[go: up one dir, main page]

CN107190008A - 一种基于Crispr/cas9的捕获基因组目标序列的方法及其在高通量测序中的应用 - Google Patents

一种基于Crispr/cas9的捕获基因组目标序列的方法及其在高通量测序中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN107190008A
CN107190008A CN201710589991.5A CN201710589991A CN107190008A CN 107190008 A CN107190008 A CN 107190008A CN 201710589991 A CN201710589991 A CN 201710589991A CN 107190008 A CN107190008 A CN 107190008A
Authority
CN
China
Prior art keywords
dna
artificial sequence
sequence
grna
target gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201710589991.5A
Other languages
English (en)
Inventor
郭良让
王德华
张佩琢
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Suzhou Ji Ji Gene Sequencing Technology Co Ltd
Original Assignee
Suzhou Ji Ji Gene Sequencing Technology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Suzhou Ji Ji Gene Sequencing Technology Co Ltd filed Critical Suzhou Ji Ji Gene Sequencing Technology Co Ltd
Priority to CN201710589991.5A priority Critical patent/CN107190008A/zh
Publication of CN107190008A publication Critical patent/CN107190008A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y603/00—Ligases forming carbon-nitrogen bonds (6.3)
    • C12Y603/02—Acid—amino-acid ligases (peptide synthases)(6.3.2)
    • C12Y603/02019—Ubiquitin-protein ligase (6.3.2.19), i.e. ubiquitin-conjugating enzyme
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B50/00—Methods of creating libraries, e.g. combinatorial synthesis
    • C40B50/06—Biochemical methods, e.g. using enzymes or whole viable microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种基于Crispr/cas9的捕获基因组目标序列的方法及其在高通量测序中的应用。本发明提供了一种基于Crispr/cas9系统从基因组DNA中捕获目标基因序列的方法：1)、根据目标基因序列设计合成多个gRNA；2)将用所述多个gRNA和所述cas9酶对所述基因组DNA进行切割反应，得到含有多个100‑300bp的片段化产物的切割产物；3)捕获所述切割产物中的目标基因序列的多个100‑300bp的片段化产物。本发明通过基于CRISPR基因编辑捕获靶序列，可用于高通量测序，适用于有家族遗传史的特定人群的筛查和大众体检市场等。

Description

一种基于Crispr/cas9的捕获基因组目标序列的方法及其在 高通量测序中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种基于Crispr/cas9的捕获基因组目标序列的方法及其在高通量测序中的应用。
背景技术
CRlSPR/Cas(Clusteredregularly interspaccd short palindromic repeats/CRlSPR-associatednuclease)技术是2013年开发的一种新的DNA靶向编辑工具，被美国科学杂志评为2013年十大科学突破技术之一。Cas9核酸酶，S.pyogenes，是RNA介导的核酸酶，可以催化双链DNA特异位点切割。切割位点位于NGG PAM(Protospacer Adjacent Motif)上游序列的3个碱基处。PAM序列的NGG必须连在靶点之后，位于与gRNA互补的DNA的链上。其DNA特异识别是靠一小段发夹RNA结构实现的，而DNA剪切则是凭借结合于RNA上的Cas核酸酶执行。CRlSPR序列是存在于微生物基因组中，由长度25-50bp的重复序列(repeat，R)和间区序列(spacer，S)间隔成簇排列(R-S结构)而成的DNA序列，而Cas则是存在于CRISPR簇侧翼序列附近的多态性家族基因，编码可与CrisPR区域发生作用的一组功能域蛋白(具有核酸酶、解旋酶、整合酶和聚合酶等的活性)。在指导RNA(guide RNA)的引导下对靶位点进行切割。此外，在CRISPR位点的第一个重复序列上游有CRISPR前导序列L(Leader)。该前导序列可以作为启动子，启动CRISPR序列的转录。前导序列、R-S结构以及一系列的Cas组成了完整的CRISPR/Cas系统。人们发现这些CRISPR序列能与病毒或质粒DNA序列相匹配，表明CRISPR/Cas系统能够编码“适应性”免疫系统，在细菌的获得性免疫中发挥作用。
自人类基因组图谱绘制完成后，各国政府都加大了对人类基因组研究的扶持力度，在这样的大背景下，基因测序技术得到了迅猛发展，基因测序市场也快速扩大，并已经从实验室走入临床。
基于液相捕获高通量测序技术，市场主要有安捷伦公司的全外显子捕获试剂盒，罗氏公司的固相杂交法和液相杂交法两种技术，这些产品捕获的DNA序列虽然只是全基因组的部分区域，相对于全基因组测序来说成本和时间花费上具有很大的优势，但每个样本的价格仍在数千元以上，超出了普通民众的承受范围，不适合大范围内筛查单基因遗传疾病的检测。而且这些技术的缺点是需要合成大量长片段(150－200bp)的DNA，经过PCR扩增，转录成加生物素修饰的RNA。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种基于Crispr/cas9系统从基因组DNA中捕获目标基因序列的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：
1)、根据目标基因序列设计合成多个gRNA；
每个所述gRNA能结合且识别所述目标基因序列不同靶区域；
所述目标基因序列能通过所述gRNA引导cas9酶将其分隔为多个100-300bp的片段化产物；
2)将用所述多个gRNA和所述cas9酶对所述基因组DNA进行切割反应，得到含有多个100-300bp的片段化产物的切割产物；
3)捕获所述切割产物中的目标基因序列的多个100-300bp的片段化产物。
上述切割反应仅切割不修复。
上述目标基因可以是一个目标基因或多个目标基因。
上述方法中，
步骤1)中，所述设计合成多个gRNA的方法为如下a或b：
a所示的方法包括如下步骤：
(1)根据所述目标基因序列设计多个所述gRNA，再根据所述gRNA设计合成用于制备其对应转录模板的引物对，得到多个所述gRNA转录模板对应的引物对；
(2)将多个所述gRNA转录模板对应的引物对分别进行聚合酶链式反应，得到对应的多个所述gRNA转录模板，
(3)转录所述对应的多个gRNA转录模板，得到多个gRNA；
b所示的方法包括如下步骤：
(1)根据所述目标基因序列设计多个所述gRNA，再根据所述gRNA设计合成对应的转录模板，得到多个gRNA转录模板；
(2)转录所述多个gRNA转录模板，得到多个gRNA。
上述方法中，
所述转录多个gRNA转录模板为分别转录或者混合多个gRNA转录模板再共同转录；
或所述捕获的方法为磁珠法。
上述方法中，
所述基因组DNA为人或动物或其他物种的细胞的基因组DNA；
所述目标基因序列为BRCA1基因的外显子和BRCA2基因的外显子；
所述BRCA1基因的外显子对应的多个gRNA的核苷酸序列分别为序列158-220；
所述BRCA2基因的外显子对应的多个gRNA的核苷酸序列分别为序列221-316；
或所述BRCA1基因的外显子对应的多个gRNA对应的引物对中的上游引物的核苷酸序列分别为序列1-序列63，下游引物的核苷酸序列为序列157；
或所述BRCA2基因的外显子对应的多个gRNA对应的引物对中的上游引物的核苷酸序列分别为序列64-序列156，下游引物的核苷酸序列为序列157。
上述的方法在目标基因序列的高通量测序文库制备中的应用也是本发明保护的范围。
上述的方法在目标基因序列的高通量测序中的应用也是本发明保护的范围。
本发明另一个目的是提供一种目标基因序列的高通量测序方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：
1)上述的方法捕获所述目标基因序列的多个100-300bp的片段化产物；
2)用所述多个100-300bp的片段化产物制备高通量测序文库；
3)高通量测序所述高通量测序文库，实现目标基因序列的高通量测序。
Crispr/cas9系统在基因组DNA中捕获或分离或聚集目标基因序列中的应用也是本发明保护的范围；
所述Crispr/cas9系统包括多个gRNA和cas9酶；
所述多个gRNA引导所述CAS9酶将所述目标基因序列分割为多个大小为100-300bp片段化产物。
本发明第3个目的是提供一种用于基因组DNA中捕获目标基因序列的试剂盒。
本发明提供的试剂盒，包括上述应用中的所述Crispr/cas9系统。
本发明第4个目的是提供一种高通量测序目标基因序列的试剂盒。
本发明提供的试剂盒，包括上述应用中的所述Crispr/cas9系统和测序文库制备所需试剂。
本发明通过基于CRISPR基因编辑捕获靶序列，可用于高通量测序，适用于有家族遗传史的特定人群的筛查和大众体检市场；更有意义的是，本项技术还可用于开发其他单基因、多基因遗传疾病的检测试剂盒及外显子测序捕获试剂,以供临床应用。
附图说明
图1为BRCA1gRNA和BRCA2gRNA质检结果。
图2为文库扩增产物2％琼脂糖凝胶电泳图。
图3为文库胶回收产物2％琼脂糖凝胶电泳图。
图4为文库检测PCR扩增产物2％琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、基于Crispr/cas9的捕获基因组中目标基因序列的方法
下面的实施例以人293T细胞基因组DNA中的BRCA1和BRCA2基因为例，
根据BRCA1基因(GI:262359905)和BRCA2基因(GI:568815585)的外显子为目标基因序列。
一、转录RNA模板制备
1、转录RNA模板的引物设计合成
根据目标基因组中BRCA1基因(GI:262359905)及BRCA2基因(GI:568815585)的外显子，分别设计63个BRCA1gRNA(序列158-220)和96个BRCA2gRNA(序列221-313)，这些gRNA可以引导CAS9酶将BRCA1的外显子和BRCA2的外显子全部分割为多个大小为100-300bp片段化产物。
根据63个BRCA1gRNA和96个BRCA2gRNA分别设计63个BRCA1的外显子转录RNA模板的扩增引物和93个BRCA2的外显子转录RNA模板的扩增引物如下：
用于合成63个BRCA1的外显子转录RNA模板的扩增引物：
上游引物分别为BRCA1gRNA1_F-BRCA1gRNA63_F(序列1-序列63)，下游引物为gRNA_R(序列157)；
用于合成63个BRCA1的外显子转录RNA模板的扩增引物：
上游引物分别为BRCA2gRNA1_F-BRCA2gRNA93_F(序列64-序列156)，下游引物为gRNA_R(序列157)。
2、转录RNA模板的制备
将上述BRCA1gRNA1_F-BRCA1gRNA63_F分别与下游引物gRNA_R在如下表1的体系中退火聚合酶链式反应，得到63个BRCA1gRNA1-BRCA1gRNA63的外显子转录RNA的模板；
将上述BRCA2gRNA1_F-BRCA2gRNA93_F分别与下游引物gRNA_R在如下表1的体系聚合酶链式反应，得到93个BRCA2gRNA1-BRCA2gRNA93的外显子转录RNA的模板。
表1为退火PCR扩增反应体系
2×pfu Master Mix with Dye，苏州吉玛基因股份有限公司,目录号：J09002。
将表1的体系进行聚合酶链式反应，得到用以转录RNA模板的PCR扩增产物。
上述反应程序为：94℃3min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，15个循环；72℃10min；4℃保存。
聚合酶链式反应后取5μLPCR产物用2％琼脂糖凝胶电泳，检测，无非特异性条带后，用PCR产物纯化试剂盒(离心柱)进行纯化，得到63个BRCA1gRNA-BRCA1gRNA63转录RNA的模板和93个BRCA2gRNABRCA2gRNA93转录RNA的模板。
二、gRNA的转录
将上述63个BRCA1gRNA1-BRCA1gRNA63的转录RNA模板和93个BRCA2gRNA1–BRCA2gRNA93的转录RNA模板按照等质量比混合，按照TranscriptAid T7HighYieldTranscription Kit(赛默飞世尔科技(中国)有限公司；目录号：K0441)说明书共同转录，得到63个BRCA1gRNA1-BRCA1gRNA63和93个BRCA2gRNA1–BRCA2gRNA93的混合物。
上述转录体系如表2所示，
表2为转录反应体系
组份
不含核酸酶的水 to 20μL
5×TranscriptAid Reaction Buffer 4μL
ATP/CTP/GTP/UTP mix* 8μL
转录RNA模板 2μg**
TranscriptAid Enzyme Mix 2μL
总体积 20μL
37℃转录4小时，得到转录产物。
将转录产物按照如下方法纯化，得到63个BRCA1gRNA-BRCA1gRNA63和93个BRCA2gRNA–BRCA2gRNA93的混合物：
(1)转录产物加入2μL Dnase I混合，37℃反应35分钟；
(2)20μL反应产物中加入115μL无核酸酶的水，15μL3M醋酸钠；
(3)加入等体积的水饱和酚，氯仿各75μL，混合，12000转/分离心5分钟；
(4)重复(3)一次；
(5)加入2倍体积-20℃预冷的无水乙醇沉淀RNA,-20℃放置过夜；
(6)4℃12000转/分离心30分钟，去上清；
(7)加入1mL70％乙醇，12000转/分离心5分钟，去上清；
(8)室温干燥，加入20μL DEPC水处溶解RNA。
将纯化后63个BRCA1gRNA1-BRCA1gRNA63和93个BRCA2gRNA1–BRCA2gRNA93进行质检，结果如图1所示，泳道M为10bp DNA Ladder泳道1和2均为200ng转录的gRNA，可以看出，已得到转录的gRNA。
上述质检的方法如下：
(1)配制15％变性胶；
(2)200v预电泳30分钟；
(3)取200ng的RNA加入2×RNA上样缓冲液；
(4)于65℃变性5分钟，立即冰浴；
(5)200v电泳60分钟；
(6)于染胶盒中染色10分钟；
(7)拍照。
三、目标基因组DNA体外切割
1)将上述纯化后63个BRCA1gRNA1-BRCA1gRNA63和93个BRCA2gRNA1–BRCA2gRNA93混合物取10μL稀释至15μM，再90℃加热5分钟，缓慢冷却至室温(形成二级结构)，得到处理后63个BRCA1gRNA1-BRCA1gRNA63和处理后93个BRCA2gRNA1–BRCA2gRNA93。
2)将处理后63个BRCA1gRNA1-BRCA1gRNA63和处理后93个BRCA2gRNA1–BRCA2gRNA93混合物加入表3所示的切割反应体系中，室温孵育15分钟，然后加入5.5μL100ng/μL的人293T细胞基因组DNA。
表3基因组DNA切割反应体系
Volume(μL)
不含核酸酶的水 27.5
5×Cleavage buffer 11.0
Cas9核酸酶：15μM 5.5
反应产物：15μM 5.5
Cas9核酸酶，S.pyogenes,NEB(北京)有限公司,NEB(北京)有限公司,M0386M。
在37℃孵育30分钟，得到反应产物。
(3)将2)得到的反应产物加入5μL 500mM EDTA，加入22μL蛋白酶K消化Cas9，室温孵育20分钟，得到切割产物。
四、从切割产物中磁珠法序列捕获片段化产物
1.振荡Ampure XP磁珠(贝克曼库尔特有限公司生产的Agencourt AMPure XPKit:产品目录号为A63880)，充分混匀；
2.向上述三得到的切割产物中加入0.7×的磁珠，用移液器混匀10次，室温放置1分钟；
3.置于磁力架上吸附5分钟，转移上清至新的离心管中；
4.加入1.1倍体积的磁珠，用移液器混匀10次，室温放置1分钟；
5.向磁珠中加入200μL新鲜配制的80％的乙醇，室温放置30s，弃上清；
6.重复上述步骤1次；
7.开盖室温放置10分钟；
8.加入50μL不含核酸酶的水，用移液器混匀，室温放置1分钟；
9.置于磁力架上5分钟，转移上清至新的离心管中，得到含有BRCA1的外显子大小为100-300bp片段化产物和BRCA2的外显子大小为100-300bp片段化产物的混合物。
实施例2、高通量测序目标靶序列
一、高通量测序文库构建
1、末端修复、磷酸化并加dA尾
(1)在灭菌EP管中加入下列试剂表4所示：
表4为末端修复、磷酸化并加dA尾体系
(2)使用移液器轻轻吹打混匀，短暂离心将反应液收集至管底。
(3)将反应管置于PCR仪，运行表5程序，得到反应产物：
表5
2、接头连接
(1)向步骤1得到的反应产物中加入下列组分：
表6
T4DNA连接酶,NEB(北京)有限公司,NEB(北京)有限公司,M0202L。
Y型接头(UAF/AI1)
UAF AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T
AI1GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACATCACGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG
*硫代修饰，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。
(2)使用移液器轻轻吹打混匀，短暂离心将反应液收集至管底。
(3)将反应管置于PCR仪，运行下列程序，得到接头连接产物：
表7
3、接头连接产物纯化和大小分选
(1)涡旋振荡混匀AMPure XP beads(可为贝克曼库尔特有限公司生产的Agencourt AMPure XP Kit:产品目录号为A63880)；
(2)向50ul上述2得到的接头连接产物入50ul AMPure XP beads；
(3)用移液器混匀10次，室温放置5min；
(4)将磁珠置于磁力架吸附2min，弃掉上清；
(5)向磁珠加入200ul新鲜80％乙醇漂洗磁珠，室温放置30sec,磁铁吸附去上清；
(6)重复上步骤1次；
(7)开盖放置10min；
(8)从磁铁上取下磁珠加入50ul DEPC水，用移液器混匀10次；
(9)将磁珠置于磁铁～5min；
(10)取50ul上清至一个新的EP管中；
(11)涡旋振荡混匀AMPure XP beads；
(12)向上步50ul洗脱产物入50ul AMPure XP beads；
(13)用移液器混匀10次，室温放置5min；
(14)将磁珠置于磁力架吸附2min，弃上清；
(15)向磁珠加入200ul新鲜80％乙醇漂洗磁珠，室温放置30sec,磁铁吸附去上清；
(16)重复上步骤1次；
(17)开盖放置10min；
(18)从磁铁上取下磁珠加入40ul DEPC水，用移液器混匀10次；
(19)将磁珠置于磁铁～5min；
(20)吸取约40ul上清至一个新的EP管中，得到纯化后接头连接产物。
4、接头连接产物PCR扩增
(1)配制下列反应：
表8
引物mPF
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
引物mRPI1
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC*T
由上海捷瑞生物工程有限公司合成。
KAPA HIFi DNA聚合酶：Kapa Biosystems,目录号：KK2102
(2)使用移液器轻轻吹打混匀，短暂离心将反应液收集至管底。
将反应管置于PCR仪，运行：反应程序为：94℃3min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，15个循环；72℃10min；4℃保存。
把扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所示，M:20bp DNA Ladder；1：文库扩增产物，可以看出，得到文库扩增产物。
5、PCR扩增产物纯化
(1)切取上述4电泳中所需条带，用上海捷瑞生物工程有限公司的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(离心柱型)：GK2042-50进行凝胶收。
(2)向凝胶中加入400μLBinding Solution，置于50℃水浴锅中，至胶块溶解。
(3)期间每隔2分钟摇动一次。
(4)将溶好的胶块转移至硅胶柱中，室温放置2分钟，6000转/分离心1分钟，弃废液。
(5)向硅胶柱中加入500μLWashing Solution，室温放置3分钟。
(6)12000转/分离心1分钟，弃废液。
(7)重复(6)一次。
(8)12000转/分离心1分钟，转移硅胶柱至新的1.5mL离心管中
(9)向硅胶柱中加入30μL不含核酸酶的水，室温放置2分钟。
(10)12000转/分离心1分钟，收集上清，得到纯化后PCR扩增产物。
将纯化后PCR扩增产物进行电泳检测，结果如图3所示，M:20bp DNA Ladder；1：文库胶回收产物，可以看出，得到高通量测序文库。
6、捕获文库检测
(1)PCR反应体系配制
表9文库质检反应体系
组份 体积(μL)
不含核酸酶的水 16.2
10×PCR Buffer 2.5
MgCl2:25mM 2.5
10mM dNTP Mix 0.5
Taq DNA聚合酶 0.3
5得到的纯化后PCR扩增产物 1
总体积 23μL
Taq DNA Polymerase为Promega公司的产品，产品目录号为M1665S；
根据样品数量配制反应体系以23μL/管，分装至0.2mL的PCR管中，分别标记为1-10,分别再向PCR管中加入不同的上下游引物(该上下游引物用于扩增大小为100-300bp片段化产物，每对引物对应一个100-300bp片段，随机选取其中10对引物)，如下：
表10
(2)反应程序：反应程序为：94℃3min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，22个循环；72℃10min；4℃保存
(3)扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，结果如图4所示，20bp DNA Ladder；1：rs55906931；2：rs4986850；2：rs799917；4：rs80357280；5：rs56012641；6：rs1800704；7：rs80357420；8：rs1799950；9：rs4986852；10：rs16941；可以看出，均扩增出目的条带，表明捕获序列中有BRCA1的外显子大小为100-300bp片段化产物和BRCA2的外显子大小为100-300bp片段化产物。
7、高通量测序及数据分析
取步骤4构建好的文库用Hiseq 3000平台进行测序，对测序数据用FASTX-Toolkit0.0.13软件(网址为：http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/)中的fastq_quality_trimmer模块去除低质量Reads，用fastx_clipper模块去除接头序列，分隔含N的读段数，提取分隔后的配对读段；
测序数据预处理后的结果见表11。
表11测序数据质量预处理数据统计结果
使用bwa-0.7.15进行有基因参照的参考基因组mapping。从结果上看，捕获文库比对到参考基因组上的读段数比例x在84％以上，其中成对儿reads比对的比例约83％，结果正常。
与参考基因组比对后的统计结果见表12。
表12参考基因组比对整体情况统计
用bwa-0.7.15软件(网址为：https://sourceforge.net/projects/bio-bwa/files/)对有效数据与基因组DNA进行比对，用samtools-0.1.9软件(网址为：https://sourceforge.net/projects/samtools/files/samtools/0.1.19/)把比对的sam格式转换成bam格式，用bedtools-2.17.0软件(网址为：https://github.com/arq5x/bedtools/releases/tag/v2.17.0)中的coverage模块计算靶区域的覆盖率。
靶区域的覆盖率见表13；
表13富集效率
靶序列捕获文库 覆盖率(％)
S 96.58％
根据公式
用TEQC3.16.0软件(网址为：https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/TEQC.htm)计算靶区域的富集效率，靶区域的富集效率见表14。
表14靶区域的富集效率统计结果
上述结果表明，本发明所提供的Crispr探针组合可用于构建捕获文库，进一步利用该文库捕获基因组靶序列。因此，本发明所提供的方法，可制备靶序列的捕获文库。
序列表
<110>苏州吉赛基因测序科技有限公司
<120>一种基于Crispr/cas9的捕获基因组目标序列的方法及其在高通量测序中的应用
<160> 333
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 1
taatacgact cactataggc aaacttaggt attggaaccg ttttagagct agaaatag 58
<210> 2
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 2
taatacgact cactataggt tcttcacagt gcagtgaatg ttttagagct agaaatag 58
<210> 3
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 3
taatacgact cactatagga tataccttct cagtctactg ttttagagct agaaatag 58
<210> 4
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 4
taatacgact cactataggg ttagatgatg gtgaaataag ttttagagct agaaatag 58
<210> 5
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 5
taatacgact cactataggg aatgctatgc ttagattagg ttttagagct agaaatag 58
<210> 6
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 6
taatacgact cactataggt ctgctagagg aaaactttgg ttttagagct agaaatag 58
<210> 7
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 7
taatacgact cactatagga ctgcaggctt tcctgtggtg ttttagagct agaaatag 58
<210> 8
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 8
taatacgact cactataggt cgggaaacaa gcatagaaag ttttagagct agaaatag 58
<210> 9
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 9
taatacgact cactatagga gcagtatttc attggtaccg ttttagagct agaaatag 58
<210> 10
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 10
taatacgact cactataggg aaggtaaaga acctgcaacg ttttagagct agaaatag 58
<210> 11
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 11
taatacgact cactataggt gaggaggaag tcttctaccg ttttagagct agaaatag 58
<210> 12
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 12
taatacgact cactatagga ctcctgaaat gataaatcag ttttagagct agaaatag 58
<210> 13
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 13
taatacgact cactatagga ctggccagtg atcctcatgg ttttagagct agaaatag 58
<210> 14
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 14
taatacgact cactataggg agatactgaa gatgttcctg ttttagagct agaaatag 58
<210> 15
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 15
taatacgact cactatagga gacagaatga atgtagaaag ttttagagct agaaatag 58
<210> 16
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 16
taatacgact cactataggt gcttgtgaat tttctgagag ttttagagct agaaatag 58
<210> 17
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 17
taatacgact cactataggc ttcagtcctt ctactgtccg ttttagagct agaaatag 58
<210> 18
<211> 56
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 18
taatacgact cactataggc tctaatcaat cgactccgtt ttagagctag aaatag 56
<210> 19
<211> 57
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 19
taatacgact cactataggc atgtacctgt gctatatggt tttagagcta gaaatag 57
<210> 20
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 20
taatacgact cactatagga gcattcaaag tgtcaaagtg ttttagagct agaaatag 58
<210> 21
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 21
taatacgact cactataggc tacagtaggg gcatccatag ttttagagct agaaatag 58
<210> 22
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 22
taatacgact cactatagga ccctacactc tccggatgag ttttagagct agaaatag 58
<210> 23
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 23
taatacgact cactatagga tctgaggaac ccccatcgtg ttttagagct agaaatag 58
<210> 24
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 24
taatacgact cactataggt ccaatgtcca gaacactacg ttttagagct agaaatag 58
<210> 25
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 25
taatacgact cactatagga gtgctagata ctttcacacg ttttagagct agaaatag 58
<210> 26
<211> 57
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 26
taatacgact cactatagga gcagacacgt catatttagt tttagagcta gaaatag 57
<210> 27
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 27
taatacgact cactatagga ggatcatcaa gaattatgcg ttttagagct agaaatag 58
<210> 28
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 28
taatacgact cactatagga gcgattcaca aaagagcacg ttttagagct agaaatag 58
<210> 29
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 29
taatacgact cactataggc acctaacgtt taacacctag ttttagagct agaaatag 58
<210> 30
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 30
taatacgact cactataggt tacactccca agatcaatcg ttttagagct agaaatag 58
<210> 31
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 31
taatacgact cactataggc caccgtgcct cgcctcatgg ttttagagct agaaatag 58
<210> 32
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 32
taatacgact cactataggt gcacgttcta cacgtgtccg ttttagagct agaaatag 58
<210> 33
<211> 57
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 33
taatacgact cactataggt tgttaagtct tagtcattgt tttagagcta gaaatag 57
<210> 34
<211> 57
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 34
taatacgact cactataggc cccagagtca gctcgtgtgt tttagagcta gaaatag 57
<210> 35
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 35
taatacgact cactataggt gggtacatga atacagtgtg ttttagagct agaaatag 58
<210> 36
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 36
taatacgact cactataggt tagatgtact agtctatcag ttttagagct agaaatag 58
<210> 37
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 37
taatacgact cactatagga ccacctatca tctaatgatg ttttagagct agaaatag 58
<210> 38
<211> 57
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 38
taatacgact cactataggt caaccctgac atattggcgt tttagagcta gaaatag 57
<210> 39
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 39
taatacgact cactataggc atgttgtagc ttatgttatg ttttagagct agaaatag 58
<210> 40
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 40
taatacgact cactataggc ttctggattc tggcttatag ttttagagct agaaatag 58
<210> 41
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 41
taatacgact cactatagga gacagatgct agcaccaaag ttttagagct agaaatag 58
<210> 42
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 42
taatacgact cactatagga caactaatat accagtcagg ttttagagct agaaatag 58
<210> 43
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 43
taatacgact cactataggt gctttgttct ggatttcgcg ttttagagct agaaatag 58
<210> 44
<211> 56
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 44
taatacgact cactatagga attgaaatca cctagtagtt ttagagctag aaatag 56
<210> 45
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 45
taatacgact cactatagga ggtagtatga gttccatcag ttttagagct agaaatag 58
<210> 46
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 46
taatacgact cactataggt ttaaggtgaa gcagcatctg ttttagagct agaaatag 58
<210> 47
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 47
taatacgact cactatagga ttactggtgg acttacttcg ttttagagct agaaatag 58
<210> 48
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 48
taatacgact cactataggc tctgtcaaat gtcgtggtag ttttagagct agaaatag 58
<210> 49
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 49
taatacgact cactataggt tcttgatctc ccacactatg ttttagagct agaaatag 58
<210> 50
<211> 57
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 50
taatacgact cactatagga aatggttgct gggcacgggt tttagagcta gaaatag 57
<210> 51
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 51
taatacgact cactataggt ataggtaaac acacgacttg ttttagagct agaaatag 58
<210> 52
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 52
taatacgact cactataggt tctgaagata ccgttaatag ttttagagct agaaatag 58
<210> 53
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 53
