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CN104936596A - 神经保护性cb2受体激动剂 - Google Patents

神经保护性cb2受体激动剂 Download PDF

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CN104936596A
CN104936596A CN201380047775.8A CN201380047775A CN104936596A CN 104936596 A CN104936596 A CN 104936596A CN 201380047775 A CN201380047775 A CN 201380047775A CN 104936596 A CN104936596 A CN 104936596A
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CN
China
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mda7
rats
receptor
disease
receptor agonist
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Application number
CN201380047775.8A
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English (en)
Inventor
穆罕穆德·纳布吉·阿塔拉
大卫·L·布朗
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Cleveland Clinic Foundation
Original Assignee
Cleveland Clinic Foundation
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Abstract

本发明描述通过给药药学有效量的CB2受体激动剂以治疗或预防个体的神经炎症和/或神经变性疾病的方法。所述CB2受体激动剂可以是式I(以结构表示)的化合物或其药学上可接受的盐，其中R1和R2如本文所定义。所述CB2受体激动剂的给药激活小胶质细胞中的CB2受体，并且可恢复脑中具有升高水平的淀粉样β肽的个体的突触可塑性、认知和记忆。

Description

神经保护性CB2受体激动剂
延续申请信息
本申请要求2012年7月13日提交的美国临时申请第61/671,277号的权益，其公开内容通过引用并入本文中。
背景技术
阿尔茨海默氏病(AD)是年龄相关性神经变性病症，其特征在于记忆和认知功能的逐渐丧失。AD患者的脑的特征在于淀粉样β(Αβ)肽的细胞外聚集的大量沉积物。这些肽形成老年斑和过度磷酸化tau蛋白的细胞内聚集。淀粉样纤维的异常积聚导致神经元回路逐渐丧失、脑中的突触可塑性受损和最终记忆缺陷。另外，淀粉样纤维激活炎症路径，其特征在于，在AD患者的脑中看到激活的小胶质细胞和星形细胞。可能的情况是，神经炎症可诱导有益的免疫反应，从而实现淀粉样纤维的吞噬，以试图限制疾病的发展。Wyss-Coray,T.,Nat.Med.12,1005-1015(2006)。然而，最普遍的证据表明，神经炎症可能是通过由脑中的激活的小胶质细胞和星形细胞产生促炎趋化因子、细胞因子和神经毒素加速AD的驱动力。Perry等人，Nat.Rev.Neurol.6,193-201(2010)。
大麻素受体(CB)家族目前包括两种克隆的促代谢受体：CB1(主要在脑中发现)和CB2(主要在外周免疫系统中发现，并且较少地在中枢神经系统和小胶质细胞中发现)。向大鼠脑海马中体内注射Αβ1-42导致内源性大麻素水平的增加(van der Stelt等人，Cell.Mol.Life Sci.63,1410-1424(2006))，并且花生四烯酸乙醇胺已被证明可防止细胞培养物中的Αβ毒性(Milton,Neurosci.Lett.332,127-130(2002))。
除了位于脑干和小脑中的小群体神经元以外，健康的脑组织不表达CB2受体。Van Sickle等人，Science 310,329-332(2005)。相反，CB2受体在AD、亨廷顿氏病、猿免疫缺陷病毒诱导的脑炎、HIV脑炎和多发性硬化中在反应性小胶质细胞中上调。体外研究表明，CB2选择性激动剂阻断在将Αβ加入大鼠皮层共培养物中后小胶质细胞介导的神经毒性。此外，向大鼠脑室内给药非选择性大麻素受体激动剂WIN 55,212-2防止Αβ诱导的小胶质细胞激活、认知损害和神经元标记的丧失。CB2激动剂是神经保护性的，并且它们具有没有用CB1激动剂时通常看到的精神不良作用的优点。Ramirez等人，J.Neurosci.25,1904-1913(2005)。相反，CB1激动剂在AD小鼠模型中似乎对AD神经病理学和行为缺陷没有有益的效果。Chen等人，Curr.Alzheimer Res.7,255-261(2010)。
研究表明，在AD背景中，小胶质细胞和星形细胞变成完全反应性的，从而引发导致潜在神经毒性物质(包括细胞因子)的释放的促炎级联，所述潜在神经毒性物质导致神经元的变性改变。CB2在这个过程中也上调。本发明人以前的工作确立1-((3-苄基-3-甲基-2,3-二氢-1-苯并呋喃-6-基)羰基)哌啶(MDA7)为新的血脑屏障渗透剂和高度选择性CB2激动剂。Diaz等人，Chemmedchem 4,1615-1629(2009)。MDA7在CB2基因敲除小鼠中缺乏活性，并且其在大鼠和C57BL/6野生型小鼠中的效果受CB2拮抗剂拮抗。Naguib等人，Anesth.Analg.114,1104-1120(2012)。在体内和体外模型中，MDA7的神经保护效果被发现是通过防止胶质细胞激活来介导。MDA7在其它胶质细胞相关性病理生理学病症(例如AD)中的潜在效果仍未探讨。
发明内容
大麻素2型(CB2)激动剂是神经保护性的，并且似乎在阿尔茨海默氏病的神经变性过程中发挥调节作用。本发明人研究了MDA7(新的缺乏精神活性的选择性CB2激动剂)改善通过向大鼠的海马CA1区中双侧微量注射淀粉样β(Αβ1-40)纤维诱导的神经炎症过程、突触功能障碍和认知损害的效果。在注射Αβ1-40纤维的大鼠中，与腹膜内(i.p.)给药盐水持续14天相比，每天用15mg/kgMDA7i.p.治疗持续14天(i)改善CD11b(小胶质细胞标记)和GFAP(星形细胞标记)的表达，(ii)减少IL-1β的分泌，(iii)降低CB2受体的高涨，(iv)促进Αβ的清除，以及(v)恢复突触可塑性、认知和记忆。研究结果表明，MDA7是用于治疗阿尔茨海默氏病的创新治疗方法。
在一个方面中，本发明提供通过向个体给药药学有效量的CB2受体激动剂治疗或预防所述个体的神经炎症和/或神经变性疾病的方法。在一些实施方案中，所述CB2受体激动剂包含式I的化合物：
或其药学上可接受的盐，其中：R1选自环烷基或杂环烷基，其任何碳原子均可任选地被取代；并且R2选自芳基、环烷基、芳烷基和烯基，其任何碳原子均可任选地被取代。
本发明的另一个方面提供通过向个体给药药学有效量的CB2受体激动剂激活所述个体的小胶质细胞中的CB2受体的方法。在一些实施方案中，所述个体的脑中的淀粉样β肽的水平升高。在其它实施方案中，激活所述CB2受体增加所述个体的突触可塑性、认知或记忆中的一种或多种。在另外的实施方案中，激活所述CB2受体减少由小胶质细胞产生IL-1β并且抑制MAPK。在再一实施方案中，激活所述CB2受体增加所述个体中的谷氨酸能神经传递。
图式简单说明
图1提供柱状图，其示出给药MDA7在Morris水迷宫测试中减弱淀粉样纤维损害的表现。(A)MDA7治疗以剂量依赖性方式降低Morris水迷宫测试中的逃脱等待时间评分。注射淀粉样(Αβ)Αβ1-40纤维并用15mg/kg MDA7腹膜内(i.p.)治疗14天的动物与注射Αβ1-40纤维并用盐水i.p.治疗14天的动物相比，在Morris水迷宫测试中在第3天和第5天具有显著(P<0.05)更短的逃脱等待时间。相比之下，1.5mg/kg MDA7i.p.持续14天在Αβ1-40纤维给药后未实现任何显著的记忆增强，然而，5mg/kg MDA7剂量的效果仅限于第3天和第5天。(B)在第6天进行探索试验以测定与右象限(RQ)、相对象限(OQ)和左象限(LQ)相比在目标象限(TQ或平台象限)中所度过的时间。注射Αβ1-40纤维并用15mg/kg MDA7i.p.治疗14天的大鼠与注射Αβ1-40并用盐水i.p.治疗14天的动物相比在TQ中度过最长时间(P<0.05)。(C)注射Αβ1-40纤维并用盐水i.p.治疗14天的大鼠与接受双侧脑内微量注射人造脑脊液并用盐水i.p.治疗的大鼠(对照)或注射Αβ1-40并用15mg/kg MDA7i.p.治疗14天的动物相比在Morris水迷宫测试中在第3-5天具有显著延长的逃脱等待时间。在MDA7治疗之前给药AM630消除了所观察到的MDA7的效果，这表明MDA7的效果通过刺激大麻素(CB)2受体介导。此外，注射Αβ1-40并仅i.p.接受5mg/kg AM63014天的大鼠与注射Αβ1-40并用盐水i.p.治疗或用5mg/kg AM630加上15mg/kg MDA7i.p.治疗14天的动物相比具有类似的认知损害。接受双侧脑内微量注射人造脑脊液并用盐水i.p.或15mg/kg MDA7治疗14天的大鼠的逃脱等待时间值未表现出显著差异。(D)在探索试验期间，注射Αβ1-40纤维并用15mg/kg MDA7i.p.治疗14天的大鼠与注射Αβ1-40并用盐水i.p.、单独AM630或AM630加上MDA7治疗14天的动物相比在TQ中度过最长时间(P<0.01)。统计显著性通过方差的重复测量分析及随后Student-Newman-Keuls多范围检验来确定。
图2提供的图形和图像示出给药MDA7减弱海马CA1区中淀粉样纤维诱导的CD11b免疫反应性。(A)示出海马墨水注射的大鼠冠状脑切片：注射印度墨水，以确认注射操作是准确的，并且材料被明确注射到大鼠的海马CA1区中。(B)各组大鼠中海马CA1区中的CD11b免疫反应性的免疫荧光图像。(C)CD11b免疫荧光强度的分析(来自每组5只动物的20个切片)表明，接受为期14天的MDA7腹膜内(i.p.)治疗的注射淀粉样β(Αβ)1-40的大鼠与注射Αβ1-40并用盐水i.p.治疗14天的动物相比免疫荧光强度显著较低(P<0.01)。(D)海马CA1区中的CD11b反应性的免疫印迹。(E)CD11b免疫反应性的分析表明，注射Αβ1-40并用盐水i.p.治疗14天的动物中的CD11b强度与对照组(每组n＝5-7)相比显著增加(P<0.01)。这些变化在接受为期14天的MDA7i.p.治疗的注射Αβ1-40的大鼠中显著减弱(P<0.01)。应注意，单独用MDA7治疗与对照大鼠相比对CD11b的表达无显著效果。统计显著性通过单向方差分析及随后Student-Newman-Keuls多范围检验来确定。
