CN104894071A - 一种对gt1-7细胞进行基因编辑的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种对GT1-7细胞进行基因编辑的方法，包括：将GT1-7细胞铺于24孔板中；待细胞贴壁生长，将含有Cas9基因和嘌呤霉素抗性基因的42229质粒转染进入GT1-7细胞系；待细胞表达嘌呤霉素基因，用嘌呤霉素筛选42229转染GT1-7细胞；筛选后，去除含有嘌呤霉素的培养基，更换成正常高糖培养基，并进行扩大培养，待培养板中的GT1-7细胞长满，消化转移到培养瓶中继续扩大培养，即得Cas9稳转GT1-7细胞。本发明在实际应用中只需要转染特定的sgRNA质粒就能对GT1-7细胞靶基因进行精确的基因编辑，避免了Cas9质粒较大对于转染效率的影响，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于CRISPR-Cas9领域，特别涉及一种对GT1-7细胞进行基因编辑的方法。
背景技术
CRISPR序列的发现可以追溯到1987年，Nakata和他的同事在研究E.coli iap基因时发现，在该基因的下游存在着一系列长度为29nt的重复序列，这些29nt的重复元件被32nt的非重复序列所间隔开。在以后的十年间，随着大量微生物的基因被测序，Mojica和他的同事发现这种被间隔的重复序列广泛存在于细菌和古细菌中[Ishino Y,Shinagawa H,Makino K,et al.Nucleotide sequence of the iap gene,responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion inEscherichia coli,and identification of the gene product[J].Journal of bacteriology,1987,169(12):5429-5433]、[Mojica F J M,C,Soria E,et al.Biological significance of a familyof regularly spaced repeats in the genomes of Archaea,Bacteria and mitochondria[J].Molecularmicrobiology,2000,36(1):244-246]。
2002年，Jansen和Mojica首次用CRISPR这一新的名词来命名这些规则被间隔的重复序列。与此同时，Jansen等在CRISPR序列的上游发现了CRISPR相关联的保守基因家族-Cas[Jansen R,Embden J,Gaastra W,et al.Identification of genes that are associated with DNArepeats in prokaryotes[J].Molecular microbiology,2002,43(6):1565-1575]。2007年，Horvath和他的同事证明了CRIPSR系统中的间隔序列作为靶向序列结合目标DNA而Cas酶介导DNA的剪切[Barrangou R,Fremaux C,Deveau H,et al.CRISPR provides acquired resistance againstviruses in prokaryotes[J].Science,2007,315(5819):1709-1712]。
根据CRISPR序列的上游Cas基因家族成员的不同，可以将CRISPR系统大致分成三类(typeI-III),其中typeII CRISPR系统的Cas基因家族成员最少,用来作为基因编辑工具最为简便。2011到2013年。Sikney和Cong等利用typeII CRISPR-Cas9系统在体外、细菌体内和哺乳动物体内完成了多基因编辑操作[Sapranauskas R,Gasiunas G,Fremaux C,et al.TheStreptococcus thermophilus CRISPR/Cas system provides immunity in Escherichia coli[J].Nucleicacids research,2011]、[Nucleic acids research,2011；Cong L,Ran F A,Cox D,et al.Multiplexgenome engineering using CRISPR/Cas systems[J].Science,2013,339(6121):819-823]。
