CN104628810B - 一种细胞膜蛋白质富集纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种细胞膜蛋白质富集纯化方法，该方法利用细胞膜表面整合膜蛋白质贯穿于膜双分子层且细胞膜表面膜蛋白质多发生糖基化修饰的自然特征，通过功能化磁性微球捕获作为诱饵的细胞膜表面糖基化修饰蛋白质，实现细胞膜与细胞器的分离及细胞膜整合膜蛋白质的高效富集。该方法具有细胞膜与细胞器分离效率高的优点，可对细胞膜蛋白质进行高效分析及表征。此外功能化磁性微球的引入，使该方法具有操作简便，分离快速且样品损失低的优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种细胞膜蛋白质富集纯化方法。
背景技术
细胞膜是细胞内外环境交流的界面，细胞膜蛋白质在细胞内外物质交换、细胞识别与免疫应答信号传导和调控，以及能量传递等方面扮演着重要的角色。在已知的药物靶标中，大约有70%是细胞膜蛋白质。因此，疾病细胞的过表达细胞膜蛋白质可作为治疗用抗体及小分子药物的蛋白靶标。
然而，目前在PDB数据库中已经被成功解析的86000多种蛋白质的数据结构中，只有1%～2%的结果与细胞膜蛋白质相关。原因在于细胞膜蛋白质具有丰度低、疏水性强及大部分细胞膜蛋白质存在糖基化与磷酸化等翻译后修饰造成膜蛋白的微观不均一性的特性。通过细胞膜与细胞器的分离及细胞膜蛋白质的富集，可以减少样品的复杂性；同时可提高起始样品复合物的动力学范围，从而提高低丰度蛋白的鉴定。因此，如何分离纯化细胞膜蛋白质特别是含有跨膜区的整合膜蛋白是细胞膜蛋白质组学研究的难点。
近年来，研究者们利用细胞膜蛋白质的特性发展了许多细胞膜蛋白质的富集方法，包括差速离心法、两相分配法、抗体免疫磁珠结合法、生物素标记法等。然而，这些方法具有膜细胞器污染严重、可用抗体种类少、回收率低等缺点。
细胞表面蛋白糖基化修饰富集方法由于其应用范围广、纯度高等优势近年来受到广泛关注。（Wollscheid,B.,Bausch F.D.,Henderson C.,O’Brien R.,Bibel M.,SchiessR.,Aebersold R.&Watts,J.Nat.Biotechnol.2009(27),378-386.）然而，目前采用该方法研究细胞膜蛋白质的结果都关注于细胞膜蛋白质中的糖蛋白质及糖基化位点的研究，使用该方法应用于细胞膜蛋白质的深度覆盖的研究并未见报道。本发明集合了细胞表面糖基化修饰蛋白质富集方法可高效完成细胞膜与细胞器分离的优势及功能化磁性微球操作简便、分离快速、样品损失低的特点，发展出一种细胞膜与细胞器分离高效、回收率高、操作简便的细胞膜蛋白质高纯度富集方法。
发明内容
为了克服细胞膜蛋白质提取纯度低、膜细胞器污染严重等不足，本发明提供一种细胞膜蛋白质富集纯化方法，使用功能化磁性微球捕获作为诱饵的细胞表面糖基化修饰蛋白，以富集及分析细胞膜蛋白质，从而实现细胞膜与细胞器分离并获得高纯度细胞膜蛋白质。该方法选择性高，此外功能化磁性微球的使用，使该方法具有操作简便，分离快速且样品损失小的优点。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
（1）细胞膜表面糖基化修饰蛋白的氧化：使用酶消化法、离子螯合法或物理法将培养皿中细胞消化后，向细胞样品中加入氧化缓冲液（pH为4-7的醋酸盐与氯化盐混合缓冲液或磷酸缓冲液）配制的氧化剂（浓度为1-100mM的高碘化物）溶液与细胞反应5min-2h；
（2）细胞膜表面糖蛋白的捕获：采用氧化缓冲液清洗氧化的细胞样品去除剩余的氧化剂后，向细胞样品中加入悬浮于氧化缓冲液的带有功能化官能团的磁性微球，室温下震荡2-24h；
