缀合物)。在一些实施方案中，所述抗LGR5抗体并不显著抑制wnt途径信号传导。在一些实施方案中，所述Hedgehog相关疾病为基底细胞癌(“BCC”)。在一些实施方案中，所述基底细胞癌为局部晚期BCC或转移性BCC。在一些实施方案中，所述Hedgehog相关疾病为髓母细胞瘤。
本文中还提供的是在个体中治疗Hedgehog相关疾病的方法，其包括对该个体施用有效量的抗LGR5抗体和有效量的Hedgehog途径抑制剂。例如，其中与Hedgehog途径抑制剂单独的治疗相比，所述抗LGR5抗体和所述Hedgehog途径抑制剂各自的量有效延长治疗响应时段和/或延迟复发和/或抗性发生。在一些实施方案中，所述Hedgehog途径抑制剂为Smoothened的拮抗剂。在一些实施方案中，所述Hedgehog途径抑制剂为Smoothened的环杷明竞争性拮抗剂。在一些实施方案中，所述Smoothened的拮抗剂为2-氯-N-[4-氯-3-(吡啶-2-基)苯基]-4-(甲基磺酰基)苯甲酰胺或其盐。在一些实施方案中，所述Smoothened的拮抗剂为2-氯-N-[4-氯-3-(吡啶-2-基)苯基]-4-(甲基磺酰基)苯甲酰胺。在一些实施方案中，所述Smoothened的拮抗剂为Vismodegib。在一些实施方案中，所述抗LGR5抗体为与细胞毒剂缀合的抗LGR5抗体(在本文中也称作免疫缀合物)。在一些实施方案中，所述抗LGR5抗体并不显著抑制wnt途径信号传导。在一些实施方案中，所述Hedgehog相关疾病为基底细胞癌(“BCC”)。在一些实施方案中，所述基底细胞癌为局部晚期BCC或转移性BCC。在一些实施方案中，所述Hedgehog相关疾病为髓母细胞瘤。
本文中提供的是在个体中提高包含Hedgehog途径抑制剂的Hedgehog相关疾病治疗的功效的方法，其中该方法包括对该个体施用有效量的抗LGR5抗体和有效量的该Hedgehog途径抑制剂。在一些实施方案中，所述Hedgehog途径抑制剂为Smoothened的拮抗剂。在一些实施方案中，所述Hedgehog途径抑制剂为Smoothened的环杷明竞争性拮抗剂。在一些实施方案中，所述Smoothened的拮抗剂为2-氯-N-[4-氯-3-(吡啶-2-基)苯基]-4-(甲基磺酰基)苯甲酰胺或其盐。在一些实施方案中，所述Smoothened的拮抗剂为2-氯-N-[4-氯-3-(吡啶-2-基)苯基]-4-(甲基磺酰基)苯甲酰胺。在一些实施方案中，所述Smoothened的拮抗剂为Vismodegib。在一些实施方案中，所述抗LGR5抗体为与细胞毒剂缀合的抗LGR5抗体(在本文中也称作免疫缀合物)。在一些实施方案中，所述抗LGR5抗体并不显著抑制wnt途径信号传导。在一些实施方案中，所述Hedgehog相关疾病为基底细胞癌(“BCC”)。在一些实施方案中，所述基底细胞癌为局部晚期BCC或转移性BCC。在一些实施方案中，所述Hedgehog相关疾病为髓母细胞瘤。
本文中进一步提供的是在个体中治疗Hedgehog相关疾病的方法，其中该治疗包括对该个体施用有效量的抗LGR5抗体和有效量的Hedgehog途径抑制剂，且其中该治疗具有与包括在没有该抗LGR5抗体的情况下(在缺失该抗LGR5抗体下)施用有效量的该Hedgehog途径抑制剂的标准治疗相比升高的功效。在一些实施方案中，所述Hedgehog途径抑制剂为Smoothened的拮抗剂。在一些实施方案中，所述Hedgehog途径抑制剂为Smoothened的环杷明竞争性拮抗剂。在一些实施方案中，所述Smoothened的拮抗剂为2-氯-N-[4-氯-3-(吡啶-2-基)苯基]-4-(甲基磺酰基)苯甲酰胺或其盐。在一些实施方案中，所述Smoothened的拮抗剂为2-氯-N-[4-氯-3-(吡啶-2-基)苯基]-4-(甲基磺酰基)苯甲酰胺。在一些实施方案中，所述Smoothened的拮抗剂为Vismodegib。在一些实施方案中，所述抗LGR5抗体为与细胞毒剂缀合的抗LGR5抗体(在本文中也称作免疫缀合物)。在一些实施方案中，所述抗LGR5抗体并不显著抑制wnt途径信号传导。在一些实施方案中，所述Hedgehog相关疾病为基底细胞癌(“BCC”)。在一些实施方案中，所述基底细胞癌为局部晚期BCC或转移性BCC。在一些实施方案中，所述Hedgehog相关疾病为髓母细胞瘤。
本文中还提供的是在个体中延迟和/或阻止Hedgehog相关疾病复发和/或Hedgehog相关疾病对Hedgehog途径抑制剂的抗性发生的方法，其包括对该个体施用有效量的抗LGR5抗体和有效量的该Hedgehog途径抑制剂。本文中还提供的是在具有Hedgehog相关疾病的个体中延长对Hedgehog途径抑制剂的敏感性时段的方法，其包括对该个体施用有效量的抗LGR5抗体和有效量的该Hedgehog途径抑制剂。本文中提供的是在具有Hedgehog相关疾病的个体中延长对Hedgehog途径抑制剂的响应持续时间的方法，其包括对该个体施用有效量的抗LGR5抗体和有效量的该Hedgehog途径抑制剂。在一些实施方案中，所述Hedgehog途径抑制剂为Smoothened的拮抗剂。在一些实施方案中，所述Hedgehog途径抑制剂为Smoothened的环杷明竞争性拮抗剂。在一些实施方案中，所述Smoothened的拮抗剂为2-氯-N-[4-氯-3-(吡啶-2-基)苯基]-4-(甲基磺酰基)苯甲酰胺或其盐。在一些实施方案中，所述Smoothened的拮抗剂为2-氯-N-[4-氯-3-(吡啶-2-基)苯基]-4-(甲基磺酰基)苯甲酰胺。在一些实施方案中，所述Smoothened的拮抗剂为Vismodegib。在一些实施方案中，所述抗LGR5抗体为与细胞毒剂缀合的抗LGR5抗体(在本文中也称作免疫缀合物)。在一些实施方案中，所述抗LGR5抗体并不显著抑制wnt途径信号传导。在一些实施方案中，所述Hedgehog相关疾病为基底细胞癌(“BCC”)。在一些实施方案中，所述基底细胞癌为局部晚期BCC或转移性BCC。在一些实施方案中，所述Hedgehog相关疾病为髓母细胞瘤。
本文中提供的是在具有Hedgehog相关疾病的个体中提高对Hedgehog途径抑制剂的敏感性的方法，其包括对该个体施用有效量的抗LGR5抗体和有效量的该Hedgehog途径抑制剂。在一些实施方案中，所述Hedgehog途径抑制剂为Smoothened的拮抗剂。在一些实施方案中，所述Hedgehog途径抑制剂为Smoothened的环杷明竞争性拮抗剂。在一些实施方案中，所述Smoothened的拮抗剂为2-氯-N-[4-氯-3-(吡啶-2-基)苯基]-4-(甲基磺酰基)苯甲酰胺或其盐。在一些实施方案中，所述Smoothened的拮抗剂为2-氯-N-[4-氯-3-(吡啶-2-基)苯基]-4-(甲基磺酰基)苯甲酰胺。在一些实施方案中，所述Smoothened的拮抗剂为Vismodegib。在一些实施方案中，所述抗LGR5抗体为与细胞毒剂缀合的抗LGR5抗体(在本文中也称作免疫缀合物)。在一些实施方案中，所述抗LGR5抗体并不显著抑制wnt途径信号传导。在一些实施方案中，所述Hedgehog相关疾病为基底细胞癌(“BCC”)。在一些实施方案中，所述基底细胞癌为局部晚期BCC或转移性BCC。在一些实施方案中，所述Hedgehog相关疾病为髓母细胞瘤。
对本文中使用的疗法具有抗性的癌症包括对疗法不响应和/或产生显著响应(例如部分响应和/或完全响应)的能力降低的癌症。抗性可以是在治疗方法过程中产生的获得性抗性。在一些实施方案中，所述获得性药物抗性是瞬时和/或可逆药物耐受。对疗法的瞬时和/或可逆药物抗性包括其中所述药物抗性能够在所述治疗方法暂停后再获得对疗法的敏感性。在一些实施方案中，所述获得性抗性是永久抗性。对疗法的永久抗性包括赋予药物抗性的遗传变化。
对本文中使用的疗法具有敏感性的癌症包括响应和/或能够产生显著响应(例如部分响应和/或完全响应)的癌症。
评估对疗法的抗性获得和/或敏感性维持的测定方法是本领域已知的。在一些实施方案中，可以通过IC50，EC50的变化或药物耐受坚持者和/或药物耐受扩大坚持者中肿瘤生长的降低来指示抗性。在一些实施方案中，所述变化大于约50％，100％，和/或200％任一。另外，可以在体内评估抗性获得和/或敏感性维持的变化，例如通过评估对疗法的响应，响应持续时间，和/或进展前时间，例如部分响应和完全响应。抗性获得和/或敏感性维持的变化可以基于一群个体中对疗法的响应，响应持续时间，和/或进展前时间的变化，例如部分响应和完全响应的数目。
在一些实施方案中，所述癌症是LGR5阳性的。可通过许多方法学来分析样品中各种生物标志物的存在，其中许多是本领域中已知且熟练技术人员理解的，包括但不限于免疫组织化学(“IHC”)，Western印迹分析，免疫沉淀，分子结合测定法，ELISA，ELIFA，荧光激活细胞分选(“FACS”)，MassARRAY，蛋白组学，基于血液的定量测定法(如例如血清ELISA)，生化酶活性测定法，原位杂交，Southern分析，Northern分析，全基因组测序，聚合酶链式反应(“PCR”)(包括定量实时PCR(“qRT-PCR”)和其它扩增类型检测方法，诸如例如分支的DNA，SISBA，TMA等等)，RNA-Seq，FISH，微阵列分析，基因表达概况分析，和/或基因表达系列分析(“SAGE”)，以及可通过蛋白质，基因和/或组织阵列分析实施的许多种测定法中的任一种。用于评估基因和基因产物状态的典型方案见于例如Ausubeletal.,eds.,1995,CurrentProtocolsInMolecularBiology,Units2(NorthernBlotting),4(SouthernBlotting),15(Immunoblotting)和18(PCRAnalysis)。还可使用多重免疫测定法，诸如那些可从RulesBasedMedicine或MesoScaleDiscovery(“MSD”)获得的。
体外细胞增殖抑制可使用可购自Promega(Madison,WI)的CellTiter-GloTM发光细胞存活力测定法来测定。该测定法基于存在的ATP(它是代谢活跃细胞的指标)的量化来测定培养物中的可存活细胞数目。参见Crouchetal.(1993)J.Immunol.Meth.160:81-88；美国专利No.6602677。该测定法可以以96孔或384孔形式进行，使之适应自动化高通量筛选(HTS)。参见Creeetal.(1995)AntiCancerDrugs6:398-404。该测定法规程牵涉直接向培养细胞添加单一试剂(试剂)。这导致细胞溶解和通过萤光素酶反应产生的发光信号的生成。发光信号与存在的ATP的量成正比，后者直接与培养物中存在的可存活细胞数成正比。可以通过光度计或CCD照相机成像装置来记录数据。发光输出表述成相对光单位(RLU)。
又一方面，本发明提供治疗LGR5阳性癌症的方法。在一个实施方案中，所述方法包括对具有此类LGR5阳性癌症的个体施用有效量的抗LGR5抗体(包括免疫缀合物)。在一个此类实施方案中，所述方法进一步包括对个体施用有效量的至少一种其它的治疗剂，如下文所描述的。
在一些实施方案中，LGR5阳性癌症是得到大于“0”的抗LGR5免疫组织化学(IHC)或原位杂交(ISH)得分的癌症，这对应于>90％的肿瘤细胞中染色很弱或无染色。在另一个实施方案中，LGR5阳性癌症以1+，2+或3+水平表达LGR5。在一些实施方案中，LGR5阳性癌症是根据检测LGR5mRNA的逆转录酶PCR(RT-PCR)测定法表达LGR5的癌症。在一些实施方案中，所述RT-PCR是定量RT-PCR。
依照任何上述实施方案的“个体”可以是人。
又一方面，本发明提供药物配制剂，其包含本文中提供的任何抗LGR5抗体(包括免疫缀合物)，例如在任何上述治疗性方法中使用。在一个实施方案中，药物配制剂包含本文中提供的任何抗LGR5抗体(包括免疫缀合物)和药学可接受载体。在另一个实施方案中，药物配制剂包含本文中提供的任何抗LGR5抗体(包括免疫缀合物)和至少一种其它的治疗剂，例如如下文所描述的。
可以单独或与疗法中的其它药剂(例如Hedgehog信号传导抑制剂)组合使用抗体(包括免疫缀合物)。例如，可以与至少一种其它的治疗剂(例如Hedgehog信号传导抑制剂)共施用抗体(包括免疫缀合物)。
上文记录的此类组合疗法涵盖组合施用(其中两种或更多种治疗剂包含在同一配制剂或分开的配制剂中)，和分开施用，在该情况中，可以在其它的治疗剂和/或佐剂的施用之前，同时，和/或之后发生抗体(包括免疫缀合物)的施用。也可以与放射疗法组合使用抗体(包括免疫缀合物)。
可以通过任何合适的手段，包括胃肠外，肺内，和鼻内，及若期望用于局部治疗的话，损伤内施用来施用抗体(包括免疫缀合物)(和任何其它的治疗剂)。胃肠外输注包括肌肉内，静脉内，动脉内，腹膜内，或皮下施用。部分根据施用是短暂的还是长期的，剂量给药可以通过任何合适的路径，例如通过注射，诸如静脉内或皮下注射进行。本文中涵盖各种剂量给药日程表，包括但不限于单次施用或在多个时间点里的多次施用，推注施用，和脉冲输注。
抗体(包括免疫缀合物)会以一种符合良好的医学实践的方式配制，确定剂量及施用。关于这一点考虑的因素包括在治疗的特定病症，在治疗的特定哺乳动物，患者个体的临床状态，病症的原因，药剂的递送部位，施用的方法，施用进度表，及其它为医学从业人员所知的因素。抗体(包括免疫缀合物)无需但任选与一种或多种目前用于预防或治疗所讨论病症的药剂一起配制。此类其它药剂的有效量取决于配制剂中存在的抗体(包括免疫缀合物)的量，病症或治疗的类型，及其它上文讨论的因素。这些药剂通常以与本文所述相同的剂量和施用路径使用，或者是本文所述剂量的约1-99％，或者凭经验/在临床上确定适宜的以任何剂量并通过任何途径使用。
为了预防或治疗疾病，抗体(包括免疫缀合物)(当单独或与一种或多种其它另外的治疗剂(例如Hedgehog途径抑制剂)组合使用时)的适宜剂量会取决于要治疗的疾病的类型，抗体(包括免疫缀合物)的类型，疾病的严重性和过程，施用抗体(包括免疫缀合物)是为了预防还是治疗目的，在先的疗法，患者的临床史和对抗体(包括免疫缀合物)的响应，及主治医师的斟酌决定。抗体(包括免疫缀合物)适合于在一次或一系列的治疗中施用于患者。根据疾病的类型和严重性，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)的抗体(包括免疫缀合物)可作为首次候选剂量施用于患者，无论是例如通过一次或多次分开的施用或者是通过连续输注。根据上文提到的因素，一种典型的日剂量可在约1μg/kg至100mg/kg或更多的范围内。对于几天或更长时间的重复施用，根据状况，治疗通常会持续直至发生疾病症状的期望阻抑。抗体(包括免疫缀合物)的一种例示性剂量会在约0.05mg/kg至约10mg/kg的范围中。如此，可以对患者施用一剂或多剂约0.5mg/kg，2.0mg/kg，4.0mg/kg或10mg/kg(或其任意组合)。此类剂量可间歇施用，例如每周或每三周(例如，使得患者接受约2至约20或例如约6剂抗体)。可施用初始较高的加载剂量，接着施用一个或多个较低的剂量。然而，其它剂量方案可以是有用的。通过常规技术和测定法易于监测此疗法的进展。
理解的是，可以使用免疫缀合物和抗LGR5抗体二者实施任何上述配制剂或治疗性方法。
B.供本文所述方法使用的抗LGR5抗体
本文中提供的是供本文所述方法使用的抗LGR5抗体。在一些实施方案中，抗LGR5抗体结合LGR5。LGR5是在例如活跃循环的肠干细胞的表面上找到的一种七次跨膜蛋白质。
在本文所述方法中有用的抗LGR5抗体包括但不限于US2010/0275280，US2011/017699，US8158757，US8158758，WO2013/067054，WO2013/067055，WO2013/067057，WO2013/067060，和PCT/US2013/034629中记载的抗LGR5抗体，据此通过援引将其完整收录。
一种例示性的天然发生人LGR5前体蛋白序列(带信号序列，氨基酸1-21)提供于SEQIDNO：67，而相应的成熟LGR5蛋白序列(对应于SEQIDNO：67的氨基酸22-907)。
在某些实施方案中，抗LGR5抗体具有至少一项或多项任意组合的下述特征：(a)结合SEQIDNO：67氨基酸22-555内的表位；(b)以≤5nM，或≤4nM，或≤3nM，或≤2nM，或≤1nM，且任选≥0.0001nM，或≥0.001nM，或≥0.01nM的亲和力结合LGR5；(c)并不显著破坏R-spondin(RSPO)对LGR5的结合；(d)并不显著破坏β-联蛋白信号传导；(e)并不显著破坏LGR5信号传导的RSPO激活；(f)激活胱天蛋白酶3切割；(g)识别人和啮齿动物LGR5二者；(h)识别人LGR5但不识别啮齿动物LGR5；(i)以其未缀合形式并不显著抑制肿瘤生长；和(j)并不诱导干细胞分化。在一些实施方案中，所述抗LGR5抗体为8E11及其人源化变体，诸如hu8E11.v2；YW353；2H6；和3G12。在一些实施方案中，LGR5为人LGR5。在一些实施方案中，LGR5选自人，猕猴，小鼠，和大鼠LGR5。
(a)结合SEQIDNO：67氨基酸22-555内的表位
测定抗LGR5抗体是否结合LGR5表位的方法是本领域已知的。在一些实施方案中，抗LGR5抗体对LGR5表位(例如SEQIDNO：67氨基酸22-555内的)的结合可以通过在293细胞中表达具有N和C端删除的LGR5多肽并通过FACS测试抗体对截短多肽的结合来测定。在一些实施方案中，相对于对在293细胞中表达的全长LGR5的结合，抗体对截短多肽的结合的实质性降低(≥70％的降低)或消除指示该抗体不结合该截短多肽。在一些实施方案中，LGR5为人LGR5。在一些实施方案中，LGR5为人LGR5或猕猴LGR5。
在一些实施方案中，LGR5表位包含LGR5的富亮氨酸N端域(例如SEQIDNO：67氨基酸残基25-66)。在一些实施方案中，LGR5表位包含LGR5的一个或多个富亮氨酸重复(LRR)(例如SEQIDNO：67氨基酸残基67-446；LGR5的LRR1-16)。在一些实施方案中，LGR5表位包含LGR5的LRR1(例如SEQIDNO：67氨基酸残基67-90)。在一些实施方案中，LGR5表位包含LGR5的LRR2(例如SEQIDNO：67氨基酸残基91-112)。在一些实施方案中，LGR5表位包含LGR5的LRR3(例如SEQIDNO：67氨基酸残基115-136)。在一些实施方案中，LGR5表位包含LGR5的LRR4(例如SEQIDNO：67氨基酸残基139-160)。在一些实施方案中，LGR5表位包含LGR5的LRR5(例如SEQIDNO：67氨基酸残基163-184)。在一些实施方案中，LGR5表位包含LGR5的LRR6(例如SEQIDNO：67氨基酸残基187-208)。在一些实施方案中，LGR5表位包含LGR5的LRR7(例如SEQIDNO：67氨基酸残基211-232)。在一些实施方案中，LGR5表位包含LGR5的LRR8(例如SEQIDNO：67氨基酸残基235-256)。在一些实施方案中，LGR5表位包含LGR5的LRR9(例如SEQIDNO：67氨基酸残基258-279)。在一些实施方案中，LGR5表位包含LGR5的LRR10(例如SEQIDNO：67氨基酸残基282-303)。在一些实施方案中，LGR5表位包含LGR5的LRR11(例如SEQIDNO：67氨基酸残基306-328)。在一些实施方案中，LGR5表位包含LGR5的LRR12(例如SEQIDNO：67氨基酸残基329-350)。在一些实施方案中，LGR5表位包含LGR5的LRR13(例如SEQIDNO：67氨基酸残基353-374)。在一些实施方案中，LGR5表位包含LGR5的LRR14(例如SEQIDNO：67氨基酸残基375-396)。在一些实施方案中，LGR5表位包含LGR5的LRR15(例如SEQIDNO：67氨基酸残基399-420)。在一些实施方案中，LGR5表位包含LGR5的LRR16(例如SEQIDNO：67氨基酸残基423-446)。在一些实施方案中，LGR5表位包含LRR1至LRR11，LRR2至LRR11，LRR3至LRR11，LLR1至LLR3，LLR2至LLR3，LLR2至LLR8，LLR3至LL7，或LLR4至LLR6任一。
在一些实施方案中，LGR5表位包含SEQIDNO：67氨基酸22-555内的表位。在一些实施方案中，LGR5表位包含SEQIDNO：67氨基酸22-424内的表位。在一些实施方案中，LGR5表位包含SEQIDNO：67氨基酸22-123内的表位。在一些实施方案中，LGR5表位包含SEQIDNO：67氨基酸22-323内的表位。在一些实施方案中，LGR5表位包含SEQIDNO：67氨基酸324-555内的表位。在一些实施方案中，LGR5表位包含SEQIDNO：67氨基酸324-424内的表位。
理解的是，本文所述各个方面和实施方案包括“组成”和/或“有效组成”方面和实施方案。
(b)以≤5nM，或≤4nM，或≤3nM，或≤2nM，或≤1nM，且任选≥0.0001nM，或≥0.001nM，或≥0.01nM的亲和力结合LGR5
