[go: up one dir, main page]

CN107002147A - 用于俘获核酸的方法 - Google Patents

用于俘获核酸的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107002147A
CN107002147A CN201580067328.8A CN201580067328A CN107002147A CN 107002147 A CN107002147 A CN 107002147A CN 201580067328 A CN201580067328 A CN 201580067328A CN 107002147 A CN107002147 A CN 107002147A
Authority
CN
China
Prior art keywords
nucleic acid
capture
matrix
target nucleic
probe
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201580067328.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107002147B (zh
Inventor
J.R.内尔森
B.李
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
GE Healthcare UK Ltd
Global Life Sciences Solutions Operations UK Ltd
Original Assignee
General Electric Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US14/566,865 external-priority patent/US10870845B2/en
Application filed by General Electric Co filed Critical General Electric Co
Publication of CN107002147A publication Critical patent/CN107002147A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107002147B publication Critical patent/CN107002147B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本文提供一种方法，其中俘获靶核酸的方法包括将核酸俘获探针施加至需要定义的俘获区，其中具有第一分子量的核酸俘获探针至少包含与靶核酸序列的至少一部分互补的序列，且核酸俘获探针基本固定在基质的俘获区上。所述方法进一步包括将包含具有第二分子量的靶核酸的样品施加至基质的样品施加区；其中包含靶核酸的样品通过侧向流动流经从样品施加区至俘获区的一段基质，且靶核酸通过与俘获区杂交被核酸俘获探针俘获。

