CN105002213A - 一种不整合可删除新型非病毒载体及其构建方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种不整合可删除新型非病毒载体及其构建方法和用途。所述的非病毒载体包含S/MAR序列、SV40复制原点和Cre-ERT2表达序列，所述的S/MAR序列的上游和下游均具有一个loxP序列，且其中一个loxP序列位于S/MAR序列和SV40复制原点之间。本发明的非病毒载体能游离于基因组外，并伴随着细胞周期稳定遗传，不表达病毒蛋白，并且在适当的时候能通过Tamoxifen的诱导从细胞中删除，安全性更高，有利于促进诱导多功能干细胞技术和转分化技术早日应用于临床治疗。

Description

一种不整合可删除新型非病毒载体及其构建方法和用途

【技术领域】

本发明涉及生物领域的一种非病毒载体，具体地说，涉及一种不整合可删除非病毒载体及其构建方法和用途。

【背景技术】

如今，转基因技术不单单用于科学研究，还已经广泛应用于社会生产生活中。在诱导多功能干细胞技术及转分化技术发明以后，转基因技术大量应用于临床已是必然趋势。现在转基因技术用于临床的其中一个障碍就是安全性：首先，外源基因随机插入到基因组上，存在造成基因突变、基因沉默等潜在风险；其次，外源目的基因无法及时清除，特别是当目的基因具有成瘤作用时，这是非常危险的；最后，有的载体需要表达病毒蛋白，一些病毒蛋白本身具有致癌作用，并且有较高的免疫原性，在临床应用中受到很大限制。

转基因技术出现以后，研究者对转基因载体的安全性的提高一直做着不懈的努力。首先是一类以SV40、BPV、EBV病毒为基础的载体的出现。这类载体实现了在真核细胞中以游离基因的形式进行复制遗传，从而解决了载体基因在宿主细胞基因组中随机插入的难题。但是这类载体的复制都需要表达病毒来源的反式作用因子，而这类蛋白会转变宿主细胞，例如：基于SV40病毒的载体复制，需要表达大T抗原（其他蛋白由宿主细胞提供），而大T抗原能永生化原代细胞，在应用于动物时，就会导致肿瘤的发生。

1999年，H.J.Lipps实验室发现将人类来源的S/MAR元件替代了SV40大T抗原基因，而保留SV40的复制原点（origin），构建的载体pEPI-1仍然可以在CHO细胞中以游离基因的形式复制遗传，并且在没有抗性筛选的情况下，可以在CHO细胞中保留100代以上。S/MAR序列来源于人类β干扰素基因5’端支架粘连区，这类区域是典型的A/T富集序列，在维持染色体结构中起重要作用。pEPI-1经过了多次改善，都集中在精简序列和减少CpG原件上，从而提高载体的转染效率以及表达效率，如pEPito。后来H.J.Lipps实验室和Anthony Atala分别在动物实验以及人类诱导多功能干细胞中，验证了基于S/MAR-SV40-Origin系列载体的可行性。

作为不整合的非病毒载体，S/MAR-SV40-Origin载体已经提高了很大的安全性，但是仍然存在着隐患。在诱导体细胞重编程过程中为了提高表达效率和转化效率，常常会使用强启动子，而应用于临床需要重编程细胞再次分化，这时持续的表达分化早期的外源基因是我们不想看到的。

综上所述，还亟需构建一种更安全的转染载体，以促进诱导多功能干细胞技术和转分化技术早日应用于临床治疗。

【发明内容】

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种不整合可删除新型非病毒载体。

本发明的再一的目的是，提供一种如上所述的非病毒载体的构建方法。

本发明的另一的目的是，提供如上所述的非病毒载体的用途。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

一种不整合非病毒载体，所述的非病毒载体包含S/MAR序列、SV40复制原点和Cre-ERT2表达序列，所述的S/MAR序列的上游和下游分别具有一个loxP序列，两个loxP方向相同，且其中一个loxP序列位于S/MAR序列和SV40复制原点之间。

所述的非病毒载体还包括外源目的基因，优选的为EGFP。

所述的S/MAR序列、Cre-ERT2表达序列和外源目的基因共用启动子和终止子，所述的启动子优选为真核表达的启动子。

所述的Cre-ERT2表达序列与外源目的基因用IRES序列连接。

一个LoxP序列在所述启动子上游连接，另一loxP序列在S/MAR序列的下游连接。

所述的S/MAR序列如SEQ ID NO.6所示，所述的SV40复制原点的序列如SEQ ID NO.4所示，所述的Cre-ERT2表达序列如SEQ ID NO.2所示，所述的loxP序列与SEQ ID NO.8有85%-100%相似度，优选的LoxP序列如SEQ ID NO.8所示。

所述的非病毒载体是通过以下方法构建的：

a）从序列如SEQ ID NO.1所示的pEP4-Cre-EGFP质粒中克隆出Cre-ERT2-IRES-EGFP片段，

b）将Cre-ERT2-IRES-EGFP片段插入pcDNA3.1(-)质粒的CMV Promoter下游，得到pcDNA-Cre-EGFP质粒，

c）用EF1α Promoter替换pcDNA-Cre-EGFP中的CMV Promoter得到pECG质粒，

d）将S/MAR片段插入到pECG载体中，得到pECG-S/MAR质粒，

e）利用SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19所示的引物以pECG-S/MAR质粒为模板克隆出Afl II-LoxP片段，

f）将pECG-S/MAR质粒和Afl II-LoxP片段用Afl II和Xma I双酶切，分别得到pECG-S/MAR载体和Afl II-LoxP-XmaI片段，

g）将Afl II-LoxP-Xma I片段插入到pECG-S/MAR载体中，得到pECG-S/MAR-Afl IILoxP质粒，

h）用与步骤g）同样的方法将另一个loxP插入到pECG-S/MAR-Afl IILoxP质粒的EF1α promoter 5’端，得到pECG-S/MAR-LoxP。

所述的非病毒载体还具有药物筛选标记基因和/或实时筛选标记基因。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：

一种如上所述的非病毒载体的构建方法，包括以下步骤：将S/MAR序列、SV40复制原点、Cre-ERT2表达序列构建于骨架载体中，并于所述的S/MAR序列的上游和下游各插入一个loxP序列，同时保证其中一个loxP序列位于S/MAR序列和SV40复制原点之间。

为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：

如上任一所述的非病毒载体的用途，用于介导外源目的基因进入宿主细胞并在宿主细胞中表达。

本发明中，所述的“序列”、“表达序列”、“元件”、“基因”、“片段”可以互换使用；所述的Cre-ERT2即Cre recombinase - estrogen receptor T2，所述的Cre-ERT2表达序列、基因、元件或序列都为表达Cre-ERT2的多核苷酸序列；所述的S/MAR序列或元件，都为表达S/MAR的多核苷酸序列，其为人类来源，与SV40复制原点合用，能够保证载体不插入基因组内而实现表达和复制遗传。凡是可实现上述目的的S/MAR序列、SV40复制原点均包括在本发明的范围内。所述的“loxP” （locus of X-over P1）序列，来源于P1噬菌体，是由两个13bp反向重复序列和中间间隔8bp序列共同组成，8bp的间隔序列同时也确定了loxP 的方向。loxP序列包括如：ATAACTTCGTATA(13bp)-NNNTANNN(8bp)-TATACGAAGTTAT(13bp)所示序列，“N”表示任意核苷酸；所述loxP序列还可包括上述一个13bp的反向重复序列或8bp的间隔序列突变的序列，例如下表中所列序列：

所述的Cre-ERT2表达序列能表达Cre-ERT2蛋白，用Tamoxifen处理后，Cre-ERT2蛋白会入核特异性诱导S/MAR序列两侧的同向的loxP序列重组，使S/MAR序列与SV40复制原点分离，从而使得本发明的非病毒载体失去复制遗传功能。所述的“S/MAR序列的上游和下游分别具有一个loxP序列”是指两个loxP序列分别位于S/MAR序列的上游和下游，两个loxP方向相同，而且两个loxP序列并不是必须与S/MAR基因片段的上、下游序列紧密相连，其和S/MAR序列之间还可包含其它片段，只要能保证两个loxP序列重组后S/MAR序列与SV40复制原点分离。所述的S/MAR序列、SV40复制原点、Cre-ERT2表达序列、loxP序列的具体核苷酸序列均不限于本发明的实施例，通常优选其与本发明实施例中所示的序列具有85%-100%的相似度。为保证构建的非病毒载体的转染效率和兼顾构建载体的便利性，所述的S/MAR序列、Cre-ERT2表达序列和外源目的基因可共用启动子和终止子，如本发明中共用EF1α Promoter和BGH pA，但是显然的，三者可分别具有各自的启动子和终止子。所用的启动子优选为真核表达的启动子，如EF1α Promoter，保证其在真核生物体内能启动编码区的转录。优选地，所述的Cre-ERT2表达序列位于外源目的基因上游，且二者之间设有IRES序列，IRES 是核糖体结合序列，所以转录出来是一条RNA，保证表达出来的是Cre-ERT2蛋白和外源目的蛋白，而不是融合蛋白。所述的药物筛选标记基因可以是Amp基因、卡那霉素基因等，所述的实时筛选标记基因为EGFP基因、GFP基因等。所述的“骨架载体”是指基本表达载体，在表达载体构建过程中，我们通常选择一个载体作为骨架载体，发挥基本骨架的作用，将其它目的片段依次连接入该骨架载体中。本发明的非病毒载体可用于介导外源目的基因进入宿主细胞并在宿主细胞中表达，该用途优选为非治疗目的的，如利用本发明的非病毒载体携带外源目的目的基因进入宿主细胞表达，然而这种做法并不是直接用于疾病诊断或治疗，又如将本发明的非病毒载体用于制备介导外源目的基因进入宿主细胞并在宿主细胞中表达的产品。所述的“外源目的基因”是指可用于表达目的蛋白的基因，例如可表达实时筛选标记蛋白、对靶细胞生理生化或基因表达产生影响的蛋白等。