taatacgact cactataggt taaaggcatg ggcttcgccg ttttagagct agaaatag 58
<210> 54
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 54
taatacgact cactatagga gtgaatttta tgagccctag ttttagagct agaaatag 58
<210> 55
<211> 57
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 55
taatacgact cactatagga cgtctgtcta cattgaatgt tttagagcta gaaatag 57
<210> 56
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 56
taatacgact cactataggc agctaacatg tatgatgccg ttttagagct agaaatag 58
<210> 57
<211> 57
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 57
taatacgact cactataggc cttagccccc ttagtagcgt tttagagcta gaaatag 57
<210> 58
<211> 56
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 58
taatacgact cactataggt ttctgtagcc catacttgtt ttagagctag aaatag 56
<210> 59
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 59
taatacgact cactatagga gcatacatag ggtttctctg ttttagagct agaaatag 58
<210> 60
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 60
taatacgact cactataggc agcacttgag tgtcattctg ttttagagct agaaatag 58
<210> 61
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 61
taatacgact cactataggc atctgtataa accgtgtgag ttttagagct agaaatag 58
<210> 62
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 62
taatacgact cactatagga tttggtaatg atgctaggtg ttttagagct agaaatag 58
<210> 63
<211> 57
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 63
taatacgact cactataggc catttaaaaa gtaatggcgt tttagagcta gaaatag 57
<210> 64
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 64
taatacgact cactatagga agcattggag gaatatcgtg ttttagagct agaaatag 58
<210> 65
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 65
taatacgact cactatagga caacataatc atcgtttgcg ttttagagct agaaatag 58
<210> 66
<211> 57
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 66
taatacgact cactataggt cactggttaa aactaagggt tttagagcta gaaatag 57
<210> 67
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 67
taatacgact cactatagga gtaatgcaat atggtagacg ttttagagct agaaatag 58
<210> 68
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 68
taatacgact cactataggc agtgagaatg tatatactcg ttttagagct agaaatag 58
<210> 69
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 69
taatacgact cactataggt aatattttgg ctaagagccg ttttagagct agaaatag 58
<210> 70
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 70
taatacgact cactataggt tctcattcat ataaattgtg ttttagagct agaaatag 58
<210> 71
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 71
taatacgact cactataggt tttaccccca gtggtatgtg ttttagagct agaaatag 58
<210> 72
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 72
taatacgact cactataggt agaaatgccc tgatcattag ttttagagct agaaatag 58
<210> 73
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 73
taatacgact cactataggc tatgagcaca gtagaactag ttttagagct agaaatag 58
<210> 74
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 74
taatacgact cactataggt acatttagtg gtagtccagg ttttagagct agaaatag 58
<210> 75
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 75
taatacgact cactataggc ttaagtatag taattagaag ttttagagct agaaatag 58
<210> 76
<211> 57
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 76
taatacgact cactataggc ttagataaat tacagattgt tttagagcta gaaatag 57
<210> 77
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 77
taatacgact cactataggt agtagtcccc ccttatccag ttttagagct agaaatag 58
<210> 78
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 78
taatacgact cactataggt tgcggtaaac cgagatcacg ttttagagct agaaatag 58
<210> 79
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 79
taatacgact cactataggt caggctttac tagaagaacg ttttagagct agaaatag 58
<210> 80
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 80
taatacgact cactatagga atagctgcaa agaccacatg ttttagagct agaaatag 58
<210> 81
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 81
taatacgact cactatagga ttcatcagcg tttgcttcag ttttagagct agaaatag 58
<210> 82
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 82
taatacgact cactataggc aaggaagttg taccgtcttg ttttagagct agaaatag 58
<210> 83
<211> 57
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 83
taatacgact cactataggc agtaaagcag gcaatatcgt tttagagcta gaaatag 57
<210> 84
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 84
taatacgact cactataggt ctgtagcttt gaagaatgcg ttttagagct agaaatag 58
<210> 85
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 85
taatacgact cactatagga catttgcaaa tgctgattcg ttttagagct agaaatag 58
<210> 86
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 86
taatacgact cactatagga gtgacctgat tctaaacacg ttttagagct agaaatag 58
<210> 87
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 87
taatacgact cactataggc caggagttcg agactagccg ttttagagct agaaatag 58
<210> 88
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 88
taatacgact cactataggt gtcccaaaag agctagttag ttttagagct agaaatag 58
<210> 89
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 89
taatacgact cactataggt ccacttttga atgttgtacg ttttagagct agaaatag 58
<210> 90
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 90
taatacgact cactatagga aaatgtcaga caagctcaag ttttagagct agaaatag 58
<210> 91
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 91
taatacgact cactataggt cttccaagta gctaatgaag ttttagagct agaaatag 58
<210> 92
<211> 57
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 92
taatacgact cactatagga ttacatgaac aaatgggcgt tttagagcta gaaatag 57
<210> 93
<211> 57
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 93
taatacgact cactatagga tacagtatta attgactggt tttagagcta gaaatag 57
<210> 94
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 94
taatacgact cactataggt ggtctttaag atagtcatcg ttttagagct agaaatag 58
<210> 95
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 95
taatacgact cactatagga ggggctttta ttctgctcag ttttagagct agaaatag 58
<210> 96
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 96
taatacgact cactatagga ataatattga aatgactacg ttttagagct agaaatag 58
<210> 97
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 97
taatacgact cactatagga ttatctggcc agtttatgag ttttagagct agaaatag 58
<210> 98
<211> 57
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 98
taatacgact cactatagga aaagttatgc aattcttcgt tttagagcta gaaatag 57
<210> 99
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 99
taatacgact cactataggt gggttttcat acagctagcg ttttagagct agaaatag 58
<210> 100
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 100
taatacgact cactataggt tatcacttaa gagcttaggg ttttagagct agaaatag 58
<210> 101
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 101
taatacgact cactatagga caacttgtgt aaaaagctag ttttagagct agaaatag 58
<210> 102
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 102
taatacgact cactatagga tatacctcat cagaatggtg ttttagagct agaaatag 58
<210> 103
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 103
taatacgact cactataggc ctgcatttag gatagccagg ttttagagct agaaatag 58
<210> 104
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 104
taatacgact cactatagga tgtagcacgc attcacatag ttttagagct agaaatag 58
<210> 105
<211> 56
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 105
taatacgact cactataggg atttttagca cagcaaggtt ttagagctag aaatag 56
<210> 106
<211> 57
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 106
taatacgact cactataggt aatgaagcat ctgataccgt tttagagcta gaaatag 57
<210> 107
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 107
taatacgact cactataggc aaagttaagg gagtgttagg ttttagagct agaaatag 58
<210> 108
<211> 57
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 108
taatacgact cactatagga caaacaacag ttggtattgt tttagagcta gaaatag 57
<210> 109
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 109
taatacgact cactatagga gagaatgtgt ggcatgactg ttttagagct agaaatag 58
<210> 110
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 110
taatacgact cactataggc gtatacagat ttgatatctg ttttagagct agaaatag 58
<210> 111
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 111
taatacgact cactatagga ctttactctt tcaaacattg ttttagagct agaaatag 58
<210> 112
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 112
taatacgact cactataggc tgttctccct ctataggtag ttttagagct agaaatag 58
<210> 113
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 113
taatacgact cactataggt gcttgtactg tgagttattg ttttagagct agaaatag 58
<210> 114
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 114
taatacgact cactataggt ttaaacatgt cttaccgaag ttttagagct agaaatag 58
<210> 115
<211> 57
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 115
taatacgact cactatagga tgaagtacta aggttgaggt tttagagcta gaaatag 57
<210> 116
<211> 57
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 116
taatacgact cactataggc agaccctcat ttgctacagt tttagagcta gaaatag 57
<210> 117
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 117
taatacgact cactatagga tgagacactt gattactacg ttttagagct agaaatag 58
<210> 118
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 118
taatacgact cactatagga gttacagcta ctgcttgatg ttttagagct agaaatag 58
<210> 119
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 119
taatacgact cactataggc aatctaggac tgctgttacg ttttagagct agaaatag 58
<210> 120
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 120
taatacgact cactataggt gaggcgggca gatcatctgg ttttagagct agaaatag 58
<210> 121
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 121
taatacgact cactataggc tctgcgtgtt ctcataaacg ttttagagct agaaatag 58
<210> 122
