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CN105026432A - 抑肽酶衍生的多肽-抗体缀合物 - Google Patents

抑肽酶衍生的多肽-抗体缀合物 Download PDF

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CN105026432A
CN105026432A CN201380070335.4A CN201380070335A CN105026432A CN 105026432 A CN105026432 A CN 105026432A CN 201380070335 A CN201380070335 A CN 201380070335A CN 105026432 A CN105026432 A CN 105026432A
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CN
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polypeptide
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seq
linker
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CN201380070335.4A
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萨斯米塔·塔里帕西
米歇尔·德默勒
让-克里斯托夫·柯里
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Original Assignee
Angiochem Inc
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Abstract

本发明涉及蛋白缀合物，其包含有利于穿过血脑屏障传送缀合物的抑肽酶衍生的多肽，和选择性地结合CNS内的靶的抗体部分。蛋白缀合物进一步通过接头的内含物；通过缀合至每一抗体部分的多肽的数目；通过抗体部分和多肽发生缀合的位置；以及通过缀合物的更大构型(其中每个多肽仅仅连接至抗体部分)来限定。改性的抑肽酶衍生的多肽、接头结合的抗体部分、药物组合物、试剂盒以及制备和使用所述蛋白缀合物的方法也是本发明的特征。

Description

抑肽酶衍生的多肽-抗体缀合物
相关申请的引用
本申请要求于2012年11月12日提交的美国临时专利申请号61/725,365的优先权日的权益。这个早期提交的临时申请的内容以其全部内容结合于本文中作为参考。
技术领域
本发明涉及其中一种或多种Kunitz型蛋白酶抑制剂(例如，抑肽酶酶)或其衍生物(例如，抑肽酶衍生的多肽)以本文中的方式缀合至抗体部分的蛋白缀合物；缀合物藉此合成用于药物用途或诊断用途(例如，用作成像试剂)的方法；包含它们的生理可接受组合物；以及将缀合物给药于患者用于，例如，癌症和神经功能障碍的诊断和治疗的方法。
背景技术
尽管血脑屏障(BBB)保护中枢神经系统(CNS)不受有害物质(例如，意外摄入毒素)侵害，但它也阻止治疗性蛋白接近大脑和脊髓，因此，在治疗CNS的病症中设置了主要障碍。一般来说，仅仅小于约500道尔顿的亲脂分子穿过BBB。许多在CNS疾病的动物研究中表现出有前景结果的药物都比此大得多，而蛋白治疗剂通常由于脑毛细血管内皮壁对那种尺寸和复杂性的药物的渗透性可以忽略不计而一般从中枢神经系统排除。
目前增强蛋白质治疗剂递送至中枢神经系统的策略能够分为三类。第一类包括创伤性方案，如药物的直接脑室内给药和暂时中断BBB的高渗性溶液内颈动脉灌注。第二类包括旨在通过BBB提高蛋白质脂溶性的药理学基的策略。在第三类中是递送方案，其中治疗剂连接于一种相对于BBB起到载体或受体-靶向的递送载体作用的蛋白。这种方法的优点在于，它是高度特异性的和高效的，导致不利影响最小，并且适用广泛。
发明内容
在第一方面中，本发明特征在于包含抗体部分和一种或多种Kunitz型蛋白酶抑制剂(例如，抑肽酶)或其衍生物(例如，抑肽酶衍生的多肽)的蛋白缀合物。抗体部分和将缀合物传送通过BBB的多肽二者都将在以下进行详细讨论。蛋白缀合物能够通过接头的内含物；通过缀合至每一抗体部分的多肽的数目；和/或通过抗体部分和多肽发生缀合的位置进一步定义。而且，在给定的缀合物中，在含有不只一个多肽的情况下，每个多肽仅仅连接至抗体部分。换句话说，没有多肽经由接头或另外方式连接至缀合物中的另一多肽。
在一个实施方式中，蛋白缀合物包含抗体部分和包含氨基酸序列Thr1-Phe2-Phe3-Tyr4-Gly5-Gly6-Cys7/Ser7-Arg8-Gly9-Lys10-Arg11-Asn12-Asn13-Phe14-Lys15-Thr16-Glu17-Glu18-Tyr19(SEQ ID NO:117)或生物活性类似物或SEQ ID NO:117的片段的多肽。正如由"Cys7/Ser7"所示，在位置7的氨基酸残基能够是半胱氨酸或丝氨酸。在包含这种多肽(SEQ IDNO:117)或任何其它本文中的多肽的蛋白缀合物中，抗体部分能够在多肽的一个或多个以下位置缀合至多肽：N-端氨基酸残基(例如，Thr1，其中多肽由SEQ ID NO:117组成)；C-端氨基酸残基(例如，Tyr19，其中多肽由SEQ ID NO:117)；或N-端和C-端之间的赖氨酸残基(例如，SEQ IDNO:117中的Lys10或Lys15)。
我们使用术语“蛋白质缀合物”是指由分子耦合部分形成的氨基酸基化合物。在本发明中，部件包括抗体部分和由其(例如，通过接头)耦合的一个或多个多肽。“氨基酸基的化合物”是指主要包括，但不一定完全是氨基酸残基的化合物(即，仅包含氨基酸残基(如在常规融合蛋白中的情况)的化合物或包含氨基酸残基和其它构件的化合物)。正如上面所提及，蛋白缀合物能够包含接头，其可以是化学化合物。这种缀合物将主要包括，但非唯一地是，氨基酸残基，因为抗体部分与多肽是由氨基酸构成而接头是化学化合物。蛋白缀合物还可以包括检测剂(例如，荧光体、放射性同位素、染料等)。可检测的试剂可以不包括氨基酸残基，以及在这种情况下，我们也可以是指一种含有这些检测剂作为氨基酸基化合物的蛋白缀合物。本发明还涵盖在诊断方法，包括诊断成像中使用可检测的缀合物的方法。
为了更加清楚起见，我们注意到，抗体部分与一个或多个多肽彼此区别(即，它们是彼此不相同的)。然而，任何蛋白质缀合物能够包括不只一个多肽，而两个、三个、四个或更多个多肽可以是相同的(即，可以具有相同的氨基酸序列)或可以彼此不同(即，缀合至抗体部分的多肽可以有不同的氨基酸序列)。关于本发明的组合物和方法，我们使用了术语“包含”意指“含有”。例如，在以上的实施方式中，蛋白缀合物包含抗体部分和依次含有由SEQ ID NO:117表示的氨基酸序列的多肽。在任何情况下，除非上下文另外特别指明，否则，本发明的组合物，其组成部分(例如，抗体部分和多肽)和本发明的方法能够包含所引述的要素或步骤或由其组成。例如，给定的多肽能够包含所引述的序列(例如，SEQ ID NO：117)或由所引述的序列组成。
正如以上所示，本发明的蛋白缀合物能够包括如本文的多肽或生物活性类似物或其片段。我们关于蛋白缀合物的多肽部分使用了术语“生物活性”是指所引用的多肽的类似物或片段在有用的生理设置中保留了足够活性。由于蛋白缀合物的多肽部分负责传送缀合物和/或多肽连接的抗体部分穿过BBB，则所引述的多肽的类似物或片段在其有能力传送缀合物和/或多肽连接的抗体部分穿过BBB时也是生物活性的。这个属性能够在体内或体外模型中进行测试，而所引述的多肽的生物活性类似物和片段可能在此转运中比引述的多肽更加有效或不太有效。具体而言，片段或类似物只要它保持足够高活性而实现所需结果(例如，只要其中包含的缀合物实现临床上有益的结果)时其功效可以比所引述的多肽功效低。
所引述多肽的“片段”是所引述多肽的连续或紧邻部分(例如，多肽十个氨基酸长的片段能够是那个多肽中任意2-9个近邻残基(contiguousresidues))。所引述多肽的“类似物”是具有类似于，但不相同于所引述多肽或其部分之序列的序列的任何多肽。因此，包含一个或多个氨基酸取代、插入或氨基酸残基的缺失(或其任何组合)的多肽就是所引述序列的类似物。适合包含于本发明蛋白缀合物中的多肽的片段和类似物进一步描述如下。
如所示，本发明的任何蛋白缀合物能够包括缀合物的抗体部分和一个或多个多肽之间的接头。缀合物能够通过本领域内已知为“点击化学(clickchemistry)”的方法进行组装。或许点击反应的最突出的实例是铜-催化的叠氮化物-炔环加成反应(CuAAC)，而该反应能够用于生成本发明的缀合物。这些反应在体内是有用的，因为叠氮化物或端炔官能团通常都存在于自然系统中。尽管基于CuAAC的点击化学具有引人入胜的特点，但铜可能阻碍活体细胞或整个生物内的生物正交缀合，而本发明的方法也能够采用无铜点击化学(即，本发明本缀合物能够采用无铜点击化学进行组装)。
在一些实施方式中，接头是包含与伯胺具有反应活性的基团的化学化合物。因此，接头能够是单氟化环辛炔(MFCO)、双环[6.1.0]壬炔(BCN)、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基硫代乙酸酯(SATA)、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基硫代丙酸酯(SATP)、马来酰亚胺或二苯并环辛炔(DBCO)。合适的接头和将其引入本发明的缀合物中的方法以下进一步进行描述。
在由SEQ ID NO:117表示的多肽中，在编号位置7处的残基能够是半胱氨酸残基或丝氨酸残基，而这种取代能够在本文中的任何多肽中进行。因此，有用的多肽能够包括氨基酸序列Thr1-Phe2-Phe3-Tyr4-Gly5-Gly6-Cys7-Arg8-Gly9-Lys10-Arg11-Asn12-Asn13-Phe14-Lys15-Thr16-Glu17-Glu18-Tyr19(SEQ ID NO:67)，氨基酸序列Thr1-Phe2-Phe3-Tyr4-Gly5-Gly6-Ser7-Arg8-Gly9-Lys10-Arg11-Asn12-Asn13-Phe14-Lys15-Thr16-Glu17-Glu18-Tyr19(SEQ ID NO:97)，或由SEQ ID NO:67或SEQID NO:97表示的多肽的生物活性片段或类似物。为了易于阅读，我们在每个可能情况下将不会重复短语或其生物活性片段或类似物。应该理解的是在所引述多肽是有用的情况下，生物活性片段或其类似物也是有用的。
在蛋白缀合物包括SEQ ID NO:117的类似物，该类似物能够含有至少13个相对于SEQ ID NO:117是无变化的氨基酸残基(例如，13-19个氨基酸残基，包括13和19个在内)。由于类似物可以包括其它氨基酸残基，则类似物可以比SEQ ID NO:117的19个氨基酸残基长。无论长度或是差异的精确本质，相似度能够表达为类似物的序列和所引述的多肽(本文中，SEQ ID NO:117)的序列之间的“同一性百分比”。按照这种方式表征的类似物进一步在以下进行描述。在多肽是SEQ ID NO:117的类似物的任何情况下，在编号位置10的赖氨酸残基和/或编号位置15的赖氨酸残基能够保持不变。即，类似物能够在位置10处和/或在位置15处包含赖氨酸残基。本领域的普通技术员将会意识到，给定残基的绝对位置可以在某些情况下进行变化。例如，如果类似物包含多于或少于SEQ ID NO:117的第9个氨基酸残基，则刚才提及的赖氨酸残基将会出现在等同于位置10和/15的位置。例如，在N-端包含一个其它氨基酸残基的类似物中，在所引述的序列的位置10和15处的赖氨酸残基将会出现在类似物的位置11和16处。