Description

用于俘获核酸的方法
相交申请的交叉引用
本申请是2014年7月1日提交的名为“Method, Substrate and Device forSeparating Nucleic Acid (用于分离核酸的方法、基质和装置)”的美国专利申请号14/321160的部分继续申请，其通过引用结合到本文中。
本发明在美国国防部高级研究计划局(Defense Advanced Research ProjectsAgency，DARPA)授予的资助号HR0011-11-2-0007的政府支持下完成。政府在本发明中享有一定权利。
发明领域
本发明总的来说涉及从生物样品中分离靶核酸的方法。本发明还涉及使用核酸俘获探针通过侧向流动俘获靶核酸的方法。
发明背景
样品中核酸的分离、检测和浓缩对于例如基础研究、法医和诊断应用、感测、基因组测序等各种应用是最基本的要求。涉及核酸的各种应用之前通常是将靶核酸从不需要的核酸和污染物中分离和纯化以降低对下游应用的干扰并达到所需结果。技术包括凝胶电泳、毛细管电泳或微型流体装置或微型分析装置中的电泳，它们是分子和细胞生物学中能够分离和纯化特定核酸的主流技术。传统的纯化或分离方法和相关技术是耗费时间的和劳动密集的。
核酸的检测在多种应用中具有极大重要性，包括但不限于诊断应用、法医分析、基因组测序、临床研究和生物制药学研究。各种检测探针目前被用于测定正常和/或异常条件下、基因组筛查中的基因表达以预测各种遗传病症、检测个体中突变基因(例如致癌基因)的存在或鉴定感染性生物(例如细菌和病毒)的存在。然而，特异性、选择性和分辨率的缺乏仍是目前所用核酸检测系统的主要障碍。为了达到靶核酸或检测探针的所需浓度，已开发了多种技术，这可包括靶分子的扩增或俘获探针的扩增，然而这些方法需要额外的扩增步骤以提高检测系统的灵敏度。
已开发了使用基质从液体样品中分离和/或检测核酸的各种技术，其包括：通过使样品沿吸水膜流动以沿膜的长度分布，从样品中分离核酸。使用在膜上交联的俘获探针，进一步俘获分离的核酸。在另一种方法中，分离至少二种细胞组分(例如基因组DNA、RNA和蛋白质)，其中将包括细胞组分的水性溶液施加到多种固体基质上接着洗涤。这些方法是耗时和复杂的，因为它们需要多个步骤(例如洗涤或洗脱)或多种基质。在许多的这些方法中，基质的洗涤是重要的步骤；然而，如果探针不与基质交联，则洗涤可稀释俘获探针或将其从基质中除去。
十分需要从复杂样品中分离核酸用于后继分析的简化方法。当生物样品的量较少时，例如从活检样品中获得的样品或收集用于法医应用的样品，尤其需要核酸的同时俘获、分离、扩增、浓缩和检测。核酸使用的增加需要快速、简单和可靠的用于分离和检测核酸的方法。
发明简述
在一个实施方案中，提供俘获靶核酸的方法，其中所述方法包括将核酸俘获探针施加至基质的俘获区，其中具有第一分子量的核酸俘获探针至少包含与靶核酸序列的至少一部分互补的序列，且核酸俘获探针基本固定在基质的俘获区上；将包含具有第二分子量的靶核酸的样品施加至基质的样品施加区；其中包含靶核酸的样品通过侧向流动流经从样品施加区至俘获区的一段基质，靶核酸在俘获区通过杂交被核酸俘获探针俘获，其中核酸俘获探针是滚环扩增(RCA)产物。
在另一个实施方案中，提供俘获靶核酸的方法，其中所述方法包括将核酸俘获探针施加至基质的俘获区，其中具有第一分子量的核酸俘获探针至少包含与靶核酸序列的至少一部分互补的序列，且核酸俘获探针基本固定在基质的俘获区上；将包含具有第二分子量的靶核酸的样品施加至基质的样品施加区；并使液体流经从样品施加区至俘获区的一段基质，其中靶核酸通过侧向流动迁移离开样品施加区至俘获区，并通过杂交被核酸俘获探针俘获。
在又一个实施方案中，提供俘获靶核酸的方法，其中所述方法包括将核酸俘获探针施加至基质的俘获区，其中具有第一分子量的核酸俘获探针至少包含与靶核酸序列的至少一部分互补的序列，且核酸俘获探针基本固定在基质的俘获区上；将包含具有第二分子量的靶核酸、具有第三分子量的模板核酸的一种或多种的样品施加至基质的样品施加区；使核酸扩增反应混合物流经通过样品施加区至俘获区的一段基质，其中模板核酸经扩增形成靶核酸；通过侧向流动从模板核酸分离靶核酸，其中靶核酸迁移离开样品施加区至俘获区，且通过杂交被核酸俘获探针俘获而无需洗涤步骤。
附图简述
图1说明按照本发明实施方案的实例使用核酸俘获探俘获的靶核酸针的俘获和检测的示意图。
图2说明按照本发明实施方案的另一个实例包含用于侧向流动的基质的装置的示意图。
图3说明按照本发明实施方案的另一个实例的核酸俘获探针、靶核酸、检测探针的示意图。图3按出现的顺序分别公开了SEQ ID NO 8、7和9。
图4A说明按照本发明实施方案的实例在室温条件下膜上的侧向流动测定。
图4B说明按照本发明实施方案的实例在高温条件下膜上的侧向流动测定。
图5A说明按照本发明实施方案的实例在室温下在俘获探针的不同浓度的条件下膜上的侧向流动测定。
图5B说明按照本发明实施方案的实例在高温下在俘获探针的不同浓度的条件下膜上的侧向流动测定。
图5C说明显示按照本发明实施方案的实例自图5A和5B产生的信号强度的图。
图6A说明按照本发明实施方案的实例，在将膜干燥1天和2天后在室温下在俘获探针的不同浓度的条件下PEG改良的硝酸纤维素膜上的侧向流动测定。
图6B说明按照本发明实施方案的实例，在将膜干燥1天和2天后在室温下在俘获探针的不同浓度的条件下硝酸纤维素膜上的侧向流动测定。
图7说明按照本发明实施方案的实例，在不同温度和核酸俘获探针的不同干燥时间的条件下等温DNA扩增反应的不同输入浓度的基因组DNA的硝酸纤维素膜上的侧向流动测定。
发明详述
不同的实施方案提供从生物样品中分离靶核酸、接着检测和浓缩靶核酸(例如来自包含非靶核酸、不需要的污染物的样品的核酸扩增子)的合适方法。根据核酸俘获探针-靶核酸相互作用(例如杂交)使用核酸俘获探针通过俘获靶核酸从生物样品中分离靶核酸。基质经配置以收集生物样品，从样品中提取核酸，接着在同一基质上分离和检测。
为了更明确和简明地描述要求保护的发明的主题，提供用于以下描述和随附权利要求书的专项术语的下列定义。在说明书中，专项术语的例举应视为非限制性实例。
单数形式“a”、“an”和“the”包括复数指代物，除非文中另有明确说明。本文在整个说明书和权利要求书中使用的近似用语可用于修饰可允许变化而不导致与之相关的基本功能改变的任何定量表示法。因此，被术语例如“约”修饰的值不限于所规定的精确值。在某些情况下，近似语可与用于测量该值的仪器的精确度一致。需要时，可提供范围，且这些范围包括其之间的所有子范围。
本文提及的术语“核酸”包含所有形式的DNA (例如基因组DNA、mtDNA)或RNA(mRNA、tRNA、rRNA、小RNA、siRNA、miRNA、非编码RNA、动物RNA、植物RNA、病毒RNA或细菌RNA)以及重组RNA和DNA分子或使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA的类似物。核酸可以是单链或双链的。核酸可包括编码或非编码链。该术语还包括可采用公开的提取方法回收的核酸例如天然存在的RNA或DNA的片段。核酸还可指核酸(例如RNA或DNA)的一部分。提取的核酸另可包含肽核酸(PNA)。
分离的核酸可包含单一类型的核酸或两种或更多种不同类型的核酸。核酸可以是单链、双链、线性或环状的。分离核酸的分子量也不受限制，可任选为几个碱基对(bp)至几百万个碱基对(Mbp)的范围。
本文所用术语“靶核酸”是指需要通过核酸俘获探针俘获的天然或合成源的核酸(例如DNA或RNA)序列。靶核酸还需要被检出或另外在扩增反应中扩增。靶核酸可体内或体外获自生物样品。例如靶核酸可获自体液(例如血液、血浆、血清或尿液)、器官、组织、细胞、器官或组织的切片部分、从生物对象分离的细胞(例如含有患病细胞或循环肿瘤细胞的区域)、法医样品或古旧样品。含有或疑似含有靶核酸的生物样品可以是真核生物源、原核生物源、病毒源或噬菌体源的。例如靶核酸可获自昆虫、原生动物、鸟、鱼、爬行动物、哺乳动物(例如大鼠、小鼠、牛、狗、豚鼠或兔)或灵长类动物(例如黑猩猩或人)。靶核酸还可以是使用逆转录酶从RNA模板(例如mRNA、核糖体RNA)产生的互补DNA (cDNA)。通过另一种反应(例如连接反应、PCR反应)产生的DNA产物或合成DNA也可用作合适的靶核酸。靶核酸可分散在溶液中或可加入固定在固体支持体(例如印迹、阵列、载玻片、微量滴定板、珠粒或ELISA板)上的核酸俘获探针中。
“模板核酸”被定义为可在基质上扩增的DNA或RNA。DNA可在DNA扩增反应中通过DNA聚合酶扩增以产生靶扩增产物或靶扩增子。
本文所用术语“俘获探针”或“核酸俘获探针”是指包含与靶核酸的至少一个序列互补的至少一个序列的核酸。在一些实施方案中，核酸俘获探针是脱氧核糖核酸(DNA)。在一个实施方案中，核酸俘获探针是滚环扩增产物DNA。核酸俘获探针可包含与靶核酸的DNA序列(例如靶DNA)互补的多个序列。通过RCA反应产生的俘获探针，可包含核苷酸类似物。在一个实施方案中，RCA反应始于环状模板且仅原始环通过扩增复制，其中掺入俘获探针的核苷酸类似物可用于产生具有高特异性和模板的结合提高的探针。将核酸俘获探针施加至基质的俘获区，其中俘获探针通过杂交俘获靶核酸。
本文所用术语“样品施加区”是指基质上的区域，其中将样品施加至基质的该区域或区带以进一步处理。样品施加区是同一基质的一部分。在一些实施方案中，样品施加区可包含渗入的试剂，例如稳定试剂或细胞裂解试剂。样品施加区可为包含分布在基质上的试剂的纸。
本文所用术语“俘获区”是指基质上的区域，其中将核酸俘获探针固定在基质上。样品的靶核酸在基质的俘获区被俘获，从而与样品的其它非靶物质和/或污染物分离。俘获区是同一基质的一部分。在一些实施方案中，俘获区亦称为“检测区”，因为在俘获靶核酸后，将检测探针加入基质中，通过与“俘获区”的检测探针结合检出俘获的核酸。在一些实施方案中，俘获区包含渗入的检测探针。
“扩增子”或“扩增产物”可包括模板核酸的多个拷贝或与模板核酸互补的序列的多个拷贝。扩增子可包含与存在于核酸俘获探针中的至少一个序列互补的一个或多个核酸序列。扩增子或扩增产物是“靶核酸”。模板核酸(例如模板DNA)经扩增以产生扩增子，其被称为靶核酸或靶核酸扩增子。靶DNA的一部分或靶DNA的整个区域可被核酸俘获探针俘获以产生靶核酸扩增子：核酸俘获探针复合物，其中靶核酸扩增子和核酸俘获探针彼此杂交。
本文所用术语“基本固定的”是指位于特定定位部分(例如基质上的俘获区)周围的具有某种分子量的核酸俘获探针的量。核酸俘获探针的固定可因核酸的较高分子量而产生。具有较高分子量的核酸通常在使缓冲液沿基质的一段流动时具有较低的流动性。核酸的实际量可表示为样品溶液中具有特定分子量的核酸的总量固定在特定位置的百分比。例如基本上具有第一分子量的核酸俘获探针意指施加至基质上的总核酸俘获探针的90%在俘获区上或俘获区周围固定在基质上。
本文所用术语“寡核苷酸”是指核苷酸的寡聚体。核苷酸可使用相当于其核苷的首字母以其字母标识表示。例如A表示腺嘌呤，C表示胞嘧啶，G表示鸟嘌呤，U表示尿嘧啶，T表示胸腺嘧啶(5-甲基尿嘧啶)，W表示A或T/U，而S表示G或C。N表示任意核苷，可以是A、C、G或T/U的任一个。字母标识前的星形(*)符号表示由该字母标明的核苷酸是硫代磷酸修饰的核苷酸。例如*N表示硫代磷酸修饰的任意核苷酸。字母标识前的加号(+)符号表示由该字母标明的核苷酸是锁定核酸(LNA)核苷酸。例如+A表示腺苷LNA核苷酸，+N表示锁定的任意核苷酸。寡核苷酸可以是DNA寡核苷酸、RNA寡核苷酸或DNA-RNA嵌合序列。每当用寡核苷酸用字母序列表示时，核苷酸为从左到右5ꞌ→3ꞌ顺序。例如由字母序列(W)x(N)y(S)z (其中x=2，y=3，z=1)表示的寡核苷酸表示寡核苷酸序列WWNNNS，其中W为5'末端核苷酸，S为3'末端核苷酸(“末端核苷酸”是指位于寡核苷酸序列的末端位置的核苷酸。位于3'末端位置的末端核苷酸是指3'末端核苷酸，位于5'末端位置的末端核苷酸是指5'末端核苷酸)。
如本文所用，dNTP混合物是指脱氧核糖核苷三磷酸的混合物，其中N是任意核苷酸，包括A、C、G或T/U的任一个。
如本文所用，“引物”或“引物序列”是指与靶核酸序列(例如脱氧核糖核酸(DNA))杂交以引发核酸扩增反应的短的线性寡核苷酸。引物可以是核糖核酸(RNA)寡核苷酸，DNA寡核苷酸或嵌合序列。引物可含有天然、合成或修饰的核苷酸。引物长度的上限和下限两者凭经验确定。引物长度的下限是在核酸扩增反应条件下与靶核酸杂交时形成稳定双链体所需要的最低长度。极短引物(通常小于3-4个核苷酸长)在所述杂交条件下不与靶核酸形成热力学上稳定的双链体。常常通过在靶核酸中的预先确定的核酸序列以外的区域中具有双链体形成可能性来确定上限。作为非限制性实例，合适的引物长度的范围常常为约4-约40个核苷酸长。还可使用引物以俘获核酸序列。
本文所用术语“扩增”、“核酸扩增”或“使……扩增”是指多拷贝核酸模板的产生或与核酸模板互补的多个核酸序列拷贝的产生。
本文所用术语“核苷酸类似物”是指在结构上与天然存在的核苷酸相似(类似)的化合物。核苷酸类似物可能具有改变的磷酸骨架、糖部分、核碱基或其组合。一般而言，具有改变的核碱基的核苷酸类似物特别赋予不同的碱基配对和碱基堆积性质。具有改变的磷酸-糖骨架的核苷酸类似物(例如肽核酸(PNA)、锁定核酸(LNA))通常特别修饰链性质例如二级结构形成。
本文所用术语“互补的”，当用来描述与第二核酸/寡核苷酸序列有关的第一核酸/寡核苷酸序列时，是指包含第一核酸/寡核苷酸序列的多核苷酸或寡核苷酸在某种杂交条件下与包含第二核酸/寡核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸杂交(例如形成双链体结构)的能力。杂交通过核苷酸的碱基配对(互补核苷酸)而发生。核苷酸的碱基配对可通过Watson-Crick碱基配对、非Watson-Crick碱基配对或由非天然/修饰的核苷酸形成的碱基配对而发生。
