CN104560906B - 纤维细胞中特异表达的蛋白质CYP734A1 like‑1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及纤维细胞中特异表达的蛋白质CYP734A1 like‑1及其应用。本发明要解决的技术问题是为改善目前得的纤维特异或优势表达的基因还是太少，还不能满足改良棉花纤维产量和品质分子设计的需要。本发明公开的蛋白质CYP734A1like‑1，具有如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。本发明还提供了表达所述蛋白的植物表达载体。本发明为改善棉花纤维品质和改良棉花品种提供新选择。

Description

纤维细胞中特异表达的蛋白质CYP734A1 like-1及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及纤维细胞中特异表达的蛋白质CYP734A1like-1及其应用。

背景技术

棉花是世界上主要的纤维作物之一。棉花纤维细胞是棉花胚珠外珠被表皮细胞经分化突起和极性伸长而成的单细胞。其生长发育过程分为四个既明显区分又有所重叠的时期：纤维细胞起始期、纤维细胞伸长期、次生壁增厚期和脱水成熟期。每个时期都有各自的特点，但相邻发育时期又有所重叠。纤维发育的每个时期对纤维的产量和/或品质都有影响，纤维的分化起始决定了单粒胚珠中纤维的数量，纤维细胞伸长速率和持续时间主要决定了纤维的长度，次生壁沉积的方式和持续时间主要决定了成熟纤维的强度和次生壁厚度。纤维伸长期是(初生壁合成期)从开花当天开始，可以持续到开花后25天(25DPA)，主要进行细胞极性伸长和初生细胞壁的合成，这时期的纤维伸长速率和持续时间决定纤维的最终长度，陆地棉纤维长径比可达1000-3000。但迄今为止，我们对调控其发育过程的分子机制仍知之甚少。

由于棉花纤维细胞是一个特殊的细胞，其发育过程中必定有特殊的基因表达和相关调控机制。因此筛选纤维细胞特异表达的基因成为棉花纤维分子生物学研究的热点。通过cDNA文库差示筛选、cDNA代表性差异分析、抑制差减杂交和mRNA差异显示技术，以及近年来发展而成的基因芯片技术、高通量测序技术等，克隆和分析了纤维中特异或优势表达基因。John和Crow于1992年首次通过cDNA文库差异筛选，克隆了纤维发育早期特异表达的E6基因[John M E,Crow L J.1992.Gene expression in cotton(Gossypium hirsutum L.)fiber：Cloning of the mRNAs.Proc Natl Acad Sci USA，89(13)：5769-5773].利用同样的方法，Rinehart等(1996)分离到了纤维发育中后期特异表达基因FbL2A[Rinehart J A，Petersen M W，John M E.1996.Tissue specific and developmental regulation ofcotton gene FbL2A.Plant Physiology,112(3):1331-1334]。近年来，纤维特异或优势表达的微管蛋白基因、伸展蛋白基因、脂转移蛋白基因等被相继克隆和分析[吕少溥,王旭静,唐巧玲,等.2014.棉纤维特异基因及其特异启动子的研究进展.生物技术进展，4(1):1-6]。这些研究结果不仅证实了纤维特异或优势表达基因对纤维细胞的发育具有重要作用，而且为解析了纤维细胞生长发育的调控机制提供了实验数据。但是到目前为止，获得的纤维特异或优势表达的基因还是太少，还不能满足改良棉花纤维产量和品质分子设计的需要。

发明内容

本发明要解决的技术问题是为改善棉花纤维品质提供一种新选择，以改善目前得的纤维特异或优势表达的基因还是太少，还不能满足改良棉花纤维产量和品质分子设计的需要。

本发明的技术方案是在纤维细胞中特异表达的蛋白质CYP734A1 like-1，具有(a)如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。

具体的，所述蛋白的编码GhCYP734A1L-1基因具有：

(a)如SEQ ID NO.1所示的cDNA(cDNA即互补脱氧核糖核酸，为具有与mRNA(信使RNA)链呈互补的碱基序列的单链DNA)；

或(b)如SEQ ID NO.2所示的基因组DNA(基因组DNA即gDNA)。

本发明还提供了表达所述蛋白质的植物表达载体。

具体的，所述的植物表达载体为超量表达GhCYP734A1L-1基因或者反义抑制GhCYP734A1L-1基因的载体。

本发明还提供了含有所述载体的宿主细胞。

具体的，所述的宿主细胞为农杆菌。

本发明还提供了所述的CYP734A1 like-1或植物表达载体在改良棉花品种中的应用。

本发明还提供了所述CYP734A1 like-1或植物表达载体在改良棉花纤维品质中的应用。

本发明中，蛋白质GhCYP734A1L-1包括，具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；或将SEQ ID NO.3的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加，且具有与SEQ ID NO.3的氨基酸残基序列相同生物活性的衍生的蛋白质。

SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列为编码棉花GhCYP734A1L-1基因的cDNA序列，SEQID NO.2所示的核苷酸序列为gGhCYP734A1L-1基因的gDNA(基因组DNA)序列。其中所述cDNA序列包含5'-非翻译区序列、开放阅读框(ORF)序列和3'-非翻译区序列，其中开放阅读框序列为编码序列，gDNA序列含有外显子和内含子序列。

本发明的植物表达载体，可采用增强型、组成型或诱导型启动子中的至少一种来调控GhCYP734A1L-1基因的表达。用于构建本发明植物表达载体的启动子优选组成型启动子或组织特异性启动子，更优选来源于花椰菜花叶病毒的植物组成型启动子CaMV35S。通常，将GhCYP734A1L-1基因构建在CaMV35S的下游。用于构建本发明植物表达载体的出发载体可以是任意一种双元农杆菌载体或者可用于基因枪转化的植物表达载体。为了筛选和表达的需要，还可选地在表达载体中包含筛选基因序列、报告基因序列以及其它的为基因工程操作的需要而插入的各种内切酶位点，筛选基因和报告基因可以从本领域常用的基因序列中选择，优选地，本发明的植物表达具有如图5所示的结构。例如，可以在所述表达载体中加入在植物中能表达的编码可发生颜色变化的酶或发光化合物的基因，如GUS(β-葡萄糖苷酸酶)基因、GFP(绿色荧光蛋白)基因、荧光素酶等；具有抗性的抗生素标记物，如抗庆大霉素标记物、抗卡拉霉素标记物等；抗化学试剂标记基因，如抗除草剂基因等。

本发明采用超量或抑制GhCYP734A1L-1表达载体制备转基因植物的方法，包括以下步骤：

1)将GhCYP734A1L-1基因与启动子可操作地连接；

2)构建含有GhCYP734A1L-1基因与启动子的植物表达载体；

3)用所述植物表达载体转化宿主，获得转化体；

4)用所述转化体转化植物，获得转基因植物。

本发明中，可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物或微生物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导或农杆菌介导等常规生物学方法，将含有本发明GhCYP734A1L-1基因的表达载体转染棉花而获得转化体。

本发明的有益效果：

本发明所公开GhCYP734A1L-1基因的编码蛋白质可促进棉花纤维伸长，提高棉花纤维长度，增加纤维品质和产量；因此可利用该基因来改良棉花纤维品质，同时还可以根据需要选用不同类型的启动子，来改良棉花纤维品质或者改善棉花株型，以有利于棉花产量品质的提高和特殊的栽培操作(如机械采收操作和高密度栽培等)。

附图说明

图1：GhCYP734A1L-1蛋白质与其他物种相关蛋白质的同源性比较；

gi144905179：豌豆(Pisum sativum)细胞色素P450家族蛋白；gi15225777：拟南芥(Arabidopsis thaliana)细胞色素P450蛋白(CYP734A1)；gi225445412：葡萄(Vitisvinifera)类细胞色素P450蛋白(CYP734A1-like)；gi255566913：蓖麻(Ricinus communis)类细胞色素P450蛋白；gi356563055：大豆(Glycine max)类细胞色素P450蛋白(CYP734A1-like)；gi590577824：可可(Theobroma cacao)细胞色素P450蛋白；gi728846626：中棉假拟蛋白。本图显示GhCYP734A1L-1与其他物种的细胞色素P450蛋白(CYP734A1)具有较高的同源性，GhCYP734A1L-1基因是CYP734A1的同源基因。

图2：GhCYP734A1L-1的进化树分析；

本图显示GhCYP734A1L-1基因与中棉和可可中的同源基因亲缘关系最近。

图3：GhCYP734A1L-1基因的表达分析；

其中A：GhCYP734A1L-1基因在不同组织、器官和细胞中的表达模式；

其中B：GhCYP734A1L-1基因在纤维细胞和胚珠不同发育时期的表达水平；OF-0DPA～OF-4DPA：开花当天的胚珠(含纤维细胞)到开花后4天的胚珠(含纤维细胞)；F-6DPA～F-16DPA：开花后6天的纤维到开花后16天的纤维；O-6DPA～O-16DPA：开花后6天的胚珠到开花后16天的胚珠。本图显示GhCYP734A1L-1基因在纤维细胞中特异表达，在根、茎、叶、花、子叶、下胚轴和胚珠几乎不表达。图中胚珠中的微弱表达可能是纤维细胞从胚珠表面剥离时残留的纤维细胞所致。

图4：GhCYP734A1L-1基因在陆地棉野生型TM-1和其超短纤维突变体li-1的纤维和胚珠中的表达；

TM-1：陆地棉野生型；li-1：超短纤维突变体；FO-0DPA:开花当天的胚珠纤维；FO-6DPA:开花后6天的胚珠纤维；F-10DPA：开花后10天的纤维细胞；O-10DPA：开花后10天的胚珠。本图显示GhCYP734A1L-1基因在超短纤维突变体开花后6天的胚珠纤维中和开花后10天的纤维细胞中的表达远远低于其野生型相同发育时期对应纤维和胚珠中的表达。说明GhCYP734A1L-1基因在纤维伸长过程中具有重要作用。

