CN105456311A - 一种用于防治乳腺癌、肝癌的沙棘提取物及其制备方法和其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于治疗乳腺癌、肝癌的沙棘提取物及其制备方法和其应用。本发明所述的沙棘提取物由下述方法制备得到：1)将沙棘果烘干后，制得沙棘干果；2)将沙棘干果粉碎至100～800目，制得沙棘粉；3)在4～25℃条件下，在沙棘粉中加入水，浸泡1-10h后，超声提取10min-6h，其中，沙棘粉：水的质量体积比为1：2-1：15，制得沙棘提取液；4)过滤，收集沙棘提取液，提取液经干燥，即得。该提取物对乳腺癌细胞的抑制率高达80.73％，对肝癌细胞的抑制率高达87.28％，且毒副作用小。

Description

一种用于防治乳腺癌、肝癌的沙棘提取物及其制备方法和其应用

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及一种用于防治乳腺癌、肝癌的沙棘提取物及其制备方法和其应用。

背景技术

众所周知，恶性肿瘤已成为严重威胁人类健康的多发病和常见病，但其发病机制尚未完全阐明，治疗效果亦不尽人意。

根据世界卫生组织(WHO)的统计，乳腺癌是发生在乳腺腺上皮组织的恶性肿瘤，99％发生在女性，男性仅占1％。全球每年约有120万妇女被确诊为乳腺癌患者。八名美国妇女中会有一人患乳腺癌。国家癌症中心和卫生部疾病预防控制局于2009年公布的乳腺癌发病数据显示：全国肿瘤登记地区乳腺癌发病率位居女性恶性肿瘤的第一位，已成为现代女性的“头号杀手”和当前社会重大的公共卫生问题，且乳腺癌细胞容易脱落并随血液或淋巴液播散全身，形成转移并危及生命，引发多种并发症。

沙棘(HippophaerhamnoidesLinn.)为胡颓子科(Elaeagnaceae)沙棘属(Hippophae)植物，学名HippophaerhamnoidesL.subsp.sinensisRousi，为落叶灌木或乔木，高5～10m，具粗壮棘刺。枝幼时密被褐锈色鳞片。叶互生，线性或线状披针形，两端钝尖，下面密被淡白色鳞片；叶柄极短。花先叶开放，雌雄异株；短总状花序腋生于头年枝上；花小，淡黄色，雄花花被2裂，雄蕊4；雌花花被筒囊状，顶端2裂。果为肉质花被筒包围，近球形，橙黄色。花期3～4月，果期9～10月。生于河边、高山、草原。10～11月采摘成熟果实，晒干。果实呈类球形或扁球形，有的数个粘连，单个直径5～8mm。表面橙黄色或棕红色，皱缩，基部具短小果梗或果梗痕，顶端有残存花柱。果肉油润，质柔软。种子斜卵形，长约4mm，宽约2mm，表面褐色，有光泽，中间有1纵沟，种皮较硬，种仁乳白色，有油性。气微，味酸、涩。产河北、内蒙古、山西、陕西、甘肃、青海、四川西部。常生于海拔800-3600米温带地区向阳的山嵴、谷地、干涸河床地或山坡，多砾石或沙质土壤或黄土上。中国黄土高原极为普遍。性温，味酸涩；人肝、胃、大小肠经。含异鼠李素(isorhamnetin)、异鼠李素-3-B-D-葡萄糖甙(isorhamnetin-3-B-D-glucoside)、异鼠李素-3-B-芸香糖甙(isorhamnetin-3-B-rutinoside)、槲角素及山奈酚的低糖甙(oligosides)等成份。

沙棘为胡颓子科植物中国沙棘和云南沙棘的果实，具有极好药用价值以果实入药，主要成分化合物具有强劲抗癌功效。

刘洪章等(沙棘生物学及化学成分研究，吉林农业大学博士学位论文，2003年)研究了沙棘所含的化学成分(如5-羟色胺、多糖等)，其中，5-羟色胺存在于沙棘的茎皮、果实和叶片中，具有抗癌作用；张丽萍等和王桂云等对沙棘果的多糖进行制备和分离鉴定，得到了一个中性杂多糖JS1，还公开了沙棘有效成分提取流程图，包括5-羟色胺和多糖的提取。李晓花(沙棘有效成分动态变化研究，吉林农业大学硕士学位论文，2003年)研究了沙棘所含的化学成分5-羟色胺、多糖等，5-羟色胺存在于沙棘的茎皮、果实和叶片中，具有抗癌作用；王桂云等对沙棘果的多糖进行分离鉴定，得到了一个中性杂多糖JS1，还公开了沙棘有效成分提取流程图。

