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CN105392900A - 收集和扩增循环核酸的方法和装置 - Google Patents

收集和扩增循环核酸的方法和装置 Download PDF

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CN105392900A
CN105392900A CN201480042256.7A CN201480042256A CN105392900A CN 105392900 A CN105392900 A CN 105392900A CN 201480042256 A CN201480042256 A CN 201480042256A CN 105392900 A CN105392900 A CN 105392900A
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CN
China
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dna
nucleic acid
amplification
solid substrate
serum
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Application number
CN201480042256.7A
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English (en)
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E.L.克瓦姆
J.R.奈尔逊
G.A.格罗斯曼
R.C.赫勒
E.J.芬霍特
C.M.普莱奥
W.P.沃特斯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
GE Healthcare UK Ltd
Global Life Sciences Solutions Operations UK Ltd
Original Assignee
General Electric Co
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Abstract

本文提供从生物学样本的非-细胞部分收集和扩增循环核酸的方法。循环核酸从非-细胞部分提取并经环化以生成单链核酸环，其然后接着通过使用随机引物的滚环扩增进行扩增，以产生扩增库。本文还提供用于从生物学样本收集非-细胞部分的装置。所述装置包括过滤膜和干燥的固体基质，所述固体基质与过滤膜直接接触。

Description

收集和扩增循环核酸的方法和装置
背景
本申请总体上涉及从生物学样本收集和扩增循环核酸(CNA)。更特别地，本申请涉及从生物学样本分离、收集、扩增和进一步检测循环核酸。
循环核酸从各种组织释放并在体液中积聚。各种完整和/或碎片的核酸已在CNA中鉴定，包括mRNA、miRNA、线粒体DNA、基因组DNA和反转录转座子。CNA理想地适合于疾病的早期检测以及预测和治疗诊断的应用。CNA的诊断潜力已在广泛的疾病谱，包括肿瘤发生、炎症、心肌梗死、自身免疫性疾病和妊娠相关并发症中得到证实。
循环核酸可使用采集体液样品的最小侵入方法检测。然而，CNA以极低丰度存在于体液中。因此，CNA的分析一般往往需要收集和处理大体积(毫升或升)的体液。然而，很多时候，只有非常少量的体液样本(微升)可供用来分析，特别是在体外诊断、病理学和法医学领域。此外，大体积的样本收集往往导致显著的装置成本、运输/处理成本和样本矫作物(artifact)。另外，因为CNA在体液中存在于细胞外，这种循环的核酸池可逐渐被通过体液中的定居细胞溶解释放的细胞内DNA或RNA淹没。这种淹没或污染可能是时间、温度、用于稳定的处理类型和用来分离体液的分离力的多参数函数。这些预分析变量可以从存在于体液中的定居细胞产生不希望的基因组污染。例如，在全血样本中，DNA或RNA可以在贮存和处理期间从血细胞释放到血浆或血清中。这可干扰存在于血浆或血清中的细胞外循环核酸的分析。循环核酸池的基因组污染可通过维持血样于4℃和在2小时内处理样本而减少。然而，这样的条件对于许多应用往往是不可行的和/或没有成本效益的。
全基因组扩增可用于扩大循环核酸的天然池。然而，先前使用多重置换扩增(MDA)技术的CNA全基因组扩增的尝试已强调与体液中CNA的劣质和低量有关的独特挑战。一般来说，CNA由于其本质上源自凋亡/坏死细胞，因而是高度片段化的。CNA的核酸片段化模式对于常规的全基因组扩增不是理想的，因而导致等位基因遗失和/或序列偏倚的扩增模式。另外，许多常规的全基因组扩增技术需要纳克量的输入核酸。因此，CNA必须从大体积的非-细胞部分提纯，以满足这些模板浓度要求。鉴于上述，存在对从生物学样本简化分离、收集、稳定和/或扩增循环核酸的技术的迫切需求，特别是当分析含有皮克量的CNA的小样本体积时。
发明简述
本发明涉及从生物学样本收集CNA和随后扩增CNA。
本发明的一个方面涉及一种存在于生物学样本的非-细胞部分中的循环核酸的扩增方法。该方法包括过滤生物学样本以将非-细胞部分与完整细胞分离，将分离的非-细胞部分收集到干燥的固体基质上，和从收集的非-细胞部分提取CNA的步骤。该方法还包括环化提取的CNA以形成单链核酸环，和通过随机-引物滚环扩增来扩增单链核酸环以形成扩增的CNA产物的步骤。如果CNA以双链形式存在，该方法还包括在用于制备单链核酸环的分子内连接反应之前将双链CNA变性为单链形式的步骤。线性单链CNA的环化可通过能够分子内连接单链核酸的连接酶实现。
本发明的另一方面涉及一种在收集点处理全血以收集含有循环核酸的血浆或血清的方法。该方法包括在收集点过滤全血以从全血分离血浆或血清，将分离的血浆或血清收集到干燥的固体基质上并在固体基质上干燥收集的血浆的步骤。固体基质没有任何去垢剂。
本发明的另一方面涉及一种从干燥的血浆或血清样本检测CNA的方法。该方法包括从干燥的血浆或血清提取CNA，进行提取的循环核酸的全基因组扩增以形成扩增的循环核酸(CNA)产物，和在扩增的CNA产物中检测特定循环核酸序列的步骤。全基因组扩增通过首先使用能够分子内连接单链核酸的连接酶环化提取的CNA以形成单链核酸环，和通过使用随机引物滚环扩增来扩增单链核酸环进行。如果CNA以双链形式存在，该方法还包括在分子内连接反应之前，将双链CNA变性为其单链形式的步骤。
本发明的另一方面涉及一种用于收集生物学样本的包含循环核酸的非-细胞部分的装置。该装置包括被配置以将生物学样本的非-细胞部分与完整细胞分离的过滤膜，和被配置以收集分离的非-细胞部分的干燥的固体基质。过滤膜和固体基质被配制以在它们之间建立直接的接触。此外，固体基质没有任何去垢剂。
附图
所述发明的这些和其它特征、方面和优势，当参照附图(其中贯穿整个附图的相同字符代表相同的部分)阅读以下详细描述时，将变得更易理解，其中：