测定结合亲和力的方法是本领域已知的。在一些实施方案中，结合亲和力可以依照测定法来测定。具体而言，在一些实施方案中，可以使用(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)通过表面等离振子共振测定法来测量Kd。可以依照供应商的说明书用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)试剂活化BIAcoreTM科研级CM5芯片。可以将山羊抗人FcIgG偶联至芯片以实现每个流动室中大约10,000个响应单位(RU)。可以用1M乙醇胺封闭未反应的偶联基团。对于动力学测量，可以捕捉抗LGR5抗体以实现大约300RU。可以于25℃以30μl/min的流速注射人LGR5ECD(例如在杆状病毒系统中表达的与His-Fc融合的氨基酸22-557(或类似片段，诸如22-555)，或自CHO细胞表达的与Fc融合的氨基酸22-558(或类似片段，诸如22-555))在HBS-P缓冲液(0.01MHEPESpH7.4，0.15MNaCl，0.005％表面活性剂P20)中的两倍连续稀释液(125nM至0.49nM)。可以使用1:1朗格缪尔(Langmuir)结合模型(BIAcoreTMEvaluationSoftwareversion3.2)计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。可以作为比koff/kon计算平衡解离常数(Kd)。如果根据上文表面等离振子共振测定法结合速率超出106M-1s-1，那么可以使用荧光淬灭技术于25℃测定在渐增浓度的抗原存在下20nM抗抗原抗体(Fab形式)在PBS，pH7.2中的结合速率，该技术测量荧光发射强度的升高或降低(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm通带)，如在分光计，诸如配备了断流装置的分光光度计(AvivInstruments)或带有搅拌比色杯的8000系列分光光度计(ThermoSpectronic)中测量的。
在一些实施方案中，所述抗LGR5抗体以约≤5nM，或≤4nM，或≤3nM，或≤2nM，或≤1nM任一的亲和力结合LGR5。在一些实施方案中，所述抗LGR5抗体以约≤5的亲和力结合LGR5。在一些实施方案中，所述抗LGR5抗体以约≤4nM的亲和力结合LGR5。在一些实施方案中，所述抗LGR5抗体以约≤3nM的亲和力结合LGR5。在一些实施方案中，所述抗LGR5抗体以约≤2nM的亲和力结合LGR5。在一些实施方案中，LGR5为人LGR5。在一些实施方案中，LGR5为人LGR5或猕猴LGR5。
正如本领域技术人员理解的，提到“约”数值或参数包括(及描述)针对该数值或参数本身的实施方案。例如，提到“约X”的描述包括“X”的描述。
(c)并不显著破坏R-spondin(RSPO)对LGR5的结合
测定抗LGR5抗体破坏RSPO对LGR5的结合的能力的方法是本领域已知的。在一些实施方案中，可以通过流式细胞术来测定抗LGR5抗体显著破坏R-spondon(RSPO)对LGR5的结合的能力。在一些实施方案中，例如，可以在抗LGR5抗体存在和缺失下使表达LGR5的293细胞与荧光标记的RSPO(诸如RSPO1，RSPO2，RSPO3，和/或RSPO4)接触。可以使用荧光激活细胞分选(FACS)来检测RSPO对293细胞的结合。在一些实施方案中，抗LGR5抗体存在下的RSPO结合相对于对照抗体存在下的RSPO结合的少于约25％的降低指示该抗LGR5抗体并不显著破坏RSPO对LGR5的结合。
在一些实施方案中，可以通过BIAcore测定法来测定抗LGR5抗体显著破坏R-spondon(RSPO)对LGR5的结合的能力。在一些实施方案中，例如，可以在例如如本文所述CM5芯片上固定化LGR5胞外域，并且可以在抗LGR5抗体存在和缺失下测定RSPO(诸如RSPO1，RSPO2，RSPO3，和/或RSPO4)对固定化LGR5的结合。在一些实施方案中，抗LGR5抗体存在下的RSPO结合相对于对照抗体存在下的RSPO结合的少于约25％的降低指示该抗LGR5抗体并不显著破坏RSPO对LGR5的结合。
在一些实施方案中，所述RSPO选自RSPO1，RSPO2，RSPO3，和RSPO4。在一些实施方案中，所述抗体将结合破坏少于约25％，少于约20％，少于约15％，或少于约10％。在一些实施方案中，所述抗体并不可检测地破坏RSPO对LGR5的结合。在一些实施方案中，LGR5为人LGR5。在一些实施方案中，LGR5为人LGR5或猕猴LGR5。
(d)并不显著破坏wnt/β-联蛋白信号传导
测定抗LGR5抗体破坏wnt/β-联蛋白信号传导的能力的方法是本领域已知的。在一些实施方案中，可以使用报告基因测定法来测量抗LGR5抗体显著破坏wnt/β-联蛋白信号传导的能力。在一些实施方案中，例如，可以将包含在wnt/β-联蛋白响应性启动子(诸如例如包含多聚化TCF/LEFDNA结合位点的启动子)控制下的报告基因(诸如例如萤光素酶基因)的报告构建物转染入表达LGR5的细胞中。然后可以在抗LGR5抗体存在和缺失下使细胞与Wnt配体(诸如Wnt3a)和RSPO(诸如RSPO1，RSPO2，RSPO3，和/或RSPO4)接触，并测量萤光素酶表达。在一些实施方案中，抗体存在下的萤光素酶表达相对于对照抗体存在下的萤光素酶表达的少于约25％的降低指示该抗LGR5抗体并不显著破坏β-联蛋白信号传导。
在一些实施方案中，所述抗体将β-联蛋白信号传导破坏少于约25％，少于约20％，少于约15％，或少于约10％。在一些实施方案中，所述抗体并不可检测地破坏β-联蛋白信号传导。在一些实施方案中，LGR5为人LGR5。在一些实施方案中，LGR5为人LGR5或猕猴LGR5。
(e)并不显著破坏LGR5信号传导的RSPO激活
测定抗LGR5抗体破坏LGR5的RSPO激活的能力的方法是本领域已知的。在一些实施方案中，可以使用报告基因测定法来测定抗LGR5抗体显著破坏LGR5信号传导的RSPO激活的能力。在一些实施方案中，例如，可以将包含在β-联蛋白响应性启动子(诸如例如包含多聚化TCF/LEFDNA结合位点的启动子)控制下的报告基因(诸如例如萤光素酶基因)的报告构建物转染入表达LGR5的细胞中。然后可以在RSPO(诸如RSPO1，RSPO2，RSPO3，和/或RSPO4)存在和缺失下使细胞与Wnt配体(诸如Wnt3a)接触，并且可以作为在RSPO存在下萤光素酶表达的升高来测量LGR5信号传导的激活。也可以在抗LGR5抗体存在和缺失下测量LGR5信号传导的激活。在一些实施方案中，当细胞与抗LGR5抗体较之对照抗体接触时，在RSPO1，RSPO2，RSPO3，和/或RSPO4存在下LGR5信号传导激活少于约25％的降低指示该抗LGR5抗体并不显著破坏LGR5信号传导的RSPO激活。
在一些实施方案中，所述RSPO选自RSPO1，RSPO2，RSPO3，和RSPO4。在一些实施方案中，所述抗体将LGR5信号传导的RSPO激活破坏少于约25％，少于约20％，少于约15％，或少于约10％。在一些实施方案中，所述抗体并不可检测地破坏LGR5信号传导的RSPO激活。在一些实施方案中，LGR5为人LGR5。在一些实施方案中，LGR5为人LGR5或猕猴LGR5。
(f)激活胱天蛋白酶3切割
测定抗LGR5抗体激活胱天蛋白酶3切割的能力的方法是本领域已知的。在一些实施方案中，可以在啮齿动物异种移植物模型中测定抗LGR5抗体激活胱天蛋白酶3切割的能力。在一些实施方案中，可以作为肿瘤面积的函数测量受到切割的胱天蛋白酶3的存在，例如自施用抗LGR5抗体的肿瘤发生模型小鼠收集的福尔马林固定石蜡包膜(FFPE)组织中的。在一些实施方案中，可以使用免疫组织化学来测定受到切割的胱天蛋白酶3的存在。而且，在一些实施方案中，可以作为百分百阳性肿瘤面积来测定胱天蛋白酶3切割。
在一些实施方案中，抗LGR5抗体将胱天蛋白酶3阳性肿瘤面积的百分比提高约至少20％，至少25％，至少30％，至少35％，至少40％，至少45％，至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，或至少100％(即阳性肿瘤面积的百分比加倍)任一。
(g)识别人和啮齿动物LGR5二者
测定抗LGR5抗体结合人和啮齿动物LGR5二者的能力的方法是本领域已知的。在一些实施方案中，在293细胞中表达人和啮齿动物LGR5多肽，并通过FACS测试抗体对LGR5表达性293细胞的结合。在一些实施方案中，啮齿动物LGR5为小鼠或大鼠LGR5。在一些实施方案中，啮齿动物LGR5为小鼠LGR5。
(h)识别人LGR5但不识别啮齿动物LGR5
测定抗LGR5抗体结合人LGR5但不结合啮齿动物LGR5的能力的方法是本领域已知的。在一些实施方案中，在293细胞中表达人和啮齿动物LGR5多肽，并通过FACS测试抗体对LGR5表达性293细胞的结合。在一些实施方案中，啮齿动物LGR5为小鼠或大鼠LGR5。在一些实施方案中，啮齿动物LGR5为小鼠LGR5。
(i)以其未缀合形式并不显著抑制肿瘤生长
测定抗LGR5抗体以其未缀合形式抑制肿瘤生长的能力的方法是本领域已知的。异种移植物模型或鼠肿瘤发生模型中对肿瘤生长的抑制是相对于媒介对照或对照抗体测定的。
在一些实施方案中，抗LGR5抗体以其未缀合形式将肿瘤生长抑制少于约25％，少于约20％，少于约15％，或少于约10％。在一些实施方案中，抗LGR5抗体以其未缀合形式并不可检测地抑制肿瘤生长。
(j)并不诱导干细胞分化
测定抗LGR5抗体诱导干细胞分化能力的方法是本领域已知的。在一些实施方案中，可以通过测定在抗LGR5抗体存在或缺失下隐窝基底柱状细胞(CBC)(它们是小肠中表达LGR5的快速循环干细胞)分化成例如肠细胞，杯形细胞，和/或肠内分泌细胞的能力来测定干细胞分化。在一些实施方案中，如果在对照抗体在少于约25％的一群CBC中诱导干细胞分化的条件下在抗LGR5抗体存在下约少于25％，少于20％，少于15％，或少于10％任一的一群CBC分化的话，认为该抗LGR5抗体不诱导干细胞分化。
在一些实施方案中，抗LGR5抗体免疫缀合物经由不诱导干细胞分化的主要机制抑制肿瘤生长。在一些此类实施方案中，所述抗LGR5抗体免疫缀合物经由由与免疫缀合物中的抗体缀合的细胞毒剂介导的细胞毒性活性抑制肿瘤生长。
例示性抗LGR5抗体
在一些实施方案中，本文中提供的是例示性但非限制性的供本文所述方法使用的抗LGR5抗体。在任何方法的一些实施方案中，所述抗LGR5抗体包含至少一个，两个，三个，四个，五个，或六个选自下述的HVR：(a)包含SEQIDNO：30的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO：31的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQIDNO：32的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQIDNO：27的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQIDNO：28的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQIDNO：29的氨基酸序列的HVR-L3。
在任何方法的一些实施方案中，所述抗LGR5抗体包含：(a)VH域，其包含(i)包含SEQIDNO：30的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQIDNO：31的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含SEQIDNO：32的氨基酸序列的HVR-H3；和/或(b)VL域，其包含(i)包含SEQIDNO：27的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQIDNO：28的氨基酸序列的HVR-L2，和(c)包含SEQIDNO：29的氨基酸序列的HVR-L3。
在一些实施方案中，抗LGR5抗体包含任何上述实施方案中的HVR，且进一步包含选自SEQIDNO：40至43的重链框架FR3序列。在一些实施方案中，抗LGR5抗体包含任何上述实施方案中的HVR，且进一步包含SEQIDNO：41的重链框架FR3序列。在一些此类实施方案中，所述重链可变域框架为具有选自SEQIDNO：40至43的FR3序列的经修饰人VH1框架。在一些此类实施方案中，所述重链可变域框架为具有SEQIDNO：41的FR3序列的经修饰人VH1框架。
在一些实施方案中，抗LGR5抗体包含任何上述实施方案中的HVR，且进一步包含SEQIDNO：36的轻链框架FR3序列。在一些此类实施方案中，所述重链可变域框架为具有SEQIDNO：36的FR3序列的经修饰VL卡帕IV共有(VLKIV)框架。
另一方面，在任何方法的一些实施方案中，所述抗LGR5抗体包含上文提供的任何实施方案中的VH和上文提供的任何实施方案中的VL。在一个实施方案中，所述抗体包含分别在SEQIDNO：6和SEQIDNO：5中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，所述抗体包含分别在SEQIDNO：8和SEQIDNO：7中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，所述抗体包含分别在SEQIDNO：10和SEQIDNO：9中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，所述抗体包含分别在SEQIDNO：12和SEQIDNO：11中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，所述抗体包含分别在SEQIDNO：14和SEQIDNO：13中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，所述抗体包含分别在SEQIDNO：16和SEQIDNO：15中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，所述抗体包含分别在SEQIDNO：18和SEQIDNO：17中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，所述抗体包含分别在SEQIDNO：20和SEQIDNO：19中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。
一方面，在任何方法的一些实施方案中，所述抗LGR5抗体包含至少一个，两个，三个，四个，五个，或六个选自下述的HVR：(a)包含SEQIDNO：60的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO：61的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQIDNO：62的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQIDNO：57的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQIDNO：58的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQIDNO：59的氨基酸序列的HVR-L3。
另一方面，在任何方法的一些实施方案中，所述抗LGR5抗体包含：(a)VH域，其包含(i)包含SEQIDNO：60的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQIDNO：61的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含SEQIDNO：62的氨基酸序列的HVR-H3；和/或(b)VL域，其包含(i)包含SEQIDNO：57的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQIDNO：58的氨基酸序列的HVR-L2，和(c)包含SEQIDNO：59的氨基酸序列的HVR-L3。
另一方面，在任何方法的一些实施方案中，所述抗LGR5抗体包含：(a)包含SEQIDNO：60的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO：61的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQIDNO：62的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQIDNO：57的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQIDNO：58的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQIDNO：59的氨基酸序列的HVR-L3。
另一方面，提供抗LGR5抗体，其中该抗体包含上文提供的任何实施方案中的VH和上文提供的任何实施方案中的VL。在一个实施方案中，所述抗体包含分别在SEQIDNO：26和SEQIDNO：25中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。
在一些实施方案中，在任何方法的一些实施方案中，所述抗LGR5抗体包含至少一个，两个，三个，四个，五个，或六个选自下述的HVR：(a)包含SEQIDNO：48的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO：49的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQIDNO：50的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQIDNO：45的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQIDNO：46的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQIDNO：47的氨基酸序列的HVR-L3。
另一方面，在任何方法的一些实施方案中，所述抗LGR5抗体包含：(a)VH域，其包含(i)包含SEQIDNO：48的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQIDNO：49的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含SEQIDNO：50的氨基酸序列的HVR-H3；和/或(b)VL域，其包含(i)包含SEQIDNO：45的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQIDNO：46的氨基酸序列的HVR-L2，和(c)包含SEQIDNO：47的氨基酸序列的HVR-L3。
另一方面，在任何方法的一些实施方案中，所述抗LGR5抗体包含上文提供的任何实施方案中的VH和上文提供的任何实施方案中的VL。在一个实施方案中，所述抗体包含分别在SEQIDNO：22和SEQIDNO：21中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。
在一些实施方案中，在任何方法的一些实施方案中，所述抗LGR5抗体包含至少一个，两个，三个，四个，五个，或六个选自下述的HVR：(a)包含SEQIDNO：54的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO：55的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQIDNO：56的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQIDNO：51的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQIDNO：52的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQIDNO：53的氨基酸序列的HVR-L3。
另一方面，在任何方法的一些实施方案中，所述抗LGR5抗体包含：(a)VH域，其包含(i)包含SEQIDNO：54的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQIDNO：55的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含SEQIDNO：56的氨基酸序列的HVR-H3；和/或(b)VL域，其包含(i)包含SEQIDNO：51的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQIDNO：52的氨基酸序列的HVR-L2，和(c)包含SEQIDNO：53的氨基酸序列的HVR-L3。
另一方面，提供抗LGR5抗体，其中该抗体包含上文提供的任何实施方案中的VH和上文提供的任何实施方案中的VL。在一个实施方案中，所述抗体包含分别在SEQIDNO：24和SEQIDNO：23中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。