前述文献并未公开沙棘提取物中的生物碱和多糖/糖类的含量，且采用不同的提取工艺。

刘雪凌等(沙棘产品的开发及应用前景，安徽农业科学，2012年)研究了沙棘叶和果实中含有多种三萜烯类、甾醇类、生物碱、糖类以及挥发性成分，其中，5-氢色胺具有抗肿瘤、抗癌作用。赵志永等(沙棘的有效成分及其保健功能研究进展，农产品加工创新版，2010年7月)研究了沙棘所含的黄酮类化合物、维生素、脂类、萜类及甾体类化合物、5-羟色胺、多糖等的种类及其保健功能，其中，5-羟色胺存在于沙棘的茎皮、果实和叶片中，具有抗癌作用。陈凡等(俄罗斯沙棘开发利用及技术推广的考察报告，辽宁林业科技，2004年)研究了沙棘果和叶含有200多种人体必需的生化成分，包括维生素、氨基酸、黄酮、甾醇、磷脂、多糖、生物碱和不饱和脂肪酸、酚类化合物、微量元素等生物活性成分。王华等(几种小浆果生物活性物质研究进展，北方园艺，2011年)研究了沙棘果和叶含有丰富的生物活性成分，其中，糖类以葡萄糖和果糖为主，并含有5-羟色胺。王鑫等(沙棘提取物及应用研究，高师理科学刊，2010年11月)研究了沙棘提取物主要有类胡萝卜素、黄酮类化合物、原花色素、多糖和沙棘油，沙棘油是果肉油和种子油的统称，是天然的抗性维生素、植物甾醇、磷脂、黄酮、生物碱等。滕晓萍等(沙棘叶研究进展综述，国际沙棘研究与开发，2010年9月)研究了沙棘叶和沙棘果一样含有极其丰富的营养成分和生理活性物质,主要包括蛋白质、多糖类、有机酸、生物碱、黄酮类,氨基酸、类胡萝卜素、叶绿素及微量元素等成份。

前述文献并未公开沙棘提取物中的生物碱和多糖/糖类的含量，也未公开具体的提取工艺，而提取条件不同将导致最终产品具有不可预期的不同组成成分。

李忌等(沙棘提取物对癌细胞DNA、蛋白质合成及体内血浆中cAMP含量的影响，厦门大学学报自然科学版，1994年7月)研究了沙棘汁系沙棘果经压榨、过滤、浓缩所得，其作为抗癌药是通过改善宿主对癌细胞的生物效应而产生抗癌作用。苟新元(沙棘B型油用于晚期癌症镇痛3例，现代中医药，2002年)研究了沙棘油具有很强的抗癌作用。孙斌(蒺藜皂苷和沙棘籽渣黄酮对乳腺癌和肝癌细胞的抑制作用，华东师范大学硕士学位论文，2004年)研究了沙棘籽渣黄酮对乳腺癌和肝癌细胞的抑制作用。

CN101073430A公开了每100克沙棘果可提取2.4％黄酮、1％沙棘多糖，沙棘黄酮具有诱导乳腺癌细胞凋亡的作用。

毛玉昌等(沙棘黄酮类化合物对人乳腺癌细胞生长抑制和凋亡诱导的研究，《现代免疫学》，2005年)研究了沙棘黄酮类化合物对人乳腺癌细胞生长抑制和凋亡诱导的研究。章平等(沙棘次生代谢物致人乳腺癌细胞Bcap-37细胞凋亡的机理研究，《科学墙报》，膜与细胞生物物理)研究了沙棘次生代谢物致人乳腺癌细胞Bcap-37细胞凋亡的机理研究。孙斌等(沙棘籽渣黄酮类化合物诱导人肝癌细胞凋亡研究，《中药材》，2003年12月)研究了沙棘籽渣黄酮类化合物诱导人肝癌细胞凋亡的作用。

