CN104988157A - 植物株高和籽粒大小相关的OsTAL基因及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种植物株高和籽粒大小相关的OsTAL基因及其应用。该蛋白是具有序列表中SEQ ID No:2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将SEQ ID No:2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID No:2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID No:2衍生的蛋白质。在植物中过表达该基因时，转基因植株表现出更强的生长势，包括成熟期株高增加、百粒重增加。根据本发明，可利用基因工程方法培育转基因植物，调节株型和百粒重等农艺性状，因而可很好地应用于作物品种的改良。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程领域。具体涉及一种植物株高和籽粒大小相关的OsTAL基因及其应用。
背景技术
水稻是我国最重要的粮食作物，也是全世界最重要的粮食作物之一。据统计，全球约占50％的人口以稻米为主食。水稻也是我国最重要的粮食作物之一。据统计，2008-2012年全国水稻种植面积占粮食作物总面积的27.2％，年均生产稻谷总量占粮食总产的35.7％(中国统计年鉴,2013)。
株型和籽粒大小是水稻产量和稻米品质的重要决定因素。20世纪60年代，墨西哥的小麦，我国和菲律宾的水稻由于降低了株高而提高了产量，增强了抗倒伏性，被称为“绿色革命”(Monna L.DNAResearch,2002,9(1):11-17；Spielmeyer,W.Proc Natl Acad SciU S A,2002,99(13):9043-9048)。研究表明，在这一过程中，产量的提高主要是围绕着以利用矮秆基因为基础，通过株型改良而进行的。水稻中应用的矮秆基因为sd1，编码一个GA20氧化酶，参与了赤霉素的合成。现在水稻生产和育种中利用的矮秆基因仍主要是sd1，同一矮秆基因的过度利用潜伏着由遗传单一带来的风险，而且水稻高产育种的趋势是“矮中求高”，即适当地提高株高，以增加生物学产量来提供稻谷的产量(袁隆平.杂交水稻,1996,2:1-3)。另一方面，在增加水稻物质生产能力的同时，还要提高水稻的“库容量”，即增加水稻单位面积穗数、每穗粒数和粒重。其中，粒重是产量构成因子的三要素之一，和籽粒长、籽粒宽和籽粒厚呈正相关，粒重有时也以粒长、宽和厚的综合指标衡量(钱前.科学出版社:水稻基因设计育种,2007,87)。因此，研究水稻株高与籽粒大小的调控机制不仅具有理论上的意义，同时也具有重要的现实意义。通过调控水稻株高高矮和籽粒的大小，可以增加水稻的产量，进而保障我国的粮食安全。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种植物株高和籽粒大小相关的OsTAL基因，该基因编码的蛋白质。
本发明的另一个目的是提供一种培育株高和籽粒大小改良的转基因植物的方法。
实现本发明目的的技术解决方案是：
本发明提供了一种植物株高和籽粒大小相关的OsTAL基因，其核苷酸序列如SEQID No:1所示。
本发明还提供了所述OsTAL基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。该蛋白质，名称为OsTAL，来源于水稻武运粳8号(Oryza sativa L.cv.Wuyunjing 8，1999年江苏审定，审定编号：苏种审字第314号)，是如下(1)或(2)所述的重组蛋白质；
(1)由SEQ ID No:2的氨基酸残基序列组成的蛋白质；
(2)将(1)中的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物株高矮、种子粒型或种子重量相关的由(1)衍生的蛋白质。