目前广泛使用的酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)typeII CRISPR-Cas9系统主要由CRISPR、trancrRNA和Cas9三个元件组成。CRISPR元件位于基因的下游部分，而Cas和trancrRNA则位于其上游部分。trancrRNA与CRISPR按照不同方向转录，trancrRNA有两个转录起始点。首先CRISPR会被转录成511nt长度的pre-crRNA序列，而trancrRNA会被转录成171nt和89nt长度的两种初级转录本。trancrRNA这两种初级转录本有25nt的序列与CRISPR的重复序列(repeats)互补，这两者的互补使得CRISPR能被加工成39-42nt的成熟crRNA，而trancrRNA的初级转录本则被加工成75nt的序列。39-42nt的成熟crRNA包含20nt的间隔序列(spacers)，它能互补靶向目标序列。而Cas9负责对目标序列进行双链切割，Cas9切割的位点通常位于PAM序列上游3个核苷酸处。其中PAM(protospacer adjacent motif)序列对于CRISPR系统发挥功能是必需的[Deltcheva E,Chylinski K,Sharma C M,et al.CRISPR RNAmaturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III[J].Nature,2011,471(7340):602-607]。为了进一步简化CRISPR-Cas9系统，Zhang等针对crRNA：trancrRNA复合体构建了sgRNA元件，使得在CRISPR-Cas9系统只需要sgRNA和Cas9两种元件就能完成精确的基因编辑而不影响基因编辑的效率。目前，分别表达sgRNA、Cas9基因以及同时表达crRNA、trancrRNA和Cas9基因的质粒都能从addgene(http://www.addgene.org/)网站上查询与购买。
虽然CRISPR-Cas9已广泛应用于细菌、植物以及哺乳动物细胞，但是其中往往是细胞系和胚胎细胞。对于转染效率较低的神经元细胞，由于Cas9质粒较大所以无法形成有效的基因编辑。GT1-7细胞是通过对小鼠GnRH神经元进行改造分离得到的细胞系。该细胞系保留了原高度分化GnRH神经元的表型，能够产生神经突起并且保留了原有神经元的标记物，是研究小鼠GnRH分泌、生殖发育重要的细胞模型[Mellon P L,Windle J J,Goldsmith P C,et al.Immortalization of hypothalamic GnRH by genetically targeted tumorigenesis[J].Neuron,1990,5(1):1-10]。
目前利用CRISPR-Cas9系统研究神经元的报道较少，而利用CRISPR-Cas9系统研究GT1-7细胞系的更是未见报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种对GT1-7细胞进行基因编辑的方法，该方法只需要转染特定的sgRNA质粒就能对GT1-7细胞靶基因进行精确的基因编辑，避免了Cas9质粒较大对于转染效率的影响。此外，在实际应用中采用病毒携带sgRNA来转染细胞更能进一步地提高基因编辑的效率，具有良好的应用前景。
本发明的一种对GT1-7细胞进行基因编辑的方法，包括：
将GT1-7细胞铺于24孔板中；待细胞贴壁生长，利用Lipo2000法将含有Cas9基因和嘌呤霉素抗性基因的42229质粒转染进入GT1-7细胞系；待细胞表达嘌呤霉素基因，用终浓度0.3ug/ml的嘌呤霉素筛选42229转染GT1-7细胞；筛选后，去除含有嘌呤霉素的培养基，更换成正常高糖培养基，并进行扩大培养，待培养板中的GT1-7细胞长满，消化转移到培养瓶中继续扩大培养，即得Cas9稳转GT1-7细胞。
所述GT1-7细胞铺于24孔板具体参数为每个孔15万个细胞，铺6个孔。
所述42229质粒与Lipo2000的浓度配比分别为500ng/1.5ul、700ng/1.5ul、500ng/2.0ul、700ng/2.0ul和两个阴性对照。
所述嘌呤霉素筛选时间为9～10天。
本发明通过质粒抗性筛选获得了Cas9稳转的GT1-7细胞，结合特定sgRNA可以用于GT1-7细胞进行分子水平的研究。此外，本发明中使用质粒抗性筛选相对于PB转座子和病毒载体构建Cas9稳转细胞更加方便、快捷。
有益效果
本发明提供了利用CRISPR-Cas9系统对GT1-7细胞系进行基因编辑的方法，由于本发明构建了Cas9稳转的GT1-7细胞系，在实际应用中只需要转染特定的sgRNA质粒就能对GT1-7细胞靶基因进行精确的基因编辑，避免了Cas9质粒较大对于转染效率的影响。此外，在实际应用中采用病毒携带sgRNA来转染细胞更能进一步地提高基因编辑的效率，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为嘌呤霉素筛选GT1-7细胞结果；其中，A为GT1-7细胞阳性克隆；B为阴性对照；