在SEQ ID NO:117的其它类似物中，Asn12能够用Gln取代，Asn13能够用Gln取代，和/或Phe14能够用Tyr或Trp取代。在SEQ ID NO:117的其它有用的类似物中，半胱氨酸残基加入到多肽的氨基和/或羧基端的末端。无论位置是SEQ ID NO:117的位置1上的苏氨酸残基，SEQ ID NO:117的位置19上的酪氨酸残基，或是从多肽的氨基-和/或羧基端末端缺失一个或多个残基产生的残基内部的残基，半胱氨酸残基都能够加在端位置上。换言之，N-和/或C-端半胱氨酸残基能够添加到全长多肽或其片段或类似物上。有用的类似物能够包括序列：Phe3-Tyr4-Gly5-Gly6-Cys7/Ser7-Arg8-Gly9-Lys10-Arg11-Asn12-Asn13-Phe14-Lys15-Thr16-Glu17-Glu18-Tyr19-Cys(SEQ ID NO:118)；Gly5-Gly6-Ser7-Arg8-Gly9-Lys10-Arg11-Asn12-Asn13-Phe14-Lys15-Thr16-Glu17-Glu18-Tyr19-Cys(SEQ ID NO:119)；Ser7-Arg8-Gly9-Lys10-Arg11-Asn12-Asn13-Phe14-Lys15-Thr16-Glu17-Glu18-Tyr19-Cys(SEQ IDNO:120)；Gly9-Lys10-Arg11-Asn12-Asn13-Phe14-Lys15-Thr16-Glu17-Glu18-Tyr19-Cys(SEQ ID NO:121)；或Lys10-Arg11-Asn12-Asn13-Phe14-Lys15-Tyr19-Cys(SEQ ID NO:122)。我们已经对我们已有的氨基酸残基进行了编号而使之在类似物如何涉及SEQ ID NO:117时更加显而易见。例如，Phe3是SEQ IDNO:117的第三氨基酸残基，但是，显而易见是，由SEQ ID NO:118表示的SEQ ID NO:117的类似物中的第一氨基酸残基。
在蛋白缀合物包含SEQ ID NO:117的片段的情况下，片段能够包含SEQ ID NO:117的至少6个(例如，6～18，包括6和18个在内)近邻氨基酸残基。例如，片段能够包括或包含序列Lys10-Arg11-Asn12-Asn13-Phe14-Lys15(SEQ ID NO:123)。
在任何实施方式中，多肽能够包括以D-形式、L-形式，或这两种形式的氨基酸残基。例如，一个或多个(并高达全部的残基)能够是以L-形式或D-形式。
关于蛋白缀合物的构型，缀合物能够包括一个抗体部分和，与其连接的，不同数目的多肽。多肽的数目将由抗体部分上合适的连接点的数目决定。由于本文中的接头能够与伯胺基团反应，则接头可以在抗体部分中的一个或多个赖氨酸残基处将多肽连接至抗体部分。另外，接头也可以与抗体部分上的巯基基团或糖类基团反应(而因此与之连接)。接头可以定位于少至1-10个赖氨酸残基(即，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个多肽能够缀合于抗体部分的明显不同的赖氨酸残基处。在具体的实施方式中，约15(例如，14-16)、约30、约40、约50、约60、约70、约80或约90个赖氨酸残基可以占据。缀合物中的多肽数目也能够表示为抗体部分中可用于缀合的残基数目的百分数。更具体而言，约10％至高达100％的赖氨酸残基能够缀合至多肽。
在任何实施方式中，抗体部分能够是IgG的类别。在任何实施方式中，抗体部分能够是四聚体抗体，单链抗体(scFv)，四聚体抗体的片段(例如，Fab片段、F(ab’)2片段)或任何这些抗体部分的生物活性变体。我们关于蛋白缀合物的抗体部分使用了术语“生物活性的”是指抗体的变体保持了有用的生理设置中的足够活性。由于蛋白缀合物的抗体部分选择性地结合生物靶，所引述的抗体部分的变体，当其有能力选择性地结合靶至有用程度时，则是生物活性。抗体部分的生物活性变体对生物靶(例如，细胞受体)可以具有与所引述的抗体部分不同的亲和性。亲和力只要其维持足够高而实现所需的结果(例如，只要包括它的缀合物获得临床受益的结果)，则可以比所引述的抗体部分的更低。
抗体部分能够是人的、嵌合的或人源化的抗体部分或其生物活性变体。为了易于阅读起见，我们将不会在每个场合下都重复短语“或其生物活性变体”。应该理解的是，抗体部分适用于本发明的上下文中，其生物活性变体也是有用的。抗体部分能够是单克隆抗体或多克隆抗体，由单克隆或多克隆抗体构建的单链抗体、或单克隆或多克隆抗体的片段(例如，Fab或F(ab’)2片段)。
关于靶，抗体部分(例如，四聚体抗体、其生物活性变体、scFv、Fab片段或F(ab’)2片段，或其生物活性变体，无论类别(即，无论是IgG类别或其它类别)和是否是人的、人源化的、嵌合的、单克隆的或具有本文中的任何其它属性或特性)能够特异性地结合生长因子受体或细胞因子受体(例如，白细胞介素受体)。生长因子受体能够是通过表皮生长因子(EGF)家族的成员结合的受体。对于EGF家族中的蛋白的受体实例包括EGF受体(EGFR)、肝素结合的类EGF生长因子受体(HB-EGFR)、双调蛋白受体(AR)、表皮调节素受体(EPR)、epigen受体、β细胞素受体、和神经调节蛋白的受体(例如，神经调节蛋白-1、神经调节蛋白-2、神经调节蛋白-3、或神经调节蛋白-4的受体)。尽管本发明并未如此限制，但当EGFR被靶向时，抗体部分能够是曲妥珠单抗，西妥昔单抗，或帕尼单抗，含有曲妥珠单抗、西妥昔单抗或帕尼单抗的重链和轻链的可变域的scFv，或这些四聚或单链抗体的生物活性变体。例如，曲妥珠单抗、西妥昔单抗、或帕尼单抗的Fab或F(ab’)2片段。我们已经对具有与曲妥珠单抗具有约99％同源性的序列的抗体进行了研究。在其它实施方式中，生长因子受体能够是由血管内皮生长因子(VEGF)家族的成员结合的受体。VEGF家族中的蛋白的受体靶实例包括VEGF受体(VEGFR；例如，VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C或VEGF-D的受体)或胎盘生长因子(PGFR)的受体。尽管本发明并未如此限制，但是当VEGFR被靶向时，抗体部分能够是贝伐单抗或雷珠单抗(ranibizumab)，含有贝伐单抗或雷珠单抗的重链和轻链的可变域的scFV，或这些四聚或单链抗体的生物活性变体。例如，抗体部分能够是贝伐单抗或雷珠单抗的Fab或F(ab’)2片段。正如所示，本发明的蛋白缀合物中抗体部分的其它合适靶是细胞因子受体，包括肿瘤坏死因子(TNF)家族成员的那些。这些受体包括由TNF结合的那些(也已知为TNF-α或恶液质素)、淋巴毒素-α(LT-a)、T细胞抗原gp39(CD40L)、FASL、4-1BBL、OX40L和TNF-相关的诱导细胞凋亡配体(TRAIL)。尽管本发明并未如此限制，但是当TNF受体被靶向时，抗体部分能够是阿达木单抗，赛妥珠单抗，戈利木单抗，或英夫利昔单抗，阿达木单抗，含有阿达木单抗、赛妥珠单抗、戈利木单抗或英夫利昔单抗重链和轻链的可变域的scFv，或这些四聚或单链抗体的生物活性变体。例如，抗体部分能够是阿达木单抗、赛妥珠单抗、戈利木单抗或英夫利昔单抗的Fab或F(ab’)2片段。在靶向的受体是白细胞介素受体的情况下，抗体部分能够特异性地结合白细胞介素-2(IL-2)或白细胞介素-6(IL-6)受体。尽管本发明并未如此限制，但是当抗体部分靶向IL-2的受体时，抗体部分能够是巴利昔单抗或达珠单抗，含有巴利昔单抗或达珠单抗重链和轻链的可变域的scFV，或四聚的或单链抗体的生物活性变体。例如，抗体部分能够是巴利昔单抗或达珠单抗的Fab或F(ab’)2片段。类似地，当抗体部分靶向IL-6的受体时，抗体部分能够是妥珠单抗，含有妥珠单抗重链和轻链的可变域的scFV，或这种四聚的或单链抗体的生物活性变体(例如，妥珠单抗的Fab或F(ab’)2片段)。关于功能，抗体部分能够是化疗剂或抗炎剂。
在第二方面中，本发明特征在于包含本文中的蛋白缀合物和药用载体的药物组合物。相关的组合物，其也在本发明的范围之内，包括这些药物组合物的前体，如浓缩原液，冻干制剂，以冷冻形式保存的组合物(例如，采用冷冻保护剂)，或其它在给药于患者之前需要某些操作(例如，稀释、再悬浮、纯化和/或灭菌)的组合物。这些组合物和它们可以包含的药用载体以下将进一步描述。组合物可以以各种方式进行配制，包括口服和非肠道(例如，静脉或经粘膜)给药。
在第三方面中，本发明特征在于治疗患有中枢神经系统的癌症或涉及CNS的神经功能障碍(例如，与发炎相关的障碍症)的患者的方法。该方法能够包括向患者给予治疗有效量的含本文中所述蛋白缀合物的药物组合物的步骤。在任何所述方法中，在给予药物组合物之前也能够实施识别需要这种治疗的患者的步骤。例如，通过实施一种或多种诊断测试，如诊断成像，能够识别出患有CNS癌症的患者。类似地，能够实施适合诊断神经功能障碍的体检。尽管本发明并未如此限制，我们显然能够设想对人患者的这种治疗。兽医用途(例如，治疗非人哺乳动物，如家养宠物)当然是可能的，但是至少在不久的将来成本可能会保持太高。尽管我们倾向于使用术语“患者”，但是无论是人或是兽医用途的背景下，我们也会无意义差别地称之为“个体”或“受试者”。我们使用术语“功能障碍症”广义地是指影响患者的任何诊断上的不良病症。例如，尽管某些健康状况专门称之为疾病(例如，帕金森病和阿尔兹海默症)，但这些健康状况临床上是令人不快的而是本文所使用的术语“障碍症”。因此，具有CNS参与的神经功能障碍症能够是任何这种通常称之为障碍症，疾病，病症，综合症等的健康状况。药物组合物的“治疗有效量”是足以带来正的临床效果的用量，无论效果根除障碍症与否。因此，“治疗”患者通过改善所关注的障碍症的体征或症状或抑制或减缓障碍症发展至更严重的状态而完成。给药的蛋白缀合物的量可以是“等当剂量”，在这种情况下在蛋白缀合物中给药的抗体部分的用量是与给药而有效治疗不受BBB保护的组织的抗体部分的用量相同或大致相同(例如，±10-20％)。在障碍症是影响CNS的癌症的情况下，癌症可以是CNS内生的癌症或转移至CNS的癌症。
在第四方面中，本发明特征在于制作本文中的蛋白缀合物的方法。所述方法通过将抗体部分经由接头缀合至多肽而实施。在一个实施方式中，所述方法将抗体部分缀合至含有氨基酸序列Thr1-Phe2-Phe3-Tyr4-Gly5-Gly6-Cys7/Ser7-Arg8-Gly9-Lys10-Arg11-Asn12-Asn13-Phe14-Lys15-Thr16-Glu17-Glu18-Tyr19(SEQ ID NO:117)的多肽，或生物活性类似物或其片段。在其它实施方式中，任何本文中所描述的其它多肽都能够引入。所述方法能够包括以下步骤：(a)提供接头结合的抗体部分；(b)提供改性(修饰，modified)形式的多肽；和(c)将接头结合的抗体部分在产生包含抗体部分，接头和多肽的蛋白缀合物的条件下暴露于改性形式的多肽。多肽当其包含与接头具有反应活性的化学实体(例如，伯胺(例如，N3))时则是改性形式的。接头结合的抗体部分能够通过实施以下步骤而形成：(a)提供抗体部分；和(b)将抗体部分在产生接头结合的抗体部分的条件下暴露于接头。改性的多肽能够通过实施以下步骤而形成：(a)提供多肽；和(b)将多肽在产生改性的多肽的条件下暴露于与接头具有反应活性的化学实体。