上述SEQ ID No:2由432个氨基酸残基组成。
所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
所述蛋白OsTAL的编码基因也属于本发明的保护范围。
所述蛋白OsTAL的编码基因为如下1)～3)中任一所述的DNA分子
1)SEQ ID No:1所示的DNA分子；
2)在严格条件下与SEQ ID No:1限定的DNA序列杂交且与植物种子粒型或籽粒宽或籽粒厚或籽粒重相关的DNA分子；
3)与SEQ ID No:1限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％至少具有99％同源性且与植物株高、种子粒型或籽粒宽或种子厚或种子重相关的DNA分子。
本发明还提供了含有上述基因的植物表达载体。
含有所述编码基因的重组载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒也是本发明保护的范围。所述重组载体的启动子为玉米Uniquitin启动子UbiPro。
所述重组载体通过如下步骤获得：
1)用Sac I和EcoR I酶切pBI121载体获得终止子Noster，连入同样经Sac I和EcoR I酶切后的pCAMBIA1301，获得载体p1301NOS；以玉米自交系B73基因组(Schnable PS,Science.2009,326(5956):1112-1115)DNA为模板，通过PCR的方法扩增玉米Uniquitin启动子，在PCR引物中引入Hind III和BamH I酶切位点；连入经Hind III和BamH I酶切后的p1301NOS载体中，获得中间载体p1301UN。
2)将OsTAL蛋白的编码基因插入中间载体p1301UN的Kpn I和Sac I识别位点之间，获得重组载体p1301UN-OsTAL。
扩增所述OsTALl编码基因编码区的引物对；所述引物对如下所示：上游引物序列如SEQID No:3所示，下游引物序列如SEQ ID No:4所示。在PCR引物中引入Kpn I和Sac I酶切位点。
本发明还提供一种培育株高和籽粒大小改良的转基因植物的方法。是将所述的OsTALl编码基因导入目的植物，培育得到株高和粒型改良的转基因植物。
所述粒型改良为如下1)-4)中的至少一种:
1)所述转基因植物的株高大于所述目的植物；
2)所述转基因植物的种子粒宽大于所述目的植物；
3)所述转基因植物的种子粒厚大于所述目的植物；
4)所述转基因植物的种子的粒重大于所述目的植物。
所述粒重为百粒重。
所述编码基因是通过所述重组载体导入所述目的植物中。
所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物，所述单子叶植物优选为水稻，所述水稻的品种尤其优选为武运粳8号。
本发与现有技术相比，其显著优点是：
将粳稻武运粳8号中克隆到的OsTAL基因导入水稻武运粳8号获得过量表达OsTAL基因的水稻，过表达水稻的株高、籽粒宽、籽粒厚和籽粒百粒重均大于所述目的植物。证实该基因具有调节水稻株高和籽粒大小的作用，增大粒重可以有效增加作物的产量，因而可以很好地应用于作物品种的改良。本发明提供的OsTAL基因，不仅为植物调控株高和籽粒大小方面的理论研究提供重要的分子遗传学信息，还在提高作物产量，改良作物的农艺性状等基因工程育种方面提供了基础。
附图说明
图1为用PCR扩增OsTAL基因的编码区，Marker为DL 2000(购自宝生物工程(大连)有限公司，产品号：3427A)。
图2为玉米Ubiquitin启动子驱动水稻OsTAL基因(即p1301UN-OsTAL融合基因)的植物表达载体图。
图3为野生型武运粳8号和转p1301UN-OsTAL融合基因植株中OsTAL的mRNA转录本分析。野生型武运粳8号中OsTAL基因的mRNA转录本很低，而转p1301UN-OsTAL融合基因植株中OsTAL的mRNA转录本水平很高(**表示P<0.01水平差异)。