又一方面，在任何方法的一些实施方案中，所述抗LGR5抗体与本文中提供的抗LGR5抗体结合相同表位。例如，在某些实施方案中，提供与包含SEQIDNO：24的VH序列和SEQIDNO：23的VL序列的抗LGR5抗体结合相同表位的抗体。在某些实施方案中，提供与包含SEQIDNO：22的VH序列和SEQIDNO：21的VL序列的抗LGR5抗体结合相同表位的抗体。在某些实施方案中，提供结合SEQIDNO：67中来自氨基酸324-423，在氨基酸324-423内，或与氨基酸324-423交叠的表位的抗体。在一些实施方案中，提供结合来自氨基酸303-402，在氨基酸303-402内，或与氨基酸303-402交叠的表位的抗体。在某些实施方案中，提供结合SEQIDNO：67中来自氨基酸324-555，在氨基酸324-555内，或与氨基酸324-555交叠的表位的抗体。在一些实施方案中，提供结合来自氨基酸303-534，在氨基酸303-534内，或与氨基酸303-534交叠的表位的抗体。例如，在某些实施方案中，提供与包含SEQIDNO：26的VH序列和SEQIDNO：25的VL序列的抗LGR5抗体结合相同表位的抗体。在某些实施方案中，提供结合SEQIDNO：67中来自氨基酸22-123，在氨基酸22-123内，或与氨基酸22-123交叠的表位的抗体。在某些实施方案中，提供结合来自氨基酸1-102，在氨基酸1-102内，或与氨基酸1-102交叠的表位的抗体。例如，在某些实施方案中，提供与包含SEQIDNO：8的VH序列和SEQIDNO：7的VL序列的抗LGR5抗体结合相同表位的抗体。在某些实施方案中，提供结合SEQIDNO：67中来自氨基酸22-323，在氨基酸22-323内，或与氨基酸22-323交叠的表位的抗体。在一些实施方案中，提供结合来自氨基酸1-312，在氨基酸1-312内，或与氨基酸1-312交叠的表位的抗体。
在任何上述实施方案中，抗LGR5抗体是人源化的。在一个实施方案中，抗LGR5抗体包含任何上述实施方案中的HVR，且进一步包含人受体框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。在某些实施方案中，所述人受体框架为人VL卡帕IV共有(VLKIV)框架和/或VH框架VH1。在某些实施方案中，所述人受体框架为人VL卡帕IV共有(VLKIV)框架和/或在重链框架区FR3中包含R71S突变和A78V突变的VH框架VH1。
在又一方面，依照任何上述实施方案的抗LGR5抗体是单克隆抗体，包括嵌合，人源化或人抗体。在一个实施方案中，抗LGR5抗体是抗体片段，例如Fv，Fab，Fab’，scFv，双抗体，或F(ab’)2片段。在另一个实施方案中，抗体是基本上全长抗体，例如IgG1抗体或本文中定义的其它抗体类或同种型。
又一方面，依照任何上述实施方案的抗LGR5抗体可单一地或组合地并入下文1-7节描述的任何特征：
1.抗体亲和力
在某些实施方案中，本文中提供的抗体具有≤1μM，≤100nM，≤10nM，≤1nM，≤0.1nM，≤0.01nM，或≤0.001nM的解离常数(Kd)，且任选≥10-13M(例如10-8M或更少，例如10-8M至10-13M，例如，10-9M至10-13M)。
在一个实施方案中，Kd是通过如下述测定法所述用Fab型式的感兴趣抗体及其抗原实施的放射性标记抗原结合测定法(RIA)来测量的。通过在存在未标记抗原的滴定系列的情况中用最小浓度的(125I)标记抗原平衡Fab，然后用抗Fab抗体包被板捕捉结合的抗原来测量Fab对抗原的溶液结合亲和力(见例如Chen等,J.Mol.Biol.293:865-881(1999))。为了建立测定法的条件，将多孔板(ThermoScientific)用50mM碳酸钠(pH9.6)中的5μg/ml捕捉用抗Fab抗体(CappelLabs)包被过夜，随后用PBS中的2％(w/v)牛血清清蛋白于室温(约23℃)封闭2-5小时。在非吸附板(Nunc#269620)中，将100pM或26pM[125I]-抗原与连续稀释的感兴趣Fab(例如与Presta等,CancerRes.57:4593-4599(1997)中抗VEGF抗体，Fab-12的评估一致)混合。然后将感兴趣的Fab温育过夜；然而，温育可持续更长时间(例如约65小时)以确保达到平衡。此后，将混合物转移至捕捉板，于室温温育(例如1小时)。然后除去溶液，并用PBS中的0.1％聚山梨酯20洗板8次。平板干燥后，加入150μl/孔闪烁液(MICROSCINT-20TM；Packard)，然后在TOPCOUNTTM伽马计数器(Packard)上对平板计数10分钟。选择各Fab给出小于或等于最大结合之20％的浓度用于竞争性结合测定法。
依照另一个实施方案，Kd是使用表面等离振子共振测定法使用或(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)于25℃使用固定化抗原CM5芯片在约10个响应单位(RU)测量的。简言之，依照供应商的用法说明书用盐酸N-乙基-N’-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物传感器芯片(CM5,BIACORE,Inc.)。将抗原用10mM乙酸钠pH4.8稀释至5μg/ml(约0.2μM)，然后以5μl/分钟的流速注射以获得约10个响应单位(RU)的偶联蛋白质。注入抗原后，注入1M乙醇胺以封闭未反应基团。为了进行动力学测量，于25℃以约25μl/分钟的流速注入在含0.05％聚山梨酯20(TWEEN-20TM)表面活性剂的PBS(PBST)中两倍连续稀释的Fab(0.78nM至500nM)。使用简单一对一朗格缪尔(Langmuir)结合模型(EvaluationSoftwareversion3.2)通过同时拟合结合和解离传感图计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。平衡解离常数(Kd)以比率koff/kon计算。见例如Chen等,J.Mol.Biol.293:865-881(1999)。如果根据上文表面等离振子共振测定法，结合速率超过106M-1S-1，那么结合速率可使用荧光淬灭技术来测定，即根据分光计诸如配备了断流装置的分光光度计(AvivInstruments)或8000系列SLM-AMINCOTM分光光度计(ThermoSpectronic)中用搅拌比色杯的测量，在存在浓度渐增的抗原的情况中，测量PBSpH7.2中20nM抗抗原抗体(Fab形式)于25℃的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的升高或降低。
2.抗体片段
在某些实施方案中，本文中提供的抗体是抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab，Fab’，Fab’-SH，F(ab’)2，Fv，和scFv片段，及下文所描述的其它片段。关于某些抗体片段的综述，见Hudson等,Nat.Med.9:129-134(2003)。关于scFv片段的综述，见例如Pluckthün,于ThePharmacologyofMonoclonalAntibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编,(Springer-Verlag,NewYork),第269-315页(1994)；还可见WO93/16185；及美国专利No.5,571,894和5,587,458。关于包含补救受体结合表位残基，并且具有延长的体内半衰期的Fab和F(ab’)2片段的讨论，见美国专利No.5,869,046。
双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价的或双特异性的。见例如EP404,097；WO1993/01161；Hudson等,Nat.Med.9:129-134(2003)；及Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448(1993)。三抗体和四抗体也记载于Hudson等,Nat.Med.9:129-134(2003)。
单域抗体是包含抗体的整个或部分重链可变域或整个或部分轻链可变域的抗体片段。在某些实施方案中，单域抗体是人单域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,MA；见例如美国专利No.6,248,516B1)。
可以通过多种技术，包括但不限于对完整抗体的蛋白水解消化及重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)的生成来生成抗体片段，如本文中所描述的。
3.嵌合的和人源化的抗体
在某些实施方案中，本文中提供的抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体记载于例如美国专利No.4,816,567；及Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))。在一个例子中，嵌合抗体包含非人可变区(例如，自小鼠，大鼠，仓鼠，家兔，或非人灵长类，诸如猴衍生的可变区)和人恒定区。在又一个例子中，嵌合抗体是“类转换的”抗体，其中类或亚类已经自亲本抗体的类或亚类改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在某些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。通常，将非人抗体人源化以降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。一般地，人源化抗体包含一个或多个可变域，其中HVR，例如CDR(或其部分)自非人抗体衍生，而FR(或其部分)自人抗体序列衍生。任选地，人源化抗体还会至少包含人恒定区的一部分。在一些实施方案中，将人源化抗体中的一些FR残基用来自非人抗体(例如衍生HVR残基的抗体)的相应残基替代，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
人源化抗体及其生成方法综述于例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)，并且进一步记载于例如Riechmann等,Nature332:323-329(1988)；Queen等,Proc.Nat’lAcad.Sci.USA86:10029-10033(1989)；美国专利No.5,821,337,7,527,791,6,982,321和7,087,409；Kashmiri等,Methods36:25-34(2005)(描述了SDR(a-CDR)嫁接)；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述了“重修表面”)；Dall’Acqua等,Methods36:43-60(2005)(描述了“FR改组”)；及Osbourn等,Methods36:61-68(2005)和Klimka等,Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(描述了FR改组的“引导选择”方法)。
可以用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳拟合(best-fit)”方法选择的框架区(见例如Sims等,J.Immunol.151:2296(1993))；自轻或重链可变区的特定亚组的人抗体的共有序列衍生的框架区(见例如Carter等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；及Presta等,J.Immunol.,151:2623(1993))；人成熟的(体细胞突变的)框架区或人种系框架区(见例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))；和通过筛选FR文库衍生的框架区(见例如Baca等,J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)及Rosok等,J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。
4.人抗体
在某些实施方案中，本文中提供的抗体是人抗体。可以使用本领域中已知的多种技术来生成人抗体。一般地，人抗体记载于vanDijk和vandeWinkel,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)及Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)。
可以通过对转基因动物施用免疫原来制备人抗体，所述转基因动物已经修饰为响应抗原性攻击而生成完整人抗体或具有人可变区的完整抗体。此类动物通常含有所有或部分人免疫球蛋白基因座，其替换内源免疫球蛋白基因座，或者其在染色体外存在或随机整合入动物的染色体中。在此类转基因小鼠中，一般已经将内源免疫球蛋白基因座灭活。关于自转基因动物获得人抗体的方法的综述，见Lonberg,Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。还可见例如美国专利No.6,075,181和6,150,584，其描述了XENOMOUSETM技术；美国专利No.5,770,429，其描述了技术；美国专利No.7,041,870，其描述了K-M技术，和美国专利申请公开文本No.US2007/0061900，其描述了技术)。可以例如通过与不同人恒定区组合进一步修饰来自由此类动物生成的完整抗体的人可变区。
也可以通过基于杂交瘤的方法生成人抗体。已经描述了用于生成人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异骨髓瘤细胞系(见例如KozborJ.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等,MonoclonalAntibodyProductionTechniquesandApplications,第51-63页(MarcelDekker,Inc.,NewYork,1987)；及Boerner等,J.Immunol.,147:86(1991))。经由人B细胞杂交瘤技术生成的人抗体也记载于Li等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)。其它方法包括那些例如记载于美国专利No.7,189,826(其描述了自杂交瘤细胞系生成单克隆人IgM抗体)和Ni,XiandaiMianyixue,26(4):265-268(2006)(其描述了人-人杂交瘤)的。人杂交瘤技术(Trioma技术)也记载于Vollmers和Brandlein,HistologyandHistopathology,20(3):927-937(2005)及Vollmers和Brandlein,MethodsandFindingsinExperimentalandClinicalPharmacology,27(3):185-91(2005)。
也可以通过分离自人衍生的噬菌体展示文库选择的Fv克隆可变域序列生成人抗体。然后，可以将此类可变域序列与期望的人恒定域组合。下文描述了自抗体文库选择人抗体的技术。
5.文库衍生的抗体
可以通过对组合文库筛选具有期望的一种或多种活性的抗体来分离供本文所述方法使用的抗体。例如，用于生成噬菌体展示文库并对此类文库筛选拥有期望结合特征的抗体的多种方法是本领域中已知的。此类方法综述于例如Hoogenboom等,于MethodsinMolecularBiology178:1-37(O’Brien等编,HumanPress,Totowa,NJ,2001)，并且进一步记载于例如McCafferty等,Nature348:552-554；Clackson等,Nature352:624-628(1991)；Marks等,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Marks和Bradbury,于MethodsinMolecularBiology248:161-175(Lo编,HumanPress,Totowa,NJ,2003)；Sidhu等,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA101(34):12467-12472(2004)；及Lee等,J.Immunol.Methods284(1-2):119-132(2004)。
在某些噬菌体展示方法中，将VH和VL基因的全集分别通过聚合酶链式反应(PCR)克隆，并在噬菌体文库中随机重组，然后可以对所述噬菌体文库筛选抗原结合噬菌体，如记载于Winter等,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)的。噬菌体通常以单链Fv(scFv)片段或以Fab片段展示抗体片段。来自经免疫的来源的文库提供针对免疫原的高亲和力抗体，而不需要构建杂交瘤。或者，可以(例如自人)克隆天然全集以在没有任何免疫的情况中提供针对一大批非自身和还有自身抗原的抗体的单一来源，如由Griffiths等,EMBOJ,12:725-734(1993)描述的。最后，也可以通过自干细胞克隆未重排的V基因区段，并使用含有随机序列的PCR引物编码高度可变的CDR3区并在体外实现重排来合成生成未免疫文库，如由Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)所描述的。描述人抗体噬菌体文库的专利公开文本包括例如：美国专利No.5,750,373，和美国专利公开文本No.2005/0079574,2005/0119455,2005/0266000,2007/0117126,2007/0160598,2007/0237764,2007/0292936和2009/0002360。
认为自人抗体文库分离的抗体或抗体片段是本文中的人抗体或人抗体片段。
6.多特异性抗体
在某些实施方案中，本文中提供的抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，结合特异性之一针对LGR5，而另一种针对任何其它抗原。在某些实施方案中，结合特异性之一针对LGR5，而另一种针对CD3。参见例如美国专利No.5,821,337。在某些实施方案中，双特异性抗体可以结合LGR5的两个不同表位。也可以使用双特异性抗体来将细胞毒剂定位于表达LGR5的细胞。双特异性抗体可以以全长抗体或抗体片段制备。
用于生成多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两对免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(见Milstein和Cuello,Nature305:537(1983))，WO93/08829，和Traunecker等,EMBOJ.10:3655(1991))，和“突起-入-空穴”工程化(见例如美国专利No.5,731,168)。也可以通过用于生成抗体Fc-异二聚体分子的工程化静电操纵效应(WO2009/089004A1)；交联两个或更多个抗体或片段(见例如美国专利No.4,676,980,及Brennan等,Science,229:81(1985))；使用亮氨酸拉链来生成双特异性抗体(见例如Kostelny等,J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992))；使用用于生成双特异性抗体片段的“双抗体”技术(见例如Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993))；及使用单链Fv(sFv)二聚体(见例如Gruber等,J.Immunol.,152:5368(1994))；及如例如Tutt等,J.Immunol.147:60(1991)中所描述的，制备三特异性抗体来生成多特异性抗体。
本文中还包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化改造抗体，包括“章鱼抗体”(见例如US2006/0025576A1)。
本文中的抗体或片段还包括包含结合LGR5及另一种不同抗原的抗原结合位点的“双重作用FAb”或“DAF”(见例如US2008/0069820)。
7.抗体变体
在某些实施方案中，涵盖本文中提供的抗体的氨基酸序列变体。例如，可以期望改善抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。可以通过将合适的修饰引入编码抗体的核苷酸序列中，或者通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如对抗体的氨基酸序列内的残基的删除，和/或插入和/或替代。可以进行删除，插入，和替代的任何组合以得到最终的构建体，只要最终的构建体拥有期望的特征，例如，抗原结合。
a)替代，插入，和删除变体
在某些实施方案中，提供了具有一处或多处氨基酸替代的抗体变体。替代诱变感兴趣的位点包括HVR和FR。保守替代在表1中在“优选的替代”的标题下显示。更实质的变化在表1中在“例示性替代”的标题下提供，并且如下文参照氨基酸侧链类别进一步描述的。可以将氨基酸替代引入感兴趣的抗体中，并且对产物筛选期望的活性，例如保留/改善的抗原结合，降低的免疫原性，或改善的ADCC或CDC。
表1
依照共同的侧链特性，氨基酸可以如下分组：
(1)疏水性的：正亮氨酸,Met,Ala,Val,Leu,Ile；
(2)中性，亲水性的：Cys,Ser,Thr,Asn,Gln；
(3)酸性的：Asp,Glu；