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 122
taatacgact cactataggc cccttgctag gcctgcctcg ttttagagct agaaatag 58
<210> 123
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 123
taatacgact cactataggt agcaggaggc gtataaacgg ttttagagct agaaatag 58
<210> 124
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 124
taatacgact cactataggt ttgtgtagct gtatacgtag ttttagagct agaaatag 58
<210> 125
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 125
taatacgact cactataggt gtctctcgaa ctaaaaagtg ttttagagct agaaatag 58
<210> 126
<211> 57
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 126
taatacgact cactatagga attcagtatc atcctatggt tttagagcta gaaatag 57
<210> 127
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 127
taatacgact cactataggc gtaatcatat acggcagtag ttttagagct agaaatag 58
<210> 128
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 128
taatacgact cactataggt attagcaatc cccaaatagg ttttagagct agaaatag 58
<210> 129
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 129
taatacgact cactatagga tcggctataa aaaagataag ttttagagct agaaatag 58
<210> 130
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 130
taatacgact cactataggt ggggcttcaa gaggtgtacg ttttagagct agaaatag 58
<210> 131
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 131
taatacgact cactataggt taagctcaag aaagatctcg ttttagagct agaaatag 58
<210> 132
<211> 57
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 132
taatacgact cactataggc ttcctcaaaa aatctacagt tttagagcta gaaatag 57
<210> 133
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 133
taatacgact cactatagga gtttggtata ccagcgagcg ttttagagct agaaatag 58
<210> 134
<211> 57
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 134
taatacgact cactatagga gaatcacttg aacccggggt tttagagcta gaaatag 57
<210> 135
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 135
taatacgact cactataggc aagttaattg tatcaggccg ttttagagct agaaatag 58
<210> 136
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 136
taatacgact cactatagga gccttattca ctaaaattcg ttttagagct agaaatag 58
<210> 137
<211> 57
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 137
taatacgact cactataggt atctagggta ttctttttgt tttagagcta gaaatag 57
<210> 138
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 138
taatacgact cactataggt ctcactctgt cacccaatcg ttttagagct agaaatag 58
<210> 139
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 139
taatacgact cactataggt gtcttgttag tgcacgtgag ttttagagct agaaatag 58
<210> 140
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 140
taatacgact cactataggt tcaactatat accgagtagg ttttagagct agaaatag 58
<210> 141
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 141
taatacgact cactataggt agagctcatc ttaagggtgg ttttagagct agaaatag 58
<210> 142
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 142
taatacgact cactataggc aagggatgtc acaaccgtgg ttttagagct agaaatag 58
<210> 143
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 143
taatacgact cactatagga aacagttata ctgagtattg ttttagagct agaaatag 58
<210> 144
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 144
taatacgact cactatagga gtgaaggggc tcccgtggcg ttttagagct agaaatag 58
<210> 145
<211> 57
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 145
taatacgact cactatagga ttagttggag ctaccagtgt tttagagcta gaaatag 57
<210> 146
<211> 57
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 146
taatacgact cactataggc tgaatttggc gaaagctcgt tttagagcta gaaatag 57
<210> 147
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 147
taatacgact cactatagga tttggattct ggtcgccacg ttttagagct agaaatag 58
<210> 148
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 148
taatacgact cactataggc cccatctcct gaggttcatg ttttagagct agaaatag 58
<210> 149
<211> 57
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 149
taatacgact cactataggc atcggcatgt ttgacaatgt tttagagcta gaaatag 57
<210> 150
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 150
taatacgact cactataggt tagttggggt ggaccacttg ttttagagct agaaatag 58
<210> 151
<211> 57
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 151
taatacgact cactataggc tcaaatcatt cctggtacgt tttagagcta gaaatag 57
<210> 152
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 152
taatacgact cactataggt gaagcaagat atgaaactcg ttttagagct agaaatag 58
<210> 153
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 153
taatacgact cactataggc ctaacctatt aggagttagg ttttagagct agaaatag 58
<210> 154
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 154
taatacgact cactataggc agtctactca agaaatccag ttttagagct agaaatag 58
<210> 155
<211> 57
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 155
taatacgact cactataggc tcttttgtct ggttcaacgt tttagagcta gaaatag 57
<210> 156
<211> 57
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 156
taatacgact cactataggc aacataagta ctaatgtggt tttagagcta gaaatag 57
<210> 157
<211> 78
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 157
aagcaccgac tcggtgccac tttttcaagt tgataacgga ctagccttat tttaacttgc 60
tatttctagc tctaaaac 78
<210> 158
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 158
ggcaaacuua gguauuggaa ccguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 159
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 159
gguucuucac agugcaguga auguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 160
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 160
ggauauaccu ucucagucua cuguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 161
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 161
ggguuagaug auggugaaau aaguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 162
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 162
gggaaugcua ugcuuagauu agguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 163
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 163
ggucugcuag aggaaaacuu ugguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 164
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 164
ggacugcagg cuuuccugug guguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 165
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 165
ggucgggaaa caagcauaga aaguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 166
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 166
ggagcaguau uucauuggua ccguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 167
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 167
gggaagguaa agaaccugca acguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 168
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 168
ggugaggagg aagucuucua ccguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 169
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 169
ggacuccuga aaugauaaau caguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 170
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 170
ggacuggcca gugauccuca ugguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 171
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 171
gggagauacu gaagauguuc cuguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 172
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 172
ggagacagaa ugaauguaga aaguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 173
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 173
ggugcuugug aauuuucuga gaguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 174
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 174
ggcuucaguc cuucuacugu ccguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 175
<211> 39
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 175
ggcucuaauc aaucgacucc guuuuagagc uagaaauag 39
<210> 176
<211> 40
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 176
ggcauguacc ugugcuauau gguuuuagag cuagaaauag 40
<210> 177
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 177
ggagcauuca aagugucaaa guguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 178
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 178
ggcuacagua ggggcaucca uaguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 179
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 179
ggacccuaca cucuccggau gaguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 180
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 180
ggaucugagg aacccccauc guguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 181
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 181
gguccaaugu ccagaacacu acguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 182
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 182
ggagugcuag auacuuucac acguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 183
<211> 40
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 183
ggagcagaca cgucauauuu aguuuuagag cuagaaauag 40
<210> 184
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 184
ggaggaucau caagaauuau gcguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 185
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 185
ggagcgauuc acaaaagagc acguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 186
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 186
ggcaccuaac guuuaacacc uaguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 187
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 187
gguuacacuc ccaagaucaa ucguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 188
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 188
ggccaccgug ccucgccuca ugguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 189