图5：含GhCYP734A1L-1基因的植物表达载体的结构图；

其中CaMV 35S代表CaMV 35S启动子；GhCYP734A1L-1代表GhCYP734A1L-1基因cDNA；Ter代表终止子；LB代表T-DNA左边界；RB代表T-DNA右边界。

图6：本发明优选的植物表达载体pC-CaMV 35S-GhCYP734A1L-1结构图；

其中GusPlus-His6代表GUSPlus报告基因，该基因在C端融合了His6序列标签；NPTII代表新霉素磷酸转移酶基因，具有卡拉霉素抗性；Ter：Nos终止子；CaMV35S：来源于花椰菜花叶病毒的植物组成性启动子；LB：T-DNA左边界；RB：T-DNA右边界。植物表达载体为改造的pCambia载体(详见实施例三)。

图7：本发明优选的反义抑制GhCYP734A1L-1基因植物表达载体pC-CaMV 35S-反义GhCYP734A1L-1结构图。其中GusPlus-His6代表GUSPlus报告基因，该基因在C端融合了His6序列标签；NPTII代表新霉素磷酸转移酶基因，具有卡拉霉素抗性；Ter：Nos终止子；CaMV35S：来源于花椰菜花叶病毒的植物组成性启动子；LB：T-DNA左边界；RB：T-DNA右边界。植物表达载体为改造的pCambia载体(详见实施例三)。

图8：转基因棉花的鉴定；

其中A：转基因棉花的组织化学鉴定，WT：非转基因棉花(野生型)，作对照；pC-CaMV35S-反义GhCYP734A1L-1为反义抑制GhCYP734A1L-1基因的转基因棉花叶片；pC-CaMV35S-GhCYP734A1L-1代表超量表达GhCYP734A1L-1基因的转基因棉花叶片；

其中B：超量表达GhCYP734A1L-1转基因棉花的扩增验证，M：DNA marker2000；H₂O：以水为PCR扩增模板，作空白对照；+：以pC-CaMV 35S-GhCYP734A1L-1质粒为PCR扩增模板，作阳性对照；1和2：超量表达GhCYP734A1L-1转基因棉花1#和2#。

其中C：反义抑制GhCYP734A1L-1转基因棉花的扩增验证，M：DNA marker15；-：非转基因棉花(野生型)，作阴性对照；H₂O：以水为PCR扩增模板，作空白对照；+：以pC-CaMV35S-反义GhCYP734A1L-1质粒为PCR扩增模板，作阳性对照；1～3：反义抑制GhCYP734A1L-1转基因棉花1#～3#。

图9：转基因棉花中GhCYP734A1L-1基因的表达分析；

其中A：反义抑制GhCYP734A1L-1转基因棉花纤维中GhCYP734A1L-1基因的表达分析，WT:非转基因棉花(野生型)；S1～S13:反义抑制GhCYP734A1L-1转基因棉花1#～13#。

其中B：超量表达GhCYP734A1L-1转基因棉花叶片中GhCYP734A1L-1的表达分析，WT：非转基因棉花(野生型)；O1～O14:超量表达GhCYP734A1L-1转基因棉花1#～14#。

本图表明，通过棉花遗传转化，获得GhCYP734A1L-1基因表达水平增加和降低的转基因棉花。

图10：超量表达GhCYP734A1L-1基因对棉花植株生长发育的影响；

其中A：非转基因棉花(野生型)和超量表达GhCYP734A1L-1转基因棉花植株的生长状况；左为野生型棉花植株，右为超量表达GhCYP734A1L-1转基因棉花植株，标尺＝10cm。

其中B：野生型棉花叶片和转基因棉花叶片的比较；左为野生型棉花成熟叶片，右上为转基因棉花幼叶，右下为转基因棉花成熟叶片，标尺＝10cm。

其中C：野生型棉花叶片和转基因棉花叶片的叶绿素含量比较；WT:非转基因棉花(野生型)叶片；O1:超量表达GhCYP734A1L-1转基因棉花叶片。

其中D：野生型棉花叶片和转基因棉花叶片的气孔开闭情况；下图为非转基因棉花(野生型)叶片上气孔的开闭情况，上图为转基因棉花叶片上气孔的开闭情况。

图11：反义抑制GhCYP734A1L-1基因对棉花纤维长度的影响；

其中A：棉花成熟纤维的长度比较；WT：非转基因棉花(野生型)；S1:反义抑制GhCYP734A1L-1转基因棉花1#株系；

其中B：棉花胚珠离体培养体系中，非转基因棉花(野生型)和反义抑制GhCYP734A1L-1转基因棉花纤维的生长情况；WT：非转基因棉花(野生型)；S1:反义抑制GhCYP734A1L-1转基因棉花1#株系；

其中C：成熟纤维的纤维长度测量统计，野生型和转基因纤维各检测20粒，经过纤维梳理后测量其长度。WT：非转基因棉花(野生型)；S1:反义抑制GhCYP734A1L-1转基因棉花1#株系。