在另一缀合方案中，接头首先连接到多肽，而改性的中间体(接头结合的多肽)随后缀合至抗体部分。在缀合通过叠氮-炔环加成反应介导的情况下，给定的接头中的炔与缀合配对物上的叠氮反应。例如，在结合至接头的多肽包含炔的情况下，抗体部分能够经过改性而包含叠氮(接头结合的多肽和含叠氮的抗体就是缀合配对物)。烷基和叠氮反应而产生稳定的三唑。例如，通过结合至含烷基的二苯并环辛基(DBCO接头)改性的多肽可以与含叠氮的抗体部分反应而产生稳定的三唑，这也可以称为无Cu(I)反应或促张力点击反应(strain-promoted click reaction)。参见文献Baskin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 104(43)：16793-16797，2007；Ning et al.Anweg.Chem.Int.Ed.，47:2253-5；和Jewett et al，J.Am.Chem.Soc,132(ll):3688-3690，2010。
如果本领域的普通技术人员期望关于缀合方法和机理的其它信息，他能够查阅Jewett和Bertozzi(“Cu-free click cycloaddition reactions inchemical biology,”Chemical Society Reviews 39：1272-1279，2010)，WO2012/134925，以及美国专利申请出版物号2005-0222427和2009-004753，这些文献以其全部内容结合于本文中作为参考。
在涉及到接头的方法中，接头能够包括环辛炔或环张力的环辛炔。多肽上能够与接头反应的化学实体能够包括叠氮基。为了实现缀合，改性的多肽上的叠氮基与接头上的辛炔反应，正如图1中所示。在图1中，举例说明的接头是MFCO-N-羟基琥珀酰亚胺酯。更一般而言，所采用的接头能够是单氟环辛炔(MFCO)、双环[6.1.0]壬炔(BCN)、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基硫代乙酸酯(SATA)、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基硫代丙酸酯(SATP)、马来酰亚胺或二苯并环辛炔(DBCO)。尽管制作蛋白缀合物的条件以下将更全面地进行介绍，但是我们在本文中还要指出，接头结合的抗体部分能够在室温下限光环境中暴露于改性的多肽长约8-24小时。缀合能够通过，例如，液相色谱-质谱(LC-MS)监测改性多肽的消耗而进行监控。在缀合之后，蛋白缀合物能够通过，例如，柱色谱进行纯化。例如，人们能够将缀合物传送通过蛋白A柱并用约pH 3.0的柠檬酸缓冲液将其洗脱。
接头结合的抗体部分和改性的多肽，该改性的多肽也可以是接头结合的，正如本文中，也是本发明的组合物并可以包含于本发明的试剂盒中。因此，在第五方面，本发明特征在于试剂盒。在一个实施方式中，试剂盒包含与使用说明书一起包装的药物组合物或其前体，以及可选的任何适用于给药准备中操作组合物和/或给药组合物的器件。例如，本发明的试剂盒能够包括以下的一种或多种：稀释剂、手套、小药瓶或其它容器、吸管、针头、注射器、导管、立架、刮铲、无菌布或盖布(drape)、阳性和/或阴性对照物等。在另一实施方式中，本发明的试剂盒包含适用于制作蛋白缀合物的组合物和试剂。例如，试剂盒能够包括以下的一种或多种：抗体部分、接头、接头结合的抗体部分、多肽、与接头具有反应活性的化学实体、和/或改性的多肽。例如，在一个实施方式中，试剂盒能够包括抗体部分、接头、与接头具有反应活性的化学实体、和多肽。在其它实施方式中，试剂盒能够包括接头结合的抗体部分和改性的多肽。与适用于给药组合物的试剂盒一样，适用于制备组合物的试剂盒能够包括任何以下的一种或多种：稀释剂、手套、小药瓶或其它容器、吸管、针头、注射器、导管、立架、刮铲、无菌布或盖布、阳性和/或阴性对照物等。也能够包含任何适用于将接头连接至抗体部分，改性多肽，将接头结合的抗体部分缀合至改性的多肽，或纯化和测试蛋白缀合物的试剂。正如所提及的那样，接头结合的抗体部分和改性的多肽都是本发明的组合物的特征。
在第六方面，本发明特征在于生物组织，如中枢神经系统内的组织的成像方法。所述方法通过提供本文中的经过设计而包含可检测成像试剂的缀合物而进行实施。这种试剂能够有所不同，并能够选自任何目前可利用的标签和在成像中使用的标记。例如，成像剂可以是，或可以包括，荧光染料或放射性同位素。成像剂引入到本发明的缀合物中(例如，通过常规的化学反应)，然后将其给药于受试者。例如，包含可检测标记或标签的缀合物能够静脉内施用，并且受试者然后能够采用经过配置而检测已引入到缀合物中的具体的成像剂的仪器进行检测。
除了BBB渗透性外，本发明的蛋白缀合物可以具有一种或多种以下优点：在剂量浓度下很少或没有沉淀；冻融稳定性；和溶解性(如果在溶液中发生任何聚结也会产生极少)。抗体部分还能够保留对其靶的高亲合力(相对于未缀合形式中的亲合力)。例如，抗体部分能够具有的对其靶的亲合力是未缀合时该部分亲合力的约3倍。在对蛋白缀合物H43的研究中，我们观察到2.2nM的亲合力，其中未缀合的抗体部分的亲合力为1.3nM。本发明组合物和方法的其它特征和优点将在以下的描述、，附图和权利要求中举例说明。
附图说明
图1a和图1b是图示说明使用无铜“点击化学”技术将抗体部分附连于多肽的方法发示意图。分图a)描述了通用反应图解式而分图b)描述了更具体的缀合方法。
图2是列出本文中所描述的和引述的多肽序列的表格。
图3是总结关于本发明的蛋白缀合物可以检测和表征的某些参数(例如，BBB渗透性和结合亲合力)，能够实施用于测试这些参数的实验，以及采用示例性蛋白缀合物(H43，包含Angiopep-2多肽和曲妥珠单抗)获得的结果的图表。
图4是显示采用标识为H1、H2和H3的蛋白缀合物的灌注研究的结果的柱状图。在大脑、毛细血管和实质中对于每一缀合物和对于曲妥珠单抗(抗-HER2)都显示了Vd(mL/100g/2min)。
图5是一对显示采用标示为H40和H41(左侧曲线)以及H42、H43和H44(右侧曲线)的蛋白缀合物相对于未缀合的曲妥珠单抗(αHer-2)的结合研究的结果的线型曲线图。
图6是显示采用标示为H40、H41、H42、H43和H44的蛋白缀合物灌注研究结果的柱状图。在大脑、毛细血管和实质中对于每一缀合物和对于曲妥珠单抗(抗-HER2)都显示了Vd(mL/100g/2min)。
图7是显示静脉注射后不同时间下小鼠脑组织中曲妥珠单抗和本发明包含曲妥珠单抗和An2的蛋白缀合物的含量(脑血比(％))的柱状图。
图8是显示小鼠注射BT-474肿瘤细胞并随后用载体/对照溶液、用曲妥珠单抗或用本发明的蛋白缀合物(H43)治疗的体内研究结果的柱状图。
图9是显示组织分布的体内研究结果的一系列柱状图。未缀合的抗-HER2抗体和缀合的构建体H43的分布表示为％[脑]/[血浆](左侧图)和％注射剂量/g组织(中间图)。血浆水平显示于右侧曲线图中。在每一曲线图中，采用未缀合的抗HER2抗体获得的数据由每一对的较深色的最左边的条柱表示，而采用H43获得的数据由较浅色的最右边的条柱表示。
图10是人抑肽酶和AngioPep-2的比对。
图11是，包括适用于本发明缀合物和包含于本发明试剂盒中的示例性接头的四个一系列表格。第一表格列出了胺-胺接头，包括NHS酯、亚酰胺酯等；第二表格列出了巯基-巯基接头，如马来酰亚胺和吡啶二硫醇；第三表格列出了胺-巯基接头，其包括NHS酯/马来酰亚胺化合物。这些化合物的实例提供于以下表格中。
具体实施方式
大多数潜在适用于治疗CNS的药物并不穿过BBB，并且令人惊讶的是人们对于这个长期存在的问题关注而付诸的努力却如此之少。据估计，全球范围内99％以上的CNS药物开发都是致力于药物本身的发现，针对改善药物递送的努力却不到1％。对于许多严重的成本高昂而衰弱的CNS障碍症，包括帕金森氏病、阿尔茨海默氏病和脑癌症，却没有可靠而有效的治疗。因此，对于不仅是发现有效的药物，而且对于成功递送这些药物至脑和脊髓都存在大量而未满足的需要。
治疗性抗体是其中对于许多类型的障碍症，包括影响CNS的障碍症，最有前景的新治疗方法。由于它们的尺寸，治疗性抗体也是其中最难递送至CNS的药物。在本发明的上下文中，抗体部分当缀合至如本文中的多肽(例如，抑肽酶衍生的多肽)时，穿过血脑屏障的程度要比单独穿过血脑屏障的相同抗体部分(即，未缀合之时)更大。传输上的差异也能够在BBB的体外模型中进行观察。因此，本发明缀合物的多肽适用于将抗体部分传送穿过个体的血脑屏障，而对CNS所产生的，改善的进入允许抗体部分用于以以前不可能的方式治疗和诊断癌症和神经功能障碍症。
本发明部分基于本发明人对于药物递送的生理基策略的工作，其中治疗药物(在本发明中是抗体部分)以特定方式缀合于用作相对于BBB的载体或受体靶递送载体的多肽(例如，抑肽酶衍生的多肽)。
在BBB存在的传送体和受体在维持BBB和动态平衡的完整性方面是很重要的。受体的一个家族，低密度脂蛋白受体-相关的蛋白(LRP)，包括LRPl和LRP2(也称为巨蛋白)，会介导穿过BBB内皮细胞的配体的转运(Shibata等人，2000；Ito等人，2006；Bell等人，2007)。更具体而言，LRP2充当了上皮细胞的质膜处的多配体结合受体的作用并介导了配体导致胞转的内吞作用。例如，LRPl和LRP2都调节分泌型淀粉样前体蛋白(APP)的内吞作用(Kounnas等人，1995；Cam和Bu，Mol.Neurodegen.1:8，2006)。有意思的是，APP缺乏库尼兹(Kunitz)蛋白酶抑制剂(KPI)域而对于LRP是较差的底物/配体。这间接表明，这个域对于LRP对APP的识别，内化和清除是很重要的(Kounnas等人，1995)。
抑肽酶是库尼兹型蛋白酶抑制剂(即，它包含了KPI域)，则它是LRP1和LRP2的配体。它是来自牛肺组织的生物活性单体多肽，并且它用于降低复杂外科手术期间的出血。抑肽酶由58个氨基酸残基构成，具有10个带正电的赖氨酸和精氨酸残基，而只有四个负电荷的天冬氨酸和谷氨酸残基。抑肽酶由于包含三个连接蛋白质内的6个半胱氨酸残基的二硫键而很稳定。它还包含扭曲的β发夹(hairpin)和C-端α-螺旋。体外研究已经证明，抑肽酶能够穿过模拟哺乳动物BBB的细胞层，而由此起到按需要传送药物穿过个体的BBB的载体作用。
因此，本发明缀合物中有用的多肽能够具有抑肽酶多肽或其它KPI域多肽的一种或多种特性。也就是说，本发明缀合物中引入的多肽能够包括或包含约58个表现出与抑肽酶序列一定程度的同源性或同一性(例如，70％～100％的同源性或同一性)的氨基酸残基(例如，56～60个氨基酸残基，包括56和60个在内)；能够包括约十个赖氨酸和/或精氨酸残基；能够包含不超过约四个带负电荷的残基(例如，不超过约4个天门冬氨酸或谷氨酸残基)；能够包括约三个(例如，2～4个，包括2和4个在内)分子内(例如，二硫键)键；和/或能够包括扭曲的β发夹和/或C-端螺旋。本发明人已确定出不同于抑肽酶多肽但保留一定程度的相似性的多肽家族。这些抑肽酶衍生的多肽在本文中描述于新构造设计的蛋白缀合物的上下文中，其中它们能够是一部分。因此，本发明的缀合物能够包括本文中所描述的抑肽酶序列(例如，具有由SEQ ID NO:98或SEQ ID NO:126构成的序列的多肽)(另请参见Siekmann等人，Biol.Chem.369(3):157-163，1988)。尽管转胞吞作用的确切分子机理尚不清楚，但是本发明并不限于通过任何具体分子机理发挥作用的蛋白缀合物，本文中的多肽，包括抑肽酶和抑肽酶衍生的多肽，都认为会与LRP家族中的受体产生相互作用。
多肽：适用于本发明缀合物上下文中的多肽包括具有库尼兹型结构域的那些，这在本领域内应该理解为抑制蛋白降解酶。本发明缀合物中引入的多肽可以或不可以保留那种功能。由于结构域通常是长度约50～60个氨基酸残基并且通常具有约6kDa的分子量，则本发明缀合物的多肽部分能够具有这些相同的特性。更具体而言，多肽能够是抑肽酶，阿尔茨海默氏淀粉样前体蛋白(APP)，或组织因子途径抑制剂(TFPI)。由于这些蛋白质可以是免疫原性的，则本发明涵盖陪护缀合的抗体部分穿过血脑屏障的这些蛋白的较少免疫原性的片段。APP或其生物活性片段尽管缺乏KPI域但仍能够用于本发明缀合物中。