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 189
ggugcacguu cuacacgugu ccguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 190
<211> 40
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 190
gguuguuaag ucuuagucau uguuuuagag cuagaaauag 40
<210> 191
<211> 40
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 191
ggccccagag ucagcucgug uguuuuagag cuagaaauag 40
<210> 192
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 192
gguggguaca ugaauacagu guguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 193
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 193
gguuagaugu acuagucuau caguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 194
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 194
ggaccaccua ucaucuaaug auguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 195
<211> 40
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 195
ggucaacccu gacauauugg cguuuuagag cuagaaauag 40
<210> 196
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 196
ggcauguugu agcuuauguu auguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 197
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 197
ggcuucugga uucuggcuua uaguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 198
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 198
ggagacagau gcuagcacca aaguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 199
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 199
ggacaacuaa uauaccaguc agguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 200
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 200
ggugcuuugu ucuggauuuc gcguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 201
<211> 39
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 201
ggaauugaaa ucaccuagua guuuuagagc uagaaauag 39
<210> 202
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 202
ggagguagua ugaguuccau caguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 203
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 203
gguuuaaggu gaagcagcau cuguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 204
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 204
ggauuacugg uggacuuacu ucguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 205
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 205
ggcucuguca aaugucgugg uaguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 206
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 206
gguucuugau cucccacacu auguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 207
<211> 40
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 207
ggaaaugguu gcugggcacg gguuuuagag cuagaaauag 40
<210> 208
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 208
gguauaggua aacacacgac uuguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 209
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 209
gguucugaag auaccguuaa uaguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 210
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 210
gguuaaaggc augggcuucg ccguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 211
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 211
ggagugaauu uuaugagccc uaguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 212
<211> 40
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 212
ggacgucugu cuacauugaa uguuuuagag cuagaaauag 40
<210> 213
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 213
ggcagcuaac auguaugaug ccguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 214
<211> 40
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 214
ggccuuagcc cccuuaguag cguuuuagag cuagaaauag 40
<210> 215
<211> 39
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 215
gguuucugua gcccauacuu guuuuagagc uagaaauag 39
<210> 216
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 216
ggagcauaca uaggguuucu cuguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 217
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 217
ggcagcacuu gagugucauu cuguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 218
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 218
ggcaucugua uaaaccgugu gaguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 219
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 219
ggauuuggua augaugcuag guguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 220
<211> 40
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 220
ggccauuuaa aaaguaaugg cguuuuagag cuagaaauag 40
<210> 221
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 221
ggaagcauug gaggaauauc guguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 222
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 222
ggacaacaua aucaucguuu gcguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 223
<211> 40
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 223
ggucacuggu uaaaacuaag gguuuuagag cuagaaauag 40
<210> 224
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 224
ggaguaaugc aauaugguag acguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 225
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 225
ggcagugaga auguauauac ucguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 226
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 226
gguaauauuu uggcuaagag ccguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 227
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 227
gguucucauu cauauaaauu guguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 228
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 228
gguuuuaccc ccagugguau guguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 229
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 229
gguagaaaug cccugaucau uaguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 230
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 230
ggcuaugagc acaguagaac uaguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 231
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 231
gguacauuua gugguagucc agguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 232
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 232
ggcuuaagua uaguaauuag aaguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 233
<211> 40
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 233
ggcuuagaua aauuacagau uguuuuagag cuagaaauag 40
<210> 234
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 234
gguaguaguc cccccuuauc caguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 235
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 235
gguugcggua aaccgagauc acguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 236
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 236
ggucaggcuu uacuagaaga acguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 237
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 237
ggaauagcug caaagaccac auguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 238
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 238
ggauucauca gcguuugcuu caguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 239
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 239
ggcaaggaag uuguaccguc uuguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 240
<211> 40
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 240
ggcaguaaag caggcaauau cguuuuagag cuagaaauag 40
<210> 241
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 241
ggucuguagc uuugaagaau gcguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 242
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 242
ggacauuugc aaaugcugau ucguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 243
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 243
ggagugaccu gauucuaaac acguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 244
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 244
ggccaggagu ucgagacuag ccguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 245
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 245
ggugucccaa aagagcuagu uaguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 246
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 246
gguccacuuu ugaauguugu acguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 247
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 247
ggaaaauguc agacaagcuc aaguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 248
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 248
ggucuuccaa guagcuaaug aaguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 249
<211> 40
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 249
ggauuacaug aacaaauggg cguuuuagag cuagaaauag 40
<210> 250
<211> 40
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 250
ggauacagua uuaauugacu gguuuuagag cuagaaauag 40
<210> 251
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 251
gguggucuuu aagauaguca ucguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 252
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 252
ggaggggcuu uuauucugcu caguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 253
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 253
ggaauaauau ugaaaugacu acguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 254
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 254
ggauuaucug gccaguuuau gaguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 255
<211> 40
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 255
ggaaaaguua ugcaauucuu cguuuuagag cuagaaauag 40
<210> 256
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 256