图3提供的图形和图像示出给药MDA7减弱海马CA1区中淀粉样纤维诱导的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫反应性。(A)各组大鼠中海马CA1区中的GFAP免疫反应性的免疫荧光图像。(B)GFAP免疫荧光强度的分析(来自每组5只动物的20个切片)表明，接受为期14天的15mg/kg MDA7腹膜内(i.p.)治疗的注射淀粉样β(Αβ)1-40的大鼠与注射Αβ1-40并用盐水i.p.治疗14天的动物相比免疫荧光强度显著较低(P<0.01)。(C)海马CA1区中的GFAP反应性的免疫印迹。(D)GFAP免疫反应性的分析表明，注射Αβ1-40并用盐水i.p.治疗14天的大鼠中的GFAP强度与对照组(每组n＝5-7)相比显著增加(P<0.01)。这些变化在接受为期14天的MDA7i.p.治疗的注射Αβ1-40的大鼠中显著减弱(P<0.01)。应注意，单独用15mg/kg MDA7i.p.治疗与对照大鼠相比对GFAP的表达无显著效果。统计显著性通过单向方差分析随后Student-Newman-Keuls多范围检验来确定。
图4提供的图形和图像示出给药MDA7减弱海马CA1区中Αβ1-40纤维上调的大麻素(CB)2受体的表达。(A)海马CA1区中的CB2染色和定位。示出了小胶质细胞中CB2和CD11b的免疫荧光图像以及CB2和小胶质细胞的共区域化。(B)在对照组中未观察到明显的CB2表达，但在注射Αβ1-40并用盐水腹膜内(i.p.)治疗14天的大鼠中观察到明显的CB2表达(相对于对照，P<0.01)(来自每组5只动物的n＝20个切片)。在接受为期14天的15mg/kgMDA7i.p.治疗的注射Αβ1-40的大鼠中CB2的表达显著降低。(C)代表性免疫印迹条带，其示出所有组中海马CA1区中的CB2受体的表达；(D)所有组中海马CA1组织中的CB2免疫反应性的图形分析(绘图分析？)。应注意，MDA7治疗显著逆转由Αβ1-40诱导的CB2表达的高涨(P<0.01)；每组n＝6。统计显著性通过单向方差分析随后Student-Newman-Keuls多范围检验来确定。数据显示为平均值±平均值的标准误差。比例尺＝40μm。
图5提供的图形和图像示出给药MDA7降低海马CA1区中淀粉样β(Αβ)1-40纤维上调的白细胞介素(ΙL)-1β的水平。(A)所有组中海马CA1组织中的IL-1β反应性的免疫印迹；(B)所有组中海马CA1组织中的IL-1β免疫反应性的图形分析。应注意，为期14天的15mg/kg MDA7腹膜内(i.p.)治疗显著逆转由Αβ1-40诱导的IL-1β蛋白表达的增加(P<0.01；每组n＝5；单向方差分析随后Student-Newman-Keuls多范围检验)。数据显示为平均值±平均值的标准误差。
图6提供的图形和图像示出大麻素(CB)2激动剂MDA7诱导淀粉样β(Αβ)1-40的清除。(A)不同组中海马CA1区中的Αβ1-40沉积物的免疫荧光图像。(B)注射Αβ1-40并用15mg/kg MDA7腹膜内(i.p.)治疗14天的大鼠表现出沉积Αβ肽的减少(相对于注射Αβ1-40并用盐水i.p.治疗14天的大鼠，P<0.01；来自每组5只动物的n＝20个切片)，并且该效果通过预先i.p.给药5mg/kg AM630持续14天而消除。单独i.p.给药5mg/kg AM630对注射的Αβ1-40的清除无效果。统计显著性通过单向方差分析随后Student-Newman-Keuls多范围检验来确定。数据显示为平均值±平均值的标准误差。比例尺＝80μm。
图7提供的图形示出为期14天的腹膜内(i.p.)系统给药15mg/kgMDA7改善海马CA1切片中的淀粉样β(Αβ)1-40损害的基底谷氨酸能强度和长时程增强(LTP)。LTP通过以100Hz对Schaffer侧副-连合纤维电刺激1秒诱导。(A)所有组中在3个等级的刺激强度下诱发的兴奋性突触后电流(EPSC)的代表性轨迹。(B)所有4个组中CA1神经元(每组n＝9-10个神经元)中的诱发的EPSC的输入(刺激强度)-输出(EPSC电流)曲线。(C)示出所有4个组中在基线、电感应后30分钟和60分钟诱发的EPSC的代表性轨迹。(D)所有4个组中海马CA1神经元(来自每组4-5只大鼠的n＝9-12个神经元)中的LTP感应的时程。统计显著性通过方差的重复测量分析随后Student-Newman-Keuls多范围检验来确定。数据显示为平均值±SEM。*P<0.05；**P<0.01，相对于Αβ1-40和Αβ1-40+ΜDΑ7组。
具体实施方式
本发明人已经证明，由MDA7激活中央小胶质细胞CB2受体促进Αβ清除，改善Αβ诱导的胶质细胞激活和IL-1β产生，并恢复突触可塑性、认知和记忆。因此，本发明提供可用于治疗神经炎症和/或神经变性疾病，包括阿尔茨海默氏病的CB2受体激动剂。
定义
如本文所用，下面的术语具有所指示的含义。如在本发明的描述和所附权利要求中所用，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包括其复数形式，除非其周围的上下文有禁忌。
如本文所用，单独或组合的术语“烯基”是指具有一个或多个双键并且含有2-20个，优选2-6个碳原子的直链或支链烃基。亚烯基是指在两个或更多个位置连接的碳-碳双键系统，例如亚乙烯基[(CH＝CH-)，(-C::C-)]。合适的烯基的实例包括乙烯基、丙烯基、2-甲基丙烯基、1,4-丁二烯基等。
如本文所用，单独或组合的术语“烷氧基”是指烷基醚基，其中术语烷基如下文所定义。合适的烷基醚基的实例包括甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基等。
如本文所用，单独或组合的术语“烷基”是指含有1-20个并且包括20个，优选1-10个，更优选1-6个碳原子的直链或支链烷基。烷基可以任选地如本文所定义被取代。烷基的实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、己基、辛基、壬基等。如本文所用，单独或组合的术语“亚烷基”是指衍生自直链或支链饱和烃的在两个或更多个位置连接的饱和脂族基团，例如亚甲基(-CH2-)。
如本文所用，单独或组合的术语“炔基”是指具有一个或多个三键并且含有2-20个，优选2-6个，更优选2-4个碳原子的直链或支链烃基。“亚炔基”是指在两个位置连接的碳-碳三键，例如亚乙炔基(-C:::C-，-C≡C-)。炔基的实例包括乙炔基、丙炔基、羟基丙炔基、丁炔-1-基、丁炔-2-基、戊炔-1-基、3-甲基丁炔-1-基、己炔-2-基等。
如本文所用，单独或组合的术语“氨基”是指-NRR'，其中R和R'独立地选自氢、烷基、酰基、杂烷基、芳基、环烷基、杂芳基和杂环烷基，其中任何一种本身可以任选地被取代。
如本文所用，单独或组合的术语“芳基”是指含有一个、两个或三个环的碳环芳族系统，其中此类环可以链接方式连接在一起或者可以是稠合的。术语“芳基”包括芳族基团，例如苄基、苯基、萘基、蒽基、菲基、茚满基、茚基、轮烯基、薁基、四氢萘基和联苯基。
如本文所用，单独或组合的术语“芳基烷基”或“芳烷基”是指通过烷基连接到母体分子部分的芳基。
术语“杂芳基”是指间杂有一个或多个杂原子的芳基，例如噻吩基、噻唑基或咪唑基，其任选地被至少一个以下基团取代：卤素、含有1-3个碳原子的烷基、烷氧基、芳基、硝基官能团、聚醚基、杂芳基、苯甲酰基、烷基酯基、羧酸基、任选地用乙酰基或苯甲酰基保护的羟基，或者任选地用乙酰基或苯甲酰基保护或任选地被至少一个含有1-6个碳原子的烷基取代的氨基官能团。
如本文所用，单独或组合的术语“环烷基”或替代地“碳环”是指饱和或部分饱和的单环、二环或三环烷基，其中每个环部分含有3-12个，优选5-7个碳原子环成员并且其可任选地为任选地如本文所定义被取代的苯并稠合环系统。此类环烷基的实例包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、八氢萘基、2,3-二氢-1H-茚基、金刚烷基等。如本文所用的“二环”和“三环”意欲包括稠合环系统例如十氢萘、八氢萘以及多环(多中心)饱和或部分不饱和的类型两者。后一种类型的异构体通常由二环[1,1,1]戊烷、樟脑、金刚烷和二环[3,2,1]辛烷例示。
如本文所用，单独或组合的术语“酯”是指桥接两个在碳原子连接的部分的羧基。
如本文所用，单独或组合的术语“醚”是指桥接两个在碳原子连接的部分的氧基。
如本文所用，单独或组合的术语“卤素(halo或halogen)”是指氟、氯、溴或碘。
如本文所用，单独或组合的术语“卤代烷基”是指其中一个或多个氢被替换为卤素的具有如上文所定义的含义的烷基。特别是包括单卤代烷基、二卤代烷基和多卤代烷基。对于一个实例，单卤代烷基在所述基团内可以具有碘、溴、氯或氟原子。二卤代烷基和多卤代烷基可以具有两个或更多个相同的卤素原子或不同卤素基团的组合。卤代烷基的实例包括氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、氯甲基、二氯甲基、三氯甲基、五氟乙基、七氟丙基、二氟氯甲基、二氯氟甲基、二氟乙基、二氟丙基、二氯乙基和二氯丙基。“卤代亚烷基”是指在两个或更多个位置连接的卤代烷基。实例包括氟亚甲基(-CFH-)、二氟亚甲基(-CF2-)、氯亚甲基(-CHCl-)等。
如本文所用，单独或组合的术语“杂烷基”是指稳定的直链或支链或环状烃基或其组合，其完全饱和或含有1-3个不饱和度，由指定数目的碳原子以及1-3个选自O、N和S的杂原子组成，并且其中氮和硫原子可任选地被氧化，并且氮杂原子可任选地被季铵化。杂原子O、N和S可位于杂烷基的任何内部位置。至多两个杂原子可以是连续的，例如-CH2-NH-OCH3。
如本文所用，单独或组合的术语“杂芳基”是指3-7元，优选5-7元不饱和的杂单环或其中至少一个稠合环是不饱和的稠合多环，其中至少一个原子选自O、S和N。该术语也包括其中杂环基与芳基稠合、其中杂芳基与其它杂芳基稠合或其中杂芳基与环烷基稠合的稠合多环基团。杂芳基的实例包括吡咯基、吡咯啉基、咪唑基、吡唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、三唑基、吡喃基、呋喃基、噻吩基、噁唑基、异噁唑基、噁二唑基、噻唑基、噻二唑基、异噻唑基、吲哚基、异吲哚基、吲嗪基、苯并咪唑基、喹啉基、异喹啉基、喹喔啉基、喹唑啉基、吲唑基、苯并三唑基、苯并二氧杂环戊烯基、苯并吡喃基、苯并噁唑基、苯并噁二唑基、苯并噻唑基、苯并噻二唑基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、色酮基、香豆素基、苯并吡喃基、四氢喹啉基、四唑并哒嗪基、四氢异喹啉基、噻吩并吡啶基、呋喃并吡啶基、吡咯并吡啶基等。示例性三环杂环基包括咔唑基、苯并吲哚基、菲咯啉基、二苯并呋喃基、吖啶基、菲啶基、呫吨基等。