图1描绘说明本发明方法的实施方案的流程图。
图2描绘用于分离和收集生物学样本的非-细胞部分的侧向流动装置的示意图。
图3描绘制备用于分离和收集生物学样本的非-细胞部分的侧向流动装置的实施方案的示意图。
图4描绘用于分离和收集生物学样本的非-细胞部分的垂直流动装置的示意图。
图5描绘按照侧向或垂直分离人全血，将血浆DNA收集到干燥的固体基质上。
图6描绘连接酶-辅助的全基因组扩增，其能够从经侧向或垂直流从全血分离的血浆DNA(即，从血浆提取的循环DNA)检测四个不同的染色体位点。
图7说明线性双链DNA的连接酶-辅助全基因组扩增的实施方案的示意图。
图8说明从健康个体的血浆分离的循环DNA的大小分布。
图9A说明使用CircLigaseTMII，从全血的非-细胞部分提取的循环DNA的连接酶-辅助全基因组扩增。
图9B说明使用T4DNA连接酶，从全血的非-细胞部分提取的循环DNA的连接酶-辅助全基因组扩增。
图9C说明使用大肠杆菌(E.Coli)连接酶，从全血的非-细胞部分提取的循环DNA的连接酶-辅助全基因组扩增。
图10说明用于4种不同的CODIS位点的灵敏的和平衡的DNA扩增的连接酶-辅助全基因组扩增的效力。
图11说明用于12种不同的CODIS位点的灵敏的和平衡的DNA扩增的连接酶-辅助全基因组扩增的效力。
图12说明在不同的反应和缓冲条件下，连接酶-辅助的全基因组扩增的不同效率。
图13说明在连接酶-辅助的全基因组扩增中，高分子量基因组DNA扩增的抑制作用。
图14说明使用雄性-雌性血浆/血的单管连接酶-辅助的扩增反应，其中DYS14雄性-特异性标记物使用从输入CNA创立的库检测。
详细描述
以下详细描述是示例性的并不打算限制要求保护的发明或要求保护的发明的应用。而且，不打算受在要求保护的发明的前述背景或以下详细描述中提出的任何理论的限制。
在以下说明书和所附权利要求书中，单数形式“a”、“an”和“the”包括复数指代，除非文中另外清楚地指明。近似语言，如本文中贯穿说明书和权利要求书中所用的，可用于修饰任何定量的表示，其可允许变化而不导致其相关基本功能的改变。因此，由术语如“约”修饰的值并不限于所指定的精确值。除非另外指明，本说明书和权利要求书中所用的表示成分的量、特性例如分子量、反应条件等的所有数字应被理解为在所有的情况下由术语“约”修饰。在一些情况下，近似语言可与测量值的仪器的精度相对应。
如本文所用的，术语“生物学样本”指从真核起源的生物对象获得的任何类型的生物液体。生物学样本的非-限制性实例包括全血、尿、唾液、汗水、眼泪、羊水、母乳、鼻腔冲洗液或支气管肺泡灌洗液。在一些实施方案中，生物学样本源自哺乳动物(如，大鼠、小鼠、牛、狗、猴、豚鼠或兔)。在某些实施方案中，生物学样本源自人。
如本文所用的，术语“完整细胞”指可存在于生物学样本(即，生物液体)中的非-破坏的细胞。因为完整细胞是未破坏的，没有核酸和/或核酸片段从完整细胞内部释放到生物学样本的非-细胞部分中。完整细胞可包括定居的真核细胞(如，在全血中的血细胞)和/或循环细胞(如，在全血中的循环肿瘤细胞)。在一些实施方案中，完整细胞可包括可存在于生物学样本中的其它致病细胞(如，细菌或病毒细胞)。
如本文所用的，术语“非-细胞部分”指没有完整细胞的生物学样本的成分。例如，全血的非-细胞部分包含血浆和血清，其没有完整血细胞(如白细胞、红细胞和血小板)。基于用来产生非-细胞部分的过滤膜的孔径，非-细胞部分可缺乏真核细胞、原核细胞和/或病毒细胞颗粒。
如本文所用的，术语“循环核酸”或“CNA”指在生物学样本的非-细胞部分中发现的无细胞核酸。无细胞核酸是不限于生物学细胞的细胞区室内(如，核、线粒体等)的那些核酸。循环核酸可以是脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。
如本文所用的，术语“直接接触”指两个成分之间的连续接触。两个成分之间的直接接触通过放置两个成分使得它们直接地彼此接触来实现。
如本文所用的，术语“ssLigase”或“单链特异性连接酶”指能够分子内连接单链核酸的连接酶。
在一些实施方案中，本发明涉及一种从生物学样本收集和扩增CNA的方法。当与健康个体比较时，升高浓度的CNA往往在从患有几种病理的患者中收集的生物学样本的非-细胞部分中发现，指示它们作为疾病生物标记物的潜力。例如，在全血的血浆或血清部分中发现的源自肿瘤的循环核酸可被用来检测、监测或评价癌症和恶化前状态。因此，用于生物学样本的非-细胞部分中的CNA扩增的方法可有助于检测、诊断、监测、治疗和/或评价疾病诸如肿瘤性疾病、炎症、心肌梗塞、自身免疫性疾病、移植器官/组织排斥反应、妊娠相关并发症等。肿瘤性疾病可包括，但不限于，早期癌症、恶化前状态或晚期癌症。
本发明的一些实施方案涉及用于分离和收集生物学样本的含有循环核酸的非-细胞部分的方法和装置。在从完整细胞分离和收集非-细胞部分后，该方法还包括从非-细胞部分提取循环核酸和扩增这些核酸以创建扩增的CNA库的步骤。本文描述的方法和装置为CNA收集和扩增提供一个简化的和综合的解决方案。所述方法和装置可适合于在收集点使用，并可用低样本体积(如，少于约150μL)使用。因此本文描述的装置和相关方法减少样本处理时间并使与基因组DNA或RNA污染有关的样本矫作物最少化，并有助于增加CNA扩增和/或检测的敏感性。
在一些实施方案中，CNA可以是源自肿瘤的循环核酸。在一些其它实施方案中，CNA可源自胎儿、植入后的捐赠器官、移植细胞、移植组织或疾病状态。在一些实施方案中，循环核酸包含循环DNA或循环RNA。循环DNA可包括，但不限于，源自肿瘤的DNA、源自胎儿的DNA、源自捐赠器官的DNA、源自移植细胞的DNA、源自移植组织的DNA或其组合。
本发明的一个方面涉及一种扩增存在于生物学样本的非-细胞部分的循环核酸的方法。该方法包括过滤生物学样本以将非-细胞部分与完整细胞分离，将分离的非-细胞部分收集到干燥的固体基质上和从收集的非-细胞部分提取CNA的步骤。该方法还包括通过使用单链-特异性连接酶环化提取的循环核酸，以形成单链核酸环，和通过随机-引物滚环扩增来扩增单链核酸环以形成扩增的CNA产物的步骤。在一些实施方案中，提供了在生物学样本的非-细胞部分中扩增和检测源自肿瘤的循环DNA的方法。
图1表示说明本发明的实施方案的流程图。生物学样本被施加于包含过滤膜和干燥固体基质的装置上，所述过滤膜被配置以将非-细胞部分与完整细胞分离，和所述干燥固体基质被配置以收集分离的非-细胞部分。如图1中所示，生物学样本被施加到过滤膜(102)上。过滤时，生物学样本的完整细胞保留在上游侧/过滤膜的表面上，而非-细胞部分被收集到干燥的固体基质(104)上，其可位于下游侧(在侧向流动装置中)上或者位于底侧表面(在垂直流动装置中)上。含有非-细胞部分的干燥的固体基质然后可被贮存(106)或可直接地用来提取循环核酸(108)。提取的循环核酸随后通过能够分子内连接单链核酸的连接酶进行环化，以形成单链核酸环(110)。在一些实施方案中，该方法还包括在提取前，将收集的非-细胞部分干燥至基本上干燥的状态。如果CNA以双链形式存在，在连接反应之前将循环核酸在先变性可能是必要的。单链核酸环随后通过随机-引物滚环扩增进行扩增，以形成扩增的CNA产物。