本文所用术语“高严格杂交条件”是指与可用于核酸扩增反应的条件提供的严格性相比赋予寡核苷酸杂交事件较高严格性的条件。可能需要较高的严格性杂交条件以防止在所得杂交的双链体内可能含有错配碱基的寡核苷酸杂交事件。例如可通过提高反应温度或降低盐浓度或在缓冲液中包括例如甘油或乙二醇等变性剂，在核酸扩增反应中实现高严格杂交条件。核酸扩增反应有时在约75 mM盐浓度下进行。相比之下，如果核酸扩增反应在15 mM盐浓度下进行，则可提供高严格杂交条件。可通过提高反应温度超过30℃的典型反应温度，将高严格杂交条件用于体外等温核酸扩增反应。例如等温核酸扩增反应可在约35℃-约45℃下进行。
本文所用术语“滚环扩增(RCA)”是指通过滚环机制扩增环状核酸模板(例如单链DNA环)的核酸扩增反应。可通过引物与环状的、通常单链的核酸模板杂交引发滚环扩增反应。核酸聚合酶然后通过围绕环状核酸模板不断前行反复不断地复制核酸模板的序列(滚环机制)，使与环状核酸模板杂交的引物延伸。滚环扩增通常产生包含环状核酸模板序列的串联重复单位的多联体。滚环扩增可以是显示线性扩增动力学的线性RCA (LRCA) (例如使用单特异性引物的RCA)或可以是显示指数扩增动力学的指数RCA (ERCA)。滚环扩增还可使用多个引物(多重引发滚环扩增或MPRCA)进行，产生超支化多联体。例如在双重引发RCA中，一个引物与在LRCA中一样可与环状核酸模板互补，而另一个可与RCA产物的串联重复单位核酸序列互补。因此，双重引发RCA可作为具有指数(几何)扩增动力学的链式反应进行，其特征在于多重杂交的支化级联、引物延伸和涉及两个引物的链置换事件。这常常产生一组不关联的多联体双链核酸扩增产物。滚环扩增可使用合适的核酸聚合酶(例如Phi29 DNA聚合酶)在等温条件下体外进行。
本文所用术语“DNA聚合酶”是指使用核酸链作为模板重新合成DNA链的酶。DNA聚合酶使用现有的DNA或RNA作为模板用于DNA合成，并沿它读取的模板链催化脱氧核糖核苷酸的聚合。新合成的DNA链与模板链互补。DNA聚合酶可将游离核苷酸只加在新形成链的3'-羟基端上。它通过从脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)转移核苷一磷酸到延伸的寡核苷酸链的3'-羟基上来合成寡核苷酸。这导致新链以5'→3'方向延长。因为DNA聚合酶可只将核苷酸加至先已存在的3'-OH基团上以开始DNA合成反应，所以DNA聚合酶需要其可添加第一个核苷酸的引物。合适的引物包括RNA或DNA或核苷酸类似物的寡核苷酸。DNA聚合酶可以是天然存在的DNA聚合酶或具有上述活性的天然酶的变体。例如它可包括具有链置换活性的DNA聚合酶、缺乏5'→3'外切核酸酶活性的DNA聚合酶、具有反转录酶活性的DNA聚合酶或具有外切核酸酶活性的DNA聚合酶。
本文所用术语“链置换核酸聚合酶”或“具有链置换活性的聚合酶”是指除其核酸合成活性以外具有链置换活性的核酸聚合酶。通过读取模板链同时置换退火至模板链的互补链，链置换核酸聚合酶可在核酸模板链的序列基础上继续核酸合成。链置换核酸聚合酶包括DNA聚合酶、RNA聚合酶和反转录酶。
本文提及的术语“还原剂”包括向另一化学物类提供电子的任何化学物类。多种还原剂是本领域已知的。还原剂的实例包括二硫苏糖醇(DTT)、2-巯基乙醇(2-ME)和三(2-羧乙基)膦(TCEP)。此外，可使用这些或其它还原剂的任何组合。在具体的实施方案中，还原剂为TCEP。
本文所用术语“扩增缓冲液”包括但不限于2-氨基-2-羟基甲基-丙烷-1,3-二醇(Tris)、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)、柠檬酸盐缓冲液、4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)和磷酸盐缓冲液。扩增缓冲液另包括例如Tris-HCl、硫酸氢二铵、一价阳离子(例如KCl)、二价阳离子(例如MgSO4)或Tween®20。这个潜在缓冲液的列表仅用于说明目的。缓冲液的pH通常滴定在6-8的范围。在一些实施方案中，缓冲液包含dNTP、BSA或其组合。
本文所用术语“分离”表示从样品溶液的非靶核酸和/或不需要的污染物中分离或纯化靶核酸的行动或动作。
术语“样品”或“生物样品”以广义使用，旨在包括含核酸的多种生理学或临床生物学来源。所述来源包括而不限于完整组织，包括活检样品材料和抽吸物；体外培养的细胞，包括原代细胞和次代细胞、转化细胞系和组织和血细胞；体液例如尿液、痰、精液、分泌物、眼洗出物和抽吸物、肺洗出物和抽吸物；来自DNA或RNA合成的介质；化学或生物化学合成的DNA或RNA的混合物；真菌和植物组织，例如叶、根、茎和根冠；可存在于生物样品上或生物样品中的微生物和病毒；细菌细胞；以及其中有或可能有DNA和/或RNA的任何其它来源。
样品溶液是包含DNA和RNA的任一种或两种，或者包含溶解、悬浮、混合或以别的方式包括在其中的DNA和RNA的任一种或两种的细胞、细胞组分或细胞提取物的溶液。样品溶液可以是自生物样品制备的溶液。
提供俘获靶核酸的方法的一个或多个实施方案，其中所述方法包括将核酸俘获探针施加至基质的俘获区，其中具有第一分子量的核酸俘获探针至少包含与靶核酸序列的至少一部分互补的序列，且核酸俘获探针基本固定在基质的俘获区上。在这些实施方案中，所述方法进一步包括将包含具有第二分子量的靶核酸的样品施加至基质的样品施加区；其中包含靶核酸的样品通过侧向流动流经从样品施加区至俘获区的一段基质，靶核酸在俘获区通过杂交被核酸俘获探针俘获。
可参照图1所示说明性实例详细描述方法步骤。按照一个实施方案，图1说明通过固定在基质12上的核酸俘获探针2俘获靶核酸4的图示1。如所述，该方法包括将核酸俘获探针2施加至基质12的俘获区上，其中核酸俘获探针2具有第一分子量。核酸俘获探针的第一分子量高到足以使侧向流动期间基质上核酸俘获探针的流动性减到最小，且核酸俘获探针缠结在基质12上，如图1所示。缠结的核酸俘获探针2基本固定在基质12上，从而用作俘获靶核酸4的俘获探针，所述靶核酸可包含检测部分6。靶核酸4被俘获，接着使用例如检测探针8检测。
核酸俘获探针2俘获存在于加样样品中的靶核酸4。术语“俘获”可包括但不限于靶核酸与核酸俘获探针的杂交、靶核酸与核酸俘获探针的物理相互作用或靶核酸与核酸俘获探针的化学相互作用。在一个或多个实施方案中，靶核酸4可用检测剂部分6标记，其可通过检测剂探针8检测。
为了充分描述所述方法步骤，本文简单描述了基质的设计以使所述方法步骤与基质组分总体上关联。参照图2，按照一个实施方案，装置10包含具有第一末端11和第二末端31的基质12。在一些实施方案中，基质是一个长形条带12，第一末端11和第二末端31位于基质12的主轴(例如长度)的相对侧。基质包含邻近第二末端31的俘获区20。
用于该方法的核酸俘获探针可包含高分子量核酸，其具有低流动性，并且不能利用侧向流动从基质12的一个末端11迁移至另一个末端31。可被核酸俘获探针2俘获的靶核酸4的大小一般较小。更明确的讲，靶核酸4具有第二分子量，其小于核酸俘获探针2的第一分子量，其中靶核酸在侧向流动时从基质12的一个末端迁移至另一个末端。在一些实施方案中，核酸俘获探针的第一分子量的范围为约20,000个碱基-约150,000个碱基。在一个实施方案中，核酸俘获探针的第一分子量为120,000个碱基。
在一个或多个实施方案中，核酸俘获探针可为滚环扩增(RCA)产物，其通过RCA反应合成。因为RCA通常产生包含环状核酸模板序列互补序列的串联重复单位的多联体，所以核酸俘获探针还可包含多个串联重复序列。在一些实施方案中，核酸俘获探针包含20-150个核苷酸串联重复序列。在一些实施方案中，串联重复序列可具有50-100个核苷酸。
在一个或多个实施方案中，核酸俘获探针包含单链核酸，例如单链DNA (ss DNA)或单链RNA (ss RNA)。核酸俘获探针可包含具有与靶核酸的一个或多个序列互补的特定序列的环状单链核酸、缺口核酸或线性核酸。在一个实施方案中，核酸俘获探针至少包含与靶核酸序列的至少一部分互补的序列。在一些实施方案中，核酸俘获探针可包含特定序列的多个拷贝或可称为重复序列。在这些实施方案中，核酸俘获探针可包含与靶核酸的至少一个序列互补的多个序列，其中多个靶核酸可通过具有多个重复序列的单一俘获探针俘获。
在一个或多个实施方案中，核酸俘获探针包含脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、核酸类似物或其组合。核酸俘获探针可包含核苷酸类似物，其在结构上与天然存在的核苷酸相似(类似)。核苷酸类似物可具有改变的磷酸骨架，例如磷酸-糖骨架常常特别修饰链性质，例如二级结构形成。核酸俘获探针可包含核苷酸类似物，例如肽核酸(PNA)或锁定核酸(LNA)。在一些实施方案中，核酸俘获探针可以是高分子量的cDNA或基因组DNA。核酸俘获探针可以是合成核酸或天然核酸。它还可包含修饰的核苷酸。
在一些实施方案中，核酸俘获探针基本被固定在基质的俘获区。具有某种分子量(例如介于20 kb和约150 kb之间)的一些核酸俘获探针可位于特定定位部分的周围，例如基质12的俘获区20。侧向流动基质上核酸俘获探针的固定可因俘获探针的核酸的较高分子量而发生。通常，在核酸流经侧向流动基质的长度时，具有较高分子量的核酸具有较低的流动性。施加至特定位置上的具有特定分子量的核酸俘获探针总量的百分比是指固定(或基本固定)在基质上的核酸俘获探针的实际量。具有第一分子量的实际核酸俘获探针可为施加至基质的俘获区的总核酸俘获探针的例如90%或更高。
核酸可通过机械相互作用与基质连接。在一个或多个实施方案中，核酸(例如DNA)通过机械相互作用(这包括但不限于缠结)附着在基质表面上。在一些实施方案中，核酸俘获探针通过核酸与基质缠结固定在基质上(图1)。核酸可在基质表面上缠结，其中核酸俘获探针和基质之间的相互作用足够稳定以抵抗在液体通过基质侧向流动期间核酸俘获探针从基质上解离，例如在洗涤的情况下，核酸俘获探针保留在基质上。
与其中核酸需要在基质上交联以固定的方法不同，本发明方法利用高分子量RCA核酸作为通过缠结固定在基质上的俘获探针。用于通过侧向流动进行核酸检测的基质(substrate/matrix)上核酸交联是本领域已知的，其报道于Asian Biomedicine, 第6卷,第3期, 2012; 459-463; “Sensitivity enhancement of nucleic acid detection bylateral flow strip test using UV crosslink method (采用UV交联方法通过侧向流动条带试验的核酸检测的灵敏度提高)” (Mongokol等)。交联是将核酸固定在基质上的单独过程，这需要时间、资源和努力。通过交联将核酸固定在膜上接着杂交的方法报道于CurrProtoc Immunol., 2001年5月; 第10章: Unit 10.6A. doi: 10.1002/0471142735.im1006as06；Anal Biochem. 1985年8月15日;149(1):229-37,“Quantitative molecular hybridization on nylon membranes (尼龙膜上的定量分子杂交)” (Cannon G, Heinhorst S, Weissbach A)；以及Biotechniques. 1990年5月; 8(5):478-82. “Parameters affecting hybridization of nucleic acids blotted ontonylon or nitrocellulose membranes (影响印在尼龙或硝酸纤维素膜上的核酸杂交的参数)” (Twomey TA1, Krawetz SA)。然而，使RCA核酸固定在基质上用于侧向流动试验的本发明方法排除了将核酸固定在不同基质上的这类交联技术的需要。
例如pDNA已被用于不同侧向流动测定法的俘获探针，其中pDNA需要UV交联以与基质连接，这是制备与基质结合的俘获探针的额外步骤。pDNA能够与基质(substrate/matrix)交联。交联可使用紫外光进行，称为UV交联。用于侧向流动试验的使pDNA俘获探针通过交联活性在硝酸纤维素条上的UV-固定报道于美国专利申请号US 2012/0015358 A1(Scarr等)。pDNA是吡喃糖基核酸(pNA或pDNA)，它与天然RNA是同质异构的，其中戊糖单位以吡喃糖形式存在，并通过C-2’和C-4’位之间的磷酸二酯基重复连接。pDNA俘获探针报道于美国专利7,153,955 B2 (Miculka等)。使用RCA俘获探针减少交联的步骤，并简化该过程。
此外，使用高分子量RCA核酸产物(例如RCA DNA)，其一般包含串联重复序列，减少人工制备具有多个重复序列和接头的核酸俘获探针的步骤。另外，在核酸俘获探针(RCADNA)中使用多个重复序列(其与靶核酸的一个或多个序列互补)，确保靶核酸的牢固杂交和俘获。当包含靶核酸的样品施加至基质上时，存在于基质上的核酸俘获探针以高效率俘获靶核酸。
如所述，把样品施加至基质的样品施加区上，所述样品施加区可存在于基质的任一端。现参照图1，按照一个实施方案，装置10包含具有第一末端11和第二末端31的基质12。基质12包含样品施加区14，其中可通过任何手段(例如通过移液)施加样品。样品施加区14可毗邻第一末端11，而俘获区20位于样品施加区14的相对端，与基质的第二末端31毗邻。如所述，装置10还包含灯芯垫(wicking pad) 28和停止垫30。样品施加区14还可用作样品溶解区和/或核酸稳定区。基质任选含有发热体18，其位于样品施加区处或其附近用于干燥加载的样品。
在一些实施方案中，所述方法包括将包含靶核酸的样品施加到基质的样品施加区；其中样品为液体形式，例如样品溶液。可将样品溶液、液体、扩增试剂或洗涤溶液施加到样品施加区14。术语“施加”的非限制性实例包括使用管、拭子、移液管、导管、注射器、导管、自动注射器或使用任何其它合适的手段/工具，使样品或扩增试剂或洗涤溶液接触基质或布置在其上。在一些实施方案中，可将样品倒在基质上。