gguggguuuu cauacagcua gcguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 257
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 257
gguuaucacu uaagagcuua ggguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 258
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 258
ggacaacuug uguaaaaagc uaguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 259
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 259
ggauauaccu caucagaaug guguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 260
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 260
ggccugcauu uaggauagcc agguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 261
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 261
ggauguagca cgcauucaca uaguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 262
<211> 39
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 262
gggauuuuua gcacagcaag guuuuagagc uagaaauag 39
<210> 263
<211> 40
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 263
gguaaugaag caucugauac cguuuuagag cuagaaauag 40
<210> 264
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 264
ggcaaaguua agggaguguu agguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 265
<211> 40
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 265
ggacaaacaa caguugguau uguuuuagag cuagaaauag 40
<210> 266
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 266
ggagagaaug uguggcauga cuguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 267
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 267
ggcguauaca gauuugauau cuguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 268
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 268
ggacuuuacu cuuucaaaca uuguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 269
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 269
ggcuguucuc ccucuauagg uaguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 270
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 270
ggugcuugua cugugaguua uuguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 271
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 271
gguuuaaaca ugucuuaccg aaguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 272
<211> 40
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 272
ggaugaagua cuaagguuga gguuuuagag cuagaaauag 40
<210> 273
<211> 40
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 273
ggcagacccu cauuugcuac aguuuuagag cuagaaauag 40
<210> 274
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 274
ggaugagaca cuugauuacu acguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 275
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 275
ggaguuacag cuacugcuug auguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 276
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 276
ggcaaucuag gacugcuguu acguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 277
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 277
ggugaggcgg gcagaucauc ugguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 278
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 278
ggcucugcgu guucucauaa acguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 279
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 279
ggccccuugc uaggccugcc ucguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 280
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 280
gguagcagga ggcguauaaa cgguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 281
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 281
gguuugugua gcuguauacg uaguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 282
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 282
ggugucucuc gaacuaaaaa guguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 283
<211> 40
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 283
ggaauucagu aucauccuau gguuuuagag cuagaaauag 40
<210> 284
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 284
ggcguaauca uauacggcag uaguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 285
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 285
gguauuagca auccccaaau agguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 286
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 286
ggaucggcua uaaaaaagau aaguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 287
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 287
gguggggcuu caagaggugu acguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 288
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 288
gguuaagcuc aagaaagauc ucguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 289
<211> 40
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 289
ggcuuccuca aaaaaucuac aguuuuagag cuagaaauag 40
<210> 290
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 290
ggaguuuggu auaccagcga gcguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 291
<211> 40
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 291
ggagaaucac uugaacccgg gguuuuagag cuagaaauag 40
<210> 292
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 292
ggcaaguuaa uuguaucagg ccguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 293
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 293
ggagccuuau ucacuaaaau ucguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 294
<211> 40
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 294
gguaucuagg guauucuuuu uguuuuagag cuagaaauag 40
<210> 295
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 295
ggucucacuc ugucacccaa ucguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 296
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 296
ggugucuugu uagugcacgu gaguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 297
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 297
gguucaacua uauaccgagu agguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 298
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 298
gguagagcuc aucuuaaggg ugguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 299
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 299
ggcaagggau gucacaaccg ugguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 300
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 300
ggaaacaguu auacugagua uuguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 301
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 301
ggagugaagg ggcucccgug gcguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 302
<211> 40
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 302
ggauuaguug gagcuaccag uguuuuagag cuagaaauag 40
<210> 303
<211> 40
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 303
ggcugaauuu ggcgaaagcu cguuuuagag cuagaaauag 40
<210> 304
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 304
ggauuuggau ucuggucgcc acguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 305
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 305
ggccccaucu ccugagguuc auguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 306
<211> 40
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 306
ggcaucggca uguuugacaa uguuuuagag cuagaaauag 40
<210> 307
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 307
gguuaguugg gguggaccac uuguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 308
<211> 40
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 308
ggcucaaauc auuccuggua cguuuuagag cuagaaauag 40
<210> 309
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 309
ggugaagcaa gauaugaaac ucguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 310
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 310
ggccuaaccu auuaggaguu agguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 311
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 311
ggcagucuac ucaagaaauc caguuuuaga gcuagaaaua g 41
<210> 312
<211> 40
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 312
ggcucuuuug ucugguucaa cguuuuagag cuagaaauag 40
<210> 313
<211> 40
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 313
ggcaacauaa guacuaaugu gguuuuagag cuagaaauag 40
<210> 314
<211> 30
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 314
acgttggatg acctatcgga agaaggcaag 30
<210> 315
<211> 30
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 315
acgttggatg cgctcttgta ttatctgtgg 30
<210> 316
<211> 30
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 316
acgttggatg taacttcagc tctgggaaag 30
<210> 317
<211> 30
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 317
acgttggatg ctggagccaa gaagagtaac 30
<210> 318
<211> 30
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 318
acgttggatg agagtgggca gagaatgttg 30
<210> 319
<211> 30
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 319
acgttggatg aaggtttcaa agcgccagtc 30
<210> 320
<211> 30
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 320
acgttggatg tgtctaagaa cacagaggag 30
<210> 321
<211> 30
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 321
acgttggatg aggtgatgtt cctgagatgc 30
<210> 322
<211> 31
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 322
acgttggatg ctcattctga atagaatcac c 31
<210> 323
<211> 30
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 323
acgttggatg aacggagcag aatggtcaag 30
<210> 324
<211> 30
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 324
acgttggatg acggctaatt gtgctcactg 30
<210> 325
<211> 30
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 325
acgttggatg gctagaggaa aactttgagg 30
<210> 326
<211> 30