如本文所用，单独或组合的术语“杂环烷基”和可互换地“杂环基”各自是指含有至少一个，优选1-4个，更优选1-2个杂原子作为环成员的饱和、部分不饱和或完全不饱和的单环、二环或三环杂环基，其中每个所述杂原子可以独立地选自氮、氧和硫，并且其中优选每个环中存在3-8个环成员，更优选每个环中存在3-7个环成员，最优选每个环中存在5-6个环成员。“杂环烷基”和“杂环基”意欲包括砜、亚砜、叔氮环成员的N-氧化物以及碳环稠合和苯并稠合环系统；另外，这两个术语还包括其中杂环稠合到如本文所定义的芳基或者另外的杂环基的系统。本发明的杂环基由以下基团例示：氮丙啶基、氮杂环丁烷基、1,3-苯并二氧杂环戊烯基、二氢异吲哚基、二氢异喹啉基、二氢噌啉基、二氢苯并二氧杂环己烯基、二氢[1,3]噁唑并[4,5-b]吡啶基、苯并噻唑基、二氢吲哚基、二氢吡啶基、1,3-二噁烷基、1,4-二噁烷基、1,3-二氧戊环基、异二氢吲哚基、吗啉基、哌嗪基、吡咯烷基、四氢吡啶基、哌啶基、硫代吗啉基等。除非明确禁止，否则所述杂环基可任选地被取代。
本文的任何定义可以与任何其它定义组合使用来描述复合结构基团。按照惯例，任何此类定义的后缀元素连接到母体部分。例如，复合基团烷基酰氨基将代表通过酰氨基连接到母体分子的烷基，并且术语烷氧基烷基将代表通过烷基连接到母体分子的烷氧基。
术语“任选地被取代的”是指之前的基团可以被取代或未被取代。当被取代时，“任选地被取代的”基团的取代基可以包括但不限于一个或多个独立地选自下列基团或特别指定的基团组(单独或组合)的取代基：低级烷基、低级烯基、低级炔基、低级烷酰基、低级杂烷基、低级杂环烷基、低级卤代烷基、低级卤代烯基、低级卤代炔基、低级全卤代烷基、低级全卤代烷氧基、低级环烷基、苯基、芳基、芳氧基、低级烷氧基、低级卤代烷氧基、氧代、低级酰氧基、羰基、羧基、低级烷基羰基、低级羧基酯、低级羧酰氨基、氰基、氢、卤素、羟基、氨基、低级烷基氨基、芳基氨基、酰氨基、硝基、巯基、低级烷硫基、芳硫基、低级烷基亚磺酰基、低级烷基磺酰基、芳基亚磺酰基、芳基磺酰基、芳硫基、磺酸酯基、磺酸基、三取代的甲硅烷基、N3、SH、SCH3、C(O)CH3、CO2CH3、CO2H、吡啶基、噻吩基、呋喃基、低级氨基甲酸酯基和低级脲基。两个取代基可以连接在一起形成包含0-3个杂原子的稠合的五元、六元或七元碳环或杂环，例如形成亚甲二氧基或亚乙二氧基。任选地被取代的基团可以是未取代的(例如，-CH2CH3)、完全取代的(例如，-CF2CF3)、单取代的(例如，-CH2CH2F)或以介于完全取代与单取代之间的任何水平取代的(例如，-CH2CF3)。在取代基未限定为取代被提及的情况下，涵盖取代和未取代的形式两者。在取代基限定为“取代”的情况下，明确意指取代的形式。另外，特定部分的不同组的任选取代基可以视需要进行定义；在这些情况下，任选的取代将如通常紧接短语“任选地被…取代的”之后所定义的。
本发明包括本文所述的化合物的任何药学上可接受的形式，包括异构体(例如，非对映异构体和对映异构体)、互变异构体、盐、溶剂合物、多晶型物、前药等。特别地，如果化合物是光学活性的，则本发明具体地包括化合物的每一对映异构体以及对映异构体的外消旋混合物。无论对映异构体是否示于表示化合物的化学式中，都是如此。例如，如果包含手性中心的化合物示出为没有任何立体化学指示，则假定代表化合物的所有可能的立体异构体。应理解，术语“化合物”包括任何或所有的此类形式，无论是否明确陈述(尽管有时明确地陈述“盐”)。
如本文所用，“治疗(treat、treating和treatment等)”是指向受例如阿尔茨海默氏病的病症或疾病折磨的个体提供益处的任何行动。治疗可实现神经变性疾病的完全缓解，但也可包括较低的效果，包括通过减轻或抑制至少一种症状、延迟疾病的进展、避免在已知受阿尔茨海默氏病折磨的人中发生另外的症状等改善病症。
如本文所用，预防是指向处于受例如阿尔茨海默氏病的病症或疾病折磨的风险中的个体提供益处的任何行动，包括避免阿尔茨海默氏病的发生，或减少阿尔茨海默氏病会发生的一种或多种疾病症状。个体可以是由于年老、由于家族史和/或由于各种其它已知的风险因素而处于风险中。
如本文所用，“药学上可接受的”是指化合物或组合物适于根据疾病的严重程度和治疗的必要性向个体给药用于本文所述的方法，而没有过度有害的副作用。
术语“药学有效量”意在限定每种药剂实现降低疾病的严重程度同时避免不利的副作用(例如通常与替代疗法有关的那些)的目标的量。药学有效量可以一个或多个剂量给药。
本发明人已经确定，CB2受体以负反馈环路起作用，并且CB2激动剂的给药可以促进Αβ的清除，改善对Αβ的神经炎症反应，并且防止Αβ诱导的小胶质细胞和星形细胞激活、细胞因子产生、突触可塑性的丧失和认知损害。因此，本发明的一个方面提供通过向个体给药药学有效量的大麻素受体2(CB2)受体激动剂治疗或预防所述个体的神经变性疾病的方法。大麻素受体是在G蛋白偶联受体超家族中的一类细胞膜受体，并且包括亚型CB1和CB2。如本文所定义，CB2受体激动剂是如在下文概述的大麻素受体测定法中所测量，对于CB2受体活性表现出不大于约100μM并且更典型地不大于约50μM的EC50或IC50的化合物。“EC50”是将大麻素受体的活性激活到半数最大水平的调节剂的浓度。“IC50”是将CB2受体的活性降低到半数最大水平的调节剂的浓度。
神经变性疾病是涉及神经元的结构或功能的逐渐丧失，包括神经元的死亡的疾病。存在多种通常与不同类型的神经变性疾病有关的特征，包括蛋白质错折叠、蛋白质降解路径、线粒体功能障碍和程序性细胞死亡。神经变性疾病的实例包括阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿氏病和肌萎缩侧索硬化。在一些实施方案中，所述疾病是神经炎症疾病。神经炎症疾病涉及神经组织的炎症，并且通常涉及小胶质细胞和/或星形细胞的激活以及促炎细胞因子和趋化因子的伴随表达。术语神经炎症已经由本领域技术人员充分定义。O’Callaghan等人，Ann.N Y Acad Sci.,1139,318-30(2008)。
在其它实施方案中，所述疾病涉及在个体的脑中淀粉样β肽的水平升高。“涉及”是指Αβ在疾病的病理学中起作用。水平升高是指水平比在健康个体中发现的水平更高。有多种方式来测定Αβ水平，包括免疫染色、ELISA和原子力显微镜检查。淀粉样β(β淀粉样蛋白)(Αβ)是从淀粉样前体蛋白(APP)加工的36-43个氨基酸的肽，所述淀粉样前体蛋白(APP)人所共知是与阿尔茨海默氏病有关的淀粉样斑的组分。斑由缠结成一团的称为淀粉样纤维的规则有序的纤维状聚集体组成。类似的斑出现在路易体痴呆的一些变体以及包涵体肌炎(肌肉疾病)中，而Αβ也可以形成涂覆脑淀粉样血管病中的脑血管的聚集体。
在一些实施方案中，CB2受体激动剂用于治疗或预防阿尔茨海默氏病。阿尔茨海默氏病(AD)是年龄相关性神经变性病症，其特征在于记忆和认知功能的逐渐丧失。AD患者的脑的特征在于细胞外聚集体(Αβ)肽的大量沉积物。病程分为四个阶段，具有认知和功能损害的渐进模式，包括痴呆前、早期AD、中期AD和晚期AD。阿尔茨海默氏病的症状包括意识错乱、易激惹、攻击性、情绪不稳、语言困难和长期记忆丧失。当怀疑AD诊断时，所述诊断可以通过脑扫描与评估行为和思维能力的测试予以证实。计算机断层扫描(CT)、磁共振成像(MRI)、单光子发射计算机断层扫描(SPECT)和正电子发射断层扫描(PET)是可用于对怀疑患有AD的个体进行脑扫描的成像技术的实例。
已经开发了各种有效的CB2受体激动剂。CB2受体激动剂包括非选择性CB2受体激动剂和选择性CB2受体激动剂。非选择性CB2受体激动剂的实例包括Δ9-四氢大麻酚(Δ9-THC)、(6aR)-反式-3-(1,1-二甲基庚基)-6a,7,10,10α-四氢-1-羟基-6,6-二甲基-6H-二苯并[b,d]吡喃-9-甲醇(HU-210)、(-)-顺式-3-[2-羟基-4-(1,1-二甲基庚基)苯基]-反式-4-(3-羟基丙基)环己醇(CP55940)、(R)-(+)-[2,3-二氢-5-甲基-3-(4-吗啉基甲基)吡咯并-[1,2,3-de]-1,4-苯并噁嗪-6-基]-1-萘基甲酮(R-(+)-WIN55212)、N-花生四烯酸乙醇胺(anandamide)和2-花生四烯酸甘油。
选择性CB2受体激动剂的实例包括3-苄基-3-甲基-2,3-二氢苯并呋喃-6-甲酸-哌啶酰胺(MDA7)、(2-甲基-1-丙基-1H-吲哚-3-基)-1-萘基甲酮(JWH-015)、3-(1,1-二甲基丁基)-6,6,9-三甲基-6a,7,10,10α-四氢-6H-苯并[c]色烯(JWH-133)、HU-308、(2-碘-5-硝基苯基)-[1-(1-甲基哌啶-2-基甲基)-1H-吲哚-3-基]-甲酮(AM1241)、GW405833、GW842166X和O-1966。选择性和非选择性CB2受体激动剂的结构和进一步信息由Guindon等人(Guindon等人，Brit.J.Pharmacol,153,319-334(2008))和Roger Pertwee(Pertwee,R,Brit.J.Pharmacol,156,397-411(2009))描述，所述文献的公开内容通过引用并入本文中。其它CB2受体激动剂可以通过从已知的化学支架开发的化合物高通量筛选来鉴定，如由Whiteside等人(Whiteside等人，Curr Med Chem,14(8),917-36(2007))描述，所述文献的公开内容通过引用并入本文中。
候选CB2受体激动剂可以在动物模型中进行测试。例如，CB2受体激动剂可以在给药Αβ1-40的大鼠中如本文所述进行测试。结果通常在用候选药剂治疗的动物与未接受治疗的对照同窝出生仔畜之间进行比较。转基因动物模型也可用，并且普遍接受作为人类疾病的模型(参见例如Greenberg等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,92:3439-3443(1995))。候选药剂可以在这些动物模型中使用，以确定候选药剂是否减少一种或多种与阿尔茨海默氏病有关的症状，包括例如增加的Αβ水平、记忆的丧失、降低的突触可塑性或其组合。例如，海马LTP被用作用于学习和记忆的关联，并且已经成为用于研究涉及AD相关认知缺陷的机制的有价值的模型。
在一些实施方案中，所述CB2受体激动剂包含式I的化合物：
或其药学上可接受的盐，其中：R1选自环烷基或杂环烷基，其任何碳原子均可任选地被取代；并且R2选自芳基、环烷基、芳烷基和烯基，其任何碳原子均可任选地被取代。在另外的实施方案中，所述CB2受体激动剂包含式I的化合物的S异构体。