具体实施方式

本发明实例中的试剂药品未做具体说明的均为普通市售，材料方法未做具体说明的均参考《分子克隆实验指南》(Sambrook和Russell,2001)。

在本发明的下述实例中，所用的棉花实验材料为冀棉14(Gossypium hirsutumcv.Jimian14)，为生产上栽培品种；TM-1(Gossypium hirsutum cv.TM-1)及其超短纤维突变体(ligon lintless-1,li-1)。野生型TM-1从每次播种的li-1突变体中分离出来(li-1突变体是一个显性突变体，纯合体致死。因此每季只需要收获突变体种子，该种子播种后长出的棉花幼苗中有一部分是分离出来的野生型，即TM-1)，li-1突变体来自中国农科院棉花研究所种质库，公开发放。

实施例1 GhCYP734A1L-1基因的克隆和序列分析

1、棉花RNA的提取

选取约3g新鲜棉花材料，在液氮中迅速磨成精细粉末，装入50mL离心管，加入15ml65℃预热的RNA提取液(2％CTAB(W/V)，2％PVP(W/V)，100mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，0.5g/L亚精胺，2.0mol/L NaCl，2％巯基乙醇(V/V)，使用前加入))，颠倒混匀。65℃水浴3～10min，期间混匀2～3次。氯仿︰异戊醇(24︰1)抽提2次(10,000r/min，室温，5min)。取上清，加入1/4体积10mol/L LiCl溶液，4℃放置6h，以氯仿︰异戊醇(24︰1)各抽提1次(10,000r/min，室温，5min)。加2倍体积的无水乙醇，在-70℃冰箱沉淀30min以上。12,000r/min，4℃离心20min，弃上清。沉淀用200μL的DEPC处理水溶解。酚(pH4.5)︰氯仿︰异戊醇(25︰24︰1)、氯仿︰异戊醇(24︰1)各抽提1次(10,000r/min，室温，5min)。加1/10体积3mol/L NaAc溶液和2.5倍体积的无水乙醇，在-70℃冰箱沉淀30min以上。12,000r/min，4℃离心20min，弃上清。沉淀用70％的酒精漂洗一次，风干。加200μL的DEPC处理水溶解。用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量。

2、cDNA合成

以棉花各种样品总RNA，用试剂盒(Fermentas)合成cDNA一链。具体方法为：取约10μg总RNA到DEPC处理的扩增管中，加入1μL 2.5μmol/L Oligo-dT，加DEPC处理的水至终体积12μL，70℃水浴5min使RNA变性后，立即冰浴3min。然后向扩增管中依次加入4μL 5×缓冲液，2μL 10mmol/L dNTPs，1μL RNase抑制剂(20U)，37℃处理5min。加入1μL逆转录酶AMVRtase(5U)后，保温程序为42℃，60min；70℃，5min；5℃，5min。程序结束后，cDNA一链产物于-20℃冻存。

3、棉花基因组DNA的提取

采用改良的CTAB法提取棉花基因组DNA。取0.5g棉花幼叶，在液氮中迅速研磨成粉，加入3mL 65℃预热的CTAB提取液，快速振荡混匀。65℃水浴30min，然后加入1mL 5mol/LKAc，冰浴20min后，用等体积的氯仿︰异戊醇(24︰1)抽提1次(12,000r/min，4℃离心5min)，取上清，加入2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇,混匀,静置约30min，挑出絮状沉淀，75％的乙醇反复漂洗3次，再用无水乙醇漂洗1次，吹干，重溶于500μL TE中。加入1μL RNaseA(10mg/mL)，37℃处理1h。再用酚︰氯仿︰异戊醇(25︰24︰1)和氯仿︰异戊醇(24︰1)各抽提1次(12,000r/min，4℃离心5min)，取上清，加入2倍体积的无水乙醇沉淀DNA。-20℃放置约30min，离心(12,000r/min，4℃离心5min)，弃上清，沉淀用75％的乙醇漂洗，风干，溶于200μL TE中，-20℃保存备用。

4、筛选高同源棉花EST序列

以拟南芥油菜素类固醇代谢基因CYP734A1的蛋白质序列搜索NCBI数据库中的棉花EST(Expressed Sequence Tag，表达序列标签)序列，对搜索到的高同源性棉花EST序列进行整合分析，获得一条整合序列，再将整合序列发到NCBI数据库中进行比对，确定整合序列是不是编码CYP734A1的同源基因，如果是，则在整合序列所含ORF(开放阅读框，openreading frame)的两侧设计扩增引物，进行基因克隆。