（3）醛基的封闭：采用pH为7-10的三羟甲基氨基甲烷缓冲液清洗捕获蛋白样品的磁性微球，将捕获细胞样品的磁性微球重悬浮于三羟甲基氨基甲烷缓冲液并孵育5min-2h以封闭经氧化的非细胞膜蛋白质；
（4）外周膜蛋白质的去除：分别使用0.1-8M的氯化钠、0.1-8M氯化钾溶液、0.1-1M的碳酸钠溶液、2-10M的尿素溶液、1-8M的盐酸胍溶液或10-1000mM的碳酸氢铵溶液清洗磁性微球以去除逸出的可溶性蛋白；
（5）细胞的裂解：向细胞样品中加入裂解液，使用机械裂解、化学裂解或酶解方法将细胞裂解；
（6）可溶性蛋白质的去除及细胞器分级：细胞裂解后，分别使用0.1-8M的氯化钠、0.1-8M氯化钾溶液、0.1-1M的碳酸钠溶液、2-10M的尿素溶液、1-8M的盐酸胍溶液或10-1000mM的碳酸氢铵溶液清洗裂解的细胞样品。
（7）细胞膜蛋白质的富集：向细胞样品中加入pH为7.5-14的碱性缓冲溶液（碳酸氢铵缓冲盐溶液、磷酸缓冲盐溶液或三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液）配制的糖基肽酶溶液，反应6-24h使连接在磁性微球上的糖链断裂以获得磁性微球上的细胞膜蛋白质；或使用pH为7.5-14的溶有体积浓度为1%-30%的表面活性剂（十二烷基磺酸钠、脱氧胆酸钠、Triton X-100、chaps、Rapigest SF或NP-40d）或去垢剂（尿素、硫脲或盐酸胍）的碱性溶液超声萃取0.1-2h获得磁性微球上细胞膜蛋白质。
本发明具有以下优点：
1、可有效实现细胞膜与细胞器分离。功能化磁性微球仅与经氧化的细胞膜表面糖基化修饰蛋白质反应，且在样品处理过程中，加入多次清洗过程，去除逸出的细胞器及非细胞膜蛋白质，实现细胞膜与细胞器的有效分离。
2、细胞膜蛋白质纯度高。保持细胞膜完整的条件下进行细胞膜表面糖基化修饰蛋白质的捕获；磁性微球捕获细胞膜表面糖基化修饰蛋白质及细胞裂解后，使用三羟甲基氨基甲烷缓冲液与样品孵育，封闭非细胞膜蛋白质的醛基位点，阻止非细胞膜蛋白质与磁性微球作用，减少细胞器蛋白质及可溶性蛋白质造成的污染；高盐高pH缓冲液的使用，可有效地去除细胞质蛋白及外周膜蛋白质。
3、操作简便。功能化磁性微球的引入，可以通过磁力吸附实现磁性微球与非细胞膜蛋白质的分离。
附图说明
图1为细胞膜蛋白质富集纯化流程图。
图中1：细胞膜表面糖蛋白的氧化2：细胞膜表面糖基化修饰蛋白的捕获3：细胞的裂解4：细胞膜蛋白质的富集5：细胞膜蛋白质的酶解6：细胞膜蛋白质酶解产物的收集。
具体实施方式
实施例1
1.细胞膜表面糖蛋白的氧化
使用胰酶将培养皿中人宫颈癌细胞消化后，向细胞样品中加入氧化缓冲液（100mM醋酸钠,150mM氯化钠,pH5.5）配制的5mM高碘酸钠溶液与细胞反应1h；
2.细胞膜表面糖蛋白质的捕获
采用氧化缓冲液清洗氧化的细胞样品以去除剩余的氧化剂后，向氧化的细胞样品中加入悬浮于氧化缓冲液的酰肼磁性微球，室温下震荡16h；
3.醛基的封闭
采用pH为8的100mM三羟甲基氨基甲烷缓冲液清洗捕获蛋白样品的磁性微球，并将捕获细胞样品的磁性微球重悬浮于三羟甲基氨基甲烷缓冲液并孵育1h；
4.可溶性蛋白质的去除
分别使用2M氯化钾、4M尿素及2M氯化钠溶液清洗磁性微球；
5.细胞的裂解
向细胞样品中加入裂解液（pH为7.4的磷酸缓冲液配制的2M氯化钠溶液,1%cocktail），使用超声破碎裂解细胞(10s on,10s off,300s)；
6.可溶性蛋白质的去除及细胞器分级
细胞裂解后，分别使用2M氯化钠、2M氯化钾、0.1M碳酸钠、4M尿素、6M盐酸胍及50mM碳酸氢铵缓冲溶液（ABC）清洗裂解的细胞样品。
7.细胞膜蛋白质的富集