施加至基质上的样品可以是生物样品，其获自包含核酸的生理学或临床生物学来源。在一些实施方案中，样品是核酸，在一些其它实施方案中，样品是来自DNA或RNA合成的介质；化学或生物化学合成的DNA或RNA的混合物，其中将样品直接施加至基质上，接着扩增、分离和俘获。在一些实施方案中，样品是扩增产物或扩增子。
当样品包括细胞或组织时，可利用细胞裂解，从细胞中提取核酸。例如当样品从血液，切成薄片的组织，组织培养细胞，细菌细胞，体液例如尿液、痰、精液，包含DNA和/或RNA的分泌物中收集时，在将样品施加至基质上之后或之前用裂解试剂处理样品。因此，在这些实施方案中，所述方法通常还包括使样品与裂解试剂接触。
在将样品施加至样品施加区14前可用用于裂解难以裂解的细胞的其它裂解试剂对其进行预处理。例如结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的细胞，其具有不可渗透和难以裂解的复杂的细胞壁结构，可在施加到基质之前用裂解试剂进行预处理。
在所述方法的一些实施方案中，样品本身包含裂解试剂。在一些其它实施方案中，使裂解试剂浸于基质的样品施加区14。细胞当与裂解试剂接触时被裂解以从细胞中提取核酸。用于制备包含来自生物样品的核酸的样品溶液的方法的一个实例包括使用裂解试剂裂解生物样品的步骤，其中裂解试剂包含离液物质和/或其它试剂。
如所述，包含靶核酸的样品通过侧向流动流经从样品施加区14至俘获区20的一段基质。流经基质的一段的移动在本文称为“侧向流动”。在侧向流动移动中，液体在重力下迁移，所述重力与液体布置在其上的基质的斜面平行。液体的侧向流动移动使靶核酸能够从纵向基质12的一个末端11迁移至另一个末端20。
在一些实施方案中，可允许施加的样品干燥，且施加的样品需要再水化以从样品中分离。在这些实施方案中，所述方法进一步包括使液体经基质的一段从样品施加区流至俘获区，其中靶核酸通过侧向流动迁移离开样品施加区进入俘获区。干燥可包括发热元件18的启动，所述发热元件可存在于样品施加区14之下或与之毗邻。在这些实施方案中，液体(例如缓冲液)流经样品施加区至俘获区的一段基质，且干燥的样品可通过加入液体再水化。干燥的靶核酸可用液体(例如缓冲液)再水化，并复溶为包含靶核酸的溶液，其通过侧向流动迁移离开样品施加区14进入俘获区20。
在一些实施方案中，液体包含缓冲液、扩增反应混合物、洗涤溶液或其组合。在一个实施方案中，液体可沿一段基质流过样品施加区用于洗涤基质。在一些实施方案中，液体是扩增缓冲液。在一些其它实施方案中，液体是洗涤缓冲液。
在所述方法的一些实施方案中，靶核酸通过杂交被核酸俘获探针俘获。在这些实施方案中，核酸俘获探针的核酸/寡核苷酸序列在某种杂交条件下与靶核酸/寡核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸杂交(例如形成双链体结构)。杂交通过核苷酸的碱基配对(互补核苷酸)而发生，其中核苷酸的碱基配对可通过Watson-Crick碱基配对、非Watson-Crick碱基配对或由非天然/修饰的核苷酸形成的碱基配对产生。图3说明按照本发明的一个实施方案，靶核酸序列4与核酸俘获探针序列2的杂交方式。
在一些实施方案中，寡核苷酸杂交事件在与由核酸扩增反应的条件提供的严格性相比较高严格性条件下进行。可能需要较高的严格性杂交条件以防止在所得杂交的双链体内可能含有错配碱基的寡核苷酸杂交事件。例如可通过提高反应温度或降低盐浓度或在缓冲液中包括例如甘油或乙二醇等变性剂，而在核酸扩增反应中实现高严格杂交条件。在一个说明性实施方案中，15 mM盐浓度可提供高严格杂交条件。可通过提高反应温度超过30℃的典型反应温度，采用高严格杂交条件。
用作俘获探针的RCA产物具有在高严格杂交条件下使用是有利的特有特征。如所述，核酸俘获探针是RCA产物，俘获探针可称为“RCA俘获探针”。靶核酸在被RCA俘获探针俘获时，接着使用生物素-链霉抗生物素检测探针检测，其中检测性能通过基质上的条带显示。由于RCA俘获探针的长度延长和高的解链温度，俘获探针的检测性能在室温下或在50℃下保持相同，分别如图4A和4B所示。这相对于传统pDNA俘获探针是一种改进，传统pDNA俘获探针中俘获可限于室温或略升高的温度，因为pDNA探针的解链温度低。
侧向流动试验灵敏度取决于不同俘获探针浓度下的温度条件，如图5A和5B中所示。在室温下以及在高温下，当硝酸纤维素膜上RCA探针浓度增加时，侧向流动检测试验的条带的信号强度增加，如图5A、5B和5C中所示。
在侧向流动检测中使用RCA俘获探针显示在硝酸纤维素基质或改良的硝酸纤维素基质(例如聚乙二醇化硝酸纤维素膜)上类似的效率。与一(1)天相比，当RCA俘获探针施加至基质上并干燥两(2)天时，俘获的靶核酸的信号强度提高，如图6A和6B中所示。
在一个或多个实施方案中，所述方法进一步包括使缓冲液沿一段基质流经样品施加区用于洗涤基质。在一些实施方案中，缓冲液包含扩增缓冲液。在一些实施方案中，扩增试剂和洗涤溶液可加在样品施加区的上游。
在一些实施方案中，将洗涤液(例如扩增缓冲液)加入基质用于洗涤基质，扩增缓冲液从其中施加样品溶液的基质中带走杂质。在杂质和基质之间及在核酸和基质之间有不同的亲和力，这有助于解除对产生外部驱动力(例如离心力和压力)的仪器以及对现场和在偏远地区从样品分离靶核酸的专业技术人员的需要。显然，通过使洗涤液(例如扩增缓冲液)流经样品施加区除去杂质或非靶核酸，靶核酸变得与样品溶液中的其它组分充分分离。
如所述，样品施加区另可包含裂解试剂或稳定试剂，或者可在样品施加到基质之前或之后将裂解试剂加入样品中，其中洗涤步骤导致除去浸入和/或存在于基质上的裂解试剂和/或稳定试剂。裂解试剂、稳定试剂或其它杂质和/或非靶核酸可抑制下游应用，例如扩增。在一些实施方案中，核酸扩增反应混合物洗涤存在于基质上的一种或多种抑制剂。抑制剂或污染物还可产生于细胞裂解(例如细胞碎片或其它细胞器)，其对下游过程具有抑制作用，并通过洗涤除去。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括使洗涤缓冲液沿基质流动。术语“洗涤缓冲液”在本文可与清洗缓冲液或清洗试剂或洗涤试剂互换使用。参照图1，洗涤试剂可存储于洗涤试剂贮器26中，洗涤试剂从贮器26经过样品施加区14流到洗涤试剂灯芯垫30。吸水基质(例如石英纤维过滤器本身)的多孔性所固有的芯吸力起驱动力的作用，使扩增缓冲液能够沿石英纤维过滤器和通过样品施加区流动。基于其强的芯吸力，灯芯垫28、30吸取液体样品或扩增缓冲液或洗涤缓冲液向灯芯垫28、30流动。
在一些实施方案中，洗涤试剂和扩增缓冲液是相同的，并可储存在单个贮器中。扩增缓冲液可包含除酶(例如聚合酶)以外的扩增试剂。在这些实施方案中，洗涤溶液可用扩增缓冲液置换，这可通过将两个步骤(例如核酸的洗涤和分离)并成一个，来消除洗涤步骤。在这些实施方案中，核酸通过扩增缓冲液在基质12上的扩散洗涤。洗涤缓冲液或扩增试剂溶液在芯吸力下沿基质12流动，其中不使用外力，并带走对基质(例如石英纤维过滤器)的亲和力比靶核酸的亲和力小的杂质。在洗涤的实施方案中，将核酸俘获探针固定在基质上，并且不受洗涤液的侧向流动影响。在一些实施方案中，通过施加洗涤液，靶核酸从样品施加区迁移至俘获区，并通过杂交被核酸俘获探针俘获。
在一个或多个实施方案中，液体是核酸扩增反应混合物，其扩增存在于样品中的模板核酸形成靶核酸扩增产物或靶扩增子。在这些实施方案中，通过扩增存在于施加的样品中的核酸模板形成靶核酸。在这些实施方案中，所述方法进一步包括使核酸扩增试剂通过样品施加区流经一段基质。术语“扩增试剂”和“扩增试剂溶液”在下文可互换使用。扩增试剂包含dNTP的混合物、寡聚体(引物)、酶(包括聚合酶)和扩增缓冲液。
在一些实施方案中，将包含dNTP的混合物、寡聚体(引物)、缓冲液和盐的扩增缓冲液加入基质中使基质再水化。为了开始扩增反应，单独将酶加入基质中。在一些实施方案中，当与样品施加区的模板核酸接触时，扩增反应混合物在扩增缓冲液存在下开始扩增，其中扩增反应混合物含有酶。在一些实施方案中，可将包含dNTP混合物、寡聚体和扩增缓冲液试剂的扩增试剂浸入基质中，所述基质可使用水性缓冲液重构。在这些实施方案中，在开始扩增反应之前加入DNA聚合酶。扩增试剂还可包含修饰的核苷酸。
参照图2，扩增试剂可存储在扩增试剂贮器24中。基质包含一个或多个熔片16以容纳试剂且当需要时释放。在完成洗涤时，熔片16溶解，扩增试剂的侧向流动开始从扩增试剂贮器24流动，通过样品施加区14和俘获(检测)区20，并达到扩增试剂灯芯垫28。灯芯垫产生芯吸力，这使扩增试剂的侧向流动能够穿过一段基质向灯芯垫28迁移。
在一个或多个实施方案中，扩增试剂通过基质流动以扩增模板核酸形成核酸扩增产物(扩增子)，这在本文称为“靶核酸”或“靶扩增子”。在一些实施方案中，核酸俘获探针具有第一分子量、包含具有第二分子量的靶核酸的一个或多个的样品和具有第三分子量的模板核酸。在这些实施方案中，样品包含具有第二分子量的靶核酸和具有第三分子量的模板核酸两者，将样品施加至基质12的样品施加区。在一些其它实施方案中，样品包含具有第三分子量的模板核酸，没有第二分子量的靶核酸。在这些实施方案中，如早期所述，模板核酸经扩增形成扩增子，其是具有第二分子量的靶核酸或靶扩增子，并且对具有第一分子量的核酸俘获探针具有亲和力。在这些实施方案中，具有第三分子量的模板核酸基本被固定在样品施加区14，具有第二分子量的扩增产物通过侧向流动迁移离开样品施加区14进入俘获区20。如所述，本文所用术语“第一”、“第二”、“第三”等，并不表明任何顺序、量或重要性，而是用来将一个要素与另一个区分开来。
具有第三分子量的核酸基本上可位于样品施加区14周围。具有第二分子量的靶核酸或扩增子基本上被核酸俘获探针(例如RCA俘获探针)俘获，如图7中所示，俘获的靶扩增子基本上位于俘获区(或检测区) 20周围。本文所用术语“基本上”是指具有某种分子量和位于定位部分周围的核酸的量，其可以是样品溶液中具有该分子量的核酸的总量的至少约15%保留在该特定位置、样品溶液中具有该分子量的核酸的总量的至少50%保留在该特定位置或样品溶液中具有该分子量的核酸的总量的至少90%保留在该特定位置。例如，基本上具有第三分子量的核酸意指施加至基质上的总模板核酸的90%保留在样品施加区14处或其周围的基质上，而对于具有第二分子量的靶核酸，基质上产生的总扩增核酸的90%保留在所述一段基质上或其周围或具体地讲在俘获区(或检测区) 20上或其周围的基质上。
在方法的一些实施方案中，当扩增试剂进入样品施加区14时，扩增开始。在一些实施方案中，在浸入的扩增试剂再水化以使加入基质的试剂和核酸聚合酶重构时，扩增反应开始。扩增试剂可持续流经俘获区20至灯芯垫28。扩增试剂可通过侧向流动从贮器移动至灯芯垫而不形成团块。扩增产物可在俘获区20被一个或多个核酸俘获探针(例如RCA俘获探针)俘获。在一些实施方案中，所述方法提供扩增试剂和扩增产物经过俘获区(或检测区)20的连续流动。在这些实施方案中，靶扩增子或靶核酸到俘获区的连续流动导致靶核酸或扩增子被核酸俘获探针重复俘获。该方法在俘获区蓄积大量的靶核酸，当靶核酸的浓度在俘获区颇高时，靶核酸可容易地检出。另外，这可能是在从样品分离后蓄积靶核酸的一种方式，其中样品可以是包含多个类似组分的复杂样品。所述方法通过重复流经基质导致从稀样品浓缩特定的靶核酸，当从俘获探针洗脱时，这进一步降低溶液中靶标的异质性。
在一些实施方案中，所述方法包括使核酸扩增反应混合物流动，这按照其分子量分离模板核酸和靶核酸扩增产物。模板核酸具有第三分子量，扩增的靶核酸具有第二分子量，其中分子量之间的差异可使扩增的靶核酸能够在侧向流动期间与模板核酸分离。正如可从实例中所见，在扩增试剂通过样品施加区14沿基质12的一段扩散后，核酸按照其分子量位于石英纤维过滤器12。具体说来，与具有较低分子量的核酸相比，具有较高分子量的核酸较靠近地位于样品施加区14，较低分子量的核酸在俘获区被第一分子量的核酸俘获探针俘获。
样品施加区14是具有第三分子量的模板核酸的定位部分。具有第三分子量的核酸的大部分位于样品施加区14周围。在一些实施方案中，第三分子量的范围为至少约50 kb。在一些实施方案中，第三分子量的范围为约50 kb-约150 kb。在一些实施方案中，约50 kb是指50 kb ±15 kb的范围。
在一些实施方案中，具有第二分子量的核酸的大部分位于第二末端31的周围。在这种情况下，第二末端31是具有第二分子量的靶核酸以及具有第一分子量的核酸俘获探针的定位部分。具有第二分子量的靶核酸可跨越基质分布。在一些实施方案中，第二分子量的范围为小于约50 kb。在一些实施方案中，靶核酸扩增子可具有不止一种分子量群，其可产生于不止一种模板分子。
在所述方法的一些实施方案中，一个或多个扩增反应发生在基质上。在一些实施方案中，第一扩增反应发生在样品施加区以产生第一扩增产物(或第一靶核酸)。一个或多个扩增反应可发生在第一扩增产物或第一靶核酸迁移期间。同样，一个或多个扩增反应可发生第二扩增产物或第二靶核酸迁移期间，等等。多个扩增反应产生大量的靶扩增产物，这有利于较大便易性、灵敏度和准确性的检测方法。在这些实施方案中，核酸俘获探针还包含与第一靶核酸扩增子或第二靶核酸扩增子的一个或多个序列互补的一个序列或多个序列，并通过杂交俘获第一靶核酸扩增子或第二靶核酸扩增子。特别是，当模板核酸可以痕量获得时，例如用于法医应用或来自活检样品的所获得的样品，多个扩增反应是有用的。
在一些实施方案中，发生在基质上以产生靶核酸的扩增是等温扩增反应。等温扩增可包括但不限于滚环扩增(RCA)、多重置换扩增(MDA)、解旋酶依赖性扩增(HDA)、乒乓扩增、交叉引发扩增(CPA)、重组酶聚合酶扩增(RPA)、环介导等温扩增(LAMP)和链置换扩增(SDA)。