已进行的结构活性研究证实式I的CB2受体激动剂的活性。参见Diaz等人，ChemMedChem 4，1615-1629(2009)，所述文献的公开内容通过引用并入本文中。已显示，一些化合物具有比其它化合物更高的活性。例如，不同的活性可以通过改变R2上的取代基来获得。因此，在一些实施方案中，R2是芳基，而在另外的实施方案中，R2是苯基。不同的活性也可以通过改变R1来获得。因此，在一些实施方案中，R1是杂环烷基，而在其它实施方案中，R1是1-哌啶基。
在优选的实施方案中，所述CB2受体激动剂是式II的化合物
该化合物的化学名称为3-苄基-3-甲基-2,3-二氢苯并呋喃-6-甲酸-哌啶酰胺，并且在本文中也称为MDA7。
已进行另外的研究以测定MDA7的一种对映异构体是否比另一种更具活性。尽管两种对映异构体都具有活性，但已显示，S对映异构体表现出更高的活性。参见Luo等人，Tetrahedron Letters,53(26),3316(2012)，所述文献的公开内容通过引用并入本文中。S对映异构体((S)-(3-苄基-3-甲基-2,3-二氢-苯并呋喃-6-基)-哌啶-1-基-甲酮)的结构示于下式III中：
在另一个方面中，提供一种通过向个体给药药学有效量的CB2受体激动剂以激活所述个体的小胶质细胞中的CB2受体的方法。CB2受体激动剂包括本文所述的特异性CB2受体激动剂和非特异性CB2受体激动剂。
在一些实施方案中，所述激活CB2受体的方法使用式I的CB2受体激动剂。在一些实施方案中，所述CB2受体激动剂包含式I的化合物：
或其药学上可接受的盐，其中：R1选自环烷基或杂环烷基，其任何碳原子均可任选地被取代；并且R2选自芳基、环烷基、芳烷基和烯基，其任何碳原子均可任选地被取代。
在一些实施方案中，R2是芳基，而在另外的实施方案中，R2是苯基。不同的活性也可以通过改变R1来获得。在另外的实施方案中，R1是杂环烷基，而在其它实施方案中，R1是1-哌啶基。
在优选的实施方案中，所述CB2受体激动剂是式II的化合物
该化合物的化学名称为3-苄基-3-甲基-2,3-二氢苯并呋喃-6-甲酸-哌啶酰胺，并且在本文中也称为MDA7。在一些实施方案中，所述CB2受体激动剂是S对映异构体((S)-(3-苄基-3-甲基-2,3-二氢-苯并呋喃-6-基)-哌啶-1-基-甲酮)。
在激活个体的小胶质细胞中的CB2受体的方法的一些实施方案中，所述个体的脑中的淀粉样β肽的水平升高。本发明人已经证明，个体中升高水平的淀粉样β肽的存在诱导星形细胞和小胶质细胞的激活以及海马CA1区中的CB2受体的上调，并且用CB2受体激动剂MDA7治疗逆转该过程。由于小胶质细胞的激活会导致炎症，因此，通过逆转小胶质细胞的激活抑制神经组织的炎症可用于治疗或预防涉及神经炎症的神经变性疾病。
本发明人还已经证明，由MDA7激活中央小胶质细胞CB2受体(i)促进Aβ清除，(ii)改善Aβ诱导的胶质细胞激活和IL-1β产生，以及(iii)恢复突触可塑性、认知和记忆。因此，在一些实施方案中，所述激活CB2受体的方法可以增加个体的突触可塑性、认知或记忆中的一种或多种。突触可塑性是两个神经元之间的连接或突触响应于在突触路径中使用或停止使用传递而改变强度的能力。由于记忆被假定通过脑中突触的广大互连网络呈现，因此，突触可塑性是学习和记忆的重要神经化学基础之一。突触可塑性通常测量为诱发电生理学反应的变化，例如递质释放或相对电位的变化。测量个体的认知和记忆能力的定义和方法对于本领域技术人员而言是熟知的。
在另一个实施方案中，激活CB2受体减少由小胶质细胞产生IL-1β。IL-1β由脑中的激活的小胶质细胞和星形细胞合成和释放，并且积极参与淀粉样蛋白诱导的脑炎症、受损的谷氨酸能传递和记忆缺陷的发生。本发明人证明，来自激活的胶质细胞的白细胞介素1β(IL-1β)的水平在微量注射Aβ1-40后在海马CA1区中显著增加，并且这些增加通过为期14天的MDA7治疗而钝化。至少出于IL-1β是神经炎症的重要介质的原因，减少IL-1β是重要的。
在另一个实施方案中，激活CB2受体增加个体中的谷氨酸能神经传递。谷氨酸能神经传递是基于谷氨酸盐的神经传递，谷氨酸盐是哺乳动物中枢神经系统中主要的兴奋性神经递质。Niciu等人，Pharmacol Biochem Behav.100(4),656-664(2012)。谷氨酸能神经传递涉及多种亲离子和促代谢受体，例如NMDA受体和AMPA/红藻氨酸盐受体。本发明人证明，MDA7可有效地改善受Aβ1-40损害的谷氨酸能传递。
本发明的化合物可用于提供预防性和/或治疗性治疗。本发明的化合物可以例如在发生神经变性病症(例如，阿尔茨海默氏病)之前向个体预防性地给药。预防性(即，防止性)给药可有效地降低个体随后发生神经炎症或神经变性疾病的可能性，或者降低随后发生的神经炎症或神经变性疾病的严重程度。预防性治疗可以提供给处于升高的发生神经炎症和/或神经变性疾病的风险下的个体，例如具有神经炎症或神经变性疾病家族史的个体。
本发明的化合物也可以向已经受神经炎症或神经变性疾病折磨的个体治疗性地给药。在治疗性给药的一个实施方案中，所述化合物的给药可有效地消除神经变性疾病；在另一个实施方案中，所述化合物的给药可有效地降低神经炎症或神经变性疾病的严重程度或者延长受累个体的寿命。个体优选是哺乳动物，例如驯养家畜(例如，牛、马、猪)或宠物(例如，狗、猫)。更优选地，个体是人类，在这种情况下，个体还可以称为患者。
在一些实施方案中，CB2受体激动剂可以与一种或多种已知可有效治疗阿尔茨海默氏病的其它药剂组合给药。组合给药是指化合物以同期方式向个体给药。组合给药并不要求药剂同时给药或者将它们配制在一起，尽管在一些实施方案中，可能是这种情况。已知有效治疗阿尔茨海默氏病的其它药剂的实例包括乙酰胆碱酯酶抑制剂例如他克林、利凡斯的明、加兰他敏和多奈哌齐以及NMDA受体拮抗剂美金刚。与其它抗阿尔茨海默氏病剂组合给药也意欲包括与后续开发的抗阿尔茨海默氏病剂一起给药。
本发明的化合物的给药和配制
本发明还提供药物组合物，其包含作为活性成分的化合物(例如由本文所述的化学式定义的那些)以及与所述活性成分组合的药学上可接受的液体或固体载体。任何上文描述为适于治疗癌症的化合物均可以包含在本发明的药物组合物中。
化合物可以作为药学上可接受的盐给药。药学上可接受的盐是指化合物的相对无毒性的无机和有机酸加成盐。这些盐可以在本发明的化合物的最终分离和纯化期间原位制备，或者通过分别使本发明的纯化的化合物与合适的抗衡离子(取决于化合物的性质)反应并分离由此形成的盐来制备。代表性抗衡离子包括氯化物、溴化物、硝酸盐、铵、硫酸盐、甲苯磺酸盐、磷酸盐、酒石酸盐、乙二胺和马来酸盐等。参见例如Haynes等人，J.Pharm.Sci.,94，第2111-2120页(2005)。
所述药物组合物包含一种或多种本发明的化合物以及各种用于递送到患者的生理上可接受的载体(包括本领域的普通技术人员已知的各种稀释剂或赋形剂)中的一种或多种。例如，对于胃肠外给药，优选等渗盐水。对于局部给药，可以使用乳膏，其包含例如二甲基亚砜(DMSO)的载体或通常存在于局部乳膏中的不阻断或抑制化合物的活性的其它药剂。其它合适的载体包括但不限于酒精、磷酸盐缓冲盐水和其它平衡盐溶液。
制剂可方便地以单位剂型呈现，并且可以通过任何药学领域中熟知的方法来制备。优选地，此类方法包括使活性剂与构成一种或多种辅助成分的载体结合的步骤。通常，制剂通过以下方式制备：使活性剂与液体载体、细碎的固体载体或两者均匀且紧密地结合，然后，如果需要，使产物成形为所需的制剂。本发明的方法包括向个体，优选哺乳动物，更优选人类给药可有效产生期望效果的量的本发明的组合物。所配制的化合物可以作为单剂量或以多剂量给药。活性剂的可用剂量可以通过比较它们的体外活性和在动物模型中的体内活性而确定。将在小鼠和其它动物中的有效剂量外推到人类的方法在本领域中是已知的；例如，参见美国专利第4,938,949号。
用于胃肠外给药的制剂包括活性化合物的水性和非水性(油性)无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质；以及水性和非水性无菌混悬剂，其可包含悬浮剂和增稠剂。合适的亲脂性溶剂或媒介物包括脂肪油，例如芝麻油；或合成脂肪酸酯，例如油酸乙酯或甘油三酯；或脂质体。水性注射混悬剂可以含有增加混悬剂的粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。任选地，混悬剂还可以含有合适的稳定剂或增加化合物的溶解度以允许制备高度浓缩的溶液的药剂。
适于通过胃肠外途径给药的制剂的一个实例包含1.00g MDA7、30.00g N-甲基吡咯烷酮、30.00g丙二醇、10.00gELP、10.00g EtOH(95％)和19.00g盐水溶液。制剂的另一个实例基于羟丙基-β-环糊精(HPβCD)，如Astruc-Diaz,F.,McDaniel,S.W.,Xu,J.J.,Parola,S.,Brown,D.L.,Naguib,M.,Diaz,P.2013.In vivo efficacy of enabling formulations based onhydroxypropyl-β-cyclodextrins,micellar preparation,and liposomes for thelipophilic cannabinoid CB2agonist,MDA7.J Pharm Sci 102,352-364中所述。
本发明的药剂优选配制成药物组合物，然后，按照本发明的方法以各种适于所选择的给药途径的形式向个体，例如人类患者给药。所述制剂包括但不限于适于口服、直肠、阴道、局部、鼻、眼或胃肠外(包括皮下、肌内、腹膜内、肿瘤内和静脉内)给药的那些。优选的给药形式是胃肠外给药。
本发明的适于口服给药的制剂可以作为以下形式呈现：离散的单位，例如片剂、含锭、胶囊、糖锭、糯米纸囊剂或扁囊剂，每个单位含有预定量的作为粉末或颗粒的活性剂；含有活性化合物的脂质体；或者在水性液体或非水性液体中的溶液或混悬剂，例如糖浆、酏剂、乳剂或顿服剂。此类组合物和制剂通常含有至少约0.1重量％的活性剂。CB2受体激动剂(即，活性剂)的量应使得剂量水平可有效地在个体中产生期望的效果。
鼻喷雾制剂包含活性剂的纯化的水溶液以及防腐剂和等渗剂。此类制剂优选调整到与鼻粘膜相容的pH和等渗状态。用于直肠或阴道给药的制剂可以作为具有合适的载体例如可可脂或氢化脂肪或氢化脂肪羧酸的栓剂呈现。眼用制剂通过与鼻喷雾类似的方法制备，只是优选调整pH和等渗因子以匹配眼睛的pH和等渗因子。局部制剂包含溶解或悬浮于一种或多种介质例如矿物油、石油、多羟基醇或用于局部药物制剂的其它基质中的活性剂。