图4为野生型武运粳8号和转p1301UN-OsTAL融合基因植株株高的统计(**表示P<0.01水平差异)。
图5为野生型武运粳8号和转p1301UN-OsTAL融合基因植株籽粒长的统计。
图6为野生型武运粳8号和转p1301UN-OsTAL融合基因植株籽粒宽的统计(*表示P<0.05水平差异；**表示P<0.01水平差异)。
图7为野生型武运粳8号和转p1301UN-OsTAL融合基因植株籽粒厚的统计(**表示P<0.01水平差异)。
图8为野生型武运粳8号和转p1301UN-OsTAL融合基因植株籽粒百粒重的统计(**表示P<0.01水平差异)。
图9为野生型武运粳8号和转p1301UN-OsTAL融合基因植株形态。
图10为野生型武运粳8号和转p1301UN-OsTAL融合基因的籽粒形态。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步详细描述，但不限制本发明。
下述实施例中的实验方法，包括DNA提取、RNA提取、cDNA的制备、酶切、克隆和表达载体的构建、连接、菌株转化和筛选等，如无特别说明，均为本领域内的常规方法。
下述实施例中，所使用的各种实验材料、试剂、酶、载体等，均可通过商业途径获得。
实施例1
OsTAL基因的克隆：
采用本领域常规的Trizol提取法提取水稻叶片总mRNA，DNase I(购自宝生物工程(大连)有限公司，产品号：2270A)处理后，用M-MLV反转录酶(购自宝生物工程(大连)有限公司，产品号：2641Q)反转录合成cDNA，反应体系和反应条件参考相关试剂盒说明。利用该cDNA为PCR模板，扩增OsTAL基因的编码序列SEQ ID No:1，扩增所用特异性引物如下：
上游引物(SEQ ID No:3)：AAAGGTACCATGACCGGCGCCGTCTCCA
下划线序列为Kpn I位点；
下游引物(SEQ ID No:4)：AAAGAGCTCCTACAGGCTCACGGTCTTCTTGA
下划线序列为Spe I位点。
PCR反应体系：10хTaq Buffer 5μL、10mM dNTP Mix 2μL、上游引物(SEQ ID No:3)(10μmol/L)2μL、下游引物(SEQ ID No:4)(10μmol/L)2μL、cDNA模板2μL、高保真Taq酶(5U/μL)1μL和ddH2O 36μL。
PCR反应程序：94℃预变性3min后进入PCR循环，循环参数为94℃30s变性→55℃30s复性→72℃2min延伸，进行35个循环，最后在72℃下延伸10min。
扩增的PCR产物经过1％的琼脂糖凝胶电泳分离，结果如图1所示，从图中可以看出，得到分子量大约1.3Kb的条带，用DNA凝胶回收试剂盒(购自宝生物工程(大连)有限公司，产品号：7345)回收该片段，获得回收产物。将PCR产物与pZeroBack/blunt载体(购自天根生化科技(北京)有限公司，产品号：VT204-01)在16℃下连接30min，42℃热击60s，转化大肠杆菌DH5α，转化物在含氨苄青霉素的LB平板培养基上生长，挑选阳性克隆，提取质粒并测序(委托深圳华大基因完成)，该质粒中含有序列表SEQ ID No:1的核苷酸。将该质粒命名为p-OsTAL。
实施例2
OsTAL过量表达重组载体的获得：
p1301UN载体的构建方法为：
取0.1g玉米幼苗叶片，放在液氮中研磨，加入800μL提取缓冲液(0.1M Tris-HclpH8.0，50mM EDTA，0.5M NaCl，1％SDS和1％β-巯基乙醇)，重复震荡悬浮；65℃水浴40min，每10min混匀一次；然后加入250μL预冷的5M乙酸钾，颠倒混匀，冰浴5min；加入等量酚/氯仿，混匀抽提；12000rpm离心5min；吸取上清到另一离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇，室温放置60min沉淀DNA；4℃12000rpm离心15min，弃上清；沉淀用70％酒精洗涤一次；干燥后，加入20μL ddH2O溶解，获得玉米基因组DNA。以此DNA为模板，加入上、下游引物(上游引物序列为：AAAAAGCTTCTGCAGTGCAGCGTGACCCGGTCGTG，下游引物序列为：AAAGGATCCTGCAGAAGTAACACCAAACAACAGGG)进行PCR扩增，引物中分别引入Hind III和BamH I酶切位点(划线部分序列)。