本发明优点在于：

本发明将人源的染色体支架/基质粘区S/MAR序列，以及Cre-ERT2表达序列、LoxP序列等整合到载体上，该载体能游离于基因组外，并伴随着细胞周期稳定遗传，不表达病毒蛋白，并且在适当的时候能通过Tamoxifen的诱导从细胞中删除，安全性更高。以往基因治疗大都是针对基因缺陷的，研究者关注更多的是怎样能让外源基因持久表达，通常不考虑怎样删除，本发明弥补了该方面的不足。

作为本发明的一个实施例，以pcDNA-3.1为骨架，克服了loxP序列在插入到载体时容易形成发卡结构等困难，同时两个loxP序列之间的距离设置合理，成功构建了pECG-S/MAR-LoxP载体。在正常的培养条件下，由于S/MAR-SV40-origin的作用，载体能够不插入基因组内而实现表达和复制遗传。而用Tamoxifen处理后，Cre-ERT2蛋白会入核特异性诱导S/MAR序列两侧的同向的loxP序列重组，使S/MAR序列与SV40-origin分离，从而实现整个载体在细胞中删除。我们将载体转染到了HEK293细胞中并成功得到了稳转细胞系。稳转细胞系在没有抗性筛选压力情况下可以稳定表达GFP100代以上并且可以冻存和复苏。稳转细胞系在Tamoxifen处理后，载体有较高的删除效率，在第五天GFP阴性率已经超过50%。

本发明构建的更安全的转染载体将促进诱导多功能干细胞技术和转分化技术早日应用于临床治疗。

【附图说明】

图1、pEP4 EO2S EN2K质粒图谱。

图2、pEP4-Cre-EGFP质粒图谱。

图3、pcDNA3.1(-)质粒图谱。

图4、pcDNA-Cre-EGFP质粒图谱。

图5、显示酶切位点的pEP4-Cre-EGFP质粒图谱。

图6、pECG质粒图谱。

图7、pECG、pECG-S/MAR、pECG-S/MAR-LOXP质粒酶切鉴定，1、2、3分别为pECG-S/MAR-LOXP、pECG、pECG-S/MAR经Hind III酶切后的结果。

图8、pECG-S/MAR质粒图谱。

图9、pECG-S/MAR-LoxP质粒图谱。

图10、pECG、pECG-S/MAR、pECG-S/MAR-LoxP转染HEK293的转染效率及筛选2周后，细胞的GFP阳性率。上排为转染48小时的结果，下排为筛选2周后结果。

图11、pECG-S/MAR-LoxP转染的HEK293细胞在冻存前及复苏后GFP阳性率的变化。

图12、Tamoxifen处理后，第二天到第五天GFP阳性细胞的变化。

【具体实施方式】

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1

1、构建pEP4-Cre-EGFP质粒

1）利用附表 1中的引物IRES-EGFP-S和IRES-EGFP-AS，以LV-EF1α-IRES-EGFP为模板克隆出IRES-EGFP片段。

 

用PCR回收试剂盒回收PCR的IRES-EGFP片段。

2）将回收的IRES-EGFP片段用BamH I和Asc I双酶切。

37℃保温，酶切6小时。用PCR回收试剂盒回收酶切片段。

3）利用附表 1中的引物Cre-ERT2-S和Cre-ERT2-AS，以Cre-ERT2小鼠鼠尾DNA为模板克隆出Cre-ERT2片段。

用PCR回收试剂盒回收PCR的Cre-ERT2片段。

4）将回收的Cre-ERT2片段用HindIII和Asc I双酶切。

37℃保温，酶切6小时。用PCR回收试剂盒回收酶切片段。

5）将pEP4 EO2S EN2K质粒（质粒图谱见图1）用Hind III和BamH I双酶切。

37 ℃保温，酶切6小时。回收酶切产物pEP4片段（8510bp）。

6）将以上2）、4）、5）步骤得到的酶切片段用T4连接酶连接。

16℃反应4h后，取3μl连接产物转化TBE180感受态细胞，37℃培养14h，挑取单克隆，抽取质粒pEP4-Cre-EGFP，并通过酶切验证（pEP4-Cre-EGFP质粒图谱见图2，质粒序列如SEQ ID NO.1所示）。

、构建pECG、pECG-S/MAR、pECG-S/MAR-loxP质粒

1）利用附表 1中的引物Cre-EGFP-S和Cre-EGFP-AS，以上述构建的pEP4-Cre-EGFP质粒为模板克隆出Cre-ERT2-IRES-EGFP片段（最终连入载体中的Cre-ERT2片段序列如SEQ ID NO.2所示）。

2）利用PCR回收试剂盒回收PCR的Cre-ERT2-IRES-EGFP片段。

3）将第2）步得到的Cre-ERT2-IRES-EGFP片段连接至pEASY-Blunt载体（购于全式金公司）中，得到pEASY-Cre-EGFP质粒。

室温反应25mins后，取3μl连接产物转化E.coli DH5ɑ感受态细胞，37℃培养14h，挑取单克隆，抽取质粒，测序验证。

4）将pEASY-Cre-EGFP和 pcDNA3.1(-)质粒（质粒图谱见图3，质粒序列如SEQ ID NO.3所示，该质粒自带SV40 origin，SV40 origin序列如SEQ ID NO.4所示）用Not I和Nhe I双酶切。

37 ℃保温，酶切6小时。

37 ℃保温，酶切6小时。

回收酶切产物Cre-ERT2-IRES-EGFP片段与pcDNA3.1(-)载体。

5）将Cre-ERT2-IRES-EGFP片段插入到pcDNA3.1(-)中得到pcDNA-Cre-EGFP质粒（质粒图谱见图4）。

16℃反应4h后，取3μl连接产物转化E.coli DH5ɑ感受态细胞，37℃培养14h，挑取单克隆，抽取质粒，并通过酶切验证。

6）将pcDNA-Cre-EGFP用Xba I和Mfe I双酶切，将pEP4-Cre-EGFP（显示酶切位点的质粒图谱见图5）用Xba I和Mfe I双酶切得到EF1α Promoter片段。

37 ℃保温，酶切6小时。

37 ℃保温，酶切6小时。

回收酶切产物EF1α Promoter片段和pcDNA-Cre-EGFP载体。

7）用EF1α Promoter（最终连入载体的EF1α Promoter的序列如SEQ ID NO.5所示）替换pcDNA-Cre-EGFP中的CMV Promoter得到pECG（质粒图谱见图6）。

16℃反应4h后，取3μl连接产物转化TBE180感受态细胞，37℃培养14h，挑取单克隆，抽取质粒，并通过酶切验证，酶切结果见图7。

8）利用附表 1中的引物S/MAR-AS1和S/MAR-Ps，以293T细胞基因组DNA为模板克隆出S/MAR片段。

利用PCR回收试剂盒回收PCR的S/MAR片段。

9）将pECG和S/MAR片段用EcoR I和Not I双酶切，分别得到pECG载体和S/MAR片段（其中最终连入到载体中的S/MAR片段的序列如SEQ ID NO.6所示）。

37℃保温，酶切6小时。

37 ℃保温，酶切6小时。

回收酶切产物pECG载体和S/MAR片段。

10）将S/MAR片段插入到pECG载体中，得到pECG-S/MAR质粒（质粒图谱见图8）。

16℃反应4h后，取3μl连接产物转化TB4180感受态细胞，37℃培养14h，挑取单克隆，抽取质粒，并通过酶切验证，酶切结果见图7。

11）利用附表 1中的引物Afl II-LoxP和Neo-BX-AS，以pECG-S/MAR为模板克隆出Afl II-LoxP片段。

利用PCR回收试剂盒回收PCR的Afl II-LoxP片段。

12）将pECG-S/MAR质粒和Afl II-LoxP片段用Afl II和Xma I双酶切，分别得到pECG-S/MAR载体和Afl II-LoxP-XmaI片段（Afl II-LoxP-XmaI片段序列如SEQ ID NO.7所示，其中第6-39位核苷酸为LoxP序列：ataacttcgtatagcatacattatacgaagttat，记为SEQ ID NO.8）。