用于给药局部药物制剂的优选方法是透皮贴剂。透皮贴剂通过以有效的方式呈现用于吸收的药物以受控速率以最低的药物降解分配药物。典型地，透皮贴剂包含不可渗透的背衬层、单一压敏粘合剂和具有释放衬垫的可除去的保护层。本领域的普通技术人员将理解并了解适于根据技术人员的需要制造期望的有效透皮贴剂的技术。
片剂、含锭、丸剂、胶囊等还可以含有一种或多种以下物质：结合剂，例如黄蓍胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂，例如磷酸二钙；崩解剂，例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、藻酸等；润滑剂，例如硬脂酸镁；甜味剂，例如蔗糖、果糖、乳糖或阿斯巴甜；以及天然或人造调味剂。当单位剂型是胶囊时，它可以进一步含有液体载体，例如植物油或聚乙二醇。各种其它材料可以作为包衣存在或以其它方式改变固体单位剂型的物理形式。例如，片剂、丸剂或胶囊可以涂覆有明胶、蜡、虫胶、糖等。糖浆或酏剂可以含有一种或多种甜味剂；防腐剂，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；延缓糖结晶的药剂；增加任何其它成分的溶解度的药剂，例如多元醇，例如甘油或山梨醇；染料；以及调味剂。用于制备任何单位剂型的材料以所使用的量基本上无毒性。活性剂可以掺入缓释制剂和装置中。
化合物的制备
本发明的化合物可以通过合成途径合成，所述合成途径包括的工序类似于化学领域中熟知的那些。原料通常可从商业来源例如Aldrich Chemicals(Milwaukee,Wisconsin,USA)获得，或者容易地使用本领域技术人员熟知的方法制备(例如，通过概述于以下文献中的方法制备：Louis F.Fieser和Mary Fieser,Reagents for Organic Synthesis，第1-19卷，Wiley,New York,(1967-1999版)；Alan R.Katritsky,Otto Meth-Cohn,Charles W.Rees,Comprehensive OrganicFunctional Group Transformations，第1-6卷，Pergamon Press,Oxford,England,(1995)；Barry M.Trost和Ian Fleming,Comprehensive Organic Synthesis，第1-8卷，Pergamon Press,Oxford,England,(1991)；或者Beilsteins Handbuch derorganischen Chemie,4,Aufl.Ed.Springer-Verlag,Berlin,Germany，包括增刊(也可通过Beilstein在线数据库获得))。特别地，用于制备各种CB2受体激动剂的方法描述于美国专利申请第12/668,840号和美国专利申请第12/668,867号中，其公开内容通过引用并入本文中。
本发明通过以下实施例进行说明。应理解，特定的实施例、材料、量和程序应根据如本文所述的本发明的范围和精神宽泛地解释。
实施例
实施例1：3-苄基-3-甲基-2,3-二氢苯并呋喃-6-甲酸-哌啶酰胺(MDA7)的制 备
A)4-羟基-3-碘-苯甲酸：将4-羟基苯甲酸(0.037mol，5.1g)溶解在100mL甲醇中。添加一当量碘化钠(0.037mol，5.54g)和一当量氢氧化钠(0.037mol，1.48g)，并将溶液冷却到0℃。经75min，在0-3℃下滴加次氯酸钠水溶液(64ml，4.0％NaOCl)。由于每一滴击打溶液，因此，红色几乎瞬间呈现并褪色。将所得无色浆液在0-2℃下搅拌1h，然后用40mL 10％硫代硫酸钠水溶液处理。将混合物用4M HCl水溶液酸化。产物结晶并滤出，得到1.1g。添加乙酸乙酯(250mL)，并分层。将有机层用盐水(240mL)、水洗涤，然后用MgSO4干燥。蒸发溶剂后，获得4.3g白色粉末。将水相酸化到pH 1。添加乙酸乙酯(250mL)，并分层。将有机层用盐水(240mL)、水洗涤，然后用MgSO4干燥。蒸发溶剂后，获得8.22g白色粉末。
B)4-羟基-3-碘苯甲酸甲酯：将3-碘-4-羟基苯甲酸(7.25g，27.4mmol)和硫酸(1.9ml，36mmol)在甲醇中的溶液在55℃下搅拌6小时。TLC(二氯甲烷)：原料的30％。将溶液在室温下搅拌12h。TLC(二氯甲烷)：原料的10％，并在55℃下搅拌2h。冷却后，添加乙酸乙酯(200mL)，并使用碳酸氢钠将混合物调整到pH 3。将有机层用水洗涤两次，然后用MgSO4干燥。过滤并在40℃下旋转蒸发，获得白色固体。将固体与己烷一起研磨，滤出并在减压下干燥。M＝4.47g。收率：59％。
C)4-碘-3-(2-甲基-烯丙氧基)-苯甲酸甲酯：向3-羟基-4-碘苯甲酸甲酯(1.5g，5.4mmol)在无水甲基乙基酮(60mL)中的溶液中添加细粉状碳酸钾(1.49g，10.78mmol)，随后添加3-溴-2-甲基丙烯(0.81mL，1.1g，8.15mmol)。将反应混合物在70℃下加热4h。将所述混合物稀释过滤，用水洗涤，并用MgSO4干燥。在真空中蒸发溶剂和剩余的溴丙烯，得到为黄色油状物的所需烷基化酯。M：1.4g，收率：78％。
NMR(CDCl3,1H)：1.90(3H,d,J＝1.2Hz),194(3H,s),4.56(2H,s),5.06(1H,d,J＝1.2Hz),5.25(1H,d,J＝1.2Hz),7.38(1H,dd,J＝8.1Hz,J＝1.8Hz),7.44(1H,d,J＝1.8Hz),7.88(1H,d,J＝1.8Hz)。
D)3-苄基-3-甲基-2,3-二氢-苯并呋喃-6-甲酸甲酯：向4-碘-3-(2-甲基-烯丙氧基)-苯甲酸甲酯(455mg，1.37mmol)在DMF(15mL)中的溶液中添加碳酸钾(379mg，2.74mmol)、四丁基氯化铵(380mg，1.37mmol)、在DMF(5mL)中的乙酸钯(25.6mg，0.136mmol)和苯基硼酸(200mg，1.64mmol)。将所得混合物在115℃下搅拌3h，冷却到室温，通过硅胶过滤，用水洗涤，用MgSO4干燥并浓缩。柱色谱法(硅胶，庚烷/CH2Cl2：4/6)得到368mg(95％)为结晶的浅棕色油状物的标题化合物。Mp：52℃。
NMR(CDCl3,1H)：1.38(3H,s),2.86(1H,d,J＝14Hz),2.93(1H,d,J＝14Hz),3.89(3H,s),4.12(1H,d,J＝8.7Hz),4.55(1H,d,J＝8.7Hz),6.93-6.98(3H,m),7.22-7.24(3H,m),7.38(1H,d,J＝1.2Hz),7.59(1H,dd,J1＝7.5Hz,J2＝1.2Hz)。
E)3-苄基-3-甲基-2,3-二氢-苯并呋喃-6-甲酸：将3-苄基-3-甲基-2,3-二氢-苯并呋喃-6-甲酸甲酯(300mg，1.06mmol)、氢氧化钠(260mg，6.5mmol)、乙醇(10ml)和水(1ml)在四氢呋喃(10ml)中的混合物在室温下搅拌12h。将反应介质通过添加1.2M盐酸溶液酸化并用乙酸乙酯萃取。将有机相用水洗涤，干燥(Na2SO4)，并在旋转蒸发器中浓缩。获得为白色固体的产物(300mg，100％)。Mp：165℃。
NMR(CDCl3,1H)：1.39(3H,s),2.87(1H,d,J＝14Hz),2.93(1H,d,J＝14Hz),4.14(1H,d,J＝8.7Hz),4.57(1H,d,J＝8.7Hz),6.96-7.00(3H,m),7.22-7.25(3H,m),7.45(1H,d,J＝1.2Hz),7.65(1H,dd,J1＝7.8Hz,J2＝1.2Hz)。
F)3-苄基-3-甲基-2,3-二氢苯并呋喃-6-甲酸-哌啶酰胺：向3-苄基-3-甲基-2,3-二氢-苯并呋喃-6-甲酸(80mg，0.3mmol)和哌啶(28mg，33μL，0.33mmol)在二氯甲烷(3mL)和DMF(2mL)中的搅拌过的悬浮液中添加O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU)(125mg，0.33mmol)，然后添加N,N-二异丙基乙胺(58mg，78μL，0.45mmol)在DMF(1mL)中的溶液。将反应混合物在环境温度下搅拌18h。将反应介质通过添加1.2M盐酸溶液酸化并用乙酸乙酯萃取。将有机相用水洗涤，干燥(MgSO4)，并浓缩以得到酰胺，通过快速色谱法(AcOEt/庚烷：4/6)对其进行纯化，得到50mg白色固体(收率：50％)。
NMR(CDCl3,1H)：1.36(3H,s),1.54-1.67(6H,m),2.85(1H,d,J＝13.2Hz),2.90(1H,d,J＝13.2Hz),3.35(2H,m),3.68(2H,m),4.09(1H,d,J＝8.7Hz),4.53(1H,d,J＝8.7Hz),6.75(1H,m),6.88(1H,dd,J1＝7.5Hz,J2＝1.2Hz),6.94(1H,d,J＝7.5Hz),7.00(2H,m),7.21-7.24(3H,m)。
实施例II：CB 2 受体系统的激活逆转淀粉样蛋白诱导的记忆缺陷
在本研究中，本发明人证明，MDA7通过钝化神经炎症过程施加神经保护效果，所述神经炎症过程对于Αβ诱导的神经毒性的发生至关重要。发现，MDA7可以：(1)促进Αβ清除，(2)防止星形细胞中的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和小胶质细胞中的CD11b(指示神经炎症过程的激活)的水平的增加，所述增加通常在注射Αβ的大鼠的海马中看到；(3)减少白细胞介素(IL)-1β的产生；(4)改善注射Αβ的大鼠的海马中Αβ介导的谷氨酸能传递的抑制；以及(5)防止在注射Αβ的大鼠中使用Morris水迷宫测试的空间记忆表现的认知损害。由于该CB2激动剂可防止Αβ诱导的神经炎症和其后续后果-突触可塑性和认知损害，因此，假设CB2受体以负反馈环路起作用，并且其激活可以诱导Αβ清除以及钝化神经炎症反应和由Αβ纤维诱导的认知损害。
材料和方法
动物和治疗方案。所有动物操作均由Animal Care and UseCommittee of Cleveland Clinic批准。将动物圈养在Institutional Biological RodentUnit中维持12/12h光照/黑暗循环，可随意获得水和食物颗粒。使用重200-250g的成年雄性Sprague-Dawley(Charles River,Wilmington,MA)大鼠，并且所有实验都在光照循环期间进行。