经清洗的细胞样品重悬浮于50mM ABC缓冲溶液中，并加入糖基肽酶于37℃孵育12h后，利用磁力吸附取出磁性微球，将上清蛋白质溶液冻干；
8.细胞膜蛋白质的酶解
使用4%SDS(溶于50mM ABC缓冲溶液)重溶冷冻干燥的蛋白样品转至离心超滤装置的超滤管中,参照Mann,M.的FASP方法（Wisniewski,J.R.;Zougman,A.;Nagaraj,N.;Mann,M.Nat.Methods.2009(6),359–362.）完成蛋白质样品的酶解过程，获得细胞膜蛋白质的酶解产物。
9.LTQ-Orbitrap Velos检测
酶解产物14000×g转速下离心10min，取其上清溶液，使用LTQ-Orbitrap Velos进行检测。质谱仪分析在正离子模式下进行。喷雾电压为2.0kV，加热毛细管温度为200℃。采用Xcalibur软件记录总离子流图与MS谱图；质荷比范围为300到1800。MS/MS谱图采用数据依赖模式进行采集。从一张MS全扫描中，选择15个最强的母离子进行MS/MS的分析。MS/MS扫描的碰撞能量为35%。
10.数据分析
对采集的谱图，采用Mascot进行数据检索，数据库为ncbi.HUMAN.REVERSE。半胱氨酸残基设为固定化修饰+57.0215Da，甲硫氨酸残基设为可变修饰+15.9949Da。肽段检索采用胰蛋白酶完全酶切，最多允许两个漏切位点。肽段和MS/MS质量允许偏差分别为10ppm和0.5Da。调节Xcorr值以控制肽段鉴定的假阳性率FDR<1%(FDR定义为采用正库与反库鉴定到的肽段数量)。共鉴定到2800个蛋白group，对应10225条非冗余肽段。对鉴定到的2800个蛋白质，依据蛋白质数据库Uniprot（http://www.uniprot.org）的限定进行细胞定位，其中2500个蛋白质（89%）的蛋白质为细胞膜蛋白质，此外，在鉴定到的2500个细胞膜蛋白质中，具有跨膜区的整合膜蛋白质为2102个（84%）。
鉴定结果
实施例2
将实施例1中的人宫颈癌细胞更换为人肝癌细胞；细胞样品处理步骤同实施例1。
鉴定结果
实施例3
将实施例1中的人宫颈癌细胞更换为人T淋巴瘤细胞；细胞样品处理步骤同实施例1。
鉴定结果
实施例4
细胞膜表面糖蛋白的氧化方法步骤为：使用胰酶将细胞消化后，向细胞样品中加入氧化缓冲液（PBS，pH6.2）配制的5mM高碘酸钠溶液反应1h；
细胞样品其余处理步骤同实施例1。
鉴定结果
实施例5
细胞膜表面糖蛋白的氧化方法步骤为：使用胰酶将细胞消化后，向细胞样品中加入氧化缓冲液（100mM醋酸钠,150mM氯化钠,pH5.5）配制的1mM高碘酸钠溶液反应10min；
细胞样品其余处理步骤同实施例1。
鉴定结果
实施例6
细胞的裂解方法步骤为：向细胞样品中加入pH为8的100mM三羟甲基氨基甲烷缓冲液配制的胰酶溶液，37℃下反应1h；
细胞样品其余处理步骤同实施例1。
鉴定结果
实施例7
细胞膜蛋白质的富集方法步骤为：向经清洗的细胞样品中加入pH为8的50mM ABC缓冲溶液配制的4%SDS溶液，超声萃取30min，利用磁力吸附取出上清；重复该过程两次，获得磁性微球上膜蛋白质；
细胞样品其余处理步骤同实施例1。
鉴定结果
本发明利用细胞膜表面整合膜蛋白质贯穿于膜双分子层且细胞膜表面膜蛋白质多发生糖基化修饰的自然特征，通过功能化磁性微球捕获作为诱饵的细胞膜表面糖基化修饰蛋白质，实现细胞膜与细胞器的分离及细胞膜整合膜蛋白质的高效富集。该方法具有细胞膜与细胞器分离效率高的优点，可对细胞膜蛋白质进行高效分析及表征。此外功能化磁性微球的引入，使该方法具有操作简便，分离快速且样品损失低的优点。
Claims (9)
1.一种细胞膜蛋白质富集纯化方法，其特征在于：使用功能化磁性微球捕获作为诱饵的细胞膜表面糖基化修饰蛋白，以富集及分析细胞膜蛋白质，具体包括：