PCR反应程序：94℃预变性3min后进入PCR循环，循环参数为94℃30s变性→59℃30s复性→72℃2min延伸，进行35个循环，最后在72℃下延伸10min。扩增的PCR产物经过1％的琼脂糖凝胶电泳分离，用DNA凝胶回收试剂盒(购自宝生物工程(大连)有限公司，产品号：7345)回收该片段，获得回收产物。将PCR产物与pZeroBack/blunt载体(购自天根生化科技(北京)有限公司，产品号：VT204-01)在16℃下连接30min，42℃热击60s，转化大肠杆菌DH5α，转化物在含氨苄青霉素的LB平板培养基上生长，挑选阳性克隆，提取质粒并测序(委托深圳华大基因完成)，该质粒中含有玉米Ubiquitin启动子的核苷酸，将该质粒命名为p-UbiPro。
用Sac I和EcoR I酶切pBI121载体获得终止子Noster，连入同样经Sac I和EcoR I酶切后的pCAMBIA1301，获得载体p1301NOS；再用Hind III和BamH I双酶切将Ubiquitin启动子从p-UbiPro切下，与经同样酶酶切后的p1301NOS连接，获得中间载体p1301UN。
重组载体p1301UN-OsTAL的获得：
用Kpn I和Sac I双酶切实施例1中获得的p-OsTAL质粒，酶切体系为：10х酶切Buffer 5μL、p-OsTAL质粒15μL，Kpn I(5U/μL)和Sac I(5U/μL)各1μL、ddH2O 28μL。37℃酶切12小时。酶切产物经过1％的琼脂糖凝胶电泳分离，用DNA凝胶回收试剂盒(购自宝生物工程(大连)有限公司，产品号：7345)回收约1.3Kb的OsTAL基因编码区DNA片段，溶解于30μL ddH2O中备用。
采用分步酶切法获得Kpn I和Sac I酶切的p1301UN：首先，用Kpn I单酶切中间载体p1301UN，酶切体系为：10х酶切Buffer 3μL、p1301UN质粒15μL，Kpn I(5U/μL)1μL、ddH2O 11μL；37℃酶切4小时；然后加入1/10体积的3M CH3COONa(pH 5.2)，混匀；加入2.5倍体积的预冷无水乙醇，混匀，-20℃放置60min；12000rpm，4℃离心10min，回收沉淀；然后用1ml 70％的预冷乙醇清洗沉淀，12000rpm，4℃离心10min，除去上清，室温干燥沉淀；沉淀用20μL ddH2O溶解；将回收产物继续用Sac I酶切，酶切体系为：10х酶切Buffer 3μL、p1301UN质粒20μL，Kpn I(5U/μL)1μL、ddH2O 6μL；37℃酶切4小时。酶切产物经过1％的琼脂糖凝胶电泳分离，用DNA凝胶回收试剂盒(购自宝生物工程(大连)有限公司，产品号：7345)回收线性化的p1301UN载体片段，溶解于30μL ddH2O中备用。
将上述回收的OsTAL基因片段和p1301UN载体片段进行连接反应，连接体系为：OsTAL基因片段6μL、p1301UN载体片段2μL、10х连接Buffer 1μL、T4连接酶1μL；混合均匀后，16℃连接12小时，然后将连接产物转化大肠杆菌DH5α，转化物在含卡那霉素的LB平板培养基上生长，挑选阳性克隆，提取质粒并测序鉴定(委托深圳华大基因完成)，结果玉米Ubiquitin启动子、OsTAL基因和Noster终止子的结构正确，将该质粒命名为p1301UN-OsTAL。该重组载体的物理图谱如图2所示。
实施例3
含有p1301UN-OsTAL重组载体转基因水稻的获得
p1301UN-OsTAL重组质粒转化农杆菌A.Tumefaciens EHA105，在含有卡那霉素的LB培养基上挑单克隆，并用PCR鉴定阳性克隆。