5、GhCYP734A1L-1基因cDNA序列和基因组序列的扩增

以整合序列为基础，在其ORF的两侧设计扩增引物，5'端引物是GhCYP734A1L-1-3(SEQ ID NO.4)和3'端引物是GhCYP734A1L-1-4(SEQ ID NO.5)，以12DPA纤维cDNA为模板进行PCR。25μL的cDNA扩增体系含2.5μL 10×Ex PCR缓冲液(无Mg²⁺)，2μL 2.5mmol/L dNTPs，2μL 25mmol/L MgCl₂，1μL特异引物GhCYP734A1L-1-3(SEQ ID NO.4)(5μmol/L)，1μLGhCYP734A1L-1-4(SEQ ID NO.5)(5μmol/L)，0.2μL Ex Taq DNA聚合酶，1μL cDNA一链产物。扩增程序为：94℃，5min；94℃，30sec，56℃，30sec，72℃，1.5min，30个循环；72℃延伸10min。

同时以棉花基因组DNA为模板和相同的引物进行扩增，20μL的基因组DNA扩增体系含10μL 2×PrimerStar mix，1μL特异引物GhCYP734A1L-1-3(SEQ ID NO.4)(5μmol/L)，1μLGhCYP734A1L-1-4(SEQ ID NO.5)(5μmol/L)，1μL gDNA和7μL水。扩增程序为：94℃，5min；94℃，30sec，56℃，30sec，72℃，20sec，30个循环；72℃延伸10min。

6、扩增片段回收，连接，转化大肠杆菌DH5a

(1)电泳

将扩增产物在1.0％(W/V)琼脂糖凝胶中进行电泳分离。

(2)回收

使用回收试剂盒：回收步骤按照试剂盒说明书进行，回收片段在琼脂糖凝胶上电泳定量。

(3)克隆和测序

回收的片段经琼脂糖凝胶电泳定量。按试剂盒说明书，通过回收片段与克隆载体的连接、连接产物的大肠杆菌转化、阳性菌落的培养和质粒酶切验证，将回收片段克隆到pGEm-T(上海Sangon)载体上。序列测定由英骏公司完成。

回收的片段与pGEm-T(上海生工)载体建立如下连接体系：10×T4 DNA连接缓冲液1μL，载体DNA片段1μL，外源连接产物DNA片段1μL，T4 DNA连接酶1μL，用双蒸水补足体积至10μL。

载体DNA片段与外源连接产物DNA片段摩尔比为1︰3，16℃连接12h。之后将连接产物转化大肠杆菌DH5a。

7、GhCYP734A1L-1基因序列分析

以陆地棉冀棉14 12DPA纤维cDNA为模板，扩增出一条大约1700bp的特异带。测序后发现该扩增特异片段长1730bp(SEQ ID NO.1)，包含一个完整的开放阅读框(ORF)，长1575bp。编码一个524个氨基酸残基的蛋白质(SEQ ID NO.3)，该蛋白质预测的分子量为59.8kD，等电点为9.498。

在NCBI上搜索GhCYP734A1L-1的同源蛋白，结果表明GhCYP734A1L-1属于细胞色素P450家族的CYP734A亚家族。该蛋白与豌豆(Pisum sativum)CYP734A1蛋白(gi144905179)；大豆(Glycine max)类细胞色素P450蛋白(CYP734A1-like)(gi356563055)；拟南芥(Arabidopsis thaliana)细胞色素P450蛋白(CYP734A1)(gi15225777)；葡萄(Vitisvinifera)类细胞色素P450蛋白(CYP734A1-like)(gi225445412)；蓖麻(Ricinuscommunis)类细胞色素P450蛋白(gi255566913)；可可(Theobroma cacao)细胞色素P450蛋白(gi590577824)等蛋白具有较高的同源性，GhCYP734A1L-1与这些蛋白的相同氨基酸残基分别达到79％、63％、66％、72％和65％，相似氨基酸残基分别达到88％、85％、84％、83％和78％(图1)。说明GhCYP734A1L-1是CYP734A1基因的同源基因。

系统进化分析结果表明GhCYP734A1L-1与可可、葡萄、杨树和蓖麻的CYP734A1具有较近的亲缘关系，而与豌豆和拟南芥等物种的CYP734A亚家族蛋白的亲缘关系较远(图2)。

同时从陆地棉中克隆了GhCYP734A1L-1基因的基因组DNA序列，该序列长2978bp(SEQ ID NO.2)，通过与GhCYP734A1L-1基因的cDNA序列进行比对和根据GT-AG内含子识别规律分析，结果发现，GhCYP734A1L-1基因组序列含有5个外显子和4个内含子。

实施例2 GhCYP734A1L-1基因在棉花植株和纤维发育中的表达分析

以合成的cDNA一链作为模板，采用实时定量PCR试剂盒(Bio-Rad)进行PCR。表达引物依据GhCYP734A1L-1基因的cDNA序列设计，5’端引物为GhCYP734A1L-1-1(SEQ ID NO.6)，3’端引物为GhCYP734A1L-1-2(SEQ ID NO.7)。在20μL的反应体系中包括10μL MIX缓冲液(包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、dNTPs和MgCl₂)，5'-端和3'-端引物各1μL(5μmol/L)。循环参数为94℃预变性3min；94℃，30sec，55℃，30sec，72℃，30sec，预设循环数为40。用棉花GhHISTONE3基因(GenBank登录号：AF024716)作内标，GhHISTONE3基因的5'-引物是GhHIS-1(SEQ ID NO.8)，3'-引物为GhHIS-2(SEQ ID NO.9)。