在不同的实施方案中，一级检测探针(primary detection probe) (或检测探针)可与不同的分子、基质偶联，或可单独加入。例如，基质包含检测探针，核酸俘获探针包含检测探针，扩增的靶核酸包含检测探针，或检测探针可在靶核酸的扩增反应或俘获期间、之前或在其完成时单独加入。
在一些实施方案中，存在于样品中的靶核酸用可检测部分标记，可检测部分可包括但不限于亲和标签、染料、酶基质或磁性探针。在一个说明性实施方案中，亲和探针是生物素，其是相对小的(244.3道尔顿)配体，并且可与其生物活性最小改变的许多蛋白质和其它分子缀合。生物素标签可用来促进用与酶、荧光团或其它报道分子缀合的生物素结合蛋白的检测。优化的生物素与探针之比可大大提高检测系统的信号输出，这为检测系统提供适当的信号。
所述方法进一步包括通过使用一级检测探针检测靶核酸。靶核酸可包含一级检测探针。在一些实施方案中，核酸俘获探针包含一级检测探针。一级检测探针可包含生色团部分、荧光部分、磷光部分、亲和探针、磁性探针、顺磁性探针或其组合。一级检测探针另可包含结合部分例如生物素或抗体、链霉抗生物素、金颗粒或其组合。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括使包含二级检测探针的溶液沿基质的一段流动。在这些实施方案中，二级检测探针与一级检测探针结合，其中一级检测探针之前与俘获的靶核酸结合。在一些其它实施方案中，二级检测探针与一级检测探针结合，其中一级检测探针之前与核酸俘获探针结合。
扩增的靶核酸或扩增子可在俘获区被俘获，接着检测基质上的靶核酸。在一些实施方案中，将包含一个或多个检测探针的溶液加入基质上。在一些其它实施方案中，检测探针是扩增反应混合物的一部分。包含一个或多个检测探针的溶液或包含一个或多个检测探针的扩增反应混合物可沿基质的一段流动。在一些实施方案中，可将检测探针直接加在俘获区或检测区20上。在一些实例中，将呈溶液形式或作为扩增反应混合物一部分的检测探针施加至俘获区或检测区20上。
核酸俘获探针可在核酸在基质中扩散期间俘获基质上的扩增的目标靶核酸。扩增产物(靶核酸)可通过与核酸俘获探针的物理相互作用固定在基质上，其中核酸俘获探针用检测探针标记。
“检测探针”可采用一种或多种检测方法检测靶核酸或靶核酸扩增子。检测探针可包括但不限于金颗粒、反义寡聚体、焦磷酸、磷酸酶、生物素-链霉抗生物素珠粒、抗体、荧光共振能量转移(FRET)探针、辣根过氧化物酶(HRP)探针和萤光素酶。反义寡聚体可包含天然核苷酸或核苷酸类似物。寡核苷酸可用FRET探针(例如荧光素、Cy5、Cy5.5和BIODPY®)标记。
俘获并分离靶核酸，其可通过不同的方法进一步检测。在一些实施方案中，靶核酸例如DNA可通过DNA印迹检测，RNA可通过RNA印迹检测。在俘获区俘获和分离的靶核酸可通过比色检测方法、基于化学、热、电学、pH、发光或荧光的检测方法检测。
在一些实施方案中，一级检测探针与靶核酸、核酸俘获探针或其组合偶联。如所述，一级检测探针与靶核酸或核酸俘获探针“偶联”，其中一级检测探针可与靶核酸或核酸俘获探针或两者物理或化学连接或相连。在一些实施方案中，靶核酸包含同时存在于样品中的一级检测探针。在一些其它实施方案中，核酸俘获探针当固定在基质上时包含一级检测探针。在一个实施方案中，在施加到基质上之前将一级检测探针加入样品中，其中一级检测探针与靶核酸偶联。在一些实施方案中，可将一级检测探针加入基质上的核酸俘获探针中。一级检测探针可以是与靶核酸杂交的反义寡聚体，其中可检测反义寡聚体探针。检测探针可包括但不限于放射性分子、荧光分子、蛋白质或肽。例如将磷的放射性同位素32P插入可用作一级检测探针的反义寡聚体的磷酸二酯键中。一级检测探针可用非放射性标记(例如洋地黄毒苷)标记。在这种情况下，抗洋地黄毒苷抗体可用来检测洋地黄毒苷标记的探针。在一些实例中，一级检测探针是化学实体，其与靶核酸连接的部分接触可产生荧光信号。一级检测探针可以是酶，在与靶核酸上的部分相互作用时可产生显现颜色的化学物。这可将被核酸俘获探针俘获的有色靶核酸与无色模板或非靶核酸区别开来。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括：使包含一级检测探针的溶液沿基质的一段流经样品施加区以与俘获的靶核酸或俘获的靶扩增产物结合形成一级检测探针结合的靶核酸(或扩增产物)。
所述方法的一些实施方案进一步包括：使包含二级检测探针的溶液沿基质的一段流经样品施加区以结合一级检测探针、靶核酸或核酸俘获探针或其组合。二级检测探针可与一级检测探针结合的靶核酸结合。在一些实施方案中，一级检测探针可与荧光部分连接，其中可选择二级检测探针作为猝灭剂。二级检测探针可猝灭在相互作用时由一级检测探针产生的荧光。在一些其它实施方案中，一级检测探针可与第一抗体连接，其中可选择二级检测探针作为第二抗体，其中第二抗体可与第一抗体结合并产生信号。
在一些实施方案中，在靶核酸俘获并将其从非靶核酸或杂质(例如DNA和/或RNA)中分离后，可使靶核酸稳定以长期保存，这取决于其应用和要求。靶核酸可与固定在基质上的核酸俘获探针物理结合，其中可使用不同的试剂或条件使结合效率进一步提高。在一些实施方案中，可将稳定试剂浸入俘获区的基质中，这进一步使俘获的靶核酸稳定。在一些实施方案中，可将稳定试剂浸入样品施加区14、俘获区20或整个基质12中。本说明书的稍后部分更详细地描述了稳定试剂。
液体，例如洗涤缓冲液、扩增试剂或扩增缓冲液沿石英纤维过滤器的一段流经样品施加区，靶核酸在基质上的迁移取决于核酸的长度。靶核酸在石英纤维过滤器上迁移，分子量越低，核酸在石英纤维过滤器上从样品施加区迁移得越远。在该方法的一个或多个实施方案中，将迁移调节剂加入基质中。迁移调节剂改进分子与基质的结合效率。在一些实施方案中，样品施加区还包含迁移调节剂。迁移调节剂可用来改进利用侧向流动的靶核酸迁移速率或模式。通过确保模板核酸与基质更好的结合，迁移调节剂可降低一个或多个模板核酸的迁移速率。使用迁移调节剂确保靶核酸或扩增的靶核酸的有效俘获、分离和检测。
在一些实施方案中，迁移调节剂包含离液剂。迁移调节剂可包含胍盐，其可使模板DNA在扩增产物或靶DNA侧向流动期间的迁移最小化。在一个实施方案中，迁移调节剂包含硫氰酸胍。一般来讲，硫氰酸胍改进基因组DNA与基质的结合，这保留模板核酸，例如样品施加区上结合的基因组DNA。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括提供毗邻基质的第二末端31的灯芯垫，其可用作停止垫或收集垫。停止垫可使包含核酸的样品在第二末端附近停止流动。停止垫可被流动屏障替代。收集垫可通过将俘获的扩增子转移到收集垫上，从基质收集核酸。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括加入收集垫。在这些实施方案中，在洗涤缓冲液沿石英纤维过滤器12的一段通过样品施加区14扩散后，将收集垫(停止垫、灯芯垫或石英纤维过滤器)从基质上拆下，并更换新的收集垫使得缓冲液从基质流向新的收集垫。
在一些实施方案中，基质是固体基质，其是一种非水溶性的材料，能够收集、提取、分离、俘获、检测和储存核酸，接着通过使用水或水性缓冲液洗脱而不使材料增溶。在一些实施方案中，基质是包含第一末端11、样品施加区14和第二末端31的长形条带。自样品施加开始至俘获靶核酸的运行时间可随靶核酸长度的增加而延长，因为高分子量靶核酸具有低的流动性，且迁移慢。从样品分离核酸可随基质的长度增加而更好。考虑更好的分离以及运行时间，可使基质的长度优化。基质可具有范围介于1 cm和20 cm的长度。在一些实施方案中，基质具有小于10 cm的长度。
基质包括但不限于例如纤维素、醋酸纤维素、硝酸纤维素、玻璃纤维等材料或其组合。在一个实施方案中，基质包含纤维素。在一个或多个实施方案中，基质选自硝酸纤维素膜、纤维素膜、醋酸纤维素膜、再生纤维素膜、硝酸纤维素混合酯膜、聚醚砜膜、尼龙膜、聚烯烃膜、聚酯膜、聚碳酸酯膜、聚丙烯膜、聚偏二氟乙烯膜、聚乙烯膜、聚苯乙烯膜、聚氨酯膜、聚苯醚膜、四氟乙烯-六氟丙烯共聚物膜和上述膜的两种或更多种的任何组合。在一些实施方案中，基质包含改良的纤维素，例如聚乙二醇化纤维素或聚乙二醇化硝酸纤维素。
在一些实施方案中，基质是多孔基质。在一个实施方案中，基质是多孔纤维素膜。在一个实施方案中，固体基质是多孔纤维素纸，例如来自GE Healthcare Life Sciences的纤维素基质(旧称Whatman™)。在一个实例中，纤维素基质包含903-纤维素、FTA™或FTA™Elute。
将包含核酸的样品溶液施加到石英纤维过滤器12的样品施加区14。样品施加区14可以是样品溶液可施加至其上的任何形状或构造。在一些实施方案中，石英纤维过滤器12的样品施加区14包含裂解试剂，并将包含核酸的生物样品直接施加至石英纤维过滤器12的样品施加区14。在装置的一个或多个实施方案中，样品施加区包含FTA垫。
在一个或多个实施方案中，基质包含为基本干燥状态的一种或多种细胞裂解试剂、蛋白质变性剂或稳定剂。在其它实施方案中，除为干燥状态的蛋白质变性剂以外，基质另包含缓冲液试剂、还原剂和任选自由基清除剂。基质可提取核酸并将核酸保持在干燥条件下，其中通过用水或水性缓冲液再水化，可将干燥的核酸从基质中进一步洗脱。
如所述，样品施加区包含裂解试剂，其中裂解试剂可包含离液剂。离液物质的实例包括但不限于盐酸胍、氯化胍、异硫氰酸胍/硫氰酸胍、硫氰酸钠、高氯酸钠、碘化钠、碘化钾、脲和/或其任何组合。为了降低离液强度所示典型的阴离子离液系列包括：CCl3COO-、CNS-、CF3COO-、ClO4 -、I-、CH3COO-、Br-、Cl-或CHO2 -。裂解试剂可包括浓度为0.1 M-10 M或1 M-10 M的离液物质。
对于某些生物样品(例如细菌)，裂解试剂可包含例如裂解酶，或生物样品可在裂解前用例如裂解酶预处理。裂解试剂还可包含蛋白酶，例如丝氨酸、胱氨酸和金属蛋白酶。可使用不含核酸酶的蛋白酶。可使用包含稳定剂(例如金属离子)的蛋白酶。可使用蛋白酶，在添加时量优选为每ml完整裂解试剂约0.001 IU-约10 IU、更优选约0.01 IU-约1 IU。
在一些实施方案中，裂解试剂还包括足量的缓冲液。用于裂解试剂的缓冲液的实例包括三-(羟基甲基)氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)、磷酸钠、乙酸钠、四硼酸钠-硼酸和甘氨酸-氢氧化钠。
在一些实施方案中，裂解试剂还包括非离子型表面活性剂、阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、两性表面活性剂和/或其任何组合。示例性的非离子型表面活性剂包括但不限于叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100TM)、(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPALTM CA-630/NP-40)、三乙二醇单月桂醚(BRIJTM 30)、脱水山梨糖醇单月桂酸酯(SPANTM 20)或聚山梨醇酯家族的化学品，例如聚山梨醇酯20 (即TWEENTM 20)、TWEENTM 40、TWEENTM 60和TWEENTM 80 (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo.)。阳离子表面活性剂的实例包括鲸蜡基三甲基溴化铵、十二烷基三甲基氯化铵、十四烷基三甲基氯化铵和西吡氯铵。裂解试剂中表面活性剂的浓度在不同的表面活性剂中可略微改变，并取决于待裂解的生物样品中的组分。在一些实施方案中，表面活性剂浓度的范围为约0.01%-约20% (重量)。裂解试剂另可包含二硫苏糖醇(DTT)。
在一个实施方案中，基质用核酸稳定试剂浸入。这些稳定试剂可包括DNA分解酶抑制剂例如DNA酶抑制剂和/或RNA分解酶抑制剂例如RNA酶抑制剂、缓冲液试剂或螯合剂(例如EDTA)。如所述，基质包含RNA酶抑制剂，其中RNA酶抑制剂包含氧钒核糖核苷复合物(VRC)、核苷酸类似物、市购可获得的RNA酶抑制剂(例如SUPERase-In™)或三磷酸盐，例如三磷酸钠。基质可包含DNA酶抑制剂，其可包括但不限于2-巯基乙醇、2-硝基-5-氰硫基苯甲酸、肌动蛋白、黄曲霉毒素B2a、G2、G2a和M1、Ca2+、EGTA、EDTA、十二烷基硫酸钠、牛脾抑制剂蛋白、碳二亚胺和硫酸胆固醇、碘乙酸盐。
在一些实施方案中，基质包含稳定试剂，其可包括促进RNA酶变性并有助于降解的RNA分离的还原剂。示例性还原剂包括但不限于2-氨基乙硫醇、三羧乙基膦(TCEP)和β-巯基乙醇。如所述，基质另包含螯合剂，其中螯合剂选自乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸、乙二醇四乙酸(EGTA)或其组合。
基质另可包含紫外线防护剂、自由基清除剂、螯合剂或其组合用于稳定核酸。虽无意限于任何具体的UV防护，但示例性抗氧化剂包括例如氢醌一甲基醚(MEHQ)、氢醌(HQ)、甲基氢醌(THQ)、尿酸和抗坏血酸。在一些实施方案中，抗氧化剂是THQ。
如所述，可从基质上洗去来自样品施加区14的非靶核酸、残余的裂解试剂、抑制剂或其它杂质。可在扩增模板核酸和/或俘获靶核酸之前使用扩增缓冲液进行洗涤。在一些实施方案中，可以使用其它洗涤溶液，其中洗涤溶液包含水性缓冲液，其可以是核酸的任何溶剂。在一些实施方案中，水性缓冲液包含三(羟基甲基)氨基甲烷、乙二胺四乙酸(EDTA)缓冲液、磷酸缓冲盐水(PBS)或其中tris缓冲液用HEPES替换的Tris EDTA (TE)。如所述，水性缓冲液沿基质的一段流经样品施加区14，例如石英纤维过滤器12。在一些实施方案中，使基质的第一末端11放置在水性缓冲液中，使得水性缓冲液从基质12的第一末端11流过。