37℃保温，酶切6小时。

37℃保温，酶切6小时。

回收酶切产物pECG-S/MAR载体和Afl II-LoxP-Xma I片段。

13）将Afl II-LoxP-Xma I片段插入到pECG-S/MAR载体中，得到pECG-S/MAR-Afl IILoxP质粒。

16℃反应4h后，取3μl连接产物转化TB4180感受态细胞，37℃培养14h，挑取单克隆，抽取质粒，并通过酶切验证。

14）用同样的方法将另一个loxP（此处含有loxP片段的序列如SEQ ID NO.9所示，其中第6-39位核苷酸为LoxP序列：ataacttcgtatagcatacattatacgaagttat）插入到pECG-S/MAR-Afl IILoxP质粒的EF1α promoter 5’端，得到pECG-S/MAR-LoxP（质粒图谱见图9），并通过酶切及测序验证，酶切结果见图7。

、筛选pECG-S/MAR-LoxP等载体稳转细胞系

1）在转染前一天铺适量的 HEK293细胞于6-well-dish中。

2）待细胞密度达到80%时，用FuGen-HD将pECG-S/MAR-LoxP转到HEK293细胞中，并用pECG及pECG-S/MAR作为对照。

3）在转染48小时后收集细胞，取部分细胞，用流式细胞仪检测转染效率（图10），发现S/MAR及loxP对质粒转染效率影响不是很大。

4）余下细胞开始用含有500μg/ml G418的培养基筛选。

5）在筛选两周后用流式细胞仪再次检测GFP阳性细胞（图10），这时发现GFP阳性细胞GFP的表达水平趋于一致，转染pECG-S/MAR和pECG-S/MAR-LOXP的细胞的GFP阳性率分别为31.8%和23.8%，高于转染了不含S/MAR序列的pECG的细胞的阳性率15.1%。

6）在筛选三周后，收集细胞，用流式细胞仪分选出GFP阳性的细胞群。分选得到大约3×10⁵个细胞，继续在含有500μg/ml G418的培养基中培养。

、pECG-S/MAR-LoxP稳转细胞系的冻存与复苏

1）取一个长满的10cm培养皿，消化细胞，将细胞收集于15ml离心管。

2）1000rpm离心5分钟，弃上清液。

3）加入8ml PBS，重新悬浮细胞，留样检测GFP阳性率，重复第2步。

4）加入1.5ml培养基重新悬浮细胞。

5）配制2x冻存液：取0.3ml DMSO溶于1.2ml FBS中。

6）将2x冻存液缓缓加入细胞悬浮液中，轻轻混合。DMSO终浓度为10%。

7）将3ml混合液分装到3支冻存管中，每管1ml。

8）将冻存管放入冻存盒中，放人-80℃冰箱。

9）1个月后复苏细胞。

10）取一支冻存的细胞，在37℃水浴中迅速融化。

11）将细胞悬浮液转移至15ml离心管中，稀释于10ml培养液。

12）1000rpm离心5分钟，弃上清液。

13）用5ml培养液重新悬浮细胞，转移至10cm培养皿中，补助培养基。

14）第二天，弃上清，加入新鲜培养基。

15）第三天，细胞传代，并留样检测GFP阳性率。细胞冻存前有96.3%的阳性率，复苏后仍然有93.1%GFP阳性率，见图11。

、检验在Tamoxifen处理下载体pECG-S/MAR-LoxP在细胞中的删除效率

1）铺5×10⁴个每孔的GFP阳性细胞于24-well-dish，用不含G418的基础培养基培养。

2）Tamoxifen预先溶于无水乙醇中，配制成2mg/ml的溶液。以1:1000的比例加入到培养基中，使终浓度为2μg/ml。

3）6小时后，弃掉上清，加入新鲜培养基。

48小时后，每24小时收集细胞检测GFP阳性率一次，连续检测4天（图12）。从图中我们可以看到，pECG-S/MAR-LoxP转染的细胞从第二天开始逐渐从GFP阳性向阴性偏移并且最终成为GFP阴性细胞，而这种现象在另外两个对照组中没有观察到。