图2描述可用来分离生物学样本的非-细胞部分的装置的一个实施方案的示意图。过滤膜(202)具有样本应用区(210)和传送区(212)。过滤膜经由传送区(212)与固体基质(204)直接接触。过滤步骤包括在过滤膜的样本应用区上提供生物学样本并使生物学样本通过过滤膜。过滤膜具有多个孔。一旦生物学样本穿过过滤膜，在生物学样本中的定居完整细胞被过滤膜保留，主要在样本应用区(210)本身，而非-细胞部分通过孔到达传送区(212)并被转移和收集到干燥的固体基质上。在一些实施方案中，可使用具有在约0.01微米-约5微米范围内的孔径的过滤膜。在一些其它实施方案中，过滤膜的孔径可在约0.22微米-约2微米之间变化。在一个示例性实施方案中，过滤膜具有在约1微米-约2微米之间的孔径。当使用1微米孔径的过滤膜时，具有直径大于1微米的任何其它循环真核细胞和/或致病细胞将被保留在过滤膜中，并且因此在过滤时不将到达干燥的固体基质。
在一些实施方案中，非-细胞部分可在收集点本身被从生物学样本滤出。过滤可在无生物学样本的任何先前的预处理的情况下进行。进一步的过滤可在不存在任何稳定剂的情况下进行。过滤后，分离的非-细胞部分可通过物理相互作用收集到干燥的固体基质上。非-细胞部分可通过吸附或吸收而收集到干燥的固体基质上。
过滤膜可由各种材料制得。用来形成过滤膜的材料可以是天然材料、合成材料或经合成修饰的天然存在材料。可用来制备过滤膜的合适的材料包括，但不限于，玻璃纤维、聚乙烯醇-结合的玻璃纤维、聚醚砜、聚丙烯、聚偏氟乙烯、聚碳酸酯、乙酸纤维素、硝基纤维素、亲水性膨胀聚(四氟乙烯)、阳极氧化铝、轨迹蚀刻聚碳酸酯、电纺纳米纤维或聚乙烯吡咯烷酮。在一个实例中，过滤膜由聚乙烯醇-结合的玻璃纤维滤器(MF1TM膜，GEHealthcare)形成。在另一个实例中，过滤膜由不对称的聚醚砜(VividTM,PallCorporation)形成。在一些实施方案中，过滤膜可由二种或更多种不同的聚合物的组合形成。例如，过滤膜可由聚醚砜和聚乙烯吡咯烷酮(PrimecareTM,iPOC)的组合形成。
在过滤时收集到干燥的固体基质上的非-细胞部分然后可被干燥至基本上干燥的状态并贮存以供后来的分析。本文所用的术语“基本上干燥的状态”指其中干燥的样本含有少于约10%(wt/wt)含水量的情形。在一些实施方案中，样本可被干燥，以使它含有少于约5%的水。在一些其它实施方案中，样本可被干燥，以使它含有少于约2%的水。这样，可存在于生物学样本的非-细胞部分中的CNA可以干燥的形式贮存，其适用于以后的后续分析。干燥的非-细胞部分可贮存长时间，例如，贮存至少24小时，贮存至少7天，贮存至少30天，贮存至少90天，贮存至少180天，贮存至少1年，或贮存至少10年。在一个实施方案中，非-细胞部分被贮存在干燥的固体基质上至少30分钟。典型地，样本在范围从-80℃至40℃的温度下贮存。此外，样本可任选地在干燥或脱水条件下或在惰性气氛下贮存。干燥可通过在周围环境条件下风干或通过真空-辅助蒸发来进行。在一些实施方案中，非-细胞部分在周围环境条件下，通过正常蒸发被干燥并维持在低湿度环境中。从收集的非-细胞部分除去水有助于稳定存在于非-细胞部分中的循环核酸。
适合于这个目的的干燥的固体基质包括，但不限于，天然材料、合成材料或经合成修饰的天然存在材料。可用作干燥的固体基质的合适材料包括，但不限于，纤维素、乙酸纤维素、硝基纤维素、羧甲基纤维素、石英纤维、亲水性聚合物、聚四氟乙烯、玻璃纤维和多孔陶瓷。亲水性聚合物可以是聚酯、聚酰胺或碳水化合物聚合物。在一些实施方案中，干燥的固体基质由纤维素组成。纤维素-基干燥固体基质没有任何去垢剂。在一些实施方案中，纤维素-基干燥固体基质可不用任何试剂浸渍。在其它实施方案中，纤维素-基干燥固体基质可用离液盐浸渍。离液盐的实例包括，但不限于，硫氰酸胍、氯化胍、盐酸胍、异硫氰酸胍、硫氰酸钠和碘化钠。在一些实施方案中，纤维素-基干燥固体基质是FTATMElute(GEHealthcare)。
在将非-细胞部分收集到干燥的固体基质上后，CNA从这种收集的非-细胞部分提取。提取可使用任何常规核酸提取方法进行。可采用的提取方法的非-限制性实例包括，但不限于，电洗脱、明胶提取、二氧化硅或玻璃珠提取、硫氰酸胍-苯酚溶液提取、基于硫氰酸胍鎓盐的提取、通过碘化钠或类似的梯度离心、或基于苯酚-氯仿的提取。提取步骤有助于除去杂质如蛋白并浓缩循环核酸。提取的循环核酸可使用方法如琼脂糖凝胶电泳、分光光度法、荧光法或液相色谱检查。
然后，提取的CNA在提取后通过分子内连接反应，转化为单链核酸环。CNA可呈现为双链形式或者呈现为单链形式。此外，CNA往往可以是高度片段化的。双链CNA在分子内连接反应之前被变性为单链形式。双链核酸向单链形式的这种变性通过使用任何本领域-公认的方法实现。例如，双链核酸可被热变性、化学变性或同时热变性和化学变性。双链核酸可使用降低双链核酸的解链温度的变性剂(如，甘油、乙二醇、甲酰胺或其组合)进行化学变性。对于每10%(vol./vol.)的变性剂加入到反应混合物中，变性剂可降低解链温度5℃-6℃。变性剂或变性剂的组合(如，10%甘油和6-7%乙二醇)可占反应混合物(vol./vol.)的1%、5%、10%、15%、20%或25%。例如，降低杂交严格性的盐可以低浓度包含在反应缓冲液中，以在低温下使双链循环DNA化学变性。双链循环DNA也可通过于95℃加热经热变性形成单链DNA(ssDNA)。在变性步骤后，生成的单链核酸可用能够分子内连接单链核酸底物的单链特异性连接酶处理，以形成单链核酸环。
单链循环核酸的分子内连接可在模板的存在或不存在下，通过使用用来分子内连接单链核酸的任何常规方法进行。例如，线性单链DNA分子转化为单链DNA环使用连接酶如T4RNA连接酶，经由模板-依赖性分子内连接反应常规进行。然而，单链DNA或单链RNA的模板-依赖性分子内连接仅经受有限的成功，特别是当单链DNA分子的环化将在未知序列和/或大小的单链DNA分子群体中进行时。即使噬菌体T4RNA连接酶I显示出模板-非依赖性分子内连接活性，这种活性对于实际用于从线性单链DNA分子生成环状单链DNA分子来说是极其低且效率差的。在一些实施方案中，提取的单链循环核酸的分子内连接在不存在任何模板的情况下进行。例如，甚至短于500个核苷酸的单链DNA序列可使用模板-非依赖性分子内连接来环化。此外，当单链DNA(ssDNA)的连接以模板-非依赖性方式进行时，不需要目标序列的现有知识以创建DNA环。
