[go: up one dir, main page]

CN104519897A - 促凝血化合物 - Google Patents

促凝血化合物 Download PDF

Info

Publication number
CN104519897A
CN104519897A CN201380036823.3A CN201380036823A CN104519897A CN 104519897 A CN104519897 A CN 104519897A CN 201380036823 A CN201380036823 A CN 201380036823A CN 104519897 A CN104519897 A CN 104519897A
Authority
CN
China
Prior art keywords
procoagulant
protease
compound according
peptide
procoagulant compound
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201380036823.3A
Other languages
English (en)
Inventor
洪吴鹏
亚当·R·梅祖
乔·萨拉斯
罗伯特·彼得斯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Biogen MA Inc
Original Assignee
Biogen Idec MA Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biogen Idec MA Inc filed Critical Biogen Idec MA Inc
Publication of CN104519897A publication Critical patent/CN104519897A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6437—Coagulation factor VIIa (3.4.21.21)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/02—Peptides of undefined number of amino acids; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/36—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A61K38/482—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • A61K38/4846—Factor VII (3.4.21.21); Factor IX (3.4.21.22); Factor Xa (3.4.21.6); Factor XI (3.4.21.27); Factor XII (3.4.21.38)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6432—Coagulation factor Xa (3.4.21.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供蛋白酶可活化的促凝血化合物，其包含促凝血多肽例如促凝血肽和/或凝血因子，和含有蛋白酶可切割的底物(例如，合成的凝血酶底物)和自分解性间隔子(例如，氨基甲酸对氨基苄酯)的接头。在蛋白酶可切割的底物被蛋白酶(例如，凝血酶)切割时，自分解性间隔子将其自身从促凝血多肽上切割以使该多肽是未衍生的活性形式。还提供药物组合物、使用本发明的化合物用于治疗出血病症的方法、增强促凝血多肽的体内功效的方法、增加包含促凝血多肽的化合物的蛋白水解切割功效的方法、使促凝血多肽活化的方法和从异源部分诸如PEG释放促凝血多肽的方法。