(4)碱性的：His,Lys,Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly,Pro；
(6)芳香族的：Trp,Tyr,Phe。
非保守替代会需要用这些类别之一的成员替换另一个类别的。
一类替代变体牵涉替代亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。一般地，为进一步研究选择的所得变体相对于亲本抗体会具有某些生物学特性的改变(例如改善)(例如升高的亲和力，降低的免疫原性)和/或会基本上保留亲本抗体的某些生物学特性。例示性的替代变体是亲和力成熟的抗体，其可以例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术诸如本文中所描述的那些技术来方便地生成。简言之，将一个或多个HVR残基突变，并将变体抗体在噬菌体上展示，并对其筛选特定的生物学活性(例如结合亲和力)。
可以对HVR做出变化(例如，替代)，例如以改善抗体亲和力。可以对HVR“热点”，即由在体细胞成熟过程期间以高频率经历突变的密码子编码的残基(见例如Chowdhury,MethodsMol.Biol.207:179-196(2008))，和/或SDR(a-CDR)做出此类变化，其中对所得的变体VH或VL测试结合亲和力。通过次级文库的构建和再选择进行的亲和力成熟已经记载于例如Hoogenboom等,于MethodsinMolecularBiology178:1-37(O’Brien等编,HumanPress,Totowa,NJ,(2001))。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法(例如，易错PCR，链改组，或寡核苷酸指导的诱变)将多样性引入为成熟选择的可变基因。然后，创建次级文库。然后，筛选文库以鉴定具有期望的亲和力的任何抗体变体。另一种引入多样性的方法牵涉HVR指导的方法，其中将几个HVR残基(例如，一次4-6个残基)随机化。可以例如使用丙氨酸扫描诱变或建模来特异性鉴定牵涉抗原结合的HVR残基。特别地，经常靶向CDR-H3和CDR-L3。
在某些实施方案中，可以在一个或多个HVR内发生替代，插入，或删除，只要此类变化不实质性降低抗体结合抗原的能力。例如，可以对HVR做出保守变化(例如，保守替代，如本文中提供的)，其不实质性降低结合亲和力。此类变化可以在HVR“热点”或SDR外部。在上文提供的变体VH和VL序列的某些实施方案中，每个HVR是未改变的，或者含有不超过1，2或3处氨基酸替代。
一种可用于鉴定抗体中可以作为诱变靶位的残基或区域的方法称作“丙氨酸扫描诱变”，如由Cunningham和Wells(1989)Science,244:1081-1085所描述的。在此方法中，将残基或靶残基的组(例如，带电荷的残基诸如arg，asp，his，lys，和glu)鉴定，并用中性或带负电荷的氨基酸(例如，丙氨酸或多丙氨酸)替换以测定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可以在对初始替代表明功能敏感性的氨基酸位置引入进一步的替代。或者/另外，利用抗原-抗体复合物的晶体结构来鉴定抗体与抗原间的接触点。作为替代的候选，可以靶向或消除此类接触残基和邻近残基。可以筛选变体以确定它们是否含有期望的特性。
氨基酸序列插入包括长度范围为1个残基至含有100或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基端融合，及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有N端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其它插入变体包括抗体的N或C端与酶(例如对于ADEPT)或延长抗体的血清半衰期的多肽的融合物。
b)糖基化变体
在某些实施方案中，改变本文中提供的抗体以提高或降低抗体糖基化的程度。可以通过改变氨基酸序列，使得创建或消除一个或多个糖基化位点来方便地实现对抗体的糖基化位点的添加或删除。
在抗体包含Fc区的情况中，可以改变其附着的碳水化合物。由哺乳动物细胞生成的天然抗体通常包含分支的，双触角寡糖，其一般通过N连接附着于Fc区的CH2域的Asn297。见例如Wright等,TIBTECH15:26-32(1997)。寡糖可以包括各种碳水化合物，例如，甘露糖，N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)，半乳糖，和唾液酸，以及附着于双触角寡糖结构“主干”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些实施方案中，可以对抗体中的寡糖进行修饰以创建具有某些改善的特性的抗体变体。
在一个实施方案中，提供了抗体变体，其具有缺乏附着(直接或间接)于Fc区的岩藻糖的碳水化合物结构。例如，此类抗体中的岩藻糖量可以是1％至80％，1％至65％，5％至65％或20％至40％。通过相对于附着于Asn297的所有糖结构(例如，复合的，杂合的和高甘露糖的结构)的总和，计算Asn297处糖链内岩藻糖的平均量来测定岩藻糖量，如通过MALDI-TOF质谱术测量的，例如如记载于WO2008/077546的。Asn297指位于Fc区中的约第297位(Fc区残基的Eu编号方式)的天冬酰胺残基；然而，Asn297也可以由于抗体中的微小序列变异而位于第297位上游或下游约±3个氨基酸，即在第294位和第300位之间。此类岩藻糖基化变体可以具有改善的ADCC功能。见例如美国专利公开文本No.US2003/0157108(Presta,L.)；US2004/0093621(KyowaHakkoKogyoCo.,Ltd)。涉及“脱岩藻糖基化的”或“岩藻糖缺乏的”抗体变体的出版物的例子包括：US2003/0157108；WO2000/61739；WO2001/29246；US2003/0115614；US2002/0164328；US2004/0093621；US2004/0132140；US2004/0110704；US2004/0110282；US2004/0109865；WO2003/085119；WO2003/084570；WO2005/035586；WO2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等,J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等,Biotech.Bioeng.87:614(2004)。能够生成脱岩藻糖基化抗体的细胞系的例子包括蛋白质岩藻糖基化缺陷的Lec13CHO细胞(Ripka等,Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；美国专利申请NoUS2003/0157108A1,Presta,L；及WO2004/056312A1,Adams等，尤其在实施例11)，和敲除细胞系，诸如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因FUT8敲除CHO细胞(见例如Yamane-Ohnuki等,Biotech.Bioeng.87:614(2004)；Kanda,Y.等,Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006)；及WO2003/085107)。
进一步提供了具有两分型寡糖的抗体变体，例如其中附着于抗体Fc区的双触角寡糖是通过GlcNAc两分的。此类抗体变体可以具有降低的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。此类抗体变体的例子记载于例如WO2003/011878(Jean-Mairet等)；美国专利No.6,602,684(Umana等)；及US2005/0123546(Umana等)。还提供了在附着于Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。此类抗体变体可以具有改善的CDC功能。此类抗体变体记载于例如WO1997/30087(Patel等)；WO1998/58964(Raju,S.)；及WO1999/22764(Raju,S.)。
c)Fc区变体
在某些实施方案中，可以将一处或多处氨基酸修饰引入本文中提供的抗体的Fc区中，由此生成Fc区变体。Fc区变体可以包含在一个或多个氨基酸位置包含氨基酸修饰(例如替代)的人Fc区序列(例如，人IgG1，IgG2，IgG3或IgG4Fc区)。
在某些实施方案中，涵盖拥有一些但不是所有效应器功能的抗体变体可用于本文所述方法，所述效应器功能使其成为如下应用的期望候选物，其中抗体的体内半衰期是重要的，而某些效应器功能(诸如补体和ADCC)是不必要的或有害的。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定法以确认CDC和/或ADCC活性的降低/消减。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定法以确保抗体缺乏FcγR结合(因此有可能缺乏ADCC活性)，但是保留FcRn结合能力。介导ADCC的主要细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI，FcγRII和FcγRIII。在Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)的第464页上的表3中汇总了造血细胞上的FcR表达。评估感兴趣分子的ADCC活性的体外测定法的非限制性例子记载于美国专利No.5,500,362(见例如Hellstrom,I.等,Proc.Nat’lAcad.Sci.USA83:7059-7063(1986))和Hellstrom,I等,Proc.Nat’lAcad.Sci.USA82:1499-1502(1985)；5,821,337(见Bruggemann,M.等,J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))。或者，可以采用非放射性测定方法(见例如用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定法(CellTechnology,Inc.MountainView,CA；和CytoTox非放射性细胞毒性测定法(Promega,Madison,WI))。对于此类测定法有用的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可以在体内评估感兴趣分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如披露于Clynes等,Proc.Nat’lAcad.Sci.USA95:652-656(1998)的。也可以实施C1q结合测定法以确认抗体不能结合C1q，并且因此缺乏CDC活性。见例如WO2006/029879和WO2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活，可以实施CDC测定法(见例如Gazzano-Santoro等,J.Immunol.Methods202:163(1996)；Cragg,M.S.等,Blood101:1045-1052(2003)；及Cragg,M.S.和M.J.Glennie,Blood103:2738-2743(2004))。也可以使用本领域中已知的方法来实施FcRn结合和体内清除/半衰期测定(见例如Petkova,S.B.等,Int’l.Immunol.18(12):1759-1769(2006))。
具有降低的效应器功能的抗体包括那些具有Fc区残基238,265,269,270,297,327和329中的一个或多个的替代的(美国专利No.6,737,056)。此类Fc突变体包括在氨基酸位置265，269，270，297和327中的两处或更多处具有替代的Fc突变体，包括残基265和297替代成丙氨酸的所谓的“DANA”Fc突变体(美国专利No.7,332,581)。
描述了具有改善的或降低的对FcR的结合的某些抗体变体(见例如美国专利No.6,737,056；WO2004/056312，及Shields等,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001))。
在某些实施方案中，抗体变体包含具有改善ADCC的一处或多处氨基酸替代，例如Fc区的位置298，333，和/或334(残基的EU编号方式)的替代的Fc区。
在一些实施方案中，对Fc区做出改变，其导致改变的(即，改善的或降低的)C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，例如，如记载于美国专利No.6,194,551，WO99/51642，及Idusogie等,J.Immunol.164:4178-4184(2000)的。
具有延长的半衰期和改善的对新生儿Fc受体(FcRn)的结合的抗体记载于US2005/0014934A1(Hinton等)，新生儿Fc受体(FcRn)负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer等,J.Immunol.117:587(1976)及Kim等,J.Immunol.24:249(1994))。那些抗体包含其中具有改善Fc区对FcRn结合的一处或多处替代的Fc区。此类Fc变体包括那些在Fc区残基238,256,265,272,286,303,305,307,311,312,317,340,356,360,362,376,378,380,382,413,424或434中的一处或多处具有替代，例如，Fc区残基434的替代的(美国专利No.7,371,826)。
还可见Duncan和Winter,Nature322:738-40(1988)；美国专利No.5,648,260；美国专利No.5,624,821；及WO94/29351，其关注Fc区变体的其它例子。
d)经半胱氨酸工程化改造的抗体变体
在某些实施方案中，可以期望创建经半胱氨酸工程化改造的抗体，例如，“thioMAb”，其中抗体的一个或多个残基用半胱氨酸残基替代。在具体的实施方案中，替代的残基存在于抗体的可接近位点。通过用半胱氨酸替代那些残基，反应性硫醇基团由此定位于抗体的可接近位点，并且可以用于将抗体与其它模块，诸如药物模块或接头-药物模块缀合，以创建免疫缀合物，如本文中进一步描述的。在某些实施方案中，可以用半胱氨酸替代下列残基之任一个或多个：轻链的V205(Kabat编号方式)；重链的A118(EU编号方式)；和重链Fc区的S400(EU编号方式)。可以如例如美国专利No.7,521,541所述生成经半胱氨酸工程化改造的抗体。
别的例示性V205C半胱氨酸改造的thiomab包含：轻链，其包含选自SEQIDNO：3，5，7，9，11，13，15，17，19，21和23的可变区和SEQIDNO：80的恒定区；和重链，其包含选自SEQIDNO：4，6，8，10，12，14，16，18，20，22和24的可变区和人重链恒定区，诸如IgG1。别的例示性A118C半胱氨酸改造的thiomab包含：轻链，其包含选自SEQIDNO：3，5，7，9，11，13，15，17，19，21和23的可变区和人轻链恒定区，诸如卡帕轻链恒定区；和重链，其包含选自SEQIDNO：4，6，8，10，12，14，16，18，20，22和24的可变区和恒定区。别的例示性S400C半胱氨酸改造的thiomab包含：轻链，其包含选自SEQIDNO：3，5，7，9，11，13，15，17，19，21和23的可变区和人轻链恒定区，诸如卡帕轻链恒定区；和重链，其包含选自SEQIDNO：4，6，8，10，12，14，16，18，20，22和24的可变区和恒定区。
e)抗体衍生物
在某些实施方案中，可以进一步修饰本文中提供的抗体以含有本领域知道的且易于获得的额外非蛋白质性质模块。适合于抗体衍生化的模块包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包括但不限于聚乙二醇(PEG)，乙二醇/丙二醇共聚物，羧甲基纤维素，右旋糖苷，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，聚-1,3-二氧戊环，聚-1,3,6-三口恶烷，乙烯/马来酸酐共聚物，聚氨基酸(均聚物或随机共聚物)，和右旋糖苷或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇，丙二醇均聚物，环氧丙烷/环氧乙烷共聚物，聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)，聚乙烯醇及其混合物。由于其在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛在生产中可能具有优势。聚合物可以是任何分子量，而且可以是分支的或不分支的。附着到抗体上的聚合物数目可以变化，而且如果附着了超过一个聚合物，那么它们可以是相同或不同的分子。一般而言，可根据下列考虑来确定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型，包括但不限于抗体要改进的具体特性或功能，抗体衍生物是否将用于指定条件下的治疗等。
在另一个实施方案中，提供了抗体和可以通过暴露于辐射选择性加热的非蛋白质性质模块的缀合物。在一个实施方案中，非蛋白质性质模块是碳纳米管(Kam等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA102:11600-11605(2005))。辐射可以是任何波长的，并且包括但不限于对普通细胞没有损害，但是将非蛋白质性质模块加热至抗体-非蛋白质性质模块附近的细胞被杀死的温度的波长。
C.重组方法和组合物
可以使用重组方法和组合物来生成抗体，例如，如记载于美国专利No.4,816,567的。在一个实施方案中，提供了编码本文中所描述的抗LGR5抗体的分离的核酸。此类核酸可以编码包含抗体VL的氨基酸序列和/或包含VH的氨基酸序列(例如，抗体的轻和/或重链)。在又一个实施方案中，提供了包含此类核酸的一种或多种载体(例如，表达载体)。在又一个实施方案中，提供了包含此类核酸的宿主细胞。在一个此类实施方案中，宿主细胞包含(例如，已经用下列载体转化)：(1)包含核酸的载体，所述核酸编码包含抗体的VL的氨基酸序列和包含抗体的VH的氨基酸序列，或(2)第一载体和第二载体，所述第一载体包含编码包含抗体的VL的氨基酸序列的核酸，所述第二载体包含编码包含抗体的VH的氨基酸序列的核酸。在一个实施方案中，宿主细胞是真核的，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如，Y0，NS0，Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供了生成抗LGR5抗体的方法，其中该方法包括在适合于表达抗体的条件下培养包含编码抗体的核酸的宿主细胞，如上文提供的，并且任选地，自宿主细胞(或宿主细胞培养液)回收抗体。
对于抗LGR5抗体的重组生成，将编码抗体的核酸(例如如上文所描述的)分离，并插入一种或多种载体中，以在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可以使用常规规程将此类核酸容易地分离并测序(例如，通过使用寡核苷酸探针来进行，所述寡核苷酸探针能够特异性结合编码抗体的重和轻链的基因)。
适合于克隆或表达抗体编码载体的宿主细胞包括本文中所描述的原核或真核细胞。例如，可以在细菌中生成抗体，特别是在不需要糖基化和Fc效应器功能时。对于抗体片段和多肽在细菌中的表达，见例如美国专利No.5,648,237,5,789,199和5,840,523(还可见Charlton,MethodsinMolecularBiology,第248卷(B.K.C.Lo编,HumanaPress,Totowa,NJ,2003),第245-254页，其描述了抗体片段在大肠杆菌(E.coli.)中的表达)。表达后，可以将抗体在可溶性级分中自细菌细胞团糊分离，并可以进一步纯化。
在原核生物外，真核微生物诸如丝状真菌或酵母是适合于抗体编码载体的克隆或表达宿主，包括其糖基化途径已经“人源化”，导致生成具有部分或完全人的糖基化样式的抗体的真菌和酵母菌株。见Gerngross,Nat.Biotech.22:1409-1414(2004),及Li等,Nat.Biotech.24:210-215(2006)。
适合于表达糖基化抗体的宿主细胞也自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)衍生。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。已经鉴定出许多杆状病毒株，其可以与昆虫细胞一起使用，特别是用于转染草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞。
也可以利用植物细胞培养物作为宿主。见例如美国专利No.5,959,177,6,040,498,6,420,548,7,125,978和6,417,429(其描述了用于在转基因植物中生成抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