前述文献均未公开沙棘提取物中的生物碱和多糖用于治疗乳腺癌、肝癌的应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种沙棘提取物的制备方法，包括下述步骤：1)将沙棘果烘干后，制得沙棘干果；2)将沙棘干果粉碎至100～800目，制得沙棘粉；3)在4～25℃条件下，在沙棘粉中加入水，浸泡1-10h后，超声提取10min-6h，其中，沙棘粉：水的质量体积比为1：2-1：15，制得沙棘提取液；4)过滤，收集沙棘提取液，提取液经干燥，即得。

本发明的优选技术方案中，所述沙棘果烘干前经筛选、除杂处理。

本发明的优选技术方案中，所述烘干温度为30～80℃，优选为40-70℃，更优选为55-65℃。

本发明的优选技术方案中，所述沙棘干果粉碎至150-700目，优选为250-600目，更优选为450-550目。

本发明的优选技术方案中，所述超声提取温度为8-20℃，优选为10-15℃。

本发明的优选技术方案中，所述沙棘粉浸泡2-8h，优选浸泡3-6h，更优选浸泡4-5h。

本发明的优选技术方案中，其中，沙棘粉与水的质量体积比为1:4-1:12，优选为1:6-1:10，最优选为1:7-1:8。

本发明的优选技术方案中，所述水选自软水、蒸馏水、去离子水的任一种或其组合。

本发明的优选技术方案中，其中，超声提取次数为1-6次，优选为2-5次，更优选为3-4次。

本发明的优选技术方案中，所述超声提取条件为，超声15-100min，优选超声25-80min，更优选超声35-60min，最优选超声40-50min。

本发明的优选技术方案中，所述超声提取条件为，超声功率为200-1000W，优选为300-900W，更优选为400-750W，最优选为500-650W。

本发明的优选技术方案中，所述超声提取条件为，超声1-100s，间隙1-100s，优选超声5-80s，间隙5-80s，更优选超声10-70s，间隙10-70s，最优选超声20-60s，间隙20-60s。

本发明的优选技术方案中，所述过滤依次为初滤、精滤、膜阻菌过滤，优选初滤用100目筛网过滤，精滤使用生白布反复吸附过滤4-6次，膜阻菌过滤的孔径为0.22μm-0.45μm。

本发明的优选技术方案中，所述干燥选自减压浓缩干燥、冷冻干燥或喷雾干燥的任一种或其组合。

本发明的优选技术方案中，所述提取物中有效成分包括生物碱和多糖，优选所述有效成分包括10-25g生物碱/Kg沙棘提取物和70-90g多糖/Kg沙棘提取物，更优选所述有效成分包括16g生物碱/Kg沙棘提取物和75-80g多糖/Kg沙棘提取物。

本发明的另一目的在于提供一种本发明所述的制备方法制得的沙棘提取物。

本发明的优选技术方案中，其中所述提取物为粉末，优选所述粉末为100％全水溶性浅棕色半透明结晶体。

本发明的优选技术方案中，所述提取物中有效成分包括生物碱和多糖，优选所述有效成分包括10-25g生物碱/Kg沙棘提取物和70-90g多糖/Kg沙棘提取物，更优选所述有效成分包括16g生物碱/Kg沙棘提取物和75-80g多糖/Kg沙棘提取物。

本发明的另一目的在于提供一种用于防治乳腺癌、肝癌的药物组合物，所述的药物组合物由本发明所述的沙棘提取物和药学上可接受的载体组成。

本发明的药物组合物可采用本领域常规的制剂技术制备得到。

本发明的优选技术方案中，所述的药物组合物选自口服制剂、外用制剂、肠溶口服制剂的任一种。

本发明的优选技术方案中，所述的口服制剂选自片剂、胶囊剂、颗粒剂、粉剂、口服液、混悬液、丸剂、散剂、滴丸、糖浆剂、合剂、露剂、泡腾剂、糊剂、乳剂、茶剂的任一种或其肠溶制剂。

本发明的优选技术方案中，所述的肠溶口服制剂选自肠溶片剂、肠溶胶囊剂、肠溶颗粒剂、肠溶粉剂、肠溶口服液、肠溶混悬液、肠溶丸剂、肠溶散剂、肠溶滴丸、肠溶糖浆剂、肠溶合剂、肠溶露剂、肠溶泡腾剂、肠溶糊剂、肠溶乳剂、肠溶茶剂的任一种。