1、不同组织器官和纤维胚珠发育的不同时期的表达模式

提取陆地棉(Gossypium hirsutum L.)各组织和器官的总RNA，并合成cDNA一链。用实时定量RT-PCR检测了GhCYP734A1L-1基因在不同组织和器官中的表达情况。检测结果表明，GhCYP734A1L-1基因在纤维细胞中特异表达，在根、茎、叶、花、子叶、下胚轴和胚珠几乎不表达。图中胚珠中的微弱表达可能是纤维细胞从胚珠表面剥离时残留的纤维细胞所致(图3A)。说明GhCYP734A1L-1基因是一个纤维细胞特异表达基因。

进一步检测GhCYP734A1L-1在棉花胚珠纤维不同发育时期的表达情况。结果表明(图3B)，该基因在开花当天(0DPA)和开花后2天(2DPA)的胚珠纤维中几乎不表达，在开花后4天(4DPA)胚珠纤维中有微弱表达；在开花后6天(6DPA)至开花后10天(10DPA)的纤维细胞中大量表达，并随着纤维细胞的生长，表达水平逐渐升高，在10DPA时达到表达最高峰；10DPA以后，随着纤维细胞的继续生长，GhCYP734A1L-1基因的表达水平逐渐降低，但在开花后16天(16DPA)纤维细胞中仍有较高的表达水平。胚珠中的表达水平都远远低于相同发育时期纤维中的表达水平，在16DPA胚珠中几乎检测不到GhCYP734A1L-1基因的表达。胚珠中的微弱表达可能是纤维从胚珠表面剥离时残留的部分纤维所致(图3B)。这一表达模式显示GhCYP734A1L-1基因在纤维细胞快速伸长期表达水平最高，其表达水平与纤维细胞伸长速率成正比，说明该基因在纤维细胞伸长中具有重要作用。

2、在超短纤维突变体纤维中的表达差异

ligonless-1(li-1)是一个超短纤维突变体，其纤维在发育早期与其野生型TM-1的纤维发育没有明显的差异，开花后5天时，两者的纤维发育开始出现差异，到纤维成熟时，li-1突变体的纤维长度仅有6毫米左右，而野生型TM-1的纤维长度为29毫米左右。li-1的纤维细胞伸长收到严重抑制，因此该突变体是研究纤维细胞伸长的良好材料。为了进一步明确GhCYP734A1L-1基因在纤维细胞伸长中的作用，利用实时定量RT-PCR检测了TM-1和li-1突变体开花当天的胚珠纤维(FO-0DPA)、开花后6天的胚珠纤维(FO-6DPA)、开花后10天的纤维细胞(F-10DPA)和开花后10天的胚珠(O-10DPA)中GhCYP734A1L-1基因的表达差异。结果表明该基因的表达水平在6DPA胚珠纤维和10DPA纤维中出现显著差异，特别是在10DPA纤维中，该基因在li-1纤维中几乎不表达，而在野生型纤维中该基因具有极高的表达水平。在0DPA胚珠纤维和10DPA胚珠中，该基因在野生型和li-1突变体中都不表达(图4)。由此推测GhCYP734A1L-1基因在6DPA胚珠纤维中的表达差异主要也来源于6DPA纤维细胞中的差异表达。这结果说明GhCYP734A1L-1基因在纤维细胞伸长中具有重要作用。

实施例3 超量表达和反义抑制GhCYP734A1L-1基因植物表达载体的构建以及棉花的遗传转化

1、超量和反义表达载体的构建

pGEm-GhCYP734A1L-1载体是在克隆GhCYP734A1L-1基因时构建，其上的GhCYP734A1L-1片段已测序。植物表达载体为改造的pCambia载体(广州吉赛生物科技有限公司)，该载体的HPT II基因用XhoI单酶切后替换为NPT II基因(设计引物从pBI121载体中扩增获得，引物设计两端带XhoI位点)，限制性酶切和测序结果验证了NPT II基因的方向。在pBI121载体中扩增获得CaMV35S启动子和NOS终止子，同时这两个元件两端也引入了相应的酶切位点，这两个元件最后分别导入pCambia的多克隆位点，形成CaMV35S：：MCS：：NOS单元。该植物表达载体(图5)含有一套2×CaMV35S启动子控制NPTII基因的植物表达元件、一套CaMV35S启动子控制报告基因GRP-GusPlus-His6的植物表达元件和一套CaMV35S启动子控制目标基因的植物表达元件，可实现Kan和GUS活性的双标记筛选。在多克隆位点(Multiple cloning site，MCS)插入外源基因，可以实现外源基因的超量表达。