附表1 引物序列

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110>  中国科学院上海巴斯德研究所

<120>  一种不整合可删除新型非病毒载体及其构建方法和用途

<130>  /

<160>  19   

<170>  PatentIn version 3.3

<210>  1

<211>  11840

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  1

gctagcggct ccggtgcccg tcagtgggca gagcgcacat cgcccacagt ccccgagaag     60

ttggggggag gggtcggcaa ttgaaccggt gcctagagaa ggtggcgcgg ggtaaactgg    120

gaaagtgatg tcgtgtactg gctccgcctt tttcccgagg gtgggggaga accgtatata    180

agtgcagtag tcgccgtgaa cgttcttttt cgcaacgggt ttgccgccag aacacaggta    240

agtgccgtgt gtggttcccg cgggcctggc ctctttacgg gttatggccc ttgcgtgcct    300

tgaattactt ccacctggct ccagtacgtg attcttgatc ccgagctgga gccaggggcg    360

ggccttgcgc tttaggagcc ccttcgcctc gtgcttgagt tgaggcctgg cctgggcgct    420

ggggccgccg cgtgcgaatc tggtggcacc ttcgcgcctg tctcgctgct ttcgataagt    480

ctctagccat ttaaaatttt tgatgacctg ctgcgacgct ttttttctgg caagatagtc    540

ttgtaaatgc gggccaggat ctgcacactg gtatttcggt ttttgggccc gcggccggcg    600

acggggcccg tgcgtcccag cgcacatgtt cggcgaggcg gggcctgcga gcgcggccac    660

cgagaatcgg acgggggtag tctcaagctg gccggcctgc tctggtgcct ggcctcgcgc    720

cgccgtgtat cgccccgccc tgggcggcaa ggctggcccg gtcggcacca gttgcgtgag    780

cggaaagatg gccgcttccc ggccctgctc cagggggctc aaaatggagg acgcggcgct    840

cgggagagcg ggcgggtgag tcacccacac aaaggaaaag ggcctttccg tcctcagccg    900

tcgcttcatg tgactccacg gagtaccggg cgccgtccag gcacctcgat tagttctgga    960

gcttttggag tacgtcgtct ttaggttggg gggaggggtt ttatgcgatg gagtttcccc   1020

acactgagtg ggtggagact gaagttaggc cagcttggca cttgatgtaa ttctcgttgg   1080

aatttgccct ttttgagttt ggatcttggt tcattctcaa gcctcagaca gtggttcaaa   1140

gtttttttct tccatttcag gtgtcgtgaa cacgtggtcg cggccaattc tgcagtcgag   1200

ctcaagcttc ctgcaggccg ccaccatgtc caatttactg accgtacacc aaaatttgcc   1260

tgcattaccg gtcgatgcaa cgagtgatga ggttcgcaag aacctgatgg acatgttcag   1320

ggatcgccag gcgttttctg agcatacctg gaaaatgctt ctgtccgttt gccggtcgtg   1380

ggcggcatgg tgcaagttga ataaccggaa atggtttccc gcagaacctg aagatgttcg   1440

cgattatctt ctatatcttc aggcgcgcgg tctggcagta aaaactatcc agcaacattt   1500

gggccagcta aacatgcttc atcgtcggtc cgggctgcca cgaccaagtg acagcaatgc   1560

tgtttcactg gttatgcggc ggatccgaaa agaaaacgtt gatgccggtg aacgtgcaaa   1620

acaggctcta gcgttcgaac gcactgattt cgaccaggtt cgttcactca tggaaaatag   1680

cgatcgctgc caggatatac gtaatctggc atttctgggg attgcttata acaccctgtt   1740

acgtatagcc gaaattgcca ggatcagggt taaagatatc tcacgtactg acggtgggag   1800

aatgttaatc catattggca gaacgaaaac gctggttagc accgcaggtg tagagaaggc   1860

acttagcctg ggggtaacta aactggtcga gcgatggatt tccgtctctg gtgtagctga   1920

tgatccgaat aactacctgt tttgccgggt cagaaaaaat ggtgttgccg cgccatctgc   1980

caccagccag ctatcaactc gcgccctgga agggattttt gaagcaactc atcgattgat   2040

ttacggcgct aaggatgact ctggtcagag atacctggcc tggtctggac acagtgcccg   2100

tgtcggagcc gcgcgagata tggcccgcgc tggagtttca ataccggaga tcatgcaagc   2160

tggtggctgg accaatgtaa atattgtcat gaactatatc cgtaacctgg atagtgaaac   2220

aggggcaatg gtgcgcctgc tggaagatgg cgatctcgag ccatctgctg gagacatgag   2280

agctgccaac ctttggccaa gcccgctcat gatcaaacgc tctaagaaga acagcctggc   2340

cttgtccctg acggccgacc agatggtcag tgccttgttg gatgctgagc cccccatact   2400

ctattccgag tatgatccta ccagaccctt cagtgaagct tcgatgatgg gcttactgac   2460

caacctggca gacagggagc tggttcacat gatcaactgg gcgaagaggg tgccaggctt   2520

tgtggatttg accctccatg atcaggtcca ccttctagaa tgtgcctggc tagagatcct   2580

gatgattggt ctcgtctggc gctccatgga gcacccagtg aagctactgt ttgctcctaa   2640

cttgctcttg gacaggaacc agggaaaatg tgtagagggc atggtggaga tcttcgacat   2700

gctgctggct acatcatctc ggttccgcat gatgaatctg cagggagagg agtttgtgtg   2760

cctcaaatct attattttgc ttaattctgg agtgtacaca tttctgtcca gcaccctgaa   2820

gtctctggaa gagaaggacc atatccaccg agtcctggac aagatcacag acactttgat   2880

ccacctgatg gccaaggcag gcctgaccct gcagcagcag caccagcggc tggcccagct   2940

cctcctcatc ctctcccaca tcaggcacat gagtaacaaa ggcatggagc atctgtacag   3000

catgaagtgc aagaacgtgg tgcccctcta tgacctgctg ctggaggcgg cggacgccca   3060

ccgcctacat gcgcccacta gccgtggagg ggcatccgtg gaggagacgg accaaagcca   3120

cttggccact gcgggctcta cttcatcgca ttccttgcaa aagtattaca tcacggggga   3180

ggcagagggt ttccctgcca cagcttgagg cgcgcccctc tccctccccc ccccctaacg   3240

ttactggccg aagccgcttg gaataaggcc ggtgtgcgtt tgtctatatg ttattttcca   3300

ccatattgcc gtcttttggc aatgtgaggg cccggaaacc tggccctgtc ttcttgacga   3360

gcattcctag gggtctttcc cctctcgcca aaggaatgca aggtctgttg aatgtcgtga   3420

aggaagcagt tcctctggaa gcttcttgaa gacaaacaac gtctgtagcg accctttgca   3480

ggcagcggaa ccccccacct ggcgacaggt gcctctgcgg ccaaaagcca cgtgtataag   3540

atacacctgc aaaggcggca caaccccagt gccacgttgt gagttggata gttgtggaaa   3600

gagtcaaatg gctctcctca agcgtattca acaaggggct gaaggatgcc cagaaggtac   3660

cccattgtat gggatctgat ctggggcctc ggtacacatg ctttacatgt gtttagtcga   3720

ggttaaaaaa acgtctaggc cccccgaacc acggggacgt ggttttcctt tgaaaaacac   3780

gatgataata tggccacaac ccatggtgag caagggcgag gagctgttca ccggggtggt   3840

gcccatcctg gtcgagctgg acggcgacgt aaacggccac aagttcagcg tgtccggcga   3900

gggcgagggc gatgccacct acggcaagct gaccctgaag ttcatctgca ccaccggcaa   3960

gctgcccgtg ccctggccca ccctcgtgac caccctgacc tacggcgtgc agtgcttcag   4020

ccgctacccc gaccacatga agcagcacga cttcttcaag tccgccatgc ccgaaggcta   4080

cgtccaggag cgcaccatct tcttcaagga cgacggcaac tacaagaccc gcgccgaggt   4140

gaagttcgag ggcgacaccc tggtgaaccg catcgagctg aagggcatcg acttcaagga   4200

ggacggcaac atcctggggc acaagctgga gtacaactac aacagccaca acgtctatat   4260

catggccgac aagcagaaga acggcatcaa ggtgaacttc aagatccgcc acaacatcga   4320

ggacggcagc gtgcagctcg ccgaccacta ccagcagaac acccccatcg gcgacggccc   4380

cgtgctgctg cccgacaacc actacctgag cacccagtcc gccctgagca aagaccccaa   4440

cgagaagcgc gatcacatgg tcctgctgga gttcgtgacc gccgccggga tcactctcgg   4500

catggacgag ctgtacaagt aagtcgacgg atccgatcca gacatgataa gatacattga   4560

tgagtttgga caaaccacaa ctagaatgca gtgaaaaaaa tgctttattt gtgaaatttg   4620

tgatgctatt gctttatttg taaccattat aagctgcaat aaacaagtta acaacaacaa   4680

ttgcattcat tttatgtttc aggttcaggg ggaggtgtgg gaggtttttt aaagcaagta   4740

aaacctctac aaatgtggta tggctgatta tgatccggct gcctcgcgcg tttcggtgat   4800

gacggtgaaa acctctgaca catgcagctc ccggagacgg tcacagcttg tctgtaagcg   4860

gatgccggga gcagacaagc ccgtcaggcg tcagcgggtg ttggcgggtg tcggggcgca   4920

gccatgaggt cgatcgactc tagctagagg atcgatgccc cgccccggac gaactaaacc   4980

tgactacgac atctctgccc cttcttcgcg gggcagtgca tgtaatccct tcagttggtt   5040

ggtacaactt gccaactggg ccctgttcca catgtgacac ggggggggac caaacacaaa   5100

ggggttctct gactgtagtt gacatcctta taaatggatg tgcacatttg ccaacactga   5160

gtggctttca tcctggagca gactttgcag tctgtggact gcaacacaac attgccttta   5220

tgtgtaactc ttggctgaag ctcttacacc aatgctgggg gacatgtacc tcccaggggc   5280

ccaggaagac tacgggaggc tacaccaacg tcaatcagag gggcctgtgt agctaccgat   5340

aagcggaccc tcaagagggc attagcaata gtgtttataa ggcccccttg ttaaccctaa   5400

acgggtagca tatgcttccc gggtagtagt atatactatc cagactaacc ctaattcaat   5460

agcatatgtt acccaacggg aagcatatgc tatcgaatta gggttagtaa aagggtccta   5520

aggaacagcg atatctccca ccccatgagc tgtcacggtt ttatttacat ggggtcagga   5580

ttccacgagg gtagtgaacc attttagtca caagggcagt ggctgaagat caaggagcgg   5640

gcagtgaact ctcctgaatc ttcgcctgct tcttcattct ccttcgttta gctaatagaa   5700

taactgctga gttgtgaaca gtaaggtgta tgtgaggtgc tcgaaaacaa ggtttcaggt   5760

gacgccccca gaataaaatt tggacggggg gttcagtggt ggcattgtgc tatgacacca   5820