本发明所述的药学上可接受的载体为本领域熟知用于制备上述制剂的常用赋形剂或辅料。口服制剂或外用制剂常用的赋形剂或辅料包括但不仅限于填充剂(又称稀释剂)、润滑剂(又称助流剂或抗粘着剂)、分散剂、湿润剂、粘合剂、调节剂、增溶剂、抗氧剂、抑菌剂、乳化剂、矫味剂或赋香剂等。粘合剂，例如糖浆、阿拉伯胶、明胶、山梨醇、黄芪胶、纤维素及其衍生物、明胶浆、糖浆、淀粉浆或聚乙烯吡咯烷酮，优选的纤维素衍生物为微晶纤维素、羧甲基纤维素钠、乙基纤维素或羟丙甲基纤维素；填充剂，例如乳糖、糖粉、糊精、淀粉及其衍生物、纤维素及其衍生物、无机钙盐、山梨醇或甘氨酸，优选无机钙盐为硫酸钙、磷酸钙、磷酸氢钙或沉降碳酸钙；润滑剂，例如微粉硅胶、硬脂酸镁、滑石粉、氢氧化铝、硼酸、氢化植物油或聚乙二醇；崩解剂，例如淀粉及其衍生物、聚乙烯吡咯烷酮、交联聚乙烯吡咯烷酮或微晶纤维素，优选的淀粉衍生物为羧甲基淀粉钠、淀粉乙醇酸钠、预胶化淀粉、改良淀粉、羟丙基淀粉或玉米淀粉；湿润剂，例如十二烷基硫酸钠、水或醇等。

本发明的优选技术方案中，将活性成分与药学上可接受的缓释载体或控释载体按其制备要求加以混合，再按照本领域熟知的缓释制剂或控释制剂的制备方法，如加入阻滞剂包衣或将活性成分微囊化后再制成微丸，如缓释微丸或控释微丸；所述的缓释载体或控释载体包括但不仅限于油脂性掺入剂、亲水胶体或包衣阻滞剂等，所述的油脂性掺入剂选自单硬脂酸甘油酯、氢化蓖麻油、矿油、聚硅氧烷或二甲基硅氧烷的任一种或其组合；所述的亲水胶体选自羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、PVP、阿拉伯胶、西黄耆胶或卡波普的任一种或其组合；所述的包衣阻滞剂选自乙基纤维素(EC)、羟丙甲基纤维素(HMPC)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、邻苯二甲酸醋酸纤维素(CAP)、丙烯酸类树脂的任一种或其组合。

本发明的优选技术方案中，所述的药物组合物为其缓释制剂或控释制剂，优选所述的缓释制剂或控释制剂选自缓释微丸或控释微丸。

本发明的优选技术方案中，所述药物组合物为肠溶片剂。

本发明的优选技术方案中，所述沙棘肠溶片剂中含有沙棘提取物30-70份，微晶纤维素1-10份，优选为沙棘提取物40-50份，微晶纤维素3-6份。

本发明的优选技术方案中，所述单位剂量的沙棘提取物肠溶片剂中含50mg微晶纤维素和500mg沙棘提取物。

本发明的优选技术方案中，所述单位剂量的沙棘提取物肠溶片剂中含25mg微晶纤维素和250mg沙棘提取物。

本发明的另一目的在于提供沙棘提取物或其药物组合物在制备用于治疗乳腺癌、肝癌、乳腺癌并发症、肝癌并发症的药物中的应用。

本发明的优选技术方案中，患者的用药量与其年龄、性别、体质、病情等因素相关。优选成人患者的用量为500mg/粒/次，每次8-10粒，每日三次，更优选未成年及儿童患者的用量为成人患者的一半用量，或者根据其年龄、性别、体质、病情等因素进行适当调整。温开水空腹服药。

除非另有说明，本发明涉及液体与液体之间的百分比时，所述的百分比为体积/体积百分比；本发明涉及液体与固体之间的百分比时，所述百分比为体积/重量百分比；本发明涉及固体与液体之间的百分比时，所述百分比为重量/体积百分比；其余为重量/重量百分比。

与现有技术相比，本发明具有下述有益技术效果：

1、本发明采用低温超声水提取方法制得一种高活性的、安全的、全组分的沙棘提取物，该提取物包括10-25g生物碱/Kg沙棘提取物和70-90g多糖/Kg沙棘提取物，并具有促进微管蛋白聚合，抑制癌细胞的有丝分裂并杀死癌细胞，有效阻止癌细胞的增殖、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制血管生成等抑制肿瘤生长作用，而具有优良的抗肿瘤活性，对乳腺癌及肝癌细胞具有较强的靶向性，对乳腺癌细胞并不产生耐药性，与传统化疗药无交叉耐药，并具有高效、安全、毒副作用小等优点。