也可以使用脊椎动物细胞作为宿主。例如，适合于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可以是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其它例子是经SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(293或293细胞，如记载于例如Graham等,J.GenVirol.36:59(1977)的)；幼年仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠塞托利(sertoli)细胞(TM4细胞，如记载于例如Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980)的)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK；牛鼠(buffalorat)肝细胞(BRL3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(HepG2)；小鼠乳房肿瘤(MMT060562)；TRI细胞，如记载于例如Mather等,AnnalsN.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)的；MRC5细胞；和FS4细胞。其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216(1980))；和骨髓瘤细胞系诸如Y0，NS0和Sp2/0。关于适合于抗体生成的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，见例如Yazaki和Wu,MethodsinMolecularBiology,第248卷(B.K.C.Lo编,HumanaPress,Totowa,NJ),第255-268页(2003)。
D.测定法
可以通过本领域中已知的多种测定法对本文中提供的抗LGR5抗体鉴定，筛选，或表征其物理/化学特性和/或生物学活性。
一方面，对抗体测试其抗原结合活性，例如通过已知的方法诸如ELISA，FACS，或Western印迹来进行。
另一方面，可使用竞争测定法来鉴定与本文所述任何抗体竞争对LGR5的结合的抗体。在某些实施方案中，此类竞争性抗体结合与本文所述抗体所结合表位相同的表位(例如线性或构象表位)。用于定位抗体所结合表位的详细例示性方法见Morris(1996)“EpitopeMappingProtocols”,MethodsinMolecularBiologyvol.66(HumanaPress,Totowa,NJ)。
在一种例示性竞争测定法中，在包含第一经标记抗体(其结合LGR5，例如本文所述任何抗体)和第二未标记抗体(其要测试与第一抗体竞争对LGR5的结合的能力)的溶液中温育固定化LGR5。第二抗体可存在于杂交瘤上清液中。作为对照，在包含第一经标记抗体但不包含第二未标记抗体的溶液中温育固定化LGR5。在允许第一抗体结合LGR5的条件下温育后，除去过量的未结合抗体，并测量与固定化LGR5联合的标记物的量。如果测试样品中与固定化LGR5联合的标记物的量与对照样品相比实质性降低，那么这指示第二抗体与第一抗体竞争对LGR5的结合。参见HarlowandLane(1988)Antibodies:ALaboratoryManualch.14(ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY)。
E.免疫缀合物
本文中还提供供本文中使用的抗LGR5抗体，其包含缀合有一种或多种细胞毒剂(诸如化疗剂或化疗药物，生长抑制剂，毒素(例如蛋白质毒素，细菌，真菌，植物，或动物起源的酶活性毒素，或其片段)，或放射性同位素(即放射缀合物))的本文中抗LGR5抗体(也称作“免疫缀合物”)。
免疫缀合物容许将药物模块靶向投递至肿瘤，而且在一些实施方案中，在其中胞内积累，在那里系统施用未缀合的药物可对正常细胞导致不可接受水平的毒性(Polakis,P.(2005)CurrentOpinioninPharmacology5:382-387)。
抗体-药物缀合物(ADC)是靶向化疗分子，其通过将有力的细胞毒性药物靶向表达抗原的肿瘤细胞而组合抗体和细胞毒性药物二者的特性(Teicher,B.A.(2009)CurrentCancerDrugTargets9:982-1004)，由此通过最大化功效及最小化脱靶毒性而增强治疗指数(Carter,P.J.andSenterP.D.(2008)TheCancerJour.14(3):154-169；Chari,R.V.(2008)Acc.Chem.Res.41:98-107)。
供本文中使用的ADC化合物包括那些具有抗癌活性的。在一些实施方案中，该ADC化合物包括缀合(即共价附着)至药物模块的抗体。在一些实施方案中，经由接头将抗体共价附着至药物模块。抗体-药物缀合物(ADC)将有效剂量的药物选择性投递至肿瘤组织，由此在提高治疗指数(“治疗窗”)的同时可实现更大的选择性(即更低的有效剂量)。
抗体-药物缀合物(ADC)的药物模块(D)可包括任何具有细胞毒性或细胞抑制性效果的化合物，模块或基团。药物模块可通过包括但不限于微管蛋白结合，DNA结合或插层，和抑制RNA聚合酶，蛋白质合成，和/或拓扑异构酶的机制来发挥它们的细胞毒性和细胞抑制性效果。例示性药物模块包括但不限于美登木素生物碱(maytansinoid)，多拉司他汀(dolastatin)，奥瑞司他汀(auristatin)，加利车霉素(calicheamicin)，吡咯并苯并二氮卓(pyrrolobenzodiazepine，PBD)，奈莫柔比星(nemorubicin)及其衍生物，PNU-159682，蒽环类抗生素(anthracycline)，度卡霉素(duocarmycin)，长春花生物碱(vincaalkaloid)，紫杉烷(taxane)，单端孢菌素(trichothecene)，CC1065，喜树碱(camptothecin)，依利奈法德(elinafide)，及其具有细胞毒性活性的立体异构体，电子等排体，类似物，和衍生物。下文更为详细地讨论了此类免疫缀合物的非限制性例子。
1.例示性抗体-药物缀合物
抗体-药物缀合物(ADC)化合物的一个例示性实施方案包含靶向肿瘤细胞的抗体(Ab)，药物模块(D)，和将Ab附着至D的接头模块(L)。在一些实施方案中，经由一个或多个氨基酸残基(诸如赖氨酸和/或半胱氨酸)将抗体附着至接头模块(L)。
一种例示性ADC具有式I：
Ab-(L-D)pI
其中p为1至约20。在一些实施方案中，可缀合至抗体的药物模块的数目受到游离半胱氨酸残基的数目限制。在一些实施方案中，通过本文所述方法将游离半胱氨酸残基引入抗体氨基酸序列中。式I的例示性ADC包括但不限于具有1，2，3，或4个工程化改造的半胱氨酸氨基酸的抗体(Lyon,R.etal.(2012)MethodsinEnzym.502:123-138)。在一些实施方案中，抗体中早就存在一个或多个游离半胱氨酸残基，无需使用工程化改造，在这种情况中，可利用现有的游离半胱氨酸残基将抗体缀合至药物。在一些实施方案中，在缀合抗体之前将抗体暴露于还原条件，从而生成一个或多个游离半胱氨酸残基。
a)例示性接头
“接头”(L)为双功能或多功能模块，其可用于将一个或多个药物模块(D)连接至抗体(Ab)以形成式I的抗体-药物缀合物(ADC)。在一些实施方案中，可使用具有反应性官能度(用于共价附着至药物和抗体)的接头来制备抗体-药物缀合物(ADC)。例如，在一些实施方案中，抗体(Ab)的半胱氨酸硫醇可与接头或药物-接头中间体的反应性官能团形成键以生成ADC。
一方面，接头具有能够与抗体上存在的游离半胱氨酸反应以形成共价键的官能度。非限制性例示性此类反应性官能度包括马来酰亚胺，卤代乙酰胺，α-卤代乙酰基，活化的酯诸如琥珀酰亚胺酯，4-硝基苯基酯，五氟苯基酯，四氟苯基酯，酸酐，氯化酸，磺酰氯，异氰酸酯，和异硫氰酸酯。参见例如Klussmanetal.(2004)BioconjugateChemistry15(4):765-773第766页上的缀合方法及本文中的实施例。
在一些实施方案中，接头具有能够与抗体上存在的亲电子基团反应的官能度。例示性此类亲电子基团包括但不限于醛和酮羰基。在一些实施方案中，接头的反应性官能度的杂原子能与抗体上的亲电子基团反应并与抗体单元形成共价键。非限制性例示性此类反应性官能度包括但不限于酰肼(hydrazide)，肟(oxime)，氨基(amino)，肼(hydrazine)，硫代半卡巴腙(thiosemicarbazone)，肼羧酸酯(hydrazinecarboxylate)，和芳酰肼(arylhydrazide)。
接头可包含一种或多种接头构件。例示性接头构件包括6-马来酰亚胺基己酰基(“MC”)，马来酰亚胺基丙酰基(“MP”)，缬氨酸-瓜氨酸(“val-cit”或“vc”)，丙氨酸-苯丙氨酸(“ala-phe”)，对氨基苄氧羰基(“PAB”)，N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基硫基)戊酸酯(“SPP”)，和4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1羧酸酯(“MCC”)。本领域已知多种接头构件，下文描述了其中一些。
接头可以是便于释放药物的“可切割接头”。非限制性例示性可切割接头包括酸不稳定接头(例如包含腙)，蛋白酶敏感(例如肽酶敏感)接头，光不稳定接头，或含二硫化物接头(Charietal.(1992)CancerResearch52:127-131；US5,208,020)。
在某些实施方案中，接头具有下示式II：
-Aa-Ww-Yy-II，
其中A为“延伸物单元”(stretcherunit)，而a为0至1的整数；W为“氨基酸单元”，而w为0至12的整数；Y为“间隔物单元”(spacerunit)，而y是0，1，或2。包含式II接头的ADC具有式I(A)：Ab-(Aa-Ww-Yy-D)p，其中Ab，D，和p如上文关于式I定义的。此类接头的例示性实施方案记载于美国专利No.7,498,298，通过述及明确将其收入本文。
在一些实施方案中，接头构件包含将抗体连接至另一接头构件或药物模块的“延伸物单元”(A)。非限制性例示性延伸物单元显示于下文(其中波形线指示共价附着至抗体，药物，或别的接头构件的位点)：
在一些实施方案中，接头构件包含“氨基酸单元”(W)。在一些此类实施方案中，氨基酸单元容许蛋白酶切割接头，由此便于一暴露于胞内蛋白酶(诸如溶酶体酶)就从免疫缀合物释放药物(Doroninaetal.(2003)Nat.Biotechnol.21:778-784)。例示性氨基酸单元包括但不限于二肽，三肽，四肽，和五肽。例示性二肽包括但不限于缬氨酸-瓜氨酸(vc或val-cit)，丙氨酸-苯丙氨酸(af或ala-phe)，苯丙氨酸-赖氨酸(fk或phe-lys)，苯丙氨酸-高赖氨酸(phe-homolys)，和N-甲基-缬氨酸-瓜氨酸(Me-val-cit)。例示性三肽包括但不限于甘氨酸-缬氨酸-瓜氨酸(gly-val-cit)和甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(gly-gly-gly)。氨基酸单元可包含天然存在的氨基酸残基和/或次要氨基酸(minoraminoacid)和/或非天然存在氨基酸类似物，诸如瓜氨酸。可以针对特定酶(例如肿瘤相关蛋白酶，组织蛋白酶B，C和D，或纤溶酶蛋白酶)的酶促切割来设计和优化氨基酸单元。
典型地，可通过在两个或更多个氨基酸和/或肽片段之间形成肽键来制备肽型接头。例如，可依照液相合成法来制备此类肽键(例如E.andK.Lübke(1965)“ThePeptides”,volume1,pp76-136,AcademicPress)。
在一些实施方案中，接头构件包含将抗体连接(或是直接地或是经由延伸物单元和/或氨基酸单元)至药物模块的“间隔物单元”(Y)。间隔物单元可以是“自我牺牲的”(self-immolative)或“非自我牺牲的”。“非自我牺牲的”间隔物单元指间隔物单元的部分或整体在ADC受到切割后保持结合至药物模块的间隔物单元。非自我牺牲的间隔物单元的例子包括但不限于甘氨酸间隔物单元和甘氨酸-甘氨酸间隔物单元。在一些实施方案中，肿瘤细胞相关蛋白酶对包含甘氨酸-甘氨酸间隔物单元的ADC的酶促切割导致甘氨酸-甘氨酸-药物模块自ADC的剩余部分释放。在一些此类实施方案中，甘氨酸-甘氨酸-药物模块在肿瘤细胞中进行水解步骤，如此自药物模块切割甘氨酸-甘氨酸间隔物单元。
“自我牺牲的”间隔物单元容许释放药物模块。在某些实施方案中，接头的间隔物单元包含对氨基苯甲基单元。在一些此类实施方案中，将对氨基苯甲醇经酰胺键附着至氨基酸单元，并且在苯甲醇与药物之间生成氨基甲酸酯，甲基氨基甲酸酯，或碳酸酯(Hamannetal.(2005)ExpertOpin.Ther.Patents15:1087-1103)。在一些实施方案中，间隔物单元包含对氨基苯甲基氧羰基(PAB)。在一些实施方案中，包含自我牺牲的接头的ADC具有结构：
其中Q为-C1-C8烃基，-O-(C1-C8烃基)，-卤素，-硝基，或-氰基；m为范围为0至4的整数；X可以是一个或多个另外的间隔物单元或者可以是不存在；且p范围为1至约20。在一些实施方案中，p范围为1至10，1至7，1至5，或1至4。非限制性例示性X间隔物单元包括：和其中R1和R2独立选自H和C1-C6烃基。在一些实施方案中，R1和R2各自为-CH3。
自我牺牲的间隔物的其它例子包括但不限于在电子上与PAB基团相似的芳族化合物，诸如2-氨基咪唑-5-甲醇衍生物(美国专利No.7,375,078；Hayetal.(1999)Bioorg.Med.Chem.Lett.9:2237)和邻位或对位氨基苯甲基乙缩醛。在一些实施方案中，可使用在酰胺键水解后发生环化的间隔物，诸如取代的和未取代的4-氨基丁酸酰胺(Rodriguesetal.(1995)ChemistryBiology2:223)，恰当取代的双环[2.2.1]和双环[2.2.2]环体系(Stormetal.(1972)J.Amer.Chem.Soc.94:5815)及2-氨基苯基丙酸酰胺(Amsberryetal.(1990)J.Org.Chem.55:5867)。药物与甘氨酸残基α碳的连接是在ADC中可能有用的自我牺牲的间隔物的另一个例子(Kingsburyetal.(1984)J.Med.Chem.27:1447)。
在一些实施方案中，接头L可以为树枝状类型接头，其用于经由分支的多官能接头模块将多于一个药物模块共价结合至抗体(Sunetal.(2002)Bioorganic&MedicinalChemistryLetters12:2213-2215；Sunetal.(2003)Bioorganic&MedicinalChemistry11:1761-1768)。树枝状接头可提高药物与抗体的摩尔比，即载荷，它与ADC的效力相关。因此，在抗体仅带有一个反应性半胱氨酸硫醇基的情况中，可经由树枝状接头附着众多药物模块。
下文在式I的ADC的背景中显示非限制性例示性接头：
其中R1和R2独立选自H和C1-C6烃基。在一些实施方案中，R1和R2各自为–CH3。
其中n为0至12。在一些实施方案中，n为2至10。在一些实施方案中，n为4至8。
别的非限制性例示性ADC包括下示结构：
其中X为：
Y为：
每一个R独立为H或C1-C6烃基；且n为1至12。
在一些实施方案中，用调控溶解度和/或反应性的基团对接头进行取代。作为一个非限制性例子，带电荷的取代基诸如磺酸酯(-SO3 -)或铵可提高接头试剂的水溶性及便于接头试剂与抗体和/或药物模块的偶联反应，或便于Ab-L(抗体-接头中间体)与D或D-L(药物-接头中间体)与Ab的偶联反应，这取决于制备ADC所采用的合成路径。在一些实施方案中，将接头的一部分偶联至抗体并将接头的一部分偶联至药物，然后将Ab-(接头部分)a偶联至药物-(接头部分)b以形成式I的ADC。
化合物明确涵盖但不限于用下述接头试剂制备的ADC：二-马来酰亚胺基-三氧乙二醇(BMPEO)，N-(β-马来酰亚胺基丙基氧)-N-羟基琥珀酰亚胺酯(BMPS)，N-(ε-马来酰亚胺基己酰基氧)琥珀酰亚胺酯(EMCS)，N-[γ-马来酰亚胺基丁酰基氧]琥珀酰亚胺酯(GMBS)，1,6-己烷-二-乙烯基砜(HBVS)，琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧基-(6-氨基己酸酯)(LC-SMCC)，m-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)，4-(4-N-马来酰亚胺基苯基)丁酸酰肼(MPBH)，琥珀酰亚胺基3-(溴乙酰胺基)丙酸酯(SBAP)，琥珀酰亚胺基碘乙酸酯(SIA)，琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(SIAB)，N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(SPP)，琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)，琥珀酰亚胺基4-(p-马来酰亚胺基苯基)丁酸酯(SMPB)，琥珀酰亚胺基6-[(β-马来酰亚胺基丙酰胺基)己酸酯](SMPH)，亚氨基硫烷(IT)，sulfo-EMCS，sulfo-GMBS，sulfo-KMUS，sulfo-MBS，sulfo-SIAB，sulfo-SMCC，和sulfo-SMPB，和琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯(SVSB)，而且包括二-马来酰亚胺试剂：二硫代二马来酰亚胺基乙烷(DTME)，1,4-二马来酰亚胺基丁烷(BMB)，1,4-二马来酰亚胺基-2,3-二羟基丁烷(BMDB)，二马来酰亚胺基己烷(BMH)，二马来酰亚胺基乙烷(BMOE)，BM(PEG)2(下文所示)，和BM(PEG)3(下文所示)；亚胺酸酯(诸如盐酸己二酰亚胺酸二甲酯)，活性酯(诸如辛二酸二琥珀酰亚胺基酯)，醛(诸如戊二醛)，双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)，双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)乙二胺)，二异氰酸酯(诸如甲苯2,6-二异氰酸酯)，和双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)的双功能衍生物。在一些实施方案中，二-马来酰亚胺试剂容许将抗体中的半胱氨酸的硫醇基团附着至含硫醇的药物模块，接头，或接头-药物中间体。与硫醇基团反应性的其它官能团包括但不限于碘乙酰胺，溴乙酰胺，乙烯基吡啶，二硫化物，吡啶基二硫化物，异氰酸酯，和异硫氰酸酯。
某些有用的接头试剂可得自各种商业来源，诸如PierceBiotechnology,Inc.(Rockford，IL)，MolecularBiosciencesInc.(Boulder，CO)，或者依照本领域中记载的规程合成；例如Tokietal.(2002)J.Org.Chem.67:1866-1872；Dubowchiketal.(1997)TetrahedronLetters38:5257-60；Walker,M.A.(1995)J.Org.Chem.60:5352-5355；Frischetal.(1996)BioconjugateChem.7:180-186；US6,214,345；WO02/088172；US2003130189；US2003096743；WO03/026577；WO03/043583；及WO04/032828。
碳-14标记的1-异硫氰酸苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸缀合至抗体的一种例示性螯合剂。参见例如WO94/11026。
b)例示性药物模块
(1)美登素和美登木素生物碱
在一些实施方案中，免疫缀合物包含缀合至一个或多个美登木素生物碱分子的抗体。美登木素生物碱是美登素(maytansine)的衍生物，而且是通过抑制微管蛋白聚合来发挥作用的有丝分裂抑制剂。美登素最初从东非灌木齿叶美登木(Maytenusserrata)分离得到(美国专利No.3,896,111)。随后发现某些微生物也生成美登木素生物碱，诸如美登醇和C-3美登醇酯(美国专利No.4,151,042)。例如下述美国专利公开了合成美登木素生物碱：4,137,230；4,248,870；4,256,746；4,260,608；4,265,814；4,294,757；4,307,016；4,308,268；4,308,269；4,309,428；4,313,946；4,315,929；4,317,821；4,322,348；4,331,598；4,361,650；4,364,866；4,424,219；4,450,254；4,362,663；及4,371,533。
美登木素生物碱药物模块在抗体-药物缀合物中是有吸引力的药物模块，因为它们：(i)相对易于通过发酵或发酵产物的化学修饰或衍生化来制备；(ii)易于用适于经由非二硫化物接头缀合至抗体的官能团衍生化；(iii)在血浆中稳定；且(iv)有效针对多种肿瘤细胞系。