将动物分成若干组(每组40-50只大鼠)。Αβ1-40组接受一次双侧脑内微量注射Αβ1-40纤维，并且每天腹膜内(i.p.)接受盐水，为期14天。Αβ1-40+MDA7组接受一次双侧脑内微量注射Αβ1-40纤维，并且每天i.p.接受15mg/kg MDA7，为期14天。其它群组每天i.p.接受较小剂量的MDA7(5mg/kg或1.5mg/kg)，为期14天，以测定MDA7的剂量-反应特性。在其它组中，单独(Αβ1-40+AM630组)或在给药MDA7(15mg/kg i.p.)之前15min(Αβ1-40+MDA7+AM630组)向注射Αβ1-40纤维的大鼠每天i.p.给药5mg/kg AM630(CB2拮抗剂)，为期14天。MDA7组和对照组接受一次双侧脑内微量注射人造脑脊液(130mM NaCl、2.6mM KCl、4.3mM MgCl2和1.8mM CaCl2)，并且分别每天i.p.接受15mg/kgMDA7或盐水，为期14天。在脑内微量注射Αβ1-40后的同一天开始腹膜内给药AM630、MDA7或盐水。所有药物均编以代码制备。在所有实验结束时进行解码。
将淀粉样纤维微量注射到海马CA1区中。将大鼠用戊巴比妥钠(45mg/kg i.p.)麻醉，并限制在立体定位仪中。如前所述形成Αβ1-40纤维。Chacon等人，Mol Psychiatry 9(10),953-61(2004)。将Αβ1-40纤维(10μg/3μl)或3μl人造脑脊液使用10μl汉密尔顿注射器用27G不锈钢针以0.5μl/min的速率以立体定位且双侧方式注射到每个海马(坐标：前囟-3.5mm前后，±2.0mm中间外侧，以及-3.0mm背腹侧)中。该实验模型已被用于研究AD。Ahmed等人，Neuroscience 169(3),1296-306(2010)。
Morris水迷宫测试。如Chacon等人(同上)所述，在手术后15天对大鼠群组(每组n＝10)进行测试。在所有组中在这天的同一时间进行测试。实验设备由圆形水池(直径为120cm，高45cm)组成。将看不见的平台(直径为15cm，高35cm)置于水表面下方1.5cm处。水温保持在24-28℃。所述水池位于测试室中，并且从水池可以看见迷宫外部的许多线索，这可由大鼠用来进行空间定位。线索的位置在整个任务期间保持不变。每只大鼠每天经历四次试验，为期五天。在每次试验(记忆获得)期间，将大鼠随机放置在四个固定起点中的一个，并允许游泳120秒或者直到它们到达平台后从水中逃出。平台在整个测试期间位于相同的位置在一个象限的中间。在每次试验中，将起始位置移动到不同的象限，以使得在连续的试验中不使用单一起始位置。在每个训练期中，记录逃脱到隐藏的平台的等待时间。在大鼠到达平台后，允许他们在那里休息20秒，然后将其从水池中取出。使用至少4分钟的试验间间隔以确保每个大鼠的表现不因疲劳而受损。在完成四次试验后，将大鼠从水池中取出，干燥，并返回其居住的笼子。第6天，所有大鼠进行一次其中平台被除去的探索试验(记忆提取)，并且每只动物有60秒在所述水池搜寻平台。所有行为测试都由对不同治疗组不知情的单一实验者进行。在行为测试后，将大鼠处死，并收集海马组织用于进一步研究。
海马切片的制备。制备含有海马的脑切片。从已进行Morris水迷宫测试的所有大鼠(每组n＝10-12只大鼠)获得用于电生理学记录的脑切片。所有大鼠均用戊巴比妥麻醉，然后通过断头无痛致死。将脑迅速取出，并在Vibratome(Leica VT-1000S)上在冷的(4℃)生理盐水中切割，以获得含有海马的冠状切片(厚300μm)。将单一切片浸没在浅记录室中，并灌注温的(35℃)生理盐水(126mM NaCl、2.5mM KCl、1.2mM NaH2PO4、1.2mM MgCl2、2.4mMCaCl2、11mM葡萄糖和25mM NaHCO3，用95％O2和5％CO2饱和，pH7.3-7.4)。在整个记录实验期间，切片保持在约35℃下。
海马切片中的全细胞膜片钳记录。使海马切片在将其使用正置显微镜用红外光照射可视后恢复1h。来自CA1区的全细胞电压钳记录使用Axopatch 200B放大器(Molecular Devices)用含有以下内部溶液(mM)的2-4ΜΩ玻璃电极获取：K-葡糖酸盐或甲磺酸铯，125；NaCl，5；MgCl2，1；EGTA，0.5；Mg-ATP，2；Na3GTP，0.1；HEPES，10；pH 7.3；290-300mOsmol。≥2GΩ的封接电阻和15-20ΜΩ的入口电阻被认为是可以接受的。串联电阻最适宜补偿≥70％，并且在整个实验期间不断监测。除非另有说明，否则在整个实验期间膜电位保持在-70mV。Schaffer侧副-连合纤维通过超薄同心双极电极(FHC公司，Bowdoinham，ME)刺激，并且除非指定，否则调整刺激强度以诱发约35％的最大刺激。在GABAA拮抗剂荷包牡丹碱(30μΜ)存在下，在CA1区中记录兴奋性突触后电流(EPSC)。将诱发EPSC在2kHz下过滤，在10kHz下数字化，并使用Axograph X软件获取和分析。EPSC的振幅监测至少15分钟的基线期。如果突触传递稳定(在15分钟内EPSC的振幅的变化<15％)，则由单一高频电刺激串诱导长时程增强(LTP)(100Hz持续1秒)。所有电生理学实验均在室温(23±2℃)下进行。
免疫染色。进行海马切片的免疫染色。Bie等人，J Neurosci 30(16),5617-28(2010)。将大鼠群组(每组n＝10-12)用60mg/kg戊巴比妥钠深度麻醉，并且经心脏(transcardially)灌注0.1M PBS，然后灌注4％福尔马林。收集脑干，在相同的固定剂中后固定4小时，然后在PBS中的30％蔗糖中冷冻保护3天。从固定的脑切割含有海马CA1区的连续切片(30μm，15-20个/大鼠)。将切片在具有0.3％Triton X-100加5％正常驴血清的0.01M PBS中孵育至少1小时。将初级抗体和次级抗体稀释在具有0.3％Triton X-100加1％牛血清的0.01MPBS中。将切片在4℃下使用针对CB2的兔抗体(1:500,Thermo Scientific,Rockford,IL)、针对小胶质细胞标记CD11b的小鼠单克隆抗体(1:200,Abeam,Cambridge,MA)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体(1:400；Abeam,Cambridge,MA)处理过夜，以用于双标记免疫荧光。将其它切片在4℃下使用Αβ1-40(11A50-B10)单克隆抗体(1μg/ml PBS，Covance San Diego CA)处理过夜，以用于免疫荧光。然后，将切片用FITC偶联次级抗体(1:500,JacksonImmunoResearch,West Grove,PA)或Cy3偶联次级抗体(1:500,JacksonImmunoResearch,West Grove,PA)的混合物孵育1小时。初级抗体和次级抗体的省略导致未免疫染色。从每只大鼠随机选择3-6个切片，并由一个对所检查组织的来源不知情的研究者使用Leica DMLB荧光显微镜(Leica MicrosystemsWetzlar GmbH,Germany)进行分析。使用MCID核心软件7.0版(InterFocusImaging有限公司，Cambridge,England)量化图像。
蛋白质提取和免疫印迹。将来自所有组中的大鼠(每组n＝10-12只大鼠)的海马CA1组织在含有50mM Tris-Cl、150mM NaCl、0.02mM NaN2、100μg/ml苯基甲基磺酰氟、1μg/ml抑肽酶、1％Triton X-100和蛋白酶抑制剂混合液的冰冷的裂解缓冲液中轻轻地均质化。将裂解物在4℃下以14,000rpm离心10分钟，并且上清液用于SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。蛋白质浓度通过使用Bio-Rad(Hercules,CA)蛋白质测定试剂盒来测定。
将样品用SDS样品缓冲液在95℃下处理5分钟，加载在7.5％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上，并转印到硝酸纤维素膜上。将印迹在4℃下用兔多克隆抗CB2初级抗体(1:100；Santa Cruz Biotechnology公司，Santa Cruz,CA)、单克隆抗CD11b抗体(1:1000；Abeam,Cambridge,MA)、单克隆抗GFAP抗体(1:1000；Abeam,Cambridge,MA)、山羊多克隆抗IL-1β抗体(1:300；Abeam,Cambridge,MA)或单克隆抗β肌动蛋白抗体(1:250；Santa Cruz Biotechnology公司)孵育过夜。将膜用Tris缓冲盐水彻底洗涤，并用辣根过氧化物酶偶联的抗小鼠和抗兔IgG抗体或抗山羊IgG抗体(1:10,000；Jackson ImmunoResearch Laboratories公司，West Grove,PA)孵育。使用增强的化学发光(ECL Advance试剂盒；Amersham Biosciences)检测免疫反应性。带的强度以数字方式获取，并用ImageJ软件进行定量分析。将CB2、CD11b和GFAP的免疫反应性标准化到β肌动蛋白的免疫反应性。
化合物。由人类野生型序列的残基1-40组成的Αβ肽(Αβ1-40)从Bachem(Torrance,CA,USA)购得。AP-5(D-2-氨基-5-膦酰戊酸)、CNQX(6-氰基-2,3-二羟基-7-硝基喹喔啉)、荷包牡丹碱和其它化学品(NaCl、KCl、NaH2PO4、MgCl2、CaCl2、葡萄糖、NaHCO3、EGTA、Mg-ATP、Na3GTP、HEPES和Triton-X100)从Sigma Aldrich(St.Louis,MO)或Tocris(Ellisville,MO)购得。AM630(6-碘-2-甲基-1-[2-(4-吗啉基)乙基]-1H-吲哚-3-基](4-甲氧基苯基)甲酮)从Tocris(Ellis ville,MO)购得。如先前所述合成MDA7(hCB1Ki值>10,1000nM；hCB2Ki值＝422nM；rCB1Ki值＝2565nM；rCB2Ki值＝238nM；hCB1的EC50＝不具活性，hCB2的EC50＝128nM；rCB1的EC50＝不具活性；rCB2的EC50＝67nM)。Diaz等人，ChemMedChem 4(10),1615-29(2009)。
数据分析和统计。行为数据使用重复测量ANOVA随后事后Student-Newman-Keuls多范围检验进行分析。使用单向ANOVA随后事后Student-Newman-Keuls多范围检验对免疫染色和免疫印迹数据进行分析，以用于组平均值。诱发EPSC和LTP数据使用重复测量ANOVA随后事后Student-Newman-Keuls多范围检验进行分析。所有分析均使用BMDP统计软件包(Statistical Solutions,Saugus,MA)进行。结果表示为平均值和SEM，并且当P<0.05时，它们被认为是显著的。
结果