2、本发明采用低温超声水提取的方法制备沙棘提取物，既减少溶剂污染，又杜绝三废(废水、废渣、废气)的排放及其对环境的污染，确保生产过程安全；同时，本发明将沙棘提取药渣用于制备生物肥料或生物质能源，利于资源的循环利用，显著提高资源利用率。

3、本发明采用低温超声水提取的方法制备沙棘提取物的提取效率显著优于传统提取工艺，如传统的加热提取、加温浓缩等高温操作，导致提取物中70％以上的有效成分失效，如传统提取(加温提取、浓缩)不能完全保持药物原生态及纯天然；传统提取加温(色深)失去活性；传统提取加温(色深及发黑)活性受到破坏；传统提取加温超过100～110℃最有效组分挥发物不能锁定被流失。

4、本发明的沙棘提取物肠溶制剂在胃肠道崩解小肠吸收，崩解时限为30～50分钟，起效快、持续时间长，疗效确切。实验研究表明，本发明的沙棘提取物对乳腺癌细胞的抑制率高达80.73％，对肝癌细胞的抑制率高达87.28％。

附图说明

图1沙棘提取物对乳腺癌细胞(MCF-7)的生长抑制作用；

图2沙棘提取物对肝癌细胞(SMMC-7721)的生长抑制作用。

具体实施方式

下面通过实施例来进一步描述本发明的技术方案，对于本领域的普通技术人员而言，下列实施例不构成对本发明的保护范围的限制。

实施例1沙棘提取物的制备

沙棘提取物的制备方法，包括下述步骤：

1)选取无可见异物，无腐烂、无霉变，水分≤10％的沙棘果1Kg，将其在50～55℃烘干后，制得沙棘干果；

2)将沙棘干果粉碎至400目，制得沙棘粉；

3)在15℃条件下，在沙棘粉中加入软水，超声提取，其中，沙棘粉与软水的质量体积比为1：8，所述超声提取条件为，超声功率为550W，超声10s，间隙10s，累计超声15min，制得沙棘超声水提液；

4)所述沙棘超声水提液采用100目滤网进行初滤，再使用生白布反复吸附过滤4次，取滤液经0.25μm的滤膜进行阻菌过滤，滤液减压浓缩干燥后，制得沙棘提取物250g。

5)将沙棘提取药渣用于制备生物肥料，提高资源利用率。

实施例2沙棘提取物的制备

沙棘提取物的制备方法，包括下述步骤：

1)选取无可见异物，无腐烂、无霉变，水分≤10％的沙棘果2Kg，将其在60～65℃烘干后，制得沙棘干果；

2)将沙棘干果粉碎至500目，制得沙棘粉；

3)在20℃条件下，在沙棘粉中加入软水，超声提取，其中，沙棘粉与软水的质量体积比为1：6，所述超声提取条件为，超声功率为600W，超声8s，间隙8s，累计超声12min，制得沙棘超声水提液；

4)所述沙棘超声水提液采用100目滤网进行初滤，再使用生白布反复吸附过滤5次，取滤液经0.35μm的滤膜进行阻菌过滤，，滤液经喷雾干燥后，制得沙棘提取物501g。

5)将沙棘提取药渣用于制备生物肥料，提高资源利用率。

实施例3沙棘提取物的制备

沙棘提取物的制备方法，包括下述步骤：

1)选取无可见异物，无腐烂、无霉变，水分≤10％的沙棘果3Kg，将其在55～60℃烘干后，制得沙棘干果；

2)将沙棘干果粉碎至550目，制得沙棘粉；

3)在25℃条件下，在沙棘粉中加入软水，超声提取，其中，沙棘粉与软水的质量体积比为1：10，所述超声提取条件为，超声功率为650W，超声5s，间隙5s，累计超声15min，制得沙棘超声水提液；

4)所述沙棘超声水提液采用100目滤网进行初滤，再使用生白布反复吸附过滤6次，取滤液经0.38μm的滤膜进行阻菌过滤，，滤液经冷冻干燥后，制得沙棘提取物750g。