在一些实施方案中，线性单链循环核酸转化为单链核酸环用热稳定的RNA连接酶进行，所述酶具有良好的用于具有5'磷酰基和3'羟基的线性单链DNA和/或单链RNA底物的模板-非依赖性分子内连接活性。可用来模板-非依赖性分子内连接提取的单链循环核酸的合适连接酶包括，但不限于，TS2126RNA连接酶、T4DNA连接酶、T3DNA连接酶或大肠杆菌(E.coli)DNA连接酶。例如，源自感染嗜热细菌水管致黑栖热菌(Thermusscotoductus)的栖热菌属噬菌体TS2126的TS2126RNA连接酶，可被用于线性循环ssDNA的模板-非依赖性环化，以生成环状单链DNA。TS2126RNA连接酶是比许多嗜温性RNA连接酶如T4RNA连接酶更加热稳定的(在至多约75℃是稳定的)。结果，TS2126RNA连接酶可在较高的温度下使用，这进一步减少ssDNA的不需要的二级结构。具有8.0的pH的HEPES缓冲液可用来增加TS2126RNA连接酶-介导的分子内连接的效率。提取的单链循环DNA的环化也可使用并非TS2126RNA连接酶的连接酶或通过使用具有DNA连接活性的任何其它酶如拓扑异构酶实现。在一些实施方案中，ssDNA分子的环化可通过源自嗜热古细菌热自养甲烷杆菌(Methanobacteriumthermoautotrophicum)的RNA连接酶1(Mth1)实现，该酶在环化线性的、片段化的单链DNA分子中具有高的模板-非依赖性连接酶活性。
然后单链核酸环可在等温条件下，通过使用滚环扩增(RCA)方法扩增。单链核酸环的扩增可在进行分子内连接的相同的反应容器中进行。在扩增反应之前，单链核酸环的分离或纯化和/或连接酶的除去可能不是必需的。在一些实施方案中，单链核酸连接和扩增的整个过程可在单一管中进行，无需任何中间纯化或分离步骤。
在一些实施方案中，该方法还包括从扩增的循环核酸产物中检测核酸。从扩增的循环核酸产物中检测核酸通过本领域已知的方法进行。检测扩增的产物的各种方法包括，但不限于，PCR、RT-PCR、qPCR、RT-qPCR、基于限制酶的方法、琼脂糖凝胶电泳、ELISA检测方法、电化学发光法、高效液相色谱、DNA印迹杂交、RNA印迹杂交或反向斑点印迹法。在一个实施方案中，检测通过定量PCR，使用特异性引物进行，所述引物扩增循环核酸扩增产物内的特定靶标。可进行检测以鉴定在扩增的循环核酸产物中特定循环核酸序列的存在、缺失和/或量。
本文公开的全基因组扩增方法改进扩增敏感性、减少序列丢失，并允许更平衡的扩增。所描述的方法是有利的，特别是当可获得有限量的生物学样本时。在一些实施方案中，非-细胞部分从约10μL-约500μL的总生物学样本体积分离。此外，环化和扩增两种反应可在单一反应容器中进行，而无需任何中间纯化或分离步骤，从而减少污染的机会并简化扩增工作流。
在一些实施方案中，提供通过多重置换扩增(MDA)进行片段化循环DNA的全基因组扩增。循环DNA，由它的来源性质，往往是高度片段化的。此外，生物学样本的非-细胞部分中循环DNA的量一般是极低的。MDA的常规方法，当在线性片段化的DNA上尝试时，导致降低的扩增速度，显著的序列丢失和导致高度的序列-偏倚扩增。为克服这些限制，在从干燥的固体基质提取循环DNA后，片段化双链循环DNA被首先转化为其单链形式。然后单链循环DNA经由模板-非依赖性分子内连接反应被转化为单链DNA环，从而消除了有问题的DNA末端。在片段化单链循环DNA的环化后，MDA在环化的DNA上进行。
提取的循环DNA的MDA反应可在等温条件下，通过使用滚环扩增(RCA)方法进行。为扩增单链DNA环，包括DNA聚合酶、引物和dNTP的扩增试剂可加入到进行连接的相同反应容器中，以产生扩增反应混合物来启动RCA反应。扩增反应混合物还可包括试剂如单链DNA结合蛋白和/或合适的扩增反应缓冲剂。RCA可通过使用本领域已知的任何链置换DNA聚合酶如Phi29DNA聚合酶进行。RCA可使用可市售获得的RCA扩增试剂盒如TempliPhiTMRCA试剂盒(GEHealthcare)进行。TempliPhiTM滚环扩增使用含有锁定核酸的随机引物，其提供较高的敏感性和扩增平衡。在一些实施方案中，随机引物被用于RCA反应。可使用包含一个或多个核苷酸类似物(如，LNA核苷酸)的引物序列。在一些实施方案中，耐核酸酶引物(如，包含在适当位置的硫代磷酸酯基团的引物序列)被用于扩增反应(如，NNNN*N*N，其中*N表示具有硫代磷酸酯键的随机核苷酸)。在一些实施方案中，滚环扩增可通过使单链DNA环与包含随机引物混合物的引物溶液接触，以形成DNA模板-引物复合物；使DNA模板-引物复合物与DNA聚合酶和脱氧核糖核苷三磷酸接触；和扩增DNA模板来进行。因为单链DNA的模板-非依赖性环化即使在低浓度下也可在短序列上完成，当连接酶-辅助的全基因组扩增被用来扩增高度片段化的循环DNA(如，存在于全血中的循环DNA)时，一种具有更快的动力学和改进的序列覆盖率的更为平衡的DNA扩增可完成。
图7描述片段化双链循环DNA的连接酶-辅助全基因组扩增的实施方案示意图。双链DNA的持续长度比单链DNA要高得多(~150bp)，且其天然的刚度使得少于500bp的片段的环化效率非常低。此外，使用约250bp范围的小双链片段化DNA分子，环化是效率低的，除非末端处于正确的对齐位置(~10.5bp/转角)。相反，与双链片段化DNA比较，单链片段化DNA的环化的持续长度非常小，约15个核苷酸。如在图7中所示，在连接酶-辅助的全基因组扩增中，片段化的双链循环DNA首先转化为单链DNA环。这可通过于95℃孵育片段化双链循环DNA充分的时期，以使双链DNA变性为单链来完成。片段化单链循环DNA然后用DNA或RNA连接酶处理，所述酶能够进行模板-独立的分子内连接单链循环DNA底物，以生成单链DNA环。然后加入扩增试剂，包括DNA聚合酶、随机引物和dNTP，以启动在单链DNA环上的RCA反应。与常规全基因组扩增方法对比，这种连接酶-辅助的全基因组RCA扩增产生大量的具有减少的序列丢失和扩增偏倚的DNA。因此，它可用来扩增和检测甚至高度片段化的循环DNA。在一些实施方案中，生产单链DNA环及其随后通过RCA的扩增的整个过程在单一管中进行，无需任何干预纯化步骤。
本文提供的连接-辅助的全基因组扩增方法，其包括早先将单链循环DNA片段连接于DNA环，接着滚环扩增，提供超过高分子量基因组DNA的优先的片段化CNA扩增。例如，包含CNA的血浆制剂往往可在纯化过程中被从血细胞中释放的基因组DNA污染。通过MDA的全基因组扩增的常规方法扩增循环DNA和基因组DNA二者。相反，当片段化的CNA分子首先使用TS2126RNA连接酶环化，接着使用Phi29DNA聚合酶通过RCA扩增时，循环DNA超过高分子量基因组DNA而优先地扩增。片段化循环DNA超过基因组DNA的这样的优先扩增特别适合于诊断应用，因为诊断相关的DNA可优先扩增用于下游分析(图13)。此外，与常规的基于MDA的全基因组扩增比较，连接酶-辅助的全基因组扩增允许片段化DNA的更加稳健的扩增。
在一些实施方案中，生物学样本的非-细胞部分中循环DNA扩增和检测的敏感性可在ssDNA连接步骤和RCA之前，通过用多核苷酸激酶(PNK)磷酸化提取的循环DNA而进一步增加。DNA的分子内连接是不可行的，除非ssDNA模板具有5'磷酸基团和3'羟基。各种条件(如，DNaseII酶裂解，和血中的磷酸酶活性)可导致含有具有5'羟基或者3'磷酸基团或者二者的非-可连接DNA序列的循环DNA的生成。PNK处理通过磷酸化5'末端或脱磷酸化3'末端，将这些非-可连接DNA序列转化为可连接DNA序列。这提高了滚环扩增的CNA库的多样性。在工作流程中掺入PNK步骤时，本文提出的连接酶-辅助的全基因组扩增方法可检测在雌性全血中的雄性循环DNA(当以1%水平掺入时(三份重复，图14))。