将此导入p1301UN-OsTAL重组质粒的农杆菌转化水稻武运粳8号愈伤，经过愈伤诱导、侵染、共培养、筛选具有抗性的愈伤、分化、生根、移栽，最终获得转基因植株。农杆菌介导的水稻遗传转化体系主要参照Hiei等人的方法(Agrobacterium-mediatedtransformation of rice using immature embryos or calli induced from mature seed,NatureProtocols,2008(3):824-834)基础上开展。主要遗传转化步骤如下：
1、挑选饱满的武运粳8号的种子，将成熟的种子去壳，用75％的酒精消毒30s-1min，然后加入次氯酸钠灭菌(次氯酸钠/蒸馏水＝1:2，充分混匀)，再加1-2滴Tween-20，静置35-40min，期间每隔10min轻轻摇一次。然后用无菌水漂洗3-5次，风干，接种于N6D2培养基上，28℃暗培养10-15天。将诱导出来的愈伤切下，于N6D2培养基上继代3-5天。
2、挑取导入p1301UN-OsTAL重组质粒的农杆菌单菌落接种于3ml含50mg/l卡那霉素的LB液体培养基中，在28℃振荡培养16h，再按1/100(v/v)接种量接种入LB液体培养基中。当培养至对数生长期时，离心收集农杆菌并重悬于适量的AAM(含100-400μmol/l的乙酰丁香酮)液体培养基中，将已培养武运粳8号的愈伤组织浸泡入此农杆菌菌液中。侵染15-20min后，将愈伤组织放在无菌滤纸上吸去过多的菌液，然后将愈伤组织转入N6D2C培养基上于28℃黑暗条件下进行共培养。共培养3天后，将愈伤组织转入含25mg/L潮霉素和600mg/L头孢霉素的选择培养基CCD2S1上进行第一轮筛选培养；10天后将长出的新鲜抗性愈伤再转入含50mg/L潮霉素和300mg/L头孢霉素的选择培养基CCD2S2上继续筛选。
3、愈伤组织经过2代筛选后，选择生长旺盛的新鲜抗性愈伤组织转移到含50mg/L潮霉素和300mg/L头孢霉素的CCA培养基上于28℃黑暗条件下进行预分化培养。10天后，再将预分化培养的抗性愈伤组织转移至含50mg/L潮霉素和300mg/L头孢霉素的分化培养基MSR上于16h光/8h暗、28℃条件下进行分化。
4、再生的小苗在含12.5mg/l潮霉素和150mg/l头孢霉素的1/2MS培养基上生根壮苗，最后转移到田间栽培。转基因水稻的栽培管理按常规方法进行。
表1水稻组织培养和转化中使用的培养基及其成分
上述植物表达载体pCAMBIA1301、pBI121、大肠杆菌DH5α和农杆菌A.TumefaciensEHA105均为本领域技术人员常用的实验材料。上述分子操作过程中所涉及的PCR、酶切、连接、大肠杆菌细胞转化和农杆菌的转化均为本领域的常规操作。
实施例4
含有p1301UN-OsTAL转基因植物的分子鉴定和表型分析
共获得了14个独立的T0代转p1301UN-OsTAL水稻，将这些植株和未转化受体武运粳8号一起在大田种植。用Trizol法提取T0代过量表达OsTAL基因的转基因植株和未转化受体武运粳8号叶片中的总RNA，反转录获得第一链cDNA，利用实时荧光定量PCR，以基因特异序列为引物随机对其中的3个转基因植株中OsTAL的转录水平进行分析。用于实时荧光定量PCR的反转录试剂为PrimeScriptTM RT Master Mix(购自宝生物工程(大连)有限公司，产品号：RR036A)，反应体系和反应条件参照说明书。用于实时荧光定量分析的试剂为Premix Ex TaqTM II(购自宝生物工程(大连)有限公司，产品号：RR820A)。仪器为美国Life Technologies公司实时荧光定量PCR仪ABIVii A7。反应体系参照说明书。OsTAL基因特异上游引物序列为：5'-AGATACGAGGCTGTGATTGA-3'；下游引物序列为：5'-TCTTGGCACCTTTCTTGAC-3'。用Actin基因作物内参，其上游引物序列为：5'-GATGACCCAGATCATGTTTG-3'；其下游引物序列为：5'-GGGCGATGTAGGAAAGC-3'。PCR程序为：预变性3min，然后进入PCR循环，循环参数为94℃15s变性→55℃15s复性→72℃40s延伸，进行40个循环。