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 326
acgttggatg ctctgggtcc ttaaagaaac 30
<210> 327
<211> 30
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 327
acgttggatg acaggcttga tattagactc 30
<210> 328
<211> 30
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 328
acgttggatg agatctgaat gctgatcccc 30
<210> 329
<211> 30
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 329
acgttggatg ctaggattct ctgagcatgg 30
<210> 330
<211> 30
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 330
acgttggatg acagtgagca caattagccg 30
<210> 331
<211> 30
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 331
acgttggatg ttagtactgg aacctacttc 30
<210> 332
<211> 30
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 332
acgttggatg ttagtactgg aacctacttc 30
<210> 333
<211> 30
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 333
acgttggatg acagtgagca caattagccg 30

Claims (10)

1.一种基于Crispr/cas9系统从基因组DNA中捕获目标基因序列的方法，包括如下步骤：
1)、根据目标基因序列设计合成多个gRNA；
每个所述gRNA能结合且识别所述目标基因序列不同靶区域；
所述目标基因序列能通过所述gRNA引导cas9酶将其切割为多个100-300bp的片段化产物；
2)用所述多个gRNA和所述cas9酶对所述基因组DNA进行切割反应，得到含有多个100-300bp的片段化产物的切割产物；
3)捕获所述切割产物中的目标基因序列的多个100-300bp的片段化产物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
步骤1)中，所述设计合成多个gRNA的方法为如下a或b：
a所示的方法包括如下步骤：
(1)根据所述目标基因序列设计多个所述gRNA，再根据所述gRNA设计合成用于制备其对应转录模板的引物对，得到多个所述gRNA转录模板对应的引物对；
(2)将多个所述gRNA转录模板对应的引物对分别进行聚合酶链式反应，得到对应的多个所述gRNA转录模板，
(3)转录所述对应的多个gRNA转录模板，得到多个gRNA；
b所示的方法包括如下步骤：
(1)根据所述目标基因序列设计多个所述gRNA，再根据所述gRNA设计合成对应的转录模板，得到多个gRNA转录模板；
(2)转录所述多个gRNA转录模板，得到多个gRNA。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
所述转录多个gRNA转录模板为分别转录或者混合多个gRNA转录模板再共同转录；
或所述捕获的方法为磁珠法。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：
所述基因组DNA为人或动物或其他物种的细胞的基因组DNA；
所述目标基因序列为BRCA1基因的外显子和BRCA2基因的外显子；
所述BRCA1基因的外显子对应的多个gRNA的核苷酸序列分别为序列158-220；
所述BRCA2基因的外显子对应的多个gRNA的核苷酸序列分别为序列221-313；
或所述BRCA1基因的外显子对应的多个gRNA对应的引物对中的上游引物的核苷酸序列分别为序列1-序列63，下游引物的核苷酸序列为序列157；
或所述BRCA2基因的外显子对应的多个gRNA对应的引物对中的上游引物的核苷酸序列分别为序列64-序列156，下游引物的核苷酸序列为序列157。
5.权利要求1-4中任一所述的方法在目标基因序列的高通量测序文库制备中的应用。
6.权利要求1-4中任一所述的方法在目标基因序列的高通量测序中的应用。
7.一种目标基因序列的高通量测序方法，包括如下步骤：
1)权利要求1-4中任一所述的方法捕获所述目标基因序列的多个100-300bp的片段化产物；
2)用所述多个100-300bp的片段化产物制备高通量测序文库；
3)高通量测序所述高通量测序文库，实现目标基因序列的高通量测序。
8.Crispr/cas9系统在基因组DNA中捕获或分离或聚集目标基因序列中的应用；
所述Crispr/cas9系统包括多个gRNA和cas9酶；
所述多个gRNA引导所述CAS9酶将所述目标基因序列切割为多个大小为100-300bp片段化产物。
9.一种用于基因组DNA中捕获目标基因序列的试剂盒，包括权利要求8所述应用中的所述Crispr/cas9系统。
10.一种高通量测序目标基因序列的试剂盒，包括权利要求8所述应用中的所述Crispr/cas9系统和测序文库制备所需试剂。
CN201710589991.5A 2017-07-19 2017-07-19 一种基于Crispr/cas9的捕获基因组目标序列的方法及其在高通量测序中的应用 Pending CN107190008A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710589991.5A CN107190008A (zh) 2017-07-19 2017-07-19 一种基于Crispr/cas9的捕获基因组目标序列的方法及其在高通量测序中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710589991.5A CN107190008A (zh) 2017-07-19 2017-07-19 一种基于Crispr/cas9的捕获基因组目标序列的方法及其在高通量测序中的应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107190008A true CN107190008A (zh) 2017-09-22

Family

ID=59882651

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710589991.5A Pending CN107190008A (zh) 2017-07-19 2017-07-19 一种基于Crispr/cas9的捕获基因组目标序列的方法及其在高通量测序中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107190008A (zh)

Cited By (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9999671B2 (en) 2013-09-06 2018-06-19 President And Fellows Of Harvard College Delivery of negatively charged proteins using cationic lipids
US10113163B2 (en) 2016-08-03 2018-10-30 President And Fellows Of Harvard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
US10167457B2 (en) 2015-10-23 2019-01-01 President And Fellows Of Harvard College Nucleobase editors and uses thereof
CN109182454A (zh) * 2018-08-22 2019-01-11 杭州恺思医疗器械有限公司 一种捕获基因组特定dna片段的方法
CN109355289A (zh) * 2018-12-24 2019-02-19 人和未来生物科技（长沙）有限公司 用于从预文库中富集靶标序列的试剂盒、制备方法和应用
CN109652861A (zh) * 2018-12-22 2019-04-19 阅尔基因技术（苏州）有限公司 一种生化试剂盒及其应用方法
CN109652497A (zh) * 2018-12-24 2019-04-19 人和未来生物科技（长沙）有限公司 一种从预文库中富集靶标序列的方法和应用
US10323236B2 (en) 2011-07-22 2019-06-18 President And Fellows Of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
CN110205318A (zh) * 2019-05-15 2019-09-06 杭州杰毅生物技术有限公司 基于CRISPR-Cas去除宿主基因组DNA的宏基因组提取方法
US10465176B2 (en) 2013-12-12 2019-11-05 President And Fellows Of Harvard College Cas variants for gene editing
US10508298B2 (en) 2013-08-09 2019-12-17 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a CAS9 nuclease
US10597679B2 (en) 2013-09-06 2020-03-24 President And Fellows Of Harvard College Switchable Cas9 nucleases and uses thereof
US10704062B2 (en) 2014-07-30 2020-07-07 President And Fellows Of Harvard College CAS9 proteins including ligand-dependent inteins
CN111471745A (zh) * 2020-03-30 2020-07-31 华中农业大学 基于CRISPR/Cas9系统介导的DNA靶向捕获方法
US10745677B2 (en) 2016-12-23 2020-08-18 President And Fellows Of Harvard College Editing of CCR5 receptor gene to protect against HIV infection
CN111910001A (zh) * 2020-07-16 2020-11-10 河南金泰生物技术股份有限公司 一种检测BRCA1基因SNP位点rs1799950基因分型的引物组及试剂盒
US10858639B2 (en) 2013-09-06 2020-12-08 President And Fellows Of Harvard College CAS9 variants and uses thereof
US11046948B2 (en) 2013-08-22 2021-06-29 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
CN113106144A (zh) * 2020-12-30 2021-07-13 中南大学湘雅二医院 Dna片段靶向富集方法及其在基因组靶向测序中的应用
US11268082B2 (en) 2017-03-23 2022-03-08 President And Fellows Of Harvard College Nucleobase editors comprising nucleic acid programmable DNA binding proteins
US11306324B2 (en) 2016-10-14 2022-04-19 President And Fellows Of Harvard College AAV delivery of nucleobase editors
US11319532B2 (en) 2017-08-30 2022-05-03 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising Gam
US11447770B1 (en) 2019-03-19 2022-09-20 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for prime editing nucleotide sequences
US11542509B2 (en) 2016-08-24 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
US11542496B2 (en) 2017-03-10 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Cytosine to guanine base editor
US11560566B2 (en) 2017-05-12 2023-01-24 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide RNAs for use with CRISPR-Cas9 in genome editing and transcriptional activation
US11661590B2 (en) 2016-08-09 2023-05-30 President And Fellows Of Harvard College Programmable CAS9-recombinase fusion proteins and uses thereof
US11732274B2 (en) 2017-07-28 2023-08-22 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for evolving base editors using phage-assisted continuous evolution (PACE)
US11795443B2 (en) 2017-10-16 2023-10-24 The Broad Institute, Inc. Uses of adenosine base editors
US11898179B2 (en) 2017-03-09 2024-02-13 President And Fellows Of Harvard College Suppression of pain by gene editing
US11912985B2 (en) 2020-05-08 2024-02-27 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for simultaneous editing of both strands of a target double-stranded nucleotide sequence
US12157760B2 (en) 2018-05-23 2024-12-03 The Broad Institute, Inc. Base editors and uses thereof
US12281338B2 (en) 2018-10-29 2025-04-22 The Broad Institute, Inc. Nucleobase editors comprising GeoCas9 and uses thereof
US12351837B2 (en) 2019-01-23 2025-07-08 The Broad Institute, Inc. Supernegatively charged proteins and uses thereof
US12390514B2 (en) 2017-03-09 2025-08-19 President And Fellows Of Harvard College Cancer vaccine
US12406749B2 (en) 2017-12-15 2025-09-02 The Broad Institute, Inc. Systems and methods for predicting repair outcomes in genetic engineering
US12435330B2 (en) 2019-10-10 2025-10-07 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for prime editing RNA
US12473543B2 (en) 2019-04-17 2025-11-18 The Broad Institute, Inc. Adenine base editors with reduced off-target effects
US12522807B2 (en) 2018-07-09 2026-01-13 The Broad Institute, Inc. RNA programmable epigenetic RNA modifiers and uses thereof
US12584118B2 (en) 2022-09-30 2026-03-24 President And Fellows Of Harvard College Cas9 variants and uses thereof

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140357523A1 (en) * 2013-05-29 2014-12-04 Agilent Technologies, Inc. Method for fragmenting genomic dna using cas9
CN107406875A (zh) * 2014-12-20 2017-11-28 阿克生物公司 使用CRISPR/Cas系统蛋白靶向消减、富集、和分割核酸的组合物及方法
CN108138176A (zh) * 2015-08-19 2018-06-08 阿克生物公司 使用基于核酸引导的核酸酶的系统捕获核酸
CN109182454A (zh) * 2018-08-22 2019-01-11 杭州恺思医疗器械有限公司 一种捕获基因组特定dna片段的方法
CN109790576A (zh) * 2016-09-27 2019-05-21 优比欧迈公司 基于crispr的文库制备和测序的方法和系统

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140357523A1 (en) * 2013-05-29 2014-12-04 Agilent Technologies, Inc. Method for fragmenting genomic dna using cas9
CN107406875A (zh) * 2014-12-20 2017-11-28 阿克生物公司 使用CRISPR/Cas系统蛋白靶向消减、富集、和分割核酸的组合物及方法
CN108138176A (zh) * 2015-08-19 2018-06-08 阿克生物公司 使用基于核酸引导的核酸酶的系统捕获核酸
CN109790576A (zh) * 2016-09-27 2019-05-21 优比欧迈公司 基于crispr的文库制备和测序的方法和系统
CN109182454A (zh) * 2018-08-22 2019-01-11 杭州恺思医疗器械有限公司 一种捕获基因组特定dna片段的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
温旺荣: "《临床分子诊断学》", 31 March 2014, 广东科技出版社 *
邵志敏: "《乳腺癌 基础与临床的转化 上》", 30 September 2016, 上海交通大学出版社 *

Cited By (71)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10323236B2 (en) 2011-07-22 2019-06-18 President And Fellows Of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
US12006520B2 (en) 2011-07-22 2024-06-11 President And Fellows Of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
US11920181B2 (en) 2013-08-09 2024-03-05 President And Fellows Of Harvard College Nuclease profiling system