洗涤缓冲液可包含能够降解污染物(例如蛋白质)的酶。此外，视情况它可包含脱氧核糖核酸酶、核糖核酸酶等。使用包含脱氧核糖核酸酶的洗涤缓冲液允许RNA的选择性回收。同样，使用包含核糖核酸酶的洗涤缓冲液允许DNA的选择性回收。
可将用于洗涤基质的扩增缓冲液施加至与施加包含核酸的样品溶液的位置(即样品施加区)相同位置处的石英纤维过滤器上。还可将扩增缓冲液施加至不同于样品施加区和缓冲液加载部分两者的位置处的石英纤维过滤器上。
在一些实施方案中，扩增缓冲液流至第二末端31，并将样品溶液中不需要的污染物带入第二末端。然后在使液体流动以迁移靶核酸或使扩增试剂或扩增缓冲液流动之前，切下第二末端31。以这样的方式，将位于石英纤维过滤器的俘获区20的靶核酸从不需要的污染物中分隔/分离。在液体(例如扩增缓冲液或洗涤缓冲液)扩散之后，可在低离子强度、高热量、电泳或本领域已知的其它方法的条件下洗脱位于石英纤维过滤器12的俘获区20的靶核酸。
在一些实例中，样品溶液被吸附、吸收或以别的方式掺入样品施加区中或其上，其方式是不容易从样品施加区清除，除非使之受制于有意或非有意进行的从样品施加区清除吸附的组分的条件。
包括以下实施例以向本领域普通技术人员提供实施要求保护的发明的额外指导。这些实施例不限制随附权利要求书中限定的发明。
实施例
实施例1：GF/F基质的制备
将GF/F多孔基质(Whatman® -GE Healthcare)浸入280 mg/ml硫氰酸胍(Sigma-Aldrich)的溶液中，并使之风干。然后把这种处理的基质切成5x5 mm方块，使用PDMS胶将各方块装配在改进的侧向流动条带上。如下改进各侧向流动条带(基质) 12 (图2)：在将放置处理的GF/F多孔基质14的5 mm方块的位置下方距顶端11约10-12 mm处去除一块面积。一个条带用相对尖端11的末端上存在的灯芯28处理(图2)。
实施例2：基于改良的多孔硝酸纤维素的基质的制备
将基于硝酸纤维素的基质(GE Healthcare)浸入含有10% (w/v)聚乙二醇甲基醚甲基丙烯酸酯300 (PEG；Sigma-Aldrich)和30% (v/v) Tween 20 (Sigma-Aldrich)的水溶液中10秒钟，制备改良的多孔基质。除去过量溶液，处理的基质进行总量为10 kGy的电子束(Advanced Electron Beam)处理。在照射后，如下处理改良的基质：1)使用定轨旋转台，通过在蒸馏水中浸透3次各30分钟来洗涤，2)除去过量的水，和3)允许在室温下风干过夜。
实施例3：RCA扩增子(或RCA俘获探针)的制备
进行滚环扩增反应以产生RCA产物DNA。使具有序列5′-CATCATTGATTTAGACACTGAAAAA-3′ (SEQ ID No. 1)的25个核苷酸(nt)长的5′-磷酸化DNA寡核苷酸(oligo)探针退火至具有序列5′-ATCAATGATGTTTTTCAGTG-3′ (SEQ ID No. 2)的20 nt支架寡核苷酸，并通过连接末端使之环化，形成环化模板DNA。表1提供序列供参考。
表1：用于RCA反应的寡核苷酸的序列。
样品 SEQ ID No. 序列
寡核苷酸(oligo)探针 1 5′-CATCATTGATTTAGACACTGAAAAA-3′
支架寡核苷酸 2 5′-ATCAATGATGTTTTTCAGTG-3′
退火—将含有10 mM Tris (pH 8.0)、50 mM NaCl、100 pmol探针寡核苷酸和150pmol支架寡核苷酸的退火反应物(40 µl)在95℃下温育2分钟，以每秒0.1℃温度降低的速率慢慢冷却至4℃。
连接—将含有50 mM Tris (pH 7.5)、10 mM MgCl2、10 mM DTT、1 mM ATP、40pmol退火的探针/支架寡核苷酸和1600 U T4 DNA连接酶(NEB)的连接反应物(80 µl)在23℃下温育16小时，然后在65℃下温育以使连接酶失活。
扩增—使如上文所述制备的环化DNA模板在2种不同的RCA反应(例如“高聚合酶”和“低聚合酶” RCA反应)中扩增。使用含有50 mM HEPES (pH 8.0)、20 mM MgCl2、0.01%Tween-20、1 mM TCEP、8.5 pmol环化探针/支架寡核苷酸、15 mM KCl、400 µM dNTPs和5.4µg Phi29 DNA聚合酶的“高聚合酶”滚环扩增(RCA)反应物(270 µl)，使环化模板DNA扩增。在另一组中，进行了“低聚合酶” RCA反应；其中低聚合酶RCA反应物相同，不同的是Phi29DNA聚合酶的量减至0.6 µg。在低聚合酶扩增反应物中，使反应混合物在37℃下温育16小时，在65℃下再温育20分钟以使聚合酶热灭活，然后扩增的DNA通过乙醇沉淀纯化，重新悬浮于250 µl的10 mM Tris (pH 7.5)、0.1 mM EDTA中。
实施例4：乳酸脱氢酶I (LDH I)扩增子的制备
用于含LDH的扩增反应的不同寡核苷酸见表2。10微升的各反应混合物含有1x反应缓冲液(50 mM KPO4 pH=7.6、3.75 mM MgSO4、0.2 mM dNTP)、50 nM正向bumper引物和反向bumper引物、250 nM正向扩增引物、500 nM反向扩增引物、6单位N. BbvC1B限制性酶(购自New England Biolabs或NEB)、8单位Bst2.0 warm start DNA聚合酶(购自New EnglandBiolabs或NEB)、200 nM生物素化检测探针。反应混合物另含有1,000,000拷贝的甲氧西林敏感性金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) (MSSA)基因组DNA用于试验样品。使反应在50℃下温育30分钟。
表2：用于LDH反应的寡核苷酸的序列
样品 SEQ ID No. 核酸序列
正向Bumper引物 3 5'AGGTAATGGTGCAGTAGGT
正向扩增引物 4 5'gcataatactaccagtctcctcagcAAGCTACGCATTTTCATT
反向扩增引物 5 5'tagaatagtcgcatacttcctcagcACATCTCCTCGAACTTTTT
反向Bumper引物 6 5'CCAGCTTTCACACGAAC
生物素化检测探针 7 5'CTAATTCATCAACAATGC-生物素
实施例5：使用RCA俘获探针的侧向流动测定和温度的影响
使用移液管，以9 pmol/mm2的浓度将从用低聚合酶浓度(0.6微克/反应)或高聚合酶浓度(5.4微克/反应)的反应中制备的RCA产物点在硝酸纤维素膜(NC)或含PEG的改良硝酸纤维素膜(NC-PEG)上，接着在环境条件下干燥过夜。NC或NC-PEG基质上所施加和干燥的RCA产物用作核酸俘获探针，RCA探针施加线在侧向流动基质的一个末端，在本文可称为试验线。对于对照实验，核酸探针通过交联与基质连接，并用作核酸俘获探针。
然后装配加载了RCA俘获探针的硝酸纤维素(NC)或改良的硝酸纤维素(NC-PEG)膜(宽5 mm，长4 cm)，以及纤维素膜(长12 mm)，以形成侧向流动装置(LFD)。在LFD (或侧向流动条带)中，将纤维素吸收垫安置在硝酸纤维素(NC)或改良的硝酸纤维素(NC-PEG)膜上，接近NC或NC-PEG膜的一个末端，使得2 mm纤维素垫与硝酸纤维素或改良的硝酸纤维素膜接触(重叠)。
通过将LFD的一端浸入100 µl运行缓冲液中，进行侧向流动测定。运行缓冲液含有：1) 10 µl以106个甲氧西林敏感性金黄色葡萄球菌(MSSA)基因组DNA的输入通过等温链置换扩增(iSDA)反应产生的乳酸脱氢酶I (LDH I)扩增子；2) 10 µg的300 µm用链霉抗生物素功能化的蓝色珠粒(来自Seradyn)；和3) 15 mM HEPES (pH 6.8)、2.5 mg/ml BSA和1%Triton X-100。测定温度在室温下或在50℃下。还在50℃下测试了额外的0.4 M NaCl对试验线杂交的影响。对于试验侧向流动装置或条带，将有RCA DNA俘获探针的基质浸入运行缓冲液中。
对于低聚合酶和高聚合酶浓度，侧向流动测定在室温下和在50℃下进行，结果分别如图4A和4B所示。测定了在室温下和在50℃下的检测性能，其中在不同温度下在俘获靶核酸后基质上RCA俘获探针的条带(试验线)的强度对于低聚合酶(左图)和高聚合酶(右图)浓度仍然相同，分别如图4A、4B所示。结果(图4A、4B)表明，RCA俘获探针在流动期间不侧向迁移，尽管RCA俘获探针不与基质交联或以别的方式连接的事实。由于低分子量，靶核酸或靶扩增子(由iSDA产生)通过基质迁移，并通过与因其高分子量而固定在基质上的RCA俘获探针杂交被俘获。因俘获长度增加所致，靶核酸与RCA俘获探针结合的效率高。另外，与在50℃下不稳定的其它核酸俘获探针不同，RCA俘获探针的高解链温度确保了在较高温度(50℃)下RCA核酸的稳定性，并提供高的俘获效率(图4B)。低分子量俘获探针需要UV诱导的交联以在侧向流动期间与基质的一个位置连接(数据未显示)。通过使用在流动期间不会侧向迁移的高分子量RCA俘获探针，避免了使俘获探针与基质交联的步骤。另外，通过将0.4MNaCl盐加入俘获探针(RCA和低分子量核酸)两者中，RCA DNA俘获探针的条带强度在低温和高温下几乎保持相同。盐浓度对RCA俘获探针的俘获以及检测效率没有明显影响。
实施例6：RCA俘获探针浓度对侧向流动测定的影响
为了研究RCA俘获探针的浓度对侧向流动测定的灵敏度的影响，将不同浓度的RCA俘获探针(2.3、9或45 pmol/5 mm2)施加至NC-PEG基质上，并干燥1天。然后如上所述将NC-PEG膜装配在侧向流动装置(LFD)中。通过将LFD的一端浸入100 µl运行缓冲液中来进行侧向流动测定，所述缓冲液含有：10 µl以106基因组MSSA DNA的输入通过等温链置换扩增(iSDA)反应产生的LDH1扩增子；10 µg的300 µm用链霉抗生物素功能化的蓝色珠粒(来自Seradyn)；和15 mM HEPES (pH 6.8)、2.5 mg/ml BSA和1% Triton X-100。测定在室温下或在50℃下进行，应用Image J (NIH软件)，通过减去来自RCA条带的1 mm前缘的强度的背景信号，量化各侧向流动条带上的信号强度。备注，侧向流动试验中典型的试验线宽度视为1 mm。
在室温下在侧向流动测定之后几分钟内在俘获的核酸上产生信号。测定在30分钟内完成，侧向流动测定条带的图像应用Image J软件量化。如图5A和5B中所示，条带的信号强度在室温下和在50℃下随NC-PEG膜上的RCA俘获探针浓度的增加而增强。如图5C中所示，应用Image J软件，针对图5A和5B中的不同浓度，使在低温和高温下的RCA俘获探针的信号强度量化。该结果表明，尽管在基质上缠结，不与基质交联或连接的高分子量RCA俘获探针的官能团具有高的俘获效率。该结果还排除了以下可能性：因在基质内探针缠结的结构阻碍所致，高分子量RCA俘获探针的结合能力差。
实施例7：侧向流动测定中基质和干燥条件对不同浓度的俘获探针的影响
RCA探针以较大的体积产生，并使用BioDot XYZ-3000分配平台将其分配在NC-PEG膜或未改良的硝酸纤维素(GEHC FF80HP)膜上作为试验线(T)。还将BSA-生物素分配在膜上作为对照线(C)，其俘获流过膜的任何报告颗粒。在将加载RCA探针的膜干燥后，随后如上所述将膜装配在侧向流动装置(LFD)上。膜上RCA探针的最终浓度为2.3、9或22.5 pmol/试验线(1mm x 5 mm)。在将膜上的RCA探针干燥一(1)天或两(2)天后，通过将LFD的一端渗入100 µl运行缓冲液中来进行侧向流动测定。运行缓冲液含有：10 µl以106基因组MSSA DNA的输入通过等温链置换扩增(iSDA)反应产生的LDH1扩增子；1 OD的40 nm用链霉抗生物素共价功能化的金颗粒(Innova Biosciences)；和PBS (pH 7.4)。
如图6A和6B所示，当靶核酸(扩增子)浓度不变时，试验线的信号强度随探针浓度而变化。NC-PEG膜上第2天的信号强度一般高于第1天，对于NC-PEG和未改良FF80HP硝酸纤维素膜在第2天(在RCA完全物理吸附到膜表面上后)，观察到类似性能。
实施例8：测定扩增子的侧向流动检测的灵敏度
进行该实施例以测定RCA俘获探针的侧向流动检测的灵敏度。当模板核酸的输入较少时，扩增子产生的效率一般也降低，这导致侧向流动测定(LFA)中较少的信号强度。在该实验中，RCA探针浓度为67 pmol/试验线(1 mm x 5 mm)，并加载到侧向流动测定条带的NC-PEG膜上。使用来源于等温DNA扩增(iSDA)反应的靶扩增子(靶核酸)进行侧向流动测定，其中输入模板核酸浓度不同，例如102和106个包含MSSA基因组DNA的细胞数。使细胞裂解，并施加到扩增反应混合物中作为模板核酸的来源。如图7中所示，对于在iSDA反应中不含基因组DNA的“无模板对照” (NTC)样品(泳道1)，没有试验线信号显现。使用施加到侧向流动检测条带上的RCA探针，可检测靶扩增子(泳道2、3、4)，其中靶扩增子来源于iSDA反应，其中MSSA基因组DNA来源于在室温下以RCA探针的不同干燥条件(第1天和第5天)和在50℃下的102个细胞(泳道2、3、4)和106个细胞(5、6、7)。如图7中所示，当MSSA基因组DNA的浓度从102升至106时，如强大信号强度所示，RCA探针有大范围的检测限。该结果再次表明，RCA俘获探针在侧向流动期间保持在一个位置上，没有像低分子量俘获探针所需的交联或任何其它固定。另外，尽管RCA俘获探针在基质上的缠结，RCA俘获探针具有优良的检测灵敏度。
虽然在典型的实施方案中说明和描述了本公开内容，但无意受限于所显示的细节，因为可进行不同的改动和替换而不以任何方式偏离本公开内容的精神。因此，只是采用常规实验，本领域技术人员便会想到本公开内容的更多改动和等同内容，并且所有这类改动和等同内容都视为在随附权利要求书中限定的本公开内容的精神和范围中。