结果如图3所示，与未转化对照武运粳8号相比，在Actin基因作为内参的情况下，7个转基因植株中OsTAL的转录水平均有显著上调，说明目标基因OsTAL已经成功导入受体武运粳8号中，并且发挥了作用。收获这3个T0代转基因植株的种子，种植得到T1代植株，收获T2代种子，然后种植T2代转基因植株。
图4～图8分别显示了对T2植株株高、籽粒长、籽粒宽、籽粒厚和籽粒百粒重统计图，分别调查10-20株，结果取平均值。结果表明，未转化对照武运粳8号的株高为107.7cm，OsTAL过量表达转基因株系(株系编号：ZY14895、ZY14906、ZY14908)的株高分别是对照的112％(120.5cm)、110％(118.2cm)和106％(113.7cm)；未转化对照武运粳8号的粒长为7.2355mm，过量表达转基因株系(ZY14895、ZY14906、ZY14908)的粒长分别是对照的101％(7.3423mm)、103％(7.4400mm)和103％(7.4775mm)；未转化对照武运粳8号的粒宽为3.1840mm，过量表达转基因株系(ZY14895、ZY14906、ZY14908)的粒宽分别是对照的104％(3.3270mm)、107％(3.4220mm)和110％(3.4870mm)；未转化对照武运粳8号的粒厚为2.3035mm，过量表达转基因株系(ZY14895、ZY14906、ZY14908)的粒厚分别是对照的105％(2.4250mm)、108％(2.4790mm)和107％(2.4665mm)；未转化对照武运粳8号的百粒重为2.6781g，过量表达转基因株系(ZY14895、ZY14906、ZY14908)的百粒重分别是对照的104％(2.7720g)、106％(2.8460g)和106％(2.8350g)。
植株和籽粒表型分别如图9和图10所示，与未转化对照武运粳8号相比，T2代过量表达OsTAL基因的水稻株高增加，种子变大(株系编号：ZY14908)。
Claims (9)
1.一种植物株高和籽粒大小相关的OsTAL基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID No:1所示。
2.一种权利要求1所述植物株高和籽粒大小相关的OsTAL基因编码的蛋白质，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。
3.一种表达载体，其特征在于，含有权利要求1所述的核苷酸序列。
4.一种重组工程菌，其特征在于，含有权利要求3所述的表达载体。
5.一种培育株高和籽粒大小改良的转基因植物的方法，其特征在于，包括用具有SEQ ID No:1所示的核苷酸序列的基因导入目的植物，培育得到株高和粒型改良的转基因植物。
6.根据权利要求5所述的培育株高和籽粒大小改良的转基因植物的方法，其特征在于，所述粒型改良为如下1)-4)中的至少一种:
1)所述转基因植物的株高大于所述目的植物；
2)所述转基因植物的种子粒宽大于所述目的植物；
3)所述转基因植物的种子粒厚大于所述目的植物；
4)所述转基因植物的种子的粒重大于所述目的植物，所述粒重为百粒重。
7.根据权利要求6所述的培育株高和籽粒大小改良的转基因植物的方法，其特征在于，所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物，
8.根据权利要求7所述的培育株高和籽粒大小改良的转基因植物的方法，其特征在于，所述单子叶植物为水稻，
9.根据权利要求8所述的培育株高和籽粒大小改良的转基因植物的方法，其特征在于，所述水稻的品种为武运粳8号。
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