在一个实施方式中，引入到本发明的蛋白缀合物中的多肽有：抑肽酶(例如，SEQ ID NO:98)；抑肽酶生物活性片段或类似物(这个片段可以包括库尼兹域的一种或多种功能特性，正如以上的讨论)。在一个实施方式中，多肽由SEQ ID NO:117表示或是SEQ ID NO:117的生物活性片段或类似物(例如，图2的表中所示的片段或类似物)。
多肽内的氨基酸残基能够是标准的α-氨基酸形式并能够是D-形式、L-形式或这些两种对映体形式的混合物。正如本领域中所已知的，所有α-氨基酸除甘氨酸外都能够以两种对映体形式任意之一存在，并任一或这两种形式能够引入本发明的多肽以及蛋白缀合物的抗体部分中。正如本领域内还已知的是，将氨基酸残基称之为具有D-或L-形式的惯例并非是指氨基酸残基自身是光学活性的，而是指氨基酸理论上能够由其合成的甘油醛的异构体的光学活性(D-甘油醛是右旋的而L-甘油醛是左旋的)。D-形式氨基酸残基取代L-形式氨基酸残基可以产生更稳定的多肽。例如，采用D-赖氨酸代替位置10和/或位置15(或抑肽酶衍生的多肽类似物中相当的位置)处的L-赖氨酸会提高抑肽酶衍生的多肽的稳定性。类似地，在这种多肽的N-端和C-端采用D-形式氨基酸应该会提高体内稳定性，因为肽酶不能利用D-氨基酸作为底物(Powell等人，Pharm.Res.10:1268-1273，1993)。多肽还能够构造设计为反向-D多肽，其包含按照相对于含L-氨基酸的多肽相反的序列排布的D-形式氨基酸残基；L-氨基酸多肽的C-端残基变成了D-氨基酸多肽的N-端，反之亦然。反向D-多肽保留相同的三级构象，而因此具有相应的L-氨基酸多肽相同的活性，但其稳定性增加可能会产生更大的疗效(Brady和Dodson，Nature 368:692-693，1994以及Jameson等人，Nature 368:744-746，1994)。多肽也可以通过，例如，形成二硫桥键的半胱氨酸残基的加成而“受约束”(参见Rizo等人，Ann.Rev.Biochem.61:387-418，1992)在任何实施方式中，多肽能够是环状多肽(例如，通过包含形成二硫键的端半胱氨酸残基而环化)。
关于其制备，适用于蛋白缀合物的多肽能够通过本领域中已知的任何方法，包括通过合成方法和常规用于从核酸生产蛋白质的重组技术进行生产。所得的多肽可以以未精制的或在分离的或基本上纯化的形式储存，直到进一步使用。例如，多肽能够储存直至使用于下文产生本发明蛋白缀合物的方法中。化学合成能够，例如，通过固相合成和重组技术，包括在生物细胞(例如，原核或真核细胞)中从载体构建体进行表达而实现。编码特异性的氨基酸残基的密码子在本领域中是公知的(参见，例如，LubertStryer的“生物化学(Biochemistry)”第三版，1988年，斯坦福大学，WH弗里曼和公司，纽约)，这就是密码子优化的方法。示例性核苷酸序列编码的抑肽酶类似物举例说明于SEQ ID NO:106中，并可以以登记号No.X04666查找基因库。这个序列编码在位置16处具有赖氨酸的抑肽酶类似物(参照由SEQ ID NO:106编码的氨基酸序列)而不是在SEQ ID NO:98中发现的缬氨酸。SEQ ID NO:106的核苷酸序列中的突变通过本领域公知的方法引入，以产生SEQ ID NO:98在位置16处具有缬氨酸的肽。
本文中包含于蛋白缀合物中的多肽可以通过化学修饰无论是在多肽表达的细胞内或是体外进行翻译后修饰。例如，正如本文中的多肽能够进行聚乙二醇化、乙酰化、酰基化、酰胺化、氧化、环化和/或磺化。
正如对长度的描述，缀合物中的多肽可以具有本文中专门列出的序列(例如，由SEQ ID NO:67或97所表示的序列或任何其它在图2的表格中所示的抑肽酶衍生的多肽)或它们可以是任何这些所指的序列的生物活性片段或类似物。片段凭借具有极少的近邻氨基酸残基(N-或C-端的一个或多个氨基酸缺失)而不同于参照序列，而类似物凭借包括至少一个其它氨基酸残基或至少1个氨基酸替换而不同于参照序列。其它一个或多个氨基酸残基能够加入到N-端、C-端、参照多肽(例如，SEQ ID NO:117)的N-和C-末端之间的位置，或这些位置的任意组合。类似物可以比参照序列短(即，它可以包括一个或多个氨基酸残基缺失)，然而，我们使用术语“类似物”是指除了仅仅N-和/或C-端氨基酸残基或多个残基简单缺失之外以某些方式不同于参照序列的变体。在类似物包括氨基酸残基的替换之外，替换可以视为保守或非保守的。保守的替换是以下组之内的那些：Ser、Thr和Cys；Leu、Ile和Val；Glu和Asp；Lys和Arg；Phe、Tyr和Trp；和Gln、Asn、Glu、Asp和His。例如，用苏氨酸或半胱氨酸替换丝氨酸残基会认为是保守的氨基酸替换；异亮氨酸或缬氨酸替换亮氨酸会认为是保守的氨基酸替换；等等。保守替换也可以通过BLAST(基本局部比对搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool))算法，BLOSUM替换矩阵(例如，BLOSUM 62矩阵)，或PAM替换矩阵：p矩阵(例如，PAM 250矩阵)进行定义。
在参照序列具有19个氨基酸残基的情况下，其生物活性片段可以具有6-18个近邻残基(包括6和18个在内)。在参照序列具有19个氨基酸残基的情况下，其生物活性类似物可以具有1-13个氨基酸替换；一个或多个氨基酸插入(例如，在N-和/或C-端插入残基而将参照多肽的长度增加至高达约50个氨基酸残基)；或这种替换和插入的组合。正如所示，在类似物(而不是片段)的情况下，其中存在至少一个替换和/或至少一个插入时，也可以存在至少一个缺失。
生物活性片段或抑肽酶衍生的多肽和参照多肽的类似物之间的相似度也可以表示为在相当位置是相同的残基的百分数。生物活性片段或抑肽酶衍生的多肽的类似物可以与参照多肽(例如，本文中抑肽酶衍生的多肽指定的序列标识符)具有至少35％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或98％的同一性。
正如引入的氨基酸残基的对映体形式能够改变多肽的稳定性，人们能够修改多肽(例如，抑肽酶衍生的多肽)的长度和内容而优化特性如电荷或极性、亲水性或疏水性、生物利用度以及缀合性质。例如，人们能够通过缺失一个或多个不是碱性的/带正电的或带很少正电荷(例如，通过pKa确定)的氨基酸(例如，1至约3个氨基酸残基)促进正电荷。可替代地，或另外，正电荷能够通过插入一个或多个是碱性的/带正电的或比它们替换的残基带更多正电荷(例如，通过pKa确定)的氨基酸(例如，1至约3个氨基酸残基)促进正电荷。一个在本领域的普通技术人员将认识到，天然存在的残基已经认识到并共享性，这主要是归因于其侧链的性质。以下信息能够是用于根据需要修改的抑肽酶衍生的多肽性质。本领域的普通技术人员将认识到，天然残基已经识别并共享性质，这主要归因于其侧链的性质。以下信息能够按需用于修饰抑肽酶衍生的多肽的性质。为了提高疏水性，能够引入正亮氨酸，甲硫氨酸(Met)、丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、组氨酸(His)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)；为了增加中性或亲水性，能够引入半胱氨酸(Cys)、丝氨酸(Ser)和苏氨酸(Thr)；为了增加酸性或负电荷，能够引入天冬氨酸(Asp)或谷氨酸(Glu)；为了促进碱性，能够引入天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Glu)、组氨酸(His)、赖氨酸(Lys)和精氨酸(Arg)。影响链取向的残基包括甘氨酸(Gly)和脯氨酸(Pro)。具有芳族侧链的残基包括色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)和组氨酸(His)。
在本文提供的参照序列中，氨基酸残基是天然的。然而，这些序列的生物活性类似物能够包括一个或多个非天然的残基。例如，它们可以在任何位置包括硒基半胱氨酸(例如，硒基-L-半胱氨酸)，包括在位置7替换半胱氨酸。许多其它的“非天然”氨基酸替换在本领域中是已知的并可获自商业来源如西格玛奥德里奇(Sigma Aldrich)化学公司。非天然氨基酸的实例包括在大多数情况下的D-氨基酸，具有连接至半胱氨酸的硫原子，聚乙二醇化氨基酸和结构简式其中n为2-6的NH2(CH2)nCOOH的ω-氨基酸的乙酰基氨基甲基基团的氨基酸残基，中性、非极性氨基酸，如肌氨酸，叔丁基丙氨酸，叔丁基甘氨酸，N-甲基异亮氨酸和正亮氨酸。苯基甘氨酸可以替换Trp、Tyr或Phe；瓜氨酸和蛋氨酸亚砜是中性非极性的、磺基丙氨酸是酸性的、而鸟氨酸是碱性的。脯氨酸可以用羟基脯氨酸替换并保留赋予脯氨酸性质的构象。本发明的蛋白缀合物涵盖包括这种残基的多肽和抗体部分。应该理解的是，在我们所指修饰或功能特征如包含各种对映体、翻译后修饰、或包含“非天然”残基的情况下，修饰或功能特征可以作为抑肽酶衍生的多肽存在于本文中所述的缀合物的部分中，作为抗体部分存在于缀合物的部分中，或存在于缀合物的任何其它含氨基酸的部分中(例如，存在于可检测的标记中)。
无论所引述多肽的生物活性片段或类似物的精确序列或特性如何，变体相对于参照序列的能力可以具有转运抗体部分横跨BBB的降低的能力或增强的能力。当然，参照序列和其生物活性片段或类似物也可以具有关于BBB转运大致相同的能力。例如，在多肽是参照多肽(例如，SEQ IDNO:67，97，或117的)生物活性变体的情况下，变体转运缀合的抗体部分的能力相对于参考多肽可能会降低至少或约5％(例如，降低至少或约5％、10％、20％、25％、35％、50％、60％、70％、75％、80％、90％或95％)。在多肽是所引述的多肽(例如，SEQ ID NO:67、97或117的)生物活性变体的情况下，变体转运缀合的抗体部分的能力相对于引述的多肽可能会增强至少或约5％(例如，增强至少或约5％、10％、25％、50％、100％、200％、500％或1000％)。正如以上，虽然活性可以变化，但所引述的多肽的生物活性片段或类似物是具有足以实现有益结果(例如，将给药的患者或，平均而言，一组患者临床上有益的结果)的生物活性片段或类似物。有益的结果可以是有益的治疗或诊断方案。
在具体的实施方式中，多肽能够具有序列：Thr1-Phe2-Phe3-Tyr4-Gly5-Gly6-Cys7-Arg8-Gly9-Lys10-Arg11-Asn12-Asn13-Phe14-Lys15-Thr16-Glu17-Glu18-Tyr19(SEQ ID NO:67)或Thr1-Phe2-Phe3-Tyr4-Gly5-Gly6-Ser7-Arg8-Gly9-Lys10-Arg11-Asn12-Asn13-Phe14-Lys15-Thr16-Glu17-Glu18-Tyr19(SEQ ID NO:97)。正如以上所示，多肽能够是SEQ ID NO:117的片段或类似物，其中SEQ ID NO:117的19个氨基酸残基中至少3个氨基酸保持不变。具体而言，SEQ ID NO:117的类似物能够包括其中K10和/或K15保持不变的序列。在一些实施方式中，Asn12用另一氨基酸残基(例如，Gln)替换；Asn13用另一氨基酸残基(例如，Gln)替换；和/或Phe14用另一氨基酸残基(例如，Tyr或Trp)替换。多肽能够包括序列：Phe3-Tyr4-Gly5-Gly6-Cys7/Ser7-Arg8-Gly9-Lys10-Arg11-Asn12-Asn13-Phe14-Lys15-Thr16-Glu17-Glu18-Tyr19-Cys(SEQ ID NO:118)；Gly5-Gly6-Ser7-Arg8-Gly9-Lys10-Arg11-Asn12-Asn13-Phe14-Lys15-Thr16-Glu17-Glu18-Tyr19-Cys(SEQ ID NO:119)；Ser7-Arg8-Gly9-Lys10-Arg11-Asn12-Asn13-Phe14-Lys15-Thr16-Glu17-Glu18-Tyr19-Cys(SEQ ID NO:120)；Gly9-Lys10-Arg11-Asn12-Asn13-Phe14-Lys15-Thr16-Glu17-Glu18-Tyr19-Cys(SEQ ID NO:121)；或Lys10-Arg11-Asn12-Asn13-Phe14-Lys15-Tyr19-Cys(SEQ ID NO:122)。