Claims (29)

1.一种俘获靶核酸的方法，所述方法包括：
将核酸俘获探针施加至基质的俘获区，其中具有第一分子量的核酸俘获探针至少包含与靶核酸序列的至少一部分互补的序列，且核酸俘获探针基本固定在基质的俘获区上；
将包含具有第二分子量的靶核酸的样品施加至基质的样品施加区；其中包含靶核酸的样品通过侧向流动流经从样品施加区至俘获区的一段基质，靶核酸在俘获区通过杂交被核酸俘获探针俘获；
其中所述核酸俘获探针是滚环扩增(RCA)产物。
2.权利要求1的方法，所述方法进一步包括使液体流经从样品施加区至俘获区的一段基质，其中所述靶核酸通过侧向流动迁移离开样品施加区进入俘获区。
3.权利要求1的方法，其中所述核酸俘获探针的第一分子量的范围为约20,000个碱基-约150,000个碱基。
4.权利要求1的方法，其中所述核酸俘获探针包含多个串联重复序列。
5.权利要求1的方法，其中所述核酸俘获探针包含20-150个核苷酸的串联重复序列。
6.权利要求1的方法，其中所述核酸俘获探针包含单链核酸。
7.权利要求1的方法，其中所述核酸俘获探针包含脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、核苷酸类似物或其组合。
8.权利要求1的方法，其中所述核酸俘获探针通过与基质缠结固定在基质上。
9.权利要求1的方法，其中所述样品施加区和俘获区相同。
10.权利要求1的方法，所述方法进一步包括使样品与裂解试剂接触。
11.权利要求10的方法，其中所述样品包含裂解试剂。
12.权利要求10的方法，其中将所述裂解试剂浸入样品施加区。
13.权利要求1的方法，其中样品施加区还包含迁移调节剂。
14.权利要求13的方法，其中所述迁移调节剂包含离液剂。
15.权利要求13的方法，其中所述迁移调节剂包含硫氰酸胍。
16.权利要求1的方法，其中所述样品还包含具有第三分子量的模板核酸，且液体是扩增模板核酸形成靶核酸扩增产物的核酸扩增反应混合物。
17.权利要求16的方法，其中一个或多个扩增反应在样品施加区或在靶核酸扩增产物迁移期间发生。
18.权利要求1的方法，所述方法进一步包括洗涤基质以除去存在于基质上的一种或多种抑制剂、非靶核酸、裂解试剂或其组合。
19.权利要求1的方法，其中将一级检测探针加入靶核酸、核酸俘获探针或其组合中。
20.权利要求1的方法，其中靶核酸、核酸俘获探针的一种或多种包含一级检测探针。
21.权利要求20的方法，其中所述一级检测探针包含生色团部分、荧光部分、磷光部分、亲和探针、磁性探针、顺磁性探针、金属探针或其组合。
22.权利要求20的方法，其中所述一级检测探针包含选自抗体、生物素、链霉抗生物素珠粒、金颗粒或其组合的结合部分。
23.权利要求20的方法，所述方法进一步包括：使包含二级检测探针的溶液沿所述一段基质流动以与一级检测探针、靶核酸、核酸俘获探针或其组合结合。
24.权利要求1的方法，其中所述基质是包含第一末端、样品施加区、第二末端和俘获区的长形条带。
25.权利要求24的方法，其中所述基质还包含毗邻第二末端的灯芯垫。
26.权利要求24的方法，其中所述基质还包含毗邻第二末端的停止垫。
27.权利要求1的方法，其中所述基质包含纤维素膜、硝酸纤维素膜、基于改良的多孔硝酸纤维素或纤维素的基质、聚乙二醇改良的硝酸纤维素、醋酸纤维素膜、硝酸纤维素混合酯膜、玻璃纤维、石英纤维、聚醚砜膜、尼龙膜、聚烯烃膜、聚酯膜、聚碳酸酯膜、聚丙烯膜、聚偏二氟乙烯膜、聚乙烯膜、聚苯乙烯膜、聚氨酯膜、聚苯醚膜、四氟乙烯-六氟丙烯共聚物膜或其组合。
28.一种俘获靶核酸的方法，所述方法包括：
将核酸俘获探针施加至基质的俘获区，其中具有第一分子量的核酸俘获探针至少包含与靶核酸序列的至少一部分互补的序列，且核酸俘获探针基本固定在基质的俘获区上；
将包含具有第二分子量的靶核酸的样品施加至基质的样品施加区；和
使液体流经从样品施加区至俘获区的一段基质，其中所述靶核酸通过侧向流动迁移离开样品施加区至俘获区，并通过杂交被核酸俘获探针俘获。
29.一种俘获靶核酸的方法，所述方法包括：
将核酸俘获探针施加至基质的俘获区，其中具有第一分子量的核酸俘获探针至少包含与靶核酸序列的至少一部分互补的序列，且核酸俘获探针基本固定在基质的俘获区上；
将包含具有第二分子量的靶核酸、具有第三分子量的模板核酸的一种或多种的样品施加至基质的样品施加区；
使核酸扩增反应混合物流经通过样品施加区至俘获区的一段基质，其中模板核酸经扩增形成靶核酸；
通过侧向流动从模板核酸分离靶核酸，
其中所述靶核酸迁移离开样品施加区至俘获区，且通过杂交被核酸俘获探针俘获而无需洗涤步骤。
CN201580067328.8A 2014-12-11 2015-12-02 用于俘获核酸的方法 Active CN107002147B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US14/566865 2014-12-11
US14/566,865 US10870845B2 (en) 2014-07-01 2014-12-11 Methods for capturing nucleic acids
PCT/US2015/063468 WO2016094148A2 (en) 2014-12-11 2015-12-02 Methods for capturing nucleic acids