5)将沙棘提取药渣用于制备生物肥料，提高资源利用率。

实施例4沙棘提取物的制备

沙棘提取物的制备方法，包括下述步骤：

1)选取无可见异物，无腐烂、无霉变，水分≤10％的沙棘果3Kg，将其在65～70℃烘干后，制得沙棘干果；

2)将沙棘干果粉碎至350目，制得沙棘粉；

3)在5℃条件下，在沙棘粉中加入软水，超声提取，其中，沙棘粉与软水的质量体积比为1：8，所述超声提取条件为，超声功率为700W，超声10s，间隙10s，累计超声10min，制得沙棘超声水提液；

4)所述沙棘超声水提液采用100目滤网进行初滤，再使用生白布反复吸附过滤6次，取滤液经0.45μm的滤膜进行阻菌过滤，，滤液经减压干燥后，制得沙棘提取物745g。

5)将沙棘提取药渣用于制备生物肥料，提高资源利用率。

实施例5沙棘提取物的制备

沙棘提取物的制备方法，包括下述步骤：

1)选取无可见异物，无腐烂、无霉变，水分≤10％的沙棘果3.5Kg，将其在50～55℃烘干后，制得沙棘干果；

2)将沙棘干果粉碎至550目，制得沙棘粉；

3)在12℃条件下，在沙棘粉中加入软水，超声提取，其中，沙棘粉与软水的质量体积比为1：15，所述超声提取条件为，超声功率为700W，超声15s，间隙15s，累计超声12min，制得沙棘超声水提液；

4)所述沙棘超声水提液采用100目滤网进行初滤，再使用生白布反复吸附过滤4次，取滤液经0.44μm的滤膜进行阻菌过滤，，滤液经喷雾干燥后，制得沙棘提取物875g。

5)将沙棘提取药渣用于制备生物肥料，提高资源利用率。

实施例6沙棘提取物的制备

沙棘提取物的制备方法，包括下述步骤：

1)选取无可见异物，无腐烂、无霉变，水分≤10％的沙棘果4Kg，将其在45～50℃烘干后，制得沙棘干果；

2)将沙棘干果粉碎至300目，制得沙棘粉；

3)在18℃条件下，在沙棘粉中加入软水，超声提取，其中，沙棘粉与软水的质量体积比为1：12，所述超声提取条件为，超声功率为700W，超声15s，间隙15s，累计超声15min，制得沙棘超声水提液；

4)采用100目滤网进行初滤，再使用生白布反复吸附过滤4次，取滤液经0.28μm的滤膜进行阻菌过滤，，滤液经喷雾干燥后，制得沙棘提取物1050g。

5)将沙棘提取药渣用于制备生物肥料，提高资源利用率。

对照例1沙棘提取物的制备

沙棘提取物的制备方法，包括下述步骤：

1)选取无可见异物，无腐烂、无霉变，水分≤10％的沙棘果4Kg，将其在45～50℃烘干后，制得沙棘干果；

2)将沙棘干果粉碎至90目，制得沙棘粉；

3)在48℃条件下，在沙棘粉中加入软水，超声提取，其中，沙棘粉与软水的质量体积比为1：12，所述超声提取条件为，超声功率为700W，超声15s，间隙15s，累计超声15min，制得沙棘超声水提液；

4)所述沙棘超声水提液采用100目滤网进行初滤，再使用生白布反复吸附过滤4次，取滤液经0.28μm的滤膜进行阻菌过滤，，滤液经喷雾干燥后，制得沙棘提取物1000g。

5)将沙棘提取药渣用于制备生物肥料，提高资源利用率。

实施例7沙棘提取物的检测

实施例1-6和对照例1制得的沙棘提取物的色泽为浅棕色，气味苦，口感甘苦，组织形态均匀、无可见异物粉末(感官指标)，100％全水溶性。

采用HPLC、苯酚硫酸法检测实施例1-6和对照例1制得的沙棘提取物中的生物碱和多糖含量，结果见表1。

表1

由表1可见，沙棘的粉碎程度及提取条件对提取物有效成分的含量影响较大。粉碎颗粒较大，提取温度较高会导致有效成分的提取效率降低。

实施例8沙棘提取物对乳腺癌细胞的生长抑制作用

采用MTT法研究沙棘提取物对乳腺癌细胞(MCF-7)的生长抑制作用。

(一)实验材料

实施例1制备的沙棘提取物；

阳性药物为5-氟尿嘧啶；

人乳腺癌细胞(MCF)；

MTT(Life)：用1×PBS配制成5mg/mLMTT溶液，0.2μm滤膜抽滤；

DMSO(分析纯，国药集团)。

(二)实验方法

取对数生长期的细胞，接种于96孔板，2×10⁴-3×10⁴个/孔；在37℃条件下，将细胞置于5％CO₂细胞培养箱内培养17-24小时，至细胞贴壁并汇合度达到90％-100％。