为了在转基因植物中超量表达GhCYP734A1L-1基因，需要将GhCYP734A1L-1基因正向插入植物表达载体中，并用CaMV35S启动子启动子启动表达，构建了超量表达GhCYP734A1L-1基因植物表达载体pCambia-35S-GhCYP734A1L-1-NOS(简称pC-GhCYP734A1L-1)(图6)。将GhCYP734A1L-1基因反向插入植物表达载体pCambia中，用CaMV35S启动子启动表达，构建了含有GhCYP734A1L-1基因反义序列的植物表达载体pC-CaMV 35S-反义GhCYP734A1L-1，(简称pC-反义GhCYP734A1L-1)(图7)。

2.棉花的遗传转化

用电激法将构建的植物表达载体质粒导入农杆菌LBA4404菌株并进行棉花遗传转化。参考Bio-RAD MicroPulser用户说明书,将上述载体通过电激转化法导入农杆菌LBA4404菌株。

上述的植物表达载体通过农杆菌介导棉花下胚轴转化方法导入棉花。具体方法如下：

冀棉14种子剥去外壳，用0.1％的升汞(HgCl₂)灭菌10min，用大量无菌水冲洗8次。在125mL三角瓶中加入约35mL无菌水震荡过夜，次日换一次无菌水。当种子长出下胚轴根后，播种于种子萌发培养基上，在28℃，黑暗条件下萌发2-3d，此时种子下胚轴开始进入快速伸长的时期，适宜进行遗传转化。

转化用的含pC-CaMV35S-GhCYP734A1L-1和pC-CaMV35S-反义GhCYP734A1L-1植物表达载体的农杆菌菌株在含50mg/L Km和125mg/L Sm的YEB固体培养基上活化。挑取其单菌落，接种于5ml含相同抗生素的YEB液体培养基中，28℃、200r/min震荡培养过夜。培养后的农杆菌菌液按1：20的比例转接到25ml含相同抗生素的YEB液体培养基中，继续培养至OD600值约为0.6-0.8，10,000r/min、1min离心收集菌体，菌体用等体积的液体共培养基重悬备用。

转化时，将棉花下胚轴切成1.5-2.0cm的小段，放入三角瓶中用制备好的农杆菌菌液侵染，条件为28℃摇床120r/min侵染30min。然后吸干菌液，将下胚轴段转到共培养基上，28℃暗培养2-3天。

共培养后，下胚轴段转入到下胚段筛选培养基，28℃光照培养，约20天继代一次，直到出现大量愈伤组织。愈伤组织连同下胚段转移到胚性愈伤诱导培养基，约15天继代一次，直到出现大量的浅黄色胚性愈伤。胚性愈伤挑到胚性愈伤悬浮培养基中，28℃、120r/min摇床培养一周左右。用减去尖头的1.0mL枪头吸取细沙状的体胚平铺于体胚伸长培养基，20-30天后出现大量的绿色小体胚。挑取生长状态良好的体胚继代培养，待体胚伸长到1-2cm时，将其转移到成苗培养基生根出苗。幼苗生长到3-5cm高时，通过嫁接或者移栽的方式转移到温室花钵中生长。其中，本实验例中所用的培养基如表1所示。

表1根癌农杆菌介导的棉花下胚轴遗传转化所用培养基

MS:Murashige&Skoog,1962；B5:Gamborg,1986。

SH培养基：phytoTechnology产品号：S816，lot：11L081602613。

实施例4 转基因棉花的验证

1、组织化学鉴定

由于构建的植物表达载体中具有一套CaMV35S启动子控制报告基GusPlus-His6的植物表达元件，因此可以利用组织化学法鉴定是否是转化植株。待转化植株在生根培养基上生根并长到5～8cm时，将幼苗从培养瓶中取出洗净，转入三角瓶上水培炼苗2～3d。同时，取一小块叶片和一小段根进行GUS染色。结果如图8A所示，野生型叶片GUS染色为阴性，抗性植株叶片GUS染色为阳性，阳性植株直接移栽到营养钵中。

2、扩增验证

待棉花植株移栽成活并生长到一定大小，取0.5g叶片提取棉花基因组DNA，以GUS基因的上下游引物GUS-up(SEQ ID NO.10)和GUS-down(SEQ ID NO.11)进行扩增。25μL的扩增体系含2.5μL 10×PCR buffer，2μL 2.5mmol/L dNTPs，1.5μL 25mmol/L MgCl₂，各1μL引物GUS-up和GUS-down(5μmol/L)，1U Taq DNA聚合酶，1μL基因组DNA(50ng)。扩增程序为：94℃，5min；94℃，30sec，56℃，30sec，72℃，1min，35个循环；72℃延伸10min。用正反植物表达载体质粒作阳性对照，以水和野生型棉花基因组DNA作阴性对照。结果显示GUS染色阳性的转基因棉花植株都能扩增出一条与阳性对照一致的带，说明植物表达载体的T-DNA区段已经整合到转基因棉花基因组中(图8B和8C)。