在一个实施方案中，提供用于扩增和检测存在于全血中的循环核酸的方法。全血包含细胞部分(即白细胞、红细胞和血小板)和非-细胞部分(如，血浆或血清)。循环DNA从全血的非-细胞部分(如，血浆或血清)扩增。在优选的实施方案中，血浆或血清从手指针刺体积的血分离。所述方法包括收集全血的非-细胞部分，从非-细胞部分提取循环DNA(主要以其天然双链形式存在)，使双链循环DNA变性以生成单链DNA，使循环单链DNA环化以生成单链DNA环，和通过滚环扩增来扩增单链DNA环以形成扩增的循环核酸产物的步骤。当使用本文描述的装置过滤全血时，血浆或血清通过过滤膜的孔并被收集到干燥的固体基质上。完整血细胞被过滤膜保留。血浆或血清可在不存在抗凝血剂的情况下，通过过滤从全血样本中分离。因此，在过滤前不需要额外的步骤以维持全血样本的完整性。在一些实施方案中，生物学样本在过滤前可用试剂像抗凝血剂预处理。来自完整血细胞的基因组污染可通过在收集点过滤全血而最小化。在一个实施方案中，含有CNA的分离的血浆或血清，通过被动毛细管吸作用被吸附到干燥的固体基质上。在一个实施方案中，循环DNA从先前使用碘化钠和醇(DNAExtractorSPTM,WakoChemical)收集到固体基质上的血浆或血清中提取。在一个实例中，血浆从少于150μL的全血中分离。
通常不可能环化具有序列长度小于150bp的双链DNA，且环化双链DNA是非常困难的，直至DNA长于200bp。相反，具有15个或更多核苷酸的序列长度的线性单链DNA分子通过合适的连接酶被非常有效地环化，只要5'末端被磷酸化和3'末端被羟基化。环化单链DNA以生成单链DNA环可通过使用能够模板-非依赖性分子内连接单链DNA的连接酶完成。在一些实施方案中，单链DNA分子的环化通过用RNA连接酶如CircLigaseIITM处理单链线性DNA进行。
本发明的另一方面涉及一种在收集点本身处理全血以收集血浆或血清的方法。该方法包括在样本收集点过滤全血以分离血浆或血清，将分离的血浆或血清收集到干燥的固体基质上，其中固体基质没有任何去垢剂，以及干燥在固体基质中收集的血浆或血清的步骤。在一些实施方案中，过滤通过使用MF1TM膜进行，而收集使用对MF1TM膜侧向排列的纤维素-基固体基质进行。在其它实施方案中，VividTM或PrimacareTM膜和纤维素-基固体基质被垂直排列。在一个实例中，无论是全血还是过滤膜都不用任何抗凝血剂预处理。在另一个实例中，血和/或过滤膜用抗凝血剂预处理。在一些实施方案中，用离液盐浸渍的纤维素基质可被用来在收集点收集血浆或血清。可使用的合适离液盐包括，但不限于，硫氰酸胍、硫氰酸钠、硫氰酸钾或盐酸胍。含有干燥的血浆或血清的固体基质可长期贮存，和循环核酸可在后来的时间点从这种干燥的血浆或血清中提取、扩增和检测。
在一些方面，提供一种从干燥的血浆或血清样本检测循环核酸的方法。该方法包括从干燥的血浆或血清样本提取循环核酸，进行提取的循环核酸的全基因组扩增，以生成扩增的循环核酸产物，然后在扩增的循环核酸产物内检测特定循环核酸序列的存在、缺失或量的步骤。提取的循环核酸的全基因组扩增，可通过单链特异性连接酶首先环化提取的循环核酸，以形成单链核酸环，以及通过随机-引物滚环扩增来扩增单链核酸环，以形成扩增的循环核酸产物而实现。在扩增的库中特定循环核酸序列的检测可通过任何常规核酸检测技术完成。所述方法还可包括在分子内连接反应之前，通过单链特异性连接酶使双链CNA变性为其单链形式的步骤。
本发明的另一方面涉及一种收集生物学样本的含有循环核酸的非-细胞部分的装置。该装置包括被配置以将生物学样本的非-细胞部分与完整细胞分离的过滤膜，和被配置以收集分离的非-细胞部分的干燥固体基质。固体基质没有任何去垢剂并与过滤膜直接接触。该装置可以是侧向流动装置或垂直流动装置。
图2描述如在本发明的一个实施方案中所述的侧向流动装置(200)的示意图。侧向流动装置含有过滤膜(202)和干燥的固体基质(204)。过滤膜和干燥的固体基质被侧向排列，以致生物学样本的非-细胞部分以侧向方向穿过过滤膜至固体基质。过滤膜具有样本应用区(210)和传送区(212)。过滤膜经由传送区与固体基质直接接触。本质上，过滤膜的传送区是当过滤膜与固体基质直接接触时，接触干燥的固体基质的过滤膜的部分。样本应用区被用来接受生物学样本和传送区被用来将生物学样本的非-细胞部分传递至干燥的固体基质。在一些实施方案中，过滤膜和干燥的固体基质被排列以使它们可彼此部分重叠。在其它实施方案中，过滤膜和干燥的固体基质被排列以使它们彼此可不重叠，但生物学样本以侧向方向穿过过滤膜至固体基质。在这样的情况下，干燥的固体基质被定位在过滤膜的下游，与过滤膜接触但不重叠。在一些实施方案中，过滤膜被布置在第一固体支持体(206)上和干燥的固体基质被布置在第二固体支持体上(208)。在一些实施方案中，第一固体支持体和第二固体支持体彼此面对排列。在其它实施方案中，第一固体支持体和第二固体支持体可彼此相邻排列。在一些实施方案中，过滤膜和干燥的固体基质侧向布置在固体支持体(206)上。在一些实施方案中，第二固体支持体(208)被包括在干燥的固体基质上，以使干燥的固体基质紧靠过滤膜成为夹层并建立有效的传送区，例如，如在图2中所示。
第一固体支持体可经由用于建立过滤膜与干燥的固体基质的直接接触的方式连接于第二固体支持体。用于建立直接接触的方式可以是折页的可折叠凹痕，或其它方式的柔韧连接。在一些实施方案中，侧向流动装置可通过如在图3中所示过程(300)配置。第一固体支持体(306)和第二固体支持体(308)经由可折叠的折页(310)彼此连接。第一固体支持体具有布置在其上的过滤膜(302)和第二固体支持体具有布置在其上的干燥的固体基质(304)。过滤膜可通过折叠折页与干燥的固体基质直接接触，以致过滤膜和干燥的固体基质彼此部分重叠。在一个实施方案中，侧向流动装置包括MF1TM过滤膜和纤维素-基干燥固体基质。在其中血浆/血清从全血收集的实施方案中，应用全血并穿过过滤膜，而非-细胞血浆或血清被收集或经毛细管吸到干燥的固体基质上。
在一些实施方案中，装置可以是垂直流动装置。垂直流动装置(400)的示意图说明于图4中。装置(400)包含过滤膜(402)和干燥的固体基质(404)，其中过滤膜被布置在干燥的固体基质上。过滤膜与固体基质直接接触。过滤膜具有样本应用区(406)和传送区(408)。样本应用区被用来接受生物学样本和传送区被用来将过滤的生物学样本的非-细胞部分传递至干燥的固体基质。过滤膜的传送区被与干燥的固体基质接触的区限定。如所示的，过滤膜和干燥的固体基质被排列以使生物学样本的非-细胞部分可以垂直方向穿过过滤膜至固体基质。在一些实施方案中，干燥的固体基质被布置在第三固体支持体(410)上。在一个实施方案中，垂直流动装置包括VividTM或PrimecareTM过滤膜和纤维素-基干燥固体基质。在其中血浆/血清从全血收集的实施方案中，应用全血并穿过过滤膜，而非-细胞血浆或血清被收集或经毛细管吸到干燥的固体基质上。