适于用作美登木素生物碱药物模块的某些美登木素生物碱是本领域已知的，而且可以依照已知方法自天然来源分离，或是使用遗传工程技术生产(参见例如Yuetal.(2002)PNAS99:7968-7973)。美登木素生物碱也可依照已知方法合成制备。
例示性美登木素生物碱药物模块包括但不限于那些具有经修饰的芳香环的，诸如：C-19-脱氯(美国专利No.4,256,746)(例如通过安丝菌素(ansamytocin)P2的氢化铝锂还原来制备)；C-20-羟基(或C-20-脱甲基)+/-C-19-脱氯(美国专利No.4,361,650和No.4,307,016)(例如通过使用链霉菌或放线菌的脱甲基化或使用LAH的脱氯化来制备)；及C-20-脱甲氧基，C-20-酰氧基(-OCOR)，+/-脱氯(美国专利No.4,294,757)(例如通过使用酰氯的酰化来制备)，以及那些在芳香环的其它位置具有修饰的。
例示性美登木素生物碱药物模块还包括那些具有修饰的，诸如：C-9-SH(美国专利No.4,424,219)(例如通过美登醇与H2S或P2S5的反应来制备)；C-14-烷氧基甲基(脱甲氧基/CH2OR)(US4,331,598)；C-14-羟甲基或酰氧甲基(CH2OH或CH2OAc)(美国专利No.4,450,254)(例如自诺卡氏菌制备)；C-15-羟基/酰氧基(US4,364,866)(例如通过链霉菌对美登醇的转化来制备)；C-15-甲氧基(美国专利No.4,313,946和No.4,315,929)(例如自Trewianudlflora分离)；C-18-N-脱甲基(美国专利No.4,362,663和No.4,322,348)(例如通过链霉菌对美登醇的脱甲基化来制备)；及4,5-脱氧(US4,371,533)(例如通过美登醇的三氯化钛/LAH还原来制备)。
美登木素生物碱化合物上的许多位置作为连接位置是有用的。例如，可使用常规偶联技术通过与羟基的反应来形成酯连接。在一些实施方案中，反应可发生于具有羟基的C-3位，用羟甲基修饰的C-14位，用羟基修饰的C-15位，和具有羟基的C-20位。在一些实施方案中，在美登醇或美登醇类似物的C-3位形成连接。
美登木素生物碱药物模块包括那些具有下示结构的：
其中波状线表示美登木素生物碱药物模块的硫原子共价附着至ADC的接头。每一个R可以独立为H或C1-C6烃基。将酰胺基团附着至硫原子的亚烃基链可以为甲烷基(methanyl)，乙烷基(ethanyl)，或丙基，即m为1，2，或3(US633410；US5,208,020；Charietal.(1992)CancerRes.52:127-131；Liuetal.(1996)Proc.Natl.Acad.SciUSA93:8618-8623)。
ADC涵盖美登木素生物碱药物模块的所有立体异构体，即手性碳处的R和S构型的任何组合(US7,276,497；US6,913,748；US6,441,163；US633410(RE39151)；US5,208,020；Widdisonetal.(2006)J.Med.Chem.49:4392-4408，通过述及将其完整收录)。在一些实施方案中，美登木素生物碱药物模块具有下示立体化学：
美登木素生物碱药物模块的例示性实施方案包括但不限于具有下示结构的DM1，DM3，和DM4：
其中波形线表示药物的硫原子对抗体-药物缀合物的接头(L)的共价附着。
其它例示性美登木素生物碱抗体-药物缀合物具有如下结构和缩写(其中Ab为抗体，而p为1至约20。在一些实施方案中，p为1至10，p为1至7，p为1至5，或p为1至4)：
DM1经由BMPEO接头连接至抗体硫醇基团的例示性抗体-药物缀合物具有如下结构和缩写：
其中Ab为抗体；n为0，1，或2；而p为1至约20。在一些实施方案中，p为1至10，p为1至7，p为1至5，或p为1至4。
包含美登木素生物碱的免疫缀合物及其制备方法和治疗用途公开于例如美国专利No.5,208,020；No.5,416,064；US2005/0276812A1；及欧洲专利EP0425235B1，据此通过述及明确收录其公开内容。还可参见Liuetal.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:8618-8623；及Charietal.(1992)CancerResearch52:127-131。
在一些实施方案中，抗体-美登木素生物碱缀合物可通过在不显著削弱抗体或美登木素生物碱分子的生物学活性的情况下将抗体化学连接至美登木素生物碱分子来制备。参见例如美国专利No.5,208,020，据此通过述及明确收录其公开内容。在一些实施方案中，每个抗体分子缀合平均3-4个美登木素生物碱分子的ADC在对抗体的功能或溶解度没有负面影响的情况下在增强靶细胞的细胞毒性方面显示功效。在一些情况中，甚至一个分子的毒素/抗体预期增强细胞毒性，胜过使用裸抗体。
用于制备抗体-美登木素生物碱缀合物的例示性连接基团包括例如本文中描述的那些和美国专利No.5,208,020；欧洲专利0425235B1；Charietal.(1992)CancerResearch52:127-131；US2005/0276812A1；及US2005/016993A1中披露的那些，据此通过述及明确收录其公开内容。
(2)奥瑞司他汀和多拉司他汀
药物模块包括多拉司他汀，奥瑞司他汀，及其类似物和衍生物(US5,635,483；US5,780,588；US5,767,237；US6,124,431)。奥瑞司他汀是海洋软体动物化合物多拉司他汀-10的衍生物。虽然并非意图限于任何特定理论，多拉司他汀和奥瑞司他汀已经显示出干扰微管动力学，GTP水解，及核和细胞分裂(Woykeetal.(2001)Antimicrob.AgentsandChemother.45(12):3580-3584)且具有抗癌(US5,663,149)和抗真菌活性(Pettitetal.(1998)Antimicrob.AgentsChemother.42:2961-2965)。可将多拉司他汀/奥瑞司他汀药物模块经由肽药物模块的N(氨基)末端或C(羧基)末端附着于抗体(WO02/088172；Doroninaetal.(2003)NatureBiotechnology21(7):778-784；Franciscoetal.(2003)Blood102(4):1458-1465)。
例示性奥瑞司他汀实施方案包括N-末端连接的单甲基奥瑞司他汀药物模块DE和DF，披露于US7,498,298及US7,659,241，通过述及明确收录其完整公开内容：
其中DE和DF的波形线表示抗体或抗体-接头构件的共价附着位点，且每一个位置独立地：
R2选自H和C1-C8烃基；
R3选自H，C1-C8烃基，C3-C8碳环，芳基，C1-C8烃基-芳基，C1-C8烃基-(C3-C8碳环)，C3-C8杂环和C1-C8烃基-(C3-C8杂环)；
R4选自H，C1-C8烃基，C3-C8碳环，芳基，C1-C8烃基-芳基，C1-C8烃基-(C3-C8碳环)，C3-C8杂环和C1-C8烃基-(C3-C8杂环)；
R5选自H和甲基；
或者R4与R5一起形成碳环环且具有式-(CRaRb)n-，其中Ra和Rb独立地选自H，C1-C8烃基和C3-C8碳环，而n选自2，3，4，5和6；
R6选自H和C1-C8烃基；
R7选自H，C1-C8烃基，C3-C8碳环，芳基，C1-C8烃基-芳基，C1-C8烃基-(C3-C8碳环)，C3-C8杂环和C1-C8烃基-(C3-C8杂环)；
每一个R8独立地选自H，OH，C1-C8烃基，C3-C8碳环和O-(C1-C8烃基)；
R9选自H和C1-C8烃基；
R10选自芳基或C3-C8杂环；
Z为O，S，NH，或NR12，其中R12为C1-C8烃基；
R11选自H，C1-C20烃基，芳基，C3-C8杂环，-(R13O)m-R14或-(R13O)m-CH(R15)2；m为范围为1-1000的整数；
R13为C2-C8烃基；
R14为H或C1-C8烃基；
R15的每一次出现独立地为H，COOH，-(CH2)n-N(R16)2，-(CH2)n-SO3H，或-(CH2)n-SO3-C1-C8烃基；
R16的每一次出现独立地为H，C1-C8烃基，或-(CH2)n-COOH；
R18选自-C(R8)2-C(R8)2-芳基，-C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8杂环)，和-C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8碳环)；且
n为范围为0至6的整数。
在一个实施方案中，R3，R4和R7独立地为异丙基或仲丁基，而R5为-H或甲基。在一个例示性实施方案中，R3和R4各自为异丙基，R5为-H，而R7为仲丁基。
在还有另一个实施方案中，R2和R6各自为甲基，而R9为-H。
在仍有另一个实施方案中，R8的每一次出现为-OCH3。
在一个例示性实施方案中，R3和R4各自为异丙基，R2和R6各自为甲基，R5为-H，R7为仲丁基，R8的每一次出现为-OCH3，而R9为-H。
在一个实施方案中，Z为-O-或-NH-。
在一个实施方案中，R10为芳基。
在一个例示性实施方案中，R10为-苯基。
在一个例示性实施方案中，当Z为-O-时，R11为-H，甲基或叔丁基。
在一个实施方案中，当Z为-NH时，R11为-CH(R15)2，其中R15为-(CH2)n-N(R16)2，而R16为-C1-C8烃基或-(CH2)n-COOH。
在另一个实施方案中，当Z为-NH时，R11为-CH(R15)2，其中R15为-(CH2)n-SO3H。
式DE的一种例示性奥瑞司他汀实施方案为MMAE，其中波形线表示共价附着至抗体-药物缀合物的接头(L)：
式DF的一种例示性奥瑞司他汀实施方案为MMAF，其中波形线表示共价附着至抗体-药物缀合物的接头(L)：
其它例示性实施方案包括在五肽奥瑞司他汀药物模块C末端处具有苯丙氨酸羧基修饰的单甲基缬氨酸化合物(WO2007/008848)和在五肽奥瑞司他汀药物模块C末端处具有苯丙氨酸侧链修饰的单甲基缬氨酸化合物(WO2007/008603)。
包含MMAE或MMAF及各种接头构件的式I的ADC的非限制性例示性实施方案具有如下结构和缩写(其中“Ab”为抗体；p为1至约8；“Val-Cit”为缬氨酸-瓜氨酸二肽；而“S”为硫原子)：
包含MMAF及各种接头构件的式I的ADC的非限制性例示性实施方案进一步包括Ab-MC-PAB-MMAF和Ab-PAB-MMAF。包含通过不可蛋白水解切割的接头附着至抗体的MMAF的免疫缀合物已经显示出拥有与包含通过可蛋白水解切割的接头附着至抗体的MMAF的免疫缀合物相当的活性(Doroninaetal.(2006)BioconjugateChem.17:114-124)。在一些此类实施方案中，认为药物释放是通过细胞中的抗体降解来实现的。
典型地，可通过在两个或更多个氨基酸和/或肽片段之间形成肽键来制备基于肽的药物模块。可依照例如液相合成法来制备此类肽键(参见例如E.andK.Lübke,“ThePeptides”,volume1,pp76-136,1965,AcademicPress)。在一些实施方案中，奥瑞司他汀/多拉司他汀药物模块可依照下述文献中的方法来制备：US7,498,298；US5,635,483；US5,780,588；Pettitetal.(1989)J.Am.Chem.Soc.111:5463-5465；Pettitetal.(1998)Anti-CancerDrugDesign13:243-277；Pettit,G.R.etal.(1996)Synthesis719-725；Pettitetal.(1996)J.Chem.Soc.PerkinTrans.15:859-863；及Doronina(2003)Nat.Biotechnol.21(7):778-784。
在一些实施方案中，式DE的奥瑞司他汀/多拉司他汀药物模块(诸如MMAE)，和式DF的奥瑞司他汀/多拉司他汀药物模块(诸如MMAF)，和药物-接头中间体及其衍生物(诸如MC-MMAF，MC-MMAE，MC-vc-PAB-MMAF，和MC-vc-PAB-MMAE)可使用US7,498,298；Doroninaetal.(2006)BioconjugateChem.17:114-124；及Doroninaetal.(2003)Nat.Biotech.21:778-784中记载的方法来制备，然后将它们缀合至感兴趣的抗体。
(3)加利车霉素
在一些实施方案中，免疫缀合物包含缀合至一个或多个加利车霉素分子的抗体。加利车霉素抗生素家族及其类似物能够在亚皮摩尔浓度生成双链DNA断裂(Hinmanetal.(1993)CancerResearch53:3336-3342；Lodeetal.(1998)CancerResearch58:2925-2928)。加利车霉素具有胞内作用位点，但在某些情况中不易穿过质膜。因此，这些试剂经由抗体介导的内在化的细胞摄取在一些实施方案中可大大增强它们的细胞毒性效果。制备带有加利车霉素药物模块的抗体-药物缀合物的非限制性例示性方法记载于例如US5,712,374；US5,714,586；US5,739,116；及US5,767,285。
(4)吡咯并苯并二氮卓
在一些实施方案中，ADC包含吡咯并苯并二氮卓(PBD)。在一些实施方案中，PDB二聚体识别并结合特定DNA序列。天然产物安曲霉素(anthramycin)(一种PBD)首次报告于1965年(Leimgruberetal.(1965)J.Am.Chem.Soc.87:5793-5795；Leimgruberetal.(1965)J.Am.Chem.Soc.87:5791-5793)。自此以后，报告了一些PBD(天然发生的和类似物二者)(Thurstonetal.(1994)Chem.Rev.1994,433-465)，包括三环PBD支架的二聚体(US6,884,799；US7,049,311；US7,067,511；US7,265,105；US7,511,032；US7,528,126；US7,557,099)。并非意图限于任何特定理论，认为二聚体结构赋予适宜的三维形状以实现与B型DNA的小沟的同螺旋度(isohelicity)，导致在结合位点处的紧密贴合(Kohn,inAntibioticsIII.Springer-Verlag,NewYork,pp.3-11(1975)；HurleyandNeedham-VanDevanter(1986)Acc.Chem.Res.19:230-237)。携带C2芳基取代基的二聚PBD化合物已经显示出作为细胞毒剂是有用的(Hartleyetal.(2010)CancerRes.70(17):6849-6858；Antonow(2010)J.Med.Chem.53(7):2927-2941；Howardetal.(2009)BioorganicandMed.Chem.Letters19(22):6463-6466)。
已经将PBD二聚体缀合至抗体，而且所得ADC显示出具有抗癌特性。PBD二聚体上的非限制性例示性连接位点包括五元吡咯环，PBD单元之间的系链，和N10-C11亚胺基团(WO2009/016516；US2009/304710；US2010/047257；US2009/036431；US2011/0256157；WO2011/130598)。
ADC的非限制性例示性PBD二聚体构件为式A：
及其盐和溶剂合物，其中：
波形线表示共价附着至接头的位点；
虚线表示C1与C2或C2与C3之间任选存在双键；
R2独立地选自H，OH，＝O，＝CH2，CN，R，OR，＝CH-RD，＝C(RD)2，O-SO2-R，CO2R和COR，且任选还选自卤素或二卤素，其中RD独立地选自R，CO2R，COR，CHO，CO2H，和卤素；
R6和R9独立地选自H，R，OH，OR，SH，SR，NH2，NHR，NRR’，NO2，Me3Sn和卤素；
R7独立地选自H，R，OH，OR，SH，SR，NH2，NHR，NRR’，NO2，Me3Sn和卤素；
Q独立地选自O，S和NH；
R11为H，或R，或在Q为O的情况下，SO3M，其中M为金属阳离子；
R和R’各自独立地选自任选取代的C1-8烃基，C1-12烃基，C3-8杂环基，C3-20杂环基，和C5-20芳基基团，且任选涉及基团NRR’时，R和R’与它们所附着的氮原子一起形成任选取代的4，5，6或7元杂环环；
R12，R16，R19和R17分别如为R2，R6，R9和R7定义的；
R”为C3-12亚烃基基团，该链可以由一个或多个杂原子(例如O，S，N(H)，NMe)和/或芳香环(例如苯或吡啶)(该环是任选取代的)中断；
且X和X’独立地选自O，S和N(H)。
在一些实施方案中，R和R’各自独立选自任选取代的C1-12烃基，C3-20杂环，和C5-20芳基，且任选涉及基团NRR’时，R和R’与它们所附着的氮原子一起形成任选取代的4，5，6或7元杂环环。
在一些实施方案中，R9和R19为H。
在一些实施方案中，R6和R16为H。
在一些实施方案中，R7和R17均为OR7A，其中R7A为任选取代的C1-4烃基。在一些实施方案中，R7A为Me。在一些实施方案中，R7A为Ch2PH，其中Ph为苯基基团。
在一些实施方案中，X为O。
在一些实施方案中，R11为H。
在一些实施方案中，每一个单体单元中的C2与C3之间存在双键。
在一些实施方案中，R2和R12独立选自H和R。在一些实施方案中，R2和R12独立为R。在一些实施方案中，R2和R12独立为任选取代的C5-20芳基或C5-7芳基或C8-10芳基。在一些实施方案中，R2和R12独立为任选取代的苯基，噻吩基，萘基，吡啶基，喹啉基，或异喹啉基。在一些实施方案中，R2和R12独立选自＝O，＝CH2，＝CH-RD，和＝C(RD)2。在一些实施方案中，R2和R12各自为＝CH2。在一些实施方案中，R2和R12各自为H。在一些实施方案中，R2和R12各自为＝O。在一些实施方案中，R2和R12各自为＝CF2。在一些实施方案中，R2和/或R12独立为＝C(RD)2。在一些实施方案中，R2和/或R12独立为＝CH-RD。
在一些实施方案中，当R2和/或R12为＝CH-RD时，每一个基团可独立具有下文所示任一构型：
在一些实施方案中，一个＝CH-RD处于构型(I)。
在一些实施方案中，R”为C3亚烃基基团或C5亚烃基基团。
在一些实施方案中，ADC的一种例示性PBD二聚体构件具有式A(I)的结构：
其中n为0或1。
在一些实施方案中，ADC的一种例示性PBD二聚体构件具有式A(II)的结构：
其中n为0或1。
在一些实施方案中，ADC的一种例示性PBD二聚体构件具有式A(III)的结构：
其中RE和RE”各自独立选自H或RD，其中RD如上文定义的；且
其中n为0或1。
在一些实施方案中，n为0。在一些实施方案中，n为1。在一些实施方案中，RE和/或RE”为H。在一些实施方案中，RE和RE”为H。在一些实施方案中，RE和/或RE”为RD，其中RD为任选取代的C1-12烃基。在一些实施方案中，RE和/或RE”为RD，其中RD为甲基。
在一些实施方案中，ADC的一种例示性PBD二聚体构件具有式A(IV)的结构：
其中Ar1和Ar2各自独立为任选取代的C5-20芳基；其中Ar1和Ar2可以是相同的或不同的；且
其中n为0或1。
在一些实施方案中，ADC的一种例示性PBD二聚体构件具有式A(V)的结构：
其中Ar1和Ar2各自独立为任选取代的C5-20芳基；其中Ar1和Ar2可以是相同的或不同的；且
其中n为0或1。
在一些实施方案中，Ar1和Ar2各自独立选自任选取代的苯基，呋喃基，硫苯基和吡啶基。在一些实施方案中，Ar1和Ar2各自独立为任选取代的苯基。在一些实施方案中，Ar1和Ar2各自独立为任选取代的噻吩-2-基或噻吩-3-基。在一些实施方案中，Ar1和Ar2各自独立为任选取代的喹啉基或异喹啉基。喹啉基或异喹啉基基团可以经由任何可利用环位置结合至PBD核。例如，喹啉基可以是喹啉-2-基，喹啉-3-基，喹啉-4-基，喹啉-5-基，喹啉-6-基，喹啉-7-基和喹啉-8-基。在一些实施方案中，喹啉基选自喹啉-3-基和喹啉-6-基。异喹啉基可以是异喹啉-1-基，异喹啉-3-基，异喹啉-4-基，异喹啉-5-基，异喹啉-6-基，异喹啉-7-基和异喹啉-8-基。在一些实施方案中，异喹啉基选自异喹啉-3-基和异喹啉-6-基。
ADC的别的非限制性例示性PBD二聚体构件为式B：
及其盐和溶剂合物，其中：
波形线表示共价附着至接头的位点；
连接至OH的波形线表示S或R构型；
RV1和RV2独立选自H，甲基，乙基和苯基(苯基可以是任选用氟取代的，特别是在4位)和C5-6杂环基；其中RV1和RV2可以是相同的或不同的；且
n为0或1。
在一些实施方案中，RV1和RV2独立选自H，苯基，和4-氟苯基。
在一些实施方案中，接头可附着于PBD二聚体药物模块的多个位点之一，包括B环的N10亚胺，C环的C-2内/外位，或连接A环的系链单元(见下文结构C(I)和C(II))。
ADC的非限制性例示性PBD二聚体构件包括式C(I)和C(II)：
式C(I)和C(II)以它们的N10-C11亚胺形式显示。例示性PBD药物模块还包括甲醇胺以及受到保护的甲醇胺形式，如下文表中显示的：
其中：
X为CH2(n＝1至5)，N，或O；
Z和Z’独立选自OR和NR2，其中R为含有1至5个碳原子的伯，仲或叔烃基链；R1，R’1，R2和R’2各自独立选自H，C1-C8烷基，C2-C8烯基，C2-C8炔基，C5-20芳基(包括取代的芳基)，C5-20杂芳基基团，-NH2，-NHMe，-OH，和-SH，其中，在一些实施方案中，烷基，烯基和炔基链包含多至5个碳原子；