atataaccct cacaaacccc ttgggcaata aatactagtg taggaatgaa acattctgaa   5880

tatctttaac aatagaaatc catggggtgg ggacaagccg taaagactgg atgtccatct   5940

cacacgaatt tatggctatg ggcaacacat aatcctagtg caatatgata ctggggttat   6000

taagatgtgt cccaggcagg gaccaagaca ggtgaaccat gttgttacac tctatttgta   6060

acaaggggaa agagagtgga cgccgacagc agcggactcc actggttgtc tctaacaccc   6120

ccgaaaatta aacggggctc cacgccaatg gggcccataa acaaagacaa gtggccactc   6180

ttttttttga aattgtggag tgggggcacg cgtcagcccc cacacgccgc cctgcggttt   6240

tggactgtaa aataagggtg taataacttg gctgattgta accccgctaa ccactgcggt   6300

caaaccactt gcccacaaaa ccactaatgg caccccgggg aatacctgca taagtaggtg   6360

ggcgggccaa gataggggcg cgattgctgc gatctggagg acaaattaca cacacttgcg   6420

cctgagcgcc aagcacaggg ttgttggtcc tcatattcac gaggtcgctg agagcacggt   6480

gggctaatgt tgccatgggt agcatatact acccaaatat ctggatagca tatgctatcc   6540

taatctatat ctgggtagca taggctatcc taatctatat ctgggtagca tatgctatcc   6600

taatctatat ctgggtagta tatgctatcc taatttatat ctgggtagca taggctatcc   6660

taatctatat ctgggtagca tatgctatcc taatctatat ctgggtagta tatgctatcc   6720

taatctgtat ccgggtagca tatgctatcc taatagagat tagggtagta tatgctatcc   6780

taatttatat ctgggtagca tatactaccc aaatatctgg atagcatatg ctatcctaat   6840

ctatatctgg gtagcatatg ctatcctaat ctatatctgg gtagcatagg ctatcctaat   6900

ctatatctgg gtagcatatg ctatcctaat ctatatctgg gtagtatatg ctatcctaat   6960

ttatatctgg gtagcatagg ctatcctaat ctatatctgg gtagcatatg ctatcctaat   7020

ctatatctgg gtagtatatg ctatcctaat ctgtatccgg gtagcatatg ctatcctcat   7080

gcatatacag tcagcatatg atacccagta gtagagtggg agtgctatcc tttgcatatg   7140

ccgccacctc ccaagggggc gtgaattttc gctgcttgtc cttttcctgc tggttgctcc   7200

cattcttagg tgaatttaag gaggccaggc taaagccgtc gcatgtctga ttgctcgaat   7260

tcaccaggta aatgtcgcta atgttttcca acgcgagaag gtgttgagcg cggagctgag   7320

tgacgtgaca acatgggtat gcccaattgc cccatgttgg gaggacgaaa atggtgacaa   7380

gacagatggc cagaaataca ccaacagcac gcatgatgtc tactggggat ttattcttta   7440

gtgcggggga atacacggct tttaatacga ttgagggcgt ctcctaacaa gttacatcac   7500

tcctgccctt cctcaccctc atctccatca cctccttcat ctccgtcatc tccgtcatca   7560

ccctccgcgg cagccccttc caccataggt ggaaaccagg gaggcaaatc tactccatcg   7620

tcaaagctgc acacagtcac cctgatattg caggtaggag cgggctttgt cataacaagg   7680

tccttaatcg catccttcaa aacctcagca aatatatgag tttgtaaaaa gaccatgaaa   7740

taacagacaa tggactccct tagcgggcca ggttgtgggc cgggtccagg ggccattcca   7800

aaggggagac gactcaatgg tgtaagacga cattgtggaa tagcaagggc agttcctcgc   7860

cttaggttgt aaagggaggt cttactacct ccatatacga acacaccggc gacccaagtt   7920

ccttcgtcgg tagtcctttc tacgtgactc ctagccagga gagctcttaa accttctgca   7980

atgttctcaa atttcgggtt ggaacctcct tgaccacgat gctttccaaa ccaccctcct   8040

tttttgcgcc tgcctccatc accctgaccc cggggtccag tgcttgggcc ttctcctggg   8100

tcatctgcgg ggccctgctc tatcgctccc gggggcacgt caggctcacc atctgggcca   8160

ccttcttggt ggtattcaaa ataatcggct tcccctacag ggtggaaaaa tggccttcta   8220

cctggagggg gcctgcgcgg tggagacccg gatgatgatg actgactact gggactcctg   8280

ggcctctttt ctccacgtcc acgacctctc cccctggctc tttcacgact tccccccctg   8340

gctctttcac gtcctctacc ccggcggcct ccactacctc ctcgaccccg gcctccacta   8400

cctcctcgac cccggcctcc actgcctcct cgaccccggc ctccacctcc tgctcctgcc   8460

cctcctgctc ctgcccctcc tcctgctcct gcccctcctg cccctcctgc tcctgcccct   8520

cctgcccctc ctgctcctgc ccctcctgcc cctcctgctc ctgcccctcc tgcccctcct   8580

cctgctcctg cccctcctgc ccctcctcct gctcctgccc ctcctgcccc tcctgctcct   8640

gcccctcctg cccctcctgc tcctgcccct cctgcccctc ctgctcctgc ccctcctgct   8700

cctgcccctc ctgctcctgc ccctcctgct cctgcccctc ctgcccctcc tgcccctcct   8760

cctgctcctg cccctcctgc tcctgcccct cctgcccctc ctgcccctcc tgctcctgcc   8820

cctcctcctg ctcctgcccc tcctgcccct cctgcccctc ctcctgctcc tgcccctcct   8880

gcccctcctc ctgctcctgc ccctcctcct gctcctgccc ctcctgcccc tcctgcccct   8940

cctcctgctc ctgcccctcc tgcccctcct cctgctcctg cccctcctcc tgctcctgcc   9000

cctcctgccc ctcctgcccc tcctcctgct cctgcccctc ctcctgctcc tgcccctcct   9060

gcccctcctg cccctcctgc ccctcctcct gctcctgccc ctcctcctgc tcctgcccct   9120

cctgctcctg cccctcccgc tcctgctcct gctcctgttc caccgtgggt ccctttgcag   9180

ccaatgcaac ttggacgttt ttggggtctc cggacaccat ctctatgtct tggccctgat   9240

cctgagccgc ccggggctcc tggtcttccg cctcctcgtc ctcgtcctct tccccgtcct   9300

cgtccatggt tatcaccccc tcttctttga ggtccactgc cgccggagcc ttctggtcca   9360

gatgtgtctc ccttctctcc taggccattt ccaggtcctg tacctggccc ctcgtcagac   9420

atgattcaca ctaaaagaga tcaatagaca tctttattag acgacgctca gtgaatacag   9480

ggagtgcaga ctcctgcccc ctccaacagc ccccccaccc tcatcccctt catggtcgct   9540

gtcagacaga tccaggtctg aaaattcccc atcctccgaa ccatcctcgt cctcatcacc   9600

aattactcgc agcccggaaa actcccgctg aacatcctca agatttgcgt cctgagcctc   9660

aagccaggcc tcaaattcct cgtccccctt tttgctggac ggtagggatg gggattctcg   9720

ggacccctcc tcttcctctt caaggtcacc agacagagat gctactgggg caacggaaga   9780

aaagctgggt gcggcctgtg aggatcagct tatcgatgat aagctgtcaa acatgagaat   9840

taattcttga agacgaaagg gcctcgtgat acgcctattt ttataggtta atgtcatgat   9900

aataatggtt tcttagacgt caggtggcac ttttcgggga aatgtgcgcg gaacccctat   9960

ttgtttattt ttctaaatac attcaaatat gtatccgctc atgagacaat aaccctgata  10020

aatgcttcaa taatattgaa aaaggaagag tatgagtatt caacatttcc gtgtcgccct  10080

tattcccttt tttgcggcat tttgccttcc tgtttttgct cacccagaaa cgctggtgaa  10140

agtaaaagat gctgaagatc agttgggtgc acgagtgggt tacatcgaac tggatctcaa  10200

cagcggtaag atccttgaga gttttcgccc cgaagaacgt tttccaatga tgagcacttt  10260

taaagttctg ctatgtggcg cggtattatc ccgtgttgac gccgggcaag agcaactcgg  10320

tcgccgcata cactattctc agaatgactt ggttgagtac tcaccagtca cagaaaagca  10380

tcttacggat ggcatgacag taagagaatt atgcagtgct gccataacca tgagtgataa  10440

cactgcggcc aacttacttc tgacaacgat cggaggaccg aaggagctaa ccgctttttt  10500

gcacaacatg ggggatcatg taactcgcct tgatcgttgg gaaccggagc tgaatgaagc  10560

cataccaaac gacgagcgtg acaccacgat gcctgcagca atggcaacaa cgttgcgcaa  10620

actattaact ggcgaactac ttactctagc ttcccggcaa caattaatag actggatgga  10680

ggcggataaa gttgcaggac cacttctgcg ctcggccctt ccggctggct ggtttattgc  10740

tgataaatct ggagccggtg agcgtgggtc tcgcggtatc attgcagcac tggggccaga  10800

tggtaagccc tcccgtatcg tagttatcta cacgacgggg agtcaggcaa ctatggatga  10860

acgaaataga cagatcgctg agataggtgc ctcactgatt aagcattggt aactgtcaga  10920

ccaagtttac tcatatatac tttagattga tttaaaactt catttttaat ttaaaaggat  10980

ctaggtgaag atcctttttg ataatctcat gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt  11040

ccactgagcg tcagaccccg tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc ctttttttct  11100

gcgcgtaatc tgctgcttgc aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg tttgtttgcc  11160

ggatcaagag ctaccaactc tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc  11220

aaatactgtc cttctagtgt agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc  11280

gcctacatac ctcgctctgc taatcctgtt accagtggct gctgccagtg gcgataagtc  11340

gtgtcttacc gggttggact caagacgata gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg  11400

aacggggggt tcgtgcacac agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg aactgagata  11460

cctacagcgt gagctatgag aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg cggacaggta  11520

tccggtaagc ggcagggtcg gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag ggggaaacgc  11580

ctggtatctt tatagtcctg tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc gatttttgtg  11640

atgctcgtca ggggggcgga gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct ttttacggtt  11700