如上所述，第一固体支持体可携带过滤膜和第二和第三固体支持体可携带干燥的固体基质。固体支持体可直接地定位于邻近过滤膜或干燥的固体基质膜(如在图2、图3或图4中所示)。在一些实施方案中，一个或多个插入层可定位于固体支持体和过滤膜和/或干燥的固体基质之间。固体支持体可从能够携带过滤膜和/或干燥的固体基质的任何材料形成。支持体可由透光材料，如透明或光扩散(如，半透明)材料形成。可能合乎需要的是，固体支持体是液体不能渗透的，以使通过膜或固体基质的液流不能通过固体支持体渗漏。用于固体支持体的合适材料的实例包括，但不限于，玻璃、聚合物材料如聚苯乙烯、聚丙烯、聚酯、聚丁二烯、聚氯乙烯、聚酰胺、聚碳酸酯、环氧树脂、甲基丙烯酸酯或聚三聚氰胺。为对膜或固体基质提供足够的结构支持，固体支持体一般选择具有一定的最小厚度。例如，固体支持体可具有范围从约1/16英寸-约1/4英寸的厚度。在一个实施方案中，固体支持体是具有厚度约0.10英寸的聚碳酸酯-基(ClearLexanTM)。
在使用上述核酸沉淀方法时去垢剂可自溶液中沉淀出来，因而会干扰核酸的制备和分析方法。因此，本文所述的装置的干燥固体基质没有任何去垢剂如十二烷基硫酸钠(SDS)、SLS(月桂基)、烷基芳基磺酸酯、长链醇硫酸酯、烯烃硫酸酯、磺基琥珀酸酯、磷酸酯、2-乙基己基硫酸钠(sodium2-ethylhexysulfate)、聚乙烯硫酸酯、聚丙烯酸酯、聚磷酸酯、聚丙烯酸钠或聚乙烯硫酸钠。在一些实施方案中，干燥的固体基质可用离液盐浸渍。
在一些实施方案中，装置是这样设计的，即使得干燥的固体基质非常适合用于直接下游分析(如核酸提取)，而无需任何进一步的处理如取芯(coring)或冲压(punching)。特别是，装置的干燥固体基质具有使它能够完全适合于标准的实验室提取容器(如，微量离心管、离心管)的尺寸。在一个实施方案中，干燥的固体基质的尺寸宽度是至多约8毫米，这样使得它完全适合于在提取容器内。这样的装置的设计有助于消除在样本提取前对取芯或冲压材料的需要，并且因此使来自可能进入全基因组扩增的样本环境周围的DNA污染最小化。
在一些实施方案中，过滤膜也按比例缩放到8mm的最大尺寸宽度，以建立与固体基质对等的样本毛细管吸取。过滤膜和固体基质的尺寸长度是由生物学样本所需的输入量决定的。在一个实施方案中，对于100μL全血的侧向流动分离，MF1TM过滤膜的最佳尺寸是8mm宽x20mm长。在这种尺寸上，红细胞前沿停止在固体基质界面附近，从而使保留在过滤膜上的血浆量最小化并使血浆最大限度地转移到干燥的固体基质上。对于100μL全血的垂直流动分离，VividTM或PrimecareTM过滤膜的最佳尺寸是8mm宽x32mm长。
在一些实施方案中，固体基质可与上游过滤膜脱离并在周围环境温度下贮存，用于在样本过滤和非-细胞部分转移到固体基质上之后长期存档。此外，转移到干燥的固体基质的非-细胞部分可被干燥，以使其可长期贮存而不破坏其中存在的循环核酸。在分析时，通过将固体基质转移到常规的提取容器(如微量离心管)中并使基质在合适的提取缓冲液中再水合，可从固体基质提取循环核酸。
如上所述的装置可用来在所述生物学样本的收集点收集生物学样本的非-细胞部分。生物学样本可在过滤膜上被直接地提供，无需在样本收集点的任何预处理。一旦过滤步骤完成，非-细胞部分可被收集到干燥的固体基质上并贮存。在一些实施方案中，描述了使用装置从全血收集血浆或血清的方法。该方法包括在过滤膜的样本应用区提供全血，允许全血穿过过滤膜以将血浆或血清与血细胞分离，和在干燥的固体基质上收集分离的血浆或血清的步骤。一旦收集，血浆或血清可在固体基质上干燥用于长期贮存。整个过程可在全血样本的收集点进行。此后，具有循环核酸的干燥的血浆或血清部分可通过本文所述的用于下游分析的方法进一步处理。在一些实施方案中，少于100μL的全血样本可用来收集血浆或血清。
本文提出的装置还可包括不影响装置的基本功能(即从生物学样本收集具有循环核酸的非-细胞部分)的另外的功能组件。例如，具有不同孔径的另外的过滤膜可包括在装置中。在一些实施方案中，所述装置包括过滤膜(其被配置以使非-细胞部分与完整细胞分离)，和单一干燥固体基质(其被配置以收集分离的非-细胞部分)。在一些其它实施方案中，装置可包括过滤膜(其被配置以使非-细胞部分与完整细胞分离)、干燥的固体基质(其被配置以收集分离的非-细胞部分)，和不改变装置的基本功能的其它功能组件。这样的其它功能组件的实例包括，但不限于，固体支持体、装置壳体、保持环和/或覆盖膜。
本发明的实践从以下实施例将更加充分地理解，所述实施例在本文提出仅仅是为了举例说明，而不应视为限制由所附权利要求书限定的本发明的范围。用于实施例部分的一些缩写阐述如下：“mg”：毫克；“ng”：毫微克；“pg”：皮克；“fg”：毫微微克；“mL”：毫升；“mg/mL”：毫克/毫升；“mM”：毫摩尔量；“mmol”：毫摩尔；“pM”：皮摩尔量；“pmol”：皮摩尔；“μL”：微升；“min.”：分钟和“h.”：小时。
实施例
实施例1：按照人全血的侧向或垂直分离，在血浆收集膜上的循环DNA收集：
对于侧向流动装置，使用MF1TM膜作为过滤膜并使用903纤维素纸作为干燥的固体基质。对于垂直流动装置，使用PrimecareTM和VividTM膜作为过滤膜和使用903纤维素纸作为干燥的固体基质。将100μL的人全血施加到侧向或垂直流动装置的过滤膜上并将血浆收集到干燥的固体基质上。将收集的血浆放入一干燥器箱中并于室温下干燥，以形成干燥的血浆样本。贮存24小时后，血浆DNA通过改进的DNA提取仪SP(WakoChemical)，从各固体基质提取并使用凝胶电泳分析沉淀的血浆DNA。为了比较的目的，全血用3-步骤温和方案离心(1600xg，10分钟；收集并以1600xg再旋转血浆，10分钟；收集并以16,000xg旋转，10分钟，获得无细胞血浆)，并将50μL离心的血浆点样到相同的903纤维素纸上，提取，并平行分析。图5显示，循环血浆DNA被有效收集并从可市售获得的过滤膜下游重叠的干燥固体基质稳定。用PicoGreen测定法测定血浆-循环DNA的产量并显示MF1-过滤的全血(175pg/μL)和离心的血浆(179pg/μL)之间的类似的DNA回收。相反，使用PrimecareTM和VividTM膜过滤(垂直流动过滤)后，可见少量的基因组污染(DNA>10kB)。然而，在MF1侧流过滤或温和离心后，未见有基因组污染。
实施例2：用于检测通过侧向或垂直流从全血分离的血浆DNA的4个不同染色体位点的连接酶-辅助全基因组扩增：