（1）将培养皿中孵育的细胞样品消化后，向细胞样品中加入由氧化缓冲液配制的氧化剂溶液与细胞进行反应；
（2）氧化反应结束后，采用氧化缓冲液清洗步骤（1）中细胞样品；
（3）向细胞样品中加入悬浮于氧化缓冲液的带有功能化官能团的磁性微球，室温下震荡2-24h；
（4）采用三羟甲基氨基甲烷缓冲液清洗步骤（3）中捕获细胞样品的磁性微球；
（5）将步骤（4）中捕获细胞样品的磁性微球重悬浮于三羟甲基氨基甲烷缓冲液，室温下孵育5min-2h；
（6）使用盐溶液清洗步骤（5）中细胞样品；
（7）对步骤（6）中经清洗的细胞样品进行裂解；
（8）使用盐溶液清洗步骤（7）中经裂解的细胞样品；
（9）使用酶解或溶剂萃取的方法获得磁性微球上富集的细胞膜蛋白质，得所需细胞膜蛋白样品溶液。
2.按照权利要求1所述细胞膜蛋白质富集纯化方法，其特征在于：步骤（1）和（2）中所述的氧化缓冲液为醋酸盐和氯化盐混合缓冲液或磷酸缓冲液，醋酸盐和氯化盐混合缓冲液中醋酸盐和氯化盐浓度分别为10-200mM，氧化缓冲液pH范围为4-7；
步骤（1）中所述的氧化剂为高碘化物；氧化剂浓度为1-100mM；氧化反应时间为5min-2h。
3.按照权利要求1所述细胞膜蛋白质富集纯化方法，其特征在于：步骤（1）中所述的细胞样品消化方法包括酶消化法、离子螯合法或物理法。
4.按照权利要求1所述细胞膜蛋白质富集纯化方法，其特征在于：步骤（3）中所述的功能化磁性微球为以四氧化三铁/二氧化硅复合纳米磁球为核，使用带酰肼或氨基官能基团的硅烷化试剂制备的磁性微球。
5.按照权利要求1所述细胞膜蛋白质富集纯化方法，其特征在于：步骤（4）和（5）中所述的三羟甲基氨基甲烷缓冲液浓度为20mM-1M；pH为7-10。
6.按照权利要求1所述细胞膜蛋白质富集纯化方法，其特征在于：步骤（6）和步骤（8）中所述的盐溶液可为浓度为0.1-8M的氯化钠溶液、0.1-8M的氯化钾溶液、0.1-1M的碳酸钠溶液、2-10M的尿素溶液、1-8M的盐酸胍溶液或10-1000mM的碳酸氢铵溶液。
7.按照权利要求1所述细胞膜蛋白质富集纯化方法，其特征在于：步骤（7）中所述的细胞裂解方法包括机械裂解、化学裂解或酶裂解。
8.按照权利要7中所述细胞裂解方法，其特征在于：若采用机械裂解或化学裂解方法进行细胞裂解，在细胞裂解过程中需加入蛋白酶抑制剂，蛋白酶抑制剂为下列物质中一种或二种以上组成的混合物：AEBSF、Aprotinin、Bestatin、Sodium Pyrophosphate、E-64、EDTA、Leupeptin、Pepstatin A、PMSF，上述物质浓度范围分别在1-200mg/mL之间。
9.按照权利要求1所述细胞膜蛋白质富集纯化方法，其特征在于：步骤（9）中所述的磁性微球上膜蛋白质获取方法如下：
若采取酶解方法，向细胞样品中加入pH为7.5-14的碱性缓冲溶液配制的糖基肽酶溶液，反应6-24h使连接在磁性微球上的糖链断裂以获得磁性微球上细胞膜蛋白质溶液；所述的pH为7.5-14的碱性缓冲溶液，可为碳酸氢铵缓冲盐溶液、磷酸缓冲盐溶液或三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液；
若采取溶剂萃取的方法，向细胞样品中加入溶有体积浓度为1%-30%的表面活性剂或去垢剂的pH为7.5-14的碱性缓冲溶液，超声萃取0.1-2h获得磁性微球上细胞膜蛋白质溶液；所述的表面活性剂包括十二烷基磺酸钠、脱氧胆酸钠、Triton X-100、chaps、Rapigest SF或NP-40d；去垢剂包括尿素、硫脲或盐酸胍。
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