在多肽是SEQ ID NO:117的片段的情况下，或在多肽是SEQ IDNO:117包含SEQ ID NO:117的片段的类似物的情况下，片段可以具有至少6个与SEQ ID NO:117的6-18个近邻氨基酸残基具有同一性的氨基酸残基(例如，6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个氨基酸残基)的长度。根据本发明，片段能够是Lys10-Arg11-Asn12-Asn13-Phe14-Lys15(SEQ ID NO:123)。SEQ ID NO:17的生物活性类似物能够具有(由…组成)，或能够包括(含有)位置10和15处的赖氨酸残基是不变的序列，或位置10和15处的赖氨酸残基以及位置16处的精氨酸残基是不变的序列。在后者的情况下，生物活性类似物将会具有，或将会包括，遵照式Lys-Arg-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Lys(式I；SEQ IDNO:106)的序列。Xaa3能够是Asn或Gln；Xaa4能够是Asn或Gln；和Xaa5能够是Phe、Tyr或Trp。以上所示的序列，Lys10-Arg11-Asn12-Asn13-Phe14-Lys15(SEQ ID NO:123)与式I一致。在选择Xaa3、Xaa4和Xaas时，它们能够是保守替换(即，近邻Asn残基能够独立地用Gln、Glu、Asp或His替换，而Phe能够用Tyr或Trp替换)。Xaa3、Xaa4和Xaa5也能够以对映异构体形式变化，能够是非天然的氨基酸残基，或能够基于本文中的另一特征或特性进行选择。
在具体的实施方式中，抑肽酶衍生的多肽具有(由…组成)或包括(含有)图2的表格中所示的序列，标识为SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:123。
改性的多肽：本发明的蛋白缀合物中引入的任何多肽能够经过改性而与接头(例如，结合到抗体部分的接头)发生化学相互作用，正如以下进一步的描述。这些改性的多肽都在本发明的范围之内，并可以作为试剂盒的组件与完成缀合至接头结合的抗体部分的过程的说明书一起进行包装。例如，多肽能够经过改性而包括N3叠氮基，其将与结合至抗体部分的接头中的炔发生反应(而反之亦然；多肽能够结合至包括炔的接头，其将与抗体部分延伸出的叠氮基发生反应)。
抗体部分：除了多肽(例如，抑肽酶衍生的多肽)之外，本发明的蛋白缀合物包括单个抗体部分或其生物活性变体。正如以上，抗体部分能够是天然表达的抗体(例如，四聚体抗体)或其生物活性变体。抗体部分也能够是非天然的抗体(例如，单链抗体)或其生物活性变体。变体包括，而不限于，天然抗体的片段(例如，四聚体抗体的，例如Fab片段或F(ab’)2片段)，scFv的片段，或四聚体抗体的变体，scFv，或其凭借插入和/或替换一个或多个氨基酸残基而不同的片段。
正如本领域所公知的，抗体片段的某些类型通过“全长”抗体的酶处理而产生。采用酶木瓜蛋白酶消化会产生两个相同的Fab片段，每一个片段具有单个抗原结合位点，和残余的Fc片段。Fab片段还含有轻链的恒定域和重链的CH1域。与此相反，采用胃蛋白酶消化会产生具有两个抗原结合位点并仍能够交联抗原的F(ab′)2片段。本发明的缀合物中引入的抗体部分能够通过采用这些酶消化产生或通过其它方法产生。
Fab′片段，其也可以引入，不同于Fab片段之处在于它们在CH1域的C-端包括其它残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸残基。恒定域的半胱氨酸残基携带游离的硫醇基团，其能够参与本文中描述的缀合反应。F(ab′)2抗体片段是通过铰链区中的半胱氨酸残基连接的Fab′片段对。抗体片段的其它化学偶联在本领域内也是已知的。
Fv区是包含完整抗原识别和由一个重链和一个轻链可变结构域组成的结合位点的最小片段。每一可变结构域的三个CDR相互作用而定义VH-VL二聚体的表面上的抗原结合位点。总的来说，六个CDR对抗体赋予抗原结合特异性。正如本领域中已知的，“单链”抗体或“scFv”片段是在抗体的VH和VL域包含于识别和结合抗原的单个多肽链内时形成的单链Fv变体。通常，单链抗体包括VH和VL之间能够使scFv形成抗原结合的所需三维结构的多肽接头(参见，例如，Pluckthun，In the Pharmacology ofMonoclonal Antibody，Rosenburg and Moore eds.，Springer-Verlag，NewYork，113:269-315，1994)。
在其它实施方式中，抗体部分能够是双特异性抗体。双特异性抗体是具有两个抗原结合位点的小抗体片段。每一片段包含链状结合至VL域的VH域。然而，由于域之间的接头太短而不允许它们之间在同一链上配对，连接的VH-VL域被迫与另一条链的互补域配对，产生两个抗原结合位点。双特异性抗体更充分地描述于，例如，在EP 404,097；WO 93/11161；和Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448，1993中。
在其它实施方式中，抗体部分能够是直链抗体。在这种情况下，抗体部分由构成抗原结合区对的一对串联Fd片段(VH-CH1-VH-CH1)形成。直链抗体能够是双特异性的或单特异性的，正如描述于，例如，Zapata等人.1995，Protein Eng.8(10)：1057-1062，1995的情况。
关于靶，抗体部分(例如，四聚体抗体、其生物活性变体、scFv、Fab片段、Fab′片段、或F(ab’)2片段、或其生物活性变体，无论分类如何(即，是否是IgG类或是另一类)并且是否是人的、人源化的、嵌合的、多克隆的、单克隆的、或具有本文中任何其它属性或特性)能够特异性地结合生长因子受体或细胞因子受体(例如，白细胞介素受体)。生长因子受体能够是由表皮生长因子(EGF)家族的成员结合的受体。EGF家族中蛋白的受体的实例包括EGF受体(EGFR)，类肝素结合EGF的生长因子受体(HB-EGFR)，双调蛋白受体(AR)，表皮调节素受体(EPR)，Epigen受体，β细胞素受体，和神经调节蛋白的受体(例如，神经调节蛋白-1、神经调节蛋白-2、神经调节蛋白-3或神经调节蛋白-4的受体)。尽管本发明并未如此限制，但是当EGFR被靶向时，抗体部分能够是曲妥珠单抗，西妥昔单抗，或帕尼单抗，含有曲妥珠单抗、西妥昔单抗或帕尼单抗的重链和轻链的可变域的scFv，或这些四聚或单链抗体的生物活性变体。例如，曲妥珠单抗、西妥昔单抗或帕尼单抗的Fab或F(ab’)2片段。在其它实施方式中，生长因子受体能够是血管内皮生长因子(VEGF)家族的成员结合的受体。VEGF家族中蛋白的受体靶实例包括VEGF受体(VEGFR；例如，VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C或VEGF-D的受体)或胎盘生长因子的受体(PGFR)。尽管本发明并未如此限制，当VEGFR被靶向时，抗体部分能够是贝伐单抗或雷珠单抗，含有贝伐单抗或雷珠单抗的重链和轻链的可变域的scFV，或这些四聚或单链抗体的生物活性变体。例如，抗体部分能够是贝伐单抗或雷珠单抗的Fab或F(ab’)2片段。正如所述的，本发明蛋白缀合物的抗体部分的其它合适的靶是细胞因子受体，包括肿瘤坏死因子(TNF)家族的成员的那些。这些受体包括由TNF结合的那些(也称之为TNF-α或恶液质素)，淋巴毒素-α(LT-α)、T细胞抗原gp39(CD40L)、FASL、4-1BBL、OX40L和TNF-相关的诱导细胞凋亡的配体(TRAIL)。尽管本发明并未如此限制，当TNF受体受靶向时，抗体部分能够是阿达木单抗，赛妥珠单抗，戈利木单抗或英夫利昔单抗，含有阿达木单抗、赛妥珠单抗、戈利木单抗或英夫利昔单抗重链和轻链可变域的scFv，或这些四聚或单链抗体的生物活性变体。例如，抗体部分能够是阿达木单抗、赛妥珠单抗、戈利木单抗或英夫利昔单抗的Fab或F(ab’)2片段。在靶向的受体是白细胞介素受体时，抗体部分能够特异性地结合白细胞介素-2(IL-2)或白细胞介素-6(IL-6)受体。尽管本发明并未如此限制，当抗体部分靶向IL-2的受体时，抗体部分能够是巴利昔单抗或达珠单抗，包含巴利昔单抗或达珠单抗的重链和轻链可变域的scFV，或四聚的或单链抗体的生物活性变体。例如，抗体部分能够是巴利昔单抗或达珠单抗的Fab或F(ab’)2片段。类似地，当抗体部分靶向IL-6的受体时，抗体部分能够是妥珠单抗，包含妥珠单抗重链和轻链可变域的scFV，或这种四聚的或单链抗体的生物活性变体(例如，妥珠单抗的Fab或F(ab’)2片段)。关于功能，抗体部分能够是化疗剂或抗炎剂。
迄今为止我们的几个研究，包括一些以下实施例中描述的那些中的一些，已进行采用曲妥珠单抗()实施，这是从小鼠人源化的具有对人表皮生长因子2(HER2)/neu受体具有高亲和性的单克隆抗体。曲妥珠单抗经过美国FDA批准而用于治疗乳腺癌。HER2/neu受体被认为是还没有已知的配体的孤受体。然而，它表达于肿瘤细胞的表面上并调节诸如细胞循环进程，细胞存活，细胞增殖和细胞运动性的关键细胞过程。选择性结合HER2的曲妥珠单抗或任何抗体部分可以是某些肿瘤类型的临床相关的生物标记。在治疗上，当曲妥珠单抗结合至HER受体时，它不仅抑制细胞生长和分裂的能力，而且还标记细胞而由宿主的免疫系统将其破坏。
接头：各种接头能够用于产生本发明缀合物。例如，抗体部分或其生物活性变体能够是结合至与改性的游离胺反应的接头，这种游离氨基出现在多肽的赖氨酸残基处和多肽的氨基-端处。因此，适用于本发明缀合物的接头能够包含一个与抗体部分缀合的多肽或改性多肽上的伯胺具有反应活性的基团。更具体而言，接头能够选自由单氟环辛炔(MFCO)、双环[6.1.0]壬炔(BCN)、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基硫代乙酸酯(SATA)、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基硫代丙酸酯(SATP)、马来酰亚胺和二苯并环辛炔酯(DBCO酯)组成的组中。
适用于本发明缀合物的同型双官能和异型双官能交叉接头(缀合剂)可获自许多商业来源。虽然在本领域中是已知的，我们简要地提请注意，在同型双官能交叉接头中的反应性基团是相同的，并位于交叉接头的间隔臂的相对端上。它们很方便地与之作用，因为反应能够采用一步化学交联法完成，并且它们能够在需要之处组装而形成二聚体和聚合物。其中这些商购可获得的同型双官能交叉接头是：BSOCOES(二(2-[琥珀酰亚胺氧基羰氧基]乙基)砜；DPDPB(l,4-二-(3′-[2-吡啶基二硫基]-丙酰胺基)丁烷；DSS(二琥珀酰亚胺基辛二酸酯)；DST(二琥珀酰亚胺基酒石酸酯)；磺基DST(磺基二琥珀酰亚胺基酒石酸酯)；DSP(二硫基二(琥珀酰亚胺基丙酸酯)；DTSSP(3,3′-二硫基二(磺基琥珀酰亚胺基丙酸酯)；EGS(乙二醇二(琥珀酰亚胺基琥珀酸酯))；和BASED(可碘化的二(β-[4-叠氮基水杨酰胺基]-乙基)二硫化物)。