在市售的单链-特异性连接酶(CircLigase，EpiCentre)不存在或存在下，从实施例1的干燥固体基质(903纤维素纸)提取的血浆DNA使用滚环扩增技术扩增，而4个随机STR染色体位点(vWA、TPOX、D8S1129和D13S317)被提出以评价基因组覆盖。图6证实，滚环扩增技术结合单链-特异性连接酶活性能够从皮克量的血浆-循环DNA敏感地检测所有四个染色体STR位点。实验使用微型-STR引物组进行，因为传统的STR引物对典型扩增大于循环DNA本身的DNA区。单链-特异性连接酶活性与滚环扩增技术结合允许检测具有接近来自血沉棕黄层部分的未扩增基因组DNA的qPCRCT值的血浆STR位点，所述血沉棕黄层部分通过离心分离和使用QIAampDNA血微型试剂盒(Qiagen)提取(图6)。没有单链-特异性连接酶活性，4个血浆STR标记物中仅有2个可单独使用滚环扩增技术检测。使用连接酶-辅助的全基因组扩增，来自血浆的STR检测水平在膜-过滤的血和离心的血之间显示是相似的。
实施例3：来自血浆的循环核酸的全基因组扩增：
使用WakoDNA提取仪SP试剂盒(WakoPureChemicalIndustries)，从表观健康个体的柠檬酸盐-磷酸盐-葡萄糖(CPD)-稳定的血浆分离循环DNA。通过2%琼脂糖凝胶电泳，使用TBE缓冲液分析约1.3ng，用SYBRGold染色和使用Typhoon成像仪显现。如在图8中所述，大多数循环DNA的长度为约180bp，伴有其它较少量的序列的长度为约370bp，和显著更少量的更高分子量序列。
将得自血浆的350pg循环DNA于95℃加热以使模板变性。然后用RNA或DNA连接酶处理变性的单链DNA模板，生成单链DNA环。ATP-依赖性T4DNA连接酶、细胞-编码的NAD-依赖性大肠杆菌DNA连接酶或热稳定的RNA连接酶(CircLigaseII)被用于这些连接反应。然后使用GenomiPhi试剂盒(GEHealthcare)，使用Phi29DNA聚合酶使100pg连接的单链DNA环经受全基因组扩增。扩增使用引物混合物+N+N(atN)(atN)(atN)*N进行，其中+N表示LNA核苷酸和“atN”表示含有2-氨基dA、2-硫代dT、正常的G和正常的C的随机混合物。实时扩增(其中目标核酸的扩增和定量同时进行)通过加入小量的SYBRgreenI至扩增混合物中并在Tecan读板仪(TecanSniper,AmershamPharmeciaBiotech)中监测荧光信号随时间推移的增加而进行。为了比较，包括等量浓度的未经处理的基因组DNA、未经处理的血浆DNA和无DNA模板的样本(无模板扩增)。
如在图9中描述的，当与等量的高分子量基因组DNA比较时，未经处理的、片段化的血浆DNA的扩增动力学要低得多，指示扩增缺乏。然而，当片段化血浆DNA经预处理并使用CircLigaseTMII转化为单链DNA环时，实现快速的扩增动力学(图9A)。其它的连接酶，包括ATP-依赖性T4DNA连接酶(图9B)和细胞-编码的NAD-依赖性大肠杆菌DNA连接酶(图9C)在恢复片段化血浆DNA的扩增动力学中也是有效的。在这些实施例中，扩增动力学的相对增加指示各种连接酶在促进单链DNA模板的分子内连接中的效果。
实施例4：通过连接酶-辅助的全基因组扩增从血浆扩增的循环核酸的分析。
为了检验用于促进灵敏的和平衡的DNA扩增的连接酶-辅助全基因组扩增方法的有效性，通过定量PCR，使用靶向4个不同的CODIS位点(vWA、TPOX、D8S1129和D13S317)的引物，进一步分析在实施例3中生成的扩增的DNA。将这些DNA水平与得自未扩增的DNA的值相比较，以确定在扩增后的相对表示水平。如在图10中说明的，在两个实例中，未经处理的血浆DNA的qPCR分析导致序列丢失或产生在测试的位点上高度不具代表性的DNA。相反，在该方法中包括CircLigaseTMII或者T4DNA连接酶防止4个位点的序列丢失并产生在表现度方面与扩增的高分子量基因组DNA更类似的DNA。在使用CircLigaseTMII作为单链DNA连接酶的进一步的实施例中，在通过定量PCR(qPCR)测试的12个不同的CODIS位点中，有11个在连接酶-辅助的全基因组扩增后被检出，而在未经处理的血浆DNA中仅有4个存在(图11)。在图11中，报告的Ct值是两份重复的平均值。其中Ct值未确定的PCR反应用“X”标记。
实施例5：连接酶-辅助全基因组扩增的反应条件的优化。
连接酶-辅助的DNA扩增反应通过TS2126RNA连接酶优化单链DNA分子的连接反应的效率而得到进一步优化。金属离子的存在对于连接反应是必不可少的，因为从标准的生产商推荐的缓冲液中除去锰减少扩增速率至背景水平。使用改进的缓冲条件，将未经处理的基因组DNA和未经处理的血浆DNA与CircLigaseIITM-处理的血浆DNA样本比较。所有缓冲条件含有33mMKoAc、0.5mMDTT和1M甜菜碱。如所指明的，缓冲液含有33mMTris-乙酸盐(pH7.5)或33mMHEPES-KOH(pH8.0)并且另外含有2.5mMMgCl2或2.5mMMnCl2。实时扩增通过加入小量的SYBRgreenI至扩增混合物中并在Tecan读板仪上监测荧光随时间推移的增加而进行。扩增阈值是荧光升高至背景水平(2000RFU)以上的时间。
连接酶-辅助全基因组扩增反应(循环DNA的100pg输入)的扩增动力学比较描述于图12中。镁和锰在标准TRIS缓冲液的存在下都产生类似的效果。然而，锰和镁的组合在HEPES缓冲液(pH8.0)的存在下，促进更高的扩增速率。与TRIS缓冲液比较，HEPES缓冲液通过降低锰阳离子的氧化速率，增加血浆DNA在这些反应中的环化效率。
实施例6：在连接酶-辅助的全基因组扩增中高分子量基因组DNA扩增的抑制。
将未经处理的基因组DNA的全基因组扩增的扩增动力学与CircLigaseTMI和CircLigaseTMII-处理的基因组DNA样本(100pgDNA输入)比较。结果说明于图13中。如在图13中描述的，CircLigaseTM处理的单链基因组DNA产生对高分子量基因组DNA的扩增速率的抑制效果(不像例如在图9A中说明的对血浆DNA的积极影响)。抑制作用对CircLigaseTMI和CircLigaseTMII二者均是明显的。
为研究是否基于Phi29的扩增被连接酶抑制，在活性连接酶的存在下扩增未经处理的双链基因组DNA。实时扩增通过加入小量的SYBRgreenI至扩增混合物中并在Tecan读板仪上监测荧光随时间推移的增加而进行。扩增阈值是荧光升高至背景水平(2000RFU)以上的时间。已观察到基因组DNA扩增抑制作用不是在扩增期间存在的活性连接酶的后果。
对于扩增循环超过高分子量基因组DNA的优先选择可能是某些应用的优势，因为来自血细胞的基因组DNA往往污染循环核酸的制剂，因而具有较低的诊断价值。
实施例7：使用连接酶-辅助全基因组扩增的片段化DNA的单管扩增-在分子内连接前，使用激酶的循环DNA片段的磷酸化效果。