US10954548B2 (en) 2013-08-09 2021-03-23 President And Fellows Of Harvard College Nuclease profiling system
US10508298B2 (en) 2013-08-09 2019-12-17 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a CAS9 nuclease
US11046948B2 (en) 2013-08-22 2021-06-29 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
US10912833B2 (en) 2013-09-06 2021-02-09 President And Fellows Of Harvard College Delivery of negatively charged proteins using cationic lipids
US10682410B2 (en) 2013-09-06 2020-06-16 President And Fellows Of Harvard College Delivery system for functional nucleases
US11299755B2 (en) 2013-09-06 2022-04-12 President And Fellows Of Harvard College Switchable CAS9 nucleases and uses thereof
US12559737B2 (en) 2013-09-06 2026-02-24 President And Fellows Of Harvard College Cas9 variants and uses thereof
US12473573B2 (en) 2013-09-06 2025-11-18 President And Fellows Of Harvard College Switchable Cas9 nucleases and uses thereof
US10597679B2 (en) 2013-09-06 2020-03-24 President And Fellows Of Harvard College Switchable Cas9 nucleases and uses thereof
US10858639B2 (en) 2013-09-06 2020-12-08 President And Fellows Of Harvard College CAS9 variants and uses thereof
US9999671B2 (en) 2013-09-06 2018-06-19 President And Fellows Of Harvard College Delivery of negatively charged proteins using cationic lipids
US12215365B2 (en) 2013-12-12 2025-02-04 President And Fellows Of Harvard College Cas variants for gene editing
US10465176B2 (en) 2013-12-12 2019-11-05 President And Fellows Of Harvard College Cas variants for gene editing
US11053481B2 (en) 2013-12-12 2021-07-06 President And Fellows Of Harvard College Fusions of Cas9 domains and nucleic acid-editing domains
US11124782B2 (en) 2013-12-12 2021-09-21 President And Fellows Of Harvard College Cas variants for gene editing
US10704062B2 (en) 2014-07-30 2020-07-07 President And Fellows Of Harvard College CAS9 proteins including ligand-dependent inteins
US12398406B2 (en) 2014-07-30 2025-08-26 President And Fellows Of Harvard College CAS9 proteins including ligand-dependent inteins
US11578343B2 (en) 2014-07-30 2023-02-14 President And Fellows Of Harvard College CAS9 proteins including ligand-dependent inteins
US12344869B2 (en) 2015-10-23 2025-07-01 President And Fellows Of Harvard College Nucleobase editors and uses thereof
US10167457B2 (en) 2015-10-23 2019-01-01 President And Fellows Of Harvard College Nucleobase editors and uses thereof
US11214780B2 (en) 2015-10-23 2022-01-04 President And Fellows Of Harvard College Nucleobase editors and uses thereof
US12043852B2 (en) 2015-10-23 2024-07-23 President And Fellows Of Harvard College Evolved Cas9 proteins for gene editing
US11999947B2 (en) 2016-08-03 2024-06-04 President And Fellows Of Harvard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
US10947530B2 (en) 2016-08-03 2021-03-16 President And Fellows Of Harvard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
US10113163B2 (en) 2016-08-03 2018-10-30 President And Fellows Of Harvard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
US11702651B2 (en) 2016-08-03 2023-07-18 President And Fellows Of Harvard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
US11661590B2 (en) 2016-08-09 2023-05-30 President And Fellows Of Harvard College Programmable CAS9-recombinase fusion proteins and uses thereof
US12084663B2 (en) 2016-08-24 2024-09-10 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
US11542509B2 (en) 2016-08-24 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
US11306324B2 (en) 2016-10-14 2022-04-19 President And Fellows Of Harvard College AAV delivery of nucleobase editors
US11820969B2 (en) 2016-12-23 2023-11-21 President And Fellows Of Harvard College Editing of CCR2 receptor gene to protect against HIV infection
US10745677B2 (en) 2016-12-23 2020-08-18 President And Fellows Of Harvard College Editing of CCR5 receptor gene to protect against HIV infection
US12516308B2 (en) 2017-03-09 2026-01-06 President And Fellows Of Harvard College Suppression of pain by gene editing
US12390514B2 (en) 2017-03-09 2025-08-19 President And Fellows Of Harvard College Cancer vaccine
US11898179B2 (en) 2017-03-09 2024-02-13 President And Fellows Of Harvard College Suppression of pain by gene editing
US12435331B2 (en) 2017-03-10 2025-10-07 President And Fellows Of Harvard College Cytosine to guanine base editor
US11542496B2 (en) 2017-03-10 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Cytosine to guanine base editor
US11268082B2 (en) 2017-03-23 2022-03-08 President And Fellows Of Harvard College Nucleobase editors comprising nucleic acid programmable DNA binding proteins
US11560566B2 (en) 2017-05-12 2023-01-24 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide RNAs for use with CRISPR-Cas9 in genome editing and transcriptional activation
US11732274B2 (en) 2017-07-28 2023-08-22 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for evolving base editors using phage-assisted continuous evolution (PACE)
US12359218B2 (en) 2017-07-28 2025-07-15 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for evolving base editors using phage-assisted continuous evolution (PACE)
US11319532B2 (en) 2017-08-30 2022-05-03 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising Gam
US11932884B2 (en) 2017-08-30 2024-03-19 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising Gam
US11795443B2 (en) 2017-10-16 2023-10-24 The Broad Institute, Inc. Uses of adenosine base editors
US12406749B2 (en) 2017-12-15 2025-09-02 The Broad Institute, Inc. Systems and methods for predicting repair outcomes in genetic engineering
US12157760B2 (en) 2018-05-23 2024-12-03 The Broad Institute, Inc. Base editors and uses thereof
US12522807B2 (en) 2018-07-09 2026-01-13 The Broad Institute, Inc. RNA programmable epigenetic RNA modifiers and uses thereof
CN109182454A (zh) * 2018-08-22 2019-01-11 杭州恺思医疗器械有限公司 一种捕获基因组特定dna片段的方法
US12281338B2 (en) 2018-10-29 2025-04-22 The Broad Institute, Inc. Nucleobase editors comprising GeoCas9 and uses thereof
CN109652861A (zh) * 2018-12-22 2019-04-19 阅尔基因技术（苏州）有限公司 一种生化试剂盒及其应用方法
CN109355289A (zh) * 2018-12-24 2019-02-19 人和未来生物科技（长沙）有限公司 用于从预文库中富集靶标序列的试剂盒、制备方法和应用
CN109652497A (zh) * 2018-12-24 2019-04-19 人和未来生物科技（长沙）有限公司 一种从预文库中富集靶标序列的方法和应用
US12351837B2 (en) 2019-01-23 2025-07-08 The Broad Institute, Inc. Supernegatively charged proteins and uses thereof
US12281303B2 (en) 2019-03-19 2025-04-22 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for prime editing nucleotide sequences
US12509680B2 (en) 2019-03-19 2025-12-30 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for prime editing nucleotide sequences
US11643652B2 (en) 2019-03-19 2023-05-09 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for prime editing nucleotide sequences
US11447770B1 (en) 2019-03-19 2022-09-20 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for prime editing nucleotide sequences
US12570972B2 (en) 2019-03-19 2026-03-10 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for prime editing nucleotide sequences
US11795452B2 (en) 2019-03-19 2023-10-24 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for prime editing nucleotide sequences
US12473543B2 (en) 2019-04-17 2025-11-18 The Broad Institute, Inc. Adenine base editors with reduced off-target effects
CN110205318A (zh) * 2019-05-15 2019-09-06 杭州杰毅生物技术有限公司 基于CRISPR-Cas去除宿主基因组DNA的宏基因组提取方法
US12435330B2 (en) 2019-10-10 2025-10-07 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for prime editing RNA
CN111471745A (zh) * 2020-03-30 2020-07-31 华中农业大学 基于CRISPR/Cas9系统介导的DNA靶向捕获方法
US12031126B2 (en) 2020-05-08 2024-07-09 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for simultaneous editing of both strands of a target double-stranded nucleotide sequence
US11912985B2 (en) 2020-05-08 2024-02-27 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for simultaneous editing of both strands of a target double-stranded nucleotide sequence
CN111910001A (zh) * 2020-07-16 2020-11-10 河南金泰生物技术股份有限公司 一种检测BRCA1基因SNP位点rs1799950基因分型的引物组及试剂盒
CN113106144A (zh) * 2020-12-30 2021-07-13 中南大学湘雅二医院 Dna片段靶向富集方法及其在基因组靶向测序中的应用
US12584118B2 (en) 2022-09-30 2026-03-24 President And Fellows Of Harvard College Cas9 variants and uses thereof

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107190008A (zh) 一种基于Crispr/cas9的捕获基因组目标序列的方法及其在高通量测序中的应用
CN108103055B (zh) 一种单细胞rna逆转录与文库构建的方法
CN103088433B (zh) 全基因组甲基化高通量测序文库的构建方法及其应用
JP6483249B2 (ja) 単離されたオリゴヌクレオチドおよび核酸の配列決定におけるその使用
US20190194648A1 (en) Construction method for serial sequencing libraries of rad tags
CN103233072B (zh) 一种高通量全基因组dna甲基化检测技术
CN109666662A (zh) 新型ScCas12a在核酸检测方面的应用
CN102181943B (zh) 一种配对双末端文库构建方法及用该文库进行基因组测序的方法
CN112680797B (zh) 一种去除高丰度rna的测序文库及其构建方法
CN108138365A (zh) 一种高通量的单细胞转录组建库方法
EP3615683B1 (en) Methods for linking polynucleotides
CN110951827B (zh) 一种转录组测序文库快速构建方法及其应用
CN104313172A (zh) 一种大量样本同时分型的方法
CN108166069A (zh) 一种新型甲基化建库方法及其应用
WO2022199242A1 (zh) 一组条码接头以及中通量多重单细胞代表性dna甲基化建库和测序方法
CN107828858B (zh) 一种基于转录组测序开发鬼针草植物ssr引物的方法
CN102797044A (zh) 一种快速高效的均一化全长cDNA文库构建方法
CN109750092B (zh) 一种靶向富集高gc含量目标dna的方法和试剂盒
CN107794573A (zh) 一种构建dna大片段文库的方法及其应用
CN113638055B (zh) 一种制备双链rna测序文库的方法
CN115873922A (zh) 一种单细胞全长转录本建库测序方法
CN107794257B (zh) 一种dna大片段文库的构建方法及其应用
WO2023217214A1 (zh) 一种单细胞RNA m5C修饰的分析方法
CN104694630B (zh) 用于多重连接扩增技术的探针制备方法
CN118302538B (zh) 一种用于检测剪接异构体的靶向高通量测序方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20170922