Description

促凝血化合物
背景
发明领域
本发明涉及用于治疗出血疾病或病症的促凝血化合物。
背景
凝血途径部分涉及在血小板表面上形成因子VIIIa(FVIIIa)和因子IXa(FIXa)(X酶复合物)的酶复合物。如没有其辅因子FVIIIa，FIXa是具有相对弱催化活性的丝氨酸蛋白酶。X酶复合物将因子X(FX)切割成因子Xa(FXa)，其进而与因子Va(FVa)相互作用以切割凝血酶原并产生凝血酶。血友病A是通过导致FVIII活性缺陷的因子VIII(FVIII)基因突变和/或缺失而引起的出血病症(Peyvandi等，2006)。血友病B(也称为克雷司马斯病(Christmas disease))是全世界最常见的一种遗传性出血病症。它导致体内和体外凝血活性的降低并且在受影响个体的整个生命期间要求广泛的医疗监视。
血友病的治疗是通过靶向凝血活性恢复的替代治疗。存在血浆源性的和重组的凝血因子产品，可以用于按需治疗出血发作或通过预防性治疗来防止出血发作的发生。基于这些产品的半衰期，治疗方案需要频繁的静脉内施用。此类频繁施用是疼痛的且不方便。延长凝血因子半衰期的策略包括聚乙二醇化(Rostin J,等,Bioconj.Chem.2000；11:387-96)、糖聚乙二醇化(Stennicke HR,等,Thromb.Haemost.2008；100:920-8)、用聚乙二醇化的脂质体配制(Spira J,等,Blood 2006；108:3668-3673,Pan J,等,Blood 2009；114:2802-2811)和用白蛋白偶联(Schulte S.,Thromb.Res.2008；122增刊4:S14-9)。然而，用半衰期延长的部分(例如，PEG)修饰凝血因子和促凝血肽以及其它延长它们半衰期的类似策略可导致活性降低。为了拯救其活性，在目标蛋白或肽及其改性剂之间可以插入可切割的接头。所选择的可切割的接头必须被蛋白酶(例如，参与凝血级联的蛋白酶)有效且快速地切割。为许多凝血因子活性剂的凝血酶是最普遍的选择。然而，由天然氨基酸组成的所有已知的底物序列(例如，LVPR,ALRPR(SEQ ID NO:7),等)并不是最理想的底物。此外，可切割的接头与凝血因子或促凝血肽的共价结合可导致可防止有效酶切反应的空间位阻(例如，由于氨基酸诸如脯氨酸、异亮氨酸或精氨酸C-末端在切割位点的存在)。
发明概要
本发明提供包含蛋白酶可切割的底物(例如，合成的凝血酶底物)和与促凝血多肽(例如，凝血因子或促凝血肽)连接的自分解性(self-immolative)间隔子(例如，PABC)的促凝血化合物。因此，在一些实施方案中，本发明提供具有下式的促凝血化合物：
(Het2)-(Pep2)-(Het1)-(L)-Zy-Bx-Pep1  (式I)
其中，
Het1是第一异源分子，为不存在或存在的；
Het2是第二异源分子，为不存在或存在的；
L是接头，为不存在或存在的；
Zy是蛋白酶可切割的底物；
Bx是自分解性间隔子；
Pep1是多肽；并且，
Pep2是多肽，为不存在或存在的；
其中，Pep1或Pep2包含凝血因子或其片段，或合成的促凝血肽。
在一些实施方案中，在对蛋白酶可切割的底物进行酶切后，本发明的促凝血化合物的自分解性间隔子经历1,4消除。在一些实施方案中，在对蛋白酶可切割的底物进行酶切后，本发明的促凝血化合物的自分解性间隔子经历1,6消除。在一些实施方案中，自分解性间隔子是氨基甲酸对氨基苄酯(PABC)、对氨基苄基醚(PABE)或碳酸对氨基苄酯。在某些实施方案中，自分解性间隔子包含芳基。在一些实施方案中，芳基选自苄基、肉桂基、萘基和联苯基。在一些实施方案中，芳基是杂环的。在其它实施方案中，芳基包含至少一个取代基。在一些实施方案中，至少一个取代基选自F、Cl、I、Br、OH、甲基、甲氧基、NO2、NH2、NO3+、NHCOCH3、N(CH3)2、NHCOCF3、烷基、卤代烷基、C1-C8烷基卤化物、羧酸酯、硫酸酯、氨基磺酸酯、磺酸酯或其任意组合。在其它实施方案中，芳基中至少一个C被N、O或C-R1取代，其中R1独立地选自H、F、Cl、I、Br、OH、甲基、甲氧基、NO2、NH2、NO3+、NHCOCH3、N(CH3)2、NHCOCF3、烷基、卤代烷基、C1-C8烷基卤化物、羧酸酯、硫酸酯、氨基磺酸酯和磺酸酯。
在一些实施方案中，本发明的促凝血化合物中的蛋白酶可切割的底物包含凝血级联蛋白酶底物。在一些实施方案中，凝血级联蛋白酶选自凝血酶、凝血激酶、因子Va、因子VIIa、因子VIIIa、因子IXa、因子Xa、因子XIa、因子XIIa或其任意组合。在其它实施方案中，凝血级联蛋白酶底物是凝血酶底物。在一些实施方案中，凝血酶底物是合成的凝血酶底物。在其它实施方案中，合成的凝血酶底物包含D-Phe-Pip-Arg序列。在一些实施方案中，凝血酶底物选自D-Phe-Pro-Arg、D-Ala-Leu-Val-Pro-Arg(SEQ ID NO:17)、Ala-Leu-Val-Pro-Arg(SEQ ID NO:17)、Leu-Val-Pro-Arg(SEQ ID NO:18)或Ala-Leu-Arg-Pro-Arg(SEQ ID NO:90)。
在一些实施方案中，蛋白酶可切割的底物包含选自以下的蛋白酶的切割位点：中性溶酶(CALLA或CDlO)、甲拌磷寡肽酶(TOP)、白三烯A4水解酶、内皮缩血管肽转化酶、ste24蛋白酶、溶神经素、线粒体中间肽酶、间质胶原酶、胶原酶、溶基质素、巨噬细胞弹性酶、基质溶解因子、明胶酶、跨膜肽酶(meprins)、前胶原C-内肽酶、前胶原N-内肽酶、ADAM和ADAMT金属蛋白酶、髓磷脂相关的金属蛋白酶、釉质溶素(enamelysin)、肿瘤坏死因子α-转换酶、胰岛素溶酶(insulysin)、nardilysin、线粒体处理肽酶、magnolysin、dactylysin样金属蛋白酶、嗜中性粒细胞胶原酶、基质金属蛋白酶、膜型基质金属蛋白酶、SP2内肽酶、前列腺特异性抗原(PSA)、纤溶酶、尿激酶、人成纤维细胞活化蛋白质(FAPα)、胰蛋白酶、糜蛋白酶、降钙蛋白酶(caldecrin)、胰弹性蛋白酶、胰内肽酶、肠肽酶、白细胞弹性蛋白酶、成髓细胞、糜蛋白酶类(chymase)、类胰蛋白酶、粒酶、角质层糜蛋白酶、顶体蛋白酶、激肽释放酶、补体成分和因子、替代补体途径c3/c5转换酶、甘露糖结合蛋白相关的丝氨酸蛋白酶、凝固因子、凝血酶、蛋白c、u和t型纤溶酶原活性剂、组织蛋白酶G、肝丝酶(hepsin)、丝氨酸蛋白水解酶(prostasin)、肝细胞生长因子活化内肽酶、枯草杆菌蛋白酶/kexin型前蛋白转化酶、弗林蛋白酶、前蛋白转化酶、脯氨酰肽酶、酰基氨基酰基肽酶、肽基-glycaminase、信号肽酶、n-末端亲核试剂氨基水解酶、20s蛋白酶体、γ-谷氨酰转肽基酶、线粒体内肽酶、线粒体内肽酶Ia、htra2肽酶、蛋白裂解酶(matriptase)、位点1蛋白酶、天冬酰胺内肽酶(legumain)、组织蛋白酶、半胱氨酸组织蛋白酶、钙蛋白酶、泛素异肽酶T、胱天蛋白酶、糖基磷脂酰肌醇蛋白转酰胺基酶、癌症促凝血剂、激素原硫醇蛋白酶、γ-谷氨酰基水解酶、博莱霉素水解酶、成纤维细胞活化蛋白(seprase)、组织蛋白酶D、胃蛋白酶(pepsin)、凝乳酶(chymosyn)、胃亚蛋白酶(gastricsin)、肾素、酵母天冬酶(yapsin)和/或memapsin、前列腺特异性抗原(PSA)或其任意组合。
在一些实施方案中，Pep1和Pep2是不同的。在其它实施方案中，Pep1和Pep2是相同的。在一些实施方案中，Pep1是凝血因子或其片段。在其它实施方案中，其中Pep2是凝血因子或其片段。在某些实施方案中，Pep1和Pep2均是凝血因子或其片段。
在一些实施方案中，Pep1是凝血因子的重链，并且Pep2是凝血因子的轻链。在其它实施方案中，凝血因子选自FVII、FVIIa、FVIII、FIX、FX、FXa、vWF或其任意组合。在其它实施方案中，Pep1是合成的促凝血肽。在其它实施方案中，Pep2是合成的促凝血肽。在一些实施方案中，Pep1和Pep2均是合成的促凝血肽。
在一些实施方案中，接头(L)是肽接头。在一些实施方案中，肽接头包含至少两个氨基、至少三个、至少四个、至少五个、至少10个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个或至少100个氨基酸。在其它实施方案中，肽接头包含至少200个、至少300个、至少400个、至少500个、至少600个、至少700个、至少800个、至少900个或至少1000个氨基酸。在一些实施方案中，肽接头包含具有式[(Gly)x-Sery]z的肽，其中x为1至4，y为0或1，并且z为1至50。在一些实施方案中，接头(L)包含非肽接头。
在一些实施方案中，接头(L)由非肽接头组成。在其它实施方案中，非肽接头选自MC、MP、MPEG、SMCC、MBS、SMPT、LC-SPDP、SMPB或其任意组合。
在一些实施方案中，异源部分包含半衰期延长的部分。在其它实施方案中，半衰期延长的部分是低复杂度的多肽。在其它实施方案中，半衰期延长的部分包含白蛋白、白蛋白结合多肽或脂肪酸、Fc、转铁蛋白、PAS、人绒毛膜促性腺激素的β亚基的C-末端肽(CTP)、聚乙二醇(PEG)、羟乙基淀粉(HES)、白蛋白结合小分子、vWF、XTEN或其任意组合。在一些实施方案中，半衰期延长部分包含清除受体或阻断促凝血化合物与清除受体结合的其片段。在一些实施方案中，清除受体为LRP1。
在一些实施方案中，异源部分包含能够使促凝血化合物或其片段可视化或定位的肽或多肽。在一些实施方案中，可视化或定位能够在体外、体内、离体或其任意组合中。在一些实施方案中，能够可视化或定位的肽或多肽选自生物素受体肽、硫辛酸受体肽、荧光蛋白、用于连接双砷染料或用于偶联亚稳锝的含有半胱氨酸的肽、用于基于荧光共振能量转移(FRET)的邻近测定(proximity assay)的用于偶联铕包合物的肽、或其任意组合。
在一些实施方案中，荧光蛋白选自GFP、RFP、YFP、EGFP、EYFP或其任意组合。在一些实施方案中，双砷染料为4’,5’-双(1,3,2-二硫代砷杂环戊烷(dithioarsolan)-2-基)荧光素(FlAsH)。在一些实施方案中，生物素受体肽促进基于抗生物素蛋白的试剂和基于链霉亲和素的试剂的偶联。在一些实施方案中，硫辛酸受体肽促进硫醇反应性探针与结合的硫辛酸偶联或直接连接荧光性硫辛酸类似物。
在一些实施方案中，异源部分包含非肽活性剂。在一些实施方案中，非肽活性剂是促凝血分子。在一些实施方案中，非肽活性剂是小分子药物。在一些实施方案中，异源部分包含靶向部分或配体结合部分。在一些实施方案中，异源部分包含锚或支架分子。在一些实施方案中，锚或支架分子是脂质、碳水化合物或巯基。
在一些实施方案中，本发明的促凝血化合物包含式Het-L-Zy-Bx-Pep1，其中：
Het是半胱氨酸，
L是肽接头；
Zy是合成的凝血酶底物，
Bx是自分解性间隔子，并且
Pep1是促凝血肽。
在一些实施方案中，肽接头包含GGGG氨基酸序列，合成的凝血酶底物包含序列DPhe-Pip-Arg，自分解性间隔子是PABC，并且促凝血肽包含序列：
在一些实施方案中，本发明的促凝血化合物包含式Zy-Bx-Pep1，其中：Zy是合成的凝血酶底物，Bx是自分解性间隔子，并且Pep1是凝血因子。在一些实施方案中，合成的凝血酶底物包含序列DPhe-Pip-Arg，自分解性间隔子是PABC，并且凝血因子是因子Xa或FVIIa。
在一些实施方案中，使用选自以下的方法来测量本发明的促凝血化合物的促凝血活性：活化部分凝血活酶时间(aPTT)测定、改进的活化部分凝血活酶时间(aPTT*)测定、凝血酶生成测定(TGA)和ROTEM测定。
本发明还提供包含本发明的促凝血化合物和药学上可接受的载体的药物组合物。
还提供用于治疗、改善或预防受试者中出血疾病或病症的方法，该方法包括给受试者施用有效量的本发明的促凝血化合物或包含本发明的促凝血化合物的药物组合物。在一些实施方案中，由凝血障碍引起出血疾病或病症。在一些实施方案中，凝血障碍选自血友病和血管性血友病(von Willebrand disease)(vWD)。在一些实施方案中，凝血障碍是血友病A或血友病B。在一些实施方案中，出血疾病或病症选自关节积血、肌肉出血、口腔出血、流血、流血到肌肉、口腔流血、创伤、头部创伤、消化道出血、颅内流血、腹腔内流血、胸内出流、骨折、中枢神经系统出血、咽后区出血、腹膜后隙出血或骼腰肌鞘出血。
本发明还提供治疗、改善或预防哺乳动物受试者中至少一种凝血因子缺乏的方法，其中所述凝血因子选自FV、FVII、FVIIa、FVIII、FIX、FX、FXI和vWF，所述方法包括给受试者施用有效量的本发明的促凝血化合物或包含促凝血化合物的药物组合物。在一些实施方案中，受试者是人受试者。
在一些实施方案中，本发明的促凝血化合物或包含本发明的促凝血化合物的药物制剂可用于治疗患有凝血障碍的受试者。在一些实施方案中，受试者是人受试者。在一些实施方案中，本发明的促凝血化合物或包含本发明的促凝血化合物的药物制剂可用于生产用于治疗、预防或改善凝血障碍的药物。
本发明还提供用于包括使用固相肽合成来制备本发明的促凝血化合物的方法。在一些实施方案中，该方法使用正交固相肽合成。
本发明还提供增强促凝血多肽的体内功效的方法，所述方法包括使多肽与自分解性间隔子偶合，其中所述自分解性间隔子与蛋白酶可切割的底物部分偶合。在某些实施方案中，自分解性间隔子包含PABC基团。在一些实施方案中，蛋白酶可切割的底物部分包含合成的凝血酶底物。在一些实施方案中，促凝血多肽是凝血因子或促凝血肽。在一些实施方案中，促凝血肽是合成的。
本发明还提供增加可操作地连接至促凝血肽或凝血因子的蛋白酶底物的切割功效的方法，所述方法包括使自分解性接头与所述促凝血多肽偶联，其中将所述自分解性接头插入在蛋白酶底物和促凝血肽或凝血因子之间。还公开使促凝血肽活化的方法，该方法包括使本发明的促凝血化合物与对所述促凝血化合物中蛋白酶可切割的底物部分特异性的蛋白酶接触，其中所述活化的促凝血肽在对蛋白酶可切割的底物部分进行蛋白水解切割时释放。
还提供使凝血因子活化的方法，该方法包括使本发明的促凝血化合物与对所述促凝血化合物中蛋白酶可切割的底物部分特异性的蛋白酶接触，其中所述活化的凝血因子在对蛋白酶可切割的底物部分进行蛋白水解切割时释放。本发明还提供从异源部分释放促凝血肽的方法，该方法包括使本发明的促凝血化合物与对所述促凝血化合物中蛋白酶可切割的底物特异性的蛋白酶接触，其中所述活化的促凝血多肽在对蛋白酶可切割的底物进行蛋白水解切割时释放。
本发明还提供从异源部分释放凝血因子的方法，该方法包括使本发明的促凝血化合物与对所述促凝血化合物中蛋白酶可切割的底物特异性的蛋白酶接触，其中所述活化的凝血因子在对蛋白酶可切割的底物进行蛋白水解切割时释放。在一些实施方案中，当与具有相同序列但不具有自分解性接头的参考促凝血化合物相比时，促凝血化合物被对蛋白酶可切割的底物部分特异性的蛋白酶切割快至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍。在一些实施方案中，当与具有相同序列但不具有自分解性接头的参考促凝血化合物相比时，促凝血化合物被对蛋白酶可切割的底物部分特异性的蛋白酶切割快至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍或至少100倍。
在一些实施方案中，本发明的促凝血化合物包含含有外部位结合肽的自分解性间隔子。
附图简述
图1A示出可被蛋白酶活化的本发明的促凝血化合物的一般结构。Het2、Pep2、Het1和L为独立地任选组分。Pep1和Pep2是多肽，其中至少一种为凝血因子或促凝血肽。Het1和Het为异源部分。L是接头。另外的接头可以连接不同部分；例如，接头可位于Pep2和Het1之间(如图所示)。其它蛋白酶可切割的底物和自分解性间隔基可插在其它部分(诸如多肽或异源部分)的N-末端。该图示出在Pep2的N-末端的此类基团的任选插入。
图1B是包含蛋白酶可切割的底物(Aa1Aa2Aa3Aa4)、自分解性间隔子和目标蛋白(POI；例如，凝血因子或促凝血肽)的本发明的示例性促凝血化合物的图示；说明可切割的底物的蛋白水解切割和1,6自发片段化后化合物的片段化和目标肽或蛋白质的释放。
图2是包含外部位结合肽(M)的本发明的另一示例性蛋白酶可活化的促凝血化合物的图示。该图示出在可切割的底物(Aa1Aa2Aa3Aa4)的蛋白水解切割和1,6自发片段化后目标肽或蛋白质(POI；例如，凝血因子或促凝血肽)和外部位结合肽的释放。
图3和图4示出用于本发明的蛋白酶可活化的促凝血化合物的一般合成方案。该图对应于化合物7的合成。图3示出导致合成包含蛋白酶可切割的底物(凝血酶底物)和自分解性间隔子(PABC)的化合物的反应。图4示出底物/PABC化合物与合成的促凝血肽的偶联和所得产物的脱保护以生成化合物7。
图5表示化合物7被凝血酶切割的示意性图示。
图6示出化合物7被凝血酶切割的动力学。
图7示出在TGA测定过程中化合物7的切割。
图8示出用14nM凝血酶处理后来自不同的促凝血化合物(化合物1、2和3)的对应于FXa凝血因子的重链的六个N-末端氨基酸残基的肽IVGGQE(SEQ ID NO:85)的释放动力学。
图9示出用1.4nM凝血酶处理后来自不同的促凝血化合物(化合物1、4、5和6)的对应于FXa凝血因子的重链的六个N-末端氨基酸残基的肽IVGGQE(SEQ ID NO:85)的释放动力学。
图10示出因子X的天然加工以生成活化的因子X(FXa)。
图11是包含FXa凝血因子的本发明的示例性促凝血化合物的图示。
图12示出因子VII的天然加工以生成活化的因子VII(FVIIa)。
图13是包含FVIIa凝血因子的本发明的示例性促凝血化合物的图示。
图14A-B示出可被前蛋白转化酶(例如，PACE)加工成经加工的可切割的多肽(图14B)的可切割的多肽FVII-186(图14A)的流程图。图14A示出包含FVIILC(FVII轻链)-前蛋白转化酶的前蛋白转化酶加工位点(例如，PACE加工位点，例如，2X(RKR)(SEQ ID NO:88))-接头1-SUMO-截短的FVIIHC(在N-末端不含IVGGKV(SEQ ID NO:83)的FVII重链)-接头2-Fc区域2-接头3-Fc区域2的可切割的多肽。图14B示出已经被PACE加工的可切割的多肽的示意图。经加工的可切割的多肽包括两条多肽链，第一条链包括连接至前蛋白转化酶加工位点的FVIILC并且第二条链包括接头1-SUMO-截短的FVIIHC(在N-末端不含IVGGKV(SEQ ID NO:83)的FVII重链)-接头2-Fc区域1-接头3-Fc区域2。图14C显示示出上述构建体和链的非还原(泳道1)或还原(泳道2)SDS-PAGE。(-)表示肽键。
图15A-C示出(i)FVII-186被SUMO蛋白酶切割(图15B)和(ii)其融合至硫酯肽(图14C)的流程图。图15A与图14B中的构建体相同。图15B示出在FVII-186被SUMO蛋白酶切割后，所得切割的多肽构建体包括两条链，第一条链包括FVIILC和前蛋白转化酶位点并且第二条链包括截短的FVIIHC(在N-末端不含IVGGKV(SEQ ID NO:83)的FVII重链)-接头2-Fc区域1-接头3-Fc区域2。第一条链和第二条链通过二硫键连接。图15C示出在使图15B中切割的多肽构建体与硫酯肽连接(生物素-Pra-GGGG-D-Phe-Pip-Arg-PABC-IVGGKV-COSBn(SEQ ID NO:79))后，所得构建体包括两条多肽链，第一条链包括FVIILC和前蛋白转化酶加工位点并且第二条链包括凝血酶切割位点-FVIIHC(FVII重链)-接头2-Fc区域1-接头3-Fc区域2(TA-FVII-186)。图15D示出表示构建体和链的还原SDS-PAGE：泳道1显示标记物；泳道2显示FVII-186；泳道3显示具有SUMO蛋白酶反应的FVII-186；泳道3显示具有SUMO蛋白酶反应并与阳性对照肽偶联的FVII-186；并且泳道5显示具有SUMO蛋白酶反应并与PABC肽偶联的FVII-186。(-)表示肽键。
图16示出TA-FVII-186被凝血酶活化后的FVIIa显色测定。X轴表示时间(分钟)，并且Y轴表示对于FVIIa活性的吸光度(A405)测量。(x)示出凝血酶和水蛭素的混合物的FVIIa活性。(□)表示FVII-186、凝血酶和水蛭素的混合物的FVIIa活性。(○)表示TA-FVII-186、凝血酶和水蛭素的混合物的FVIIa活性。
图17A-B示出通过前蛋白转化酶(例如，PACE)表达FX-011的流程图。图17A示出包含FXLC(因子X轻链)–AP(活性肽)-前蛋白转化酶加工位点1(例如，2X(RKR)SEQ ID NO:88))-截短的FXHC(在N-末端不含六个氨基酸(即，IVGGQE(SEQ ID NO:85))的因子X重链)–Fc区域1-前蛋白转化酶加工位点2(例如，RRRR(SEQ ID NO:89))-接头-Fc区域2的可切割的多肽构建体。当表达图16A的可切割的构建体时，最初的构建体可被前蛋白转化酶(例如，PACE)加工成三条多肽链构建体，第一条链包含FXLC，第二条链包含截短的FXHC(在N-末端不含六个氨基酸(即，IVGGQE(SEQ ID NO:85)的因子X重链)-Fc区域1-前蛋白转化酶加工位点2，并且第三条链包含Fc区域2。图17C示出显示链和构建体的还原(泳道2)和非还原(泳道3)SDS-PAGE。(-)表示肽键。
图18A-B示出凝血酶可切割的因子X分子合成的流程图。将与图17B构建体(FX-011)相同的图18A构建体用硫酯肽(GG-D-Phe-Pip-Arg-PABC-IVGGQE-COSBn(SEQ ID NO:80))孵育。所得构建体(TA-FX-011)包括三条链：第一条链包括FXLC，第二条链包括凝血酶切割位点(D-Phe-Pip-Arg-PABC)-FXHC-Fc区域1-前蛋白转化酶加工位点，并且第三条链包括Fc区域2。第一条链和第二条链通过二硫键结合，并且第二和第三条链通过两个二硫键结合。图18C示出在SDS-PAGE中的构建体和链。(-)表示肽键。
图19示出TA-FX-011被凝血酶活化后的FXa显色测定。X轴表示时间(分钟)，并且Y轴表示对于FXa活性的吸光度(A405)测量。(x)表示凝血酶和水蛭素的混合物的FXa活性。(□)表示FX-011、凝血酶和水蛭素的混合物的FXa活性。(○)表示TA-FXa-011、凝血酶和水蛭素的混合物的FXa活性。
图20A-C示出可切割的FX多肽构建体(FX-012)的流程图。图20A示出包含FXLC–SUMO–截短的FXHC(在N-末端不含六个氨基酸，即，IVGGQE(SEQ ID NO:85)的因子X重链)–Fc区域1–前蛋白转化酶加工位点1–接头–前蛋白转化酶加工位点2–Fc区域2的可切割的多肽。图20A构建体可通过前蛋白转化酶(例如，PACE)进行细胞内加工以形成图20B的构建体。图20B示出包含三条链的经加工的可切割的FX多肽(FX-012)，第一条链包括FXLC，第二条链包括SUMO–截短的FXHC–Fc区域1-前蛋白转化酶加工位点1，并且第三条链包括Fc区域2。第一条链和第二条链通过二硫键结合。第二条链和第三条链通过两个二硫键结合。
图21A-C示出(i)FX-012被SUMO蛋白酶切割(图21B)和(ii)其融合至硫酯肽(图21C)的流程图。图21A与图20B中的构建体相同。图21B示出在FX-012被SUMO蛋白酶切割后，所得切割的多肽构建体包含三条多肽链，第一条链包含FXLC，第二条链包含截短的FXHC(在N-末端不含六个氨基酸(即，IVGGQE(SEQ ID NO:85))的因子X重链)–Fc区域1–前蛋白转化酶加工位点2，并且第三条链包含Fc区域2。第一条链和第二条链通过二硫键结合，并且第二和第三条链通过两个二硫键结合。图21C示出图21B中切割的多肽构建体与硫酯肽连接(D-Phe-Pip-Arg-PABC-IVGGQE-COSBn(SEQ ID NO:90))后。所得构建体(TA-FX-012)包括三条链：第一条链包括FXLC，第二条链包括凝血酶切割位点(D-Phe-Pip-Arg-PABC)-FXHC-Fc区域1-前蛋白转化酶加工位点，并且第三条链包括Fc区域2。第一条链和第二条链通过二硫键结合，并且第二和第三条链通过两个二硫键结合。图21D示出表示构建体和链的还原SDS-PAGE：泳道1显示FX-012；泳道2显示具有SUMO蛋白酶反应的FX-012；泳道3显示具有SUMO蛋白酶反应并与PABC肽偶联的FX-012；泳道4显示具有SUMO蛋白酶反应并与阳性对照肽偶联的FX-012；并且泳道5显示标记物。(-)表示肽键。
图22示出TA-FX-012被凝血酶活化后的FXa显色测定。X轴表示时间(分钟)，并且Y轴表示对于FXa活性的吸光度(A405)测量。(x)表示凝血酶和水蛭素的混合物的FXa活性。(·)表示不含凝血酶和水蛭素的TA-FX-012的FXa活性。(Δ)表示TA-FXa-012、凝血酶和水蛭素的混合物的FXa活性。
发明详述
本发明提供包含蛋白酶可切割的底物(例如，合成的凝血酶底物)和与促凝血多肽(例如，凝血因子或促凝血肽)连接的自分解性间隔子(例如，PABC)的促凝血化合物。蛋白酶可切割的底物可并入例如，众所周知的凝血酶底物D-PhePipArg。蛋白酶可切割的底物被蛋白酶(诸如凝血酶)切割时，自分解性间隔子允许通过自发片段化释放多肽。
I.定义
必须指出的是，除非上下文另有明确规定，如说明书和所附权利要求中所用，单数形式“一种/个(a)”、“一种/个(an)”和“该(the)”包括复数指示物。术语“一种/个(a)”(或“一种/个(an)”)以及术语“一个或多个”和“至少一个”在本文可以互换使用。
此外，当在本文使用时，“和/或”应当视为具有或不具有另一者的两种特定特征或组分的每一者的具体公开。因此，本文在短语中使用的术语“和/或”诸如“A和/或B”意为包括：“A和B二者”；“A或B”；“A”(单独)；和“B”(单独)。类似地，在短语中使用的术语“和/或”诸如“A、B和/或C”意为涵盖以下实施方案的每一种：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。
应该理解，每当在本文用措辞“包含”来描述实施方案时，还提供以“由……组成”和/或“基本上由……组成”描述的其它类似实施方案。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科技术语具有与本发明相关领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。例如，ConciseDictionary of Biomedicine and Molecular Biology,Juo,Pei-Show,第2版,2002,CRC Press；Dictionary of Cell and Molecular Biology,第3版,1999,Academic Press；和Oxford Dictionary Of Biochemistry AndMolecular Biology,修订板,2000,Oxford University Press，给普通技术人员提供本发明中使用的许多术语的通用字典。
单位、前缀和符号以其Système International de Unites(SI)可接受的形式表示。数值范围将限定范围的数量包括在内。除非另有说明，否则氨基酸序列以氨基到羧基的方向从左到右书写。本文提供的标题不限制本发明的各种实施方案，其可通过整体参考本说明书而得。因此，如下直接定义的术语通过整体参考说明书被更详细地定义。氨基酸可以在本文中由其通常已知的三字母符号或由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号来表示。同样地，核苷酸可以由其普遍接受的单字母码表示。
用于指蛋白质序列、肽序列、多肽序列或氨基酸序列的术语“序列”意指氨基酸成分在多肽中从氨基端到羧基端方向的线性表示，其中该表示中彼此紧邻的残基在多肽的初级结构中是连续的。
“蛋白质”或“多肽”意指不管长度、翻译后修饰或功能如何，通过酰胺键(肽键)线性连接的两个或多个氨基酸的任何顺序。如本文所用，术语“多肽”旨在涵盖单个“多肽”以及多个“多肽”。“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文可以互换使用。因此，肽、二肽、三肽或寡肽包括在“多肽”的定义内，并且术语“多肽”可以代替或与任何这些术语互换使用。术语“多肽”也指多肽的表达后修饰产物，包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护/封闭基团的衍生化、蛋白水解切割或通过非天然存在的氨基酸的修饰。多肽可以从天然生物源衍生或通过重组技术生产，但不需要从指定的核酸序列翻译。多肽可以任何方式产生，包括通过化学合成。本发明的多肽也包括上述多肽的片段、衍生物、类似物或变体及其任意组合。
当指本发明的多肽和蛋白质时，术语“片段”包括至少保留了参考多肽或蛋白质的一些特性的任何多肽或蛋白质。例如，在促凝血多肽(诸如凝血因子和促凝血肽)的情况下，术语片段将指至少保留了参考多肽或蛋白质的一些促凝血活性的任何多肽或蛋白质。多肽片段包括蛋白水解片段以及缺失片段。
如本文所用术语“变体”是指通过至少一个氨基酸修饰而不同于亲本多肽序列的多肽序列。变体可以天然存在或非天然存在。非天然存在的变体可以通过使用本领域已知的诱变技术而产生。变体多肽可包含保守或非保守的氨基酸取代、缺失或添加。
本发明的多肽或蛋白的“衍生物”是已被改变以展示天然多肽或蛋白质上未发现的另外特征的多肽或蛋白质。“衍生物”还包括含有20个标准氨基酸的一个或多个天然存在的氨基酸衍生物的那些肽。“源自”指定的多肽或蛋白质的多肽或氨基酸序列是指多肽源。优选地，源自特定序列的多肽或氨基酸序列具有与所述序列或其部分基本上相同的氨基酸序列，其中该部分由至少10-20个氨基酸，优选地至少20-30个氨基酸，更优选地至少30-50个氨基酸组成，或其可被本领域普通技术人员以其它方式鉴定为在序列中具有其来源。
源自另一个肽的多肽相对于起始多肽可具有一个或多个突变，例如，一个或多个氨基酸残基被另外的氨基酸残基取代或者其具有一个或多个氨基酸残基插入或缺失。优选地，多肽包含非天然存在的氨基酸序列。此类变体必然地与起始抗体具有少于100％的序列同一性或相似性。在优选的实施方案中，变体，例如在变体分子的长度上，将与起始多肽的氨基酸序列具有约75％至少于100％的氨基酸序列的同一性和相似性，更优选地约80％至少于100％，更优选地约85％至少于100％，更优选地约90％至少于100％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)，最优选地，约95％至少于100％。在一个实施方案中，在起始多肽序列与由此产生的序列之间有一个氨基酸差异。关于该序列的同一性和相似性在本文被定义为在比对序列并引入缺口(如有必要)以实现最大的序列同一性百分比后，候选序列中与起始氨基酸残基相同的氨基酸残基(即相同的残基)的百分比。
被“分离”的多肽是呈天然不存在的形式的多肽。分离的多肽包括已被纯化到不再呈其于天然中存在的形式的程度的那些多肽。在一些实施方案中，分离的多肽基本上是纯的。
“重组”多肽或蛋白质是指通过重组DNA技术产生的多肽或蛋白质。为了本发明的目的而分离的在宿主细胞中表达的重组产生的多肽和蛋白质被认为是已通过任何合适的技术被分离、分馏或部分或基本上被纯化的天然或重组多肽。本文公开的多肽(例如，凝血因子或促凝血肽)可以通过使用本领域已知的方法重组产生。或者，本文公开的蛋白质和肽可以被化学合成。
“保守的氨基酸取代”是氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替代。具有相似侧链的氨基酸残基家族在本领域中已定义，包括碱性侧链(例如，Lys、Arg、His)、酸性侧链(例如，Asp、Glu)、不带电荷的极性侧链(例如，Gly、Asn、Gnl、Ser、Thr、Tyr、Cys)、非极性侧链(例如，Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met、Trp)、β-分支侧链(例如，Thr、Val、Ile)和芳香族侧链(例如，Tyr、Phe、Trp、His)。因此，如果多肽中的氨基酸被另一个来自相同侧链家族的氨基酸替代，则该取代被认为是保守的。在另一个实施方案中，氨基酸串可以被侧链家族成员的顺序和/或组成不同而结构上类似的串保守替代。
非保守取代包括其中(i)具有带正电侧链的残基(例如，Arg、His或Lys)被取代成或被带负电残基(例如，Glu或Asp)取代，(ii)亲水残基(例如，Ser或Thr)被取代成或被疏水性残基(例如，Ala、Leu、He、Phe或Val)取代，(iii)半胱氨酸或脯氨酸被取代成或被任何其它残基取代，或(iv)具有庞大的疏水性或芳香族侧链的残基(例如，Val、He、Phe或Trp)被取代成或被具有较小侧链的残基(例如，Ala、Ser)或没有侧链的残基(例如，Gly)取代的那些取代。
术语两个多核苷酸或多肽序列之间的“百分比序列同一性”是指在对比窗内序列共有的相同匹配位置的数目，考虑必须引入用于两个序列最佳比对的添加或缺失(即，缺口)。匹配位置为其中相同的核苷酸或氨基酸呈现在靶向和参考序列上的任一位置。对呈现在靶向序列中的缺口不计数，因为缺口不是核苷酸或氨基酸。同样，对呈现在参考序列中的缺口不计数，因为对靶向序列核苷酸或氨基酸计数，而非来自参考序列的核苷酸或氨基酸。
可如下计算序列同一性百分比：确定在其上相同的氨基酸残基或核酸碱基存在于两个序列中的位置的数目以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以对比窗中位置的总数，并将结果乘以100以产生序列同一性的百分比。使用用于在线使用和用于下载的容易得到的软件可以实现序列比较并确定两个序列之间的百分比序列同一性。合适的软件程序可从各种来源获得，并用于比对蛋白质和核苷酸序列。确定百分比序列同一性的一种合适的程序是bl2seq，其为可从美国政府国立生物技术信息中心(U.S.government's National Center for Biotechnology Information)BLAST网站(blast.ncbi.nlm.nih.gov)获得的BLAST程序组(suite of program)的一部分。Bl2seq使用BLASTN或BLASTP算法在两个序列之间进行比较。BLASTN用于比较核酸序列，而BLASTP用于比较氨基酸序列。其它合适的程序为，例如，Needle、Stretcher、Water或Matcher，其为生物信息学程序的EMBOSS系列的一部分并且也可从欧洲生物信息学研究所(EBI)在www.ebi.ac.uk/Tools/psa获得。
与多核苷酸或多肽参考序列比对的单个多核苷酸或多肽靶向序列内的不同区域可各自具有其自身的百分比序列同一性。应注意，百分比序列同一性值四舍五入至最接近的十分之一。例如，80.11、80.12、80.13和80.14被舍到80.1，而80.15、80.16、80.17、80.18和80.19被入到80.2。还应注意，长度值将总是整数。
在某些实施方案中，第一氨基酸序列与第二序列氨基酸的百分比同一性“X”被计算成100x(Y/Z)，其中Y为在第一和第二序列比对(如通过目测或特殊的序列比对程序比对)中被评分为相同匹配的氨基酸残基数并且Z为第二序列中的残基总数。如果第一序列的长度长于第二序列，则第一序列与第二序列的百分比同一性将高于第二序列与第一序列的百分比同一性。
本领域技术人员将理解，用于计算百分比序列同一性而产生的序列比对不限于仅通过一级序列数据驱动的二进制序列-序列比较。序列比对可来源于多重序列比对。产生多重序列比对的一种合适的程序是购自www.clustal.org的ClustalW2。另一种合适的程序是购自www.drive5.com/muscle/的MUSCLE。ClustalW2和MUSCLE例如从EBI交替获得。
还应当理解，可通过整合序列数据与来自异源诸如结构数据(例如，结晶蛋白结构)、功能数据(例如，突变的位置)或系统发育数据的数据来产生序列比对。整合异源数据以产生多重序列对比的合适程序是从www.tcoffee.org获得并且或者例如从EBI获得的T-Coffee。还应当理解，用于计算百分比序列同一性的最终比对可以自动或手动辅助(curated)。
如本文所用，术语“半衰期”是指特定多肽(例如，凝血因子或促凝血肽)或本发明的促凝血化合物的体内生物半衰期。半衰期可以通过向受试者施用的量的半数在动物的循环和/或其他组织中清除所需的时间表示。当本发明的给定多肽或促凝血化合物的清除曲线被构建为时间函数时，该曲线通常是快速α-相和更长的β-相的双相曲线。α-相通常表示在血管内和血管外的空间之间施用Fc多肽的平衡，并且其部分由多肽的大小确定。β-相通常表示位于血管内空间的多肽的分解代谢。在一些实施方案中，本发明的促凝血化合物是单相的，并且因此不含有α相，但只有一个β相。因此，在某些实施方案中，本文使用的术语半衰期是指促凝血化合物在β-相中的半衰期。在人体中的人抗体的典型的β相半衰期为21天。
术语“异源”和“异源部分”意指来源于来自与其进行比较的实体的部分的不同实体的多核苷酸、多肽或任何其它部分。例如，异源多肽可以是合成的，或源自不同物种、个体的不同细胞类型或不同个体的相同或不同类型的细胞。在一个实施方案中，异源部分可以是与另一种多肽融合以产生融合多肽或蛋白质的多肽。在另一个实施方案中，异源部分可以是非多肽，诸如与多肽或蛋白质偶联的PEG。
本文使用的术语“连接”、“融合的”、“融合”或“连接的”是指通过肽键(例如，基因融合)、化学偶联或其它方式的连接。例如，可以连接分子或部分的一种方式采用通过肽键连接分子或部分的多肽接头。术语“基因融合的”、“基因连接的”或“基因融合”可以互换地使用，并且是指两个或两个以上的蛋白质、多肽及其片段经由其单独的肽骨架共线性、共价连接或连接，通过编码这些蛋白质、多肽或其片段的单个多聚核苷酸分子进行基因表达。这种基因融合导致单个连续基因序列的表达。优选的基因融合在框内，即两个或更多个开放阅读框(ORF)被融合以形成连续的更长的ORF，以保持原始ORF的正确阅读框的方式进行。因此，所得的重组融合蛋白是含有两个或更多个蛋白片段的单个多肽，所述蛋白片段对应于由原始ORF编码的多肽。
本文使用的术语“部分”是指本发明的促凝血化合物的组成部分或组分。
本文使用的术语“靶向部分”是指将本发明的促凝血化合物定位或定向到所需位点或细胞的异源部分。在一个实施方案中，本发明的促凝血化合物包含“靶向部分”，其例如，通过将促凝血化合物定位至所需位点来增强其活性。这样的部分可以是例如抗体及其变体(例如，和scFv)或肽。在另一个实施方案中，本发明的促凝血化合物包含可以是多肽、配体的受体结合部分或受体的配体结合部分的靶向部分，并与所需靶点(例如，在细胞或组织中的靶点)结合。在一些实施方案中，本发明的促凝血化合物包含基因融合、化学偶联或者通过接头或其它部分连接到构建体的靶向部分。以下将更详细地描述示例性的靶向部分。在一个实施方案中，用于本发明的促凝血化合物的靶向部分包含抗体或抗体变体。术语“抗体变体”或“修饰的抗体”包括不是天然存在的抗体，其具有的氨基酸序列或氨基酸侧链化学与天然获得的抗体的氨基酸序列或氨基酸侧链化学的不同之处在于如本文所述的至少一个氨基酸或氨基酸修饰。本文使用的术语“抗体变体”包括抗体的合成形式，所述抗体改变以使其不是天然存在的，例如，包含至少两条重链部分但是两条不完整的重链(诸如，结构域缺失抗体或小体)的抗体；抗体的多特异性形式(例如，双特异性、三特异性等)，其被改变以结合到两个或更多个不同抗原上或在单个抗原的不同表位上)；与scFv分子连接的重链分子；单链抗体；双抗体；三抗体；以及具有改变的效应子功能的抗体及其类似物。
本文使用的术语“scFv分子”包括结合分子，其由一条轻链可变结构域(VL)或其部分及一条重链可变结构域(VH)或其部分组成，其中每个可变结构域(或其部分)来源于相同或不同的抗体。scFv分子优选地包含scFv接头，其在VH结构域和VL结构域之间插入。ScFv分子是本领域已知的并且描述于例如，美国专利5,892,019,Ho等1989.Gene 77:51；Bird等1988Science 242:423；Pantoliano等1991.Biochemistry 30:10117；Milenic等1991.Cancer Research 51:6363；Takkinen等1991.Protein Engineering 4:837。
本文使用的“scFv接头”是指在scFv的VL和VH结构域之间插入的部分。scFv接头优选地将scFv分子以抗原结合构象维持。在一个实施方案中，scFv接头包含scFv接头肽或由scFv接头肽组成。在某些实施方案中，scFv接头肽包含gly-ser多肽接头或由gly-ser多肽接头组成。在其它实施方案中，scFv接头包含二硫键。
本文使用的术语“蛋白酶可切割的底物”是指包含被蛋白酶识别的位点的肽序列。某些切割位点包含细胞内加工位点。在一个实施方案中，本发明的促凝血化合物包含被在凝血级联期间活化的酶切割，以使此类位点的切割发生在血块形成的位点的蛋白酶可切割的底物。示例性的蛋白酶可切割的底物包括例如，被凝血酶、因子XIa或因子Xa识别的那些底物。示例性的FXIa切割位点包括例如，TQSFNDFTR(SEQ ID NO:2)和SVSQTSKLTR(SEQ ID NO:3)。示例性的凝血酶切割位点包括例如，DFLAEGGGVR(SEQ ID NO:4)、TTKIKPR(SEQ IDNO:5)、LVPRG(SEQ ID NO:6)和ALRPR(SEQ ID NO:7)。其它酶切割位点是本领域公知的。蛋白酶可切割的底物可包含天然或非天然氨基酸，例如D-氨基酸。
本文使用的术语“出血疾病或病症”意指基因遗传或后天获得的病状，其特征在于具有流血倾向，或者自发地，或作为创伤的结果，由于能力损伤或者不能够形成血纤蛋白凝块。此类病症的实例包括血友病。三种主要形式是血友病A(缺乏因子VIII)、血友病B(缺乏因子IX或“克雷司马斯病(Christmas disease)”)以及丙型血友病C(缺乏因子XI，中度出血倾向)。其它止血障碍包括例如，血管性血友病、缺乏因子XI(缺乏PTA)、缺乏因子XII、纤维蛋白原、凝血酶原、因子V、因子VII、因子X或因子XIII的缺乏或结构异常、GPIb缺陷或缺乏GPIb的伯纳德-苏利耶综合征(Bernard-Soulier syndrome)。GPIb(vWF受体)可以具有缺陷并导致缺少初级凝血形成(初级止血)和增加出血倾向，Glanzman和Naegeli的血小板机能不全(Glanzmann血小板无力症)。在肝功能衰竭(急性或慢性形式)中，由于肝脏凝血因子的产量不足，可能会增加出血的危险。
本文使用的短语“有效量”是指以适用于任何医学治疗的合理效益风险比有效产生期望效果的本发明的促凝血化合物或药物组合物的量。例如，“有效量”是有效减少或减轻被治疗的疾病或病症的至少一种症状、或者减少或推迟与该疾病或病症相关的一种或多种临床标志物或症状的发作、或者修改或逆转疾病过程的量。
本文使用的术语“药学上可接受的”意指由美国或欧盟或其它政府的监管机构批准或者在美国药典或其它通常公认的药典中列出，以供人用。因此，术语“药学上可接受的”是指从毒性和/或安全观点对患者(例如，人类患者)为可接受的那些特性和/或物质。
本文使用的术语“施用”意指通过药学上可接受的给药途径向有需要的受试者(例如，人类受试者)给予本发明的促凝血化合物或含有本发明的促凝血化合物的药物组合物。在一些实施方案中，给药途径是静脉内给药，例如静脉内注射或静脉内输注。在其它实施方案中，给药途径选自皮下、肌内、口服、经鼻和经肺给药。本发明的促凝血化合物可以作为包含至少一种药学上可接受的载体的药物组合物的一部分而施用。
本文使用的术语“预防性治疗”意指在时程内给受试者施用本发明的促凝血化合物以增加受试者的血浆中活性的水平。优选地，增加的水平足以降低自发性出血的发生率或防止出血，例如在意外损伤的情况下。优选地，在预防性治疗期间，受试者中的血浆蛋白质水平不低于该受试者的基线水平，或低于表征严重血友病的水平。
本文使用的术语“受试者”意指人类或非人类受试者。非人类哺乳动物包括例如，小鼠、狗、灵长类动物、猴、猫、马、牛、猪、以及其它家畜和小动物。
本文使用的术语“治疗剂量”意指获得如本文所述的治疗目标的剂量。可用于本发明的方法的治疗剂量为约10-100mg/kg，更具体地为10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90或90-100mg/kg，并且更具体地为10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100mg/kg。可用于本发明的方法的其它治疗剂量为约10至约150mg/kg，更具体地为约100-110、110-120、120-130、130-140、140-150mg/kg，并且更具体地为约110、115、120、125、130、135、140、145或150mg/kg。
本文用于范围的“约”修改该范围的两端。因此，“约10-20”意指“约10至约20”。
用于与蛋白水解切割有关的术语“选择性”意指相对于包含随机氨基酸序列的肽底物的切割，蛋白酶可切割的底物具有更大的切割速率。术语“选择性”还指示包含蛋白酶可切割的底物的促凝血化合物在其与自分解性间隔子的氨基偶合的位点被切割。
本文使用的术语“D-氨基酸”是指具有D构型的氨基酸(例如，D-Phe)。D-氨基酸可以是天然存在的氨基酸或非天然氨基酸。
本文使用的术语“自分解性间隔子”是指能够将两个间隔开的部分(例如，凝血因子或促凝血肽和蛋白可切割的底物)共价连接在一起成为通常稳定的三联分子(tripartate molecule)的双官能化学部分。如果自分解性间隔子与第一部分(例如，蛋白可切割的底物)的键合被切割，则自分解性间隔子将自发与第二部分(例如，凝血因子或促凝血肽)分离。
II.促凝血化合物
本发明提供包含凝血因子或其片段、变体或衍生物，或通过自分解性间隔子(例如，PABC)连接到蛋白酶可切割的底物(例如，凝血酶底物)的促凝血肽(例如，合成的促凝血肽)的促凝血化合物。PABC自分解性间隔子允许释放在蛋白酶可切割的底物被内源或外源蛋白酶和1,6-自发片段化切割时含有至少一个氨基、苯酚、羧酸或硫醇官能团的任何肽和蛋白质。切割动力学与所释放的胺、苯酚、羧酸或硫醇分子的同一性无关。此外，由于对氨基苄基的存在PABC可提高切割速率。
在一些实施方案中，本发明提供由以下通式表示的促凝血化合物：
(Het2)-(Pep2)-(Het1)-(L)-Zy-Bx-Pep1  (式I)
其中：
Het1是第一异源分子，为不存在或存在的；
Het2是第二异源分子，为不存在或存在的；
L是接头，为不存在或存在的；
Zy是蛋白酶可切割的底物；
Bx是自分解性间隔子；
Pep1是第一多肽；并且，
Pep2是第二多肽，为不存在或存在的；
其中，Pep1或Pep2为凝血因子或其片段或促凝血肽(例如，合成的促凝血肽)(参见图1A)。
在各种实施方案中，本发明特别提供：在损伤位点被选择性地活化的促凝血化合物；被凝血级联蛋白酶选择性地活化的促凝血化合物；包括施用本发明的促凝血化合物的治疗出血病症的方法；用于生产本发明的促凝血化合物的方法；和包含本发明的促凝血化合物的药物组合物。
在一些实施方案中，在不存在靶向蛋白酶可切割的底物的蛋白酶的情况下，本文公开的促凝血化合物是稳定的并且在药理上无活性。
然而，在蛋白酶作用时，或在任何其它合适的切割条件下，蛋白酶可
切割的底物被切割，并且自分解性间隔子经历自发反应，导致活性促
凝血多肽(例如，活性凝血因子或促凝血肽)的释放。在一些实施方案
中，本发明的促凝血化合物是酶原。
在一些方面，本发明的促凝血蛋白质包括选自如下的式：
(a)Zy-Bx-Pep1；
(b)Het1-Zy-Bx-Pep1；
(c)Het1-L-Zy-Bx-Pep1；
(d)Pep2-Zy-Bx-Pep1；
(e)Pep2-L-Zy-Bx-Pep1；
(f)Pep2-Het1-L-Zy-Bx-Pep1；
(g)Pep2-Het1-Zy-Bx-Pep1；
(h)Het2-Het1-L-Zy-Bx-Pep1；
(i)Het2-Het1-Zy-Bx-Pep1；
(j)Het2-Pep2-Het1-L-Zy-Bx-Pep1；
(k)Het2-Pep2-L-Zy-Bx-Pep1；
(l)Het2-Pep2-Het1-Zy-Bx-Pep1；或，
(m)Het2-Pep2-Zy-Bx-Pep1，
其中：
Het1是第一异源分子；
Het2是第二异源分子；
L是接头；
Zy是蛋白酶可切割的底物；
Bx是自分解性间隔子；
Pep1是第一多肽；并且，
Pep2是第二多肽；
其中，Pep1或Pep2为凝血因子或其片段或促凝血肽(例如，合成的促凝血肽)。
在一些实施方案中，本文所述的式可包括两个部分之间的额外序列，例如接头。例如，接头可位于Het2和Pep2之间或Pep2和Het1之间。在一些实施方案中，额外的Zy-Bx基团存在于肽(例如，Pep1或Pep2)和/或异源分子(例如，Het1或Het2)的N-末端以促进此类肽和/或异源部分的完全释放。因此，在一些实施方案中，本发明的促凝血蛋白质包括选自如下的式：
(n)Pep2-Zy-Bx-L-Zy-Bx-Pep1；
(o)Pep2-Zy-Bx-Het1-L-Zy-Bx-Pep1；
(p)Pep2-Zy-Bx-Het1-Zy-Bx-Pet1；
(q)Het2-Zy-Bx-Pep2-Zy-Bx-Het1-L-Zy-Bx-Pep1；
(r)Het2-Zy-Bx-Pep2-Zy-Bx-L-Zy-Bx-Pep1；
(s)Het2-Zy-Bx-Pep2-Zy-Bx-Het1-Zy-Bx-Pep1，或，
(t)Het2-Zy-Bx-Pep2-Zy-Bx-Pep1，
其中：
Het1是第一异源分子；
Het2是第二异源分子；
L是接头；
Zy是蛋白酶可切割的底物；
Bx是自分解性间隔子；
Pep1是第一多肽；并且，
Pep2是第二多肽；
其中，Pep1或Pep2为凝血因子或其片段或促凝血肽(例如，合成的促凝血肽)。
本文促凝血化合物式的方向从N-末端(左)至C-末端(右)示出。例如，式Pep2-Zy-Bx-Pep1意指式NH2-Pep2-Zy-Bx-Pep1-COOH。上面示出的式(a)至(t)仅仅作为本发明的促凝血化合物的非限制性实例而包括在本文中。例如，式Het2-Pep2-Het1-L-Zy-Bx-Pep1可进一步包括在Het2的游离端、Het2和Pep2之间、Pep2和Het1之间、Het1和Sp之间、L和Zy之间、Zy和Bx之间、Bx和Pep1之间或在Pep1的C-末端的序列。在另一个实施方案中，连字号(-)表示肽键或一个或多个氨基酸。
在一些实施方案中，促凝血化合物包含凝血因子或其片段和异源部分。在一些实施方案中，异源部分包括例如选自免疫球蛋白恒定区或其部分(例如，Fc区)、PAS序列、HES和白蛋白、片段或其变体或XTEN的半衰期延长部分。在其它实施方案中，促凝血化合物包含凝血因子或其片段、第二凝血因子或其片段和PEG异源部分，其中所述促凝血化合物还包含选自免疫球蛋白恒定区或其部分(例如，Fc区)、PAS序列、HES和白蛋白、片段或其变体或XTEN的异源部分。
在其它实施方案中，促凝血化合物包含凝血因子或其片段、合成的促凝血多肽和异源部分，其中所述促凝血化合物还包含选自免疫球蛋白恒定区或其部分(例如，Fc区)、PAS序列、HES和白蛋白、片段或其变体、XTEN或其任意组合的第二异源部分。在其它实施方案中，促凝血化合物包含两种合成的促凝血肽和异源部分，其中所述促凝血化合物还包含选自免疫球蛋白恒定区或其部分(例如，Fc区)、PAS序列、HES和白蛋白、片段或其变体、XTEN或其任意组合的第二异源部分。在另一个实施方案中，促凝血化合物包含凝血因子或其片段、凝血因子辅因子(例如，如果凝血因子为因子X，则辅因子为因子Va；或如果凝血因子是因子VII，则辅因子为组织因子)以及异源部分，其中所述促凝血化合物还包含选自免疫球蛋白恒定区或其部分(例如，Fc区)、PAS序列、HES和白蛋白、片段或其变体、XTEN或其任意组合的第二异源部分。
在本发明的具体方面，本发明的促凝血化合物包括下式，其中Het1-L-Zy-Bx-Pep1，其中Pep1包括包含序列rRAPGKLTCLASYCWLFWTGIA的促凝血肽，Bx包括PABC自分解性间隔子，Zy包括包含序列D-Phe-Pip-Arg的凝血酶可切割的底物，L包括包含序列GGGG的接头，并且Het1包括包含半胱氨酸氨基酸的支架异源部分。
在本发明的具体方面，本发明的促凝血化合物包括下式，其中Zy-Bx-Pep1，其中Pep1包括FXa凝血因子，Bx包括PABC自分解性间隔子，并且Zy包括包含序列D-Phe-Pip-Arg的凝血酶可切割的底物。
在本发明的具体方面，本发明的促凝血化合物包括下式，其中Zy-Bx-Pep1，其中Pep1包括FVIIa凝血因子，Bx包括PABC自分解性间隔子，并且Zy包括包含序列D-Phe-Pip-Arg的凝血酶可切割的底物。
在本发明的另一个具体方面，本发明的促凝血化合物包括下式，其中Pep2-Zy-Bx-Pep1，其中Pep1包括FX凝血因子，Bx包括PABC自分解性间隔子，Zy包括包含序列D-Phe-Pip-Arg的凝血酶可切割的底物，并且Pep2是活性肽，其中凝血酶可切割的底物的切割导致活性肽的释放和凝血因子的活化(参见图11)。在根据该式的一些实施方案中，凝血因子是FIXa并且活性肽是FVIIIa。在其它实施方案中，凝血因子是FVIIa并且活性肽是组织因子。在一些实施方案中，活性肽可以是促凝血肽。
在本发明的一些具体方面，本发明的促凝血化合物包括式Pep1-Het3-Het2-Bx-Het1，其中Pep1包括凝血因子，Het3是支架异源部分，Het2是异源部分，Bx是自分解性间隔子，并且Het1是第二异源部分。在根据该式的一些实施方案中，Pep1包括FVIII凝血因子，Het3是半胱氨酸，Het2包括Fc异源部分，Bx包括PABC自分解性间隔子，并且Het1包括XTEN。
在本发明的一些具体方面，本发明的促凝血化合物包括式Pep1-Het2-Bx-Het1，其中Pep1包括凝血因子，Het2是支架异源部分，Bx是自分解性间隔子，并且Het1是第二异源部分。在根据该式的一些实施方案中，Pep1包括FVIII凝血因子，Het2是半胱氨酸，Bx包括PABC自分解性间隔子，并且Het1包括XTEN。
为了更好地理解本发明的促凝血化合物，其组分将分别讨论如下：
A.多肽(例如，Pep1、Pep2、...、Pepn)
1.凝血因子和促凝血肽
本发明的促凝血化合物包括至少一个多肽部分(Pep1或Pep2)，该多肽为(i)凝血因子，或(ii)促凝血肽(例如，合成的促凝血肽)。
本文使用的术语“凝血因子”涵盖能阻止或降低受试者中出血发作的持续时间的天然存在、重组产生或合成产生的凝血因子(例如，vWF、FV、FVa、FVII、FVIIa、FVIII、FVIIIa、FIX、FIXa、FX、FXa、FXI、FXIa、FXII、FXIIa、FXIII或FXIIIa)、其片段、变体、类似物或衍生物。换句话说，它意指具有促凝血活性的分子。在一些实施方案中，本发明的促凝血化合物包含FVII或活化的FVII(FVIIa)凝血因子。在其它实施方案中，本发明的促凝血化合物包含FVIII或活化的FVIII(FVIIIa)凝血因子。在一些实施方案中，本发明的促凝血化合物包含FIX或活化的FIX(FIXa)凝血因子。在其它实施方案中，本发明的促凝血化合物包含FX或活化的FX(FXa)凝血因子。在一些实施方案中，本发明的促凝血化合物包含vWF。本文使用的术语“促凝血肽”是指具有促凝血活性的任何肽。特别地，该术语是指通过将可溶性循环纤维蛋白原转化为不溶性交联血纤蛋白网络来启动或加速血液凝固过程的肽。
本文使用的“合成的促凝血肽”是指已经使用固相肽合成生产的促凝血多肽。
“促凝血活性”是指在适当的测试系统中促进凝血酶产生和/或血纤蛋白沉积的能力。许多试验可用于评估凝血系统的功能：活化部分凝血激酶时间(aPTT)试验、显色测定、ROTEM测定、凝血酶原时间(PT)测试(也用于确定INR)、纤维蛋白原测试(通常通过Clauss方法)、血小板计数、血小板功能测试(通常通过PFA-100)、TCT、出血时间、混合试验(如果患者的血浆与正常血浆混合，异常是否校正)、凝结因子测定、抗磷脂抗体、D-二聚体、遗传测试(例如因子V Leiden、凝血酶原突变G20210A)、稀释蝰蛇毒时间(dRVVT)、各种血小板功能试验、凝血弹性描记法(TEG或Sonoclot)、凝血弹性测定法(thromboelastometry)(例如)或优球蛋白溶解时间(ELT)。
aPTT试验是测量“内源性”(也称为接触活化途径)和普通凝血途径的功效的性能指示符。该测试通常用于测量可商购获得的重组凝血因子(例如，FVIII或FIX)的凝血活性。它与测量外在途径的凝血酶原时间(PT)联合使用。
ROTEM分析提供关于止血的整个动力学：凝血时间、血块形成、血块稳定性和溶解的信息。凝血弹性测定法中的不同参数依赖于血浆凝血系统、血小板功能、纤维蛋白溶解或影响这些相互作用的许多因素的活性。该测定可以提供辅助止血的完整视图。
在一些实施方案中，促凝血化合物包含单个凝血因子。在一些实施方案中，所述单个凝血因子为Pep1。在其它实施方案中，所述单个凝血因子为Pep2。在其它实施方案中，促凝血化合物包含两个凝血因子。在一些实施方案中，所述两个凝血因子是相同的。在其它实施方案中，所述两个凝血因子是不同的。在一些实施方案中，一个凝血因子为凝血因子片段(例如，凝血因子诸如FVIII的重链)并且第二个凝血因子为相同凝血因子的片段(例如，凝血因子诸如FVIII的轻链)。在一些实施方案中，促凝血化合物包含两个以上凝血因子。
在一些实施方案中，凝血因子的氨基末端连接到自分解性间隔子，所述间隔子又连接到蛋白酶可切割的底物。在一些实施方案中，本发明的促凝血化合物包含两个凝血因子(例如，两个不同的凝血因子或凝血因子的重链和轻链)，其中只有一个的氨基末端连接到自分解性间隔子，所述间隔子又连接到蛋白酶可切割的底物。在其它实施方案中，本发明的促凝血化合物包含两个凝血因子(例如，两个不同的凝血因子或凝血因子的重链和轻链)，其中它们两者的氨基末端连接到自分解性间隔子，所述间隔子又连接到蛋白酶可切割的底物。
在一些实施方案中，促凝血化合物包含促凝血肽(例如，促凝血合成肽)。在一些实施方案中，促凝血化合物包含两个促凝血肽。在一些实施方案中，所述两个促凝血肽可以是相同的。在其它实施方案中，所述两个促凝血肽可以是不同的。在一些实施方案中，至少一个促凝血肽是合成的促凝血肽。在一些实施方案中，两个促凝血肽均是合成的。在一些实施方案中，促凝血化合物包含两个以上促凝血肽。
在一些实施方案中，促凝血化合物包含凝血因子和促凝血肽，例如合成的促凝血肽。在一些实施方案中，Pep1是凝血因子并且Pep2是促凝血肽，例如合成的促凝血肽。在其它实施方案中，Pep1是促凝血肽，例如合成的促凝血肽，并且Pep2是凝血因子。
在一些实施方案中，Pep1和Pep2是凝血因子凝血辅因子对，例如FVIIa和组织因子、FVIII和FIX、FVIII和vWF、FIXa和FVIIIa等。
在本发明的促凝血化合物中合并为Pep1和/或Pep2的合适的凝血因子和促凝血肽公开于例如WO2011/069164；WO 2012/006624；WO 2004/101740；WO/2007/112005；和WO 2012/006633；以及公开于美国临时专利申请61/491,762；61/467,880；61/442,029；61/363,186；61/599,305；61/586,654；61/586,099；61/622,789；61/586,443；61/569,158；61/541,561；61/522,647；61/506,015；61/496,542；61/496,541；61/496,544；61/496,543；或3480000；其全部在此通过引用整体并入。
(i)凝血因子
在一些实施方案中，Pep1和/或Pep2为凝血因子，例如，因子VII、因子VIII、因子IX和因子X。因子VII、IX和X的活性形式由二聚体分子组成，其中重链和轻链仅通过二硫键连接。用于活化凝血因子的方法在本领域已知。
a.因子VII
在一些实施方案中，凝血因子是因子VII的成熟形式或其变体。因子VII(FVII，F7也被称为因子7、凝血因子VII、血清因子VII、血清凝血酶原转化加速器、SPCA、转变素原和依他凝血素α)是丝氨酸蛋白酶类，其是凝血级联的部分。FVII包括Gla结构域，两个EGF结构域(EGF-1和EGF-2)和丝氨酸蛋白酶结构域(或肽酶S1结构域)，其在丝氨酸蛋白酶的肽酶S1家族的所有成员中高度保守，诸如例如具有糜蛋白酶。FVII以单链酶原形式、活化的酶原样双链多肽和完全活化的双链形式存在。
本文使用的“酶原样”蛋白质或多肽是指这样的蛋白质，其被蛋白水解切割活化，但是仍然显示与酶原有关的性质(诸如例如，低活性或没有活性)，或与蛋白质的酶原形式的构象类似的构象。例如，当不结合组织因子时，FVII的双链活性形式是酶原类蛋白质；它保留了类似于未切割的FVII酶原的构象，并因此展示出极低的活性。一旦结合组织因子，FVII的双链活性形式经历构象改变并获得其作为凝血因子的全部活性。
示例性FVII变体包括具有增加的比活性的那些变体，例如通过增加其酶促活性(Kcat或Km)而增加FVII活性的突变。此类变体在本领域中已有描述，并且包括例如，分子的突变形式，如描述于例如Persson等2001.PNAS 98:13583；Petrovan和Ruf.2001.J.Biol.Chem.276:6616；Persson等2001J.Biol.Chem.276:29195；Soejima等2001.J.Biol.Chem.276:17229；Soejima等2002.J.Biol.Chem.247:49027。
在一个实施方案中，FVII的变体形式包括突变示例性的突变包括V158D-E296V-M298Q。在另一个实施方案中，FVII的变体形式包括用来自胰蛋白酶的170-环的氨基酸EASYPGK取代来自FVII成熟序列的氨基酸608-619(LQQSRKVGDSPN，对应于170-环)。FIX的高比活性的变体也是本领域已知的。例如，Simioni等(2009N.E.Journal of Medicine 361:1671)描述了R338L突变。Chang等(1988JBC 273:12089)和Pierri等(2009Human Gene Therapy 20:479)描述了R338A突变。其它突变是本领域已知的，并且包括描述于例如Zogg和Brandstetter2009Structure 17:1669；Sichler等2003.J.Biol.Chem.278:4121；和Sturzebecher等1997.FEBS Lett 412:295的那些突变。这些参考文献的全部内容通过引用并入本文。
在从酶原样形式构象改变时存在的全活化在与辅因子组织因子结合时存在。同样，可引入在不存在组织因子时引起构象改变的突变。因此，提到的FVIIa包括其双链形式：酶原样形式和全活化的双链形式。
b.因子VIII
在一个实施方案中，凝血因子是因子VIII的成熟形式或其变体。FVIII在血液凝固的内源性途径中作为辅因子起作用以加速通过因子IXa对因子X的活化(存在钙离子时在带负电荷的磷脂表面上发生的反应)。FVIII以2351个氨基酸的单链多肽合成，所述单链多肽具有结构域结构A1-A2-B-A3-C1-C2。Wehar,G.A.等,Nature 312:337-342(1984)和Toole,J.J.等,Nature 312:342-347(1984)。
FVIII的结构域结构与同源凝血因子(因子V(FV))相同。Kane,W.H.等,PNAS(USA)83:6800-6804(1986)和Jenny,R.J.等,PNAS(USA)84:4846-4850(1987)。FVIII A-结构域具有330个氨基酸并且彼此之间和与FV的A-结构域以及血浆铜结合蛋白血浆铜蓝蛋白具有40％的氨基酸同一性。Takahashi,N.等,PNAS(USA)81:390-394(1984)。每个C-结构域具有150个氨基酸，并显示与FV的C-结构域和结合糖偶联物和带负电荷的磷脂的蛋白质具有40％的同一性。Stubbs,J.D.等,PNAS(USA)87:8417-8421(1990)。FVIII B-结构域由单个外显子编码并显示与任何已知的蛋白质(包括FV B-结构域)具有很少的同源性。Gitschier,J.等,Nature 312:326-330(1984)和Cripe,L.D.等,Biochemistry 31:3777-3785(1992)。
FVIII作为重链(结构域A1-A2-B)和轻链(结构域A3-C1-C2)的异源二聚体分泌到血浆中，该重链和轻链通过位于A1-和A3-结构域之间的二价金属离子键而缔合。在血浆中，FVIII通过与维勒布兰德(vonWillebrand)因子结合而被稳定化。更具体地说，FVIII轻链通过非共价键相互作用与维勒布兰德因子的氨基末端的主要结合位点结合。
一旦被凝血酶蛋白水解活化，FVIII被活化成2条重链片段(A1，50kDa片段和A2，43kDa片段)和1条轻链(A3-C1-C2，73kDa链)的异源三聚体。因此，FVIII的活性形式(FVIIIa)由通过二价金属离子键与凝血酶-切割的A3-C1-C2轻链缔合的A1亚基，和通过离子键与A1结构域缔合的游离A2亚基组成。Eaton,D.等,Biochemistry 25:505(1986)；Lollar,P.等,J.Biol.Chem.266:12481(1991)；和Fay,P.J.等,J.Biol.Chem.266:8957(1991)。该FVIIIa异源三聚体是不稳定的，并且通过在生理条件下解离A2亚基而经受快速失活。
在一个实施方案中，凝血因子包含因子VIII的B-结构域缺失的形式。本文使用的因子VIII的“B-结构域”与本领域已知的B-结构域相同，其被内部氨基酸序列同一性和蛋白水解切割位点所限定，例如全长人因子VIII的残基Ser741-Arg1648。其它的人因子VIII结构域被以下氨基酸残基所限定：A1，残基Ala1-Arg372；A2，残基Ser373-Arg740；A3，残基Ser1690-Asn2019；C1，残基Lys2020-Asn2172；C2，残基Ser2173-Tyr2332。A3-C1-C2序列包括残基Ser1690-Tyr2332。剩余的序列(残基Glu1649-Arg1689)通常被称为a3酸性区。
对于猪科动物、鼠和犬科动物因子VIII，所有结构域(包括B结构域)的边界的位置也是本领域已知的。在一个实施方案中，因子VIII的B结构域是缺失的(“B-结构域缺失的因子VIII”或“BDD FVIII”)。BDD FVIII的实例是(具有S743/Q1638融合的重组BDDFVIII)，其在本领域已知。
“B-结构域缺失的因子VIII”可以具有公开在美国专利号6,316,226、6,346,513、7,041,635、5,789,203、6,060,447、5,595,886、6,228,620、5,972,885、6,048,720、5,543,502、5,610,278、5,171,844、5,112,950、4,868,112和6,458,563的完全或部分缺失，所述专利各通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，B-结构域缺失的因子VIII序列包含于美国专利号6,316,226(同样在美国专利号6,346,513中)的第4栏第4行至第5栏第28行和实施例1-5中公开的任一缺失。
在另一个实施方案中，B-结构域缺失的因子VIII是S743/Q1638B-结构域缺失的因子VIII(SQ形式因子VIII)(例如，具有从氨基酸744至氨基酸1637缺失的因子VIII，例如，具有氨基酸1-743和氨基酸1638-2332的因子VIII)。在一些实施方案中，本发明的B-结构域缺失的因子VIII具有公开于美国专利号5,789,203(同样在美国专利号6,060,447、5,595,886和6,228,620中)的第2栏第26-51行和实施例5-8的缺失。
在一些实施方案中，B-结构域缺失的因子VIII具有于美国专利号5,972,885的第1栏第25行至第2栏第40行；美国专利号6,048,720的第6栏第1-22行和实施例1；美国专利号5,543,502的第2栏第17-46行；美国专利号5,171,844的第4栏第22行至第5栏第36行；美国专利号5,112,950的第2栏第55-68行、图2和实施例1；美国专利号4,868,112的第2栏第2行至第19栏第21行和表2；美国专利号7,041,635的第2栏第1行至第3栏第19行、第3栏第40行至第4栏第67行、第7栏第43行至第8栏第26行和第11栏第5行至第13栏第39行；或美国专利号6,458,563的第4栏第25-53行中描述的缺失。
在一些实施方案中，B-结构域缺失的因子VIII缺失大部分B结构域，但仍然含有B结构域的氨基末端序列，其对于将初级翻译产物体内蛋白水解加工成两条多肽链是必不可少的，如WO 91/09122(其通过引用整体并入本文)所公开。在一些实施方案中，B-结构域缺失的因子VIII用氨基酸747-1638缺失构建，即实际上是B结构域的完全缺失。Hoeben R.C.,等J.Biol.Chem.265(13):7318-7323(1990)，其通过引用整体并入本文。
B-结构域缺失的因子VIII也可含有因子VIII的氨基酸771-1666或氨基酸868-1562的缺失。Meulien P.,等Protein Eng.2(4):301-6(1988)，其通过引用整体并入本文。另外的B结构域也是本发明的部分，其包括：氨基酸982至1562或760至1639的缺失(Toole等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1986)83,5939-5942))、氨基酸797至1562的缺失(Eaton,等Biochemistry(1986)25:8343-8347))、氨基酸741至1646的缺失(Kaufman(PCT公布申请号WO 87/04187))、氨基酸747-1560的缺失(Sarver,等,DNA(1987)6:553-564))、氨基酸741至1648的缺失(Pasek(PCT申请号88/00831))或氨基酸816至1598或741至1648的缺失(Lagner(Behring Inst.Mitt.(1988)No 82:16-25，EP 295597))，所述文献各通过引用整体并入本文。每种上述缺失可以在任何因子VIII序列中制备。
c.因子IX
在一个实施方案中，凝血因子是因子IX的成熟形式或其变体。因子IX作为415个氨基酸的单链血浆酶原进行循环(A.Vysotchin等,J.Biol.Chem.268,8436(1993))。FIX的酶原被FXIa活化或被组织因子/FVIIa复合物活化。精氨酸-丙氨酸145-146和精氨酸-缬氨酸180-181之间的特异性切割产生通过半胱氨酸132和半胱氨酸289之间的单个二硫键连接的轻链和重链(S.Bajaj等,Biochemistry 22,4047(1983))。
FIX的结构组织类似于维生素K依赖型凝血蛋白FVII、FX和蛋白C(B.Furie和B.Furie,同上)。氨基端的大约45个氨基酸包含γ-羧基谷氨酸或Gla结构域。然后是两个表皮生长因子同源结构域(EGF)、活性肽和丝氨酸蛋白酶家族成员的催化性“重链”(A.Vysotchin等,J.Biol.Chem.268,8436(1993)；S.Spitzer等,Biochemical Journal 265,219(1990)；H.Brandstetter等,Proc.Natl.Acad Sci.USA 92,9796(1995))。
d.因子X
在一个实施方案中，凝血因子是因子X的成熟形式。因子X是分子量为58.5kDa的维生素K依赖型糖蛋白，其作为酶原形式从肝细胞分泌到血浆。最初，因子X作为具有信号肽的前肽原制备，该信号肽由总计488个氨基酸组成。信号肽在输出到内质网中时被信号肽酶切割，γ羧基化在成熟的N末端链的N末端的第一11谷氨酸残基处发生后前肽原序列被切除。进一步的加工步骤通过在Arg182和Ser183之间的切割发生。该加工步骤同样伴随导致三肽Arg180-Lys181-Arg182的缺失。所得的分泌因子X酶原由139个氨基酸(M,16,200)的N末端轻链和306个氨基酸(M,42,000)的C末端重链组成，其通过Cys172和Cys342之间的二硫桥共价地连接。进一步的翻译后加工步骤包括Asp103的β-羟基化以及N-和O-型糖基化。
应当理解的是，除了这些凝血因子或其生物活性部分的野生型(WT)形式，本发明也可采用具有活性的前体截短形式、等位基因变体和种类变体、由剪接变体编码的变体以及其他变体，包括与凝血因子的成熟形式具有至少40％、45％、50％、55％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性并保留促进血块形成的能力的多肽。例如，保留FVII的至少一种活性，诸如FVII的TF结合、因子X结合、磷脂结合和/或促凝活性的修饰FVII多肽及其变体可以被采用。通过保留活性，所述活性可被改变，诸如与野生型凝血因子相比降低或增加活性，只要所保留的活性水平足以生成可检测的效应。
示例性的修饰多肽包括但不限于组织特异性同工型及其等位基因变体，通过核酸的翻译而制备的合成分子，通过化学合成(诸如包括较短多肽通过重组方法的连接反应的合成)产生的蛋白质，从人和非人组织和细胞分离的蛋白质，嵌合多肽及其修饰形式。本发明的凝血因子也可由WT(野生型)分子的片段或部分组成，所述野生型分子具有足够长度或包括合适的区域以保留全长成熟多肽的至少一种活性(如果有需要，在活化时)。本领域已知示例性的凝血因子变体。
本文使用的术语“Gla结构域”是指保守膜结合基序，其诸如作为凝血酶原、凝血因子VII、IX和X，蛋白C、S和Z存在于维生素K依赖型蛋白中。这些蛋白质需要用于翻译后合成g-羧基谷氨酸(一种聚集在这些蛋白质的N-末端Gla结构域中的氨基酸)的维生素K。所有存在于结构域中的谷氨酸残基都是潜在的羧基化位点，因此其中许多被羧基化修饰。在存在钙离子时，Gla结构域与包括磷脂酰丝氨酸的磷脂膜相互作用。Gla结构域也在结合FVIIa辅因子、组织因子(TF)中起作用。与TF复合时，FVIIa的Gla结构域负载有7个Ca2+离子，在细胞表面与磷脂相互作用的细胞膜方向上伸出三个疏水性侧链，并且与TF的C-末端结构域明显接触。
因子VII的Gla结构域包含罕见的氨基酸-羧基谷氨酸(Gla)，其在凝血因子与带负电的磷脂表面的结合中起作用。
GLA结构域负责钙离子的高亲和力结合。它起始于蛋白质的成熟形式的N末端终点并且以保守性芳族残基结束。在结构域中部发现保守的Gla-x(3)-Gla-x-Cys基序，其似乎对于羧化酶的底物识别而言是重要的。
使用停流荧光动力学测量结合表面等离子体共振分析，发现Gla结构域在事件的序列中很重要，据此，FVIIa的蛋白酶结构域启动与sTF的接触(Biochemical and Biophysical Research Communications.2005.337:1276)。另外，凝血因子的清除可通过例如在肝细胞和清除受体(例如，EPCR)上的Gla相互作用显著地介导。
在一个实施方案中，对靶向的凝血因子进行修饰以缺乏Gla结构域。Gla结构域负责通过多个途径(诸如与肝细胞结合，清除受体诸如EPCR等)介导凝血因子的清除。因此，消除Gla结构域对凝血因子的半衰期具有有益作用。虽然Gla结构域通常也通过将凝血因子定位于凝血位点而需要活性，但是靶向结构域部分的血小板的内含物使Gla缺失的凝血因子靶向血小板。在一个实施方案中，凝血因子包含靶向部分并缺少Gla结构域。例如，在因子VII的情况下，Gla结构域存在于轻链的氨基端并由氨基酸1-35组成。示例性的凝血因子的Gla结构域在随附的序列表中示出。该结构域可能通过使用标准的分子生物学技术来去除，用靶向结构域进行替换，并且修饰的轻链结合到本发明的构建体中。在一个实施方案中，切割位点可以被引入到缺少Gla结构域的构建体中以促进分子的活化。例如，在一个实施方案中，此类切割位点可以被引入到氨基酸之间，当凝血因子被活化时该氨基酸被切割(例如，对于因子VII，位于氨基酸152和153之间)。
在一个实施方案中，切割位点可以被引入到缺少Gla结构域的构建体中以促进分子的活化。例如，在一个实施方案中，此类切割位点可以被引入到氨基酸之间，当凝血因子被活化时该氨基酸被切割(例如，对于因子VII，位于氨基酸152和153之间)。在附图中示出了示例性的缺少Gla结构域的凝血因子。
示例性的凝血因子是哺乳动物(例如，人)来源的凝血因子。
(ii)促凝血肽
在本发明的促凝血化合物中合并为Pep1和/或Pep2的合适的促凝血肽公开于例如，美国临时申请号61/495,818；61/600,237；和61/605,540，其在此通过引用整体并入。
示例性的合成促凝血肽包括，例如：
KLTCLASYCWLF                       (SEQ ID NO:8)；
RRAPGKLTCLASYCWLFWTGIA            (SEQ ID NO：9)；
RRAPGKLQCLASYCWLFWTGIA            (SEQ ID NO：10)；
PRIRTVGPGSRSASGKLTCLASYCWLFWTGIA  (SEQ ID NO：11；
SKQGRPISPDRRAAGKLTCLASYCWLFWTGIA  (SEQ ID NO：12)；
PRIRTVGPGSRSASGKSTCLASYCWLFWTGIA  (SEQ ID NO：13)；
SRIRTVSPGSRSASGKATDLASYCWLFWTGIA  (SEQ IN NO：14)；或
PRSRTVGPGSRSASGKSTCLASYCWLFWTGIA  (SEQ ID NO：15)。
2.其它多肽
在一些实施方案中，促凝血化合物包含非凝血因子或合成促凝血肽的至少一种多肽(例如，Pep1或Pep2)。在一些实施方案中，促凝血化合物包含Pep1或Pep2多肽(其为凝血级联辅因子，例如组织因子)或其衍生物、片段或变体。
在其它实施方案中，促凝血化合物包含含有配体结合部分的Pep1或Pep2多肽。在一些实施方案中，此类配体结合部分是抗体或其抗原结合片段。
B.自分解性间隔子(Bx)
本发明的促凝血化合物包含自分解性间隔子。在一些方面，自分解性间隔子包含氨基甲酸氨基苄酯基团、氨基苄基醚基或碳酸氨基苄酯基团。在一个方面，自分解性间隔子是氨基甲酸对氨基苄酯(PABC)。
氨基甲酸对氨基苄酯(PABC)是用于自分解性位点特异性前体药物活化的最有效和最广泛的连接子连接(参见，例如，Carl等J.Med.Chem.24:479-480(1981)；WO 1981/001145；Rautio等,Nature ReviewsDrug Discovery 7:255-270(2008)；Simplicio等,Molecules 13:519-547(2008)；)。在蛋白酶切割和1,6自发片段化时，PABC允许释放任何胺药物、肽和蛋白质(参见图1)。
在一些实施方案中，自分解性间隔子将目标多肽(例如，凝血因子或其片段，或合成促凝血肽)连接至蛋白酶可切割的底物(例如，凝血酶底物)。在具体方面，PABC自分解性间隔子的氨基甲酸酯基连接到目标多肽(例如，凝血因子或其片段，或合成促凝血肽)的N-末端，并且PABC自分解性间隔子的氨基连接到蛋白酶可切割的底物(例如，凝血酶底物)。
氨基苄基的芳环可任选地被芳环上的一个或多个(例如，R1和/或R2)取代基取代，其替代连接至形成环的四个未取代的碳中的一个的氢。本文使用的符号“Rx”(例如，R1、R2、R3、R4)是表示如本文所述取代基的一般缩写。
取代基可以改善对氨基苄基的自分解能力(Hay等,J.Chem Soc.,Perkin Trans.1:2759-2770(1999)；还参见，Sykes等J.Chem.Soc.,Perkin Trans.1:1601-1608(2000))。
下式示出对氨基苄基自分解性接头的一般拓补学和示例性蛋白酶可切割的底物(Aa1Aa2Aa3Aa4)和目标肽或蛋白(POI)的相对位置，所述目标肽或蛋白可以为Pep1、Pep2、多肽异源部分或包含肽接头的接头。该式表示R取代基(R1、R2、R3)的可能位置。
选择可以是单原子(例如，卤素)或多原子基(例如，甲基)的取代基以影响氨基苄基的稳定性或其产物的分解。电子从环上撤离可用于促进在氨基苄基的氨基和相邻肽键之间的键被切割后氨基苄基从药物的自发分解。示例性的芳基R1、R2或R3取代基包括例如，F、Cl、I、Br、OH、甲基、甲氧基、NO2、NH2、NO3+、NHCOCH3、N(CH3)2、NHCOCF3、烷基、卤代烷基、C1-C8烷基卤化物、羧酸酯、硫酸酯、氨基磺酸酯、磺酸酯等(参见，例如，美国专利号7,091,186和7,659,241)。对氨苄基接头可包含连接到目标蛋白的肽或蛋白的氨基末端的杂原子Z。本文使用的术语杂原子包括氧(O)、氮(N)、硫(S)、硅(Si)、硼(B)和磷(P)。在一个实施方案中，Z中的杂原子是O、S或N。
如下所述，在某些方面，自分解性接头包含含有结合至其各自凝血因子的外部位的外部位结合肽的M基。
许多外部位结合基序是本领域已知的。插入外部位结合基序可以提高切割速率。切割后，外部位结合基序和目标肽或蛋白(例如，凝血因子或其片段、或促凝血肽)被释放(参见图2)。
在一些实施方案中，对氨基苄基环中四个未取代的碳中仅一个是被取代的。在一些其它实施方案中，对氨基苄基环中四个未取代的碳中的两个是被取代的。在其它实施方案中，对氨基苄基环中四个未取代的碳中的三个是被取代的。在一些实施方案中，对氨基苄基环中四个未取代的碳是被取代的。
可以例如通过1,4消除、1,6-消除(例如，PABC)、1,8消除(例如，对氨基肉桂醇)、β-消除、环化消除(例如，4-氨基丁醇酯和乙二胺)、环化/内酯化、环化/内酯化等发生自分解性消除。参见，例如，Singh等Curr.Med.Chem.15:1802-1826(2008)；Greenwald等J.Med.Chem.43:475-487(2000)。
在一些方面，自分解性间隔子可以包含例如肉桂基、萘基或联苯基(参见，例如，Blencowe等Polym.Chem.2:773-790(2011))。在一些方面，自分解性间隔子包含基于杂环(参见，例如，美国专利号7,375,078；7,754,681)。许多同源芳族(参见，例如，Carl等J.Med.Chem.24:479(1981)；Senter等J.Org.Chem.55:2975(1990)；Taylor等J.Org.Chem.43:1197(1978)；Andrianomenjanahary等Bioorg.Med.Chem.Lett.2:1903(1992))，和香豆素(参见，例如，Weinstein等Chem.Commun.46:553(2010))、呋喃、噻吩、噻唑、噁唑、异噁唑、吡咯、吡唑(参见，例如，Hay等J.Med.Chem.46:5533(2003))、吡啶(参见，例如，Perry-Feigenbaum等Org.Biomol.Chem.7:4825(2009))、咪唑(参见，例如，Nailor等Bioorg.Med.Chem.Lett.Z:1267(1999)；Hay和Denny,Tetrahedron Lett.38:8425(1997))和三唑(参见，例如，Bertrand和Gesson,J.Org.Chem.72:3596(2007))的在水和生理条件下为自分解性的杂芳基是本领域已知的。也参见美国专利号7,691,962；7,091,186；美国专利公布号US2006/0269480；US2010/0092496；US2010/0145036；US2003/0130189；US2005/0256030)。
在一些实施方案中，本发明的促凝血化合物包含一个以上串联的自分解性间隔子，例如，两个或更多个PABC单元。参见，例如，de Groot等J.Org.Chem.66:8815-8830(2001)。在一些实施方案中，本发明的促凝血化合物可包含与荧光探针连接的自分解性间隔子(例如，对氨基苄基醇或对羧基苯甲醛或乙醛酸(glyoxilic acid)的半硫代缩醛胺(hemithioaminal)衍生物(参见，例如，Meyer等Org.Biomol.Chem.8:1777-1780(2010))。
当自分解性接头中的取代基由其从左到右书写的常规化学式指定时，其同样包括将由从右向左书写结构引起的化学上相同的取代基。例如，“-CH2O-“还意在表示“-OCH2-“。在自分解性例如在如上所述的对氨基苄基自分解性接头中的R1和/或R2取代基中的取代基，可以包括例如烷基、亚烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷基氨基、烷硫基、杂烷基、环烃基、杂环烃基、芳基、芳烷基、芳氧基、杂芳基等。当本发明的化合物包括多于一个取代基时，则独立选择每个取代基。
除非另有说明，否则本身或作为另一个取代基的部分的术语“烷基”意指具有指定碳原子数的直链或支链烃基(例如，C1-C10意指一至十个碳原子)。通常，烷基将具有1至24个碳原子，例如具有1至10个碳原子、1至8个碳原子或1至6个碳原子。“低级烷基”为具有1至4个碳原子的烷基。术语“烷基”包括二价和多价基团。例如，在合适的情况下，例如，当该式表示烷基是二价时或者当取代基连接在一起形成环时，术语“烷基”包括“亚烷基”，。烷基基团的实例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基以及例如正戊基、正己基、正庚基和正辛基的同系物和异构体。
本身或作为另一个取代基的一部分的术语“亚烷基”意指二价(二价基团)烷基基团，其中烷基如本文所定义。“亚烷基”的实例不限于-CH2CH2CH2CH2-。通常“亚烷基”将具有1至24个碳原子，例如，具有10个或更少的碳原子(例如，1至8个或1至6个碳原子)。“低级亚烷基”为具有1至4个碳原子的亚烷基。
术语“链烯基”，本身或作为另一个取代基的一部分，是指具有2至24个碳原子和至少一个双键的直链或支链烃基。典型的链烯基具有2至10个碳原子和至少一个双键。在一个实施方案中，链烯基具有2至8个碳原子或2至6个碳原子和1至3个双键。示例性链烯基包括乙烯基、2-丙烯基、1-丁-3-烯基、巴豆基、2-(丁二烯基)、2,4-戊二烯基、3-(1,4-戊二烯基)、2-异戊烯基、1-戊-3-烯基、1-己-5-烯基等。
术语“炔基”，本身或作为另一个取代基的一部分，是指具有2至24个碳原子和至少一个三键的直链或支链、不饱和或多不饱和烃基。典型的“炔基”具有2至10个碳原子和至少一个三键。在本发明的一个方面，炔基具有2至6个碳原子和至少一个三键。示例性炔基包括丙-1-炔基、丙-2-炔基(即，炔丙基)、乙炔基和3-丁炔基。
术语“烷氧基”、“烷基氨基”和“烷硫基”(或硫代烷氧基)以其常规含义使用，并且是指分别通过氧原子、氨基或硫原子连接至分子的其余部分的烷基。
本身或与另一个术语联用的术语“杂烷基”意指由指定数目的碳原子(例如，C2-C10或C2-C8)和选自例如N、O、S、Si、B和P(在一个实施方案中，N、O和S)的至少一个杂原子组成的稳定的、直链或支链烃基团，其中氮、硫和磷原子任选被氧化，并且一个(多个)氮原子任选被季铵化。一个(多个)杂原子被置于杂烷基的任何内部位置。杂烷基的实例包括但不限于-CH2-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2-S(O)-CH3、-CH2-CH2-S(O)2-CH3、-CH＝CH-O-CH3、-CH2-Si(CH3)3、-CH2-CH＝N-OCH3和-CH＝CH-N(CH3)-CH3。至多两个杂原子可以是连续的，诸如例如-CH2-NH-OCH3和–CH2-O-Si(CH3)3。
类似地，本身或作为另一个取代基的一部分的术语“杂亚烷基”意指衍生自杂烷基的二价基团，如例如但不限于-CH2-CH2-S-CH2-CH2-和–CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-。通常，杂烷基将具有3至24个原子(碳原子和杂原子，不包括氢)(3-至24-元杂烷基)。在另一个实例中，杂烷基总共具有3至10个原子(3-至10-元杂烷基)或3至8个原子(3-至8-元杂烷基)。在合适的情况下，例如，当该式表示杂烷基是二价时或者当取代基连接在一起形成环时，术语“杂烷基”包括“杂亚烷基”。
本身或与其它术语联用的术语“环烃基”表示饱和或不饱和的非芳族碳环基团，该基团具有3至24个碳原子，例如具有3至12个碳原子(例如，C3-C8环烃基或C3-C6环烃基)。环烃基的实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、1-环己烯基、3-环己烯基、环庚基等。术语“环烃基”也包括桥连的、多环(例如，双环)结构，诸如降冰片基、金刚烷基和双环[2.2.1]庚基。“环烃基”可以与至少一个(例如，1至3个)选自芳基(例如，苯基)、杂芳基(例如，吡啶基)和非芳族(例如，碳环或杂环)环的其它环稠合。当“环烃基”包括稠合的芳基、杂芳基或杂环时，则“环烃基”通过碳环连接到分子的其余部分。
本身或与其它术语联用的术语“杂环烃基”、“杂环的”、“杂环”或“杂环基”表示本领域技术人员已知的稳定组合的含有至少一个并且多达5个选自例如，N、O、S、Si、B和P(例如，N、O和S)的杂原子的碳环非芳环(例如，3-至8-元环和例如，4-、5-、6-或7-元环)，其中氮、硫和磷原子任选被氧化，并且一个(多个)氮原子任选被季铵化(例如，1至4个选自氮、氧和硫的杂原子)，或含有至少一个并且多达10个杂原子(例如，1至5个选自N、O和S的杂原子)的4-至8-元环的稠环系统。示例性的杂环烃基包括稠合的苯基环。当“杂环”基包括稠合的芳基、杂芳基或环烃基环时，则“杂环”基通过杂环连接到分子的其余部分。杂原子可以占据杂环与分子的其余部分连接的位置。
本发明的示例性杂环烃基或杂环基包括吗啉基、硫代吗啉基、硫代吗啉基S-氧化物、硫代吗啉基S,S-二氧化物、哌嗪基、高哌嗪基、吡咯烷基、吡咯啉基、咪唑烷基、四氢吡喃基、哌啶基、四氢呋喃基、四氢噻吩基、哌啶基、高哌啶基、高吗啉基、高硫代吗啉基(homothiomorpholinyl)、高硫代吗啉基S,S-二氧化物、噁唑烷酮基、二氢吡唑基、二氢吡咯基、二氢吡唑基、二氢吡啶基、二氢嘧啶基、二氢呋喃基、二氢吡喃基、四氢噻吩基S-氧化物、四氢噻吩基S,S-二氧化物、高硫代吗啉基S-氧化物、1-(1,2,5,6-四氢吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-吗啉基、3-吗啉基、四氢呋喃-2-基、四氢呋喃-3-基、四氢噻吩-2-基、四氢噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基等。
“芳基”意指具有单环(例如，苯基)或稠合到其它芳族或非芳族环(例如，1至3个其它环)的5-、6-或7-元芳族碳环基。当“芳基”包括非芳环(诸如在1,2,3,4-四氢萘基中)或杂芳基时，则“芳基”通过芳环(例如，苯环)连接到分子的其余部分。芳基为任选取代的(例如，具有本文所述的1至5个取代基)。在一个实例中，芳基具有6至10个碳原子。芳基的非限制性实例包括苯基、1-萘基、2-萘基、喹啉、茚满基、茚基、二氢萘基、芴基、四氢萘基、苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯基或6,7,8,9-四氢-5H-苯并[a]环庚烯基。在一个实施方案中，芳基选自苯基、苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯基和萘基。在另一个实施方案中，芳基为苯基。
术语“芳烷基(arylalkyl)”或“芳烷基(aralkyl)”旨在包括其中芳基或杂芳基与烷基连接以生成基团-烷基-芳基和-烷基-杂芳基(其中烷基、芳基和杂芳基如本文所定义)的那些基团。示例性的“芳烷基”或“芳烷基”包括苄基、苯乙基、吡啶基甲基等。
“芳氧基”意指基团-O-芳基，其中芳基如本文所定义。在一个实例中，芳氧基的芳基部分是苯基或萘基。在一个实施方案中，芳氧基的芳基部分为苯基。
术语“杂芳基”或“杂芳族”是指含有至少一个选自N、O、S、Si和B(例如，N、O和S)的杂原子(例如，1至5个杂原子，诸如1-3个杂原子)的多不饱和的5-、6-或7-元芳族部分，其中氮和硫原子任选被氧化，并且一个(多个)氮原子任选被季铵化。“杂芳基”可以是单环或与其它芳基、杂芳基、环烃基或杂环烃基环(例如，1至3个其它环)稠合。当“杂芳基”包括稠合的芳基、环烃基或杂环烃基环时，则“杂芳基”通过杂芳环连接到分子的其余部分。杂芳基可通过碳或杂原子连接到分子的其余部分。
在一个实例中，杂芳基具有4至10个碳原子和选自O、S和N的1至5个杂原子。杂芳基的非限制性实例包括吡啶基、嘧啶基、喹啉基、苯并噻吩基、吲哚基、二氢吲哚基、哒嗪基、吡嗪基、异吲哚基、异喹啉基、喹唑啉基、喹喔啉基、酞嗪基、咪唑基、异噁唑基、吡唑基、噁唑基、噻唑基、吲哚嗪基、吲唑基、苯并噻唑基、苯并咪唑基、苯并呋喃基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、噁二唑基、噻二唑基、三唑基、四唑基、异噻唑基、萘啶基、异色满基、色满基、四氢异喹啉基、异二氢吲哚基、异苯并四氢呋喃基、异苯并四氢噻吩基、异苯并噻吩基、苯并噁唑基、吡啶并吡啶基、苯并四氢呋喃基、苯并四氢噻吩基、嘌呤基、苯并间二氧杂环戊烯基(benzodioxolyl)、三嗪基、蝶啶基、苯并噻唑基、咪唑并吡啶基、咪唑并噻唑基、二氢苯并异噁嗪基(dihydrobenzisoxazinyl)、苯并异噁嗪基(benzisoxazinyl)、苯并噁嗪基、二氢苯并异噻嗪基(dihydrobenzisothiazinyl)、苯并吡喃基、苯并噻喃基、色酮基、色满酮基(chromanonyl)、吡啶基-N-氧化物、四氢喹啉基、二氢喹啉基、二氢喹啉酮基、二氢异喹啉酮基、二氢香豆素基、二氢异香豆素基、异二氢吲哚酮基(isoindolinonyl)、苯并二噁烷基、苯并噁唑啉酮基(benzoxazolinonyl)、吡咯基N-氧化物、嘧啶基N-氧化物、哒嗪基N-氧化物、吡嗪基-N-氧化物、喹啉基-N-氧化物、吲哚基N-氧化物、二氢吲哚基N-氧化物、异喹啉基N-氧化物、喹唑啉基N-氧化物、喹喔啉基N-氧化物、酞嗪基N-氧化物、咪唑基N-氧化物、异噁唑基N-氧化物、噁唑基N-氧化物、噻唑基N-氧化物、吲哚嗪基N-氧化物、吲唑基N-氧化物、苯并噻唑基N-氧化物、苯并咪唑基N-氧化物、吡咯基N-氧化物、噁二唑基N-氧化物、噻二唑基N-氧化物、三唑基N-氧化物、四唑基N-氧化物、苯并噻喃基S-氧化物、苯并噻喃基S,S-二氧化物。示例性杂芳基包括咪唑基、吡唑基、噻二唑基、三唑基、异噁唑基、异噻唑基、咪唑基、噻唑基、噁二唑基和吡啶基。其它示例性杂芳基包括1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-异噁唑基、4-异噁唑基、5-异噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、吡啶-4-基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基、6-喹啉基。每个上述芳基和杂芳基环系统的取代基选自下述可接受的芳基取代基。
C.蛋白酶可切割的底物(Zy)
本发明的促凝血化合物包含与自分解性间隔子(Bx)连接的蛋白酶可切割的底物(Zy)。在一些实施方案中，本发明的促凝血化合物包含单个蛋白酶可切割的底物。在其它实施方案中，特别是存在一个以上促凝血多肽(例如，凝血因子或促凝血肽)或一个或多个包含多肽序列的异源部分的实施方案中，另外的蛋白酶可切割的底物部分(单独或与自分解性间隔子串联)可与促凝血多肽或异源部分的N-末端序列连接。在一些实施方案中，蛋白酶可切割的底物部分(单独或与自分解性间隔子串联)可与包含肽接头的接头(L)的N-末端连接。
因此，本发明的促凝血化合物可包含Zy-Bx-Pep1模块，并且进一步包含例如，一个或多个以下的另外的模块：
Zy-Het(其中Het是Het1或Het2)，
Zy-Bx-Het(其中Het是Het1或Het2)，
Zy Pep(其中如果促凝血化合物包含两个以上多肽，则Pep是Pep2或另外的多肽)
Zy-Bx-Pep(其中如果促凝血化合物包含两个以上多肽，则Pep是Pep2或另外的多肽)，其中所述另外的模块与Zy-Bx-Pep1模块的N-末端或C-末端共价连接，并且任选地一个或多个接头或异源部分插入Zy-Bx-Pep1和另外的模块之间。
在一些实施方案中，当存在一个以上蛋白酶可切割的底物时，该底物可被相同或不同的蛋白酶切割。在蛋白酶可切割的底物被相同的蛋白酶切割的实施方案中，所述蛋白酶可切割的底物可以相同或可以不同。
在一些实施方案中，蛋白酶可切割的底物是通过一种或多种蛋白酶(例如，血凝级联蛋白酶)进行酶切的选择性底物。血凝级联蛋白酶包括但不必要地限于凝血酶、FVIIa、FIXa、FXa、FXIa和FXIIa。
本文使用的术语“血凝级联”是指内源性、外源性和常见途径。内源性凝血途径导致形成与FVIIIa结合的FIXa，并且FX、磷脂和Ca2+生成FXa。外源性途径在组合组织因子和FVII后生成FXa和FIXa。常见凝血途径与凝血因子FV、FVIII、FIX和FX相互作用以将凝血酶原切割成凝血酶(FIIa)，凝血酶然后能将纤维蛋白原切割成纤维蛋白。
在一些实施方案中，蛋白酶可切割的底物包含选自以下的蛋白酶的切割位点：中性溶酶(CALLA或CDlO)、甲拌磷寡肽酶(TOP)、白三烯A4水解酶、内皮缩血管肽转化酶、ste24蛋白酶、溶神经素、线粒体中间肽酶、间质胶原酶、胶原酶、溶基质素、巨噬细胞弹性酶、基质溶解因子、明胶酶、跨膜肽酶(meprins)、前胶原C-内肽酶、前胶原N-内肽酶、ADAM和ADAMT金属蛋白酶、髓磷脂相关的金属蛋白酶、釉质溶素(enamelysin)、肿瘤坏死因子α-转换酶、胰岛素溶酶(insulysin)、nardilysin、线粒体处理肽酶、magnolysin、dactylysin样金属蛋白酶、嗜中性粒细胞胶原酶、基质金属蛋白酶、膜型基质金属蛋白酶、SP2内肽酶、前列腺特异性抗原(PSA)、纤溶酶、尿激酶、人成纤维细胞活化蛋白质(FAPα)、胰蛋白酶、糜蛋白酶、降钙蛋白酶(caldecrin)、胰弹性蛋白酶、胰内肽酶、肠肽酶、白细胞弹性蛋白酶、成髓细胞、糜蛋白酶类(chymase)、类胰蛋白酶、粒酶、角质层糜蛋白酶、顶体蛋白酶、激肽释放酶、补体成分和因子、替代补体途径c3/c5转换酶、甘露糖结合蛋白相关的丝氨酸蛋白酶、凝固因子、凝血酶、蛋白c、u和t型纤溶酶原活性剂、组织蛋白酶G、肝丝酶(hepsin)、丝氨酸蛋白水解酶(prostasin)、肝细胞生长因子活化内肽酶、枯草杆菌蛋白酶/kexin型前蛋白转化酶、弗林蛋白酶、前蛋白转化酶、脯氨酰肽酶、酰基氨基酰基肽酶、肽基-glycaminase、信号肽酶、n-末端亲核试剂氨基水解酶、20s蛋白酶体、γ-谷氨酰转肽基酶、线粒体内肽酶、线粒体内肽酶Ia、htra2肽酶、蛋白裂解酶(matriptase)、位点1蛋白酶、天冬酰胺内肽酶(legumain)、组织蛋白酶、半胱氨酸组织蛋白酶、钙蛋白酶、泛素异肽酶T、胱天蛋白酶、糖基磷脂酰肌醇蛋白转酰胺基酶、癌症促凝血剂、激素原硫醇蛋白酶、γ-谷氨酰基水解酶、博莱霉素水解酶、成纤维细胞活化蛋白(seprase)、组织蛋白酶D、胃蛋白酶(pepsin)、凝乳酶(chymosyn)、胃亚蛋白酶(gastricsin)、肾素、酵母天冬酶(yapsin)和/或memapsin、前列腺特异性抗原(PSA)或其任意组合。参见，例如，Kohchi等Bioorganic&Medicinal ChemistryLetters 17:2241-2245(2007)；Brady等J.Med.Chem.45:4706-4715(2002)。
在具体的实施方案中，蛋白酶可切割的底物在损伤位点选择性地被凝血酶切割。在一些实施方案中，蛋白酶可切割的底物在体外(例如，当本发明的促凝血肽用于诊断或可视化时)选择性地被凝血酶切割。非限制性示例性凝血酶可切割的底物包括例如，DFLAEGGGVR(SEQ ID NO:4)、TTKIKPR(SEQ ID NO:5)或LVPRG(SEQ ID NO:6)，或包含以下、基本由以下组成或由以下组成的序列：ALRPR(SEQID NO:7)(例如，ALRPRVVGGA(SEQ ID NO:16))。
在具体的实施方案中，凝血酶可切割的底物包含序列ALRPR(SEQ ID NO:7)、ALVPR(SEQ ID NO:17)、LVPR(SEQ ID NO:18)、D-Phe-Pro-Arg(SEQ ID NO:19)、D-Ala-Leu-Val-Pro-Arg(SEQ ID NO:20)或D-Phe-Pip-Arg(Pip＝哌啶酸)(SEQ ID NO:21)(参见，例如，Tung等,ChemBioChem 3:207-2011(2002)；Jaffer等Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.22:1929-1935(2002)；Rijkers等Thrombosis Research 79:491-499(1995))。许多合成的凝血酶可切割的底物是本领域已知的(参见，例如，Izquierdo&Burguillo,Int.J.Biochem.21:579-592(1989)；WO1992/007869)。凝血酶的共有切割位点已经被识别为P3-疏水性、P2-Pro、Pip、P3-Arg或与Arg等排的(isosteric)和等电子的；例如，D-Phe-Pip-Lys(SEQ ID NO:22)、D-Phe-Pro-Lys(SEQ ID NO:23)、D-Phe-Pip-Orn(SEQ ID NO:24)。也参见，Gallwitz等，PLoS ONE 7(2):e31756.doi:10.1371/journal.pone.0031756(2012)；Tanihara等Peptides 19:421-425(1998)；Rijkers等Thrombosis 79:491-499(1995)。
在一些实施方案中，蛋白酶可切割的底物包含FXIa切割位点(例如，KLTR↓AET(SEQ ID NO:25))、FXIa切割位点(例如，DFTR↓VVG(SEQ ID NO:26))、FXIIa切割位点(例如，TMTR↓IVGG(SEQ ID NO:27))、激肽释放酶切割位点(例如，SPFR↓STGG(SEQ ID NO:28))、FVIIa切割位点(例如，LQVR↓IVGG(SEQ ID NO:29))、FIXa切割位点(例如，PLGR↓IVGG(SEQ ID NO:30))、FXa切割位点(例如，IEGR↓TVGG(SEQ ID NO:31))、FIIa(凝血酶)切割位点(例如，LTPR↓SLLV(SEQ ID NO:32))、弹性蛋白酶-2切割位点(例如，LGPV↓SGVP(SEQ ID NO:33))、颗粒酶-B切割位点(例如VAGD↓SLEE(SEQ ID NO:34))、MMP-12切割位点(例如，GPAG↓LGGA(SEQ ID NO:35))、MMP-13切割位点(例如，GPAG↓LRGA(SEQ ID NO:36))、MMP-17切割位点(例如，APLG↓LRLR(SEQ ID NO:37))、MMP-20切割位点(例如，PALP↓LVAQ(SEQ ID NO:38))、TEV切割位点(例如，ENLYFQ↓G(SEQ ID NO:39))、肠激酶切割位点(例如，DDDK↓IVGG(SEQ ID NO:40))、蛋白酶3C(PRESCISSIONTM)切割位点(例如，LEVLFQ↓GP(SEQID NO:41))和分选酶A切割位点(例如，LPKT↓GSES)(SEQ ID NO:42)。在某些实施方案中，FXIa切割位点包括但不限于例如，TQSFNDFTR(SEQ ID NO:2)和SVSQTSKLTR(SEQ ID NO:3)。
D.接头(L)
如上所述，本发明的促凝血化合物可包含一个或多个接头。本文使用的术语“接头”(在本文公开的式中表示为L)是指肽或多肽序列(例如，合成肽或多肽序列)，或非肽接头，其主要功能是用于连接本发明的促凝血化合物中的两个部分(例如，Het1、Het2、Pep1、Pep2、Bx)。接头可存在于本发明的促凝血化合物的任意两个部分或非接头元件之间。例如，一个或多个接头可存在于蛋白酶可切割的底物(例如，凝血酶可切割的底物)和异源部分之间、或在蛋白酶可切割的底物和多肽(例如，促凝血肽、凝血因子或非促凝血多肽)之间、或在第一多肽和第二多肽之间、或在第一异源部分和第二异源部分之间。在一些实施方案中，两个或更多个接头可以串联连接。
当本发明的促凝血化合物中存在多个接头时，每个接头可以是相同或不同的。通常，接头给多肽分子提供灵活性。接头通常不被切割；然而，在某些实施方案中，此类切割可以是期望的。因此，在一些实施方案中，接头可包含一个或多个蛋白酶可切割的位点，该位点可位于接头序列内或与接头序列的任一端侧接。
在一些实施方案中，所述接头是肽接头。在一些实施方案中，肽接头可包含至少两个氨基、至少三个、至少四个、至少五个、至少10个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个或至少100个氨基酸。在其它实施方案中，肽接头可包含至少200个、至少300个、至少400个、至少500个、至少600个、至少700个、至少800个、至少900个或至少1,000个氨基酸。在一些实施方案中，肽接头可包含至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900或2000个氨基酸。肽接头可包含1-5个氨基酸、1-10个氨基酸、1-20个氨基酸、10-50个氨基酸、50-100个氨基酸、100-200个氨基酸、200-300个氨基酸、300-400个氨基酸、400-500个氨基酸、500-600个氨基酸、600-700个氨基酸、700-800个氨基酸、800-900个氨基酸或900-1000个氨基酸。
肽接头的实例在本领域是公知的，例如根据式[(Gly)x-Sery]z(其中x为1至4、y为0或1、且z为1至50)的肽接头。在一个实施方案中，肽接头包含序列Gn，其中n可以是1至100的整数。在具体的实施方案中，所述具体的实施方案中，肽接头的序列为GGGG。肽接头可包含序列(GA)n。肽接头可包含序列(GGS)n。在其它实施方案中，肽接头包含序列(GGGS)n(SEQ ID NO:43)。在其它实施方案中，肽接头包含序列(GGS)n(GGGGS)n(SEQ ID NO:44)。在这些情况下，n可以是1-100的整数。在其它情况下，n可以是1-20的整数，即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。接头的实例包括但不限于GGG、SGGSGGS(SEQ ID NO:45)、GGSGGSGGSGGSGGG(SEQ ID NO:46)、GGSGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:47)、GGSGGSGGSGGSGGSGGS(SEQ ID NO:48)或GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:49)。在其它实施方案中，接头是多聚G序列(GGGG)n(SEQ ID NO:50)，其中n可以是1-100的整数。
在一个实施方案中，多肽接头是合成的，即，非天然存在的。在一个实施方案中，肽接头包括肽(或多肽)(例如，天然或非天然存在的肽)，其包含连接或基因融合第一线性氨基酸序列与第二线性氨基酸序列的氨基酸序列，其与第二线性氨基酸序列为非天然地连接或天然地基因融合。例如，在一个实施方案中，肽接头可包含非天然存在的多肽，其为天然存在的多肽的修饰形式(例如，包含诸如添加、取代或缺失的突变)。在另一个实施方案中，肽接头可包含非天然存在的氨基酸。在另一个实施方案中，肽接头可包含天然存在的氨基酸，其存在于不存在于自然界的线性序列中。在又一实施方案中，肽接头可包含天然存在的多肽序列。
在一些实施方案中，接头包含非肽接头。在其它实施方案中，接头由非肽接头组成。在一些实施方案中，非肽接头可以是例如马来酰亚胺基己酰基(MC)、马来酰亚胺基丙酰基(MP)、甲氧基聚乙二醇(MPEG)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺基酯(SMCC)、间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、4-(对马来酰亚胺基苯基)丁酸琥珀酰亚胺基酯(SMPB)、N-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(SIAB)、6-[3-(2-吡啶基二硫)-丙酰胺]己酸琥珀酰亚胺基酯(LC-SPDP)、4-琥珀酰亚胺基氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基二硫)甲苯(SMPT)等(参见，例如，美国专利号7,375,078)。
使用本领域已知的技术(例如，化学偶联、重组技术或肽合成)可以将接头引入多肽序列。可通过DNA序列分析确定修饰。在一些实施方案中，使用重组技术可引入接头。在其它实施方案中，使用固相肽合成可引入接头。在某些实施方案中，本发明的促凝血化合物可同时含有已使用重组技术引入的一个或多个接头和已使用固相肽合成或本领域已知的化学偶联方法引入的一个或多个接头。
E.异源部分(例如，Het1、Het2、…、Hetn)
在一些实施方案中，本发明的促凝血化合物可包含一个异源部分(本文称为“Het1”或“Het2”)。在其它实施方案中，本发明的促凝血化合物可包含两个异源部分(“Het1”和“Het2”)。在其它实施方案中，本发明的促凝血化合物可包含两个以上异源部分，例如3、4、5或超过5个异源部分。在一些实施方案中，所有的异源部分是相同的。在一些实施方案中，至少一个异源部分不同于其它异源部分。在一些实施方案中，本发明的促凝血化合物可包含两个、三个或三个以上串联的异源部分。在其它实施方案中，本发明的促凝血化合物可包含两个、三个或更多的异源部分，其中至少另外的部分(例如，促凝血多肽、接头、蛋白酶可切割的底物、自分解性间隔子或其组合)被插入在两个异源部分之间。
异源部分可包含异源多肽部分或异源非多肽部分或两者。在一个具体实施方案中，Het1是第一异源部分，例如本领域已知的半衰期延长分子。在一些实施方案中，Het2是第二异源部分，其也可以是本领域已知的半衰期延长分子。在一些方面，异源部分包含异源多肽和非多肽部分的组合。
在某些实施方案中，第一异源部分(例如，第一Fc区)和第二异源部分(例如，第二Fc区)互相结合以形成二聚体。在一个实施方案中，第二异源部分是第二Fc区，其中所述第二Fc区与第一异源部分(例如，第一Fc区)连接或与第一异源部分关联。例如，第二异源部分(例如，第二Fc区)可与第一异源部分(例如，第一Fc区)通过接头连接或与第一异源部分通过共价或非共价键关联。
在一些实施方案中，Het1和Het2异源部分是当并入本发明的促凝血化合物时具有与体内半衰期延长相关联的未结构化或结构化特征的肽和多肽。非限制性实例包括白蛋白、白蛋白片段、免疫球蛋白的Fc片段、C-末端肽(CTP)的β亚基和人绒毛膜促性腺激素的β亚基、HAP序列、XTEN、转铁蛋白或其片段、PAS多肽、聚甘氨酸接头、聚丝氨酸接头、白蛋白结合部分或这些多肽的任何片段、衍生物、变体或组合。在其它相关方面，异源部分可包括非多肽组分(诸如聚乙二醇(PEG)、羟乙基淀粉(HES)、聚唾液酸或这些元素的任何衍生物、变体或组合)的连接位点(例如，半胱氨酸氨基酸)。在一些方面，异源部分由作为非多肽组分(诸如聚乙二醇(PEG)、羟乙基淀粉(HES)、聚唾液酸、XTEN或这些元素的任何衍生物、变体或组合)的连接位点起作用的半胱氨酸氨基酸组成。
在一些实施方案中，异源部分是包含至少约10、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2500、3000或4000个氨基酸、基本由以上数目的氨基酸组成或由以上数目的氨基酸组成的多肽。在其它实施方案中，异源部分是包含约100至约200个氨基酸、约200至约300个氨基酸、约300至约400个氨基酸、约400至约500个氨基酸、约500至约600个氨基酸、约600至约700个氨基酸、约700至约800个氨基酸、约800至约900个氨基酸或约900至约1000个氨基酸、基本由以上数目的氨基酸组成或由以上数目的氨基酸组成的多肽。
在某些实施方案中，异源部分改善促凝血化合物的一种或多种药代动力学特性而不显著影响Pep1和/或Pep2多肽的生物活性或功能(例如，凝血因子或其片段的促凝血活性，或促凝血合成肽的促凝血活性)。
在某些实施方案中，异源部分增加本发明的促凝血化合物的体内和/或体外半衰期。在其它实施方案中，异源部分促进本发明的促凝血化合物或其片段(例如，在对蛋白酶可切割的底物Zy进行蛋白水解切割后包含异源部分的片段)的可视化或定位。本发明的促凝血化合物或其片段的可视化和/或定位可以在体内、体外、离体或其组合。
在其它实施方案中，异源部分增加本发明的促凝血化合物或其片段(例如，在对蛋白酶可切割的底物Zy进行蛋白水解切割后包含异源部分的片段)的稳定性。本文使用的术语“稳定性”是指本领域公认的响应于环境条件(例如，升高或降低的温度)维持促凝血化合物的一种或多种物理性质的量度。在某些方面，所述物理性质可为维持促凝血化合物的共价结构(例如，不存在蛋白酶水解切割、不希望的氧化和脱酰胺化)。在其它方面，所述物理性质也可以使促凝血化合物呈现正确的折叠状态(例如，不存在可溶性或不溶性聚集物或沉淀)。在一个方面，通过测定促凝血化合物的生物物理学性质，例如热稳定性、pH解折叠性、稳定的去除糖基化、溶解性、生化功能(例如，结合蛋白质、受体或配体的能力)等，和/或其组合来测量促凝血化合物的稳定性。另一方面，通过相互作用的结合亲和力来证实生物化学功能。在一个方面，蛋白质稳定性的量度是热稳定性，即对热挑战的抗性。可以使用本领域已知的方法，诸如HPLC(高效液相色谱)、SEC(尺寸排阻色谱)、DLS(动态光散射)等来测量稳定性。测量热稳定性的方法包括但不限于差示扫描量热法(DSC)、差示扫描荧光法(DSF)、圆二色性(CD)和热挑战试验。
1.半衰期延长的异源部分
在某些方面，本发明的促凝血化合物包含至少一个半衰期延长部分，即使所述促凝血化合物的体内半衰期相对于缺乏此类异源部分的相应促凝血化合物的体内半衰期增加的异源部分。可以通过对本领域技术人员已知的任何方法，例如活性测定(显色测定或一步凝血aPTT测定)、ELISA等来测定促凝血化合物的体内半衰期。
在一些实施方案中，与缺乏此类一个或多个半衰期延长部分的相应促凝血化合物的半衰期相比，一个或多个半衰期延长部分的存在导致促凝血化合物的半衰期增加。包含半衰期延长部分的促凝血化合物的半衰期比缺乏此类半衰期延长部分的相应促凝血化合物的体内半衰期长至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍或至少约12倍。
在一个实施方案中，包含半衰期延长部分的促凝血化合物的半衰期比缺乏此类半衰期延长部分的相应促凝血化合物的体内半衰期长约1.5倍至约20倍、约1.5倍至约15倍或约1.5倍至约10倍。在另一个实施方案中，与缺乏半衰期延长部分的相应促凝血化合物的体内半衰期相比，包含此类半衰期延长部分的促凝血化合物的半衰期被延长约2倍至约10倍、约2倍至约9倍、约2倍至约8倍、约2倍至约7倍、约2倍至约6倍、约2倍至约5倍、约2倍至约4倍、约2倍至约3倍、约2.5倍至约10倍、约2.5倍至约9倍、约2.5倍至约8倍、约2.5倍至约7倍、约2.5倍至约6倍、约2.5倍至约5倍、约2.5倍至约4倍、约2.5倍至约3倍、约3倍至约10倍、约3倍至约9倍、约3倍至约8倍、约3倍至约7倍、约3倍至约6倍、约3倍至约5倍、约3倍至约4倍、约4倍至约6倍、约5倍至约7倍或约6倍至约8倍。
在其它实施方案中，包含半衰期延长部分的促凝血化合物的半衰期为至少约17小时、至少约18小时、至少约19小时、至少约20小时、至少约21小时、至少约22小时、至少约23小时、至少24小时、至少约25小时、至少约26小时、至少约27小时、至少约28小时、至少约29小时、至少约30小时、至少约31小时、至少约32小时、至少约33小时、至少约34小时、至少约35小时、至少约36小时、至少约48小时、至少约60小时、至少约72小时、至少约84小时、至少约96小时或至少约108小时。
在其它实施方案中，包含半衰期延长部分的促凝血化合物的半衰期为约15小时至约两周、约16小时至约一周、约17小时至约一周、约18小时至约一周、约19小时至约一周、约20小时至约一周、约21小时至约一周、约22小时至约一周、约23小时至约一周、约24小时至约一周、约36小时至约一周、约48小时至约一周、约60小时至约一周、约24小时至约六天、约24小时至约五天、约24小时至约四天、约24小时至约三天或约24小时至约两天。
在一些实施方案中，包含半衰期延长部分的促凝血化合物的每个受试者的平均半衰期为约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约24小时(1天)、约25小时、约26小时、约27小时、约28小时、约29小时、约30小时、约31小时、约32小时、约33小时、约34小时、约35小时、约36小时、约40小时、约44小时、约48小时(2天)、约54小时、约60小时、约72小时(3天)、约84小时、约96小时(4天)、约108小时、约120小时(5天)、约6天、约7天(1周)、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天或约14天。
(a)低复杂性多肽
在某些方面，本发明的促凝血化合物包含至少一个含有低组成和/或结构复杂性的多肽(例如，在生理条件下在溶液中没有二级或三级结构的无序多肽)的异源部分。
(b)CTP
在某些方面，本发明的促凝血化合物包含至少一个含有人绒毛膜促性腺激素的β亚基的一个C-末端肽(CTP)、或其片段、变体或衍生物的异源部分。已知插入到重组蛋白的一个或多个CTP肽能增加该蛋白的体内半衰期。参见，例如，美国专利号5,712,122，通过引用整体并入本文。
示例性CTP肽包括DPRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPIL(SEQ ID NO:51)或SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ。(SEQ IDNO:52)。参见，例如，美国专利申请公开号US 2009/0087411 A1，通过引用并入。
(c)免疫球蛋白恒定区(Fc)或其部分
在某些方面，本发明的促凝血化合物包括至少一个Fc区。本文使用的术语“Fc”或“Fc区”意指包含Fc结构域、变体或其片段的功能性新生儿Fc受体(FcRn)结合伴侣，其保持嵌合蛋白中Fc区的理想性质(例如，体内半衰期增加)。各种突变体、片段、变体和衍生物描述于例如PCT公布号WO 2011/069164A2、WO 2012/006623A2、WO2012/006635A2或WO 2012/006633A2中，全部专利通过引用整体并入本文。Fc区由表示CH(恒定重链)结构域的结构域(CH1、CH2等)组成。根据同种型(即IgG、IgM、IgA、IgD或IgE)，Fc区可包含三或四个CH结构域。一些同种型(例如IgG)Fc区还含有铰链区。参见Janeway等2001,Immunobiology,Garland Publishing,N.Y.,N.Y.
用于制备本发明的促凝血化合物的Fc区或其部分可以获自许多不同的来源。在一些实施方案中，Fc区或其部分来源于人免疫球蛋白。然而，应当理解的是Fc区或其部分可来源于另一种哺乳动物物种的免疫球蛋白，包括例如，啮齿类动物(例如小鼠、大鼠、兔、豚鼠)或非人灵长类动物(例如黑猩猩、猕猴)物种。而且，Fc区或其部分可来源于任何免疫球蛋白类，其包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE，以及任何免疫球蛋白同种型，其包括IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。在一个实施方案中，使用人同种型IgG1。
包含免疫球蛋白的Fc区的促凝血化合物赋予嵌合蛋白多种希望的性质，包括增加的稳定性、增加的血清半衰期(参见Capon等,1989,Nature 337:525)以及与Fc受体诸如新生儿Fc受体(FcRn)结合(美国专利号6,086,875、6,485,726、6,030,613；WO 03/077834；US2003-0235536A1)，其通过引用整体并入本文。
在某些实施方案中，本发明的促凝血化合物包含一个或多个截短的Fc区，尽管如此所述截短的Fc区足以给Fc区赋予Fc受体(FcR)结合性质。例如，与FcRn结合的Fc区部分(即，FcRn结合部分)包含根据EU编号的IgG1的大约氨基酸282-438(其主要接触位点为CH2结构域的氨基酸248、250-257、272、285、288、290-291、308-311和314以及CH3结构域的氨基酸残基385-387、428和433-436)。因此，本发明的促凝血化合物的Fc区可包含FcRn结合部分或由FcRn结合部分组成。FcRn结合部分可来源于任何同种型的重链，包含IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。在一个实施方案中，使用来自人同种型IgG1的抗体的FcRn结合部分。在另一实施方案中，使用来自人同种型IgG4的抗体的FcRn结合部分。
在某些实施方案中，Fc区包含以下中的至少一个：铰链(例如，上、中和/或下铰链区)结构域(根据EU编号，抗体Fc区的大约氨基酸216-230)、CH2结构域(根据EU编号，抗体Fc区的大约氨基酸231-340)、CH3结构域(根据EU编号，抗体Fc区的大约氨基酸341-438)、CH4结构域或其变体、部分或片段。在其它实施方案中，Fc部分包含完整的Fc结构域(即，铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域)。在一些实施方案中，Fc区包含以下、基本由以下组成或由以下组成：与CH3结构域(或其部分)融合的铰链结构域(或其部分)、与CH2结构域(或其部分)融合的铰链结构域(或其部分)、与CH3结构域(或其部分)融合的CH2结构域(或其部分)、与铰链结构域(或其部分)和CH3结构域(或其部分)融合的CH2结构域(或其部分)。在其它实施方案中，Fc区缺少CH2结构域(例如，全部或部分CH2结构域)的至少一部分。在具体的实施方案中，Fc区包含或由对应于EU编号221至447的氨基酸组成。
本发明的促凝血化合物的Fc可包括(例如)在一个或多个氨基酸位置处的改变(例如，取代)，其公开于国际PCT公布WO88/07089A1、WO96/14339A1、WO98/05787A1、WO98/23289A1、WO99/51642A1、WO99/58572A1、WO00/09560A2、WO00/32767A1、WO00/42072A2、WO02/44215A2、WO02/060919A2、WO03/074569A2、WO04/016750A2、WO04/029207A2、WO04/035752A2、WO04/063351A2、WO04/074455A2、WO04/099249A2、WO05/040217A2、WO04/044859、WO05/070963A1、WO05/077981A2、WO05/092925A2、WO05/123780A2、WO06/019447A1、WO06/047350A2和WO06/085967A2；美国专利公布号US 2007/0231329、US2007/0231329、US2007/0237765、US2007/0237766、US2007/0237767、US2007/0243188、US2007/0248603、US2007/0286859、US2008/0057056；或美国专利号5,648,260；5,739,277；5,834,250；5,869,046；6,096,871；6,121,022；6,194,551；6,242,195；6,277,375；6,528,624；6,538,124；6,737,056；6,821,505；6,998,253；7,083,784；7,404,956和7,317,091，所述文献各通过引用整体并入本文。在一个实施方案中，特异性变化(例如，本领域公开的一个或多个氨基酸的特异性取代)可产生于一个或多个公开的氨基酸位置处。在另一个实施方案中，可产生于一个或多个公开的氨基酸位置处的不同变化(例如，本领域公开的一个或多个氨基酸位置的不同取代)。
本发明使用的Fc区也可包含本领域公认的改变嵌合蛋白糖基化的氨基酸取代。例如，促凝血化合物的Fc区可包含具有突变的Fc区，所述突变导致减少的糖基化(例如，N-或O-连接的糖基化)，或可包含野生型Fc部分的改变的糖型(例如，低岩藻糖或无岩藻糖聚糖)。
(d)白蛋白或片段或其变体
在某些实施方案中，本发明的促凝血化合物包含含有白蛋白或其功能片段的异源部分。人血清白蛋白(HSA或HA)，其全长形式为609个氨基酸的蛋白质，引起显著比例的血清渗透压，并可用作内源性和外源性配体的载体。本文使用的术语“白蛋白”包括全长白蛋白或其功能片段、变体、衍生物或类似物。白蛋白或片段或其变体的实例公开于美国专利公布号2008/0194481A1、2008/0004206A1、2008/0161243A1、2008/0261877A1或2008/0153751A1或PCT申请公布号2008/033413A2、2009/058322A1或2007/021494A2，其通过引用整体并入本文。
在一个实施方案中，本发明的促凝血化合物包含进一步与选自免疫球蛋白恒定区或其部分(例如，Fc区)、PAS序列、HES、XTEN、PEG或其任意组合的异源部分连接的白蛋白、片段或其变体。
(e)白蛋白结合部分
在某些实施方案中，异源部分是白蛋白结合部分，其包含白蛋白结合肽、细菌白蛋白结合结构域、白蛋白结合抗体片段、脂肪酸或其任意组合。
例如，白蛋白结合蛋白可以是细菌白蛋白结合蛋白、抗体或包括结构域抗体的抗体片段(参见美国专利号6,696,245)。白蛋白结合蛋白(例如)可以是细菌白蛋白结合结构域，诸如链球菌蛋白G中的一种(Konig,T.和Skerra,A.(1998)J.Immunol.Methods 218,73-83)。可用作偶联伴侣的白蛋白结合肽的其它实例为例如具有Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys共有序列的那些白蛋白结合肽，其中Xaa1为Asp、Asn、Ser、Thr或Trp；Xaa2为Asn、Gln、H is、Ile、Leu或Lys；Xaa3为Ala、Asp、Phe、Trp或Tyr；并且Xaa4为Asp、Gly、Leu、Phe、Ser或Thr，如描述于美国专利申请2003/0069395或Dennis等(Dennis等(2002)J.Biol.Chem.277,35035-35043)。
如Kraulis等,FEBS Lett.378:190-194(1996)和Linhult等,ProteinSci.11:206-213(2002)所公开的来自链球菌蛋白G的结构域3为细菌白蛋白结合结构域的实例。白蛋白结合肽的实例包括一系列具有核心序列DICLPRWGCLW(SEQ ID NO:53)的肽。参见，例如，Dennis等,J.Biol.Chem.2002,277:35035-35043(2002)。白蛋白结合肽的一些实例是：
RLIEDICLPRWGCLWEDD       (SEQ ID NO：54)，
QRLMEDICLPRWGCLWEDDF     (SEQ ID NO：55)，
QGLIGDICLPRWGCLWGDSVK    (SEQ ID NO：56)，或
GEWWEDICLPRWGCLWEEED     (SEQ ID NO：57)。
白蛋白结合抗体片段的实例公开于Muller和Kontermann,Curr.Opin.Mol.Ther.9:319-326(2007)；Roovers等,Cancer Immunol.Immunother.56:303-317(2007)和Holt等,Prot.Eng.Design Sci.,21:283-288(2008)，其通过引用整体并入本文。此类白蛋白结合部分的实例为2-(3-马来酰亚胺基丙酰氨基)-6-(4-(4-碘苯基)丁酰氨基)己酸酯(“Albu”标记)，如公开于Trussel等,Bioconjugate Chem.20:2286-2292(2009)。
脂肪酸，尤其是长链脂肪酸(LCFA)和长链脂肪酸类白蛋白结合化合物，可用于延长本发明的促凝血化合物的体内半衰期。LCFA类白蛋白结合化合物的实例是16-(l-(3-(9-(((2,5-二氧代吡咯烷-l-基氧基)羰基氧基)-甲基)-7-磺基-9H-芴-2-基氨基)-3-氧代丙基)-2,5-二氧代吡咯烷-3-基硫基)十六烷酸(参见，例如，WO 2010/140148)。
(f)PAS序列
在其它实施方案中，至少一个异源部分是PAS序列。本文使用的PAS序列意指主要包含丙氨酸和丝氨酸残基或主要包含丙氨酸、丝氨酸和脯氨酸残基的氨基酸序列，所述氨基酸序列在生理条件下形成无规卷曲构象。因此，PAS序列是包含丙氨酸、丝氨酸和脯氨酸、基本由丙氨酸、丝氨酸和脯氨酸组成、或由丙氨酸、丝氨酸和脯氨酸组成的结构单元、氨基酸聚合物或序列盒，其可用作促凝血化合物中异源部分的一部分。然而，本领域技术人员意识到当丙氨酸、丝氨酸和脯氨酸以外的残基作为次要成分加入PAS序列中时，氨基酸聚合物也可以形成无规卷曲构象。
本文使用的术语“次要成分”意指可以某一程度，例如多达约12％，即PAS序列的100个氨基酸中约12个、多达约10％，即PAS序列的100个氨基酸中约10个、多达约9％,即100个氨基酸中约9个、多达约8％，即100个氨基酸中约8个、约6％，即100个氨基酸中约6个、约5％，即100个氨基酸中约5个、约4％，即100个氨基酸中约4个、约3％，即100个氨基酸中约3个、约2％，即100个氨基酸中约2个、约1％，即100个氨基酸中约1个加入PAS序列的丙氨酸、丝氨酸和脯氨酸以外的氨基酸。与丙氨酸、丝氨酸和脯氨酸不同的氨基酸可以选自Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Trp、Tyr或Val。
在生理条件下，PAS序列延伸形成无规卷曲构象，从而可介导增加促凝血化合物的体内和/或体外稳定性。由于无规卷曲结构域不形成稳定结构或通过自身起作用，促凝血化合物中通过Pep1和/或Pep2多肽介导的生物活性基本上被保存。在其它实施方案中，形成无规卷曲结构域的PAS序列是生物学惰性的，特别是相对于血浆中的蛋白水解、免疫原性、等电点/静电行为、与细胞表面受体结合或内化，但仍是可生物降解的，其提供超过合成聚合物诸如PEG的明显优点。
形成无规卷曲构象的PAS序列的非限制性实例包含选自ASPAAPAPASPAAPAPSAPA(SEQ ID NO:58)、AAPASPAPAAPSAPAPAAPS(SEQ ID NO:59)、APSSPSPSAPSSPSPASPSS(SEQ ID NO:60)、APSSPSPSAPSSPSPASPS(SEQ ID NO:61)、SSPSAPSPSSPASPSPSSPA(SEQ ID NO:62)、AASPAAPSAPPAAASPAAPSAPPA(SEQID NO:63)、ASAAAPAAASAAASAPSAAA(SEQ ID NO:64)或其任意组合的氨基酸序列。PAS序列的其它实例从例如美国专利公布号2010/0292130 A1和PCT申请公布号WO 2008/155134 A1中已知。
(g)HAP序列
在某些实施方案中，至少一个异源部分是富含甘氨酸的高氨基酸聚合物(HAP)。HAP序列可包含具有至少50个氨基酸、至少100个氨基酸、120个氨基酸、140个氨基酸、160个氨基酸、180个氨基酸、200个氨基酸、250个氨基酸、300个氨基酸、350个氨基酸、400个氨基酸、450个氨基酸或500个氨基酸长度的甘氨酸的重复序列。在一个实施方案中，HAP序列能延长与HAP序列融合或连接的部分的半衰期。HAP序列的非限制性实例包括但不限于(Gly)n、(Gly4Ser)n或S(Gly4Ser)n，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在一个实施方案中，n为20、21、22、23、24、25、26、26、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40。在另一个实施方案中，n为50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200。
(h)XTEN
在某些方面，本发明的促凝血化合物包含至少一个含有XTEN多肽或片段、变体或其衍生物的异源部分。本文使用的“XTEN序列”是指具有非天然存在的、主要由小的亲水性氨基酸组成的基本上非重复序列的延伸长度的多肽，该序列在生理条件下具有低程度的或不具有二级或三级结构。作为异源部分，XTEN可以用作半衰期延长部分。此外，XTEN可以提供所希望的特性，包括但不限于增强的药物代谢动力学参数和溶解特性。
将包含XTEN序列的异源部分并入本发明的促凝血化合物可以赋予促凝血化合物一种或多种以下有利特性：构象柔性、增强的水溶性、高度的蛋白酶抗性、低免疫原性、与哺乳动物受体的低结合、或增加的流体动力学(或斯托克斯(Stokes))的半径。
在某些方面，XTEN序列可提高药物动力学特性诸如延长的体内半衰期或增加的曲线下面积(AUC)，使得本发明的促凝血化合物保留在体内并且与具有相同但没有XTEN异源部分的促凝血化合物相比，其具有促凝血活性的时间段增加。
在本发明的促凝血化合物中可用作异源部分的XTEN序列的实例公开于例如美国专利号7,855,279和7,846,445，美国专利公布号2009/0092582 A1、2010/0239554 A1、2010/0323956 A1、2011/0046060 A1、2011/0046061 A1、2011/0077199 A1或2011/0172146 A1、2013/0017997 A1或2012/0263701 A1或国际专利公布号WO 2010091122 A1、WO 2010144502 A2、WO 2010144508 A1、WO 2011028228 A1、WO 2011028229 A1或WO 2011028344 A2，或2011年8月19日提交的国际申请号PCT/US2011/48517，所述文献各通过引用整体并入本文。
(i)转铁蛋白或其片段
在某些实施方案中，至少一个异源部分是转铁蛋白或其片段。可以使用任何转铁蛋白来制备本发明的促凝血化合物。例如，野生型人Tf(Tf)是大约为75KDa(不考虑糖基化)的679个氨基酸的蛋白质，有两个似乎起源于基因复制的主要结构域，N(约330个氨基酸)和C(约340个氨基酸)。参见GenBank登录号NM001063、XM002793、M12530、XM039845、XM 039847和S95936(www.ncbi.nlm.nih.gov/)，其全部通过引用整体并入本文。转铁蛋白包含两个结构域，N结构域和C结构域。N结构域包含两个子结构域，N1结构域和N2结构域，并且C结构域包含两个子结构域，C1结构域和C2结构域。
在一个实施方案中，转铁蛋白的异源部分包括转铁蛋白剪切变体。在一个实例中，转铁蛋白剪切变体可以是人转铁蛋白的剪切变体，例如，Genbank登录号AAA61140。在另一个实施方案中，嵌合蛋白的转铁蛋白包括转铁蛋白序列的一个或多个结构域，例如，N结构域、C结构域、N1结构域、N2结构域、C1结构域、C2结构域或其任意组合。
(j)聚合物，例如，聚乙二醇(PEG)
在其它实施方案中，至少一个异源部分为本领域已知的可溶性聚合物，包括但不限于聚乙二醇、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖或聚乙烯醇。在一些实施方案中，包含PEG异源部分的促凝血化合物还包含选自免疫球蛋白恒定区或其部分(例如，Fc区)、PAS序列、HES和白蛋白、片段或其变体、XTEN或其任意组合的异源部分。在其它实施方案中，促凝血化合物包含凝血因子或其片段和PEG异源部分，其中所述促凝血化合物还包括选自免疫球蛋白恒定区或其部分(例如，Fc区)、PAS序列、HES和白蛋白、片段或其变体、XTEN或其任意组合的异源部分。
在其它实施方案中，促凝血化合物包含凝血因子或其片段、第二凝血因子或其片段和PEG异源部分，其中所述促凝血化合物还包含选自免疫球蛋白恒定区或其部分(例如，Fc区)、PAS序列、HES和白蛋白、片段或其变体、XTEN或其任意组合的异源部分。在其它实施方案中，促凝血化合物包含凝血因子或其片段、合成的促凝血多肽和PEG异源部分，其中所述促凝血化合物还包含选自免疫球蛋白恒定区或其部分(例如，Fc区)、PAS序列、HES和白蛋白、片段或其变体、XTEN或其任意组合的异源部分。
在其它实施方案中，促凝血化合物包含两种合成的促凝血肽和PEG异源部分，其中所述促凝血化合物还包含选自免疫球蛋白恒定区或其部分(例如，Fc区)、PAS序列、HES和白蛋白、片段或其变体、XTEN或其任意组合的异源部分。在另一个实施方案中，促凝血化合物包含凝血因子或其片段、凝血因子辅因子(例如，如果凝血因子为因子X，则辅因子为因子Va；或如果凝血因子为因子VII，则辅因子为组织因子)以及PEG异源部分，其中所述促凝血化合物还包含选自免疫球蛋白恒定区或其部分(例如，Fc区)、PAS序列、HES和白蛋白、片段或其变体、XTEN或其任意组合的异源部分。
本发明还提供包含异源部分的本发明的促凝血化合物，所述异源部分可提供另外的优点，诸如增加的可溶性、稳定性和多肽的循环时间、或降低的免疫原性(参见美国专利号4,179,337)。用于修饰的此类异源部分可选自水溶性聚合物，包括但不限于聚乙二醇、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇或其任意组合。
所述聚合物可具有任何分子量，并且可以是支链或非支链的。对于聚乙二醇，在一个实施方案中为便于操作和制造，分子量为约1kDa至约100kDa之间。取决于所需特性(例如，所需的缓释持续时间、是否有对生物活性的任何影响、便于操作、抗原性程度或缺乏抗原性和聚乙二醇对蛋白质或类似物的其它已知影响)，可以使用其它尺寸。例如，聚乙二醇可具有的平均分子量为约200、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10,000、10,500、11,000、11,500、12,000、12,500、13,000、13,500、14,000、14,500、15,000、15,500、16,000、16,500、17,000、17,500、18,000、18,500、19,000、19,500、20,000、25,000、30,000、35,000、40,000、45,000、50,000、55,000、60,000、65,000、70,000、75,000、80,000、85,000、90,000、95,000或100,000kDa。
在一些实施方案中，聚乙二醇可具有分支结构。支链聚乙二醇描述于例如美国专利号5,643,575；Morpurgo等,Appl.Biochem.Biotechnol.56:59-72(1996)；Vorobjev等,Nucleosides Nucleotides 18:2745-2750(1999)；和Caliceti等,Bioconjug.Chem.10:638-646(1999)，所述文献各通过引用整体并入本文。
与本发明的每个促凝血化合物连接的聚乙二醇部分的数目(即，取代度)也可以变化。例如，PEG化的促凝血化合物平均可与1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、17、20或更多个聚乙二醇分子连接。类似地，平均取代度的范围诸如1-3、2-4、3-5、4-6、5-7、6-8、7-9、8-10、9-11、10-12、11-13、12-14、13-15、14-16、15-17、16-18、17-19或18-20聚乙二醇部分/蛋白分子。确定取代度的方法讨论于，例如，Delgado等,Crit.Rev.Thera.Drug Carrier Sys.9:249-304(1992)。
在一些实施方案中，促凝血化合物可以是PEG化的。PEG化的促凝血化合物包含至少一个聚乙二醇(PEG)分子。在其它实施方案中，该聚合物可以是水溶性的。聚合物的非限制性实例可以是聚(环氧烷)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚噁唑啉或聚(丙烯酰基吗啉)。与凝血因子偶联的其它类型的聚合物公开于美国专利号7,199,223。也参见Singh等Curr.Med.Chem.15:1802-1826(2008)。
(k)羟乙基淀粉(HES)
在某些实施方案中，至少一个异源部分是聚合物，例如，羟乙基淀粉(HES)或其衍生物。羟乙基淀粉(HES)是天然存在的支链淀粉的衍生物，并且在体内通过α-淀粉酶降解。HES是碳水化合物聚合物支链淀粉的取代的衍生物，其存在于玉米淀粉中的浓度高达95重量％。HES显示有利的生物学性质，并且在临床中用作血量替代剂和血液稀释治疗(Sommermeyer等,Krankenhauspharmazie,8(8),271-278(1987)；和Weidler等,Arzneim.-Forschung/Drug Res.,41,494-498(1991))。
支链淀粉含有葡萄糖部分，其中在主链中存在α-1,4-糖苷键并且在分支位点可见α-1,6-糖苷键。此分子的物理-化学性质主要由糖苷键的类型决定。由于α-1,4-糖苷键具有切口，产生每圈约6个葡萄糖单体的螺旋结构。该聚合物的物理化学以及生物化学性质可以通过取代改变。羟乙基的引入可以通过碱性羟乙基化实现。通过改变反应条件，可以利用非取代葡萄糖单体中各羟基相对于羟乙基化的不同反应性。由于此事实，技术人员能够有限程度地影响取代模式。
HES主要由分子量分布和取代度表征。与摩尔取代有关的表示为DS的取代度是技术人员已知的。参见Sommermeyer等,Krankenhauspharmazie,8(8),271-278(1987)，如上所引用，特别在第273页。
在一个实施方案中，羟乙基淀粉具有的平均分子量(重均)为1至300kD、2至200kD、3至100kD或4至70kD。羟乙基淀粉还可示出摩尔取代程度为0.1至3，优选0.1至2，更优选0.1至0.9，优选0.1至0.8，并且对于羟乙基C2:C6取代的比率范围为2-20。具有平均分子量为约130kD的HES的非限制性实例为具有取代度0.2至0.8，诸如0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7或0.8，优选0.4至0.7，诸如0.4、0.5、0.6或0.7的HES。
在具体的实施方案中，具有平均分子量为约130kD的HES来自Fresenius的是用于例如用于用于治疗和预防血容量减少的治疗适应症的体积替代的人造胶体。的特征是平均分子量为130,000+/-20,000D，摩尔取代为0.4并且C2:C6比率为约9:1。在其它实施方案中，羟乙基淀粉的平均分子量范围为例如4至70kD或10至70kD或12至70kD或18至70kD或50至70kD或4至50kD或10至50kD或12至50kD或18至50kD或4至18kD或10至18kD或12至18kD或4至12kD或10至12kD或4至10kD。
在其它实施方案中，使用的羟乙基淀粉的平均分子量范围为大于4kD和小于70kD，诸如约10kD，或范围为9至10kD或10至11kD或9至11kD，或约12kD，或范围为11至12kD)或12至13kD或11至13kD，或约18kD，或范围为17至18kD或18至19kD或17至19kD，或约30kD，或范围为29至30，或30至31kD，或约50kD，或范围为49至50kD或50至51kD或49至51kD。
在某些实施方案中，异源部分可以是具有不同的平均分子量和/或不同的取代度和/或不同的C2:C6取代比的羟乙基淀粉的混合物。因此，可使用具有不同的平均分子量和不同的取代度和不同的C2:C6取代比、或具有不同的平均分子量和不同的取代度和相同或大约相同的C2:C6取代比、或具有不同的平均分子量和相同或大约相同的取代度和不同的C2:C6取代比、或具有相同或大约相同的平均分子量和不同的取代度和不同的C2:C6取代比、或具有不同的平均分子量和相同或大约相同的取代度和相同或大约相同的C2:C6取代比、或具有相同或大约相同的平均分子量和不同的取代度和相同或大约相同的C2:C6取代比、或具有相同或大约相同的平均分子量和相同或大约相同的取代度和不同的C2:C6取代比、或具有大约相同的平均分子量和大约相同的取代度和大约相同的C2:C6取代比的羟乙基淀粉的混合物。
(l)聚唾液酸(PSA)
在某些实施方案中，至少一个异源部分是聚合物，例如，聚唾液酸(PSA)或其衍生物。聚唾液酸(PSA)是天然存在的通过某些细菌菌株生产的和在哺乳动物中某些细胞中的唾液酸的非支化聚合物，Roth J.,等(1993)在Polysialic Acid:From Microbes to Man,编辑Roth J.,Rutishauser U.,Troy F.A.(Verlag,Basel,Switzerland),第335–348页。通过限制性酸水解或通过用神经氨酸酶消化或通过天然的细菌来源形式的聚合物的分级分离可以产生从n＝约80或更多个唾液酸残基低至n＝2的各种聚合度。
不同聚唾液酸的组合物也不同，所以存在均聚形式，即包含大肠杆菌(E.coli)K1菌株和B群脑膜炎球菌(meningococci)的荚膜多糖的α-2,8-连接的聚唾液酸，其也发现于神经细胞粘附分子(N-CAM)的胚胎形式。也存在杂聚形式—诸如大肠杆菌菌株K92的交替α-2,8α-2,9聚唾液酸和脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)的C群多糖。具有唾液酸以外的单体的唾液酸也可见于交替共聚物，诸如脑膜炎奈瑟氏菌的W135群或Y群。聚唾液酸具有重要的生物功能，包括通过病原细菌逃避免疫和补体系统以及在胎儿发育期间调节未成熟神经元的神经胶质粘附(其中聚合物具有抗粘功能)Cho和Troy,P.N.A.S.,USA,91(1994)11427-11431，尽管哺乳动物中没有已知的聚唾液酸受体。
大肠杆菌K1菌株的α-2,8-连接的聚唾液酸也称为‘多聚乙酰神经氨酸(colominic acid)’并用(不同长度)来说明本发明。将聚唾液酸与多肽连接或偶联的各种方法已描述于例如，参见美国专利号5,846,951；WO-A-0187922和US 2007/0191597 A1，其通过引用整体并入本文。
(m)清除受体
在某些方面，当促凝血化合物包含含有清除受体、片段、变体或其衍生物的至少一个异源分子时，本发明的促凝血化合物中的治疗性多肽的体内半衰期可以被延长。在其中治疗性肽是因子VIII、因子IX或因子X的具体方面，清除受体的可溶性形式(诸如低密度脂蛋白相关蛋白受体LRP1或其片段)能够阻断因子VIII、因子IX或因子X与清除受体的结合并从而延长其体内半衰期。
LRP1是涉及受体介导的多种蛋白(诸如凝血因子VIII)清除的600kDa的膜内在蛋白。参见，例如，Lenting等,Haemophilia 16:6-16(2010)。LRP1还介导因子Xa(参见，例如，Narita等,Blood 91:555-560(1998))和因子IX(参见，例如，Strickland&Medved.J.Thromb.Haemostat.4:1484-1486(2006)的清除。
其它合适的FVIII清除受体是例如LDLR(低密度脂蛋白受体)、VLDLR(极低密度脂蛋白受体)和巨蛋白(megalin)(LRP-2)或其片段。参见，例如，Bovenschen等,Blood 106:906-912(2005)；Bovenschen,Blood 116:5439-5440(2010)；Martinelli等,Blood 116:5688-5697(2010)。
2.可视化和定位
在某些实施方案中，异源部分促进本发明的促凝血化合物的可视化或定位。用于插入或者偶联至促进可视化或定位的化合物中的许多肽和其它部分是本领域已知的。此类部分可用于促进体外、体内、离体或其任意组合的可视化或者定位。
由于凝血酶在凝血级联反应中起中心作用，其体内活性的成像检测是非常期望的。因此，各种异源部分促进本发明的促凝血化合物的可视化或定位(例如，荧光染料)可促进工程化到本发明的促凝血化合物中。在一些实施方案中，可以将荧光染料工程化成非荧光，直到其胺在凝血酶切割时再生。
能够可视化或定位的肽或多肽的非限制性实例包括可促进基于抗生物素蛋白的试剂和基于链霉亲和素的试剂偶联的生物素受体肽、可促进巯基反应性探针与结合的硫辛酸偶联或直接连接荧光性硫辛酸类似物的硫辛酸受体肽、荧光蛋白例如绿色荧光蛋白(GFP)及其变体(例如，EGFP、YFP诸如EYFP、mVenus、YPet或Citrine或CFP诸如Cerulean或ECFP)或红色荧光蛋白(RFP)、用于连接双砷染料诸如4’,5’-双(1,3,2-二硫代砷杂环戊烷(dithioarsolan)-2-基)荧光素(FlAsH)或用于偶联亚稳态的锝的含有半胱氨酸的肽、用于基于荧光共振能量转移(FRET)邻近测定(proximity assays)的用于偶联铕包合物的肽、其任何变体及其任意组合。
被这些技术标记的本发明的促凝血化合物可用于(例如)病理性血栓形成和溶解的3-D成像、促凝血恶性肿瘤中的肿瘤成像、血液和血浆中促凝血微粒的流式细胞术定量和表征、通过活体显微镜监测血栓形成。
3.靶向部分、锚和其它部分
在一些实施方案中，本发明的促凝血化合物可包含通过将凝血因子或该化合物的促凝血肽定位至凝血位点(“靶向部分”)将化合物靶向具体位置(例如血小板)以增强该化合物的功效的异源部分。在一些实施方案中，靶向部分与血小板上表达的靶向分子结合。优选地，靶向分子不在除血小板之外的细胞或组织上表达，即靶向部分特异性与血小板结合。
在一个实施方案中，在静息血小板上发现的受体/构象被靶向。通过这样做，可对凝血位点进行初用于增强功效。靶向此类分子也可延长凝血因子的半衰期和/或预防清除。此类靶标的实例包括GpIb/V/IX复合物的GpIb和GpVI以及GPIIb/IIIa的非活性形式。参见，例如，Schwarz等Circulation Research.99:25-33(2006)；美国专利公布20070218067；Peterson等Hemostasis,Thrombosis,andVascular Biology 101:937(2003)；WO 2010115866；Lin等Journal ofThrombosis and Haemostasis 8:1773(2010)。
本发明的促凝血化合物可包含一个或多于一个的靶向部分。在一些实施方案中，两个或更多个靶向部分可彼此连接(例如，通过接头)。当本发明的促凝血化合物中存在两个或更多个靶向部分时，所述靶向部分可相同或不同。
在一个实施方案中，靶向部分通过蛋白酶可切割的接头与本发明的促凝血化合物融合，所述接头可被切割以在血块位点除去靶向部分。在另一个实施方案中，靶向部分不通过可切割的接头连接，因此，不在血块位点被切割。
在一个实施方案中，靶向部分定位在促凝血化合物的N-或C-末端。在一个实施方案中，靶向部分不直接与本发明的促凝血化合物基因融合，而是通过接头或化学键与构建体化学连接(参见，例如，美国专利7,381,408)。
在一个实施方案中，本发明的促凝血化合物包含至少一个抗原结合位点(例如，抗体的抗原结合位点、抗体变体或抗体片段)、多肽、配体的受体结合部分或受体的配体结合部分，其与血小板特异性结合，例如，静息血小板或活化血小板。示例性的靶向部分包括scFv分子或结合待靶向分子的肽。
在一些实施方案中，本发明的促凝血化合物包含锚或支架分子，例如脂质、碳水化合物或巯基。例如，N-末端半胱氨酸的巯基可以用于将本发明的促凝血化合物锚定至另一个分子、细胞或其它表面。例如，脂质锚可用于将本发明的促凝血化合物锚定至细胞表面或脂双层(例如脂质体)。
在一些实施方案中，本发明的促凝血化合物可包含含有用于治疗出血病症的非肽活性剂的异源分子。在一些实施方案中，非肽活性剂是促凝血分子。在一些实施方案中，非肽活性剂是小分子药物。
III.药物组合物
本发明还提供含有本发明的至少一种促凝血化合物和药学上可接受的载体的药物组合物。
术语“药学上可接受的载体”意指本领域技术人员已知的所有药学上可接受的成分，其通常被认为是非活性成分。术语“药学上可接受的载体”包括例如溶剂、固体或液体稀释剂、添加剂、媒介物、佐剂、赋形剂、助流剂、粘合剂、成粒剂、分散剂、混悬剂、湿润剂、润滑剂、崩解剂、增溶剂、稳定剂、防腐剂、乳化剂、填充剂、防腐剂(例如，抗氧化剂)、调味剂、甜味剂、增稠剂、缓冲剂、着色剂等以及其任何混合物。示例性载体(例如，赋形剂)描述于例如Handbookof Pharmaceutical Manufacturing Formulations,第1-6卷,Niazi,Sarfaraz K.,Taylor & Francis Group 2005，其通过引用整体并入本文。
药物组合物还可包含(例如)水、缓冲液(例如，中性缓冲盐水或磷酸盐缓冲盐水)、乙醇、矿物油、植物油、二甲亚砜、糖(例如，葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖)、甘露醇、蛋白质、佐剂、多肽或氨基酸(诸如甘氨酸)、抗氧化剂、螯合剂(诸如EDTA或谷胱甘肽)和/或防腐剂的中一个或多个。
药物组合物可以配制成任何合适的施用方式，包括例如局部的(例如，透皮或眼)、经口、颊、鼻、阴道、直肠或肠胃外施用。
本文所用的术语肠胃外包括皮下、皮内、血管内(例如，静脉内)、肌肉内、脊柱、颅内、鞘内、眼内、眼周、眶内、滑膜内和腹膜内注射以及任何类似的注射或输注技术。优选的是，皮下、腹膜内、颊、静脉内和其它肠胃外制剂是无菌的且无内毒素。本发明的促凝血化合物可以以无菌介质经肠胃外施用。
取决于使用的媒介物和浓度，促凝血化合物可以悬浮或溶解于媒介物中。在一个实施方案中，佐剂诸如局部麻醉剂、防腐剂和缓冲剂可以溶解于媒介物中。在一个实例中，使用非静脉内途径，例如，通过皮下、经鼻、颊、经口或经肺递送将本发明的促凝血化合物施用给受试者。
适合于口服使用的形式包括(例如)片剂、含片、锭剂、水混悬剂或油混悬剂、可分散粉剂或颗粒剂、乳剂、硬胶囊或软胶囊或糖浆剂或酏剂。本文提供的组合物可被配制成冻干产物。
药物组合物也可以为例如混悬剂、乳剂、缓释制剂、霜剂、凝胶或粉末。药物组合物可与传统的粘合剂和载体(诸如甘油三酯)被配制成栓剂。
在一个实例中，药物组合物是液体制剂，例如缓冲的等渗水性溶液。在一个实例中，药物组合物具有生理或接近生理的pH。在另一个实例中，含水制剂具有生理或接近生理的摩尔渗透压浓度和盐度。它可以含有氯化钠和/或乙酸钠。
旨在用于口服使用的药物组合物可根据已知的用于制造药物组合物的任何方法来制备。此类药物组合物可含有一种或多种选自甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂的药剂，以便提供药学上优良且可口的制剂。片剂可含有与适合片剂生产的无毒、药学上可接受的赋形剂混合的活性成分。这些赋形剂可以为例如惰性稀释剂，诸如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；成粒剂和崩解剂，例如玉米淀粉或海藻酸；粘合剂，例如淀粉、明胶或阿拉伯胶；以及润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。片剂可以不被包衣，或者它们可以通过已知技术包衣。在一些情况下，此类包衣可以通过已知技术包衣以延缓在胃肠道中的崩解和吸收，并从而在更长的时间内提供持久的作用(即，片剂可被经肠包衣)。例如，可以采用诸如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯的延时材料。
用于口服使用的药物组合物还可呈现为硬明胶胶囊剂，其中活性成分与惰性固体稀释剂(例如碳酸钙、磷酸钙或高岭土)混合，或呈现为软明胶胶囊剂，其中活性成分与水或油介质(例如花生油、液体石蜡或橄榄油)混合。在另一个实施例中，活性成分被配制成含有任选包衣的微片或微丸的胶囊。用于口服使用的药物组合物也可以呈现为锭剂。
水性混悬剂含有与适合水性混悬剂生产的赋形剂混合的一种(多种)活性成分。此类赋形剂包括混悬剂(例如，羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯基-吡咯烷酮、黄蓍胶以及阿拉伯树胶)；和分散剂或润湿剂(例如，天然存在的磷脂(诸如卵磷脂)、环氧烷与脂肪酸的缩合产物(诸如聚氧乙烯硬脂酸酯)、环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物(诸如十七元环氧乙基十六醇)、环氧乙烷与源于脂肪酸和己糖醇的部分酯的缩合产物(诸如聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯)或环氧乙烷与源于脂肪酸和己糖醇酐的部分酯的缩合产物(诸如聚乙烯山梨聚糖单油酸酯))。水性混悬剂也可包含一种或多种防腐剂(例如，对羟基苯甲酸乙酯或正丙酯)、一种或多种着色剂、一种或多种调味剂以及一种或多种甜味剂(诸如蔗糖或糖精)。
油性混悬剂可通过使活性成分混悬于植物油(例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油)或矿物油(诸如液体石蜡)中来配制。油性混悬剂可含有增稠剂，例如蜂蜡、硬石蜡或鲸蜡醇。可添加甜味剂和调味剂以提供可口的口服制剂。这些组合物可通过添加诸如抗坏血酸的抗氧化剂来保存。
适合于通过添加水来制备水性混悬剂的可分散粉剂和成粒剂可提供与分散剂或润湿剂、混悬剂以及一种或多种防腐剂混合的活性成分。适合的分散剂或湿润剂或助悬剂已通过上面提及的那些物质来举例说明。还可存在额外的赋形剂，例如甜味剂、调味剂和着色剂。
本发明的药物组合物还可以为水包油乳剂的形式。油相可以为植物油或矿物油或其混合物。合适的乳化剂可以为天然存在的树胶(例如阿拉伯树胶或黄蓍树胶)、天然存在的磷脂(例如大豆、卵磷脂)和衍生自脂肪酸和己糖醇酐的酯或偏酯(例如失水山梨糖醇单油酸酯)，和所述偏酯与氧化乙烯的缩合产物(例如聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯)。乳剂还可含有甜味剂或调味剂。
糖浆和酏剂可与例如甘油、丙二醇、山梨糖醇、葡萄糖或蔗糖的甜味剂一起配制。此类制剂还可含有缓和剂、防腐剂、调味剂或着色剂。药物组合物可呈无菌可注射水性混悬剂或油性混悬剂形式。可根据已知技术，使用已在以上提及的那些适合的分散剂或润湿剂以及混悬剂来配制这种混悬剂。无菌可注射制剂还可以是在无毒肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或混悬剂，例如在1,3-丁二醇中的溶液。可采用的可接受的媒介物和溶剂为水、林格氏溶液(Ringer'ssolution)和等渗氯化钠溶液。此外，通常采用无菌不挥发性油作为溶剂或悬浮介质。为了这个目的，可采用任何温和不挥发性油，包括合成的单甘油酯或二甘油酯。另外，诸如油酸的脂肪酸在可注射制剂中获得使用。
本发明的促凝血化合物也可以以栓剂的形式施用，例如用于药物的直肠施用。这些药物组合物可通过将药物与适合的无刺激赋形剂混合来制备，所述无刺激赋形剂在常温下为固体但是在直肠温度下为液体并因此在直肠中熔融以释放药物。此类材料包括可可脂和聚乙二醇。
可以配制本发明的促凝血化合物用于局部或表面施用，诸如用于局部施用于皮肤、伤口或粘膜，诸如眼睛。用于局部施用的制剂通常包含局部用媒介物与一种(多种)活性剂的组合，有或没有其它任选组分。合适的局部用媒介物和其它组分是本领域熟知的，并且显而易见的是媒介物的选择将取决于具体的物理形式和递送模式。局部用媒介物包括水；有机溶剂诸如醇(例如，乙醇或异丙醇)或甘油；二醇类(例如，丁二醇、异戊二醇或丙二醇)；脂族醇(例如，羊毛脂)；水和有机溶剂的混合物以及有机溶剂诸如醇和甘油的混合物；基于脂质的材料诸如脂肪酸、酰基甘油(包括油诸如矿物油，和源自天然或合成的脂肪)、磷酸甘油酯、鞘脂和蜡；基于蛋白质的材料诸如胶原和明胶；基于硅酮的材料(不挥发性和挥发性)；和烃基材料诸如海绵和聚合物基质。
组合物可进一步包括一种或多种适用于改善所施用制剂的稳定性或有效性的组分，所述施用的制剂诸如稳定剂、混悬剂、乳化剂、粘度调节剂、凝胶剂、防腐剂、抗氧化剂、皮肤渗透增强剂、润湿剂和缓释材料。此类组分的实例描述于Martindale--The ExtraPharmacopoeia(Pharmaceutical Press,London 1993)和Martin(编),Remington's Pharmaceutical Sciences。制剂可包含微囊剂，诸如羟甲基纤维素或明胶微囊剂、脂质体、白蛋白微球剂、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊。
适用于局部施用于眼睛的药物组合物也包括滴眼液，其中活性成分溶解于或悬浮于合适的载体，特别是活性成分的水性溶剂中。抗炎活性成分可以(例如)以0.5％至20％，诸如0.5％至10％，例如约1.5％w/w的浓度存在于此类制剂中。为了治疗目的，本发明的活性化合物通常与一种或多种适用于所指示的施用途径的佐剂组合。该化合物可以与乳糖、蔗糖、淀粉粉末、链烷酸的纤维素酯、纤维素烷基酯、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁、氧化镁、磷酸和硫酸的钠盐和钙盐、明胶、阿拉伯胶、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮和/或聚乙烯醇混合，然后被制成片剂或胶囊剂以便施用。此类胶囊剂或片剂可含有如可以以羟丙基甲基纤维素中活性化合物的分散剂提供的控释制剂。
用于肠胃外施用的制剂可以呈含水或不含水的等渗无菌注射液或混悬剂形式。这些溶液和混悬液可以用具有一种或多种提到的用于口服施用的制剂的载体或稀释剂的无菌粉末或颗粒制备。该化合物可以溶于水、聚乙二醇、丙二醇、乙醇、玉米油、棉籽油、花生油、芝麻油、苯甲醇、氯化钠和/或各种缓冲液。其它佐剂和施用方式在药学领域中广为周知。
可选地，可将活性成分与水包油霜剂基料一起配制成霜剂。如果需要，霜剂基料的水相可包括例如，至少30％w/w的多元醇，诸如丙二醇、丁烷-1,3-二醇、甘露醇、山梨糖醇、甘油、聚乙二醇及其混合物。局部制剂可理想地包括增强活性成分穿过皮肤或其它受感染区域的吸收或渗透的化合物。此类皮肤渗透增强剂的实例包括二甲亚砜及相关类似物。本发明的化合物也可通过透皮装置来施用。在一个实施方案中，使用贮药库(reservoir)和多孔膜类型的贴剂或固体基质种类的贴剂将实现局部施用。在任一情况下，将活性剂从贮药库或微囊剂通过膜连续递送至与接受者的皮肤或粘膜接触的活性剂可渗透的粘合剂内。
如果活性剂提供皮肤被吸收，则将受控并预定的活性剂流施用至所述接受者。在微囊剂的情况中，包封剂也可用作膜。透皮贴剂可包括在具有粘合剂体系的合适的溶剂体系(诸如丙烯酸乳剂和聚酯贴剂)中的化合物。本发明的乳剂的油相可由已知成分以已知方式构成。虽然所述相可仅包含乳化剂，但它可包含至少一种乳化剂与脂肪或油或与脂肪和油两者的混合物。在一个实施方案中，亲水性乳化剂可与用作稳定剂的亲脂性乳化剂一起包括在内。所述相可以(例如)包括油和脂肪。一种(多种)乳化剂与或不与一种(多种)稳定剂一起组成所谓的乳化蜡，并且所述蜡与油和脂肪一起组成所谓的乳化软膏剂基料，该乳化软膏剂基料形成霜剂制剂的油性分散相。
适用于本发明的制剂的乳剂和乳化稳定剂包括Tween 60、Span80、十八醇十六醇混合物、肉豆蔻醇、单硬脂酸甘油酯和月桂基硫酸钠等。用于制剂的合适的油或脂肪的选择是基于实现所需的美容性质，因为可能用于药物乳剂制剂的大多数油中活性化合物的溶解度非常低。因此，霜剂可以(例如)是具有合适的稠度以避免从管或其它容器泄漏的不含油脂、不被染色并且可洗涤的产品。可以使用直链或支链、一元或二元烷基酯诸如二异己二酸酯、硬脂酸异鲸蜡酯、椰子脂肪酸的丙二醇二酯、肉豆蔻酸异丙酯、油酸癸酯、棕榈酸异丙酯、硬脂酸丁酯、2-乙基己基棕榈酸酯或支链酯的混合物。取决于所需的性质，这些可以单独使用或组合使用。或者，可以使用高熔点脂质诸如白色软石蜡和/或液体石蜡或其它矿物油。
药物组合物可以被配制成吸入型制剂，包括喷雾剂、雾剂或气溶胶。对于吸入制剂，本文提供的化合物可以通过本领域技术人员已知的任何吸入方法来递送。此类吸入方法和装置包括但不限于具有推进剂(诸如CFC或HFA或生理和环境可接受的推进剂)的定量吸入器。其它适当的装置是呼吸操作的吸入器、多剂量干粉吸入器和气溶胶雾化吸入器。用于本发明方法的气溶胶制剂通常包括推进剂、表面活性剂和助溶剂并且可装入常规的通过合适的计量阀关闭的气溶胶容器中。
适用于吸入或吹入的制剂包括药学上可接受的水性或有机溶剂、或其混合物中的溶液和混悬剂以及粉末。液体或固体组合物可含有如上所述合适的药学上可接受的赋形剂。该组合物可通过口服或经鼻呼吸道途径施用用于局部或全身作用。组合物可以使用惰性气体喷雾或从喷雾/蒸发装置直接蒸发和呼吸，或者可将喷雾装置连接到面罩(facemask tent)或间歇式正压呼吸器。
吸入剂组合物可包含含有适合于雾化和支气管内使用的活性成分的液体或粉末状组合物，或通过分配计量剂量的气溶胶单元施用的气溶胶组合物。合适的液体组合物包含水性、药学上可接受的吸入剂溶剂(例如，等渗盐水或抑菌水)中的活性成分。通过泵或挤压启动雾化型喷雾分配器或通过任何其它常规装置来施用溶液，用于导致或使所需剂量的液体组合物能吸入到患者的肺中。其中载体是用于施用如例如鼻喷雾剂或如滴鼻剂的液体的合适制剂包括活性成分的水性或油性溶液。
适合用于经鼻施用的制剂或组合物(其中载体是固体)包括具有例如在20至500微米范围内的粒度的粗粉，以其中采用从鼻中吸入(即，通过从拿至靠近鼻的粉剂的容器经鼻道快速吸入)的方式来施用所述粗粉。以说明的方式，合适的粉末组合物包括与乳糖或其它对于支气管施用可接受的惰性粉末充分混合的活性成分的粉末制剂。该粉末组合物可通过气溶胶分配器施用或封装在易碎的胶囊中，该胶囊能被患者插入到刺穿胶囊并以适于吸入的稳定流将粉末吹出的装置中。
药物组合物可配制成缓释制剂(即，制剂诸如在施用后影响调节剂的缓慢释放的胶囊剂)。通常可以使用众所周知的技术来制备此类制剂并且通过例如口服、直肠或皮下植入或通过在所需的靶位点植入来施用。用于此类制剂内的载体是生物相容的，并且也可被生物降解；优选地所述制剂提供调节剂释放的相对恒定水平。缓释制剂内含有的调节剂的量取决于例如植入位置、释放速率和预期的持续时间以及治疗或预防的病状的性质。
在一个实例中，本文提供的药物制剂可包括一种或多种另外的活性剂(即，其它生物活性成分)。在一个实例中，所述另外的活性剂选自被批准用于治疗凝血障碍(诸如血友病A)的已知药物。例如，该药物制剂还可包括凝血因子。
药物组合物可以与提高生物利用度的试剂(诸如有机溶剂)一起配制。例如，Cremophor EL.RTM.(产品号00647/1/63；BASF Aktiengesellschaft,德国)是通过使35摩尔的环氧乙烷与一摩尔蓖麻油反应制备的聚乙氧基化的蓖麻油。它可用于稳定非极性物质在水系统中的乳剂。此外，肽、肽衍生物或双肽可以被并入在内或与蛋白质微米或纳米颗粒结合以改善生物利用度。
合适的微米或纳米颗粒描述于美国专利号5,439,686(Desai等；Vivorx Pharmaceuticals,Inc.,CA)和美国专利号5,498,421(Grinstaff等；Vivorx Pharmaceuticals,Inc.,CA)。适合地，蛋白质纳米颗粒包含人血清白蛋白，特别是人血清白蛋白或其重组形式。WO 2007/077561(Gabbai；Do-Coop Technologies Ltd.,Israel)描述了另一种包含纳米结构和液体的合适载体，本文称为NEOWATERTM。
用于兽医用途，本发明的化合物按照一般的兽医实践作为合适的可接受的制剂施用，并且兽医外科医生将确定将最适合具体动物的给药方案和施用途径。对于非人动物的施用，可将该组合物加入动物饲料或饮用水中。可以方便地配制动物饲料和饮用水组合物，以使动物随其饮食一起摄入治疗上合适量的组合物。也可以方便地将组合物作为用于添加到饲料或饮用水中的预混合物呈现。
从约0.005mg至约80mg/千克体重/天的顺序的剂量水平用于治疗本文所述的疾病和病状(例如，约0.35mg至约5.6g/人患者/天，基于平均70kg的成人体重)。可与载体物质组合以产生单剂型的活性成分的量将根据治疗宿主和特殊施用模式而变化。剂量单位形式将通常含有约1mg至约500mg的活性成分。日剂量可以以每天一至四个剂量施用。在皮肤病状的情况下，它可以(例如)作为本发明化合物的局部制剂每天1至4次应用于受影响的区域。
然而，应理解，任何特殊患者的特定剂量水平将取决于多种因素，包括所用特定化合物的活性、年龄、体重、健康状况、性别、饮食、施用时间、施用途径和排泄率、药物组合和进行治疗的特殊疾病的严重程度。
IV.制备方法
本发明的促凝血化合物可以通过化学合成、重组DNA技术、较大分子的生物化学或酶促片段化、上述的组合或通过任何其它方法来生产。
在一个实例中，该方法包括使用固相肽合成形成所述化合物、或其逆-、反-或逆-反变体的氨基酸序列。制备本发明的促凝血化合物的示例性方法本文描述于实施例1。形成合成肽的其它方法为本领域技术人员所已知。
例如，本发明的促凝血化合物可以使用固相肽合成法合成，如描述于"Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis-A Practical Approach",由W.C.Chan编,P.D.White,Oxford University Press,New York 2000和其中的参考文献。例如，通过9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)基团提供暂时的N-氨基基团保护。例如，使用20％在N,N-二甲基甲酰胺中的哌啶来进行此高度碱不稳定性的保护基团的重复切割。侧链官能度可以被保护成其丁醚(在丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的情况下)、丁酯(在谷氨酸和天冬氨酸的情况下)、丁氧基羰基衍生物(在赖氨酸和组氨酸的情况下)、三苯甲基衍生物(在半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺的情况下)和4-甲氧基-2,3,6-三甲基苯磺酰基衍生物(在精氨酸的情况下)。
固相支持物可以基于由三个单体二甲基丙烯酰胺(骨架单体)、双丙烯酰已二胺(交联剂)和丙烯酰肌胺酸甲酯(官能化剂)构成的聚二甲基-丙烯酰胺聚合物，或可以基于聚乙二醇(PEG)，诸如Rink Amide树脂(例如，NovaPEG Rink Amide)。该肽与树脂间可切割的连接剂可以为酸不稳定的4-羟甲基-苯氧基乙酸衍生物或在C-末端酰胺的情况下，为Rink-amide接头。除天冬酰胺和谷氨酰胺是使用反向的N,N-二环己基碳二亚胺/1-羟基苯并三唑介导的偶合方法加入外，其它所有氨基酸衍生物均可以其预制的对称酸酐衍生物被加入。
或者，可以使用其它肽偶合试剂，诸如O-苯并三唑-N,N,N’,N’-四甲基-脲-六氟-磷酸酯(HBTU)或2-(6-氯-1-H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基铵六氟磷酸酯(HCTU)(例如，原位)。偶合和去保护反应可以使用茚三酮、三硝基苯磺酸或吲咮醌(isotin)测试方法进行监测。合成完成后，例如，通过用含有约5-50％清除剂的95％三氟乙酸处理从树脂支持物上切割下肽并伴随除去侧链保护基团。常用的清除剂为TIPS(三异丙基硅烷)、乙二硫醇、酚、苯甲醚水及其混合物。确切的选择取决于被合成的肽的氨基酸组成。对于含有肽的甲硫氨酸，可以使用例如TIPS(例如，2-5％)和乙二硫醇(例如，2-5％)的混合物。
随后可通过真空蒸发除去三氟乙酸，随后以二乙醚研制得到粗制的肽。任何存在的清除剂可以通过简单的萃取方法除去，低压冻干水相得到不含清除剂的粗制的肽。
用于肽合成的试剂一般可由例如Calbiochem-Novabiochem(UK)或EMD4Biosciences(U.S.)购得。
可以通过诸如尺寸排阻色谱、离子交换色谱、亲和色谱、差异溶解度和反相高效液相色谱技术中的任何一种或其组合实现肽的纯化。可以使用薄层色谱、反相高效液相色谱、质谱(例如，LC-MS)、酸水解后的氨基酸分析以及通过快原子轰击(FAB)质谱进行肽的分析。
也可使用在连续纤维素膜上允许位置可寻址的(positional addressable)、化学合成肽的SPOT-合成(参见，例如，R.Frank,Tetrahedron(1992)48,9217)。
当促凝血肽特别大时，例如大于50个氨基酸或大于100个氨基酸，可以半重组制备本发明的促凝血化合物(参见，例如，美国专利7,381,408；Dawson等Ann.Rev.Biochem.69:923-9600(2000)；Mei,B.等,Blood 116:270-279(2010)；和美国专利申请公布US2006/0115876，所述文献各整体并入本文)。在一个实施方案中，凝血因子或促凝血多肽是重组产生的，然后通过如本文实施例1所述的化学连接被连接至包含可切割的底物和自分解性间隔子的中间体化合物。使用现有的有机化学技术和商业可获得的试剂可进行化学连接。
可以使用本领域已知的正交偶联策略通过偶联本文公开的不同部分(例如，多肽、异源部分、接头、蛋白酶可切割的底物等)来组装本发明的促凝血化合物。在一些实施方案中，此类策略包括例如炔烃、叠氮化物、N-末端Cys、应变炔烃、酮、醛、四嗪-反式-环辛烯及其组合。
在一个方面，可通过使用包含蛋白酶可切割的位点的可切割的多肽例如SUMO来生产本发明的促凝血化合物。小分子泛素样改性剂(或SUMO)是泛素(Ub)和泛素样(Ubl)家族的成员。SUMO翻译后连接至靶蛋白通过与泛素偶联级联(E1-E2-E3酶)类似的酶促级联发生，最终导致Ub/Ubl C-末端残基和底物赖氨酸残基之间的异肽键的形成。
SUMO蛋白酶(一种高度活性的半胱氨酰蛋白酶，也称为Ulp)是来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的Ulp1(Ubl特异性蛋白酶1)的重组片段。SUMO蛋白酶以高度特异性方式切割，识别泛素样(UBL)蛋白(SUMO)的三级结构而非氨基酸序列。蛋白酶可用于切割来自重组融合蛋白的SUMO。SUMO蛋白的序列包括：
SLQDSEVNQEAKPEVKPEVKPFTHTNLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKRQGKEMDSLRFLYDGIRIQADQAPEDLDMEDNDHEAHREQIGG(SEQ ID NO：90)
在一个实施方案中，用于本发明的可切割的多肽包含凝血因子的轻链、凝血因子的截短的重链和蛋白酶可切割的位点，其中蛋白酶可切割的位点插入凝血因子的截短的重链和凝血因子的轻链之间。在另一个实施方案中，可切割的多肽还包含蛋白酶可切割的位点和凝血因子的轻链之间的细胞内加工位点(本文也称为前蛋白转化酶加工位点)。在其它实施方案中，可切割的多肽包含凝血因子的轻链、蛋白酶可切割的位点、凝血因子的截短的重链和异源部分，其中所述蛋白酶可切割的位点插入凝血因子的轻链和截短的重链之间，并且所述异源部分通过任选的接头与凝血因子的截短的重链连接。在其它实施方案中，所述蛋白酶可切割的位点包含可被SUMO蛋白酶切割的SUMO。
在一些实施方案中，异源部分包含半衰期延长的部分。本文其它部分公开了半衰期延长部分的非限制性实例。在某些实施方案中，用于可切割多肽的凝血因子包括FVII或FX。在一些实施方案中，与凝血因子的野生型重链相比，凝血因子的截短的重链在截短的重链的N-末端不包含一个或多个氨基酸。在某些实施方案中，从凝血因子的截短的重链删除的一个或多个氨基酸为对应于在凝血因子的截短的重链缺少的重链的N-末端的2个氨基酸、3个氨基酸、4个氨基酸、5个氨基酸、6个氨基酸、7个氨基酸、8个氨基酸、9个氨基酸、10个氨基酸、11个氨基酸、12个氨基酸、13个氨基酸、14个氨基酸或15个氨基酸。在一个实例中，用于可切割的多肽的凝血因子是因子VII并且一个或多个氨基酸为IVGGKV(SEQ ID NO:83)。在另一个实例中，用于可切割的多肽的凝血因子是因子X并且一个或多个氨基酸为IVGGQE(SEQ ID NO:85)。
在某些实施方案中，本发明涉及制备可切割的多肽的方法，其包括在足以表达所述多肽的条件下用多核苷酸或编码可切割的多肽的载体转染宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞还表达可以加工任何细胞内加工位点，例如2X(RKR)(SEQ ID NO:88)或RRRR(SEQID NO:89)的前蛋白转化酶，例如PACE或PC5。
在一些方面，包含凝血因子的轻链、蛋白酶可切割的位点和凝血因子的截短的重链的可切割的多肽被蛋白酶切割。切割后，所得的构建体因此可以包括至少两条链，包括凝血因子的轻链的第一条链和包括凝血因子的截短的重链的第二条链。在一些实施方案中，与野生型凝血因子相比，凝血因子的截短的重链在N-末端的端缺少一个或多个氨基酸，从而将半胱氨酸暴露在N-末端用于化学连接。在一个实施方案中，截短的重链缺少的氨基酸为六个氨基酸，例如，FVII缺少IVGGKV(SEQ ID NO:83)或FX缺少IVGGQE(SEQ ID NO 85)。在另一个实施方案中，重链缺少的氨基酸为11个氨基酸，例如，FVII缺少IVGGKVCPKGE(SEQ ID NO:84)或FX缺少IVGGQECKDGE(SEQ ID NO:86)。在一些实施方案中，蛋白酶可切割的位点包括SUMO。
在一个方面，本发明包括制备促凝血化合物的方法，其包括在足以切割蛋白酶可切割的位点的条件下使可切割的多肽和蛋白酶组合。在另一个实施方案中，所述方法还包括将硫酯肽加至可切割的多肽中。然后可以将硫酯肽与凝血因子的截短的重链的N-末端融合，形成活化的凝血因子。在一个实例中，硫酯肽包含蛋白酶可切割的底物(Zy)。在另一个实施方案中，硫酯肽包含蛋白酶可切割的底物和自分解性间隔子(Bx)，其中自分解性间隔子插入在蛋白酶可切割的底物和截短的重链之间。在其它实施方案中，硫酯肽包含蛋白酶可切割的底物、自分解性间隔子和一个或多个氨基酸(W)，其中自分解性间隔子插入蛋白酶可切割的底物和一个或多个氨基酸(W)之间。在一个方面，与野生型重链相比，一个或多个氨基酸包含凝血因子的截短的重链缺少的N-末端氨基酸序列。因此，在某些实施方案中，包含蛋白酶可切割的底物、自分解性部分和一个或多个氨基酸(例如，对应于野生型重链的六个氨基酸)的硫酯肽形成包含蛋白酶可切割的底物、自分解性部分和全长重链的蛋白酶可切割的凝血因子。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸包含IVGGKV(SEQ ID NO:83)，其中凝血因子包含因子VII。在某些实施方案中，一个或多个氨基酸包含IVGGQE(SEQ ID NO:85)，其中凝血因子包含因子X。在其它实施方案中，一个或多个氨基酸包含11个氨基酸，例如，FVII包含IVGGKVCPKGE(SEQ ID NO:84)或FX包含IVGGQECKDGE(SEQ ID NO:86))。在其它实施方案中，硫酯肽包含式：Zy-Bx-W，其中Zy是蛋白酶可切割的底物；Bx是自分解性间隔子；并且W是凝血因子的截短的重链缺少的一个或多个氨基酸。在特定的实施方案中，凝血因子的一个或多个氨基酸和截短的重链在融合时产生完整的凝血因子的重链。在其它实施方案中，蛋白酶可切割的底物包含凝血酶切割位点，例如D-Phe-Pip-Arg。在其它实施方案中，自分解性间隔子包含PABC。
各种方法可用于重组生产凝血因子或促凝血肽用于随后并入本发明的促凝血化合物。对于重组生产，编码所述凝血因子或促凝血肽的多核苷酸序列被插入适当的表达载体中，即，包含用于插入的编码序列的转录和翻译的必需元件，或在RNA病毒载体的情况下，用于复制和翻译的必需元件的载体。编码凝血因子或促凝血肽的核酸插入合适的阅读框中的载体。然后将表达载体转染到将表达促凝血多肽的合适的靶细胞中。本领域已知的转染技术包括，但不限于，磷酸钙沉淀(Wigler等1978,Cell 14:725)和电穿孔(Neumann等1982,EMBO,J.1:841)。可使用多种宿主表达载体系统以表达真核细胞中本文所述的促凝血多肽。在一个实施方案中，真核细胞是动物细胞，包括哺乳动物细胞(例如，293细胞、PerC6、CHO、BHK、Cos、HeLa细胞)。
V.治疗方法
本发明还提供用于治疗、改善或预防受试者(例如，人类受试者)中出血疾病或病症的方法。示例性方法包括给有需要的受试者施用治疗有效量的本发明的促凝血化合物或药物组合物/制剂。在一些实施方案中，本发明的促凝血化合物或药物组合物口服施用于所述受试者。
本发明的促凝血化合物和药物组合物可用于预防。本文使用的术语“预防性治疗”是指在出血发作前施用分子。在一个实施方案中，需要一般止血剂的受试者经历或将要经历手术。本发明的促凝血化合物或药物组合物可在手术前或后作为预防药施用。本发明的促凝血化合物或药物组合物可在手术期间或手术后施用以控制急性出血发作。手术可包括但不限于肝移植、肝切除术、牙科手术或干细胞移植。
本发明的促凝血化合物或药物组合物也可用于按需治疗。术语“按需治疗”是指响应于出血发作的症状或在可导致出血的活动之前施用本发明的促凝血化合物或药物组合物。在一个方面，当出血开始时(诸如在损伤后)或当预期出血时(诸如在手术前)，按需治疗可给予受试者。在另一个方面，在增加出血危险的活动(诸如接触运动)之前可以给予按需治疗。
本文使用的治疗(treat、treatment、treating)是指，例如减少疾病或病症的严重度；减少病程的持续时间；改善与疾病或病症相关的一个或多个症状；向患有疾病或病症的受试者提供有益效果，而不一定治愈疾病或病症，或预防与疾病或病症有关的一个或多个症状。
在根据任何上述实施方案的一个实例中，由凝血障碍引起出血疾病或病症。凝血障碍也可以被称为凝血病。在特定实例中，可以用本发明的化合物或药物组合物治疗的凝血病症是血友病或血管性血友病(vWD)。在特定实例中，可以用本发明的化合物或药物组合物治疗的凝血病症是血友病A。
在另一个实例中，与出血疾病或病症有关的出血类型选自关节积血、肌肉出血、口腔出血、流血、流血到肌肉、口腔流血、创伤、头部创伤、消化道出血、颅内流血、腹腔内流血、胸内流血、骨折、中枢神经系统出血、咽后区出血、腹膜后隙出血或骼腰肌鞘出血。
在另一个实例中，患有出血疾病或者病症的受试者需要手术治疗，包括例如手术预防或手术期间管理。在一个实例中，手术选自小手术和大手术。示例性外科手术过程包括拔牙、扁桃腺切除术、腹股沟疝切开术、滑膜切除术、开颅术、骨缝合术、创伤手术、颅内手术、腹腔内手术、胸内手术、关节置换手术(例如，全膝置换、臀部置换等)、心脏手术和剖腹产。
凝血障碍可由至少一个凝血因子(例如，FVIII)的缺陷引起。本发明提供治疗具有至少一个选自维勒布兰德因子(vWF)、FV、FVII、FVIIa、FVIII、FIX、FIXa、FX、FXI和FXa(例如，用于预防和治疗急性出血)的凝血因子缺陷的受试者(例如，人类受试者)的方法。示例性方法包括给受试者施用治疗有效量的本发明的促凝血化合物或药物组合物。
在根据任何上述实施方案的一个实例中，所述受试者为人受试者(例如，人类患者)。在根据任何上述实施方案的另一个实例中，所述受试者(例如人类患者)用至少一种另外的活性剂(例如，批准用于治疗凝血障碍的药物)伴随治疗。在一个实例中，在将本发明的促凝血化合物或药物组合物施用于受试者的同时将所述另外的活性剂施用于受试者。例如，也含有本发明的化合物的药物组合物中含有至少一种另外的活性剂。在另一个实例中，在本发明的化合物的不同时间但在治疗期间将所述另外的活性剂施用于受试者。例如，另外的活性剂与本发明的促凝血化合物或药物组合物交替施用。
对于口服和肠胃外施用于对患者(包括人类患者)，本发明的促凝血化合物的每日剂量水平通常为2至2000mg/成人(即约0.03至30mg/kg)，以单次或分次剂量施用。
单位剂型(例如片剂或胶囊剂)可含有2mg至2000mg促凝血化合物。所述单位剂型可以酌情每天施用一次、两次或多次。医生在任何情况下将确定最适合任何个体患者的实际剂量，并且它随具体患者的年龄、体重和响应而不同。上述剂量是平均情况的示例。当然可以有各个情况，其中更高或更低的剂量范围是应得的，并且这些都在本发明的范围内。
VI.其它方法
本发明还提供增加切割可操作地连接至促凝血多肽(例如，合成的促凝血肽或凝血因子)的蛋白酶切割底物(例如，凝血酶可切割的底物)的功效的方法，所述方法包括使自分解性接头(例如，PABC)与所述促凝血多肽偶联，其中将所述自分解性接头插入蛋白酶可切割的底物和促凝血多肽之间。
在一些实施方案中，当与具有相同序列但不具有自分解性接头的参考促凝血化合物相比时，切割功效提高至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少70％、至少约80％、至少90％或至少约100％。在一些实施方案中，当与具有相同序列但不具有自分解性接头的参考促凝血化合物相比时，切割功效提高至少100％。
在一些实施方案中，当与具有相同序列但不具有自分解性接头的参考促凝血化合物相比时，切割功效为至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍或至少约10倍。在一些实施方案中，当与具有相同序列但不具有自分解性接头的参考促凝血化合物相比时，切割功效为至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约60倍、至少约70倍、至少约80倍、至少约90倍或至少约100倍。
在一些实施方案中，当与具有相同序列但不具有自分解性接头的参考促凝血化合物相比时，其中所述促凝血化合物被对蛋白酶可切割的底物部分特异性的蛋白酶切割快至少10％。在一些实施方案中，当与具有相同序列但不具有自分解性接头的参考促凝血化合物相比时，切割快至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少70％、至少约80％、至少90％或至少约100％。在一些实施方案中，当与具有相同序列但不具有自分解性接头的参考促凝血化合物相比时，切割快至少100％。在一些实施方案中，当与具有相同序列但不具有自分解性接头的参考促凝血化合物相比时，切割快至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍或至少约10倍。
本发明还提供使促凝血肽活化的方法，该方法包括使本发明的促凝血化合物与对所述促凝血化合物中蛋白酶可切割的底物部分特异性的蛋白酶接触，其中所述活化的促凝血肽在对蛋白酶可切割的底物部分进行蛋白水解切割时释放。
本发明还提供使凝血因子活化的方法，该方法包括使本发明的促凝血化合物与对所述促凝血化合物中蛋白酶可切割的底物部分特异性的蛋白酶接触，其中所述活化的凝血因子在对蛋白酶可切割的底物部分进行蛋白水解切割时释放。在一些实施方案中，在对本发明的促凝血化合物进行蛋白水解切割时可以释放一个以上凝血因子(例如，活化的凝血因子)、凝血因子片段(例如，重链或轻链)、促凝血肽(例如，合成的促凝血肽)或其组合。
本发明还提供从异源部分释放促凝血肽的方法，该方法包括使本发明的促凝血化合物与对所述促凝血化合物中蛋白酶可切割的底物特异性的蛋白酶接触，其中所述活化的促凝血多肽在对蛋白酶可切割的底物进行蛋白水解切割时释放。
本发明还提供从异源部分释放凝血因子的方法，该方法包括使本发明的促凝血化合物与对所述促凝血化合物中蛋白酶可切割的底物特异性的蛋白酶接触，其中所述活化的凝血因子在对蛋白酶可切割的底物进行蛋白水解切割时释放。在一些实施方案中，在本发明的促凝血化合物从一个或多个异源部分(例如，PEG)蛋白水解切割时可以释放一个以上凝血因子(例如，活化的凝血因子)、凝血因子片段(例如，重链或轻链)、促凝血肽(例如，合成的促凝血肽)或其组合。在一些实施方案中，一个或一个以上凝血因子(例如，活化的凝血因子)、凝血因子片段(例如，重链或轻链)、促凝血肽(例如，合成的促凝血肽)或其因子组合和异源部分的释放同时发生。在一些实施方案中，一个或一个以上凝血因子(例如，活化的凝血因子)、凝血因子片段(例如，重链或轻链)、促凝血肽(例如，合成的促凝血肽)或其因子组合的释放和异源部分的释放依次发生。
本发明还提供通过用一种或多种蛋白酶处理在释放一个或多个凝血因子、凝血因子片段(例如，重链或轻链)、促凝血肽(例如，合成的促凝血肽)或其组合之前或同时，从本发明的促凝血化合物释放至少一个异源部分的方法，其包括使本发明的促凝血化合物与对所述促凝血化合物中一种或一种以上蛋白酶可切割的底物特异性的一种或多种蛋白酶接触。在一些实施方案中，在蛋白水解释放凝血因子、凝血因子片段(例如，重链或轻链)、促凝血肽(例如，合成的促凝血肽)或其组合之前发生一个、两个、三个或三个以上异源部分的释放。在其它实施方案中，在蛋白水解释放凝血因子、凝血因子片段(例如，重链或轻链)、促凝血肽(例如，合成的促凝血肽)或其组合同时发生一个、两个、三个或三个以上异源部分的释放。在一些实施方案中，两个、三个或三个以上异源部分的释放同时发生。在一些实施方案中，两个、三个或三个以上异源部分的释放依次发生。
现已详细描述本发明，通过参考以下实施例将使本发明得到更清楚的理解，所述实施例包括在本文中只是为了说明目的而不旨在限制本发明。本文所参考的所有专利、专利申请、专利申请公布和其它出版物通过引用整体明确并入本文。
实施例
材料和方法
如下所述的用于肽合成、纯化和表征的材料和方法用于如下实施例中，除非另有说明。
1.固相肽合成
使用9-芴基甲氧基羰基/叔丁基(Fmoc/tBu)化学通过固相肽合成来合成本发明的合成的促凝血肽。使用微波炉或其它装置来完成加热。在大多数情况下，在35mL反应容器中使用NovaPEG Rink Amide树脂(Novabiochem)或NovaPEG TGT树脂(Novabiochem)以0.1mmol规模合成所述肽。用于树脂负载、氨基酸偶合、Fmoc去保护和洗涤步骤的标准方法在CEM Liberty肽合成器(CEM Corp.)上进行，而手动进行肽的三氟乙酸(TFA)切割。
简言之，在5当量的2(6-氯-1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基铵六氟磷酸酯(HCTU)和10当量的二异丙基乙胺(DIPEA)存在下，5当量的溶解在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中的Fmoc保护的氨基酸随后与树脂连接。用于偶合步骤的微波方法是在75℃单偶合(20W持续300秒)，除了半胱氨酸和组氨酸之外，其在50℃偶合(0W持续120秒，20W持续240秒)。在75℃将精氨酸双偶合(0W持续1500秒、20W持续300秒)。在75℃使用5％哌嗪、0.1M在DMF中的1-羟基苯并三唑(HOBt)(45W持续30秒、45W持续180秒)进行Fmoc去保护。大多数氨基酸和偶合试剂购自EMD(EMD MilliporeChemicals)。
在自动化肽合成后，用95％TFA和5％三异丙基硅烷(TIPS)持续2小时或30％在DCM中的六氟异丙醇(HFIP)从树脂上切割下肽。接着，将肽过滤至圆底反应烧瓶中。真空除去溶剂，并将含有肽的浓缩物沉淀并用冰冷的乙醚(Et2O)进一步研磨。通过质谱分析证实合成肽的特性。
2.肽纯化
使用Waters 600控制器和装配有Waters2489UV/可见光检测器和水级分收集器III(Water Fraction Collector III)(Waters Corp.)的泵系统通过制备型反相高效液相色谱(RP-HPLC)来纯化合成的肽。通常在Phenomenex Jupiter C1810微米250x21.20mm RP-HPLC柱(Phenomenex,Inc.)上以20mL/min的流速进行纯化。基于疏水性对乙腈/水(0.1％TFA)梯度进行改进用于每个特定肽。将肽在两个波长228nm和280nm下进行检测，并且通过液相色谱质谱(LC-MS)进一步分析级分。将含有足够纯度的肽的级分混合、快速冷冻并冻干。
3.肽表征
通过LC-MS(具有1200系列泵、自动处理器和UV检测系统的Agilent LC-MS TOF 6220)来表征肽。使用流动相A(水+0.08％甲酸+0.02％三氟乙酸)和B(乙腈+0.08％甲酸+0.02％三氟乙酸)在Phenomenex Jupiter C185微米250x 2.00mm柱上进行LC分离。一般LC方法的梯度为0-70％B，历时12分钟。通过电喷雾电离以正离子模式完成质量测定。通过测量色谱图中UV光在228nm的吸光度来确定肽的纯度。
实施例1
具有PABC自分解性接头的凝血酶可活化的促凝血化合物
称为化合物1至7的七个不同的肽用于本文公开的实验中(表1)。化合物1至6中的序列Ile-Val-Gly-Gly-Gln-Glu对应于FXa凝血因子的重链的6个N-末端氨基酸残基。这些化合物再现凝血酶可切割的底物和自分解性间隔子与凝血因子或其片段的N末端的偶合，在此具体实施例中所述凝血因子为FX。化合物7对应于与PABC和与凝血酶可切割的底物融合的合成的促凝血肽，并且还包括接头和用于连接半衰期延长部分诸如PEG的支架氨基酸异源部分(Cys)。
表1
Pip是哌啶酸。(D-Phe)是D-苯丙氨酸。凝血酶底物的序列用下划线标出。PABC自分解性接头的位置用方框表示。
1.PABC肽(化合物1、4、5和7)的合成
化合物7的合成过程示于图5和图6，并在下文详细解释。化合物1、4和5的合成来自外部，并遵循类似的合成方法。化合物2、3、6如上文材料和方法部分所述合成。
从树脂切割后合成化合物7中的前两个步骤示于图3：
化合物A的合成
Fmoc-Cys(Acm)-Gly-Gly-Gly-Cly-Dphe-Pip-Arg(Pbf)
通过30％HFIP/DCM将化学合成的和完全保护的化合物A肽(Fmoc-Cys(Acm)-Gly-Gly-Gly-Gly-Dphe-Pip-Arg(Pbf))从NovaPEGTGT树脂切割并过滤到圆底反应烧瓶中。真空除去溶剂，并将含有肽的浓缩物沉淀并用冰冷的乙醚(Et2O)进一步研磨。将此物质不经进一步纯化直接使用。ESI-MS m/z:1309.51(MH)+。
化合物B的合成
Fmoc-Cys(Acm)-Gly-Gly-Gly-Gly-Dphe-Pip-Arg(Pbf)-PABOH
(对氨基苄基醇)
在室温下将搅拌的Fmoc-Cys(Acm)-Gly-Gly-Gly-Gly-Dphe-Pip-Arg(Pbf)(化合物A)(268mg,0.2mmol)和对氨基苄基醇(28mg,1.1当量)在THF(2mL)中的溶液用EEDQ(55.6mg,1.1当量)处理。16小时后，将混合物蒸发至干，并将残余物用乙醚研磨。将所得的包含化合物B(Fmoc-Cys(Acm)-Gly-Gly-Gly-Gly-Dphe-Pip-Arg(Pbf)-PABOH(对氨基苄基醇))的白色固体产物通过离心收集并真空干燥(200mg,70％)。ESI-MS m/z:1414.61(MH)+。
化合物C的合成
Fmoc-Cys(Acm)-Gly-Gly-Gly-Gly-Dphe-Pip-Arg(Pbf)-PABC-PNP
在室温下将搅拌的Fmoc-Cys(Acm)-Gly-Gly-Gly-Gly-Dphe-Pip-Arg(Pbf)-PABOH(化合物B)(180mg,0.127mmol)在无水THF(4mL)和DCM(4mL)中的溶液用PNP氯甲酸酯(38.5mg,1.5当量)和无水吡啶(15mg,1.5当量)处理。16小时后，将混合物浓缩至1mL，并使产物沉淀并用冷乙醚研磨。将所得的包含化合物C(Fmoc-Cys(Acm)-Gly-Gly-Gly-Gly-Dphe-Pip-Arg(Pbf)-PABC-PNP)的白色固体产物通过离心收集并真空干燥(150mg,75％)。ESI-MS m/z:1579.61(MH)+。
合成化合物7中包括使蛋白酶可切割的底物/自分解性间隔子与合成的促凝血肽偶联的其余步骤示于图4。
化合物D的合成
rRAPCK(Alloc)LTCIASYCWLFWTGlA-NH2(二硫化物)
如一般方法所述在NovaPEG Rink Amide树脂(0.2mmol)上合成线性肽。通过在37℃将在50％DMSO/H2O中的粗制肽搅拌过夜来形成Cys-Cys二硫键。通过制备型HPLC纯化后获得35mg肽。ESI-MSm/z:1298.17(MH2)2+,865.78(MH3)3+。
化合物E的合成
Fmoc-Dys(Acm)-Gly-Gly-Gly-Dly-Dphe-Pip-Arg(Pbf)-PABC-rRAPCK(Alloc)LTCLASYCWLFWTGlA-NH2(二硫化物)
在室温下将在DMF(1mL)中的Fmoc-Cys(Acm)-Gly-Gly-Gly-Gly-Dphe-Pip-Arg(Pbf)-PABC-PNP(化合物C)(12.5mg,0.008mmol)和rRAPGK(Alloc)LTCLASYCWLFWTGIA(化合物D)(30mg,0.011mmol)用DIEA(6.5μL,5当量)处理。将混合物在黑暗中放置过夜。将粗产物沉淀，并用冷乙醚研磨。所得粗产物通过离心收集、真空干燥，并不经进一步纯化用于下一步。ESI-MS m/z:2018.32(MH2)2+,1345.86(MH3)3+。
化合物7的合成
步骤1
Fmoc-Cys(Acm)-Gly-Gly-Cly-Gly-Dphe-Pip-Arg-PABC-rRAPGK(Alloc)LTCLASYCWLFWTClA-NH2(二硫化物)
将来自前一步骤的Fmoc-Cys(Acm)-Gly-Gly-Gly-Gly-Dphe-Pip-Arg(Pbf)-PABC-rRAPGK(Alloc)LTCLA SYCWLFWTGIA的Pbf去保护在1mL溶剂混合物(72％TFA,5％DMF,5％H2O,18％DCM)中进行75分钟。由于PABC接头在此条件下不稳定，在不同时间点取等分试样以监测反应的进行。在75分钟，加入冷乙醚(50mL)以终止反应。将所得固体通过制备型HPLC纯化，以得到白色粉末(8mg,2步收率为25％)。ESI-MS m/z:1261.83(MH3)3+。
步骤2
Fmoc-Cys(Acm)-Gly-Gly-Gly-Gly-Dphe-Pip-Arg-PABC-rRAPGKLTCLASYCWLFWTGIA-NH2(二硫化物)
在室温下在N2下将MeOH/二噁烷(1:1,180μL)中的Fmoc-Cys(Acm)-Gly-Gly-Gly-Gly-Dphe-Pip-Arg-PABC-rRAPGK(Alloc)LTCLASYCWLFWTGIA(8mg,0.002mmol)用Pd(PPh3)4(0.0002mmol,0.1当量,20μL Pd(PPh3)4的THF溶液(23mg/mL)，然后用PhSiH3(0.01mmol,5当量)处理。20分钟后，将粗混合物沉淀并用冷乙醚研磨。所得粗产物不经纯化用于下一步。ESI-MS m/z:1233.82(MH3)3+。
步骤3
Cys(Acm)-Gly-Cly-Cly-Gly-Dphe-Pip-Arg-PABC-rRAPGKLTCLASYCWLFWTGIA-NH2(二硫化物)(化合物7)
将来自前一步骤的Fmoc-Cys(Acm)-Gly-Gly-Gly-Gly-Dphe-Pip-Arg-PABC-rRAPGKLTCLASYCWLFWTGIA的Fmoc去保护在DMSO(200μL)中用Et2NH(50μL,过量)进行。20分钟后该反应完成，并将混合物通过制备型HPLC纯化，以得到白色粉末SYN 4018(0.83mg,2步收率为12％)。ESI-MS m/z:1159.80(MH3)3+,870.09(MH4)4+。
2.化合物7的凝血酶切割
图5描述了通过凝血酶切割化合物7。用1.4nM于PBS中的凝血酶切割后，释放纯的合成的促凝血肽，以及包含凝血酶底物的分子部分、GGGG接头和N-末端半胱氨酸。为了进行反应，将21μL在水中的肽(0.24mM)加至476.5μL PBS中。将混合物在37℃孵育30分钟，然后加入2.5μL凝血酶(278nM,10μg/mL)，得到下列近似的初始浓度：凝血酶＝1.4nM，肽＝10μM。将混合物在37℃孵育。在不同时间点将等分试样(60μL)用1μL水蛭素(10μM)淬灭并注入HPLC(C-18柱,CH3CN/H2O,0至70％经过12分钟,60℃0.5mL/min,＝280nm)。切割化合物7的动力学示于图6。化合物7被1.4nm凝血酶迅速切割。大约90％的化合物7在30分钟后被切割。
在TGA测定过程期间化合物7也能被完全切割(图7)。在化合物7的TGA测定结束时将血浆转移到冷CH3CN(1mL)中并以13k rpm离心10分钟。将上清液(1.1mL)转移到新的小瓶中并通过speedvac干燥。用30μL H2O将所得固体复溶并注入HPLC进行分析。图7示出对应于化合物7中促凝血肽的峰，表明在TGA测定过程中化合物7被完全切割。
3.化合物1、2和3的凝血酶切割
图8描述化合物1、2和3被14nM凝血酶切割。如上所述，这些化合物包含FXa凝血因子的重链的6个N-末端氨基酸残基，并用作模型来表示本文公开的促凝血化合物设计对凝血因子的适用性。
在此具体实施例中，将50μL在水中的肽(1mM)加至900μL PBS中，然后加入50μL凝血酶(278nM,10μg/mL)，得到下列近似的初始浓度：凝血酶＝14nM，肽＝50μM。将混合物在室温下孵育。在不同时间点的等分试样(95μL)用5μL水蛭素(2μM)淬灭并注入HPLC(C-18柱，CH3CN/H2O，在12分钟内0至70％，60℃0.5mL/min，＝280nm)。肽峰面积的降低用于计算产率。
与化合物2和3相比，并入凝血酶可切割的合成的底物D-Phe-Pip-Arg(SEQ ID NO:21)和自分解性间隔子PABC(化合物1)的构建体是凝血酶更好的底物。PABC至化合物1的合并导致切割速率相比于化合物2增加至少10倍。
4.化合物1、4、5和6的凝血酶切割
图9描述化合物1、4、5和6被1.4nM凝血酶切割。化合物1、4和5并入PABC和不同的凝血酶可切割的底物。
将50μL在水中的肽(1mM)加至900μL PBS中。将混合物在37℃孵育30分钟，然后加入50μL凝血酶(27.8nM,1μg/mL)，得到下列近似的初始浓度：凝血酶＝1.4nM，肽＝50μM。将混合物在37℃孵育。在不同时间点的等分试样(95μL)用5μL水蛭素(2μM)淬灭并注入HPLC(C-18柱，CH3CN/H2O，在12分钟内0至70％，60℃0.5mL/min，＝280nm)。肽峰面积的降低用于计算产率。
化合物1比化合物4和5是凝血酶更好的底物。在1.4nM凝血酶生理相关浓度下，被快速切割并释放30％的化合物1。相反，没有观察到凝血酶介导的肽IVGGQE(SEQ ID NO:85)从不具有PABC接头的化合物6的释放。
实施例2
具有PABC自分解性接头的凝血酶可活化的FX
如上所述的那些肽合成方法等效物、标准的重组蛋白生产方法和标准的化学偶联技术用于产生此实施例中所述的促凝血化合物。
因子X由通过二硫键(Cys172-Cys342)连接的两条多肽链组成：组成Gla结构域和两个EGF的139个氨基酸的轻链；306个氨基酸的重链由与催化结构域结合的活化肽组成。因子X的活化需要活化肽和催化结构域之间的蛋白水解切割。tensase复合物和FVIIa-TF复合物执行Arg234和Ile235残基之间的这种切割(图10)。如在所有丝氨酸蛋白酶中，活化的因子X的催化链的N-末端残基参与酶促活性。产生的N-末端Ile235特别在酶的催化机制中起基本作用。
PCT公布号WO 2004/005347提出用被凝血酶切割的位点替代用于被tenase复合物活化的天然位点。然而，由于切割效率受到使切割位点加框的氨基酸性质的调节，这些凝血酶可活化的FX(TA-FX)类似物经历缓慢活化和不希望的功效。因此期望具有将表现出更快的切割动力学的其它TA-FX类似物。
本发明提供包含合成的凝血酶底物和与FXa连接的自分解性间隔子(例如，PABC)的TA-FX类似物(图11)。在凝血酶底物(D-PhePipArg)的蛋白水解切割和1,6自发片段化后，释放FXa的天然序列(图10)。使用自然化学连接化学半合成地产生TA-FX。此过程涉及使在催化结构域上含有N末端半胱氨酸残基241的重组产生的FX片段(CysFX)与合成产生的硫酯肽反应以在连接位点产生天然的酰胺键。为产生CysFX蛋白，从FX上截短包含重链的6个N-末端氨基酸残基IVGGQE(SEQ ID NO:85)的序列；并且用于被tenase复合物活化的天然位点被切割位点(例如，被PC5切割)替代。
实施例3
具有PABC自分解性接头的凝血酶可活化的FVII
相当于如上所述的那些的肽合成方法、标准的重组蛋白生产方法和标准的化学偶联技术用于产生此实施例中所述的促凝血化合物。
本发明提供包含合成的凝血酶底物和与FVIIa连接的自分解性间隔子(例如，PABC)的凝血酶可活化的FVII(TA-FVII)类似物(图13)。在凝血酶底物(D-PhePipArg)的蛋白水解切割和1,6自发片段化后，释放FVIIa的天然序列(图10)。使用天然化学连接化学半合成地产生TA-FVII。此过程涉及使在催化结构域上含有N末端半胱氨酸残基159的重组产生的FVII片段(CysFVII)与合成产生的硫酯肽反应以在连接位点产生天然的酰胺键。为了产生CysFVII蛋白，从FVII上截短包含重链的6个N-末端氨基酸残基IVGGKV(SEQ ID NO:83)的序列；并且用于被FXa活化的天然位点被切割位点(例如，被PC5切割)替代。
实施例4
具有SUMO切割位点的凝血酶可活化的FVII-186
为了克隆FVII-186，包含FVII-186的HindIII位点至EcoRI位点的核苷酸的DNA序列的合成(表2)来自外部。将DNA亚克隆到pcDNA的HindIII/EcoRI位点。
为了瞬时表达FVII-186，在37℃/10％CO2下HEK-293-F细胞在补充有维生素K3(Sigma Aldrich,St.Louis,MO)的培养基(Invitrogen)的悬浮液中生长至2μg/升(生长培养基)作为悬浮液细胞。通过以5x105细胞/ml的细胞密度接种每3至4天传代培养细胞。在转染前24个小时，在生长培养基中以7x105细胞/ml的密度接种细胞。在转染当天，用等于5％的待转染的细胞培养物的总体积的体积制备转染溶液。在转染溶液中，将DNA(终浓度20mg/L)加至新制备的PEI在生长培养基中的溶液(60mg/L)。将该溶液涡旋30秒并室温下孵育5分钟，然后直接加至细胞培养物中。4小时后，将等于补充有维生素K3和200mM L-谷氨酰胺的OPTICHOTM(Invitrogen)的细胞培养物体积的体积加至细胞中。将细胞培养物如上所示地成长并每日对培养基样本取样评估蛋白表达。在收获当天，使细胞旋转沉降并且将培养基在制剂中过滤，所述制剂通过蛋白质A下拉(pulldown)用于蛋白质纯化或蛋白质分析。为了表达FVII-186，编码FVII-186的质粒用编码前蛋白转化酶PACE的质粒共同转染，以确保在使FVII轻链与SUMO连接的接头中前蛋白转化酶切割位点(2X(RKR)SEQID NO:88)的细胞内加工和切割(图14)。
为了纯化FVII-186，在用2.0M Tris,pH 8.0将pH调节至7.4后，将条件培养基加样到QFast Flow(GE HealthCare LifeSciences)的25-mL柱上。用10mM MES、50mM NaCl，pH 6.5洗涤该柱。用10mM MES、100mM NaCl、20mM CaCl2，pH 6.5稀释蛋白质。在用0.5M MES,pH 5.5将pH调节至6.2后，将含有FVII-186的级分混合并加样至rhFcRn-琼脂糖凝胶的25-mL柱上。用50mMMES,100mM NaCl,pH 6.2洗涤后，用10mM Tris,250mM NaCl,pH8.0洗脱结合的物质并用SDS-PAGE分析。
FVII-186被SUMO蛋白酶如下切割。在室温下将FVII-186(0.83mg/mL,10μL)用10μL含有0.4mM氧化型谷胱甘肽(GSSG)、20mM谷胱甘肽(GSH)、0.2U/μL SUMO蛋白酶(Invitrogen目录号12588-018)的100mM HEPES、20mM CaCl2、0.004％Tween 80孵育48小时。还原型SDS-PAGE(图15，泳道3)示出FVII-186几乎完全转化为所需的FVIIHC。
为了FVII-186的SUMO蛋白酶切割和与硫酯肽的自然化学连接，在室温下将FVII-186(0.83mg/mL,10μL)用10μL含有0.4mMSYN470作为阳性对照肽、0.4mM GSSG、20mM GSH、0.2U/μLSUMO蛋白酶(Invitrogen目录号12588-018)的100mM HEPES、20mM CaCl2、0.004％Tween 80孵育48小时。还原型SDS-PAGE(图15，泳道4)示出FVIIHC带完全消失以及作为阳性肽对照和FVIIHC的偶联物的单条新带。
为了合成凝血酶可活化的FVII-186(TA-FVII-186)，在室温下将FVII-186(0.83mg/mL,200μL)用200μL含有0.4mM FVII-PABC肽(即，生物素-Pra-GGGG-D-Phe-Pip-Arg-PABC-IVGGKV-COSBn)(SEQID NO:79)、0.4mM GSSG、20mM GSH、0.2U/μL SUMO蛋白酶(Invitrogen目录号12588-018)的100mM HEPES、20mM CaCl2、0.004％Tween 80孵育48小时，并通过还原型SDS-PAGE分析(图15，泳道5)。将反应混合物置于具有10k MWCO的0.5mL透析盒中并在4℃用含有1L的0.4mM GSSG、2mM GSH的10mM Tris、250mMNaCl(pH8.0)中透析24小时。通过如所述的rhFcRn-琼脂糖凝胶柱进一步纯化该偶联物。
在凝血酶切割和TA-FVII-186活化后进行FVIIa显色测定(图16)。该测定通过测量FVIIa活化FX的能力来测量FX活化活性，如通过测量由活化的FX(FXa)切割的显色底物的水平测定的。在37℃用凝血酶(140nM)使TA-FVII-186(200nM)活化20分钟。加入水蛭素以使凝血酶淬灭。加入sTF-PL混合物(FVII-rTF试剂盒)、FX和FXa底物，并且通过测量405nm处的吸光度来监测反应。在凝血酶存在下，缺少6个N-末端氨基酸的FVII-186没有活性。只有具有连接至完整重链FVII(其包括FVIIa-PABC肽)的凝血酶切割位点的TA-FVII-186在凝血酶切割后显示活性。所得活性证明FVIIa-PABC肽成功地偶联到FVIIa截短的重链的N-末端半胱氨酸残基、在通过凝血酶切割后产生重要的N-末端异亮氨酸残基，和所形成的蛋白质具有活性基本结构。
实施例5.
具有PACE切割位点的凝血酶可活化的FX-011
为了克隆FX-011，包含FX-011的HindIII位点至NotI位点的核苷酸的DNA序列的合成(表4)来自外部。将DNA亚克隆到pcDNA的HindIII/NotI位点。
为了瞬时表达FX-011，如上所述基本上转染HEK-293-F细胞以获得FX-011的表达。编码FX-011的质粒用编码前蛋白转化酶PACE(20％)的质粒共同转染，以确保接头中前蛋白转化酶切割位点的细胞内加工和切割以及接头的去除(图17)。为了来自瞬时转染的蛋白，条件培养基经历蛋白A免疫沉淀反应。简略地，细胞培养悬浮物与大约50μl蛋白质A-琼脂糖50％浆液混合，并在4℃下摇动孵育1小时，然后离心沉淀蛋白质A小珠。通过在1ml PBS中重悬浮、旋转并且抽吸来清洗小珠两次。在还原或非还原条件下使小珠重悬浮于SDS-PAGE缓冲液，在95℃下加热5分钟，旋转沉降，并根据标准实验加样于SDS-PAGE凝胶上并进行电泳。在非还原条件下，观察到具有FX-011预期分子量的1个条带(图17，泳道3)。在还原条件下，观察到表示不完全加工的活化肽-重链FX-Fc亚基、所需重链FX-Fc亚基和Fc亚基的3个主要条带(图17，泳道2)。将蛋白转移到纤维素膜上并收集对应于重链FX-Fc亚基的条带并分析。N-末端测序证实如预期的在被PACE切割后N-末端半胱氨酸(Cys)残基的存在。
为了纯化FX-011，通过15mL离心过滤单元30,000MWCO(目录#UFC 903008)将条件培养基(200mL)浓缩至10mL。在用0.5MMES,pH 5.5将pH值调节至6.2后，将浓缩的培养基加样至用50mMMES、100mM NaCl的pH 6.2缓冲液平衡的0.5mL rhFcRn-琼脂糖凝胶树脂床上。用pH 6.2的50mM MES、100mM NaCl洗涤后，用pH8.0的10mM Tris、250mM NaCl洗脱结合的物质。偶联之前，通过透析将FX-011转移到20mM HEPES、500mM NaCl、5mM CaCl2的pH 7.4缓冲液中。
为了用硫酯肽通过自然化学连接半合成凝血酶可活化的FX-011(TA-FX-011)，在室温下将FX-011(0.5mg/mL)用0.5mM FX-PABC肽(即，GG-D-Phe-Pip-Arg-PABC-IVGGQE-COSBn)(SEQ ID No__)和20mM在20mM HEPES、500mM NaCl、5mM CaCl2的pH 7.4缓冲液中的2-硫烷基乙磺酸钠(MESNA)孵育16小时。反应通过SDS-PAGE凝胶分析(图18，泳道3)。通过凝胶过滤除去过量的肽和MESNA。将含有TA-FX-011的混合级分置于具有10k MWCO的0.5mL透析盒中，并在4℃下用1L的20mM HEPES、500mM NaCl、5mMCaCl2(pH 7.4)中透析24小时。
在凝血酶切割TA-FX-011后进行FXa显色测定(图19)。在37℃用凝血酶(140nM)使TA-FX-011(200nM)活化20分钟。加入水蛭素以使凝血酶淬灭。加入FXa底物并通过测量405nm处的吸光度来监测反应。在凝血酶存在下，缺少6个N-末端氨基酸的FX-011没有活性。只有具有连接至完整重链FX(其包括FXa-PABC肽)的凝血酶切割位点的TA-FX-011在凝血酶切割后显示活性。所得活性证明FXPABC肽成功地偶联到FX截短的重链的N-末端半胱氨酸残基、在通过凝血酶切割后产生重要的N-末端异亮氨酸残基，并且所形成的蛋白质具有基本活性结构。
实施例6
具有SUMO切割位点的凝血酶可活化的FX-012
为了克隆FX-012，包含FX-012的HindIII位点至NotI位点的核苷酸的DNA序列的合成(表6)来自外部。将DNA亚克隆到pcDNA的HindIII/NotI位点。
FX-012的瞬时表达和蛋白纯化基本上如对于FVII-186所述。在非还原条件下，观察到具有FX-012预期分子量的主要条带(图20，泳道2)。在还原条件下，观察到表示所需SUMO-重链FX-Fc亚基和Fc亚基的2个主要条带(图20，泳道3)。LC带是不可见的。
FX-012被SUMO蛋白酶如下切割。在室温下将FX-012(0.35mg/mL)用0.1U/μL SUMO蛋白酶(Invitrogen目录号12588-018)、20mM在50mM HEPES中的GSH、10mM CaCl2的pH 7.4缓冲液孵育24小时。还原型SDS-PAGE(图21，泳道2)示出FX-012几乎完全转化为所需的FXHC-Fc。
为了FX-012的SUMO蛋白酶切割和与硫酯肽的自然化学连接，在室温下将FX-012(0.35mg/mL)用0.4mM SYN470作为阳性对照肽、0.1U/μL SUMO蛋白酶(Invitrogen目录号12588-018)、20mM在50mM HEPES中的GSH、10mM CaCl2的pH 7.4缓冲液孵育24小时。还原型SDS-PAGE(图21，泳道4)示出FXHC-Fc带完全消失以及作为阳性肽对照和FXHC-Fc的偶联物的单条新带。
为了用硫酯肽通过自然化学连接半合成凝血酶可活化的FX-012(TA-FX-012)，在室温下将FX-012(0.35mg/mL)用0.4mM FX-PABC肽(即，D-Phe-Pip-Arg-PABC-IVGGQE-COSBn)(SEQ ID NO:90)、0.1U/μL SUMO蛋白酶(Invitrogen目录号12588-018)、20mM在50mMHEPES中的GSH、10mM CaCl2的pH 7.4缓冲液孵育24小时。还原型SDS-PAGE(图21，泳道3)示出作为FX-PABC肽和FXHC-Fc的所需偶联物的新条带。将反应混合物置于具有10k MWCO的0.5mL透析盒中并在4℃用含有1L的0.4mM GSSG、2mM GSH的10mMTris、250mM NaCl(pH8.0)中透析24小时。通过如所述的rhFcRn-琼脂糖凝胶柱进一步纯化该偶联物。
在凝血酶切割TA-FX-012后进行FXa显色测定(图22)。在37℃用凝血酶(140nM)使TA-FX-012(200nM)活化20分钟。加入水蛭素以使凝血酶淬灭。加入FXa底物并通过测量405nm处的吸光度来监测反应。在凝血酶存在下，缺少6个N-末端氨基酸的FX-012没有活性。只有具有连接至完整重链FX(其包括FXa-PABC肽)的凝血酶切割位点的TA-FX-012在凝血酶切割后显示活性。所得活性证明FXPABC肽成功地偶联到FX截短的重链的N-末端半胱氨酸残基、在通过凝血酶切割后产生重要的N-末端异亮氨酸残基，并且所形成的蛋白质具有基本活性结构。
本发明已在上文中借助示出特定功能和其关系的实现的功能构建块来描述。为了方便描述，本文已对这些功能构建块的边界进行任意界定。只要合适执行特定功能和其关系，就可界定替代边界。
特定实施方案的前述描述将会完全地揭示本发明的一般性质，以使他人可以在不背离本发明的一般概念的情况下通过应用本领域的技术范围内的知识来容易地修改和/或改编此类特定实施方案以用于各种应用。因此，基于本文所呈现的教导内容以及指导内容，此类改编以及修改意图在所公开的实施方案的等同物的含义和范围内。应当理解，本文的措词或术语目的在于说明而非限制，因此技术人员将会根据教导内容以及指导内容来对本说明书的术语或措词进行解释。
本发明的宽度以及范围不应限于上述示例性实施方案，而应仅仅根据所附权利要求和它们的等同物来界定。
表
表2：FVII-186的DNA序列(SEQ ID NO:65)
表3：FVII-186氨基酸序列。信号序列以点下划线显示，前肽为双下划线，连接FVII轻链与SUMO的具有前蛋白转化酶加工位点的接头以下划线显示，SUMO序列以虚线下划线显示，连接FVII与Fc区的接头区以斜体表示，并且连接两个Fc片段的接头以粗体显示(SEQ ID NO:66)
表4：FX-011的DNA序列(SEQ ID NO:67)
表5：FX-011氨基酸序列。信号序列以点下划线显示，前肽为双下划线，连接FX活化肽与FX重链的接头区以下划线显示，并且连接两个Fc片段的具有前蛋白转化酶加工位点的接头以粗体显示(SEQ ID NO:68)
表6：FX-012的DNA序列(SEQ ID NO:69)
表7：FX-012氨基酸序列。信号序列以点下划线显示，前肽为双下划线，连接FX轻链与SUMO的接头区以下划线显示，SUMO序列以虚线下划线显示，并且连接两个Fc片段的具有前蛋白转化酶加工位点的接头以粗体显示(SEQ ID NO:70)
序列
SEQ ID NO：51
>CTP肽1
DPRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPIL
SEQ ID NO：52
>CTP肽2
SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ
SEQ ID NO：58
>PAS肽1
ASPAAPAPASPAAPAPSAPA
SEQ ID NO：59
>PAS肽2
AAPASPAPAAPSAPAPAAPS
SEQ ID NO：60
>PAS肽3
APSSPSPSAPSSPSPASPSS
SEQ ID NO：61
>PAS肽4
APSSPSPSAPSSPSPASPS
SEQ ID NO：62
>PAS肽5
SSPSAPSPSSPASPSPSSPA
SEQ ID NO：63
>PAS肽6
AASPAAPSAPPAAASPAAPSAPPA
SEQ ID NO：64
>PAS肽7
ASAAAPAAASAAASAPSAAA
SEQ ID NO：53
>白蛋白结合肽核心序列
DICLPRWGCLW
SEQ ID NO：71
>GFP蛋白序列(Genbank ID AAG34521.1)
MSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTFGYGVQCFARYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNTLGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDELYKSRTSGSPGLQEFDIKLIDTVDLESCN
SEQ ID NO：72
>实例：单链人IgGl Fc。(具有已加下划线的Gly/ser接头的Fc序列。)
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSSEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGG GSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLHISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQOWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：73
>成熟人白蛋白蛋白序列(源自NCBI参考序列NP_000468)：
RGVFRRDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVAOESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAAEGKKLVAASQAALGL
SEQ ID NO：54
>白蛋白结合肽1
RLIEDICLPRWGCLWEDD
SEQ ID NO：55
>白蛋白结合肽2
QRLMEOICLPRWGCLWEDDF
SEQ ID NO：56
>白蛋白结合肽3
QGLIGDICLPRWGCLWGDSVK
SEQ ID NO：74
>白蛋白结合肽4
GEWWEDICLPRWGCLWEEED
SEQ ID NO：75
>含有半胱氨酸的肽
GGGSGCGGGS
SEQ ID NO：76
>人LRP1序列(已加下划线的信号肽和跨膜片段；NCBI参考序列：CAA32112)
MLTPPLLLLLPLLSALVAAAIDAPKTCSPKQFACRDQIICISKGWRCDGERDCPDGSDEAPEICPQSKAQRCQPNEHNCLGTELCVPMSRLCNGVQDCMDGSDEGPHCRELQGNCSRLGCQHHCVPTLDGPTCYCNSSFQLQADGKTCKDFDECSVYGTCSQLCTNTDGSFICGCVEGYLLQPDNRSCKAKNEPVDRPPVLLIANSQNILATYLSGAQVSTITPTSTRQTTAMDFSYANETVCWVHVGDSAAQTQLKCARMPGLKGFVDEHTTNISLSLHHVEQMAIDWLTGNFYFVDDIDDRIFVCNRNGDTCVTLLDLELYNPKGIALDPAMGKVFFTDYGQIPKVERCDMDGQNRTKLVDSKTVFPHGITLDLVSRLVYWADAYLOYIEVVDYEGKGRQTIIQGILIEHLYGLTVFENYLYATNSDNANAQQKTSVIRVNRFNSTEYQVVTRVDKGGALHIYHQRRQPRVRSHACENDQYGKPGGCSDICLLANSHKARTCRCRSGFSLGSDGKSCKKPEHELFLVYGKGRPGIIRGMDMGAKVPDEHMIPIENLMNPRALDFHAETGFIYFADTTSYLTGRQKIDGTERETILKDGIHNVEGVAVDWMGDNLYWTDDGPKKTISVARLEKAAQTRKTLIEGKMTHPRAIVVDPLNGWMYWTDWEEDPKDSRRGRLERAWMDGSHRDIFVTSKTVLWPNGLSLDIPAGRLYWVDAFYDRIETILLNGTDRKIVYEGPELNHAFGLCHHGNYLFWTEYRSGSVYRLERGVGGAPPTVTLLRSERPPIFEIRMYDAQQQQVGTNKCRVNNGGCSSLCLATPGSRQCACAEDQVLDADGVTCLANPSYVPPPQCQPGEFACANSRCIQERWKCDGDNDCLDNSDEAPALCHQHTCPSDRFKCENNRCIPNRWLCDGDNDCGNSEDESNATCSARTCPPNQFSCASGRCIPISWTCDLDDDCGDRSDESASCAYPTCFPLTQFTCNNGRCININWRCDNDNDCGDNSDEAGCSHSCSSTQFKCNSGRCIPEHWTCDGDNDCGDYSDETHANCTNQATRPPGGCHTDEFQCRLDGLCIPLRRCDGDTDCMDSSDEKSCEGVTHVCDPSVKFGCKDSARCISKAWVCDGDNDCEDNSDEENCESLACRPPSHPCANNTSVCLPPDKLCDGNDDCGDGSDEGELCDQCSLNNGGCSHNCSVAPGEGIVCSCPLGMELGPDNHTCQIQSYCAKHLKCSQKCOQNKFSVKCSCYEGWVLEPDGESCRSLDPFKPFIIFSNRHEIRRLDLHKGDYSVLVPGLRNTIALDFHLSQSALYWTDVVEDKIYRGKLLDNGALTSFEVVIQYGLATPEGLAVDWIAGNIYWVESNLDQIEVAKLDGTLRTTLLAGDIEHPRAIALDPRDGILFWTDWDASLPR_EAASHSGAGRRTVHRETGSGGWPNGLTVDYLEKRILWIDARSDAIYSARYDGSGHMEVLRGHEFLSHPFAVTLYGGEVYWTDWRTNTLAKANKWTGHNVTVVQRTNTQPFDLQVYHPSRQPHAPNPCEANGGQGPCSHLCLINYNRTVSCACPHLMKLHKDNTTCYEFKKFLLYARQMEIRGVDLDAPYYNYIISFTVPDIDNVTVLDYDAREQRVYWSDVRTQAIKRAFINGTGVETVVSADLPNAHGLAVDWVSRNLFWTSYDTNKKQINVARLDGSFKNAVVQGLEQPHGLVVHPLRGKLYWTDGDNISMANMDGSNRTLLFSGQKGPVGIAIDFPESKLYWISSGNHTINRCNLDGSGLEVIDAMRSQLGKATALAIMGDKLWWADQVSEKMGTCSKADGSGSVVLRNSTTLVMHMKVYDESIQLDHKGTNPCSVNNGDCSQLCLPTSETTRSCMCTAGYSLRSGQQACEGVGSFLLYSVHEGIRGIPLDPNDKSDALVPVSGTSLAVGIDFHAENDTIYWVDMGLSTISRAKRDQTWREDVVTNGIGRVEGIAVDWIAGNIYWTDQGFDVIEVARLNGSFRYVVISQGLDKPRAITVHPEKGYLFWTEWGQYPRIERSRLDGTERVVLVNVSISWPNGISVDYQDGKLYWCDARTDKIERIDLETGENREVVLSSNNMDMFSVSVFEDFIYWSORTHANGSIKRGSKDNATDSVPLRTGIGVQLKDIKVFNRDRQKGTNVCAVANGGCQQLCLYRGRGQRACACAHGMLAEDGASCREYAGYLLYSERTILKSIHLSDERNLNAPVQPFEDPEHMKNVIALAFDYRAGTSPGTPNRIFFSDIHFGNIQQINDDGSRRITIVENVGSVEGLAYHRGWDTLYWTSYTTSTITRHTVDQTRPGAFERETVITMSGDDHPRAFVLDECQNLMFWTNWNEQHPSTMRAALSGANVLTLTEKDIRTPNGLAIDHRAEKLYFSDATLDKIERCEYDGSHRYV_LKSEPVHPFGLAVYGEHIFWTDWVRRAVQRANKHVGSNMKLLRVDIPQQPMGIIAVANDTNSCELSPCRINNGGCQDLCLLTHQGHVNCSCRGGRILQDDLTCRAVNSSCRAQDEFECANGECINFSLTCDGVPHCKDKSDEKPSYCNSRRCKKTFRQCSNGRCVSNMLWCNGADDCGDGSDEIPCNKTACGVGEFRCRDGTCIGNSSRCNQFVDCEDASDEMNCSATDCSSYFRLGVKGVLFQPCERTSLCYAPSWVCDGANDCGDYSDERDCPGVKRPRCPLNYFACPSGRCIPMSWTCDKEDDCEHGEDETHCNKFCSEAQFECQNHRCISKQWLCDGSDDCGDGSDEAAHCEGKTCGPSSFSCPGTHVCVPERWLCDGDKDCADGADZSIAAGCLYNSTCDDREFHCQNRQCIPKHEVCDHDRDCADGSDESPECEYPTCGPSEFRCANGRCLSSRQWECDGENDCHDQSDEAPKNPHCTSPEHKCNASSQFLCSSGRCVAEALLCNGQDDCGDSSDERGCHINECLSRKLSGCSQDCEDLKIGFKCRCRPGFRLKDDGRTCADVDECSTTFPCSQRCINTHGSYKCLCVEGYAPRGGDPHSCKAVTDEEPFLIFANRYYLRKLNLDGSNYTLLKQGLNNAVALDFDYREQMIYWTDVTTQGSMIRRMHLNGSNVQVLHRTGLSNPDGLAVDWVGGNLYWCDKGRDTIEVSKLNGAYRTVLVSSGLREPRALVVDVQNGYLYWTDWGDHSLIGRIGMDGSSRSVIVDTKITWPNGLTLDYVTERIYWADAREDYIEFASLDGSNRHVVLSQDIPHIFALTLFEDYVYWTDWETKSINRAHKTTGTNKTLLISTLHRPMDLHVFHALRQPDVPNHPCKVNNGGCSNLCLLSPGGGHKCACPTNFYLGSDGRTCVSNCTASQFVCKNDKCIPFWWKCDTEDDCGDHSDEPPDCPEFKCRPGQFQCSTGICTNPAFICDGDNDCQDNSDEANCDIHVCLPSQFKCTNTNRCIPGIFRCNGQDNCGDGEDERDCPEVTCAPNQFQCSITKRCIPRVWVCDRDNDCVDGSDEPANCTQMTCGVDEFRCKDSGRCIPARWKCDGEDDCGDGSDEPKEECDERTCEPYQFRCKNNRCVPGRWQCDYDNDCGDNSDEESCTPRPCSESEFSCANGRCIAGRWKCDGDHDCADGSDEKDCTPRCDMDQFQCKSGHCIPLRWRCDADADCMDGSDEEACGTGVRTCPLDEFQCNNTLCKPLAWKCDGEDDCGDNSDENPEECARFVCPPNRPFRCKNDRVCLWIGRQCDGTDNCGDGTDEEDCEPPTAHTTHCKDKKEFLCRNQRCLSSSLRCNMFDDCGDGSDEEDCSIDPKLTSCATNASICGDEARCVRTEKAAYCACRSGFHTVPGQPGCQDINECLRFGTCSQLCNNTKGGHLCSCARNFMKTHNTCKAEGSEYQVLYIADDNEIRSLFPGHPHSAYEQAFOGDESVRIDAMDVHVKAGRVYWTNWHTGTISYRSLPPAAPPTTSNRHRRQIDRGVTHLNISGLKMPRGIAIDWVAGNVYWTDSGRDVIEVAQMKGENRKTLISGMIDEPHA_VVDPLRGTMYWSDWGNHPKIETAAMDGTLRETLVQDNIQWPTGLAVDYHNERLYWADAKLSVIGSIRLNGTDPIVAADSKRGLSHPFSIDVFEDYIYGVTYINNRVFKIHKFGHSPLVNLTGGLSHASDVV_YHQHKQPEVTNPCDRKKCEWLCLLSPSGPVCTCPNGKRLDNGTCVPVPSPTPPPDAPRPGTCNLQCFNGGSCFLNARRQPKCRCQPRYTGDKCELDQCWEHCRNGGTCAASPSGMPTCRCPTGFTGPKCTQQVCAGYCANNSTCTVNQGNQPQCRCLPGFLGDRCQYRQCSGYCENFGTCQHAADGSRQCRCTAYFEGSRCEVNKCSRCLEGACVVNKQSGOVTCNCTOGRVAPSCLTCVGHCSNGGSCTMNSKMMPECOCPPHMTGPRCEEHVFSOOOPGHIASILIPLLLLLLLVLVAGV VFWYKRRVQGAKGFQHQRMTNGAMNVEIGNPTYKMYEGGEPDDVGGLLDADFALDPDKPTNFTNPVYATLYMGGHGSRHSLASTDEKRELLGRGPEDEIGDPLA
SEQ ID NO：77
>生物素受体肽(BAP)
LNDIFEAQKLEWH
SEQ ID NO：78
>硫辛酸(Lipoate)受体肽2(LAP2)
GFEIDKVWYDLDA
SEQ ID NO：82
>HAP化基序，n＝1至400
(Gly4Ser)n
SEQ ID NO：82
>CTP
DSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ
SEQ ID NO：79
>FVII-PABC肽
生物素-Pra-GGGG-DPhe-Pip-Arg-PABC-IVGGKV-COSBn，Pra-L-炔丙基甘氨酸
SEQ ID NO：80
>FX-PABC肽
GG-DPhe-Pip-Arg-PABC-IVGGQE-COSBn
SEQ ID NO：81
>SYN470
IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNLVTRQRY-PEG4-Gly-COSBn

Claims (113)

1.一种促凝血化合物，其具有下式：
(Het2)-(Pep2)-(Het1)-(L)-Zy-Bx-Pep1
其中，
Het1是第一异源分子，为不存在或存在的；
Het2是第二异源分子，为不存在或存在的；
L是接头，为不存在或存在的；
Zy是蛋白酶可切割的底物；
Bx是自分解性间隔子；
Pep1是多肽；并且，
Pep2是多肽，为不存在或存在的；
其中，Pep1或Pep2包含凝血因子或其片段，或合成的促凝血肽。
2.根据权利要求1所述的促凝血化合物，其中所述自分解性间隔子在对蛋白酶可切割的底物进行酶切后经历1,4消除。
3.根据权利要求1所述的促凝血化合物，其中所述自分解性间隔子在对蛋白酶可切割的底物进行酶切后经历1,6消除。
4.根据权利要求1所述的促凝血化合物，其中所述自分解性间隔子是氨基甲酸对氨基苄酯(PABC)、对氨基苄基醚(PABE)或碳酸对氨基苄酯。
5.根据权利要求1所述的促凝血化合物，其中所述自分解性间隔子包含芳基。
6.根据权利要求5所述的促凝血化合物，其中所述芳基选自苄基、肉桂基、萘基和联苯基。
7.根据权利要求5所述的促凝血化合物，其中所述芳基是杂环基。
8.根据权利要求5至7中任一项所述的促凝血化合物，其中所述芳基包含至少一个取代基。
9.根据权利要求8所述的促凝血化合物，其中所述至少一个取代基选自F、Cl、I、Br、OH、甲基、甲氧基、NO2、NH2、NO3+、NHCOCH3、N(CH3)2、NHCOCF3、烷基、卤代烷基、C1-C8烷基卤化物、羧酸酯、硫酸酯、氨基磺酸酯和磺酸酯。
10.根据权利要求7所述的促凝血化合物，其中所述芳基中的至少一个C被N、O或C-R1取代，其中R1独立地选自H、F、Cl、I、Br、OH、甲基、甲氧基、NO2,NH2、NO3+、NHCOCH3、N(CH3)2、NHCOCF3、烷基、卤代烷基、C1-C8烷基卤化物、羧酸酯、硫酸酯、氨基磺酸酯和磺酸酯。
11.根据权利要求1所述的促凝血化合物，其中所述蛋白酶可切割的底物包含凝血级联蛋白酶底物。
12.根据权利要求11所述的促凝血化合物，其中所述凝血级联蛋白酶选自凝血酶、凝血酶原、因子Va、因子VIIa、因子VIIIa、因子IXa、因子Xa、因子XIa和因子XIIa。
13.根据权利要求11所述的促凝血化合物，其中所述凝血级联蛋白酶底物是凝血酶底物。
14.根据权利要求13所述的促凝血化合物，其中所述凝血酶底物是合成的凝血酶底物。
15.根据权利要求14所述的促凝血化合物，其中所述合成的凝血酶底物包含序列D-Phe-Pip-Arg。
16.根据权利要求13所述的促凝血化合物，其中所述凝血酶底物选自D-Phe-Pro-Arg、D-Ala-Leu-Val-Pro-Arg、Ala-Leu-Val-Pro-Arg、Leu-Val-Pro-Arg和Ala-Leu-Arg-Pro-Arg。
17.根据权利要求1至10中任一项所述的促凝血化合物，其中所述蛋白酶可切割的底物包含选自以下的蛋白酶的切割位点：中性溶酶(CALLA或CDlO)、甲拌磷寡肽酶(TOP)、白三烯A4水解酶、内皮缩血管肽转化酶、ste24蛋白酶、溶神经素、线粒体中间肽酶、间质胶原酶、胶原酶、溶基质素、巨噬细胞弹性酶、基质溶解因子、明胶酶、跨膜肽酶、前胶原C-内肽酶、前胶原N-内肽酶、ADAM和ADAMT金属蛋白酶、髓磷脂相关的金属蛋白酶、釉质溶素、肿瘤坏死因子α-转换酶、胰岛素溶酶、nardilysin、线粒体处理肽酶、magnolysin、dactylysin样金属蛋白酶、嗜中性粒细胞胶原酶、基质金属蛋白酶、膜型基质金属蛋白酶、SP2内肽酶、前列腺特异性抗原(PSA)、纤溶酶、尿激酶、人成纤维细胞活化蛋白质(FAPα)、胰蛋白酶、糜蛋白酶、降钙蛋白酶、胰弹性蛋白酶、胰内肽酶、肠肽酶、白细胞弹性蛋白酶、成髓细胞、糜蛋白酶类、类胰蛋白酶、粒酶、角质层糜蛋白酶、顶体蛋白酶、激肽释放酶、补体成分和因子、替代补体途径c3/c5转换酶、甘露糖结合蛋白相关的丝氨酸蛋白酶、凝固因子、凝血酶、蛋白c、u和t型纤溶酶原活性剂、组织蛋白酶G、肝丝酶、丝氨酸蛋白水解酶、肝细胞生长因子活化内肽酶、枯草杆菌蛋白酶/kexin型前蛋白转化酶、弗林蛋白酶、前蛋白转化酶、脯氨酰肽酶、酰基氨基酰基肽酶、肽基-glycaminase、信号肽酶、n-末端亲核试剂氨基水解酶、20s蛋白酶体、γ-谷氨酰转肽基酶、线粒体内肽酶、线粒体内肽酶Ia、htra2肽酶、蛋白裂解酶、位点1蛋白酶、天冬酰胺内肽酶、组织蛋白酶、半胱氨酸组织蛋白酶、钙蛋白酶、泛素异肽酶T、胱天蛋白酶、糖基磷脂酰肌醇蛋白转酰胺基酶、癌症促凝血剂、激素原硫醇蛋白酶、γ-谷氨酰基水解酶、博莱霉素水解酶、成纤维细胞活化蛋白、组织蛋白酶D、胃蛋白酶、凝乳酶、胃亚蛋白酶、肾素、酵母天冬酶和/或memapsin，和前列腺特异性抗原(PSA)。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的促凝血化合物，其中Pep1和Pep2是不同的。
19.根据权利要求1至17中任一项所述的促凝血化合物，其中Pep1和Pep2是相同的。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的促凝血化合物，其中Pep1是凝血因子或其片段。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的促凝血化合物，其中Pep2是凝血因子或其片段。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的促凝血化合物，其中Pep1和Pep2是凝血因子或其片段。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的促凝血化合物，其中Pep1是凝血因子的重链，并且Pep2是所述凝血因子的轻链。
24.根据权利要求20至23中任一项所述的促凝血化合物，其中所述凝血因子选自FVII、FVIIa、FVIII、FIX、FX、FXa和vWF。
25.根据权利要求1至19中任一项所述的促凝血化合物，其中Pep1是合成的促凝血肽。
26.根据权利要求1至19中任一项所述的促凝血化合物，其中Pep2是合成的促凝血肽。
27.根据权利要求1至19中任一项所述的促凝血化合物，其中Pep1和Pep2均是合成的促凝血肽。
28.根据权利要求1至27中任一项所述的促凝血化合物，其中所述接头是肽接头。
29.根据权利要求28所述的促凝血化合物，其中所述肽接头包含至少两个氨基、至少三个、至少四个、至少五个、至少10个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个或至少100个氨基酸。
30.根据权利要求28所述的促凝血化合物，其中所述肽接头包含至少200个、至少300个、至少400个、至少500个、至少600个、至少700个、至少800个、至少900个或至少1000个氨基酸。
31.根据权利要求28所述的促凝血化合物，其中所述肽接头包含具有式[(Gly)x-Sery]z的肽，其中x为1至4，y为0或1，并且z为1至50。
32.根据权利要求1所述的促凝血化合物，其中所述接头包含非肽接头。
33.根据权利要求1所述的促凝血化合物，其中所述接头由非肽接头组成。
34.根据权利要求30或31所述的促凝血化合物，其中所述非肽接头选自MC、MP、MPEG、SMCC、MBS、SMPT、LC-SPDP和SMPB。
35.根据权利要求1至34中任一项所述的促凝血化合物，其中所述异源部分包括半衰期延长部分。
36.根据权利要求35所述的促凝血化合物，其中所述半衰期延长部分是低复杂度的多肽。
37.根据权利要求35所述的促凝血化合物，其中所述半衰期延长部分包含白蛋白、白蛋白结合多肽或脂肪酸、Fc、转铁蛋白、PAS、人绒毛膜促性腺激素的β亚基的C-末端肽(CTP)、聚乙二醇(PEG)、羟乙基淀粉(HES)、白蛋白结合小分子、vWF或其任意组合。
38.根据权利要求35所述的促凝血化合物，其中所述半衰期延长部分包含清除受体或阻断促凝血化合物与清除受体结合的其片段。
39.根据权利要求38所述的促凝血化合物，其中所述清除受体是LRP1。
40.根据权利要求1至39中任一项所述的促凝血化合物，其中所述异源部分包含能够使促凝血化合物或其片段可视化或定位的肽或多肽。
41.根据权利要求40所述的促凝血化合物，其中所述可视化或定位能够在体外、体内、离体或其任意组合中。
42.根据权利要求41所述的促凝血化合物，其中所述能够可视化或定位的肽或多肽选自生物素受体肽、硫辛酸受体肽、荧光蛋白、用于连接双砷染料或用于偶联亚稳锝的含有半胱氨酸的肽、用于基于荧光共振能量转移(FRET)的邻近测定的用于偶联铕包合物的肽、及其任意组合。
43.根据权利要求42所述的促凝血化合物，其中所述荧光蛋白选自GFP、RFP、YFP、EGFP、EYFP及其任意组合。
44.根据权利要求42所述的促凝血化合物，其中所述双砷染料为4’,5’-双(1,3,2-二硫代砷杂环戊烷-2-基)荧光素(FlAsH)。
45.根据权利要求42所述的促凝血化合物，其中所述生物素受体肽促进基于抗生物素蛋白的试剂和基于链霉亲和素的试剂的偶联。
46.根据权利要求42所述的促凝血化合物，其中所述硫辛酸受体肽促进硫醇反应性探针与结合的硫辛酸偶联或直接连接荧光性硫辛酸类似物。
47.根据权利要求1所述的促凝血化合物，其中所述异源部分包含非肽活性剂。
48.根据权利要求47所述的促凝血化合物，其中所述非肽活性剂是促凝血分子。
49.根据权利要求47所述的促凝血化合物，其中所述非肽活性剂是小分子药物。
50.根据权利要求1所述的促凝血化合物，其中所述异源部分包含靶向部分或配体结合部分。
51.根据权利要求1所述的促凝血化合物，其中所述异源部分包含锚或支架分子。
52.根据权利要求51所述的促凝血化合物，其中所述锚或支架分子是脂质、碳水化合物或巯基。
53.根据权利要求1所述的促凝血化合物，包含式Het-L-Zy-Bx-Pep1，其中：
Het是半胱氨酸，
L是肽接头；
Zy是合成的凝血酶底物，
Bx是自分解性间隔子，并且
Pep1是促凝血肽。
54.根据权利要求53所述的促凝血化合物，其中所述肽接头包含GGGG氨基酸序列，所述合成的凝血酶底物包含序列DPhe-Pip-Arg，所述自分解性间隔子是PABC，并且所述促凝血肽包含序列
55.根据权利要求1所述的促凝血化合物，其包含式Zy-Bx-Pep1，其中：
Zy是合成的凝血酶底物，
Bx是自分解性间隔子，并且
Pep1是凝血因子。
56.根据权利要求55所述的促凝血化合物，其中所述合成的凝血酶底物包含序列DPhe-Pip-Arg，所述自分解性间隔子是PABC，并且所述凝血因子是因子Xa或FVIIa。
57.根据权利要求1所述的促凝血化合物，其中使用选自以下的方法来测量所述促凝血活性：活化部分凝血活酶时间(aPTT)测定、改进的活化部分凝血活酶时间(aPTT*)测定、凝血酶生成测定(TGA)和ROTEM测定。
58.一种药物组合物，包含根据权利要求1至57中任一项所述的促凝血化合物和药学上可接受的载体。
59.一种用于治疗、改善或预防受试者中出血疾病或病症的方法，其包括给所述受试者施用有效量的根据权利要求1至57中任一项所述的促凝血化合物或根据权利要求58所述的药物组合物。
60.根据权利要求59所述的方法，其中所述出血疾病或病症由凝血障碍引起。
61.根据权利要求60所述的方法，其中所述凝血障碍选自血友病和血管性血友病(vWD)。
62.根据权利要求61所述的方法，其中所述凝血障碍是血友病A或血友病B。
63.根据权利要求59至62中任一项所述的方法，其中所述出血疾病或病症选自关节积血、肌肉出血、口腔出血、流血、流血到肌肉、口腔流血、创伤、头部创伤、消化道出血、颅内流血、腹腔内流血、胸内流血、骨折、中枢神经系统出血、咽后区出血、腹膜后隙出血和骼腰肌鞘出血。
64.一种治疗、改善或预防哺乳动物受试者中至少一种凝血因子缺乏的方法，其中所述凝血因子选自FV、FVII、FVIIa、FVIII、FIX、FX、FXI和vWF，所述方法包括给所述受试者施用有效量的根据权利要求1至57中任一项所述的促凝血化合物或根据权利要求58所述的药物组合物。
65.根据权利要求59至64中任一项所述的方法，其中所述受试者是人受试者。
66.根据权利要求1至57中任一项所述的促凝血化合物或根据权利要求58所述的药物制剂用于治疗患有凝血障碍的受试者。
67.根据权利要求66所述的促凝血化合物，其中所述受试者是人受试者。
68.根据权利要求1至57中任一项所述的促凝血化合物或根据权利要求58所述的药物制剂用于生产用于治疗、预防或改善凝血障碍的药物的用途。
69.一种制备根据权利要求1至57中任一项所述的促凝血化合物的方法，所述方法包括使用固相肽合成。
70.根据权利要求69所述的方法，其包括使用正交固相肽合成。
71.一种增强促凝血多肽的体内功效的方法，所述方法包括使所述多肽与自分解性间隔子偶合，其中所述自分解性间隔子与蛋白酶可切割的底物部分偶合。
72.根据权利要求71所述的方法，其中所述自分解性间隔子包含PABC基团。
73.根据权利要求71所述的方法，其中所述蛋白酶可切割的底物部分包含合成的凝血酶底物。
74.根据权利要求71所述的方法，其中所述促凝血多肽是凝血因子或促凝血肽。
75.根据权利要求71所述的方法，其中所述促凝血肽是合成的。
76.一种增加可操作地连接至促凝血肽或凝血因子的蛋白酶底物的切割功效的方法，所述方法包括使自分解性接头与所述促凝血多肽偶联，其中将所述自分解性接头插入在所述蛋白酶底物和所述促凝血肽或凝血因子之间。
77.一种使促凝血肽活化的方法，其包括使根据权利要求1至57中任一项所述的促凝血化合物与对所述促凝血化合物中所述蛋白酶可切割的底物部分特异性的蛋白酶接触，其中所述活化的促凝血肽在对所述蛋白酶可切割的底物部分进行蛋白水解切割时释放。
78.一种使凝血因子活化的方法，其包括使根据权利要求1至57中任一项所述的促凝血化合物与对所述促凝血化合物中所述蛋白酶可切割的底物部分特异性的蛋白酶接触，其中所述活化的凝血因子在对所述蛋白酶可切割的底物部分进行蛋白水解切割时释放。
79.一种从异源部分释放促凝血肽的方法，其包括使根据权利要求1至57中任一项所述的促凝血化合物与对所述促凝血化合物中所述蛋白酶可切割的底物特异性的蛋白酶接触，其中所述活化的促凝血多肽在对所述蛋白酶可切割的底物进行蛋白水解切割时释放。
80.一种从异源部分释放凝血因子的方法，其包括使根据权利要求1至57中任一项所述的促凝血化合物与对所述促凝血化合物中所述蛋白酶可切割的底物特异性的蛋白酶接触，其中所述活化的凝血因子在对所述蛋白酶可切割的底物进行蛋白水解切割时释放。
81.根据权利要求1至57中任一项所述的促凝血化合物，其中当与具有所述相同序列但不具有自分解性接头的参考促凝血化合物相比时，所述促凝血化合物被对所述蛋白酶可切割的底物部分特异性的蛋白酶切割快至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍。
82.根据权利要求1至81中任一项所述的促凝血化合物，其中当与具有所述相同序列但不具有自分解性接头的参考促凝血化合物相比时，所述促凝血化合物被对所述蛋白酶可切割的底物部分特异性的蛋白酶切割快至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍或至少100倍。
83.根据权利要求1至57中任一项所述的促凝血化合物，其中所述自分解性间隔子包含外部位结合肽。
84.一种蛋白酶可切割的多肽，其包含凝血因子的轻链、所述凝血因子的截短的重链("tHC")和蛋白酶切割位点，其中所述蛋白酶切割位点连接所述凝血因子的截短的重链和所述凝血因子的轻链。
85.根据权利要求84所述的蛋白酶可切割的多肽，其还包含在所述蛋白酶切割位点和所述凝血因子的轻链之间的细胞内加工位点。
86.根据权利要求84或85所述的蛋白酶可切割的多肽，其还包含通过任选的接头与所述凝血因子的截短的重链的C-末端连接的异源部分。
87.根据权利要求86所述的蛋白酶可切割的多肽，其中所述异源部分包含半衰期延长部分。
88.根据权利要求87所述的蛋白酶可切割的多肽，其中所述半衰期延长部分包含白蛋白、白蛋白结合多肽或脂肪酸、Fc、转铁蛋白、PAS、人绒毛膜促性腺激素的β亚基的C-末端肽(CTP)、聚乙二醇(PEG)、羟乙基淀粉(HES)、白蛋白结合小分子、清除受体或阻断所述促凝血化合物与清除受体结合的其片段、或其任意组合。
89.根据权利要求86至88中任一项所述的蛋白酶可切割的多肽，其中所述异源部分包含Fc区。
90.根据权利要求86至89中任一项所述的蛋白酶可切割的多肽，其中所述异源部分包含通过接头融合的两个Fc区。
91.根据权利要求84至90中任一项所述的蛋白酶可切割的多肽，其中所述凝血因子是因子VII或因子X。
92.根据权利要求84至90中任一项所述的蛋白酶可切割的多肽，其中与所述凝血因子的所述野生型重链相比，所述凝血因子的截短的重链在所述重链的N-末端不包含一个或多个氨基酸。
93.根据权利要求92所述的蛋白酶可切割的多肽，其中所述一个或多个氨基酸在所述重链的N-末端包含2个氨基酸、3个氨基酸、4个氨基酸、5个氨基酸、6个氨基酸、7个氨基酸、8个氨基酸、9个氨基酸、10个氨基酸、11个氨基酸、12个氨基酸、13个氨基酸、14个氨基酸或15个氨基酸。
94.根据权利要求92或93所述的蛋白酶可切割的多肽，其中所述凝血因子是因子VII并且所述一个或多个氨基酸是IVGGKV(SEQID NO:83)或IVGGKVCPKGE(SEQ ID NO:84)。
95.根据权利要求92或93所述的蛋白酶可切割的多肽，其中所述凝血因子是因子X并且所述一个或多个氨基酸是IVGGQE(SEQID NO:85)或IVGGQECKDGE(SEQ ID NO:86)。
96.根据权利要求84至95中任一项所述的蛋白酶可切割的多肽，其中所述蛋白酶可切割的位点包含SUMO。
97.一种多核苷酸，其编码根据权利要求84至96中任一项所述的可切割的多肽。
98.一种表达载体，其包含根据权利要求97所述的多核苷酸。
99.一种宿主细胞，其包含根据权利要求98所述的载体。
100.一种制备可切割的多肽的方法，其包括用根据权利要求97所述的多核苷酸或根据权利要求98所述的载体转染宿主细胞并且在足以表达所述多肽的条件下培养所述宿主细胞。
101.一种制备促凝血化合物的方法，其包括在足以切割蛋白酶可切割的位点的条件下使根据权利要求84至96中任一项所述的蛋白酶可切割的多肽与蛋白酶组合，其中所述蛋白酶可切割的多肽导致被切割的多肽。
102.根据权利要求101所述的方法，其还包括向所述被切割的多肽中加入硫酯肽，其中所述硫酯肽与所述凝血因子的截短的重链的N-末端融合。
103.根据权利要求101或102所述的方法，其中所述硫酯肽包含蛋白酶可切割的底物(Zy)。
104.根据权利要求103所述的方法，其中所述硫酯肽还包含在所述蛋白酶可切割的底物和所述凝血因子的截短的重链之间的自分解性间隔子(Bx)。
105.根据权利要求104所述的方法，所述硫酯肽还包含在所述自分解性间隔子和所述凝血因子的截短的重链之间的一个或多个氨基酸。
106.根据权利要求104或105所述的方法，其中所述硫酯肽包含式：
Zy-Bx-W，
其中Zy是蛋白酶可切割的底物；
Bx是自分解性间隔子；并且
W是一个或多个氨基酸。
107.根据权利要求104或105中任一项所述的方法，其中所述一个或多个氨基酸(W)与对应于野生型凝血因子的N-末端的所述氨基酸序列相同，其中所述一个或多个氨基酸和所述凝血因子的截短的重链在融合时产生所述凝血因子的完整重链。
108.根据权利要求105至107中任一项所述的方法，其中所述一个或多个氨基酸包含IVGGKV(SEQ ID NO:83)或IVGGKVCPKGE(SEQ ID NO:84)并且其中所述凝血因子包含因子VII。
109.根据权利要求104至107中任一项所述的方法，其中所述一个或多个氨基酸包含IVGGQE(SEQ ID NO:85)或IVGGQECKDGE(SEQ ID NO:86)并且其中所述凝血因子包含因子X。
110.根据权利要求103至109中任一项所述的方法，其中所述蛋白酶可切割的底物包含凝血酶切割位点。
111.根据权利要求110所述的方法，其中所述凝血酶切割位点包含D-Phe-Pip-Arg。
112.根据权利要求104至111所述的方法，其中所述自分解性间隔子包含PABC。
113.根据权利要求100至112中任一项所述的方法，其中所述蛋白酶可切割的位点包含SUMO。
CN201380036823.3A 2012-06-08 2013-06-07 促凝血化合物 Pending CN104519897A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261657688P 2012-06-08 2012-06-08
US61/657,688 2012-06-08
US201361800626P 2013-03-15 2013-03-15
US61/800,626 2013-03-15
PCT/US2013/044841 WO2013185113A1 (en) 2012-06-08 2013-06-07 Procoagulant compounds