R3和R’3独立选自H，OR，NHR，和NR2，其中R为含有1至5个碳原子的伯，仲或叔烃基链；
R4和R’4独立选自H，Me，和OMe；
R5选自C1-C8烷基，C2-C8烯基，C2-C8炔基，C5-20芳基(包括用卤素，硝基，氰基，烃氧基，烃基，杂环基取代的芳基)和C5-20杂芳基基团，其中，在一些实施方案中，烷基，烯基和炔基链包含多至5个碳原子；
R11为H，C1-C8烃基，或保护基团(诸如乙酰基，三氟乙酰基，叔丁氧羰基(BOC)，苄氧羰基(CBZ)，9-芴基甲基烯酰基羰基(Fmoc)，或包含自我牺牲单元的模块诸如缬氨酸-瓜氨酸-PAB)；
R12为H，C1-C8烃基，或保护基团；
其中R1，R’1，R2，R’2，R5，或R12之一的一个氢或A环之间的-OCH2CH2(X)nCH2CH2O-间隔物的一个氢用连接至ADC的接头的键替换。
ADC的例示性PDB二聚体部分包括但不限于(波形线表示共价附着至接头的位点)：
包含PBD二聚体的ADC的非限制性例示性实施方案具有下示结构：
PBD二聚体-val-cit-PAB-Ab；
PBD二聚体-Phe-Lys-PAB-Ab，其中：
n为0至12。在一些实施方案中，n为2至10。在一些实施方案中，n为4至8。在一些实施方案中，n选自4，5，6，7，和8。
PBD二聚体-val-cit-PAB-Ab和PBD二聚体-Phe-Lys-PAB-Ab的接头是蛋白酶可切割的，而PBD二聚体-马来酰亚胺-乙缩醛的接头是酸不稳定的。
PBD二聚体和包含PBD二聚体的ADC可依照本领域已知方法来制备。参见例如WO2009/016516；US2009/304710；US2010/047257；US2009/036431；US2011/0256157；WO2011/130598。
(5)蒽环类抗生素
在一些实施方案中，ADC包含蒽环类抗生素。蒽环类抗生素是展现细胞毒性活性的抗生化合物。并非意图限于任何特定理论，研究已经指出蒽环类抗生素可通过多种不同机制运作来杀伤细胞，包括：1)将药物分子插入细胞的DNA中，由此抑制DNA依赖性核酸合成；2)由药物生成自由基，然后自由基与细胞高分子反应以引起对细胞的损害，和/或3)药物分子与细胞膜相互作用(参见例如C.Petersonetal.,“TransportAndStorageOfAnthracyclineInExperimentalSystemsAndHumanLeukemia”inAnthracyclineAntibioticsIn CancerTherapy；N.R.Bachur,“FreeRadicalDamage”id.atpp.97-102)。由于它们的细胞毒性潜力，蒽环类抗生素已经用于治疗众多癌症，诸如白血病，乳腺癌，肺癌，卵巢腺癌和肉瘤(参见例如P.H-Wiernik,inAnthracycline: CurrentStatusAndNewDevelopmentsp11)。
非限制性例示性蒽环类抗生素包括多柔比星，表柔比星，伊达比星，道诺霉素，奈莫柔比星，及其衍生物。已经制备并研究柔红霉素和多柔比星的免疫缀合物和药物前体(Kratzetal.(2006)CurrentMed.Chem.13:477-523；Jeffreyetal.(2006)Bioorganic&Med.Chem.Letters16:358-362；Torgovetal.(2005)Bioconj.Chem.16:717-721；Nagyetal.(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:829-834；Dubowchiketal.(2002)Bioorg.&Med.Chem.Letters12:1529-1532；Kingetal.(2002)J.Med.Chem.45:4336-4343；EP0328147；US6,630,579)。抗体-药物缀合物BR96-多柔比星与肿瘤相关抗原Lewis-Y特异性反应，而且已经在I和II期研究中进行评估(Salehetal.(2000)J.Clin.Oncology18:2282-2292；Ajanietal.(2000)CancerJour.6:78-81；Tolcheretal.(1999)J.Clin.Oncology17:478-484)。
PNU-159682是一种有力的奈莫柔比星代谢物(或衍生物)(Quintierietal.(2005)ClinicalCancerResearch11(4):1608-1617)。奈莫柔比星是多柔比星的一种半合成类似物，在多柔比星的糖苷氨基上具有2-甲氧基吗啉基团，而且已经处于临床评估(Grandietal.(1990)CancerTreat.Rev.17:133；Ripamontietal.(1992)Brit.J.Cancer65:703)，包括针对肝细胞癌瘤的II/III期试验(Sunetal.(2003)ProceedingsoftheAmericanSocietyforClinicalOncology22,Abs1448；Quintieri(2003)ProceedingsoftheAmericanAssociationofCancerResearch44:1stEd,Abs4649；Pacciarinietal.(2006)Jour.Clin.Oncology24:14116)。
包含奈莫柔比星或奈莫柔比星衍生物的一种非限制性例示性ADC如式Ia所示：
其中R1为氢原子，羟基或甲氧基基团且R2为C1-C5烃氧基基团，或其药学可接受盐；
L1和Z一起为本文所述接头(L)；
T为本文所述抗体(Ab)；且
m为1至约20。在一些实施方案中，m为1至10，1至7，1至5，或1至4。
在一些实施方案中，R1和R2二者为甲氧基(-OMe)。
包含奈莫柔比星或奈莫柔比星衍生物的又一种非限制性例示性ADC如式Ib所示：
其中R1为氢原子，羟基或甲氧基基团且R2为C1-C5烃氧基基团，或其药学可接受盐；
L2和Z一起为本文所述接头(L)；
T为本文所述抗体(Ab)；且
m为1至约20。在一些实施方案中，m为1至10，1至7，1至5，或1至4。
在一些实施方案中，R1和R2二者为甲氧基(-OMe)。
在一些实施方案中，含奈莫柔比星的ADC的奈莫柔比星构件为PNU-159682。在一些此类实施方案中，ADC的药物部分可具有下示结构之一：
其中波形线表示附着至接头(L)。
可以经由数个连接位点和多种接头(US2011/0076287；WO2009/099741；US2010/0034837；WO2010/009124)(包括本文所述接头)将蒽环类抗生素(包括PNU-159682)缀合至抗体。
包含奈莫柔比星和接头的例示性ADC包括但不限于：
PNU-159682马来酰亚胺乙缩醛-Ab；
PNU-159682-val-cit-PAB-Ab；
PNU-159682-val-cit-PAB-间隔物-Ab；
PNU-159682-val-cit-PAB-间隔物(R1R2)-Ab，其中：
R1和R2独立选自H和C1-C6烃基；和
PNU-159682-马来酰亚胺-Ab。
PNU-159682马来酰亚胺乙缩醛-Ab的接头是酸不稳定的，而PNU-159682-val-cit-PAB-Ab，PNU-159682-val-cit-PAB-间隔物-Ab，和PNU-159682-val-cit-PAB-间隔物(R1R2)-Ab的接头是蛋白酶可切割的。
(6)其它药物模块
药物模块还包括格尔德霉素(Mandleretal.(2000)J.Nat.CancerInst.92(19):1573-1581；Mandleretal.(2000)Bioorganic&Med.Chem.Letters10:1025-1028；Mandleretal.(2002)BioconjugateChem.13:786-791)；和酶活性毒素及其片段，包括但不限于白喉毒素A链，白喉毒素的非结合活性片段，外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa))，蓖麻毒蛋白(ricin)A链，相思豆毒蛋白(abrin)A链，蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链，α-帚曲霉素(sarcin)，油桐(Aleuritesfordii)毒蛋白，香石竹(dianthin)毒蛋白，美洲商陆(Phytolacaamericana)毒蛋白(PAPI，PAPII和PAP-S)，苦瓜(Momordicacharantia)抑制物，麻疯树毒蛋白(curcin)，巴豆毒蛋白(crotin)，肥皂草(sapaonariaofficinalis)抑制物，白树毒蛋白(gelonin)，丝林霉素(mitogellin)，局限曲菌素(restrictocin)，酚霉素(phenomycin)，依诺霉素(enomycin)和单端孢菌素(tricothecenes)。参见例如WO93/21232。
药物模块还包括具有核酸降解活性的化合物(例如核糖核酸酶或DNA内切核酸酶)。
在某些实施方案中，免疫缀合物可包含高度放射性原子。多种放射性同位素可用于生成放射缀合抗体。例子包括At211，I131，I125，Y90，Re186，Re188，Sm153，Bi212，P32，Pb212和Lu的放射性同位素。在一些实施方案中，在将免疫缀合物用于检测时，它可包含用于闪烁照相研究的放射性原子，例如Tc99或I123，或是包含用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，MRI)的自旋标记物，诸如锆-89，碘-123，碘-131，铟-111，氟-19，碳-13，氮-15，氧-17，钆，锰或铁。可以将锆-89与各种金属螯合剂络合及与抗体缀合，例如用于PET成像(WO2011/056983)。
可以以已知方式将放射性标记物或其它标记物掺入免疫缀合物。例如，可生物合成肽，或是化学合成肽，其中使用包含例如一个或多个氟-19原子代替一个或多个氢的合适氨基酸前体。在一些实施方案中，可以经抗体中的半胱氨酸残基来附着标记物，诸如Tc99，I123，Re186，Re188和In111。在一些实施方案中，可以经抗体的赖氨酸残基来附着钇-90。在一些实施方案中，IODOGEN法(Frakeretal.(1978)Biochem.Biophys.Res.Commun.80:49-57)可用于掺入碘-123。"MonoclonalAntibodiesinImmunoscintigraphy"(Chatal,CRCPress1989)记载了某些其它方法。
在某些实施方案中，免疫缀合物可包含缀合至药物前体活化酶的抗体。在一些此类实施方案中，药物前体活化酶将药物前体(例如肽基化疗剂，参见WO81/01145)转变成活性药物，诸如抗癌药。在一些实施方案中，此类免疫缀合物在抗体依赖性酶介导的药物前体疗法(“ADEPT”)中是有用的。可缀合至抗体的酶包括但不限于对于将含磷酸盐/酯的药物前体转变为游离药物有用的碱性磷酸酶；对于将含硫酸盐/酯的药物前体转变为游离药物有用的芳基硫酸酯酶；对于将无毒5-氟胞嘧啶转变为抗癌药物5-氟尿嘧啶有用的胞嘧啶脱氨酶；对于将含肽的药物前体转变为游离药物有用的蛋白酶，诸如沙雷氏菌蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，枯草杆菌蛋白酶，羧肽酶和组织蛋白酶(诸如组织蛋白酶B和L)；对于转化含D-氨基酸替代的药物前体有用的D-丙氨酰羧肽酶；对于将糖基化药物前体转变为游离药物有用的碳水化合物切割酶，诸如β-半乳糖苷酶和神经氨酸酶；对于将用β-内酰胺衍生的药物转变为游离药物有用的β-内酰胺酶；及对于将在其胺氮处分别用苯氧乙酰基或苯乙酰基基团衍生的药物转变为游离药物有用的青霉素酰胺酶，诸如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶。在一些实施方案中，可通过本领域共知的重组DNA技术将酶共价结合至抗体。参见例如Neubergeretal.(1984)Nature312:604-608。
c)药物载荷
药物载荷(loading)由p表示，即式I的分子中每个抗体的平均药物模块数。药物载荷的范围可以为每个抗体1至20个药物模块(D)。式I的ADC包括缀合有一定范围(1至20个)药物模块的抗体的集合。来自缀合反应的ADC制备物中每个抗体的平均药物模块数可通过常规手段来表征，诸如质谱术，ELISA测定法，和HPLC。还可测定ADC在p方面的定量分布。在一些情况中，将p为某数值的同质ADC自具有其它药物载荷的ADC分离，纯化，和表征可通过诸如反相HPLC或电泳等手段来实现。
对于一些抗体-药物缀合物，p可能受到抗体上附着位点数目限制。例如，在附着为半胱氨酸硫醇的情况中，正如上文某些例示性实施方案中的那样，抗体可能只有一个或数个半胱氨酸硫醇基团，或者可能只有一个或数个有足够反应性的硫醇基团，可附着接头。在某些实施方案中，较高的药物载荷(例如p>5)可引起某些抗体-药物缀合物的聚集，不溶性，毒性，或丧失细胞通透性。在某些实施方案中，ADC的平均药物载荷的范围为1至约8；约2至约6；或约3至约5。事实上，对于某些ADC已经显示了每个抗体的药物模块的最佳比率可以为小于8，而且可以为约2至约5(US7,498,298)。
在某些实施方案中，在缀合反应中少于理论最大值的药物模块缀合至抗体。抗体可包含例如赖氨酸残基，其不与药物-接头中间物或接头试剂反应，如下文讨论的。一般地，抗体不包含许多游离的和反应性的半胱氨酸硫醇基团，其可连接至药物模块；事实上，抗体中的大多数半胱氨酸硫醇残基作为二硫桥存在。在某些实施方案中，可以在部分或完全还原条件下用还原剂诸如二硫苏糖醇(DTT)或三羰基乙基膦(TCEP)还原抗体以产生反应性半胱氨酸硫醇基团。在某些实施方案中，将抗体置于变性条件以暴露反应性亲核基团，诸如赖氨酸或半胱氨酸。
ADC的载荷(药物/抗体比率)可以以不同方式来控制，例如通过：(i)限制药物-接头中间体或接头试剂相对于抗体的摩尔过量，(ii)限制缀合反应的时间或温度，和(iii)半胱氨酸硫醇修饰的部分或限制性还原性条件。
应当理解，在多于一个亲核基团与药物-接头中间体或与接头试剂反应的情况中，所得产物是具有一个或多个药物模块附着于抗体之分布的ADC化合物混合物。可通过对抗体特异性的和对药物特异性的双重ELISA抗体测定法自混合物计算每个抗体的平均药物数。混合物中的各种ADC分子可通过质谱术来鉴定，并通过HPLC来分离，例如疏水相互作用层析(参见例如McDonaghetal.(2006)Prot.Engr.Design&Selection19(7):299-307；Hamblettetal.(2004)Clin.CancerRes.10:7063-7070；Hamblett,K.J.etal.,“Effectofdrugloadingonthepharmacology,pharmacokinetics,andtoxicityofananti-CD30antibody-drugconjugate,”AbstractNo.624,AmericanAssociationforCancerResearch,2004AnnualMeeting,March27-31,2004,ProceedingsoftheAACR,Volume45,March2004；Alley,S.C.etal.,“Controllingthelocationofdrugattachmentinantibody-drugconjugates,”AbstractNo.627,AmericanAssociationforCancerResearch,2004AnnualMeeting,March27-31,2004,ProceedingsoftheAACR,Volume45,March2004)。在某些实施方案中，可通过电泳或层析自缀合混合物分离具有单一载荷值的同质ADC。
d)某些制备免疫缀合物的方法
可采用本领域技术人员知道的有机化学反应，条件，和试剂通过数种路径来制备式I的ADC，包括：(1)抗体的亲核基团经共价键与二价接头试剂反应以形成Ab-L，接着与药物模块D反应；和(2)药物模块的亲核基团经共价键与二价接头试剂反应以形成D-L，接着与抗体的亲核基团反应。经后一种路径制备式I的ADC的例示性方法记载于US7,498,298，通过述及明确将其收入本文。
抗体上的亲核基团包括但不限于：(i)N末端胺基团；(ii)侧链胺基团，例如赖氨酸；(iii)侧链硫醇基团，例如半胱氨酸；和(iv)在抗体糖基化的情况中糖的羟基或氨基基团。胺，硫醇，和羟基基团是亲核的，而且能够与接头模块上的亲电子基团反应以形成共价键，而接头试剂包括：(i)活性酯，诸如NHS酯，HOBt酯，卤代甲酸酯，和酸性卤化物；(ii)烃基和苄基卤化物，诸如卤代乙酰胺；和(iii)醛，酮，羧基，和马来酰亚胺基团。某些抗体具有可还原的链间二硫化物，即半胱氨酸桥。可通过用还原剂诸如DTT(二硫苏糖醇)或三羰基乙基膦(TCEP)处理使得抗体完全或部分还原，从而使抗体具有与接头试剂缀合的反应性。每个半胱氨酸桥理论上会如此形成两个反应性硫醇亲核体。可经由赖氨酸残基的修饰将别的亲核基团引入抗体，例如通过使赖氨酸残基与2-亚氨基硫烷(Traut氏试剂)反应，导致胺转变为硫醇。也可通过引入一个，两个，三个，四个，或更多个半胱氨酸残基(例如通过制备包含一个或多个非天然半胱氨酸氨基酸残基的变体抗体)而将反应性硫醇基团引入抗体。
还可通过抗体上的亲电子基团(诸如醛或酮羰基)与接头试剂或药物上的亲核基团之间的反应来生成抗体-药物缀合物。接头试剂上的有用亲核基团包括但不限于酰肼，肟，氨基，肼，硫代半卡巴腙，肼羧酸酯，和芳基酰肼。在一个实施方案中，修饰抗体以引入能够与接头试剂或药物上的亲核取代基反应的亲电子模块。在另一个实施方案中，可以用例如高碘酸盐氧化剂氧化糖基化抗体的糖，从而形成可与接头试剂或药物模块的胺基团反应的醛或酮基团。所得亚胺Schiff碱基团可形成稳定的连接，或者可以用例如硼氢化物试剂还原而形成稳定的胺连接。在一个实施方案中，糖基化抗体的碳水化合物部分与半乳糖氧化酶或偏高碘酸钠的反应可以在抗体中生成羰基(醛和酮)基团，它们能与药物上的适宜基团反应(Hermanson，BioconjugateTechniques)。在另一个实施方案中，包含N-末端丝氨酸或苏氨酸残基的抗体可以与偏高碘酸钠反应，导致生成醛替换第一个氨基酸(Geoghegan&Stroh(1992)BioconjugateChem.3:138-146；US5,362,852)。此类醛能与药物模块或接头亲核体反应。
药物模块上的例示性亲核基团包括但不限于：胺，硫醇，羟基，酰肼，肟，肼，硫代半卡巴腙，肼羧酸酯，和芳基酰肼基团，它们能够与接头模块上的亲电子基团反应而形成共价键，而接头试剂包括：(i)活性酯，诸如NHS酯，HOBt酯，卤代甲酸酯，和酸性卤化物；(ii)烃基和苄基卤化物，诸如卤代乙酰胺；(iii)醛，酮，羧基，和马来酰亚胺基团。
本文中标题为“例示性接头”的节中描述了可用于制备ADC的非限制性例示性交联剂试剂。使用此类交联剂试剂来连接两个模块(包括蛋白质性质模块和化学模块)的方法是本领域已知的。在一些实施方案中，可通过例如重组技术或肽合成来制备包含抗体和细胞毒剂的融合蛋白。重组DNA分子可包含各自编码缀合物的抗体和细胞毒性部分的区域，或是彼此毗邻或是由编码接头肽的区域分开，该接头肽不破坏缀合物的期望特性。
在还有另一个实施方案中，可以将抗体缀合至“受体”(诸如链霉亲合素)从而用于肿瘤预靶向，其中对患者施用抗体-受体缀合物，接着使用清除剂自循环清除未结合的缀合物，然后施用缀合至细胞毒剂(例如药物或放射性核苷酸)的“配体”(例如亲合素)。
F.用于诊断和检测的方法和组合物
在某些实施方案中，本文中提供的任何抗LGR5抗体可用于在本文所述任何方法中检测生物学样品中LGR5的存在。在用于本文时，术语“检测”涵盖定量或定性检测。“生物学样品”包括例如细胞或组织(例如活检材料，包括癌性或潜在癌性的基底细胞癌)。
在一个实施方案中，提供了在诊断或检测方法中使用的抗LGR5抗体。在又一方面，提供了检测生物学样品中LGR5的存在的方法。在某些实施方案中，该方法包括在容许抗LGR5抗体结合LGR5的条件下使生物学样品与抗LGR5抗体接触，如本文中所描述的，并检测是否在抗LGR5抗体与生物学样品中的LGR5间形成复合物。此类方法可以是体外或体内方法。在一个实施方案中，使用抗LGR5抗体来选择适合用抗LGR5抗体治疗的受试者，例如其中LGR5是一种用于选择患者的生物标志。在又一个实施方案中，生物学样品是细胞或组织(例如活检材料，包括癌性或潜在癌性的基底细胞癌组织)。
在又一个实施方案中，体内使用抗LGR5抗体来检测(例如通过体内成像)受试者中的LGR5阳性癌症，例如为了癌症诊断，预后，或分期，确定适宜的治疗过程，或监测癌症对治疗的响应的目的。本领域已知用于体内检测的一种方法是免疫-正电子发射体层摄影术(immuno-PET)，如记载于例如vanDongenetal.,TheOncologist12:1379-1389(2007)及Vereletal.,J.Nucl.Med.44:1271-1281(2003)。在此类实施方案中，提供了一种用于检测受试者中的LGR5阳性癌症的方法，该方法包括将经过标记的抗LGR5抗体施用于具有或怀疑具有LGR5阳性癌症的受试者，并检测所述受试者中所述经过标记的抗LGR5抗体，其中检测到所述经过标记的抗LGR5抗体指示所述受试者中的LGR5阳性癌症。在某些此类实施方案中，经过标记的抗LGR5抗体包含与正电子发射体缀合的抗LGR5抗体，诸如68Ga，18F，64Cu，86Y，76Br，89Zr，和124I。在一个具体的实施方案中，正电子发射体是89Zr。