可用于与同型或异型双官能交叉接头交联的区域可以在本发明的多肽上发现。交叉接头(或接头，因为该术语在本文中更常用)可以包括柔性臂，如例如，短臂(<2个碳的链)，中等尺寸的臂(2～5个碳的链)，或长臂(3～6个碳的链)。有用的交叉接头包括BS3([二(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯]，这是靶向可接近伯胺的同型双官能N-羟基琥珀酰亚胺酯。另一种有用的接头是NHS/EDC(N-羟基琥珀酰亚胺和N-乙基-‘(二甲基氨基丙基)碳二酰亚胺，其允许伯胺基团与羧基缀合)。另一种有用的接头是磺基EMCS([N-e-马来酰亚胺基-己酸]酰肼，其包括对巯基和氨基具有反应活性的异型双官能反应性基团(马来酰亚胺和NHS-酯)。另一有用的接头是酰肼。大多数蛋白质含有暴露的碳水化合物和酰肼是适用于将羧基连接至伯胺的试剂。另一种有用的接头是SATA(N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基硫代乙酸酯)。SATA对胺具有反应活性，并增加了受保护的巯基。关于所用的方法，将抗体部分缀合至多肽的工艺方法优选不改变或变化抗体部分的关键特性，如其免疫特异性或免疫反应活性。同型双官能胺特异性交叉接头能够依靠NHS-酯和酰亚胺酯反应性基团实现选择性缀合伯胺，并可以是可切割的。异型双官能交叉接头有两个不同的基团，其允许缀合作用按照两步反应进行。这些接头也可以以不同长度具有不同类型的间隔臂商购获得。缀合能够在伯胺基团(例如，在赖氨酸残基上的)和巯基基团(例如，在半胱氨酸残基上)之间进行。有用的接头列于图11中的表格中。
蛋白缀合物及其制备方法：在给定的缀合物中的抗体部分，接头和多肽能够进行独立选择。也就是说，任何本文中的接头能够用于将本文中的任何多肽缀合于本文中的任何抗体部分。缀合物然后能够出于治疗的原因用于将本文中的任何抗体部分递送至CNS。由于包含可检测的标记，本发明的缀合物也可以用作成像试剂，提供给装置以映射出CNS中抗体部分结合的抗原的分布。
本发明的蛋白缀合物可以通过将一种或多种多肽部分连接(即，缀合)，但不限于，抗体部分而形成。
优选的缀合技术包括交叉接头SATA和点击化学的应用。SATA是异型双官能交叉接头，其有利于连接两个分子(即，抗体部分至多肽部分)的共价键的形成。琥珀酰亚胺基酯与伯胺反应而向分子中引入硫醇基，随后除去乙酰基团，由此产生巯基。硫醇基提供经由二硫键将两个部分连接到一起的靶。采用SATA反应的一个优点在于改性的分子能够为后续的缀合反应存放很长一段时间，因为巯基能够以保护的形式添加。
正如所指出，无铜点击化学技术可以用于产生本文中的缀合物。点击化学通常理解为一种模块化反应，适用广泛，立体特异性，并且能够在温和条件(例如，在生理条件)下产生高产率产物。点击化学已经描述为囊括四类化学转化。第一类是非醇醛型羰基化学反应，如生成脲、硫脲、肟醚、腙、酰胺和芳族杂环的那些。第二类转化是亲核取代反应，其中环张力杂环亲电试剂内的环(例如，环氧、氮丙啶和吖丙啶离子)将打开。在第三类中，会发生C-C多键的加成反应，如迈克尔加成、环氧化、氮丙啶化(aziridation)和二羟基化，而在第四类中，是环加成反应，如1,3-偶极环加成和Diels-Alder反应。炔和叠氮的1,3-偶极环加成(1,3-胡伊斯根(Huisgen)反应)生成五员的三唑是点击反应的具体实例。参见，GuddehalliParameswarappy，Sharavathi，“Bifunctional cyclooctynes in copper-free clickchemistry for applications in radionuclide chemistry nd 4-Alkylpyridinederivatives in intramolecular dearomatization and heterocycle synethsis”，Dissertation，University of Iowa，2011。http://ir.uiowa.edu/etd/2710。点击化学方法可以将高毒性催化剂铜利用于生产高产量的生产方法中。然而，初步缀合反应表明，多肽在本发明的缀合物中的总引入非常低(6％)。缀合物也是不稳定的，并观察到产物沉淀。因此，采用点击化学的缀合步骤经过优化才消除铜的使用。简而言之，第一步骤涉及缀合基团的活化以及中间体的纯化和分离。对于这个步骤，第一组分(例如，抗体或抗体片段)与接头反应而产生第一组分-接头中间体(例如，抗体-或抗体片段-接头中间体)。接着，具有用于缀合的已活化基团(即，炔)和第二组分(例如，具有叠氮的多肽)反应而形成需要的缀合物，其能够进行进一步的纯化。这第二步骤是有效的，因为相关基团(炔和叠氮)之间的反应在24小时内室温下发生而不会使蛋白变性。在此过程中没有哪个步骤会干扰所产生的分子的生物活性。
另外，多肽部分可以通过氧化过程而附连或缀合至抗体分子的碳水化合物部分。碳水化合物氧化的方法能够是化学法或酶促法。碳水化合物部分能够位于抗体、Fab或Fab′片段的Fc区。抗体部分的Fc区的氧化能够使用已知产生醛的方法进行实施。氧化剂能够选自由碘酸，过碘酸，偏高碘酸钠和偏高碘酸钾组成的组。这个步骤之后是与选自由氨衍生物如伯胺、仲胺、羟胺、肼、酰肼、苯肼、氨基脲或氨基硫脲组成的组中的胺基团发生反应。酶促方法涉及抗体分子的碳水化合物部分与酶如半乳糖氧化物在氧存在下反应而生成醛。
本发明蛋白缀合物能够按照任何数目的方式进行评价。例如，蛋白缀合物能够对其以下性质进行评价：对BBB可渗透性(通过原位脑灌注或在诸如美国专利号7,557,182中描述的模型的BBB体外模型中进行测试)；对抗体部分对其靶的亲和性；对细胞毒性(例如，通过BT-474[3H]-胸苷引入)；对体外溶解性和/或稳定性；对纯度(例如，低水平的未缀合抗体部分和低水平的蛋白聚结物能够通过凝胶渗析分离和蛋白印迹法(Westernblotting)确定)；和对于体内的稳定性和组织分布(例如，通过测量随时间的血浆水平和通过成像分析测定组织分布)。
药物组合物：本发明还有的特征在于包含治疗有效量的本发明蛋白缀合物的药物组合物。组合物能够经过配制而用于通过任何各种给药途径的给药，并能够包含一种或多种生理可接受的赋形剂，其可以根据给药途径而变化。我们使用术语“赋形剂”广义上是指任何化合物或物质，包括也可被称为“载体”或“稀释剂”的那些。制备药物和生理可接受的组合物通常认为在本领域中是常规例程，而本领域普通技术人员能够查阅各种权威进行指导。例如，能够查阅《雷明顿药物科学》，Mack出版公司，费城，PA，第17版，1985(Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack PublishingCompany，Philadelphia，PA，17th ed.，1985)。对于药物递送方法的简要综述，参见，例如，Langer(Science 249：1527-1533，1990)。
本发明的药物组合物能够制备用于口服或胃肠外给药，但是我们预期胃肠外给药会是有益的(尽管不太方便但却能优化活性诊断剂或药剂(本文中，抗体部分)的递送)。制备用于肠胃外给药的药物组合物包括用于静脉内(或动脉内)，肌内，皮下，腹膜内，经粘膜(例如，鼻内、阴道内或直肠)，或经皮(例如，局部)给药。这些给药途径能够适用于任何诊断或治疗。气溶胶吸入也可以设想。因此，本发明提供了肠胃外给药的组合物，其包含溶解或悬浮于可接受的载体，优选水性载体，如水、缓冲的水、盐水、缓冲的盐水(例如，PBS)等中的蛋白缀合物。所包含的一种或多种赋形剂可以有助于接近生理条件，如pH调节和缓冲剂、渗透压调节剂、润湿剂、洗涤剂等。在组合物包含固体组分(因为它们可能用于口服给药)的情况下，一种或多种赋形剂能够起到粘合剂或填料的作用(例如，用于配制片剂、胶囊等)。在组合物经过配制而施用于皮肤或粘膜表面的情况下，一种或多种赋形剂能够是用于配制乳膏，油膏等的溶剂或乳化剂。
药物组合物可以是无菌的；它们可以通过常规的灭菌技术灭菌或可以过滤灭菌。水溶液可以原样包装，或冻干以供使用，冻干制剂，都涵盖于本发明中，在给药之前会与无菌含水载体组合。药物组合物的pH值通常将处于3～11(例如，约5～9)或6～8(例如，约7～8)。在一些实施方式中，药物组合物的pH值为约7.0～7.5。所得的固体形式的组合物可以以多个单剂量单位包装，每个单位含有固定用量的上述试剂或多种试剂，如片剂或胶囊的密封包装。固体形式的组合物也能够以灵活的量包装于容器中，如设计用于局部施用乳膏或软膏的可挤压管中。
治疗和使用的方法：以上所述的药物组合物能够经过配制而包含诊断有用的或治疗有效量的蛋白缀合物。治疗性给药包括预防性应用，而本文中所描述的任何治疗性方法能够依据蛋白组合物的“用法”进行表达(例如，在癌症的治疗中或在适用于治疗癌症的药物的制备中)。基于基因测试和其它预后方法，与其患者会诊的医生可以选择预防性给药，其中患者对CNS癌症或CNS参涉的神经功能障碍症具有临床上确定的易感性或增加的易感性(在某些情况下，是大大增加的易感性)。本发明的药物组合物能够以足以延迟、降低或优选预防临床疾病的发作的用量给药于受试者(例如，人患者)。在治疗应用中，组合物以足以至少部分改善体征或症状或抑制病症，其综合症和后果的症状的进展(和优选将其控制)的用量给药于已经患有CNS癌症活CNS参涉的神经功能障碍症的受试者(例如，人患者)。足以实现此目的的量定义为“治疗有效量”。例如，在治疗神经功能障碍症(例如，帕金森氏病、阿尔茨海默氏病或亨廷顿氏病)中，降低、防止、延迟、抑制或控制障碍症的任何症状的药物或化合物将会是治疗有效性的。治疗有效量的药物组合物可以是达到治愈的量，但结果只是能够实现的数个中之一。正如，治疗有效量包括提供功能障碍症的发作或进展延迟、受阻或防止或功能障碍症或功能障碍症的症状改善的这种治疗的用量。一种或多种症状可以是不太严重的。恢复可以在已经治疗的个体中得到加速。
这种用途的有效量可能取决于CNS癌症或神经功能障碍症的严重度和受试者的体重和一般身体状况，但一般的范围为每剂量每个受试者约0.05μg～约1000μg(例如，0.5～100μg)当量的蛋白缀合物。初始给药和增效给药的合适方案通常是初始给药后接着是以一个或多个时、日、周或月间隔的后续给药的重复剂量。例如，相比于每周一次或多次(例如，每周2、3、4、5、6或7或更多次)的每剂量未缀合抗体部分，受试者可以接收的蛋白缀合物的剂量范围为约0.05～1000μg当量剂量。例如，受试者可以接收0.1～2500μg(例如，2000、1500、1000、500、100、10、1、0.5或0.1μg)剂量/周。受试者还可以接收的本发明缀合物的剂量范围为每两个或三个星期一次的每剂量0.1～3000μg一次范围每个2或三个星期。受试者还可以接收2mg/kg/星期(所计算的重量基于缀合物或抗体部分的重量)。
本发明的药物组合物中蛋白缀合物的总有效量能够作为单个剂量，作为一段相对短时间内的推注或输注给药于哺乳动物，或能够使用分级治疗方案给药，其中多个剂量在一段更长的时间内(例如，一个剂量每4-6、8-12、14-16或18-24小时，或每2-4天、1-2周或每月一次)给药。另外，可以设想足以维持血液中治疗有效浓度的连续静脉输注。
本发明组合物中存在的和本发明方法中所用的施用于哺乳动物(例如，人)的治疗有效量的一种或多种药物能够通过本领域普通技术人员对个体的年龄，体重和其它一般状态的差异(如上述)加以考虑而确定。由于本发明的蛋白缀合物表现出穿过BBB的能力增强，则抗体部分的用量能够低于抗体部分未缀合时的有效剂量。例如，抗体部分的剂量能够是小于或等于采用相同或相当的未缀合药物治疗效果所需剂量的约90％、75％、50％、40％、30％、20％、15％、12％、10％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％。
治疗有效量也能够通过本领域那些技术人员凭经验确定。例如，本发明药物组合物的单次或多次给药能够采用由治疗医生选择的剂量水平和给药的定时或模式进行实施。剂量和给药方案能够基于受试者中疾病或病症的严重度进行决定和调节，疾病或病症的这种严重度可以根据临床医生或其它熟练卫生保健专业人员通常实践的方法在整个治疗过程中进行监控。
试剂盒：本发明的试剂盒能够包括以上组合物和合适的说明书(不论是书面的和/或作为音频、视频或视听材料提供的)的任意组合。在一个实施方式中，试剂盒包括与使用说明书一起包装的药物组合物或其前体，以及可选的任何适用于给药准备和/或给药组合物中操作组合物的器件。例如，本发明的试剂盒能够包含以下的一种或多种：稀释剂、手套、小药瓶或其它容器、吸液管、针头、注射器、导管、立架、药匙、无菌布或盖布、阳性和/或阴性对照物等。在另一实施方式中，本发明的试剂盒包括组合物和适用于制备蛋白缀合物的试剂。例如，试剂盒能够包括以下的一种或多种：抗体部分、接头、接头结合的抗体部分、多肽、与接头具有反应活性的化学实体和/或改性的多肽。例如，在一个实施方式中，试剂盒能够包括抗体部分，接头、与接头具有反应活性的化学实体和多肽。在其它实施方式中，试剂盒能够包括接头结合的抗体部分和改性的多肽。正如适用于给药组合物的试剂盒一样，适用于制备组合物的试剂盒能够包括以下的任何一种或多种：稀释剂、手套、小药瓶或其它容器、吸液管、针头、注射器、导管、立架、药匙、无菌布或盖布、阳性和/或阴性对照物等。也可以包含任何适用于将接头结合至抗体部分或多肽，改性多肽，将接头结合的抗体部分缀合至改性的多肽(反之亦然；将抗体部分缀合至接头结合的多肽)，或纯化和检测蛋白缀合物的试剂。如前所述，接头结合的抗体部分和改性的多肽也是本发明组合物的特征。
实施例
实施例1：采用不同缀合策略(H1、H2和H3)的初步研究
在一系列旨在优化制备蛋白缀合物的条件的实验中，我们将曲妥珠单抗(作为抗体部分)与由SEQ ID NO:97(Angiopep-2(An2))表示的多肽进行反应。我们使用了两种不同的缀合化学，其中之一采用接头SATA。在这种缀合作用中，接头SATA中的琥珀酰亚胺基酯与多肽中的伯胺发生化学反应。通常，采用无铜点击化学，有两种方法能够使用。在一种方法中，抗体部分采用伯胺上的叠氮基进行改性，而多肽采用炔进行改性。在第二方法中，抗体部分采用炔(例如，MFCO或BCN)进行改性，而多肽采用伯胺上的叠氮基进行改性。我们也将抗体部分与多肽的比率从1:8变化至1:32。反应在理论上5mg的规模下进行。
因为引入的Angiopep-2小于1当量，则还存在大量过量的曲妥珠单抗，并且我们使用了抗Angiopep-2亲和柱进行进一步纯化和去除曲妥珠单抗。这导致产率较差(5％～10％)。采用传统使用铜催化剂的点击化学还有一个问题，那就是铜催化剂仍然痕量保持存在而可能助长缀合物的不稳定性。
我们在设计用于测试脑灌注的研究中原位测试了H1，H2和H3。结果显示出比单独的曲妥珠单抗(aHER2)在脑中H1和H3具有更高的水平(图4)。
实施例2：采用优化的无铜点击化学制备和测试第二系列缀合物
使用无铜点击化学技术是因为它是快速，简单和可重复性的技术，也不需要高毒性催化剂。通常，炔和叠氮部分之间的反应在室温下24小时内发生，正如，并不需要催化剂Cu(I)。反应条件是温和的，而因此不会引起蛋白变性，并且反应部分不与生物分子上的官能团发生相互作用。此外，缀合位点在多肽部分上的位置能够进行控制而所得的缀合物是稳定的和生物活性的。
在我们的生产方法，我们已经指定“步骤1”为“活化、纯化和渗析分离”。这一步骤产生接头结合的抗体部分。在一项实验中，为了实施步骤1，我们向51mg抗-HER2单克隆抗体中加入200μL MFCO-N-羟基琥珀酰亚胺酯的原液。在接头的原液中，将7.6mg的MFCO-N-羟基琥珀酰亚胺酯溶于1000μL无水DMSO中。反应在室温下保持5小时，同时偶尔振荡。接头结合的抗体部分从过量的试剂中采用脱盐柱通过凝胶过滤进行纯化。从柱收集35mL，接头结合的抗体部分以1.3mg/mL的浓度存在。配体结合的抗体部分对磷酸盐/柠檬酸盐缓冲液(pH～5)4℃渗析过夜。45mg(收率88％)活化的辛炔回收，将其与叠氮An2一起用于步骤2。接头结合的抗体部分(抗体部分-辛炔)的形成通过MALDI-TOF分析证实。
在步骤2中，我们向接头结合的抗体部分中同时加入未改性的多肽(An2)和改性的多肽(连接至含有N3的化学实体的An2)。我们使用了42.8mg接头结合的抗体部分，2156μL未改性多肽的原液(8当量；13mg An2溶解于4060μL H2O中)和901μL改性多肽的原液(10mg An2-N3溶解于1230μL无水DMSO中)。混合物通过涡旋搅拌，包裹于铝箔中，并在室温下放置过夜。缀合作用通过LCD-MSN以An2-N3(改性的多肽)的消耗进行监测。由于An2的浓度不随时间而改变，则这种多肽就用作内标。所得的蛋白缀合物用pH 5.0的磷酸盐/柠檬酸盐缓冲液作为结合缓冲液而用pH 3.0的柠檬酸缓冲液作为洗脱缓冲液采用蛋白A柱进行纯化。蛋白缀合物经过分离并进一步采用磷酸氢二钠缓冲液中和至pH 5.0。溶液经过离心和倾析而获得纯的蛋白缀合物。An2的引入通过MALDI-TOF分析证实。
我们生产了5种蛋白缀合物，标识为H40～H44，包含作为抗体部分的曲妥珠单抗和由SEQ ID NO:97(Angiopep-2或An2)表示的多肽。缀合物以5mg的规模产生，而抗体部分与多肽的比率和接头的长度是不同的。
正如图5中所示，蛋白缀合物H40、H41、H42、H43和H44都显示出对曲妥珠单抗类似的结合参数。曲妥珠单抗和An2-曲妥珠单抗缀合物结合至BT-474细胞如下实施。汇合的BT-474细胞首先采用PBS-柠檬酸非酶促解离缓冲液从烧瓶种分离出来。悬浮液中的细胞在冰冷的结合缓冲液(BB：Hepes 10mM，NaCl 150mM，CaCl22.5mM，pH：7.3)中洗涤、计数、并分离于不同的自动微量吸管(eppendorf)(106个BT-474细胞/管)。曲妥珠单抗和An2-曲妥珠单抗缀合物的结合随着产物在冰冷的BB中浓度的升高而在4℃下进行了30min。然后洗涤细胞，并用在冰冷的BB中的α-人-AlexaFluor488二级抗体在4℃下培养30min。将细胞用冰冷的BB充分洗涤并通过流式细胞仪(每种条件10000门控事件)进行分析。
在原位脑灌注研究中，如上述对H1、H2和H3进行实施，显示了五种通过无铜点击化学生成的蛋白缀合物的情况，H43显示出最高脑实质渗透(图6)。我们还观察到，H43在灌注时间(时间0)至四个小时后之间的时间内随时间线性摄取。
在下面表中，我们总结了蛋白缀合物(H43)的各种特性，比较了第一和第二批次。
缀合物 Activ:An2 引入的An2 质量 浓度 产率
H43，批次1 8:8 1.7 152533 0.5mg/mL 50％
H43，批次2 8:8 3.6 157872 1.7mg/mL 78％
消耗的An2多肽数目通过LC-MS(液相色谱-质谱)进行测定。所引入的An2多肽的数目和缀合物的质量通过MALDI-TOF测定。曲妥珠单抗的质量为～148,000。
迄今为止我们对于H43的工作表明脑实质渗透提高，并且抗体部分保留了结合Her2的能力(对Her2的结合亲和力在一个冷冻/解冻循环之后是相同的)。我们生产的组合物能够通过0.2μm过滤器进行过滤而并没有任何降低缀合物的浓度。蛋白缀合物看起来也是稳定的。在4℃下存储十四天后，没有观察到沉淀，缀合物的浓度在离心之后基本上保持不变，而多肽(An2)仍然能够在10天后通过蛋白印迹法(Western blot)进行检测。
为了测试组织分布，我们采用放射标记的曲妥珠单抗(125I-曲妥珠单抗)或125I-H43以10mg/kg的当量剂量静脉注射CD-1小鼠。30分钟、1小时、4小时、7小时、24小时、48小时和72小时后采集血样。随后将小鼠处死并用冷磷酸盐缓冲盐水灌注～8分钟。收获各种组织和测定放射活性，以评价组织分布。结果如图7所示。我们发现，在30分钟后，H43在脑中的分布比曲妥珠单抗大3.5倍；60分钟后，分布大2.5-倍；而在72小时后，分布高2.3-倍。在不存在Her2-表达的脑瘤的情况下，潜在的流出物可能从脑部经由新生Fc(FcRn)受体出现，这种受体据报道表达于BBB的底外侧侧面并还已知介导穿过BBB的反向转胞吞作用。尽管蛋白缀合物的分布在脑部中比未缀合的抗体高，但是蛋白缀合物和未缀合的抗体在脑部比在任何测试的其它组织(包括肌肉、心脏、肝脏、肾脏和肺)中都更低。
在图9中，我们提呈了从上述处理的小鼠中收集的其它数据。未缀合的抗HER2抗体(125I-曲妥珠单抗)和缀合的构建体H43(125I-H43)的分布表示为％[脑]/[血浆](参见左侧图)和％注射剂量/g组织(参见中心曲线图)。血浆水平显示于右侧曲线图。
实施例3：小鼠中的原位脑瘤研究
为了测试蛋白缀合物抑制脑瘤的能力，将BT-474细胞注射到18只小鼠的脑部(注射定义第0天)。为了测试蛋白缀合物抑制脑瘤的能力，BT-474细胞注射入18只小鼠(注射定义第1天)。在第12天时，小鼠采用对照溶液(通过静脉注射提供仅仅载体的溶液)，14mg/kg曲妥珠单抗，或15mg/kg H43任一种进行处理。在第33天时，将根据每一方案处理的两只小鼠(两对照；两曲妥珠单抗；两蛋白缀合物)处死。脑组织经过解剖，并用台盼蓝(Trypan blue)染色。在这个时间点上没有明显的肿瘤。在第47天时，将根据每一治疗方案治疗的两个另外的小鼠处死。此时，对照组中的小鼠已经体重减轻，并且似乎健康状况不佳。经检查，大脑瘤清晰可见。视觉上较小的肿瘤存在于用曲妥珠单抗治疗的小鼠的脑部中，而在用蛋白缀合物治疗的小鼠中只看见很小或没有见到肿瘤。在剩余的小鼠中，继续治疗，接着向所有小鼠静脉给药Cyto720H43。对于近红外(NiR)体内成像研究，ANG4043(H43)和抗-Her2抗体采用NiR活性染料Cyto750-NHS酯(Cytodiagnostics，伯灵顿，ON)根据厂商规程进行标记。简言之，溶解于DMSO中的cyto750-NHS酯用H43或曲妥珠单抗(赫赛汀)在pH＝9下以染料与蛋白的摩尔比1:2进行培养。室温下培养1小时后，Cyto750标记蛋白质通过凝胶过滤(皮尔斯葡聚糖(Pierce Dextran)脱盐柱)从未反应的染料中分离出来，第一次跑出的色带时Cyto750标记蛋白质。小鼠用5mg/kg的cyto750-抗Her2抗体或cyto750-H43任一种进行注射。在注射之后24h使用Carestream的体内Xtreme成像系统进行动物成像。
随后那天(第48天)，将根据每一治疗方案治疗的两个其它小鼠处死。结果类似于第47天报告的情况。脑部的重量作为肿瘤负荷的指示进行测定，并且结果如图8中所示。尽管用对照溶液治疗的小鼠的脑部和用曲妥珠单抗治疗的小鼠的脑部在BT-474细胞注射之后比健康小鼠的脑部更重，但用蛋白缀合物治疗接着用BT-474细胞注射的小鼠脑部并不比健康小鼠的脑部更重。
实施例4：ANG4043治疗对BT-474脑内肿瘤进展的影响；NiR成像研究。