精密称量测试样品，使用完全培养基溶解，按照设定浓度梯度稀释，吸取孔中原培养基，加入含药培养基100μL/孔，37℃5％CO₂细胞培养箱内培养48小时；吸取含药培养基，使用1×PBS冲洗细胞，100μL/孔，冲洗两次；加入完全培养基80μL/孔，避光加入MTT溶液20μL/孔，混匀，37℃5％CO₂细胞培养箱内培养2.5小时；吸取孔内溶液，加入DMSO150μL/孔，轻微震板10分钟，使用酶标仪检测OD值，检测波长490nm，参比波长630nm，使用OD值计算相对存活率，其计算方法如下：

浓度梯度：10、5、2.5、1.25、0.63、0.31、0.16μg/mL。

沙棘提取物对MCF-7细胞的IC₅₀为3.72μg/mL；阳性药物5-氟尿嘧啶对MCF-7细胞的IC₅₀为32μg/ml。结果见表2。

表2沙棘提取物对MCF-7细胞的生长抑制作用

同法测定实施例2-6和对照例1制得的沙棘提取物对MCF-7细胞的IC₅₀为3.5～7μg/ml，对照例1提取物IC₅₀明显高于实施例1-6提取物。

沙棘提取物中生物碱及多糖对人乳腺癌MCF-7细胞增殖影响24h后显著抑制其增殖，MCF-7细胞被阻滞在G0+G1期，S期细胞显著减少，且对正常人乳腺细胞无明显细胞毒副作用。

实施例9沙棘提取物对肝癌细胞的生长抑制作用研究

采用MTT法研究沙棘提取物对肝癌细胞(SMMC-7721)的生长抑制作用。

(一)实验材料

本发明实施例1制得的沙棘提取物；

阳性药物(5-氟尿嘧啶)；

肝癌细胞(SMMC-7721)；

正常肝细胞(ChangLiver)。

(二)MTT法测定药物对细胞的抑制率

SMMC-7721细胞用含10％胎牛血清的RMPI1640培养基培养，置于5％CO₂，37℃培养箱。细胞长满后，1000rpm离心3min，倾去上清液，细胞沉淀用含10％胎牛血清的RMPI1640培养基重悬后传代或冻存。

ChangLiver细胞用含10％胎牛血清的RPMI1640培养，置于5％CO₂，37℃培养箱。细胞长满70％-90％后，用0.25％胰酶-EDTA消化，收集细胞，1000rpm离心5min，倾去上清液，细胞沉淀用含10％胎牛血清的RPMI1640培养基重悬后传代。

沙棘提取物用相应的培养基配成浓度32μg/mL。

取对数生长期的上述细胞，用培养液将细胞密度调至2.5×10⁸个/L。将上述单细胞悬液接种于96孔板内,100μL/孔，37℃，5％的CO₂培养箱中培养，24h后去除原有培养基，加入含药培养基，并适当稀释至药物的终浓度为0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2μg/mL,每个浓度设6个平行孔。同时，设阴性对照(不含药物的培养液)和阳性对照组(5-氟尿嘧啶)。作用20h后,加入终质量浓度为5mg/L的MTT溶液,继续培养4h,吸去上清液后加入DMSO,150μL/孔，振荡器低速振荡10min使结晶溶解完全，用酶标仪在490nm处测量OD值，按公式计算抑制率。

抑制率＝(1-加药组OD值/空白组OD值)×100％

沙棘提取物处理24h后，对SMMC-7721的IC₅₀为0.34μg/ml。而在浓度为32μg/ml时，对正常肝细胞的生长抑制无影响。说明沙棘提取物对于肝癌细胞具有显著的抑制作用，而对于正常肝细胞的几乎无毒性。同样条件下，阳性药物5-氟尿嘧啶对SMMC-7721的IC₅₀为0.9μg/ml。

表3沙棘提取物对SMMC-7721细胞的生长抑制作用

同法测定实施例2-6制得的沙棘提取物对SMMC-7721的IC₅₀为0.2～1.5μg/ml，而在3.2μg/ml时对正常肝细胞几乎无毒性作用，对照例1提取物IC₅₀明显高于实施例1-6提取物。