cctggccttt tgctggcctt gaagctgtcc ctgatggtcg tcatctacct gcctggacag  11760

catggcctgc aacgcgggca tcccgatgcc gccggaagcg agaagaatca taatggggaa  11820

ggccatccag cctcgcgtcg                                              11840

<210>  2

<211>  3313

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  2

cctgcaggcc gccaccatgt ccaatttact gaccgtacac caaaatttgc ctgcattacc     60

ggtcgatgca acgagtgatg aggttcgcaa gaacctgatg gacatgttca gggatcgcca    120

ggcgttttct gagcatacct ggaaaatgct tctgtccgtt tgccggtcgt gggcggcatg    180

gtgcaagttg aataaccgga aatggtttcc cgcagaacct gaagatgttc gcgattatct    240

tctatatctt caggcgcgcg gtctggcagt aaaaactatc cagcaacatt tgggccagct    300

aaacatgctt catcgtcggt ccgggctgcc acgaccaagt gacagcaatg ctgtttcact    360

ggttatgcgg cggatccgaa aagaaaacgt tgatgccggt gaacgtgcaa aacaggctct    420

agcgttcgaa cgcactgatt tcgaccaggt tcgttcactc atggaaaata gcgatcgctg    480

ccaggatata cgtaatctgg catttctggg gattgcttat aacaccctgt tacgtatagc    540

cgaaattgcc aggatcaggg ttaaagatat ctcacgtact gacggtggga gaatgttaat    600

ccatattggc agaacgaaaa cgctggttag caccgcaggt gtagagaagg cacttagcct    660

gggggtaact aaactggtcg agcgatggat ttccgtctct ggtgtagctg atgatccgaa    720

taactacctg ttttgccggg tcagaaaaaa tggtgttgcc gcgccatctg ccaccagcca    780

gctatcaact cgcgccctgg aagggatttt tgaagcaact catcgattga tttacggcgc    840

taaggatgac tctggtcaga gatacctggc ctggtctgga cacagtgccc gtgtcggagc    900

cgcgcgagat atggcccgcg ctggagtttc aataccggag atcatgcaag ctggtggctg    960

gaccaatgta aatattgtca tgaactatat ccgtaacctg gatagtgaaa caggggcaat   1020

ggtgcgcctg ctggaagatg gcgatctcga gccatctgct ggagacatga gagctgccaa   1080

cctttggcca agcccgctca tgatcaaacg ctctaagaag aacagcctgg ccttgtccct   1140

gacggccgac cagatggtca gtgccttgtt ggatgctgag ccccccatac tctattccga   1200

gtatgatcct accagaccct tcagtgaagc ttcgatgatg ggcttactga ccaacctggc   1260

agacagggag ctggttcaca tgatcaactg ggcgaagagg gtgccaggct ttgtggattt   1320

gaccctccat gatcaggtcc accttctaga atgtgcctgg ctagagatcc tgatgattgg   1380

tctcgtctgg cgctccatgg agcacccagt gaagctactg tttgctccta acttgctctt   1440

ggacaggaac cagggaaaat gtgtagaggg catggtggag atcttcgaca tgctgctggc   1500

tacatcatct cggttccgca tgatgaatct gcagggagag gagtttgtgt gcctcaaatc   1560

tattattttg cttaattctg gagtgtacac atttctgtcc agcaccctga agtctctgga   1620

agagaaggac catatccacc gagtcctgga caagatcaca gacactttga tccacctgat   1680

ggccaaggca ggcctgaccc tgcagcagca gcaccagcgg ctggcccagc tcctcctcat   1740

cctctcccac atcaggcaca tgagtaacaa aggcatggag catctgtaca gcatgaagtg   1800

caagaacgtg gtgcccctct atgacctgct gctggaggcg gcggacgccc accgcctaca   1860

tgcgcccact agccgtggag gggcatccgt ggaggagacg gaccaaagcc acttggccac   1920

tgcgggctct acttcatcgc attccttgca aaagtattac atcacggggg aggcagaggg   1980

tttccctgcc acagcttgag gcgcgcccct ctccctcccc cccccctaac gttactggcc   2040

gaagccgctt ggaataaggc cggtgtgcgt ttgtctatat gttattttcc accatattgc   2100

cgtcttttgg caatgtgagg gcccggaaac ctggccctgt cttcttgacg agcattccta   2160

ggggtctttc ccctctcgcc aaaggaatgc aaggtctgtt gaatgtcgtg aaggaagcag   2220

ttcctctgga agcttcttga agacaaacaa cgtctgtagc gaccctttgc aggcagcgga   2280

accccccacc tggcgacagg tgcctctgcg gccaaaagcc acgtgtataa gatacacctg   2340

caaaggcggc acaaccccag tgccacgttg tgagttggat agttgtggaa agagtcaaat   2400

ggctctcctc aagcgtattc aacaaggggc tgaaggatgc ccagaaggta ccccattgta   2460

tgggatctga tctggggcct cggtacacat gctttacatg tgtttagtcg aggttaaaaa   2520

aacgtctagg ccccccgaac cacggggacg tggttttcct ttgaaaaaca cgatgataat   2580

atggccacaa cccatggtga gcaagggcga ggagctgttc accggggtgg tgcccatcct   2640

ggtcgagctg gacggcgacg taaacggcca caagttcagc gtgtccggcg agggcgaggg   2700

cgatgccacc tacggcaagc tgaccctgaa gttcatctgc accaccggca agctgcccgt   2760

gccctggccc accctcgtga ccaccctgac ctacggcgtg cagtgcttca gccgctaccc   2820

cgaccacatg aagcagcacg acttcttcaa gtccgccatg cccgaaggct acgtccagga   2880

gcgcaccatc ttcttcaagg acgacggcaa ctacaagacc cgcgccgagg tgaagttcga   2940

gggcgacacc ctggtgaacc gcatcgagct gaagggcatc gacttcaagg aggacggcaa   3000

catcctgggg cacaagctgg agtacaacta caacagccac aacgtctata tcatggccga   3060

caagcagaag aacggcatca aggtgaactt caagatccgc cacaacatcg aggacggcag   3120

cgtgcagctc gccgaccact accagcagaa cacccccatc ggcgacggcc ccgtgctgct   3180

gcccgacaac cactacctga gcacccagtc cgccctgagc aaagacccca acgagaagcg   3240

cgatcacatg gtcctgctgg agttcgtgac cgccgccggg atcactctcg gcatggacga   3300

gctgtacaag taa                                                      3313

<210>  3

<211>  5427

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  3

gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg     60

ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg    120

cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc    180

ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt    240

gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata    300

tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc    360

cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc    420

attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt    480

atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt    540

atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca    600

tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg    660

actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc    720

aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg    780

gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca    840

ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gctggctagc    900

gtttaaacgg gccctctaga ctcgagcggc cgccactgtg ctggatatct gcagaattcc    960

accacactgg actagtggat ccgagctcgg taccaagctt aagtttaaac cgctgatcag   1020

cctcgactgt gccttctagt tgccagccat ctgttgtttg cccctccccc gtgccttcct   1080

tgaccctgga aggtgccact cccactgtcc tttcctaata aaatgaggaa attgcatcgc   1140

attgtctgag taggtgtcat tctattctgg ggggtggggt ggggcaggac agcaaggggg   1200

aggattggga agacaatagc aggcatgctg gggatgcggt gggctctatg gcttctgagg   1260

cggaaagaac cagctggggc tctagggggt atccccacgc gccctgtagc ggcgcattaa   1320

gcgcggcggg tgtggtggtt acgcgcagcg tgaccgctac acttgccagc gccctagcgc   1380

ccgctccttt cgctttcttc ccttcctttc tcgccacgtt cgccggcttt ccccgtcaag   1440

ctctaaatcg ggggctccct ttagggttcc gatttagtgc tttacggcac ctcgacccca   1500

aaaaacttga ttagggtgat ggttcacgta gtgggccatc gccctgatag acggtttttc   1560

gccctttgac gttggagtcc acgttcttta atagtggact cttgttccaa actggaacaa   1620

cactcaaccc tatctcggtc tattcttttg atttataagg gattttgccg atttcggcct   1680

attggttaaa aaatgagctg atttaacaaa aatttaacgc gaattaattc tgtggaatgt   1740

gtgtcagtta gggtgtggaa agtccccagg ctccccagca ggcagaagta tgcaaagcat   1800

gcatctcaat tagtcagcaa ccaggtgtgg aaagtcccca ggctccccag caggcagaag   1860

tatgcaaagc atgcatctca attagtcagc aaccatagtc ccgcccctaa ctccgcccat   1920

cccgccccta actccgccca gttccgccca ttctccgccc catggctgac taattttttt   1980

tatttatgca gaggccgagg ccgcctctgc ctctgagcta ttccagaagt agtgaggagg   2040

cttttttgga ggcctaggct tttgcaaaaa gctcccggga gcttgtatat ccattttcgg   2100

atctgatcaa gagacaggat gaggatcgtt tcgcatgatt gaacaagatg gattgcacgc   2160

aggttctccg gccgcttggg tggagaggct attcggctat gactgggcac aacagacaat   2220

cggctgctct gatgccgccg tgttccggct gtcagcgcag gggcgcccgg ttctttttgt   2280

caagaccgac ctgtccggtg ccctgaatga actgcaggac gaggcagcgc ggctatcgtg   2340

gctggccacg acgggcgttc cttgcgcagc tgtgctcgac gttgtcactg aagcgggaag   2400

ggactggctg ctattgggcg aagtgccggg gcaggatctc ctgtcatctc accttgctcc   2460

tgccgagaaa gtatccatca tggctgatgc aatgcggcgg ctgcatacgc ttgatccggc   2520

tacctgccca ttcgaccacc aagcgaaaca tcgcatcgag cgagcacgta ctcggatgga   2580

agccggtctt gtcgatcagg atgatctgga cgaagagcat caggggctcg cgccagccga   2640

actgttcgcc aggctcaagg cgcgcatgcc cgacggcgag gatctcgtcg tgacccatgg   2700

cgatgcctgc ttgccgaata tcatggtgga aaatggccgc ttttctggat tcatcgactg   2760

tggccggctg ggtgtggcgg accgctatca ggacatagcg ttggctaccc gtgatattgc   2820

tgaagagctt ggcggcgaat gggctgaccg cttcctcgtg ctttacggta tcgccgctcc   2880

cgattcgcag cgcatcgcct tctatcgcct tcttgacgag ttcttctgag cgggactctg   2940

gggttcgaaa tgaccgacca agcgacgccc aacctgccat cacgagattt cgattccacc   3000

gccgccttct atgaaaggtt gggcttcgga atcgttttcc gggacgccgg ctggatgatc   3060

ctccagcgcg gggatctcat gctggagttc ttcgcccacc ccaacttgtt tattgcagct   3120

tataatggtt acaaataaag caatagcatc acaaatttca caaataaagc atttttttca   3180

ctgcattcta gttgtggttt gtccaaactc atcaatgtat cttatcatgt ctgtataccg   3240

tcgacctcta gctagagctt ggcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt   3300

tatccgctca caattccaca caacatacga gccggaagca taaagtgtaa agcctggggt   3360

gcctaatgag tgagctaact cacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc tttccagtcg   3420

ggaaacctgt cgtgccagct gcattaatga atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg   3480

cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg   3540

cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat   3600

aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc   3660

gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc   3720

tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga   3780

agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt   3840

ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg   3900

taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc   3960

gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg   4020

gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc   4080

ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaagaacag tatttggtat ctgcgctctg   4140

ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc   4200

gctggtagcg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa   4260

gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa   4320

gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa   4380

tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatgc   4440

ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat agttgcctga   4500

ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg gagggcttac catctggccc cagtgctgca   4560

atgataccgc gagacccacg ctcaccggct ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc   4620

ggaagggccg agcgcagaag tggtcctgca actttatccg cctccatcca gtctattaat   4680

tgttgccggg aagctagagt aagtagttcg ccagttaata gtttgcgcaa cgttgttgcc   4740

attgctacag gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt   4800

tcccaacgat caaggcgagt tacatgatcc cccatgttgt gcaaaaaagc ggttagctcc   4860

ttcggtcctc cgatcgttgt cagaagtaag ttggccgcag tgttatcact catggttatg   4920

gcagcactgc ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc tgtgactggt   4980

gagtactcaa ccaagtcatt ctgagaatag tgtatgcggc gaccgagttg ctcttgcccg   5040

gcgtcaatac gggataatac cgcgccacat agcagaactt taaaagtgct catcattgga   5100

aaacgttctt cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc tgttgagatc cagttcgatg   5160

taacccactc gtgcacccaa ctgatcttca gcatctttta ctttcaccag cgtttctggg   5220

tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa taagggcgac acggaaatgt   5280

tgaatactca tactcttcct ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc   5340

atgagcggat acatatttga atgtatttag aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca   5400

tttccccgaa aagtgccacc tgacgtc                                       5427

<210>  4

<211>  182

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  4

cctaactccg cccatcccgc ccctaactcc gcccagttcc gcccattctc cgccccatgg     60

ctgactaatt ttttttattt atgcagaggc cgaggccgcc tctgcctctg agctattcca    120

gaagtagtga ggaggctttt ttggaggcct aggcttttgc aaaaagctcc cgggagcttg    180

ta                                                                   182

<210>  5

<211>  2476

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  5

aattgaaccg gtgcctagag aaggtggcgc ggggtaaact gggaaagtga tgtcgtgtac     60

tggctccgcc tttttcccga gggtggggga gaaccgtata taagtgcagt agtcgccgtg    120

aacgttcttt ttcgcaacgg gtttgccgcc agaacacagg taagtgccgt gtgtggttcc    180

cgcgggcctg gcctctttac gggttatggc ccttgcgtgc cttgaattac ttccacctgg    240

ctccagtacg tgattcttga tcccgagctg gagccagggg cgggccttgc gctttaggag    300

ccccttcgcc tcgtgcttga gttgaggcct ggcctgggcg ctggggccgc cgcgtgcgaa    360

tctggtggca ccttcgcgcc tgtctcgctg ctttcgataa gtctctagcc atttaaaatt    420

tttgatgacc tgctgcgacg ctttttttct ggcaagatag tcttgtaaat gcgggccagg    480

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agcgcacatg ttcggcgagg cggggcctgc gagcgcggcc accgagaatc ggacgggggt    600

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cctgggcggc aaggctggcc cggtcggcac cagttgcgtg agcggaaaga tggccgcttc    720

ccggccctgc tccagggggc tcaaaatgga ggacgcggcg ctcgggagag cgggcgggtg    780

agtcacccac acaaaggaaa agggcctttc cgtcctcagc cgtcgcttca tgtgactcca    840

cggagtaccg ggcgccgtcc aggcacctcg attagttctg gagcttttgg agtacgtcgt    900

ctttaggttg gggggagggg ttttatgcga tggagtttcc ccacactgag tgggtggaga    960

ctgaagttag gccagcttgg cacttgatgt aattctcgtt ggaatttgcc ctttttgagt   1020

ttggatcttg gttcattctc aagcctcaga cagtggttca aagttttttt cttccatttc   1080

aggtgtcgtg aacacgtggt cgcggccaat tctgcagtcg agctcaagct tcctgcaggc   1140

cgccaccatg tccaatttac tgaccgtaca ccaaaatttg cctgcattac cggtcgatgc   1200

aacgagtgat gaggttcgca agaacctgat ggacatgttc agggatcgcc aggcgttttc   1260

tgagcatacc tggaaaatgc ttctgtccgt ttgccggtcg tgggcggcat ggtgcaagtt   1320

gaataaccgg aaatggtttc ccgcagaacc tgaagatgtt cgcgattatc ttctatatct   1380

tcaggcgcgc ggtctggcag taaaaactat ccagcaacat ttgggccagc taaacatgct   1440

tcatcgtcgg tccgggctgc cacgaccaag tgacagcaat gctgtttcac tggttatgcg   1500

gcggatccga aaagaaaacg ttgatgccgg tgaacgtgca aaacaggctc tagcgttcga   1560

acgcactgat ttcgaccagg ttcgttcact catggaaaat agcgatcgct gccaggatat   1620

acgtaatctg gcatttctgg ggattgctta taacaccctg ttacgtatag ccgaaattgc   1680

caggatcagg gttaaagata tctcacgtac tgacggtggg agaatgttaa tccatattgg   1740

cagaacgaaa acgctggtta gcaccgcagg tgtagagaag gcacttagcc tgggggtaac   1800

taaactggtc gagcgatgga tttccgtctc tggtgtagct gatgatccga ataactacct   1860

gttttgccgg gtcagaaaaa atggtgttgc cgcgccatct gccaccagcc agctatcaac   1920

tcgcgccctg gaagggattt ttgaagcaac tcatcgattg atttacggcg ctaaggatga   1980

ctctggtcag agatacctgg cctggtctgg acacagtgcc cgtgtcggag ccgcgcgaga   2040

tatggcccgc gctggagttt caataccgga gatcatgcaa gctggtggct ggaccaatgt   2100

aaatattgtc atgaactata tccgtaacct ggatagtgaa acaggggcaa tggtgcgcct   2160

gctggaagat ggcgatctcg agccatctgc tggagacatg agagctgcca acctttggcc   2220

aagcccgctc atgatcaaac gctctaagaa gaacagcctg gccttgtccc tgacggccga   2280

ccagatggtc agtgccttgt tggatgctga gccccccata ctctattccg agtatgatcc   2340

taccagaccc ttcagtgaag cttcgatgat gggcttactg accaacctgg cagacaggga   2400

gctggttcac atgatcaact gggcgaagag ggtgccaggc tttgtggatt tgaccctcca   2460

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<210>  6

<211>  1983

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  6

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acggagagac atactatatt catgaactaa aagacttaat attgtgaagg tatactttct    120

ttccacataa atttgtagtc aatatgttca ccccaaaaaa gctgtttgtt aacttgccaa    180

cctcattcta aaatgtatat agaagcccaa aagacaataa caaaaatatt cttgtagaac    240

aaaatgggaa agaatgttcc actaaatatc aagatttaga gcaaagcatg agatgtgtgg    300

ggatagacag tgaggctgat aaaatagagt agagctcaga aacagaccca ttgatatatg    360

taagtgacct atgaaaaaaa tatggcattt tacaatggga aaatgatgat ctttttcttt    420

tttagaaaaa cagggaaata tatttatatg taaaaaataa aagggaaccc atatgtcata    480

ccatacacac aaaaaaattc cagtgaatta taagtctaaa tggagaaggc aaaactttaa    540

atcctttaga aaataatata gaagcatgcc atcatgactt cagtgtagag aaaaatttct    600

tatgactcaa agtcctaacc acaaagaaaa gattgttaat tagattgcat gaatattaag    660

acttattttt aaaattaaaa aaccattaag aaaagtcagg ccatagaatg acagaaaata    720

tttgcaacac cccagtaaag agaattgtaa tatgcagatt ataaaaagaa gtcttacaaa    780

tcagtaaaaa ataaaactag acaaaaattt gaacagatga aagagaaact ctaaataatc    840

attacacatg agaaactcaa tctcagaaat cagagaacta tcattgcata tacactaaat    900

tagagaaata ttaaaaggct aagtaacatc tgtggcaata ttgatggtat ataaccttga    960

tatgatgtga tgagaacagt actttacccc atgggcttcc tccccaaacc cttaccccag   1020

tataaatcat gacaaatata ctttaaaaac cattacccta tatctaacca gtactcctca   1080

aaactgtcaa ggtcatcaaa aataagaaaa gtctgaggaa ctgtcaaaac taagaggaac   1140

ccaaggagac atgagaatta tatgtaatgt ggcattctga atgagatccc agaacagaaa   1200

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agtctataat taaaaatttt ttaaatgtag tctggaacat tgccagaaac agaagtacag   1380

cagctatctg tgctgtcgcc taactatcca tagctgattg gtctaaaatg agatacatca   1440

acgctcctcc atgttttttg ttttcttttt aaatgaaaaa ctttattttt taagaggagt   1500

ttcaggttca tagcaaaatt gagaggaagg tacattcaag ctgaggaagt tttcctctat   1560

tcctagttta ctgagagatt gcatcatgaa tgggtgttaa attttgtcaa atgctttttc   1620

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ttaattgatt ttcaaacgct gaaccaccct tacatatctg gaataaattc tacttggttg   1740