将近红外亲脂荧光探针DiR引入到BT-474乳腺肿瘤细胞膜中。这种探针适用于包含任何本发明缀合物。然后BT-474-DiR肿瘤细胞植入裸鼠的大脑。植入后十二天，小鼠用载体或ANG4043治疗，ANG4043是与以上称之为H43的相同缀合物(15mg/kg，IV，每周两次)，并进行NiR体内成像。图像在两次和五次治疗之后拍摄而监测肿瘤进展。经过5次治疗之后，肿瘤相关的荧光在ANG4043治疗组中大大降低，而肿瘤相关的荧光在对照组中仍然保持高度可检测。这些结果表明，ANG4043治疗对肿瘤生长具有潜在的影响作用。在相关的研究中，我们发现，将抗-HER2抗体缀合至Angiopep多肽(An2)并不会影响抗体结合至BT-474乳腺肿瘤细胞细胞膜的结合亲和性。我们还进一步检测了用ANG4043或未缀合的抗-HER2抗体治疗的BT-474细胞的增殖(5天治疗接着4小时暴露于氚代胸苷)。引入在较低浓度(0.0001～0.1mM)下时相当的，但ANG4043-治疗的细胞在100nM下增殖较少。IC50(nM)对于抗HER2抗体(n＝2)为4.99±0.76而对于蛋白缀合物(n＝3)为3.16±0.97。
对于ANG4043的初步PK参数(WinNonlin非房室分析)如以下表中所示：
参数 抗-HER2抗体 ANG4043
Cmax(μg/ml) 166 91.5
T1/2β(day) 11.4 8.5
AUC0-30(天*μg/ml) 573.3 275.4
AUC0-∞(天*μg/ml) 703.6 310.3
Cl(ml/day) 0.43 0.97
Vd(ml) 7.3 11.8
MRT(天) 16.7 12.2
在啮齿类动物中的体内研究中，我们发现HER2-阳性肿瘤尺寸随着ANG4043而降低。在小鼠颅内植入(第1天)之前，BT-474肿瘤细胞预装载荧光染料，DiR。第12天开始，小鼠每周两次用抗-HER2和ANG4043，20mg/kg，进行治疗。在已经给予两次治疗的第16天，以及经过7次治疗之后在第33天进行NiR成像。通过荧光成像，我们发现，ANG4043与BT-474细胞中的细胞表面HER2共定位，并内化至比曲妥珠单抗更大的程度。ANG4043-治疗的脑具有更少的肿瘤生长(正如所观察的情况，例如，通过NiR成像)。在存活率方面：
组 平均存活率(天)
对照 47
赫赛汀(5mg/kg) 52+11％(p＝0.028)
ANG4043(5mg/kg) 60+28％(p＝0.0012)
。

Claims (50)

1.一种包含抗体部分和含有氨基酸序列Thr1-Phe2-Phe3-Tyr4-Gly5-Gly6-CyS7/Ser7-Arg8-Gly9-Lys10-Arg11-Asn12-Asn13-Phe14-Lys15-Thr16-Glu17-Glu18-Tyr19(SEQ ID NO:117)的多肽的蛋白缀合物、或生物活性类似物或其片段，其中所述抗体在所述多肽上的以下位置中的一个或多个处缀合至所述多肽：N-端氨基酸残基；C-端氨基酸残基；或N-端和C-端之间的赖氨酸残基。
2.根据权利要求1所述的蛋白缀合物，在所述抗体部分和所述多肽之间进一步包含接头。
3.根据权利要求2所述的蛋白缀合物，其中所述接头包含与伯胺具有反应活性的基团。
4.根据权利要求2所述的蛋白缀合物，其中所述接头是单氟环辛炔(MFCO)、双环[6.1.0]壬炔(BCN)、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基硫代乙酸酯(SATA)、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基硫代丙酸酯(SATP)、马来酰亚胺或二苯并环辛炔(DBCO)。
5.根据权利要求1所述的缀合物，其中所述多肽含有氨基酸序列Thr1-Phe2-Phe3-Tyr4-Gly5-Gly6-Cys7-Arg8-Gly9-Lys10-Arg11-Asn12-Asn13-Phe14-Lys15-Thr16-Glu17-Glu18-Tyr19(SEQ ID NO:67)。
6.根据权利要求1所述的缀合物，其中所述多肽含有氨基酸序列Thr1-Phe2-Phe3-Tyr4-Gly5-Gly6-Ser7-Arg8-Gly9-Lys10-Arg11-Asn12-Asn13-Phe14-Lys15-Thr16-Glu17-Glu18-Tyr19(SEQ ID NO:97)。
7.根据权利要求1所述的缀合物，其中所述缀合物含有SEQ ID NO:117的类似物。
8.根据权利要求7所述的缀合物，其中所述SEQ ID NO:117的类似物含有至少13个相对于SEQ ID NO:117是无变化的氨基酸残基。
9.根据权利要求7所述的缀合物，其中所述SEQ ID NO:117的类似物含有在其中Lys10和/或Lys15保持不变的序列。
10.根据权利要求7所述的缀合物，其中，在所述SEQ ID NO:117的类似物中，Asn12用Gln取代，Asn13用Gln取代，和/或Phe14用Tyr或Trp取代。
11.根据权利要求7所述的缀合物，其中所述SEQ ID NO:117的类似物含有序列Phe3-Tyr4-Gly5-Gly6-Cys7/Ser7-Arg8-Gly9-Lys10-Arg11-Asn12-Asn13-Phe14-Lys15-Thr16-Glu17-Glu18-Tyr19-Cys(SEQ ID NO:118)；Gly5-Gly6-Ser7-Arg8-Gly9-Lys10-Arg11-Asn12-Asn13-Phe14-Lys15-Thr16-Glu17-Glu18-Tyr19-Cys(SEQ ID NO:119)；Ser7-Arg8-Gly9-Lys10-Arg11-Asn12-Asn13-Phe14-Lys15-Thr16-Glu17-Glu18-Tyr19-Cys(SEQ ID NO:120)；Gly9-Lys10-Arg11-Asn12-Asn13-Phe14-Lys15-Thr16-Glu17-Glu18-Tyr19-Cys(SEQ ID NO:121)；或Lys10-Arg11-Asn12-Asn13-Phe14-Lys15-Tyr19-Cys(SEQ ID NO:122)。
12.根据权利要求1所述的缀合物，其中所述多肽含有SEQ ID NO:117的片段。
13.根据权利要求12所述的缀合物，其中所述片段含有SEQ ID NO:117的至少6个氨基酸残基。
14.根据权利要求13所述的缀合物，其中所述片段是Lys10-Arg11-Asn12-Asn13-Phe14-Lys15(SEQ ID NO:123)。
15.根据权利要求12所述的缀合物，其中所述片段含有SEQ ID NO:117的6-18个近邻氨基酸残基。
16.根据权利要求1所述的缀合物，其中所述多肽含有以D-形式或L-形式或这两种形式的氨基酸残基。
17.根据权利要求1所述的缀合物，其中所述缀合物含有1-10个多肽和一个抗体部分。
18.根据权利要求17所述的缀合物，其中所述缀合物含有2-6个多肽和一个抗体部分。
19.根据权利要求1所述的缀合物，其中每一个多肽经由接头连接至抗体部分，而没有多肽经由所述接头或以另外的方式连接至另一个多肽。
20.根据权利要求1所述的缀合物，其中所述抗体部分是四聚体抗体或其生物活性变体。
21.根据权利要求1所述的缀合物，其中所述抗体部分是单链抗体(scFv)、Fab片段或F(ab’)2片段。
22.根据权利要求1所述的缀合物，其中所述抗体部分含有人的、嵌合的或人源化的抗体或其生物活性变体。
23.根据权利要求1所述的缀合物，其中所述抗体部分是单克隆抗体或多克隆抗体。
24.根据权利要求20或权利要求21所述的缀合物，其中所述四聚体抗体、其生物活性变体、所述scFv、Fab片段或F(ab’)2片段特异性结合生长因子受体或白细胞介素受体。
25.根据权利要求24所述的缀合物，其中所述生长因子受体是表皮生长家族受体(EGFR)家族的成员。
26.根据权利要求25所述的缀合物，其中所述抗体部分是曲妥珠单抗、西妥昔单抗、或帕尼单抗、或其生物活性变体。
27.根据权利要求24所述的缀合物，其中所述生长因子受体是血管内皮生长因子受体(VEGFR)。
28.根据权利要求27所述的缀合物，其中所述抗体部分是贝伐单抗或雷珠单抗或其生物活性变体。
29.根据权利要求24所述的缀合物，其中所述白细胞介素受体是IL-2受体。
30.根据权利要求29所述的缀合物，其中所述抗体部分是巴利昔单抗或达珠单抗或其生物活性变体。
31.根据权利要求24所述的缀合物，其中所述白细胞介素受体是IL-6受体。
32.根据权利要求31所述的缀合物，其中所述抗体部分是妥珠单抗或其生物活性变体。
33.根据权利要求24所述的缀合物，其中所述生长因子受体是TNF-α受体。
34.根据权利要求33所述的缀合物，其中所述抗体部分是阿达木单抗、赛妥珠单抗、戈利木单抗或英夫利昔单抗。
35.根据权利要求1所述的缀合物，其中所述抗体部分是化疗剂。
36.根据权利要求1所述的缀合物，其中所述抗体部分是抗炎剂。
37.一种包含权利要求1所述的缀合物和药用载体的药物组合物。
38.根据权利要求37所述的药物组合物，其中所述组合物配制为用于静脉内给药。
39.一种治疗患有中枢神经系统癌症的患者的方法，所述方法包括：
识别需要治疗的患者；以及
向所述患者给予治疗有效量的根据权利要求37所述的药物组合物。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述患者是人类患者。
41.根据权利要求39所述的方法，其中所述癌症是脑瘤或脑转移瘤。
42.一种将抗体部分缀合至含有氨基酸序列Thr1-Phe2-Phe3-Tyr4-Gly5-Gly6-Cys7/Ser7-Arg8-Gly9-Lys10-Arg11-Asn12-Asn13-Phe14-Lys15-Thr16-Glu17-Glu18-Tyr19(SEQ ID NO:117)的多肽、或生物活性类似物或其片段的方法，所述方法包括：
(a)提供接头结合的抗体部分；
(b)提供改性形式的所述多肽；以及
(c)在产生包含所述抗体部分、所述接头和所述多肽的蛋白缀合物的条件下将所述接头结合的抗体部分暴露于改性形式的所述多肽。
43.根据权利要求42所述的方法，其中产生所述接头结合的抗体部分包括：
(a)提供所述抗体部分；以及
(b)在产生接头结合的抗体部分的条件下将所述抗体部分暴露于接头。
44.根据权利要求42所述的方法，其中产生改性形式的所述多肽包括：
(a)提供所述多肽；以及
(b)在产生改性多肽的条件下将所述多肽暴露于与所述接头具有反应活性的化学实体。
45.根据权利要求42或权利要求43所述的方法，其中所述接头含有环辛炔。
46.根据权利要求44所述的方法，其中与所述接头具有反应活性的所述化学实体包括叠氮基。
47.根据权利要求43所述的方法，其中所述接头是单氟环辛炔(MFCO)、双环[6.1.0]壬炔(BCN)、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基硫代乙酸酯(SATA)、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基硫代丙酸酯(SATP)、马来酰亚胺或二苯并环辛炔(DBCO)。
48.根据权利要求42所述的方法，其中将所述接头结合的抗体部分暴露于改性形式的所述多肽发生于室温下在限光环境中约8-24小时。
49.根据权利要求42所述的方法，进一步包括步骤(e)：通过柱色谱纯化所述缀合物。
50.根据权利要求49所述的方法，其中通过柱色谱纯化所述缀合物包括使所述缀合物通过蛋白A柱并用约pH 3.0的柠檬酸缓冲液洗脱所述缀合物。
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