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107002147A true CN107002147A (zh) 2017-08-01
CN107002147B CN107002147B (zh) 2022-01-28

Family

ID=56108345

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201580067328.8A Active CN107002147B (zh) 2014-12-11 2015-12-02 用于俘获核酸的方法

Country Status (3)

Country Link
EP (1) EP3230477B1 (zh)
CN (1) CN107002147B (zh)
WO (1) WO2016094148A2 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114480370A (zh) * 2021-12-30 2022-05-13 苏州白垩纪生物科技有限公司 核酸提取或纯化试剂和方法

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20210292746A1 (en) * 2018-08-06 2021-09-23 Northwestern University Enhanced capture of target nucleic acids
CN113755555A (zh) * 2021-09-03 2021-12-07 浙江工商大学 用于检测食物致敏原的捕获探针集、其制备方法及应用

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030032024A1 (en) * 1995-11-21 2003-02-13 Yale University Rolling circle replication reporter systems
CN101031798A (zh) * 2004-07-29 2007-09-05 瑞莱诊断体系有限公司 侧向流系统和测定
CN101473043A (zh) * 2006-04-10 2009-07-01 3M创新有限公司 使用横向流动方法的核酸检测
CN102084238A (zh) * 2008-05-05 2011-06-01 洛斯阿拉莫斯国家安全有限责任公司 基于高度简化的侧向流动的核酸样品制备和被动流体流动控制
US20140113839A1 (en) * 2012-10-18 2014-04-24 President And Fellows Of Harvard College Methods of Making Oligonucleotide Probes
WO2014076209A1 (en) * 2012-11-14 2014-05-22 Olink Ab Localised rca-based amplification method
CN103827317A (zh) * 2011-05-17 2014-05-28 德克斯特里蒂诊断公司 用于检测目标核酸的方法与组合物

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6077668A (en) * 1993-04-15 2000-06-20 University Of Rochester Highly sensitive multimeric nucleic acid probes
US20040110167A1 (en) * 1995-07-13 2004-06-10 Gerdes John C. Lateral flow system for nucleic acid detection
US20050227275A1 (en) * 2004-04-07 2005-10-13 Access Bio, Inc. Nucleic acid detection system
US8445293B2 (en) * 2005-02-09 2013-05-21 Rapid Pathogen Screening, Inc. Method to increase specificity and/or accuracy of lateral flow immunoassays
US20070015166A1 (en) * 2005-07-14 2007-01-18 Nilsen Thor W Lateral flow methods and devices for detection of nucleic acid binding proteins
WO2007092538A2 (en) * 2006-02-07 2007-08-16 President And Fellows Of Harvard College Methods for making nucleotide probes for sequencing and synthesis
ITBO20070627A1 (it) * 2007-09-14 2009-03-15 Twof Inc Metodo per la preparazione di dna microarray con sonde ad alta densita' lineare
US8815609B2 (en) * 2008-05-20 2014-08-26 Rapid Pathogen Screening, Inc. Multiplanar lateral flow assay with diverting zone
US20140039177A1 (en) * 2012-07-31 2014-02-06 General Electric Company Methods of isolating nucleic acids under reduced degradation condition

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030032024A1 (en) * 1995-11-21 2003-02-13 Yale University Rolling circle replication reporter systems
CN101031798A (zh) * 2004-07-29 2007-09-05 瑞莱诊断体系有限公司 侧向流系统和测定
CN101473043A (zh) * 2006-04-10 2009-07-01 3M创新有限公司 使用横向流动方法的核酸检测
CN102084238A (zh) * 2008-05-05 2011-06-01 洛斯阿拉莫斯国家安全有限责任公司 基于高度简化的侧向流动的核酸样品制备和被动流体流动控制
CN103827317A (zh) * 2011-05-17 2014-05-28 德克斯特里蒂诊断公司 用于检测目标核酸的方法与组合物
US20140113839A1 (en) * 2012-10-18 2014-04-24 President And Fellows Of Harvard College Methods of Making Oligonucleotide Probes
WO2014076209A1 (en) * 2012-11-14 2014-05-22 Olink Ab Localised rca-based amplification method

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
YI LONG等: "An isothermal and sensitive nucleic acids assay by target sequence recycled rolling circle amplification", 《BIOSENSORS AND BIOELECTRONICS》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114480370A (zh) * 2021-12-30 2022-05-13 苏州白垩纪生物科技有限公司 核酸提取或纯化试剂和方法
CN114480370B (zh) * 2021-12-30 2023-10-13 苏州白垩纪生物科技有限公司 核酸提取或纯化试剂和方法

Also Published As

Publication number Publication date
WO2016094148A3 (en) 2016-11-03
EP3230477A2 (en) 2017-10-18
EP3230477A4 (en) 2018-07-04
WO2016094148A2 (en) 2016-06-16
CN107002147B (zh) 2022-01-28
EP3230477B1 (en) 2024-01-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10870845B2 (en) Methods for capturing nucleic acids
EP3164510B1 (en) Method for separating nucleic acids
US11142758B2 (en) Method and device for collection and amplification of circulating nucleic acids
CN110191961B (zh) 制备经不对称标签化的测序文库的方法
US20160024572A1 (en) Massively Multiplexed RNA Sequencing
CN104838014A (zh) 用于标靶核酸富集的组合物、方法、系统和试剂盒
CN107406892B (zh) 捕获精子核酸的方法
CN107002147B (zh) 用于俘获核酸的方法
EP3164511B1 (en) Methods for amplifying nucleic acids on substrates
Bhattacharya et al. Experimental toolkit to study RNA level regulation
JP7651477B2 (ja) プライマーセット及びそれを用いて標的核酸を検出する方法
CN105247076B (zh) 使用拼装序列扩增片段化的目标核酸的方法
JP2022521209A (ja) 改良された核酸標的濃縮および関連方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20210824

Address after: England

Applicant after: Global life science solutions UK Ltd.

Address before: Buckinghamshire

Applicant before: GE HEALTHCARE UK Ltd.

Effective date of registration: 20210824

Address after: Buckinghamshire

Applicant after: GE HEALTHCARE UK Ltd.

Address before: New York State, USA

Applicant before: General Electric Co.

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant