CN107561164A - 一种尿液蛋白质组学样品预处理方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种尿液蛋白质组学样品预处理方法及应用，属于分析技术领域。所述的方法可用于尿液样品中蛋白质的富集，实现对尿液样品中蛋白质组学的深入分析。该方法是一种新型的尿液样品预处理方法，通过材料对尿液样品初步富集，再用分步洗脱的方式，有效减小尿液样品的复杂度，相比于传统的尿液样品预处理方法，具有方便易行、成本低廉等特点。该发明在蛋白质组学有较好的应用前景和实用价值。
Description
技术领域
本发明涉及尿液蛋白质组学样品预处理方法及应用，具体地说是一种通过分步洗脱的方式降低尿液样品的复杂度，实现对尿液样品中蛋白质组学分析的样品预处理方法。
背景技术
尿液样品的蛋白质组学分析对于临床的诊断和病理的分类具有重要的意义。相对于血检、活检，尿液样品可以大量获得，并且对人体是无伤害的。通过尿液样品的蛋白质组学分析，不仅能反映泌尿系统的健康情况，还能对人体系统生理状况进行监测(ExpertRev.Proteomics,2007,4,39-50)。目前，已经发展了多种尿液蛋白质组学样品预处理方法，通过蛋白分离和质谱检测技术，对尿液蛋白质组进行深入分析(J.Am.Soc.Nephrol.,2007,18,1057-71；Clin.Chim.Acta,2007,375,49-56；J.Proteome Res.,2007,6,3881-3890；Proteomics,2016,16,80–84)。但是由于尿液样品中蛋白质的组成复杂且蛋白丰度低，用现有的检测技术如何能方便地检测到尿液蛋白质成为尿液蛋白质组学样品预处理的核心问题之一。
目前，为了降低尿液样品中蛋白质的复杂度，主要用二维凝胶电泳法和(多维)液相色谱法对蛋白进行分离或分级，再与质谱检测技术联用，实现蛋白质组学的分析。二维凝胶电泳法根据蛋白的分子量、等电点的不同对蛋白进行分级，但受到分辨率和分子量范围的影响，大约30％的蛋白能够通过后续的液质联用分析获得鉴定。(多维)液相色谱法可以解决二维凝胶电泳法的不足，与质谱联用大大提高了蛋白鉴定的数目，但实验步骤比较繁琐，而且需要相应的仪器设备(Proteomics,2005,5,4994-5001；Mol.Cell.Proteomics,2006,5,560-562)。
发明内容
针对以上方法存在的不足，本发明的目的是提供一种简便高效的方法以更全面地分析尿液蛋白质组。具体是采用两性载体修饰的聚丙烯酸酯颗粒处理尿液样品，并采用氯化钠溶液，甘氨酸溶液，乙腈溶液分级洗脱。本发明通过材料对尿液样品初步富集，再用分步洗脱的方式，有效减小尿液样品的复杂度。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种尿液蛋白质组学样品预处理方法，首先将浓缩的尿液样品与颗粒进行孵育；之后离心，去除上清液，得混合物A；接着采用磷酸缓冲液洗涤混合物A，去除上清液，得混合物B；最后对混合物B进行洗脱操作:
(1)用氯化钠水溶液洗涤混合物B,收集洗脱液得到洗脱液1,
(2)用甘氨酸水溶液洗涤步骤(1)得到的物质,收集洗脱液得到洗脱液2,
(3)用乙腈水溶液洗涤步骤(2)得到的物质,收集洗脱液得到洗脱液3；
得到的洗脱液1、2、3以及经过洗涤得到的富集后的颗粒共同组成经过预处理的尿液蛋白质组学样品；
所述颗粒为两性载体修饰的聚丙烯酸酯类聚合物。
尿液样品的浓缩：将尿液样品通过截留分子量为1-10kDa的滤膜进行浓缩；
所述颗粒的孔径为颗粒粒径为2-20μm；所述颗粒选自能用于尿液样品的预处理的颗粒；
步骤(1)-(3)中，每种溶液的洗涤次数为一次或两次或三次以上。
浓缩的尿液样品与颗粒孵育的温度为10-35℃,孵育时间为1-4小时；
所述氯化钠水溶液的浓度为0.4-2.5M；甘氨酸水溶液的浓度为20-300mM,甘氨酸溶液用盐酸、甲酸或者三氟乙酸调节pH为1-3.5；乙腈水溶液中乙腈与水的体积比为0.1-0.3，用盐酸、甲酸或者三氟乙酸调节pH＝1-4。
所述颗粒表面含有氨基功能基团，通过戊二醛活化后，将两性载体分子修饰在颗粒表面，并对颗粒表面进行封尾与还原，修饰的两性载体等电点在2-14之间。
所述颗粒的制备过程包括以下步骤：
(1)聚合物颗粒活化：将颗粒分别经过有机溶剂、磷酸缓冲液(pH为7.2-8.5)洗涤两次以上，再采用质量-体积百分比浓度为5％-25％的戊二醛的磷酸缓冲液(pH为7.2-8.5)，活化2-12小时；
(2)步骤(1)活化的颗粒修饰两性载体：将步骤(1)活化的聚合物颗粒采用磷酸缓冲液或者分别采用水和磷酸缓冲液洗涤后，与质量分数为10-50％的两性载体的磷酸缓冲液(pH为7.2-8.5)反应3-24小时,磷酸缓冲液中包含质量-体积百分比浓度为0.4-1.2％的氰基硼氢化钠；
(3)步骤(2)之后对颗粒表面封尾和还原：与两性载体反应之后，弃上清液，留下的组分中加入含有质量-体积百分比浓度为0.4-1.6％的甘氨酸和质量-体积百分比浓度为0.4-1.2％的氰基硼氢化钠混合的磷酸缓冲液(pH为7.2-8.5),反应2-10小时；
(4)弃上清，采用磷酸盐缓冲液多次清洗(三次以上，优选为五次以上)，即制得两性载体修饰的聚丙烯酸酯类聚合物颗粒。
步骤(1)中所述有机溶剂选自甲醇、乙醇、乙腈中的一种；所述两性载体为两性载体电解质，等电点分布在2-14之间，具体为一种脂肪族多胺基多羧基的混合物。
本发明所述的磷酸缓冲液为钾盐或者钠盐，pH优选为7.2-8.5。
本发明还提供一种上述尿液样品预处理方法于尿液样品的蛋白质组学分析中的应用。
具体包括:将经过预处理的尿液蛋白质组学样品用蛋白酶酶解成肽段，采用液质联用，对所获得的肽段进行分离后，用质谱进行样品分析，采集数据利用蛋白质组数据库搜索引擎进行肽段和蛋白的信息利用分析。
本发明提供一种具体的过程：将权利要求1预处理方法得到的洗脱液1、2、3、富集后的颗粒以及浓缩后的尿液样品，在90℃条件下变性20min，加入1M二硫苏糖醇(DTT)的磷酸缓冲液(pH为8.0)，二硫苏糖醇在洗脱液1、2、3、富集后的颗粒与浓缩后的尿液样品中，每毫克蛋白质的用量为8μmol的二硫苏糖醇，56℃反应1.0h，以实现蛋白质的还原过程，再按比例加入1M碘乙酰胺(IAA)的磷酸缓冲液(pH为8.0)，1μmol DTT加入2.5μmol IAA，在避光条件下反应30min，对蛋白质进行烷基化；最后加入胰蛋白酶的磷酸缓冲液(pH为8.0)，胰蛋白酶与蛋白质的质量比例为1:25，在37℃反应15h；
将上述蛋白质酶解产物进行离子交换-反相串联的液质(SCX-RPLC-MS/MS)分析，蛋白质酶解产物有5个组分，分别为浓缩的尿液样品，洗脱液1，洗脱液2，洗脱液3及经过三次洗涤富集后的颗粒的蛋白质酶解产物，每次上样一个组分；均采用三种流动相：流动相A(v/v)为2％乙腈，98％水，0.1％甲酸；流动相B(v/v)为98％乙腈，2％水，0.1％甲酸；流动相C为醋酸铵，摩尔浓度为1mol/L；当样品载于SCX捕集柱上之后，分别采用5％,10％,15％,20％,30％及100％的流动相C(v/v)冲洗15min，每次冲洗后采用流动相A平衡捕集柱15min，再采用如下分离梯度进行反相分离，0-5％B(v/v),分离5min；5-35％B(v/v)，分离95min；35-80％B(v/v)，分离5min，之后采用80％流动相B(v/v)冲洗10min；LTQ-Orbitrap-Velos质谱采用正离子扫描模式，碰撞能量为35％；将质谱得到的原始数据采用MaxQuant(1.3.0.5version)进行检索，数据库为HUMAN-201307.fasta；采用假阳性率FDR<0.01对MaxQuant检索结果进行处理以得到高度可信的蛋白质。
本发明所述的尿液来自人类或动物，所述尿液样品为实验室或临床检测的尿液样品。
根据本发明，下述提供一种具体的预处理方法，但是并不限制本发明所要保护的范围。
(1)聚合物颗粒活化：10-50mg颗粒分别经过有机溶剂、磷酸缓冲液(pH为7.2-8.5)洗涤后，采用质量-体积百分比浓度为5-25％的戊二醛活化2-12小时。所述的颗粒为聚丙烯酸酯类聚合物颗粒，孔径为颗粒粒径为2-20μm，其并可用于尿液样品的预处理；
(2)修饰两性载体：将步骤(1)活化的聚合物颗粒分别采用水和磷酸缓冲液洗涤(pH为7.2-8.5)数遍后，与质量分数为10-50％的两性载体的磷酸缓冲液(包含质量-体积百分比浓度为0.4-1.2％的氰基硼氢化钠)反应3-24小时。所述的两性载体为一种脂肪族多胺基多羧基的混合物，由异构物和同系物组成，等电点在2-14之间(商品名为PharmalyteTM)；
(3)颗粒表面的封尾和还原：颗粒与两性载体反应之后，与质量-体积百分比浓度0.4-1.6％甘氨酸和质量-体积百分比浓度为0.4-1.2％的氰基硼氢化钠溶液反应2-10小时。
(4)处理尿液样品：制备的颗粒采用磷酸盐缓冲液洗涤数遍后，与经过截留分子量为1-10kDa的滤膜浓缩后的尿液样品在10-35℃条件下孵育1-4小时。
(5)蛋白质洗脱：颗粒离心，去除上清液。采用磷酸盐缓冲液洗涤颗粒，去除上清液。采用氯化钠溶液(NaCl),甘氨酸溶液(Gly-HCl)，乙腈溶液(ACN,含有0.1％三氟乙酸(TFA))分别进行洗涤，收集洗脱液。
其中氯化钠溶液的浓度为0.4-2.5M，甘氨酸溶液的浓度为20-300mM,pH为1-3.5，乙腈溶液中乙腈与水的体积比为0.1-0.3，pH＝1-4。
本发明提供一种尿液蛋白质组学样品的预处理方法,该方法首先使用两性载体修饰的聚合物颗粒进行蛋白质富集,由于两性载体是一种脂肪族多胺基多羧基的混合物，能够与蛋白质发生静电作用、疏水相互作用、氢键等多种相互作用，通过三种洗脱液破坏两性载体和蛋白质之间的相互作用，对富集有蛋白质的颗粒进行分步洗脱，有效降低了样品的复杂度。
本发明具有如下优点：
(1)本发明发展的能够有效降低尿液样品的复杂度；
(2)该方法有效地提高了尿液蛋白的鉴定数目；
(3)样品处理方法操作简便，成本低，仅需小型离心机即可实现，无需配备液相仪、电泳仪等辅助仪器等。
具体实施方式
下面采用具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明。
实施例1
两性载体修饰的聚合物微球的制备与Zeta电势测定
称取30mg聚丙烯酸酯颗粒(孔径粒径5μm)，并采用乙醇、磷酸缓冲液(pH为8.0)分别清洗三次，在室温条件下与1mL 15％戊二醛的磷酸缓冲液(pH为8.0)反应8h后，用水及磷酸缓冲液(pH为8.0)分别清洗颗粒。
量取400μL两性载体(一种脂肪族多胺基多羧基的混合物，由异构物和同系物组成，pI＝3-10，商品名为PharmalyteTM)液体，用8mg氰基硼氢化钠与600μL磷酸缓冲液(pH为8.0)的混合液溶解，即得40％的两性载体溶液，将该液体与上述颗粒室温反应24h。弃上清，使用质量-体积百分比浓度为1.5％的甘氨酸和质量-体积百分比浓度为1.2％的氰基硼氢化钠混合的磷酸缓冲液(pH为8.0)反应10小时，再采用磷酸盐缓冲液(PBS,pH为7.4)清洗7次，即制得两性载体修饰的聚丙烯酸酯微球。
Zeta电势测定结果如表1所示。两性载体分子是一种多氨基多羧基的混合物，其等电点分布在3-10之间。在不同pH缓冲液中，两性载体表面的氨基和羧基功能基团会存在不同的解离模式。如表1所示，在pH＝5的磷酸缓冲液中，表面电势是+3.63，说明颗粒表面带正电荷；在pH＝9的磷酸缓冲液中，表面电势是-5.05，说明颗粒表面带负电荷；在pH＝7的磷酸缓冲液中，表面电势几乎为零，说明颗粒表面几乎不带电。证明聚合物颗粒表面两性载体的存在。
表1不同pH条件下，两性载体修饰的聚合物颗粒表面Zeta电势
实施例2
1.样品处理过程
尿液样品先通过1,500g离心10分钟(4℃)，再用截留分子量为3kDa的滤膜浓缩，得到样品(Ur)的蛋白浓度为15mg/mL。将上述样品(10mg)加入两性载体修饰的聚合物颗粒中，室温孵育2h。离心，除去上清液。用PBS洗涤颗粒后，再次离心去除上清液，所得物质分别采用2M NaCl，200mMGly-HCl(pH 2.5)与30％ACN(含有0.1％TFA)洗涤，具体为:
(1)用2M氯化钠水溶液洗涤所得物质,洗涤3次，每次震荡20min,三次洗涤后的洗脱液合并得到洗脱液1,
(2)用200mM Gly-HCl(pH 2.5)洗涤步骤(1)得到的物质,洗涤3次，每次震荡20min,三次洗涤后的洗脱液合并得到洗脱液2,
(3)用30％ACN(含有0.1％TFA)洗涤步骤(2)得到的物质,洗涤3次，每次震荡20min,三次洗涤后的洗脱液合并得到洗脱液3。
2.蛋白质酶解过程
将上述洗脱液1、2、3，经过洗涤的富集后的颗粒(PD)与原始浓缩的尿液样品(Ur)分别进行酶解。具体过程如下：进行平行实验，将原始浓缩的尿液样品(Ur)，洗脱液1、2、3与经过洗涤的富集后的颗粒(PD)五组样品分别在90℃条件下变性20min，加入1M二硫苏糖醇(DTT)的磷酸缓冲液(pH为8.0)，二硫苏糖醇在洗脱液1、2、3、富集后的颗粒与浓缩后的尿液样品中，每毫克蛋白质的用量为8μmol的二硫苏糖醇，以实现蛋白质的还原过程，再按比例加入1M碘乙酰胺(IAA)的磷酸缓冲液(pH为8.0，1μmol DTT加入2.5μmol IAA)，在避光条件下反应30min，对蛋白质进行烷基化；最后加入胰蛋白酶的磷酸缓冲液(pH为8.0)，胰蛋白酶与蛋白质的质量比例为1:25，在37℃反应15h。
3.离子交换-反相串联液质分析与数据处理
将上述五组蛋白质酶解产物(Ur,洗脱液1(NaCl),洗脱液2(Gly-HCl),洗脱液3(ACN),PD)，进行离子交换-反相串联的液质(SCX-RPLC-MS/MS)分析。均采用三种流动相：流动相A(v/v)为2％乙腈，98％水，0.1％甲酸；流动相B(v/v)为98％乙腈，2％水，0.1％甲酸；流动相C为醋酸铵，摩尔浓度为1mol/L。当样品载于SCX捕集柱上之后，分别采用5％,10％,15％,20％,30％及100％的流动相C(v/v)冲洗15min，每次冲洗后采用流动相A平衡捕集柱15min，再采用如下分离梯度进行反相分离，0-5％B(v/v),分离5min；5-35％B(v/v)，分离95min；35-80％B(v/v)，分离5min，之后采用80％流动相B(v/v)冲洗10min。LTQ-Orbitrap-Velos质谱采用正离子扫描模式，碰撞能量为35％。将质谱得到的原始数据采用MaxQuant(1.3.0.5version)进行检索，数据库为HUMAN-201307.fasta。采用假阳性率FDR<0.01对MaxQuant检索结果进行处理以得到高度可信的蛋白质。
将得到的蛋白质信息进行统计分析，结果如表2所示。原始尿液样品能鉴定到954个蛋白和3927个肽段，而经过本发明的技术方案处理，能够有2728个蛋白和16173个肽段得到鉴定，本发明通过对蛋白质进行富集,再进行洗脱,得到洗脱液1、2、3，将经过洗脱后的富集有蛋白质的颗粒以及洗脱液1、2、3分别进行测定，去除重复的蛋白和肽段，得到最终蛋白和肽段数目大大超过了不经过本发明所述预处理方法的原始浓缩尿液样品，说明本发明所述方法能有效富集尿液样品中的蛋白，并降低了蛋白质样品的复杂度。
表2 尿液蛋白质组学样品预处理方法处理后的不同组分与原始尿液样品的蛋白和肽段鉴定数目比较
实施例3
两性载体修饰的聚合物微球的制备与Zeta电势测定
称取10mg聚丙烯酸酯颗粒(孔径粒径20μm)，并采用乙醇、磷酸缓冲液(pH为7.4)分别清洗三次，在室温条件下与1mL 8％戊二醛的磷酸缓冲液(pH为7.4)反应5h后，用水及磷酸缓冲液(pH为7.4)分别清洗颗粒。
量取200μL两性载体(一种脂肪族多胺基多羧基的混合物，由异构物和同系物组成，pI＝3-10，商品名为PharmalyteTM)液体，用5mg氰基硼氢化钠与800μL磷酸缓冲液(pH为7.4)的混合液溶解，即得20％的两性载体溶液，将该液体与上述颗粒室温反应8h。弃上清，使用质量-体积百分比浓度为0.5％的甘氨酸和质量-体积百分比浓度为0.5％的氰基硼氢化钠的磷酸缓冲液(pH为7.4)反应3小时，再采用磷酸盐缓冲液(PBS,pH 7.4)清洗7次，即制得两性载体修饰的聚丙烯酸酯微球。
Zeta电势测定结果与实施例1有相同效果。
实施例4
1.样品处理过程
尿液样品先通过1,500g离心10分钟(4℃)，再用截留分子量为10kDa的滤膜浓缩，得到样品(Ur)的蛋白浓度为15mg/mL。将上述样品(10mg)加入两性载体修饰的聚合物颗粒中，室温孵育4h。离心，除去上清液。用PBS洗涤颗粒后，再次离心去除上清液，颗粒分别采用1M NaCl，100mMGly-HCl(pH 1.0)与15％ACN(含有0.1％TFA)洗涤，具体为：
(1)用1M氯化钠水溶液洗涤所得物质,洗涤3次，每次震荡20min,三次洗涤后的洗脱液合并得到洗脱液1,
(2)用100mM Gly-HCl(pH 1.0)洗涤步骤(1)得到的物质,洗涤3次，每次震荡20min,三次洗涤后的洗脱液合并得到洗脱液2,
(3)用15％ACN(含有0.1％TFA)洗涤步骤(2)得到的物质,洗涤3次，每次震荡20min,三次洗涤后的洗脱液合并得到洗脱液3。
2.蛋白质酶解过程
将上述洗脱液1、2、3，经过洗涤的富集后的颗粒(PD)与原始浓缩的尿液样品(Ur)分别进行酶解。具体过程如下：进行平行实验，将原始浓缩的尿液样品(Ur)，洗脱液1、2、3与经过洗涤的富集后的颗粒(PD)五组样品分别在90℃条件下变性20min，加入1M二硫苏糖醇(DTT)的磷酸缓冲液(pH为8.0)，二硫苏糖醇在洗脱液1、2、3、富集后的颗粒与浓缩后的尿液样品中，每毫克蛋白质的用量为8μmol的二硫苏糖醇，以实现蛋白质的还原过程，再按比例加入1M碘乙酰胺(IAA)的磷酸缓冲液(pH为8.0，1μmol DTT加入2.5μmol IAA)，在避光条件下反应30min，对蛋白质进行烷基化；最后加入胰蛋白酶的磷酸缓冲液(pH为8.0)，胰蛋白酶与蛋白质的质量比例为1:25，在37℃反应15h。
3.离子交换-反相串联液质分析与数据处理
将上述蛋白质酶解产物(Ur,洗脱液1(NaCl),洗脱液2(Gly-HCl),洗脱液3(ACN),PD)进行离子交换-反相串联的液质(SCX-RPLC-MS/MS)分析。采用三种流动相：流动相A(v/v)为2％乙腈，98％水，0.1％甲酸；流动相B(v/v)为98％乙腈，2％水，0.1％甲酸；流动相C为醋酸铵，摩尔浓度为1mol/L。当样品载于SCX捕集柱上之后，分别采用5％,10％,15％,20％,30％及100％的流动相C(v/v)冲洗15min，每次冲洗后采用流动相A平衡捕集柱15min，再采用如下分离梯度进行反相分离，0-5％B(v/v),分离5min；5-35％B(v/v)，分离95min；35-80％B(v/v)，分离5min，之后采用80％流动相B(v/v)冲洗10min。LTQ-Orbitrap-Velos质谱采用正离子扫描模式，碰撞能量为35％。将质谱得到的原始数据采用MaxQuant(1.3.0.5version)进行检索，数据库为HUMAN-201307.fasta。采用假阳性率FDR<0.01对MaxQuant检索结果进行处理以得到高度可信的蛋白质。其结果与实施例2有相同效果。
Claims (10)
1.一种尿液蛋白质组学样品预处理方法，其特征在于：首先将浓缩的尿液样品与颗粒进行孵育；之后离心，去除上清液，得混合物A；接着采用磷酸缓冲液洗涤混合物A，去除上清液，得混合物B；最后对混合物B进行洗脱操作:
(1)用氯化钠水溶液洗涤混合物B,收集洗脱液得到洗脱液1,
(2)用甘氨酸水溶液洗涤步骤(1)得到的物质,收集洗脱液得到洗脱液2,
(3)用乙腈水溶液洗涤步骤(2)得到的物质,收集洗脱液得到洗脱液3；
得到的洗脱液1、2、3以及经过洗涤得到的富集后的颗粒共同组成经过预处理的尿液蛋白质组学样品；
所述颗粒为两性载体修饰的聚丙烯酸酯类聚合物。
2.按照权利要求1所述的预处理方法，其特征在于：尿液样品的浓缩：将尿液样品通过截留分子量为1-10kDa的滤膜进行浓缩；
所述颗粒的孔径为颗粒粒径为2-20μm；所述颗粒选自能用于尿液样品的预处理的颗粒；
步骤(1)-(3)中，每种溶液的洗涤次数为一次或两次或三次以上。
3.按照权利要求1所述的预处理方法，其特征在于：浓缩的尿液样品与颗粒孵育的温度为10-35℃,孵育时间为1-4小时；
所述氯化钠水溶液的浓度为0.4-2.5M；甘氨酸水溶液的浓度为20-300mM,甘氨酸溶液用盐酸、甲酸或者三氟乙酸调节pH为1-3.5；乙腈水溶液中乙腈与水的体积比为0.1-0.3，用盐酸、甲酸或者三氟乙酸调节pH＝1-4。
4.按照权利要求1所述的预处理方法，其特征在于：所述颗粒表面含有氨基功能基团，通过戊二醛活化后，将两性载体分子修饰在颗粒表面，并对颗粒表面进行封尾与还原，修饰的两性载体等电点在2-14之间。
5.按照权利要求4所述的预处理方法，其特征在于：所述颗粒的制备过程包括以下步骤：
(1)聚合物颗粒活化：将颗粒分别经过有机溶剂、磷酸缓冲液洗涤两次以上，再采用质量-体积百分比浓度为5％-25％的戊二醛的磷酸缓冲液，活化2-12小时；
(2)步骤(1)活化的颗粒修饰两性载体：将步骤(1)活化的聚合物颗粒采用磷酸缓冲液或者分别采用水和磷酸缓冲液洗涤后，与质量分数为10-50％的两性载体的磷酸缓冲液反应3-24小时,磷酸缓冲液中包含质量-体积百分比浓度为0.4-1.2％的氰基硼氢化钠；
(3)步骤(2)之后对颗粒表面封尾和还原：与两性载体反应之后，弃上清液，留下的组分中加入含有质量-体积百分比浓度为0.4-1.6％的甘氨酸和质量-体积百分比浓度为0.4-1.2％的氰基硼氢化钠混合的磷酸缓冲液,反应2-10小时；
(4)弃上清，采用磷酸盐缓冲液多次清洗，即制得两性载体修饰的聚丙烯酸酯类聚合物颗粒。
6.按照权利要求5所述的预处理方法，其特征在于：步骤(1)中所述有机溶剂选自甲醇、乙醇、乙腈中的一种；所述两性载体为两性载体电解质，等电点分布在2-14之间，具体为一种脂肪族多胺基多羧基的混合物。
7.按照权利要求1或5所述的预处理方法，其特征在于：所述的磷酸缓冲液为钾盐或者钠盐，pH为7.2-8.5。
8.一种权利要求1所述尿液样品预处理方法于尿液样品的蛋白质组学分析中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：将经过预处理的尿液蛋白质组学样品用蛋白酶酶解成肽段，采用液质联用，对所获得的肽段进行分离后，用质谱进行样品分析，采集数据利用蛋白质组数据库搜索引擎进行肽段和蛋白的信息利用分析。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：具体过程如下：将权利要求1预处理方法得到的洗脱液1、2、3、富集后的颗粒以及浓缩后的尿液样品，在90℃条件下变性20min，加入1M二硫苏糖醇(DTT)的磷酸缓冲液(pH为8.0)，二硫苏糖醇在洗脱液1、2、3、富集后的颗粒与浓缩后的尿液样品中，每毫克蛋白质的用量为8μmol的二硫苏糖醇，56℃反应1.0h，以实现蛋白质的还原过程，再按比例加入1M碘乙酰胺(IAA)的磷酸缓冲液(pH为8.0)，1μmol DTT加入2.5μmol IAA，在避光条件下反应30min，对蛋白质进行烷基化；最后加入胰蛋白酶的磷酸缓冲液(pH为8.0)，胰蛋白酶与蛋白质的质量比例为1:25，在37℃反应15h；
将上述蛋白质酶解产物进行离子交换-反相串联的液质(SCX-RPLC-MS/MS)分析，蛋白质酶解产物有5个组分，分别为浓缩的尿液样品，洗脱液1，洗脱液2，洗脱液3及经过三次洗涤富集后的颗粒的蛋白质酶解产物，每次上样一个组分；均采用三种流动相：流动相A(v/v)为2％乙腈，98％水，0.1％甲酸；流动相B(v/v)为98％乙腈，2％水，0.1％甲酸；流动相C为醋酸铵，摩尔浓度为1mol/L；当样品载于SCX捕集柱上之后，分别采用5％,10％,15％,20％,30％及100％的流动相C(v/v)冲洗15min，每次冲洗后采用流动相A平衡捕集柱15min，再采用如下分离梯度进行反相分离，0-5％B(v/v),分离5min；5-35％B(v/v)，分离95min；35-80％B(v/v)，分离5min，之后采用80％流动相B(v/v)冲洗10min；LTQ-Orbitrap-Velos质谱采用正离子扫描模式，碰撞能量为35％；将质谱得到的原始数据采用MaxQuant(1.3.0.5version)进行检索，数据库为HUMAN-201307.fasta；采用假阳性率FDR<0.01对MaxQuant检索结果进行处理以得到高度可信的蛋白质。
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