CB2的激活对行为测试的效果。首先，测定每天i.p.给药(为期14天)三种不同剂量的MDA7(1.5mg/kg、5mg/kg或15mg/kg)对由Αβ1-40诱导的认知损害的效果。重复测量ANOVA确定了在Morris水迷宫测试中MDA7的显著的剂量依赖性记忆增强效果(总F(4,45)＝6.86，n＝50，P＝0.0002)。在第3天(P<0.05)、第4天(P<0.05)和第5天(P<0.05)，注射Αβ1-40纤维并用15mg/kg MDA7i.p.治疗14天的动物与注射Αβ1-40纤维并用盐水i.p.治疗14天的动物相比在Morris水迷宫测试中具有显著更短的逃脱等待时间(图1A)。在探索试验期间注意到类似的观察结果，即注射Αβ1-40纤维并用15mg/kg MDA7i.p.治疗14天的大鼠与注射Αβ1-40并用盐水i.p.治疗14天的动物相比在目标象限(TQ或平台象限)中度过最长时间(P<0.05)(图1B)。注意到，为期14天的1.5mg/kg MDA7i.p.给药的效果没有实现在给药Αβ1-40纤维后任何显著的记忆增强，然而，5mg/kgMDA7剂量的效果仅限于第3天和第5天(图1A)。根据这些数据，选择15mg/kgMDA7的剂量用于进一步研究。
报告于图1C中的数据的重复测量ANOVA确定了六个组间的显著差异(总F(5,54)＝8.10，n＝60，P<0.0001)。在第3天(P<0.01)、第4天(P<0.01)和第5天(P<0.01)，Αβ1-40组中的大鼠与Αβ1-40+MDA7组或对照组中的大鼠相比在Morris水迷宫测试中具有显著延长的逃脱等待时间(图1C)。在探索试验期间(图1D)，Αβ1-40+MDA7组中的大鼠与Αβ1-40组中的大鼠相比在目标象限中度过显著更长的时间(P<0.01)。这表明，MDA7治疗能够防止由Αβ1-40诱导的空间记忆表现的认知损害。
为证实MDA7的CB2特异性效果，单独或在给药MDA7(15mg/kgi.p.)之前15min向注射Αβ1-40纤维的大鼠组每天i.p.给药5mg/kg AM630(CB2拮抗剂)，为期14天。如图1C中所示，在MDA7治疗之前给药AM630逆转MDA7对逃脱等待时间的效果。也在探索测试中注意到AM630的类似效果(图1D)。同时，单独i.p.接受AM630的大鼠(在Αβ1-40+AM630组中)与Αβ1-40组中的大鼠相比在空间记忆或探索测试中没有表现出任何改善(图1C和1D)。在本研究中注意到的不同行为表现不能归因于运动缺陷的存在，因为所有组的大鼠都表现出类似的游泳速度(数据未示出)。结果表明，MDA7对恢复认知和记忆的效果明确地通过CB2受体系统介导。
MDA7有效地改善海马CA1区中的Αβ1-40诱导的胶质细胞激活。微量注射的准确性后来以组织学方式加以证实。图2A示出了海马CA1区中的印度墨水标记的微量注射部位，从而证明注射部位的准确。
之前的研究已经发现AD与胶质细胞激活之间的关联。Akiyama等人，Neurobiol Aging 21(3),383-421(2000)；Perry等人，Nat Rev Neurol 6(4)(2010)。因此，认为MDA7对Αβ1-40诱导的小胶质细胞激活的防止效果可能通过胶质细胞激活的调节而介导。已经将特异性标记例如CD11b和GFAP的表达的增加分别与小胶质细胞(Eng,J Neuroimmunol 8(4-6),203-14(1985))和星形细胞的激活联系起来。
为期14天的每天i.p.给药15mg/kg MDA7对Αβ1-40诱导的小胶质细胞和星形细胞激活的影响通过比较各治疗组中的大鼠的海马CA1区中的针对CD11b(图2)和GFAP(图3)的免疫荧光染色和免疫印迹强度的水平进行检查。胶质细胞激活的特征在于这些细胞的数目和复杂性的增加(圆形细胞体和增粗过程)，从而导致标记细胞的数目和标记细胞的总积分强度两者的增加(图2B和图3A)。当在微量注射Αβ1-40并用盐水i.p.治疗14天后检查大鼠中的海马CA1区时，与对照组相比，分别在小胶质细胞(图2B和2C，F(3,76)＝243.2，n＝80个切片(来自每组5只动物的每只动物3-5个切片)，单向ANOVA随后Student-Newman-Keuls多范围检验，P<0.01)和星形细胞(图3A和3B，F(3,76)＝225.3，n＝80个切片(来自每组5只动物的每只动物3-5个切片)，P<0.01)中注意到增加的CD11b和GFAP免疫反应性、增大的细胞团和增加的细胞复杂性。
CD11b(图3D和3E，每组n＝6只大鼠，F(1,10)＝19.9，单向ANOVA随后Student-Newman-Keuls多范围检验，P<0.01)和GFAP(图3C和3D，每组n＝5只大鼠，F(1,8)＝32.7，P<0.01)的蛋白质表达在注射Αβ1-40并用盐水i.p.治疗14天的大鼠中与在对照组大鼠中相比显著更高。这些结果证实，Αβ1-40诱导的脑炎症的特征在于海马CA1区中的小胶质细胞和星形细胞的激活。与注射Αβ1-40并用盐水i.p.治疗14天的动物相比，CD11b和GFAP表达的变化在接受为期14天的MDA7i.p.治疗的注射Αβ的大鼠中显著减弱(图2D和2E，每组n＝6-7只大鼠，F(1,11)＝16.1，单向ANOVA随后Student-Newman-Keuls多范围检验，P<0.01)(图3C和3D，每组n＝5只大鼠，F(1,8)＝46.2，P<0.01)。单独用MDA7治疗与对照大鼠相比对CD11B或GFAP的表达无显著效果。
MDA7调节海马CA1区中的Αβ1-40诱导的CB2受体上调。本发明人先前的研究确立MDA7为有效且选择性的CB2激动剂。Naguib等人，Br JPharmacol 155(7),1104-16(2008)。这里，对Αβ1-40纤维对海马CA1区中的CB2受体的表达的效果进行了检查。已发现，Αβ1-40的给药增强CB2受体的表达(图4A和4B，F(3,76)＝48.45，n＝80个切片(来自每组5只动物的每只动物3-5个切片)，单向ANOVA随后Student-Newman-Keuls多范围检验，相对于对照组P<0.01)，并且该表达与反应性小胶质细胞共定位。向注射Αβ1-40的大鼠i.p.给药15mg/kg MDA7持续14天使得CB2的表达降低(相对于注射Αβ1-40并用盐水i.p.治疗14天的大鼠，P<0.01)。
免疫印迹研究表明，接受微量注射Αβ1-40并用盐水i.p.治疗14天的大鼠中的CB2受体的表达与对照大鼠中的相比更高(图4C和4D，n＝5，F(1,8)＝10.3，单向ANOVA随后Student-Newman-Keuls多范围检验，P<0.05)。此外，用15mg/kg MDA7每天i.p.治疗持续14天显著逆转由Αβ1-40纤维诱导的该CB2受体表达的高涨(图4C和4D，n＝5，F(1,8)＝19.1，单向ANOVA随后Student-Newman-Keuls多范围检验，P<0.01)。MDA7确实对对照大鼠中的CB2受体的表达具有一些效果。这些结果表明，CB2激动剂MDA7实现由Αβ1-40纤维诱导的脑CB2受体的适应和其调节。
MDA7减弱海马CA1区中由Αβ1-40诱导的IL-1β蛋白的表达。为更好地理解MDA7对Αβ诱导的神经炎症的干扰的基础，在海马CA1区中检查MDA7治疗(每天i.p.15mg/kg，持续14天)对促炎细胞因子IL-1β的产生的影响。在脑中，IL-1β主要由激活的小胶质细胞和星形细胞合成和分泌(Kettenmann等人，Physiol Rev 91(2),461-553(2011))，并且它与脑炎症(Gabay等人，Nat Rev Rheumatol 6(4),232-41(2010))和淀粉样蛋白诱导的记忆缺陷(Schmid等人，Hippocampus 19(7),670-6(2009))的发生有关。在本研究中，注射Αβ1-40并用盐水i.p.治疗14天的动物与对照大鼠(n＝5)相比在海马CA1组织中表现出显著更高的IL-1β蛋白质的表达(图5，n＝5，F(1,8)＝63.3，单向ANOVA随后Student-Newman-Keuls多范围检验，P<0.01)。同时，在注射Αβ1-40的大鼠中，为期14天的MDA7治疗显著减弱由微量注射淀粉样纤维诱导的IL-1β的高涨(图5，n＝5，F(1,8)＝34.6，P<0.01)。结果表明，来自激活的胶质细胞的IL-1β的水平在微量注射Aβ1-40后在海马CA1区中显著增加，并且这些增加通过为期14天的MDA7治疗钝化。
MDA7有效地促进注射在海马CA1区中的Αβ1-40的清除。体外研究(Tolon等人，Brain Res 1283,148-54(2009))已经表明，CB2激活诱导β-淀粉样蛋白的去除，并且该效果被CB2拮抗剂阻断。因此，本发明人希望MDA7会增强大鼠中注射的Αβ1-40的清除机制。在注射Αβ1-40的大鼠中，为期14天的MDA7治疗(每天15mg/kg)诱导Αβ1-40的去除(图6，F(3,76)＝707.07，n＝80个切片(来自每组5只动物的每只动物3-5个切片)，单向ANOVA随后Student-Newman-Keuls多范围检验，P<0.01)，并且该效果通过预先i.p.给药5mg/kg AM630持续14天而消除。本发明人还观察到，单独i.p.给药5mg/kgAM630对注射的Αβ1-40的清除无效果。结果表明，MDA7介导的认知改善与Αβ肽的增强的清除相关。
MDA7有效地改善海马CA1区中的Αβ1-40损害的谷氨酸能传递。因此，在所有组间比较CA1神经元中的诱发EPSC的输入(刺激强度)-输出(电流振幅)反应。如图7A和7B中所示，与对照组相比，在所有三个刺激强度下，Αβ1-40组中的诱发EPSC的振幅均显著较小，表明CA1神经元中的基底谷氨酸能强度减弱。然而，在所有三个刺激强度下，在Αβ1-40+MDA7组中，大鼠中来自注射Αβ1-40的大鼠的CA1神经元中诱发EPSC的振幅通过为期14天的15mg/kg MDA7i.p.治疗而恢复(图7A和7B)。海马切片中的基底谷氨酸能强度在对照组与MDA7组之间没有不同。这些结果表明，MDA7的给药显著改善通过向海马中微量注射Αβ1-40纤维诱导的受损的基底谷氨酸能强度。
在注射盐水的大鼠的海马切片中，对Schaffer侧副-连合纤维的高频电刺激诱导CA1神经元中的持续一个多小时的显著突触增强。诱导后30分钟和60分钟的平均LTP分别为210.5±18.6％和224.7±2.2％(n＝12，重复测量ANOVA随后Student-Newman-Keuls多范围检验，当与基线比较时P<0.01，图7C和7D)。同时，在注射Αβ1-40的大鼠的海马切片中，由高频电刺激诱导的LTP的强度显著减弱。诱导后30分钟和60分钟的平均LTP分别为107.1±14.0％和110.4±15.6％(n＝10，重复测量ANOVA随后Student-Newman-Keuls多范围检验，当与注射盐水的大鼠比较时P<0.01，图7C和7D)。然而，在来自Αβ+MDA7组的海马切片中，诱导后30分钟和60分钟的平均LTP分别为214.5±23.6和195.7±21.8(n＝9，重复测量ANOVA随后Student-Newman-Keuls多范围检验，当与注射Αβ1-40的大鼠比较时P<0.01，图7C和7D)。注意到，单独给药MDA7未能显著影响对照大鼠的海马切片中的LTP诱导。这些结果表明，MDA7的给药显著改善通过微量注射Αβ1-40纤维诱导的受损的海马突触可塑性。