使用激酶的循环DNA片段的磷酸化被发现引起血浆中循环DNA的更灵敏的检测。雄性-雌性血浆/血混合实验显示，从用激酶处理的输入CNA建立的DNA库更有代表性，允许更敏感地检测DYS14雄性-特异性标记物(3/3复制，而如果未进行磷酸化，则仅有1/3被检出)。如下制备100uL血/血浆混合物：100A：100%雄性血浆；5A-C：雄性血浆以5%v/v掺入雌性全血；1A-C：雄性血浆以1%v/v掺入雌性全血；和0A：100%雌性血。通过侧向流动穿过MF1膜，从血细胞分离血浆，接着收集到903纤维素垫，其随后被干燥并贮存过夜。然后通过改进的Wako提取仪SP试剂盒(WakoPureChemicalIndustries)，基于标准碘化钠/去垢剂的方法，从纤维素垫提取循环DNA。然后在GTP、锰和甜菜碱的存在下，用或不用T4多核苷酸激酶处理约1.8ngDNA，然后用CircLigaseIITM处理以环化单链DNA片段。然后使DNA经受GenomiPhi全基因组扩增(GEHealthcare)和产物通过定量PCR分析以评价两个标记物的检测：Dys14(其是位于Y-染色体上的多拷贝基因，并应为可仅从雄性部分检测的)，和D16S539(其是位于染色体16上的STR位点，并应为可从雄性和雌性两部分检测的)。反应在单一反应容器中进行，在工作流程中无需任何中间纯化或分离步骤。这通过以相对低浓度的GTP进行磷酸化反应而完成。
图14说明，在反应中包含激酶，允许环化和扩增不一定含有5'磷酸的CNA片段，从而创立更具代表性的库。这将包括含有5'羟基的DNA片段，其在细胞死亡期间通过DNaseII消化特异性地生成。使用雄性-雌性血浆/血混合实验，显示从用激酶处理的输入DNA创立的库是更具代表性的，允许更敏感地检测DYS14雄性-特异性标记物(3/3复制，而如果未进行磷酸化，则仅有1/3被检出)。
要求保护的发明可以其它特定形式体现，而不背离其精神或本质特征。前述实施方案是从多种形式的所有可能的实施方案或实施例选择的实施方案或实施例。因此，前述实施方案在所有的方面应被认为是对本文所述的发明进行说明而非限制。虽然要求保护的发明的仅仅某些特征已经图示说明并在本文进行描述，要理解本领域技术人员，鉴于本公开内容的利益，将能够使用根据本发明的原理的方法，鉴定、选择、优化或修饰合适的条件/参数，以适合于这些和其它类型的应用。准确的用途、试剂的选择、变量如浓度、体积、孵育时间、孵育温度等的选择可很大程度上取决于其预定的具体应用。因此，要理解所附权利要求书意欲覆盖落入本发明的真正精神范围内的所有修饰和变化。此外，落入权利要求书的等价方案的意义和范围内的所有变化均意欲包括在其中。

Claims (32)

1.一种扩增存在于生物学样本的非-细胞部分中的循环核酸的方法，所述方法包括：
过滤所述生物学样本以从完整细胞中分离非-细胞部分；
将分离的非-细胞部分收集到干燥的固体基质上；
从收集的非-细胞部分提取循环核酸；
环化提取的循环核酸以形成单链核酸环；和
经由随机-引物滚环扩增来扩增单链核酸环，以形成扩增的循环核酸产物。
2.权利要求1的方法，其还包括在提取之前将收集的非-细胞部分干燥至基本上干燥的状态。
3.权利要求1的方法，其还包括在环化前使提取的循环核酸变性。
4.权利要求2的方法，其中所述环化使用TS2126RNA连接酶进行。
5.权利要求1的方法，其还包括检测扩增的循环核酸产物中特定循环核酸序列的存在、缺失或量。
6.权利要求1的方法，其中所述生物学样本是全血，和所述非-细胞部分是血浆或血清。
7.权利要求6的方法，其中血浆或血清从少于150μL的全血收集。
8.权利要求6的方法，其中血浆或血清在不存在抗凝血剂的情况下从全血分离。
9.权利要求1的方法，其中所述循环核酸是循环DNA或循环RNA。
10.权利要求9的方法，其中所述循环DNA包括源自肿瘤的DNA、源自胎儿的DNA、源自捐赠器官的DNA、源自移植细胞的DNA、源自移植组织的DNA，或其组合。
11.权利要求9的方法，其中所述循环DNA包括源自肿瘤的DNA。
12.权利要求1的方法，其中生物学样本的过滤通过使用孔径在0.01微米和5微米之间的膜进行。
13.权利要求12的方法，其中生物学样本的过滤通过使用孔径在1微米和2微米之间的膜进行。
14.权利要求1的方法，其中所述干燥的固体基质是没有任何去垢剂的纤维素基质。
15.权利要求1的方法，其中所述干燥的固体基质用离液盐浸渍。
16.权利要求4的方法，其中所述生物学样本是全血，所述循环核酸是存在于全血中的循环DNA和所述干燥的固体基质是没有任何去垢剂的纤维素基质，和其中全血的非-细胞部分经由通过孔径在1微米和2微米之间的过滤膜过滤分离。
17.一种在收集点处理全血以收集血浆或血清的方法，所述方法包括：
在收集点过滤全血以分离血浆或血清；
将分离的血浆或血清收集到干燥的固体基质上，其中干燥的固体基质没有任何去垢剂；和
在干燥的固体基质中干燥收集的血浆或血清。
18.权利要求17的方法，其中血浆或血清在不存在抗凝血剂的情况下，经由通过过滤膜的过滤从全血中分离。
19.权利要求18的方法，其中干燥的固体基质是用离液盐浸渍的纤维素基质。
20.权利要求19的方法，其还包括贮存干燥的血浆或血清。
21.一种从干燥的血浆或血清样本检测循环核酸的方法，所述方法包括：
从干燥的血浆或血清样本提取循环核酸；
进行提取的循环核酸的全基因组扩增，以生成扩增的循环核酸产物；和
检测在扩增的循环核酸产物中特定循环核酸序列的存在、缺失或量。
22.权利要求21的方法，其中提取的循环核酸的全基因组扩增包括：
使用单链-特异性连接酶环化提取的循环核酸以形成单链核酸环；和
经由随机-引物滚环扩增来扩增单链核酸环。
23.一种从生物学样本收集含有循环核酸的非-细胞部分的装置，所述装置包括：
被配置以将非-细胞部分与完整细胞分离的过滤膜；和
被配置以收集分离的非-细胞部分的干燥的固体基质，其中所述干燥的固体基质没有任何去垢剂，和其中所述过滤膜和干燥的固体基质被配置以在它们之间建立一种直接的接触。
24.权利要求23的装置，其中所述过滤膜包括样本应用区和传送区，和其中所述固体基质直接地接触过滤膜的传送区。
25.权利要求24的装置，其中所述过滤膜和干燥的固体基质被侧向排列，以致生物学样本的非-细胞部分以侧向方向从样本应用区经由传送区通向干燥的固体基质。
26.权利要求23的装置，其中所述过滤膜被布置在第一固体支持体上和所述干燥的固体基质被布置在第二固体支持体上，且其中第一固体支持体经由一种用于建立所述过滤膜与所述干燥的固体基质直接接触的方式连接于第二固体支持体。
27.权利要求23的装置，其中所述过滤膜和干燥的固体基质被垂直排列，以致生物学样本的非-细胞部分以垂直方向穿过过滤膜到达干燥的固体基质。
28.权利要求23的装置，其中所述干燥的固体基质用离液盐浸渍。
29.权利要求23的装置，其中所述干燥的固体基质具有至多8毫米的宽度。
30.一种使用权利要求23的装置从全血收集血浆或血清的方法，所述方法包括：
在过滤膜的样本应用区提供全血；
使全血通过过滤膜以从血细胞分离血浆或血清；和
在干燥的固体基质上收集分离的血浆或血清。
31.权利要求30的方法，其中血浆或血清从少于150μL的全血中收集。
32.权利要求31的方法，其还包括在干燥的固体基质上干燥收集的血浆或血清以供贮存。
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