在又一些实施方案中，诊断或检测方法包括使固定化至基片的第一抗LGR5抗体与要测试LGR5存在情况的生物学样品接触，使该基片暴露于第二抗LGR5抗体，并检测该第二抗LGR5抗体是否结合至该第一抗LGR5抗体和该生物学样品中的LGR5之间的复合物。基片可以是任何支持性介质，例如玻璃，金属，陶瓷，聚合物珠，载玻片，芯片，和其它基片。在某些实施方案中，生物学样品包括细胞或组织(例如活检材料，包括癌性或潜在癌性的基底细胞癌组织)。在某些实施方案中，第一或第二抗LGR5抗体是本文所述任何抗体。在一些此类实施方案中，第二抗LGR5抗体可以是例如本文所述8E11或自8E11衍生的抗体。在一些此类实施方案中，第二抗LGR5抗体可以是例如本文所述YW353或自YW353衍生的抗体。在一些实施方案中，第一或第二抗LGR5抗体选自例如本文所述3G12和2H6和自3G12和/或2H6衍生的抗体。
可依照任何上述实施方案来诊断或检测的例示性病症包括LGR5阳性癌症。在一些实施方案中，LGR5阳性癌症是在实施例B中本文所述条件下得到大于“0”的抗LGR5免疫组织化学(IHC)或原位杂交(ISH)得分的癌症，这对应于>90％的肿瘤细胞中染色很弱或无染色。在另一个实施方案中，LGR5阳性癌症以1+，2+或3+水平表达LGR5，如在实施例B中本文所述条件下定义的。在一些实施方案中，LGR5阳性癌症是根据检测LGR5mRNA的逆转录酶PCR(RT-PCR)测定法表达LGR5的癌症。在一些实施方案中，所述RT-PCR是定量RT-PCR。
在某些实施方案中，提供了经标记的抗LGR5抗体。标记物包括但不限于直接检测的标记物或模块(诸如荧光，发色，电子致密，化学发光，和放射性标记物)，及例如经由酶反应或分子相互作用间接检测的模块，诸如酶或配体。例示性的标记物包括但不限于放射性同位素32P，14C，125I，3H，和131I，荧光团诸如稀土螯合物或荧光素及其衍生物，罗丹明(rhodamine)及其衍生物，丹酰，伞形酮，萤光素酶，例如，萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶(美国专利No.4,737,456)，萤光素，2,3-二氢酞嗪二酮，辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖类氧化酶，例如，葡萄糖氧化酶，半乳糖氧化酶，和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，杂环氧化酶诸如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶(其与采用过氧化氢氧化染料前体的酶诸如HRP偶联)，乳过氧化物酶，或微过氧化物酶，生物素/亲合素，自旋标记物，噬菌体标记物，稳定的自由基，等等。在另一个实施方案中，标记物是正电子发射体。正电子发射体包括但不限于68Ga，18F，64Cu，86Y，76Br，89Zr，和124I。在一个具体的实施方案中，正电子发射体是89Zr。
G.药物配制剂
通过混合具有期望纯度的此类抗体(包括免疫缀合物)与一种或多种任选的药学可接受载体(Remington’sPharmaceuticalSciences,第16版,Osol,A.编(1980))以冻干配制剂或水性溶液形式制备如本文中所描述的抗LGR5抗体(包括免疫缀合物)的药物配制剂。一般地，药学可接受载体在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，而且包括但不限于缓冲剂，诸如磷酸盐，柠檬酸盐，和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵，苯索氯铵；酚，丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烃基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，组氨酸，精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖，甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖，甘露醇，海藻糖或山梨醇；成盐相反离子，诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如聚乙二醇(PEG)。本文中的例示性的药学可接受载体进一步包含间质药物分散剂诸如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，诸如rHuPH20(BaxterInternational,Inc.)。某些例示性的sHASEGP和使用方法，包括rHuPH20记载于美国专利公开文本No.2005/0260186和2006/0104968。在一方面，将sHASEGP与一种或多种别的糖胺聚糖酶诸如软骨素酶组合。
例示性的冻干抗体(包括免疫缀合物)配制剂记载于美国专利No.6,267,958。水性抗体(包括免疫缀合物)配制剂包括那些记载于美国专利No.6,171,586和WO2006/044908的，后一种配制剂包含组氨酸-乙酸盐缓冲液。
本文中的配制剂还可含有超过一种所治疗具体适应症所必需的活性组分，优选那些活性互补且彼此没有不利影响的。
活性成分可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)，在胶状药物投递系统中(例如脂质体，清蛋白微球体，微乳剂，纳米颗粒和纳米胶囊)，或在粗滴乳状液中。此类技术披露于例如Remington'sPharmaceuticalSciences,第16版,Osol,A.编(1980)。
可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适的例子包括含有抗体(包括免疫缀合物)的固体疏水性聚合物的半透性基质，该基质为成形商品形式，例如膜，或微胶囊。
用于体内施用的配制剂一般是无菌的。无菌性可容易地实现，例如通过穿过无菌滤膜过滤。
H.制品
在另一方面，提供了一种制品，其含有可用于治疗，预防和/或诊断上文所描述的病症的材料。制品包含容器和容器上或与容器联合的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶，管形瓶，注射器，IV溶液袋，等等。容器可以由多种材料诸如玻璃或塑料形成。容器容纳单独或与另一种组合物组合有效治疗，预防和/或诊断病症的组合物，并且可以具有无菌存取口(例如，容器可以是具有由皮下注射针可穿过的塞子的管形瓶或静脉内溶液袋)。组合物中的至少一种活性剂是抗体(包括免疫缀合物)。标签或包装插页指示使用组合物来治疗选择的状况。此外，制品可以包含(a)具有其中含有的组合物的第一容器，其中组合物包含抗体(包括免疫缀合物)；和(b)具有其中含有的组合物的第二容器，其中组合物包含其它的细胞毒性或其它方面治疗性的药剂。在一些实施方案中，具有其中含有的组合物的第二容器，其中所述组合物包含Hedgehog途径抑制剂。在一些实施方案中，所述Hedgehog途径抑制剂为Smoothened的拮抗剂。在一些实施方案中，所述Hedgehog途径抑制剂为Smoothened的环杷明竞争性拮抗剂。在一些实施方案中，Smoothened的拮抗剂为2-氯-N-[4-氯-3-(吡啶-2-基)苯基]-4-(甲基磺酰基)苯甲酰胺或其盐。在一些实施方案中，Smoothened的拮抗剂为2-氯-N-[4-氯-3-(吡啶-2-基)苯基]-4-(甲基磺酰基)苯甲酰胺。在一些实施方案中，Smoothened的拮抗剂为vismodegib。
在此实施方案中的制品可以进一步包含包装插页，其指示可以使用组合物来治疗特定的状况。或者/另外，制品可以进一步包含第二(或第三)容器，其包含药学可接受缓冲液，诸如抑菌性注射用水(BWFI)，磷酸盐缓冲盐水，Ringer氏溶液或右旋糖溶液。它可以进一步包含从商业和用户观点看期望的其它材料，包括其它缓冲液，稀释剂，滤器，针，和注射器。
III.实施例
以下是本发明的方法和组合物的实施例。应当理解，鉴于上文提供的一般描述，可以实施各种其它实施方案。
实施例1
LGR5DTReGFP构建
对于LGR5，将来自C57BL/6BAC(RP23文库)的一种7,213bp片段(组装NCBI37/mm9，染色体10：115,020,315-115,027,527)克隆入质粒pBlight-TK25。为了为LGR5生成DTR-EGFPKI载体，合成DTR-EGFP-pA-loxP-Neo-loxP盒(BlueHeron/Origene，DTR-EGFP序列基于先前描述的27)，并恰好插入LGR5的ATG(染色体10：115,024,547，反向链)之后，删除外显子1的剩余部分和内含子1的剪接供体(删除212bp)。为了生成CreERT2KI载体，合成dsRed2-IRES-CreERT2-pA-Frt-neo-Frt盒(BlueHeron/Origene)并在与DTR-EGFP盒相同的位置插入。通过DNA测序确认最终的载体。
用NotI线性化LGR5KI载体，并使用标准方法靶向C57BL/6C2胚胎干细胞(G418正选择和更昔洛韦(Gancyclovir)负选择)。使用PCR和Taqman分析鉴定阳性克隆，并通过对经修饰基因座测序来确认。分别用Cre或Flpe质粒转染正确靶定的胚胎干细胞以去除Neo盒。然后使用标准技术将经修饰胚胎干细胞注射入胚泡，并在将所得嵌合体与C57BL/6N雌性杂交之后获得种系传递。
浅表基底细胞癌(BCC)中的DT细胞消融
通过将p53loxP/loxP；PtchloxP/loxP；LGR5DTReGFP/+小鼠与p53loxP/loxP；PtchloxP/+；K14CreER/+交配，生成K14CreER/+；p53loxP/loxP；PtchloxP/loxP；LGR5DTReGFP/+小鼠。对显示浅表BCC疾病的警告体征(诸如掉毛，毛皮肮脏，耳或尾皮肤变厚)的动物进行研究。动物在进行研究时通常为7周龄。用下述摄生法处理K14CreER/+；p53loxP/loxP；PtchloxP/loxP；LGR5DTReGFP/+小鼠。为了测试DT处理对残留浅表BCC的效果，将小鼠以75mg/kg用Vismodegib(GDC-0449)po(口服)bid(每天两次)处理38天，以第29天开始的最后8天伴随隔天50ug/kg白喉毒素(DT)。将对照小鼠以75mg/kg用Vismodegib(GDC-0449)pobid处理38天，处理最后8天伴随200uLIP盐水。另外，隔天以50ug/kg用盐水或DT单独处理显示(上文所列)疾病体征的动物达5天以测试单一DT处理的效果。
组织学和免疫荧光染色
使用已建立的方案，为苏木精和曙红(H&E)染色加工自处理动物收获的皮肤。或者，将来自处理动物的背部皮肤在4％低聚甲醛/PBS溶液中固定过夜，清洗，在30％蔗糖/PBS溶液中温育过夜，并在冷冻OCT中包埋。然后自冷冻块以8um切出切片，并针对凋亡标志物受到切割的胱天蛋白酶3(1:1000)，GFP(1:1000)，或角蛋白5(1:1000)染色。用DAPI将切片复染色。
结果
在用盐水单独处理的动物中在浅表BCC肿瘤中观察到强GFP表达。这个结果与揭示LGR5在浅表BCC中表达的来自原位杂交实验的观察结果一致。在这些对照小鼠中，通过CC3染色标记的凋亡细胞是稀有的且隔离至毛囊。在用DT处理总共5天的小鼠中，在肿瘤中以及在毛囊中观察到显著的CC3染色。在表皮的基底细胞中没有观察到显著的凋亡，提示DT处理特异性靶向肿瘤和毛囊。
为了确定DT处理是否能靶向残留BCC，将小鼠用Vismodegib处理28天，然后用Vismodegib和DT共处理另外8天。在至少一只动物中，残留疾病是稀有的，如通过角蛋白5染色揭示的。最小限度的CC3染色提示残留疾病很大程度上在此动物中得到消除。在其它小鼠中，我们观察到在最初没有被Smoothened拮抗剂Vismodegib自皮肤清除的残留肿瘤中发生的靶定凋亡。
对来自处理和对照小鼠的多种组织实施H&E染色。与用Vismodegib单独处理相比，在用Vismodegib加DT处理的耳组织的变厚中观察到显著降低，提示用DT处理另外消融LGR5阳性细胞在去除残留疾病方面是有益的。
尽管为了清楚理解的目的已经通过例示和实施例的方式较为详细地描述了上述发明，说明书和实施例不应解释为限制发明范围。通过援引明确收录本文中引用的所有专利和科学文献的完整公开内容。
序列的表格

Claims (46)

1.一种在个体中治疗Hedgehog相关疾病的方法，其包括对该个体施用有效量的抗LGR5抗体。
2.一种在个体中治疗Hedgehog相关疾病的方法，其包括对该个体施用有效量的抗LGR5抗体和有效量的Hedgehog途径抑制剂。
3.权利要求2的方法，其中与Hedgehog途径抑制剂单独的治疗相比，所述抗LGR5抗体和所述Hedgehog途径抑制剂各自的量有效延长治疗响应时段和/或延迟复发和/或抗性发生。
4.一种在个体中提高包含Hedgehog途径抑制剂的Hedgehog相关疾病治疗的功效的方法，其中该方法包括对该个体施用有效量的抗LGR5抗体和有效量的该Hedgehog途径抑制剂。
5.一种在个体中治疗Hedgehog相关疾病的方法，其中该治疗包括对该个体施用有效量的抗LGR5抗体和有效量的Hedgehog途径抑制剂，且其中该治疗具有与包括在没有该抗LGR5抗体的情况下(在该抗LGR5抗体缺失下)施用有效量的该Hedgehog途径抑制剂的标准治疗相比升高的功效。
6.一种在个体中延迟和/或阻止Hedgehog相关疾病复发和/或Hedgehog相关疾病对Hedgehog途径抑制剂的抗性发生的方法，其包括对该个体施用有效量的抗LGR5抗体和有效量的该Hedgehog途径抑制剂。
7.一种在具有Hedgehog相关疾病的个体中提高对Hedgehog途径抑制剂的敏感性的方法，其包括对该个体施用有效量的抗LGR5抗体和有效量的该Hedgehog途径抑制剂。
8.一种在具有Hedgehog相关疾病的个体中延长对Hedgehog途径抑制剂的敏感性时段的方法，其包括对该个体施用有效量的抗LGR5抗体和有效量的该Hedgehog途径抑制剂。
9.一种在具有Hedgehog相关疾病的个体中延长对Hedgehog途径抑制剂的响应持续时间的方法，其包括对该个体施用有效量的抗LGR5抗体和有效量的该Hedgehog途径抑制剂。
10.权利要求1-9任一项的方法，其中所述抗LGR5抗体为单克隆抗体。
11.权利要求1-10任一项的方法，其中所述抗LGR5抗体结合SEQIDNO：67氨基酸22-323内或SEQIDNO：67氨基酸22-123内的表位且以≤5nM的亲和力结合LGR5。
12.权利要求1-11任一项的方法，其中所述抗LGR5抗体为人抗体，人源化抗体，或嵌合抗体。
13.权利要求1-12任一项的方法，其中所述抗LGR5抗体为结合SEQIDNO：67的人LGR5的抗体片段。
14.权利要求1-13任一项的方法，其中所述抗LGR5抗体包含：
a)包含SEQIDNO：30的氨基酸序列的HVR-H1，包含SEQIDNO：31的氨基酸序列的HVR-H2，和包含SEQIDNO：32的氨基酸序列的HVR-H3；和
b)包含SEQIDNO：27的氨基酸序列的HVR-L1，包含SEQIDNO：28的氨基酸序列的HVR-L2，和包含SEQIDNO：29的氨基酸序列的HVR-L3。
15.权利要求1-13任一项的方法，其中所述抗LGR5抗体包含：
a)包含SEQIDNO：60的氨基酸序列的HVR-H1，包含SEQIDNO：61的氨基酸序列的HVR-H2，和包含SEQIDNO：62的氨基酸序列的HVR-H3；和
b)包含SEQIDNO：57的氨基酸序列的HVR-L1，包含SEQIDNO：58的氨基酸序列的HVR-L2，和包含SEQIDNO：59的氨基酸序列的HVR-L3。
16.权利要求1-13任一项的方法，其中所述抗LGR5抗体包含：
a)SEQIDNO：6的VH序列和SEQIDNO：5的VL序列；
b)SEQIDNO：8的VH序列和SEQIDNO：7的VL序列；
c)SEQIDNO：10的VH序列和SEQIDNO：9的VL序列；
d)SEQIDNO：12的VH序列和SEQIDNO：11的VL序列；
e)SEQIDNO：14的VH序列和SEQIDNO：13的VL序列；
f)SEQIDNO：16的VH序列和SEQIDNO：15的VL序列；
g)SEQIDNO：18的VH序列和SEQIDNO：17的VL序列；
h)SEQIDNO：20的VH序列和SEQIDNO：19的VL序列；或
i)SEQIDNO：26的VH序列和SEQIDNO：25的VL序列。
17.权利要求1-16任一项的方法，其中所述抗LGR5抗体是与细胞毒剂缀合的。
18.权利要求1-17任一项的方法，其中所述抗LGR5抗体具有式Ab-(L-D)p，其中：
(a)Ab为所述抗LGR5抗体；
(b)L为接头；
(c)D为选自美登木素生物碱(maytansinoid)，奥瑞司他汀(auristatin)，加利车霉素(calicheamicin)，吡咯并苯并二氮卓(pyrrolobenzodiazepine)，和奈莫柔比星(nemorubicin)衍生物的药物；且
(d)p的范围为1-8。
19.权利要求18的方法，其中D为奥瑞司他汀。
20.权利要求18的方法，其中D具有式DE：
且其中R2和R6各自为甲基；R3和R4各自为异丙基；R5为H；R7为仲丁基；
每一个R8独立选自CH3，O-CH3，OH，和H；R9为H；且R18为-C(R8)2-C(R8)2-芳基。
21.权利要求18的方法，其中所述药物为MMAE。
22.权利要求18的方法，其中D为式A的吡咯并苯并二氮卓：
其中虚线表示C1与C2或C2与C3之间任选存在双键；
R2独立选自H，OH，＝O，＝CH2，CN，R，OR，＝CH-RD，＝C(RD)2，O-SO2-R，CO2R和COR，且任选还选自卤素或二卤素，其中RD独立选自R，CO2R，COR，CHO，CO2H，和卤素；
R6和R9独立选自H，R，OH，OR，SH，SR，NH2，NHR，NRR’，NO2，Me3Sn和卤素；
R7独立选自H，R，OH，OR，SH，SR，NH2，NHR，NRR’，NO2，Me3Sn和卤素；
Q独立选自O，S和NH；
R11为H，或R，或在Q为O的情况下，SO3M，其中M为金属阳离子；
R和R’各自独立选自任选取代的C1-8烃基，C3-8杂环基和C5-20芳基基团，
且任选涉及基团NRR’时，R和R’与它们所附着的氮原子一起形成任选取代的4，5，6或7元杂环环；
R12，R16，R19和R17分别如为R2，R6，R9和R7定义的；
R”为C3-12亚烃基基团，该链可以由一个或多个杂原子和/或任选取代的芳香环中断；且
X和X’独立选自O，S和N(H)。
23.权利要求18的方法，其中D具有结构：
其中n为0或1。
24.权利要求18的方法，其中D具有选自下示的结构：
其中RE和RE”各自独立选自H或RD，其中RD独立选自R，CO2R，COR，
CHO，CO2H，和卤素；
其中Ar1和Ar2各自独立为任选取代的C5-20芳基；且
其中n为0或1。
25.权利要求18的方法，其中D为式B的吡咯并苯并二氮卓：
其中水平波形线指示共价附着至接头的位点；RV1和RV2独立选自H，甲基，乙基，苯基，氟取代的苯基，和C5-6杂环基；且n为0或1。
26.权利要求18的方法，其中D为奈莫柔比星衍生物。
27.权利要求18的方法，其中D具有选自下示的结构：
28.权利要求18至27任一项的方法，其中所述接头是蛋白酶可切割的。
29.权利要求28的方法，其中所述接头包含val-cit二肽或Phe-Lys二肽。
30.权利要求18至27任一项的方法，其中所述接头是酸不稳定的。
31.权利要求30的方法，其中所述接头包含腙。
32.权利要求18的方法，其具有式：
其中S为硫原子。
33.权利要求18的方法，其具有式：
34.权利要求18的方法，其具有选自下示的式：
35.权利要求18至34任一项的方法，其中p的范围为2-5。
36.权利要求1至35任一项的方法，其中所述Hedgehog途径抑制剂为Smoothened受体的拮抗剂。
37.权利要求36的方法，其中所述Smoothened受体的拮抗剂为2-氯-N-[4-氯-3-(吡啶-2-基)苯基]-4-(甲基磺酰基)苯甲酰胺或其盐。
38.权利要求37的方法，其中所述Smoothened受体的拮抗剂为2-氯-N-[4-氯-3-(吡啶-2-基)苯基]-4-(甲基磺酰基)苯甲酰胺。
39.权利要求36的方法，其中所述Smoothened受体的拮抗剂为Vismodegib。
40.权利要求1-39任一项的方法，其中所述Hedgehog相关疾病为癌症。
41.权利要求40的方法，其中所述癌症为基底细胞癌。
42.权利要求41的方法，其中所述基底细胞癌为局部晚期或转移性基底细胞癌。
43.权利要求40的方法，其中所述癌症为髓母细胞瘤。
44.权利要求40-43任一项的方法，其中所述Hedgehog相关疾病是LGR5阳性的。
45.权利要求1-44任一项的方法，其中所述Hedgehog途径抑制剂与所述抗LGR5抗体伴随施用。
46.权利要求1-44任一项的方法，其中所述Hedgehog途径抑制剂与所述抗LGR5抗体分开，序贯，或同时施用。
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