讨论
结果表明CB2激动剂MDA7在以下方面具有有前途的潜在作用：(i)促进Αβ清除；(ii)改善Αβ诱导的胶质细胞激活和细胞因子产生；以及(iii)恢复突触可塑性、认知和记忆。MDA7的效果通过预先给药CB2拮抗剂AM630而消除。单独给药AM630未对Αβ相关病理学产生任何有益的效果。本发明的体内研究证实，Αβ1-40纤维的微量注射显著(P<0.01)诱导星形细胞和小胶质细胞的激活以及海马CA1区中CB2受体的上调，并且MDA7治疗逆转该过程。用盐水i.p.治疗的大鼠中的Αβ1-40微量注射与海马CA1区中CB2表达的增加相关(图4)而用CB2激动剂MDA7治疗改善淀粉样纤维的效果的发现提出以下可能性：CB2受体充当负反馈调节剂，并且其通过MDA7的激活可用以限制神经炎症反应的程度和Αβ诱导的神经毒性的后续发生。
在本研究中，与对照相比，在用盐水i.p.治疗的大鼠中微量注射Αβ1-40后，海马CA1区中的小胶质细胞(CD11b)和星形细胞(FGAP)激活标记(在第15天测量)显著增加(P<0.01)(图2和图3)。Αβ聚集体是强有力的神经毒素和小胶质细胞激活剂(Cameron和Landreth，2010)。结果与其中在海马、额皮质中脑内微量注射Αβ1-42或脑室内给药Αβ25-35的先前公布的报道一致，即，Αβ的中央给药与小胶质细胞(Ramirez等人，J Neurosci 25(8),1904-13(2005))和星形细胞的激活相关联。该神经炎症过程似乎促成和/或反映脑中的神经元功能障碍，并且发现与AD中的认知功能逆相关(Edison等人，Neurobiol Dis 32(3),412-9(2008))。此外，在AD患者的脑组织中通常观察到小胶质细胞和星形细胞的激活(通过细胞肥大、GFAP、星形胶质细胞S100B和CD11b蛋白质的表达的增加证明)。尽管微摩尔浓度的Αβ可诱导对神经元的直接毒性，但纳摩尔水平的浓度可通过小胶质细胞介导的机制诱导神经元丧失。似乎Αβ沉积在胶质细胞激活中代表重要的触发因素(可能经由与小胶质细胞表面受体的相互作用(El Khoury等人，Nature 382(6593),716-9(1996))，从而导致脑中的炎症反应。Meda等人，Neurobiol Aging 22(6),885-93(2001)。尽管已经报道CB2拮抗剂SR144525的给药可以在降低Αβ1-40诱导的星形细胞激活中发挥作用，但数据表明，向注射Αβ1-40的大鼠i.p.给药5mg/kg AM630(CB2拮抗剂)持续14天未能改善认知功能或诱导Αβ清除。
结果表明，在双侧微量注射Αβ1-40后海马中的IL-1β水平增加，并且该增加通过MDA7治疗而阻止。CB2受体的激活已被证明减少体外大鼠小胶质细胞、人类小胶质细胞((Stella,Glia 48(4),267-77(2004))和人类星形细胞中以及围产期缺氧缺血、亨廷顿氏病和紫杉醇诱导的神经炎症的动物模型中促炎分子的产生。Naguib等人，Anesth Analg,114(5):1104-20(2012)。IL-1β由脑中的激活的小胶质细胞和星形细胞合成和释放，并且积极参与淀粉样蛋白诱导的脑炎症、受损的谷氨酸能传递和记忆缺陷的发生。IL-1β的脑室内给药显著诱导记忆缺陷，所述记忆缺陷通过若干个记忆任务中受损的表现证明。在海马神经元的原代培养物中，IL-1β(而不是IL-10或肿瘤坏死因子α)显著下调AMPA受体亚基GluR1的表面表达和Ser831磷酸化，所述GluR1在突触可塑性中起重要作用。IL-1受体在脑中的拮抗作用减轻由Αβ诱导的受损的突触可塑性。这些之前的报道确立从激活的小胶质细胞和星形细胞释放的IL-1β为阿尔茨海默氏病的发病机理和发生的重要因素。
在本研究中，在微量注射Αβ1-40纤维后注意到大鼠海马CA1组织中CB2受体表达的增加。MDA7似乎通过CB2受体系统的激活有效地抑制小胶质细胞和星形细胞的活动以及IL-1β的产生。之前的研究已经证明，胶质细胞有关的斑中CB2受体的表达在死后AD脑中增加。Ramirez等人，J Neurosci 25(8),1904-13(2005)。非选择性大麻素受体激动剂WIN 55,212-2的脑室内给药有效地阻止Αβ25-35诱导的小胶质细胞的活动。不同的大麻素(WIN 55,212-2、HU-210和JWH-113)阻断培养的小胶质细胞的Αβ1-40诱导的激活。Ramirez等人，同上。在原代小胶质细胞培养物中，Αβ1-42诱导的CB2受体的激活和JWH-015(CB2激动剂)的给药显著抑制小胶质细胞因子和一氧化氮的产生，并且减弱CD40介导的对Αβ1-42的小胶质细胞吞噬作用的抑制。Ehrhart等人，JNeuroinflammation 2,29(2005)。
CB2受体的体外激活促进从人类冰冻组织切片去除天然Αβ以及由人类巨噬细胞系去除合成致病肽。Tolon等人，Brain Res 1283,148-54(2009)。数据表明，由MDA7激活CB2受体系统可能通过恢复小胶质细胞的吞噬功能促进Αβ1-40的清除(图6)。小胶质细胞在促进Αβ的清除和吞噬中发挥重要作用，并且细胞因子的产生与Αβ的清除之间存在反相关。然而，随着AD进展，小胶质细胞继续产生促炎细胞因子，但失去其Αβ清除能力。Hickman等人，JNeurosci 28(33),8354-60(2008)。因此，阿尔茨海默氏病脑中的小胶质细胞CB2受体的上调可能将CB2受体定位为内源性保护机制，以限制该疾病中的神经炎症和病理发展。CB2激动剂的有益效果不仅依赖于其阻断Αβ诱导的小胶质细胞激活的能力，而且也依赖于其恢复小胶质细胞去除Αβ沉积物的能力的能力。
在海马微量注射Αβ1-40纤维后观察到的行为缺陷(图1B)与海马谷氨酸能传递的变化(图7)充分相关。本研究第一次证明CB2激动剂的全身给药显著改善海马CA1区中受损的基底谷氨酸能强度和电刺激诱导的突触可塑性以及通过局部微量注射Αβ1-40纤维诱导的记忆缺陷。据之前报道，淀粉样片段的微量注射显著减弱啮齿类动物的海马中的基底谷氨酸能强度。阿尔茨海默氏病脑的含Αβ的水性提取物的脑室内注射显著抑制大鼠海马中高频电刺激诱导的LTP(突触可塑性的一种形式)。海马LTP被用作用于学习和记忆的关联，并且已经成为用于研究参与与AD相关的认知缺陷的机制的有价值的模型。向海马中给药外源性Αβ显著降低大鼠在记忆任务，例如水迷宫中的表现。一致地，在本研究中，在用盐水i.p.治疗14天的大鼠中微量注射Αβ1-40纤维后15天在大鼠中观察到受损的电刺激诱导的LTP和基底谷氨酸能强度以及Morris水迷宫测试中延长的逃脱时间。有趣的是，受损的突触可塑性和记忆缺陷通过为期14天全身给药15mg/kg MDA7而标准化。
总之，由MDA7激活中央小胶质细胞CB2受体(i)促进Aβ清除，(ii)改善Aβ诱导的胶质细胞激活和IL-1β产生，以及(iii)恢复突触可塑性、认知和记忆。CB2受体在人类AD脑中的小胶质细胞中的存在表明，例如MDA7的CB2受体激动剂的使用可以代表用于治疗AD的新的治疗方法。
本文中引用的所有专利、专利申请和出版物以及电子可得材料的全部公开内容通过引用并入。上述详细描述和实施例仅为了清楚理解而给出。不应据其理解出不必要的限制。特别地，尽管可以提出描述本发明的化合物之所以有效的可能机制的理论，但本发明人并不受本文所述的理论限制。本发明不限于示出和描述的确切细节，因为对本领域技术人员显而易见的变化将包括在由权利要求所限定的本发明的范围内。

Claims (21)

1.一种通过向个体给药药学有效量的CB2受体激动剂以治疗或预防所述个体的神经炎症和/或神经变性疾病的方法。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述CB2受体激动剂包含式I的化合物，
或其药学上可接受的盐，其中：
R1选自环烷基和杂环烷基，其任何碳原子任选地被取代；并且
R2选自芳基、环烷基、芳烷基和烯基，其任何碳原子任选地被取代。
3.根据权利要求2所述的方法，其中R2是芳基。
4.根据权利要求3所述的方法，其中R2是苯基。
5.根据权利要求2所述的方法，其中R1是杂环烷基。
6.根据权利要求5所述的方法，其中R1是1-哌啶基。
7.根据权利要求2所述的方法，其中所述CB2受体激动剂是式II的化合物
8.根据权利要求7所述的化合物，其中所述化合物是S对映异构体。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述疾病是神经炎症疾病。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述疾病涉及在所述个体的脑中淀粉样β肽的水平升高。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述疾病是阿尔茨海默氏病。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述CB2受体激动剂胃肠外给药。
13.一种通过向个体给药药学有效量的CB2受体激动剂以激活所述个体的小胶质细胞中的CB2受体的方法。
14.根据权利要求10所述的方法，其中所述CB2受体激动剂包含式I的化合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
R1选自环烷基和杂环烷基，其任何碳原子任选地被取代；并且
R2选自芳基、环烷基、芳烷基和烯基，其任何碳原子任选地被取代。
15.根据权利要求14所述的方法，其中R2是苯基。
16.根据权利要求14所述的方法，其中R1是1-哌啶基。
17.根据权利要求2所述的方法，其中所述CB2受体激动剂是式II的化合物
18.根据权利要求10所述的方法，其中所述个体的脑中的淀粉样β肽的水平升高。
19.根据权利要求10所述的方法，其中激活所述CB2受体增加所述个体的突触可塑性、认知、或记忆中的一种或多种。
20.根据权利要求10所述的方法，其中激活所述CB2受体减少由所述小胶质细胞产生IL-1β。
21.根据权利要求10所述的方法，其中激活所述CB2受体增加所述个体中的谷氨酸能神经传递。
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