图2为PCR验证42229质粒随机整合进入GT1-7细胞；其中，泳道1-3为引物42229-Cas9阳性克隆，4-6为小鼠基因组，7为引物42229-Cas9PCR阴性，8-10为引物42229-Puro阳性克隆，11-13为小鼠基因组，14为引物42229-Cas9PCR阴性。
图3为阳性克隆Cas9基因表达量变化(n＝4)；
图4为Cas9和sgRNA双质粒转染GT1-7细胞靶向mir-505基因T7E1电泳图；其中，泳道1为Cas9和sgRNA双质粒转染，泳道2为未转染质粒；
图5为sgRNA转染Cas9稳转GT1-7细胞靶向mir-505基因T7E1电泳图；其中，泳道1为转染505sgRNA质粒，泳道2为未转染505sgRNA质粒；
图6为Cas9和sgRNA双质粒转染GT1-7细胞靶向mir-505基因测序图；
图7为sgRNA转染Cas9稳转GT1-7细胞靶向mir-505基因测序图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
(1)嘌呤霉素筛选GT1-7细胞最低致死浓度的摸索：
第一天：将GT1-7细胞铺于24孔板中，每个孔6万个细胞，铺5个孔。
第二天：GT1-7细胞贴壁生长。对5个细胞培养孔加入不同量的嘌呤霉素，使得5个孔的最终嘌呤霉素浓度为0.3ug/ml、0.5ug/ml、0.7ug/ml、1ug/ml和0ug/ml。之后每天观察嘌呤霉素对各个孔GT1-7细胞的致死情况，由于嘌呤霉素毒性较大筛选周期定为4天。
结果发现0.3ug/ml的嘌呤霉素浓度4天能完全杀死细胞。
(2)用0.3ug/ml嘌呤霉素筛选稳转Cas9基因GT1-7细胞：
第一天：将GT1-7细胞铺于24孔板中，每个孔15万个细胞，铺6个孔。
第二天：待细胞贴壁生长，利用Lipo2000法将含有Cas9基因和嘌呤霉素抗性基因的42229质粒转染进入GT1-7细胞系。质粒与Lipo2000的浓度配比分别为：500ng/1.5ul、700ng/1.5ul、500ng/2.0ul、700ng/2.0ul和两个阴性对照。
第四天：待细胞表达嘌呤霉素基因，用终浓度0.3ug/ml的嘌呤霉素筛选42229转染GT1-7细胞。
第十三天：用终浓度0.3ug/ml嘌呤霉素筛选9天后，去除含有嘌呤霉素的培养基，更换成正常高糖培养基，并进行扩大培养(图1)。待培养板中的GT1-7细胞长满，消化转移到培养瓶中继续扩大培养，即得Cas9稳转GT1-7细胞。
(3)设计两对引物检测42229质粒是否随机整合进入GT1-7细胞中。为了确保Cas9整合进入细胞中，其中一对引物设计在Cas9基因上，而另一对引物则设计在Puro基因上。
PCR反应体系：ddH2O 7.8ul，GT Buffer 1.5ul，dNTP 1.5ul，Taq酶1.5ul，BSA 0.2ul，上下游引物(2P)1.5ul，模板1.5ul；共15.5ul；PCR反应体系：95℃2min，(94℃30sec，58℃30sec，72℃30s)35个循环，72℃10min。
PCR结果采用1.5％的琼脂糖电泳进行鉴定(图2)。
(4)从基因表达水平验证42229质粒稳转的GT1-7细胞的Cas9表达量是否上升：
首先用Trizol法提取42229质粒稳转GT1-7细胞的总RNA。然后用随机引物和oligodT对GT1-7的总RNA进行逆转录。Real-time PCR引物同步骤(3)中42229-Cas9引物。
DnaseI处理体系：DnaseI 1ul，10*buffer 1ul，RNA 1ug，DEPC H2O补至10ul；反应程序：室温15min，10ul体系加入1ul EDTA 65℃10min。
逆转录：体系RNA 6.25ul，Random Primer 0.25ul，oligodT 0.25ul，5*Reaction Buffer1ul，dNTP mix 1ul，Ribolock RNase Inhibitor 0.5ul，RevertAidReverse Transcriptase 0.5ul共10.75ul；反应程序：25℃5min，42℃60min，70℃5min。
cDNA稀释5倍作为模板，Real-time PCR:体系DEPC-H2O 4.1ul，2*Premix 10ul，cDNA2.5ul，Primer(2P)3ul，ROX 0.4ul共20ul；反应程序：95℃2min，(94℃30sec，58℃20sec，72℃30s)40个循环。
Real-time PCR的结果通过7500软件进行分析(图3)