综上，本发明首次采取低温超声水提取方法制得沙棘提取物，该提取物本发明的沙棘提取物对乳腺癌细胞的抑制率高达80.73％，对肝癌细胞的抑制率高达87.28％，且具有毒副作用小、安全性高等优点。

实施例10沙棘提取物肠溶片剂的制备

(1)沙棘提取物肠溶片剂片芯的组成：

沙棘提取物500g

微晶纤维素50g

制得片芯1000片。

(2)肠溶包衣液的组成：

将包衣粉羟丙基甲基纤维素(HPMC)约20g以95％乙醇为溶剂配制成浓度为9％的包衣液225g(每500g药物需要包衣液225g)。

(3)沙棘提取物肠溶片剂的制备方法，包括下述步骤：

1)称取实施例2制得的沙棘提取物500g，加入50g微晶纤维素，均匀混合，按照粉末直接压片法，制备片芯1000片；

2)将进风温度调至为85℃，出风温度为50℃；将片芯倒入包衣锅，开启转速为1.5r/min，稍预热，至片床片子有温感；开启喷液，注意包衣锅内片子的情况，适当调速至2r/min-3r/min；待片子上包有一层薄膜衣时，可以停止喷液，烘干3min，关闭热风，冷却出锅。

实施例11沙棘提取物延长乳腺癌中晚期患者生存期的作用研究

在实施例10制得的沙棘提取物口服肠溶片剂，用于中晚期乳腺癌志愿者的治疗。

选取确诊患有乳腺癌的患者志愿者23例，其中，右侧乳腺浸润性导管癌12例，左侧乳腺浸润性导管癌11例(左侧腋窝淋巴结可见癌转移)。患者按照下述方式口服沙棘提取物肠溶片剂：500mg/粒/次，每日三次，一次8粒，温开水空腹送服。

研究结果，患者存活时间平均延长5-10年，生存质量得到明显改善。

Claims (10)

1.一种沙棘提取物的制备方法，包括下述步骤：1)将沙棘果烘干后，制得沙棘干果；2)将沙棘干果粉碎至100～800目，制得沙棘粉；3)在4～25℃条件下，在沙棘粉中加入水，浸泡1-10h后，超声提取10min-6h，其中，沙棘粉：水的质量体积比为1：2-1：15，制得沙棘提取液；4)过滤，收集沙棘提取液，提取液经浓缩，干燥，即得。

2.如权利要求1所述的制备方法，所述沙棘果烘干前经筛选、除杂处理。

3.如权利要求1或2所述的制备方法，所述烘干温度为30～80℃，优选为40-70℃，更优选为55-65℃。

4.如权利要求1-3任一项所述的制备方法，沙棘干果粉碎至150-700目，优选为250-600目，更优选为450-550目。

5.如权利要求1-4任一项所述的制备方法，所述提取物中有效成分包括生物碱和多糖，优选所述有效成分包括10-25g生物碱/Kg沙棘提取物和70-90g多糖/Kg沙棘提取物，更优选所述有效成分包括16g生物碱/Kg沙棘提取物和75-80g多糖/Kg沙棘提取物。

6.一种用于防治乳腺癌、肝癌的沙棘提取物，所述的提取物由权利要求1-15任一项所述的制备方法制得。

7.如权利要求6所述的沙棘提取物，所述提取物中有效成分包括生物碱和多糖，优选所述有效成分包括10-25g生物碱/Kg沙棘提取物和70-90g多糖/Kg沙棘提取物，更优选所述有效成分包括16g生物碱/Kg沙棘提取物和75-80g多糖/Kg沙棘提取物。

8.一种用于防治乳腺癌、肝癌的药物组合物，所述的药物组合物由权利要求1-15任一项所述的制备方法制得的沙棘提取物或者权利要求16-17任一项所述的沙棘提取物和药学上可接受的载体组成。

9.如权利要求18所述的药物组合物，所述的药物组合物选自口服制剂、外用制剂、肠溶口服制剂的任一种。

10.如权利要求1-5任一项所述的制备方法制得的沙棘提取物或者权利要求6-7任一项所述的沙棘提取物或权利要求8所述的药物组合物在制备用于治疗乳腺癌、肝癌、乳腺癌并发症、肝癌并发症的药物中的应用。