tggtgtatat tttttgatac attcttggat tctttttgct aatattttgt tgaaaatgtt   1800

tgtatctttg ttcatgagag atattggtct gttgttttct tttcttgtaa tgtcattttc   1860

tagttccggt attaaggtaa tgctggccta gttgaatgat ttaggaagta ttccctctgc   1920

ttctgtcttc tgaaagagat tgtagaaagt tgatacaatt tttttttctt taaatatttg   1980

ata                                                                 1983

<210>  7

<211>  1110

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  7

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gactgtgcct tctagttgcc agccatctgt tgtttgcccc tcccccgtgc cttccttgac    120

cctggaaggt gccactccca ctgtcctttc ctaataaaat gaggaaattg catcgcattg    180

tctgagtagg tgtcattcta ttctgggggg tggggtgggg caggacagca agggggagga    240

ttgggaagac aatagcaggc atgctgggga tgcggtgggc tctatggctt ctgaggcgga    300

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ggcgggtgtg gtggttacgc gcagcgtgac cgctacactt gccagcgccc tagcgcccgc    420

tcctttcgct ttcttccctt cctttctcgc cacgttcgcc ggctttcccc gtcaagctct    480

aaatcggggg ctccctttag ggttccgatt tagtgcttta cggcacctcg accccaaaaa    540

acttgattag ggtgatggtt cacgtagtgg gccatcgccc tgatagacgg tttttcgccc    600

tttgacgttg gagtccacgt tctttaatag tggactcttg ttccaaactg gaacaacact    660

caaccctatc tcggtctatt cttttgattt ataagggatt ttgccgattt cggcctattg    720

gttaaaaaat gagctgattt aacaaaaatt taacgcgaat taattctgtg gaatgtgtgt    780

cagttagggt gtggaaagtc cccaggctcc ccagcaggca gaagtatgca aagcatgcat    840

ctcaattagt cagcaaccag gtgtggaaag tccccaggct ccccagcagg cagaagtatg    900

caaagcatgc atctcaatta gtcagcaacc atagtcccgc ccctaactcc gcccatcccg    960

cccctaactc cgcccagttc cgcccattct ccgccccatg gctgactaat tttttttatt   1020

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tttggaggcc taggcttttg caaaaagctc                                    1110

<210>  8

<211>  34

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  8

ataacttcgt atagcataca ttatacgaag ttat                                 34

<210>  9

<211>  1171

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  9

aattgataac ttcgtatagc atacattata cgaagttata accggtgcct agagaaggtg     60

gcgcggggta aactgggaaa gtgatgtcgt gtactggctc cgcctttttc ccgagggtgg    120

gggagaaccg tatataagtg cagtagtcgc cgtgaacgtt ctttttcgca acgggtttgc    180

cgccagaaca caggtaagtg ccgtgtgtgg ttcccgcggg cctggcctct ttacgggtta    240

tggcccttgc gtgccttgaa ttacttccac ctggctccag tacgtgattc ttgatcccga    300

gctggagcca ggggcgggcc ttgcgcttta ggagcccctt cgcctcgtgc ttgagttgag    360

gcctggcctg ggcgctgggg ccgccgcgtg cgaatctggt ggcaccttcg cgcctgtctc    420

gctgctttcg ataagtctct agccatttaa aatttttgat gacctgctgc gacgcttttt    480

ttctggcaag atagtcttgt aaatgcgggc caggatctgc acactggtat ttcggttttt    540

gggcccgcgg ccggcgacgg ggcccgtgcg tcccagcgca catgttcggc gaggcggggc    600

ctgcgagcgc ggccaccgag aatcggacgg gggtagtctc aagctggccg gcctgctctg    660

gtgcctggcc tcgcgccgcc gtgtatcgcc ccgccctggg cggcaaggct ggcccggtcg    720

gcaccagttg cgtgagcgga aagatggccg cttcccggcc ctgctccagg gggctcaaaa    780

tggaggacgc ggcgctcggg agagcgggcg ggtgagtcac ccacacaaag gaaaagggcc    840

tttccgtcct cagccgtcgc ttcatgtgac tccacggagt accgggcgcc gtccaggcac    900

ctcgattagt tctggagctt ttggagtacg tcgtctttag gttgggggga ggggttttat    960

gcgatggagt ttccccacac tgagtgggtg gagactgaag ttaggccagc ttggcacttg   1020

atgtaattct cgttggaatt tgcccttttt gagtttggat cttggttcat tctcaagcct   1080

cagacagtgg ttcaaagttt ttttcttcca tttcaggtgt cgtgaacacg tggtcgcggc   1140

caattctgca gtcgagctca agcttcctgc a                                  1171

<210>  10

<211>  52

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  10

gcttagaagc ttcctgcagg ccgccaccat gtccaattta ctgaccgtac ac             52

<210>  11

<211>  38

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  11

gcttagggcg cgcctcaagc tgtggcaggg aaaccctc                             38

<210>  12

<211>  27

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  12

gcttagggcg cgcccctctc cctcccc                                         27

<210>  13

<211>  32

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  13

gcttagggat ccgtcgactt acttgtacag ct                                   32

<210>  14

<211>  26

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  14

gctagccctg caggccgcca ccatgt                                          26

<210>  15

<211>  28

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  15

gcggccgctt acttgtacag ctcgtcca                                        28

<210>  16

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  16

aacaggaagc acaatgccca                                                 20

<210>  17

<211>  37

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  17

aaggaaaaaa gcggccgcag atctaaataa acttata                              37

<210>  18

<211>  66

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  18

gcggcccaat tgataacttc gtatagcata cattatacga agttatcatg aagaatctgc     60

ttaggg                                                                66

<210>  19

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  19

gagcacagct gcgcaaggaa                                                 20

 

Claims (10)

1.一种不整合非病毒载体，其特征在于，所述的非病毒载体包含S/MAR序列、SV40复制原点和Cre-ERT2表达序列，所述的S/MAR序列的上游和下游分别具有一个loxP序列，两个loxP方向相同，且其中一个loxP序列位于S/MAR序列和SV40复制原点之间。

2.根据权利要求1所述的非病毒载体，其特征在于，所述的非病毒载体还包括外源目的基因，优选的为EGFP。

3.根据权利要求2所述的非病毒载体，其特征在于，所述的S/MAR序列、Cre-ERT2表达序列和外源目的基因共用启动子和终止子，所述的启动子优选为真核表达的启动子。

4.根据权利要求3所述的非病毒载体，其特征在于，所述的Cre-ERT2表达序列与外源目的基因用IRES序列连接。

5.根据权利要求3所述的非病毒载体，其特征在于，一个LoxP序列在所述启动子上游连接，另一loxP序列在S/MAR序列的下游连接。

6.根据权利要求1所述的非病毒载体，其特征在于，所述的S/MAR序列如SEQ ID NO.6所示，所述的SV40复制原点的序列如SEQ ID NO.4所示，所述的Cre-ERT2表达序列如SEQ ID NO.2所示，所述的loxP序列与SEQ ID NO.8有85%-100%相似度，优选的LoxP序列如SEQ ID NO.8所示。

7.根据权利要求1所述的非病毒载体，其特征在于，它是通过以下方法构建的：

a）从序列如SEQ ID NO.1所示的pEP4-Cre-EGFP质粒中克隆出Cre-ERT2-IRES-EGFP片段，

b）将Cre-ERT2-IRES-EGFP片段插入pcDNA3.1(-)质粒的CMV Promoter下游，得到pcDNA-Cre-EGFP质粒，

c）用EF1α Promoter替换pcDNA-Cre-EGFP中的CMV Promoter得到pECG质粒，

d）将S/MAR片段插入到pECG载体中，得到pECG-S/MAR质粒，

e）利用SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19所示的引物以pECG-S/MAR质粒为模板克隆出Afl II-LoxP片段，

f）将pECG-S/MAR质粒和Afl II-LoxP片段用Afl II和Xma I双酶切，分别得到pECG-S/MAR载体和Afl II-LoxP-XmaI片段，

g）将Afl II-LoxP-Xma I片段插入到pECG-S/MAR载体中，得到pECG-S/MAR-Afl IILoxP质粒，

h）用与步骤g）同样的方法将另一个loxP插入到pECG-S/MAR-Afl IILoxP质粒的EF1α promoter 5’端，得到pECG-S/MAR-LoxP。

8.根据权利要求1所述的非病毒载体，其特征在于，所述的非病毒载体还具有药物筛选标记基因和/或实时筛选标记基因。

9.一种权利要求1所述的非病毒载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：将S/MAR序列、SV40复制原点、Cre-ERT2表达序列构建于骨架载体中，并于所述的S/MAR序列的上游和下游各插入一个loxP序列，同时保证其中一个loxP序列位于S/MAR序列和SV40复制原点之间。

10.权利要求1-9任一所述的非病毒载体的用途，其特征在于，用于介导外源目的基因进入宿主细胞并在宿主细胞中表达。