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN104519897A true CN104519897A (zh) 2015-04-15

Family

ID=49712718

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201380036823.3A Pending CN104519897A (zh) 2012-06-08 2013-06-07 促凝血化合物

Country Status (7)

Country Link
US (2) US10287564B2 (zh)
EP (3) EP2858659B1 (zh)
JP (1) JP2015521589A (zh)
CN (1) CN104519897A (zh)
AU (1) AU2013270682A1 (zh)
CA (1) CA2875246A1 (zh)
WO (1) WO2013185113A1 (zh)

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105606412A (zh) * 2015-09-30 2016-05-25 丹阳海环医药科技发展有限公司 一种血液促凝剂的生产工艺
WO2018032638A1 (zh) * 2016-08-19 2018-02-22 安源医药科技（上海）有限公司 用于构建融合蛋白的连接肽
CN108707184A (zh) * 2018-05-21 2018-10-26 浙江大学 一种用于凝血酶活性检测的质谱探针及其制备方法和应用
CN108884146A (zh) * 2015-12-03 2018-11-23 百深公司 具有延长的半衰期及降低的配体结合性质的因子viii
CN109224139A (zh) * 2018-05-09 2019-01-18 祖晓麟 热敏型心脏支架
CN109415408A (zh) * 2015-12-11 2019-03-01 苏州嘉前医疗器械科技有限公司 通过蛋白质、多肽、抗原修饰和血液净化治疗疾病的方法
US11471513B2 (en) 2016-08-19 2022-10-18 Ampsource Biopharma Shanghai Inc. Highly glycosylated human blood-clotting factor VIII fusion protein, and manufacturing method and application of same
US11472863B2 (en) 2016-08-19 2022-10-18 Ampsource Biopharma Shanghai Inc. Human coagulation factor IX (FIX) fusion protein, preparation method therefor, and use thereof
US11981718B2 (en) 2020-05-27 2024-05-14 Ampsource Biopharma Shanghai Inc. Dual-function protein for lipid and blood glucose regulation

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012170969A2 (en) * 2011-06-10 2012-12-13 Biogen Idec Ma Inc. Pro-coagulant compounds and methods of use thereof
US10202595B2 (en) 2012-06-08 2019-02-12 Bioverativ Therapeutics Inc. Chimeric clotting factors
CA2875246A1 (en) 2012-06-08 2013-12-12 Biogen Idec Ma Inc. Procoagulant compounds
SG10201913874TA (en) 2013-03-15 2020-03-30 Biogen Ma Inc Factor ix polypeptide formulations
EP4169944A1 (en) * 2014-03-14 2023-04-26 Biomolecular Holdings LLC Process for preparing hybrid immunoglobulin containing non-peptidyl linkage
EA038573B1 (ru) 2014-03-24 2021-09-16 Биовератив Терапьютикс Инк. Лиофилизированный состав, содержащий фактор ix, для предупреждения приступов кровотечения
KR102546875B1 (ko) 2014-05-02 2023-06-26 모멘타 파머슈티컬스 인코포레이티드 공학처리된 ｆｃ 작제물과 관련된 조성물 및 방법
JP6453706B2 (ja) * 2014-05-23 2019-01-16 日本化薬株式会社 新規なグルタミン酸誘導体およびその用途
CN104672300A (zh) * 2015-03-17 2015-06-03 武汉大学 一种双酶敏感型荧光探针及其制备方法和应用
ES2972740T3 (es) 2016-03-02 2024-06-14 Momenta Pharmaceuticals Inc Procedimientos relacionados con construcciones de Fc modificadas genéticamente
IL263211B2 (en) * 2016-05-23 2023-09-01 Momenta Pharmaceuticals Inc Compositions and methods relating to engineered fc constructs
US10738338B2 (en) 2016-10-18 2020-08-11 The Research Foundation for the State University Method and composition for biocatalytic protein-oligonucleotide conjugation and protein-oligonucleotide conjugate
CN110650748B (zh) 2017-01-06 2024-01-02 动量制药公司 与经工程改造的Fc构建体相关的组合物和方法
MX2021006429A (es) * 2018-12-06 2021-07-15 Cytomx Therapeutics Inc Sustratos escindibles con matriz de metaloproteasa, serina o cisteína escindible con proteasa y métodos de uso de estos.
US11471497B1 (en) 2019-03-13 2022-10-18 David Gordon Bermudes Copper chelation therapeutics
IL266433B (en) * 2019-05-02 2020-11-30 Sagi Irit Preparations containing the propeptide of lysyl oxidase and their uses
PL4010379T3 (pl) 2019-08-08 2025-07-28 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Kompozycje i sposoby wytwarzania czynnika xa i pochodnych

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004113493A2 (en) * 2003-06-03 2004-12-29 Cell Genesys, Inc. Compositions and methods for enhanced expression of immunoglobulins from a single vector using a peptide cleavage site
US20080241102A1 (en) * 2004-03-23 2008-10-02 Complex Biosystems Gmbh Polymeric Prodrug with a Self-Immolative Linker
US7589178B2 (en) * 2001-10-19 2009-09-15 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Thrombin-cleavable chimeric proteins

Family Cites Families (144)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US1028756A (en) 1912-02-10 1912-06-04 J M Hubert Mail-receiving apparatus.
US3480000A (en) 1968-05-31 1969-11-25 Roper Corp Geo D Self-cleaning gas oven
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
WO1981001145A1 (en) 1979-10-18 1981-04-30 Univ Illinois Hydrolytic enzyme-activatible pro-drugs
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4868112A (en) 1985-04-12 1989-09-19 Genetics Institute, Inc. Novel procoagulant proteins
KR910006424B1 (ko) 1985-08-21 1991-08-24 인코텍스 비.브이 편성브리프(brief) 제조방법
EP0253870B1 (en) 1986-01-03 1993-03-31 Genetics Institute, Inc. Method for producing factor viii:c-type proteins
US5595886A (en) 1986-01-27 1997-01-21 Chiron Corporation Protein complexes having Factor VIII:C activity and production thereof
US5543502A (en) 1986-06-24 1996-08-06 Novo Nordisk A/S Process for producing a coagulation active complex of factor VIII fragments
EP0307434B2 (en) 1987-03-18 1998-07-29 Scotgen Biopharmaceuticals, Inc. Altered antibodies
US6060447A (en) 1987-05-19 2000-05-09 Chiron Corporation Protein complexes having Factor VIII:C activity and production thereof
US6346513B1 (en) 1987-06-12 2002-02-12 Baxter Trading Gmbh Proteins with factor VIII activity: process for their preparation using genetically-engineered cells and pharmaceutical compositions containing them
US5171844A (en) 1987-06-12 1992-12-15 Gist-Brocades N.W. Proteins with factor viii activity: process for their preparation using genetically-engineered cells and pharmaceutical compositions containing them
DE3720246A1 (de) 1987-06-19 1988-12-29 Behringwerke Ag Faktor viii:c-aehnliches molekuel mit koagulationsaktivitaet
US5892019A (en) 1987-07-15 1999-04-06 The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services Production of a single-gene-encoded immunoglobulin
FR2619314B1 (fr) 1987-08-11 1990-06-15 Transgene Sa Analogue du facteur viii, procede de preparation et composition pharmaceutique le contenant
US6780613B1 (en) 1988-10-28 2004-08-24 Genentech, Inc. Growth hormone variants
CA2053864C (en) 1989-02-21 2001-11-20 Irving Boime Modified forms of reproductive hormones
US5935815A (en) 1989-10-25 1999-08-10 Katholieke Universiteit Leuven Process for micro biological production of proteins
SE465222C5 (sv) 1989-12-15 1998-02-10 Pharmacia & Upjohn Ab Ett rekombinant, humant faktor VIII-derivat och förfarande för dess framställning
GB9024129D0 (en) 1990-11-06 1990-12-19 Thrombosis Research Trust Inhibitors and substrates of thrombin
IE914102A1 (en) 1990-11-26 1992-06-03 Genetics Inst Expression of pace in host cells and methods of use thereof
US5846951A (en) 1991-06-06 1998-12-08 The School Of Pharmacy, University Of London Pharmaceutical compositions
ES2219646T5 (es) 1993-02-22 2008-11-01 Abraxis Bioscience, Inc. Metodos para la administracion in vivo de compuestos biologicos y composiciones utiles para los mismos.
US5439686A (en) 1993-02-22 1995-08-08 Vivorx Pharmaceuticals, Inc. Methods for in vivo delivery of substantially water insoluble pharmacologically active agents and compositions useful therefor
SE504074C2 (sv) 1993-07-05 1996-11-04 Pharmacia Ab Proteinberedning för subkutan, intramuskulär eller intradermal administrering
US5643575A (en) 1993-10-27 1997-07-01 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
GB9422383D0 (en) 1994-11-05 1995-01-04 Wellcome Found Antibodies
US6030613A (en) 1995-01-17 2000-02-29 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of therapeutics
US6086875A (en) 1995-01-17 2000-07-11 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of immunogens
US6485726B1 (en) 1995-01-17 2002-11-26 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of therapeutics
US6096871A (en) 1995-04-14 2000-08-01 Genentech, Inc. Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5739277A (en) 1995-04-14 1998-04-14 Genentech Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5840529A (en) 1995-08-02 1998-11-24 Clinical Research Institute Of Montreal Mammalian pro-hormone convertase
SE9503380D0 (sv) 1995-09-29 1995-09-29 Pharmacia Ab Protein derivatives
US6458563B1 (en) 1996-06-26 2002-10-01 Emory University Modified factor VIII
CA2203745A1 (en) 1996-07-26 1998-01-26 Robert Day Pro-protein converting enzyme
CA2262405A1 (en) 1996-08-02 1998-02-12 Bristol-Myers Squibb Company A method for inhibiting immunoglobulin-induced toxicity resulting from the use of immunoglobulins in therapy and in vivo diagnosis
WO1998023289A1 (en) 1996-11-27 1998-06-04 The General Hospital Corporation MODULATION OF IgG BINDING TO FcRn
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
GB9722131D0 (en) 1997-10-20 1997-12-17 Medical Res Council Method
US6242195B1 (en) 1998-04-02 2001-06-05 Genentech, Inc. Methods for determining binding of an analyte to a receptor
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
DK1068241T3 (da) 1998-04-02 2008-02-04 Genentech Inc Antistofvarianter og fragmenter deraf
US6528624B1 (en) 1998-04-02 2003-03-04 Genentech, Inc. Polypeptide variants
GB9809951D0 (en) 1998-05-08 1998-07-08 Univ Cambridge Tech Binding molecules
WO2000009560A2 (en) 1998-08-17 2000-02-24 Abgenix, Inc. Generation of modified molecules with increased serum half-lives
EP1006183A1 (en) 1998-12-03 2000-06-07 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Recombinant soluble Fc receptors
MX353234B (es) 1999-01-15 2018-01-08 Genentech Inc Variantes de polipeptidos con función efectora alterada.
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
ES2529300T3 (es) 2000-04-12 2015-02-18 Novozymes Biopharma Dk A/S Proteínas de fusión de albúmina
JP2003533537A (ja) 2000-05-16 2003-11-11 リポクセン テクノロジーズ リミテッド タンパク質の誘導体化
GB0029407D0 (en) 2000-12-01 2001-01-17 Affitech As Product
DE60143544D1 (de) 2000-12-12 2011-01-05 Medimmune Llc Moleküle mit längeren halbwertszeiten, zusammensetzungen und deren verwendung
US6888319B2 (en) 2001-03-01 2005-05-03 Palomar Medical Technologies, Inc. Flashlamp drive circuit
AU2002335930B2 (en) 2001-03-09 2005-07-28 Morphosys Ag Serum albumin binding moieties
US20040106794A1 (en) 2001-04-16 2004-06-03 Schering Corporation 3,4-Di-substituted cyclobutene-1,2-diones as CXC-chemokine receptor ligands
US7091186B2 (en) 2001-09-24 2006-08-15 Seattle Genetics, Inc. p-Amidobenzylethers in drug delivery agents
DE60128914T2 (de) 2001-10-05 2008-05-08 Affimed Therapeutics Ag Antikörper menschlichen Ursprungs zur Hemmung der Thrombozytenaggregation
US20080194481A1 (en) 2001-12-21 2008-08-14 Human Genome Sciences, Inc. Albumin Fusion Proteins
ES2425738T3 (es) 2001-12-21 2013-10-17 Human Genome Sciences, Inc. Proteínas de fusión de la albúmina
KR101271635B1 (ko) 2001-12-21 2013-06-12 휴먼 게놈 사이언시즈, 인코포레이티드 알부민 융합 단백질
US20040002587A1 (en) 2002-02-20 2004-01-01 Watkins Jeffry D. Fc region variants
US7317091B2 (en) 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
JP2006502091A (ja) 2002-03-01 2006-01-19 イミューノメディクス、インコーポレイテッド クリアランス速度を高めるための二重特異性抗体点変異
CA2479212A1 (en) 2002-03-15 2003-09-25 Brigham And Women's Hospital, Inc. Central airway administration for systemic delivery of therapeutics
AU2003241599A1 (en) 2002-05-22 2003-12-12 The Children's Hospital Of Philadelphia Compositions and methods for the treatment of hemophilia a
JP2004075661A (ja) * 2002-06-18 2004-03-11 Shiseido Co Ltd 表皮基底膜ケアを特徴とする皮膚外用剤、皮膚基底膜構造形成促進剤および人工皮膚の製造方法
FR2841904B1 (fr) 2002-07-03 2004-08-20 Inst Nat Sante Rech Med Analogues de facteurs x clivables par la thrombine
PT2357006E (pt) 2002-07-31 2016-01-22 Seattle Genetics Inc Conjugados de fármacos e sua utilização para tratamento do cancro, de uma doença autoimune ou de uma doença infeciosa
DK1534335T4 (en) 2002-08-14 2015-10-05 Macrogenics Inc FCGAMMARIIB-SPECIFIC ANTIBODIES AND PROCEDURES FOR USE THEREOF
ATE541857T1 (de) 2002-09-27 2012-02-15 Xencor Inc Optimierte fc-varianten und herstellungsverfahren dafür
DK1562972T3 (da) 2002-10-15 2010-12-06 Facet Biotech Corp Modifikation af FcRn-bindingsaffiniteter eller serumhalveringstider for antistoffer ved mutagenese
GB2395337B (en) 2002-11-14 2005-12-28 Gary Michael Wilson Warning Unit
US7355008B2 (en) 2003-01-09 2008-04-08 Macrogenics, Inc. Identification and engineering of antibodies with variant Fc regions and methods of using same
US7041635B2 (en) 2003-01-28 2006-05-09 In2Gen Co., Ltd. Factor VIII polypeptide
BRPI0407882B1 (pt) 2003-02-26 2021-07-27 Nektar Therapeutics Composição compreendendo conjugados de polímero-porção de fator viii e seu método de fabricação
US20090010920A1 (en) 2003-03-03 2009-01-08 Xencor, Inc. Fc Variants Having Decreased Affinity for FcyRIIb
US8388955B2 (en) 2003-03-03 2013-03-05 Xencor, Inc. Fc variants
TWI353991B (en) 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
ES2333598T5 (es) 2003-05-06 2013-09-04 Biogen Idec Hemophilia Inc Proteinas quimericas del factor de coagulacion fc para tratar la hemofilia.
US7348004B2 (en) 2003-05-06 2008-03-25 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
US7498024B2 (en) * 2003-06-03 2009-03-03 Cell Genesys, Inc. Compositions and methods for enhanced expression of immunoglobulins from a single vector using a peptide cleavage site
JP4566194B2 (ja) 2003-08-12 2010-10-20 リポクセン テクノロジーズ リミテッド タンパク質の誘導体化及び結合のためのシアル酸誘導体
GB0324368D0 (en) 2003-10-17 2003-11-19 Univ Cambridge Tech Polypeptides including modified constant regions
EP2385069A3 (en) 2003-11-12 2012-05-30 Biogen Idec MA Inc. Neonatal Fc rReceptor (FcRn)- binding polypeptide variants, dimeric Fc binding proteins and methods related thereto
US20050249723A1 (en) 2003-12-22 2005-11-10 Xencor, Inc. Fc polypeptides with novel Fc ligand binding sites
WO2005070963A1 (en) 2004-01-12 2005-08-04 Applied Molecular Evolution, Inc Fc region variants
WO2005082023A2 (en) 2004-02-23 2005-09-09 Genentech, Inc. Heterocyclic self-immolative linkers and conjugates
EP2053062A1 (en) 2004-03-24 2009-04-29 Xencor, Inc. Immunoglobin variants outside the Fc region
WO2005123780A2 (en) 2004-04-09 2005-12-29 Protein Design Labs, Inc. Alteration of fcrn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
RU2402548C2 (ru) 2004-05-19 2010-10-27 Медарекс, Инк. Химические линкеры и их конъюгаты
WO2006085967A2 (en) 2004-07-09 2006-08-17 Xencor, Inc. OPTIMIZED ANTI-CD20 MONOCONAL ANTIBODIES HAVING Fc VARIANTS
DK2471813T3 (en) 2004-07-15 2015-03-02 Xencor Inc Optimized Fc variants
WO2006047350A2 (en) 2004-10-21 2006-05-04 Xencor, Inc. IgG IMMUNOGLOBULIN VARIANTS WITH OPTIMIZED EFFECTOR FUNCTION
US7632921B2 (en) 2004-11-12 2009-12-15 Bayer Healthcare Llc Site-directed modification of FVIII
US7393833B2 (en) 2005-03-09 2008-07-01 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Chimeric proteins with phosphatidylserine binding domains
US20060269480A1 (en) 2005-05-31 2006-11-30 Ramot At Tel Aviv University Ltd. Multi-triggered self-immolative dendritic compounds
KR20080071119A (ko) 2005-08-12 2008-08-01 휴먼 게놈 사이언시즈, 인코포레이티드 알부민 융합 단백질
US7855279B2 (en) 2005-09-27 2010-12-21 Amunix Operating, Inc. Unstructured recombinant polymers and uses thereof
US7846445B2 (en) 2005-09-27 2010-12-07 Amunix Operating, Inc. Methods for production of unstructured recombinant polymers and uses thereof
KR20080098600A (ko) 2006-01-04 2008-11-11 두-쿱 테크놀로지스 리미티드 고체-유체 조성물
US8048848B2 (en) 2006-02-03 2011-11-01 Prolor Biotech Ltd. Long-acting interferons and derivatives thereof and methods thereof
CA2644405A1 (en) * 2006-03-13 2007-09-20 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against il-6 and polypeptides comprising the same for the treatment of diseases and disorders associated with il-6-mediated signalling
JP5628481B2 (ja) 2006-03-13 2014-11-19 コーニンクレッカ フィリップス エヌ ヴェ 固体照明システムのための適応制御装置及び方法
SI2004683T1 (sl) 2006-03-24 2016-09-30 Biogen Hemophilia Inc. Pc5 kot encim za obdelavo propeptida faktorja ix
JP5759102B2 (ja) 2006-04-07 2015-08-05 ノボ ノルディスク ヘルス ケア アーゲー Ｖｉｉ因子・組織因子共有結合複合体
US7939632B2 (en) 2006-06-14 2011-05-10 Csl Behring Gmbh Proteolytically cleavable fusion proteins with high molar specific activity
GB0614780D0 (en) 2006-07-25 2006-09-06 Ucb Sa Biological products
WO2008033413A2 (en) 2006-09-14 2008-03-20 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
TWI412367B (zh) 2006-12-28 2013-10-21 Medarex Llc 化學鏈接劑與可裂解基質以及其之綴合物
EP2144930A1 (en) 2007-04-18 2010-01-20 ZymoGenetics, Inc. Single chain fc, methods of making and methods of treatment
EP2158318A2 (en) 2007-05-14 2010-03-03 Biogen Idec MA, Inc. Single-chain fc (scfc) regions, binding polypeptides comprising same, and methods related thereto
PL2369005T3 (pl) 2007-06-21 2013-10-31 Univ Muenchen Tech Białka czynne biologicznie o zwiększonej stabilności in vivo i(lub) in vitro
CA2695374A1 (en) 2007-08-15 2009-02-19 Amunix, Inc. Compositions and methods for modifying properties of biologically active polypeptides
US8800831B2 (en) 2009-08-19 2014-08-12 Larry A. Gray Multi-purpose rack and method thereof
EP2387413A4 (en) * 2009-01-19 2015-12-23 Bayer Healthcare Llc PROTEIN CONJUGATE WITH AN ENDOPEPTIDASE-SPLICABLE BIOPROTEKTIVES PART
US8680050B2 (en) 2009-02-03 2014-03-25 Amunix Operating Inc. Growth hormone polypeptides fused to extended recombinant polypeptides and methods of making and using same
US8703717B2 (en) 2009-02-03 2014-04-22 Amunix Operating Inc. Growth hormone polypeptides and methods of making and using same
ES2610356T3 (es) 2009-02-03 2017-04-27 Amunix Operating Inc. Polipéptidos recombinantes extendidos y composiciones que comprenden los mismos
JP5770161B2 (ja) 2009-04-06 2015-08-26 ノヴォ ノルディスク アー／エス 血小板への第ｖｉｉｉ因子タンパク質の標的送達
EP2437786B1 (en) 2009-06-01 2016-05-18 Yeda Research and Development Co. Ltd. Prodrugs containing albumin binding probe
PT2440228T (pt) 2009-06-08 2018-12-24 Amunix Operating Inc Polipéptidos de regulação da glicose e métodos de preparação e utilização dos mesmos
MX354555B (es) 2009-06-08 2018-03-09 Amunix Operating Inc Polipeptidos de la hormona de crecimiento y metodos de preparacion y su uso.
ES2524974T3 (es) 2009-06-25 2014-12-16 The University Of North Carolina At Chapel Hill Moléculas del Factor VII quimérico
EP3222287A1 (en) 2009-08-24 2017-09-27 Amunix Operating Inc. Coagulation factor ix compositions and methods of making and using same
WO2011028344A2 (en) 2009-08-25 2011-03-10 Amunix Operating Inc. Interleukin-1 receptor antagonist compositions and methods of making and using same
EA025416B1 (ru) 2009-12-06 2016-12-30 Байоджен Хемофилия Инк. Способ предотвращения или лечения эпизодов кровотечений с использованием химерного полипептида фактора viii длительного действия
WO2011142783A2 (en) 2009-12-16 2011-11-17 Allergan, Inc. Modified clostridial toxins comprising an integrated protease cleavage site-binding domain
US9611310B2 (en) 2010-07-09 2017-04-04 Bioverativ Therapeutics Inc. Systems for factor VIII processing and methods thereof
TW201217527A (en) 2010-07-09 2012-05-01 Biogen Idec Hemophilia Inc Processable single chain molecules and polypeptides made using same
MY192639A (en) 2010-07-09 2022-08-29 Bioverativ Therapeutics Inc Factor ix polypeptides and methods of use thereof
US20130017997A1 (en) 2010-08-19 2013-01-17 Amunix Operating Inc. Factor VIII Compositions and Methods of Making and Using Same
WO2012170969A2 (en) 2011-06-10 2012-12-13 Biogen Idec Ma Inc. Pro-coagulant compounds and methods of use thereof
TWI687226B (zh) 2011-07-08 2020-03-11 美商百歐維拉提夫治療公司 因子ｖｉｉｉ嵌合及雜交多肽，及其使用方法
CN111499760A (zh) 2012-01-12 2020-08-07 比奥贝拉蒂治疗公司 嵌合因子viii多肽及其用途
DK2822577T3 (en) 2012-02-15 2019-04-01 Bioverativ Therapeutics Inc RECOMBINANT FACTOR VIII PROTEINS
CA2875246A1 (en) 2012-06-08 2013-12-12 Biogen Idec Ma Inc. Procoagulant compounds
US10202595B2 (en) 2012-06-08 2019-02-12 Bioverativ Therapeutics Inc. Chimeric clotting factors

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7589178B2 (en) * 2001-10-19 2009-09-15 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Thrombin-cleavable chimeric proteins
WO2004113493A2 (en) * 2003-06-03 2004-12-29 Cell Genesys, Inc. Compositions and methods for enhanced expression of immunoglobulins from a single vector using a peptide cleavage site
US20080241102A1 (en) * 2004-03-23 2008-10-02 Complex Biosystems Gmbh Polymeric Prodrug with a Self-Immolative Linker

Cited By (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105606412A (zh) * 2015-09-30 2016-05-25 丹阳海环医药科技发展有限公司 一种血液促凝剂的生产工艺
CN105606412B (zh) * 2015-09-30 2018-12-07 丹阳海环医药科技发展有限公司 一种血液促凝剂的生产工艺
CN108884146A (zh) * 2015-12-03 2018-11-23 百深公司 具有延长的半衰期及降低的配体结合性质的因子viii
CN109415408A (zh) * 2015-12-11 2019-03-01 苏州嘉前医疗器械科技有限公司 通过蛋白质、多肽、抗原修饰和血液净化治疗疾病的方法
WO2018032638A1 (zh) * 2016-08-19 2018-02-22 安源医药科技（上海）有限公司 用于构建融合蛋白的连接肽
US11123438B2 (en) 2016-08-19 2021-09-21 Ampsource Biopharma Shanghai Inc. Linker peptide for constructing fusion protein
US11471513B2 (en) 2016-08-19 2022-10-18 Ampsource Biopharma Shanghai Inc. Highly glycosylated human blood-clotting factor VIII fusion protein, and manufacturing method and application of same
US11472863B2 (en) 2016-08-19 2022-10-18 Ampsource Biopharma Shanghai Inc. Human coagulation factor IX (FIX) fusion protein, preparation method therefor, and use thereof
US11833212B2 (en) 2016-08-19 2023-12-05 Ampsource Biopharma Shanghai Inc. Linker peptide for constructing fusion protein
CN109224139A (zh) * 2018-05-09 2019-01-18 祖晓麟 热敏型心脏支架
CN109224139B (zh) * 2018-05-09 2020-08-18 祖晓麟 热敏型心脏支架
CN108707184A (zh) * 2018-05-21 2018-10-26 浙江大学 一种用于凝血酶活性检测的质谱探针及其制备方法和应用
CN108707184B (zh) * 2018-05-21 2021-01-29 浙江大学 一种用于凝血酶活性检测的质谱探针及其制备方法和应用
US11981718B2 (en) 2020-05-27 2024-05-14 Ampsource Biopharma Shanghai Inc. Dual-function protein for lipid and blood glucose regulation

Also Published As

Publication number Publication date
EP2858659A4 (en) 2016-09-28
EP4079316A1 (en) 2022-10-26
US11261437B2 (en) 2022-03-01
AU2013270682A1 (en) 2014-12-11
US10287564B2 (en) 2019-05-14
US20150184142A1 (en) 2015-07-02
CA2875246A1 (en) 2013-12-12
US20190309280A1 (en) 2019-10-10
EP2858659A1 (en) 2015-04-15
HK1209023A1 (zh) 2016-03-24
WO2013185113A1 (en) 2013-12-12
EP3693000A1 (en) 2020-08-12
EP2858659B1 (en) 2019-12-25
JP2015521589A (ja) 2015-07-30
EP3693000B1 (en) 2022-03-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3693000B1 (en) Procoagulant compounds
EP2717898B1 (en) Pro-coagulant compounds and methods of use thereof
JP6527918B2 (ja) 第ｖｉｉｉ因子組成物、ならびに組成物の作製方法および用途
TWI727187B (zh) 嵌合因子viii多肽及其用途
JP6250282B2 (ja) 出血性障害の治療および予防的治療における非静脈内投与のためのアルブミン融合凝固因子
RU2620072C2 (ru) ПРОИЗВОДНЫЕ ФАКТОРОВ СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ VII И VIIa, КОНЪЮГАТЫ И КОМПЛЕКСЫ, СОДЕРЖАЩИЕ ИХ, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
JP2008509688A (ja) 改変ビタミンｋ依存性ポリペプチド
CA2875247A1 (en) Chimeric clotting factors
KR20080108147A (ko) 페질화된 인자 ｖｉｉｉ
ES2844232T3 (es) Factor de Von Willebrand modificado
US20230203195A1 (en) Anti-vwf d'd3 single-domain antibodies and polypeptides comprising thereof
EP3003368A2 (en) Anti-gpiib/iiia antibodies or uses thereof
JP2009533364A (ja) 治療用ポリペプチドのインビボでの回収を増大させる方法
TWI642444B (zh) 糖鏈加成連接基、含有糖鏈加成連接基與生理活性物質的化合物或其鹽，以及其製造方法
US20220340633A1 (en) Superagonist polypeptide analogs of adrenomedullin and intermedin peptide hormones
CN110139871A (zh) 用于治疗中风和相关凝血障碍的凝血酶抑制剂
HK40035509A (zh) 促凝血化合物
HK40035509B (zh) 促凝血化合物
JP2011510043A (ja) 新規血液凝固因子インヒビター
HK1209023B (zh) 促凝血化合物
US20220243189A1 (en) Procoagulant compounds
CN101784560A (zh) 凝血因子抑制剂
BR112014020198B1 (pt) Fator de coagulação modificado por peptídeos carbóxiterminais da gonadotrofina coriônica (ctp) e seu uso, método para produzir e extender a meia-vida do referido fator de coagulação, polinucleotídeo e composição farmacêutica
HK1127300A (zh) 聚乙二醇化的因子viii

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
C53 Correction of patent of invention or patent application
CB02 Change of applicant information

Address after: Massachusetts, USA

Applicant after: BIOGEN MA Inc.

Address before: Massachusetts, USA

Applicant before: Biogen Idec MA Inc.

COR Change of bibliographic data

Free format text: CORRECT: ADDRESS; FROM:

Free format text: CORRECT: APPLICANT; FROM: BIOGEN IDEC MA TO: BIOGEN MA INC.

SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20150415