(5)只表达sgRNA的41824质粒转染Cas9稳转GT1-7细胞。
第一天：将Cas9稳转的GT1-7细胞铺于24孔板中，每个孔20万个细胞，铺2个孔；
第二天：待细胞贴壁生长汇合度达到70-90％，首先对细胞进行无血清饥饿处理然后利用Lipo2000法将只表达sgRNA的41824质粒转染进入Cas9稳转GT1-7细胞中。其中Lipo2000：41824质粒＝2.0ul:1ug。
待细胞长满，消化下细胞抽取基因组DNA。
(6)基因突变检测：步骤(5)所获得的细胞基因组DNA通过PCR将目的基因进行扩增，然后对PCR产物进行纯化。纯化好的产物利用T7E1assay进行目的基因突变的检测。
T7E1assay体系：PCR产物600ng，buffer 1.1ul，H2O补至10.5ul；反应程序：95℃10min(95℃每30s降温1℃)共70个循环；25℃1min。然后加入0.45ul T7E1酶37℃30min。
酶切的结果通过2％的琼脂糖凝胶电泳进行检测。
(7)将只含有靶向mir-505基因sgRNA的41824质粒转染Cas9稳转GT1-7细胞：
sgRNA靶序列(20nt)为：GTAAATTGATGCACCCAGTG。
第一天：将Cas9稳转的GT1-7细胞铺于24孔板中，每个孔20万个细胞，铺2个孔；
第二天：细胞汇合度达到70-90％。转染前用无血清培养基饥饿培养细胞2h，然后用lipo2000法；将41824质粒转染进入细胞中，Lipo2000：41824质粒＝2.0ul：1ug。转染6h后用正常培养基代替无血清培养基培养细胞。
第五天：转染3天后，细胞长满孔中，利用生工动物基因组提取试剂盒将细胞基因组抽提处理出来。
(8)针对小鼠mir-505基因进行PCR扩增：
Mir-505-F:catgccaacaaacccagtga 20bp
Mir-505-L:ctggcttctactccctggtg 20bp 产物大小942bp
PCR反应体系：H2O 3.725ul、buffer 3ul、上下游引物(2P)3ul、dNTP 1.5ul、Mg2+1.2ul、Taq酶0.075ul、模板2.5ul；反应程序：95℃15min，(94℃30sec，62℃30sec，72℃1min)40个循环，72℃5min。
PCR结果用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测。
(9)利用生工PCR产物纯化试剂盒将步骤(2)的PCR产物进行纯化回收，然后进行T7E1assay检测mir-505基因是否存在突变：
T7E1assay体系：PCR产物600ng，buffer 1.1ul，H2O补至10.5ul；反应程序：95℃10min(95℃每30s降温1℃)共70个循环；25℃1min。然后加入0.45ul T7E1酶，37℃30min。
酶切结果用2.0％的琼脂糖凝胶电泳检测，相比于之前采用Cas9和sgRNA双质粒系统转染GT1-7细胞电泳结果没有酶切条带(图4)，本发明采用的基因编辑方法可以看到清晰的酶切条带，酶切条带大约为400bp和500bp两个条带(图5)。
(10)将mir-505基因的PCR纯化产物送去生工测序，相比于之前采用Cas9和sgRNA双质粒系统转染GT1-7细胞测序结果(图6)。本发明采用的基因编辑方法可以在测序图中看到乱峰出现，乱峰位置开始于PAM序列上游3bp附近(图7)。该结果证明了该基因编辑方法对于GT1-7细胞的有效性。
Claims (4)
1.一种对GT1-7细胞进行基因编辑的方法，包括：
将GT1-7细胞铺于24孔板中；待细胞贴壁生长，利用Lipo2000法将含有Cas9基因和嘌呤霉素抗性基因的42229质粒转染进入GT1-7细胞系；待细胞表达嘌呤霉素基因，用终浓度0.3ug/ml的嘌呤霉素筛选42229转染GT1-7细胞；筛选后，去除含有嘌呤霉素的培养基，更换成正常高糖培养基，并进行扩大培养，待培养板中的GT1-7细胞长满，消化转移到培养瓶中继续扩大培养，即得Cas9稳转GT1-7细胞。
2.根据权利要求1所述的一种对GT1-7细胞进行基因编辑的方法，其特征在于：所述GT1-7细胞铺于24孔板具体参数为每个孔15万个细胞，铺6个孔。
3.根据权利要求1所述的一种对GT1-7细胞进行基因编辑的方法，其特征在于：所述42229质粒与Lipo2000的浓度配比分别为500ng/1.5ul、700ng/1.5ul、500ng/2.0ul、700ng/2.0ul和两个阴性对照。
4.根据权利要求1所述的一种对GT1-7细胞进行基因编辑的方法，其特征在于：所述嘌呤霉素筛选时间为9～10天。
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