实施例5 检测GhCYP734A1L-1基因在转基因棉花中的表达变化

按照实施例1中提取棉花RNA的方法，提取转基因棉花和野生型棉花叶片的总RNA，并合成cDNA一链。用Real-Time PCR方法分析转基因棉花中目的基因的表达，PCR在实时定量PCR仪上进行，在25μL的反应体系中包括12.5μL MIX buffer(包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、dNTPs和MgCl₂，实时定量RT-PCR试剂盒提供，Bio-Rad)。GhCYP734A1L-1基因用引物GhCYP734A1L-1-1(SEQ ID NO.6)和GhCYP734A1L-1-2(SEQ ID NO.7)扩增，内标采用棉花GhHISTONE3(GenBank登录号：AF024716)，引物为GhHIS-1(SEQ ID NO.8)和GhHIS-2(SEQ IDNO.9)。扩增程序为：94℃预变性3min；94℃，30sec；56℃，30sec；72℃，30sec；预设循环数为35。在运行实时定量PCR前，用相同引物和模板在相同的温度变化程序中扩增一次，通过扩增产物的电泳，确保扩增产物是单带。实时定量RT-PCR分析的结果表明GhCYP734A1L-1基因在超量表达GhCYP734A1L-1转基因棉花叶片中的表达水平均比对照高(图9B)，由于超量表达该基因使转基因棉花植株的生长受到抑制，不能开花结果，因此不能在转基因纤维中检测该基因的表达变化，因此在叶片中检测了该基因的表达情况，结果表明该基因在转基因棉花叶片表达较高。相反在所有抑制GhCYP734A1L-1基因的转基因棉花纤维中，该基因的表达水平都不同程度降低(图9A)。这结果说明已获得超量表达和反义抑制GhCYP734A1L-1的转基因棉花植株。

实施例6 转基因棉花与野生型棉花的表型比较

1、超量表达GhCYP734A1L-1抑制棉花植株的生长

在试验田中同时栽种pC-GhCYP734A1L-1转基因和野生型棉花，进行正常的生产管理。对GhCYP734A1L-1表达水平增加的转基因棉花进行观察，发现超量表达GhCYP734A1L-1转基因棉花生长收到抑制，植株矮小(图10A)、主茎节间变短、侧枝较少或没有侧枝，且侧枝的节间变短、叶片变小(图10B)、夜色深绿、叶绿素含量增加(图10C)、叶面气孔在失水状态下不关闭(图10D)。这结果说明超量表达GhCYP734A1L-1基因能够抑制棉花植株的生长，转基因植株的株型有明显变化。如果使用茎或枝的特异启动子控制GhCYP734A1L-1基因的表达，将有效地改变转基因植株的株型，在株型育种上具有较大的应用价值。

实施例7 抑制GhCYP734A1L-1基因表达促进棉花纤维伸长

将反义抑制GhCYP734A1L-1的转基因棉花和对照同时栽种到试验田，进行正常的生产管理，观测棉花纤维的生长发育和比较成熟纤维的长度。结果显示，抑制GhCYP734A1L-1基因的转基因棉花植株在生长上与野生型棉花植株没有明显差异，进一步说明该基因不在根、茎、叶和花等器官中不表达。抑制GhCYP734A1L-1基因的转基因棉花成熟纤维比对照长，其平均长度为34.6±0.25毫米，而对照纤维的平均长度为31.9±0.54毫米，纤维长度增加了8.46％(图11A和C)。同时，通过胚珠离体培养观测转基因棉花纤维和对照纤维的生长。结果表明(图11B)，抑制GhCYP734A1L-1表达的转基因棉花胚珠上生长的纤维比野生型胚珠上生长的纤维长。这结果进一步说明GhCYP734A1L-1基因在纤维细胞伸长过程中具有重要作用，其表达水平与纤维长度有密切关系。

Claims (10)

1.植物表达载体，其特征在于：所述载体表达纤维细胞中特异表达的蛋白质 CYP734A1like-1；所述蛋白质CYP734A1 like-1 的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示；所述CYP734A1like-1的编码基因 GhCYP734A1L-1 的cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示或其基因组 DNA如SEQ ID NO. 2所示。

2.如权利要求1所述的载体，其特征在于：所述的植物表达载体为超量表达GhCYP734A1L-1基因的载体。

3.含有权利要求1或2所述载体的宿主细胞。

4.如权利要求3所述的宿主细胞，其特征在于：所述的宿主细胞为农杆菌。

5.权利要求 1或2任一项所述的植物表达载体在改良棉花品种中的应用。

6.植物表达载体，其特征在于：所述载体表达蛋白质CYP734A1 like-1 的编码基因GhCYP734A1L-1的反义序列，所述蛋白质CYP734A1 like-1 的氨基酸序列如 SEQ ID NO.3所示；所述CYP734A1like-1 的编码基因 GhYP734A1L-1 的cDNA的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

7.如权利要求6所述的载体，其特征在于：所述的植物表达载体为反义抑制GhCYP734A1L-1 基因的载体。

8.含有权利要求6或7所述载体的宿主细胞。

9.如权利要求 8 所述的宿主细胞，其特征在于：所述的宿主细胞为农杆菌。

10.权利要求6或7所述的植物表达载体在改良棉花纤维品质中的应用。